JP7268144B2 - 試料を走査する方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡法において試料を走査する方法であって、ドットパターンを形成するために少なくとも３つの照明点を生成する方法に関する。本発明はさらに、顕微鏡法において試料を走査する装置であって、ドットパターンを形成するために少なくとも３つの照明点を生成する照明ユニットを備えた装置に関する。

試料を走査する公知の顕微鏡法では、複数の照明点から成るドットパターンが利用される。複数の照明点を使用することにより、試料上または試料内の、照明点に対応付けられる複数の点を走査可能である。走査過程はいわば並列化され、したがって試料を走査する速度が高められる。

試料を走査する公知の方法ではさらに、例えば、試料の異なる部分領域がマーキングされた、試料に存在する種々異なる色素を励起して蛍光させるために、異なる波長を有する照明点が利用される。これにより、試料の異なる部分領域の位置および運動を互いに相対的に観察することができる。

P. Bingen、M. Reuss、J. Engelhardt、S. W. HellによるParallelized STED fluorescence nanoscopy、Opt Express、２０１１年、第１９巻、第２３７１６～２３７２６頁からは、ウォラストンプリズムを使用して、異なる波長を有する光からそれぞれ形成される複数の照明光点を生成する方法が公知である。

J. Bewersdorf、R. Pick、S. W. HellによるMultifocal multiphoton microscopy、Opt Lett、１９９８年、第２３巻、第６５５～６５７頁からは、マイクロレンズを配置することによって複数の照明光点が生成される顕微鏡が公知である。照明光点は、試料内に結像され、試料から放射される蛍光がカメラによって検出される。

米国特許出願公開第２００９／１０９５２７号明細書からは、直線に沿って配置されておりかつ試料内に結像される照明点を生成するために、音響光学変向器（ＡＯＤ：akustooptischer Deflektor）が利用される顕微鏡が公知である。試料から放射される蛍光は、点検出器の装置によって検出され、それぞれの照明点には点検出器が対応付けられている。

S. P. Poland、N. Krstajic、J. Monypenny、S. Coelho、D. Tyndall、R. J. Walker、V. Devauges、J. Richardson、N. Dutton、P. Barber、D. D.-U. Li、K. Suhling、T. Ng、R. K. Henderson、S. M. Ameer-BegによるA high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging、Biomed Opt Express、２０１５年からは、空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）を用いて、２次元格子に配置されておりかつ試料内に結像される複数の照明点を生成する顕微鏡が公知である。試料から放射される蛍光は、点検出器の装置によって検出され、それぞれの照明点には点検出器が対応付けられている。

欧州特許出願公開第３２１７２０５号明細書からは、照明光ビームを生成する多色光源と、この照明光ビームを複数の照明光サブビームに分割する分割デバイスと、試料上または試料内のそれぞれの光点にこれらの照明光サブビームをガイドして集束する照明ビーム路と、を有する、マルチスポット走査顕微鏡法のための装置が公知である。複数の照明ビーム路のうちの少なくとも２つには、照明ビーム路にそれぞれ対応付けられる照明光サブビームのスペクトル組成を設定する、制御可能なビーム操作手段が含まれている。この装置にはさらに、試料上に光点をガイドする走査ユニットと、検出光を検出する検出ユニットと、走査ユニットおよび検出ユニットを制御する制御ユニットと、が含まれている。

本発明の課題は、波長の異なる光を用いて、試料を特に効率的に走査できるようにする方法および装置を示すことである。

この課題は、請求項１に記載された方法および請求項１１に記載された装置によって解決される。有利な発展形態は、従属請求項に示されている。

本発明による方法では、ドットパターンを形成するために少なくとも３つの照明点を生成する。試料の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域を走査することを目的として、ドットパターンの照明点にそれぞれ対応付けられている走査ラインを生成するために第１方向に沿い、また走査ラインにそれぞれ続いて生成される走査ラインを生成するために第２方向に沿って、照明点によって形成されるドットパターンを移動させる。ドットパターンは、第１波長を有する少なくとも２つの照明点と、第１波長とは異なる第２波長を有するただ１つの照明点と、を有する。

本明細書では、実質的に第１方向に延在する、試料の領域を走査ラインと称し、この領域は、第１波長を有する少なくとも２つの照明点および／または第２波長を有する照明点によって走査される。したがって、試料のあらかじめ定められた領域は、第２方向に沿って互いに連続する複数の走査ラインを有する。この領域は、ＲＯＩ（region of interest）と称されることも多い。

本発明による方法により、試料は、第１波長の少なくとも２つの照明点によって走査される。同時に試料は、第２波長を有する照明点によって走査される。種々異なる波長の照明点を使用することにより、特に、試料の種々異なる部分領域がマーキングされている種々異なる２つの蛍光塗料を励起することができる。これにより、例えば、種々異なる部分領域の位置および運動を互いに対して相対的に観察可能である。第１波長を有する２つの照明点を使用することにより、走査過程が並列化され、これにより、試料が第１波長の照明点によって走査される速度が高められる。高められたこの速度により、特に、試料における動的な過程、例えば生物学的過程を観察することができる。

したがって本発明による方法により、複数の照明点（いわゆるマルチスポット照明）から成るドットパターンによって試料を走査する方法の利点と、ただ１つの照明点（いわゆるシングルスポット照明）を利用する、試料を走査する方法の利点と、が結び付けられる。さらに、ただ１つのドットパターンだけを動かせばよいため、ドットパターンを移動させるためにただ１つの走査ユニットだけが必要である。したがって本発明による方法は、特に容易に実現することもできる。

好適には第１方向は、第２方向に対して垂直に延びている。このようなケースは、容易に実行可能であり、一般的な試料幾何学形状に使用可能である。択一的には、第１方向と第２方向とが、９０°とは異なる任意の別の角度を成すことも可能である。

第１方向および／または第２方向に沿ってドットパターンを移動する際に、あらかじめ定められた領域を連続的または段階的に走査すると有利である。連続的または段階的に走査することにより、後の検出方法において、画像ラインを生成するためのベースとして使用される複数の走査ラインが第１方向に沿って走査される。

特に有利であるのは、第２方向に沿ってドットパターンを移動する際に、第１波長を有する照明点により、ただ１回の走査パスで、あらかじめ定められた領域を完全に走査する場合であり、また第２方向に沿ってドットパターンを移動する際に、第２波長を有する照明点により、少なくとも２回の走査パスで、あらかじめ定められた領域を完全に走査する場合である。このために、連続する２つの走査パスの間で、少なくとも１つの走査ラインだけ、第２方向に沿ってドットパターンがシフトされる。

好適には、第２方向に沿ってドットパターンを移動する際に、第２波長を有する照明点により、第１波長を有する照明点の個数に対応する走査パスの回数で、あらかじめ定められた領域を完全に走査し、それぞれの走査パスの後、少なくとも１つの走査ラインだけドットパターンをシフトさせる。これにより、特に、第２波長を用いて、動的な過程が発生するいわば背景を観察することができる一方で、第１波長を用いて、試料における動的な過程の観察を行うことができる。

好適には、一走査ステップにおいて、第２方向に沿い、少なくとも２つの走査ラインだけドットパターンが移動されるように、第２方向に沿ってドットパターンを移動する。一走査ステップにおいて、第２方向に沿って少なくとも２つの走査ラインだけドットパターンが移動されると、あらかじめ定められた領域の、最大で２つ目毎の走査ラインが、第２波長を有する照明点によって走査される。

したがって本明細書において、走査パスとは、第１波長を有する照明点を用いて、あらかじめ定められた領域を完全に走査することであると理解される。この際、このような仕方により、あらかじめ定められた領域が、第１波長によって完全に走査される（すなわち走査ステップでカバーされる）のであれば、第２方向に沿った個々の走査パスには、ドットパターンの第２方向による移動も、第２方向とは反対の移動も共に含まれていてよい。例えば、ドットパターンをまず第２方向によって移動することも考えられ、この際には、あらかじめ定められた領域の個々の部分領域を飛び越して（すなわち走査しないで）、引き続いて往路移動の際に飛ばした部分領域を走査するために、第２方向とは逆にドットパターンを移動させる。走査パスの別の例は、第２方向によってドットパターンを移動することであり、この際には部分領域を飛び越し、次に第２方向とは逆方向に、出発位置（または別の適切な位置）に飛び越し、最初に飛び越した部分領域を走査する。走査ステップとは、走査ラインを生成するための、第２方向に沿ったドットパターンの移動のことであると理解され、このようにして生成される（走査パスの第１走査ステップの場合に除外された）走査ラインは、別の走査ラインに続く。

例えば、第２波長を有する照明点により、あらかじめ定められた領域の２つ目毎の走査ラインだけを走査する間に、第１走査パスにおいて、第１波長を有する照明点により、あらかじめ定められた領域のそれぞれの走査ラインを走査することが可能である。第１走査パスに続く第２走査パスでは、第１走査パスにおいて第２波長を有する照明点によって走査されなかった、あらかじめ定められた領域の走査ラインが走査される。好適にはこのために一走査パスの後、ドットパターンを一走査ラインだけ、第２方向または第２方向の逆に移動させる。後の検出方法においてこれらの走査ラインを画像ラインの生成のベースとして使用する場合、第２波長に対応付けられる画像毎に、第１波長に対応付けられる２つの画像が生成される。したがって、第１波長に対応付けられている画像の高い画像繰り返し率が実現される。第２波長に対応付けられる、画像の画像繰り返し率は、第１波長を有する照明点の個数に対応する倍数だけ小さい。

ドットパターンの照明点を第２方向に沿った一直線上に配置すると有利である。これにより、この方法が特に容易になる。というのは、２次元のドットパターンを生成して使用することは、１次元のドットパターンを生成するのに比べて比較的複雑だからである。

さらに、第１波長を有する照明点を等間隔に配置すると有利である。第１波長を有する照明点を等間隔に配置することは、ドットパターンの特に容易な形態である。択一的には、第１波長を有する照明点を複数のグループで配置することも可能であり、それぞれ１つのグループに対応付けられる、第１波長を有する照明点は、互いに第１間隔で等間隔に配置されているのに対し、これらのグループは、第１間隔とは異なる第２間隔を互いに有する（実施例についての図３を参照されたい）。

特に有利であるのは、第１波長を有する照明点間の、複数の走査ラインにおいて定められる間隔、および／または一走査ステップにおいて第２方向に沿ってドットパターンが移動される走査ラインの個数が、第１波長を有する照明点の個数に依存する場合である。ここで、２つの照明点間の走査ラインにおいて定められる間隔とは、２つの照明点のうちの１つが、他方の照明点の位置に到達するために、第２方向に沿って移動されなければならない、走査ラインの個数のことであると理解される。したがって直に連続する２つの走査ラインは、一走査ラインの間隔を有する。

例えば、第１波長を有する照明点間の、複数の走査ラインにおいて定められる間隔は、第１波長を有する照明点の個数＋１に等しい。この特性を有するドットパターンを利用する際には、それぞれの走査ステップにおいて、照明点の個数に対応して、第２方向に沿って走査ラインの個数だけドットパターンが移動される場合、第１波長を有する照明点により、一走査パスにおいて、あらかじめ定められた領域のすべての走査ラインを走査することができる。したがって第２波長を有する照明点によって、あらかじめ定められた領域を走査するためには、第１波長を有する照明点の個数に対応する、走査パスの回数が必要である。

さらに、第１波長を有する照明点と第２波長を有する照明点とが、重ならない照明点であると有利である。択一的には、第１波長を有する照明点と第２波長を有する照明点とは互いに重なり合ってよい。

本発明はさらに、ドットパターンを形成するために少なくとも３つの照明点を生成する照明ユニットを備えた、顕微鏡法において試料を走査する装置に関する。この装置は、照明ユニットを制御する制御ユニットを有し、制御ユニットは、照明ユニットを制御し、これにより、照明ユニットによって、試料の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域を走査することを目的として、ドットパターンの照明点にそれぞれ対応付けられている走査ラインを生成するために第１方向に沿い、また走査ラインにそれぞれ続いて生成される走査ラインを生成するために第２方向に沿い、照明点によって形成されるドットパターンが移動される。照明ユニットによって生成されるドットパターンは、第１波長を有する少なくとも２つの照明点と、第１波長とは異なる第２波長を有するただ１つの照明点と、を有する。好適には、照明ユニットは、第１方向および／または第２方向に沿ってドットパターンを移動する走査ユニットを有する。

本発明による装置は、第１波長の少なくとも２つの照明点により、また第２波長を有する１つの照明点により、試料を並列に走査する。種々異なる波長を有する照明点により、特に、例えば、試料の種々異なる２つの部分領域がマーキングされている異なる２つの蛍光色素の蛍光を励起することができる。第１波長を有する２つの照明点を設けることにより、走査過程が並列化され、これにより、試料が第１波長の照明点によって走査される速度が高められる。高められたこの速度により、特に、試料における動的な過程、例えば生物学的過程を観察することができる。

したがって本発明による装置により、複数の照明点から成るドットパターンによって試料を走査する装置の利点と、異なる波長を有する照明点を利用する、試料を走査する装置の利点と、が結び付けられる。

好適には、第１波長を有する照明点と第２波長を有する照明点とは重ならない照明点である。択一的には、第１波長を有する照明点と第２波長を有する照明点とは互いに重なり合っていてよい。

ドットパターンを生成するユニットが、少なくとも１つの第１波長選択ビームスプリッタを有すると有利である。これは、複雑なドットパターンを生成するためにも特に容易な選択肢である。第１波長選択ビームスプリッタは、例えば、第１波長を有する光に対して透過であってよく、第２波長を有する光を反射することができる。

さらに、第１光源ユニットにより、第１波長を有するビームが生成され、照明ユニットが、ビームマルチプリケーションユニットを有し、ビームマルチプリケーションユニットにより、第１波長を有するビームから、第１波長を有する複数の照明点が生成されると有利である。好適にはビームマルチプリケーションユニットに、少なくとも１つの音響光学変向器（ＡＯＤ：akustooptischer Deflektor）または少なくとも１つのビームスプリッタが含まれている。ＡＯＤを使用することにより、照明点間の間隔をフレキシブルに設定可能である。ビームスプリッタにより、複雑なドットパターンも生成可能である。

本発明はさらに、上述の形式の、試料を走査する装置を有する顕微鏡に関する。本発明による顕微鏡により、特に、試料における動的な過程、例えば生物学的過程を顕微鏡視的に観察することができる。

特に有利であるのは、顕微鏡が、第１波長に対応付けられる第３波長を有する、試料から放出される検出光を検出する第１検出ユニット、例えば空間分解能型面検出器と、第２波長に対応付けられる第４波長を有する、試料から放出される検出光を検出する第２検出ユニット、例えば空間分解能型でない点検出器と、を有する場合である。これにより、種々異なる２つの蛍光色素によってマーキングされている試料の、少なくとも２つの種々異なる部分領域を同時に顕微鏡視的に観察することができる。

本発明の別の特徴および利点は、実施例に基づきかつ添付の図面に関連して本発明を詳しく説明する以下の説明から明らかになる。

第１実施例にしたがい、第１波長を有する２つの照明点と第２波長を有する１つの照明点とによって、試料を走査する方法を示す図である。 第２実施例にしたがい、第１波長を有する３つの照明点と第２波長を有する１つの照明点とによって、試料を走査する方法を示す図である。 第３実施例にしたがい、第１波長を有する４つの照明点と第２波長を有する１つの照明点とによって、試料を走査する方法を示す図である。 第４実施例にしたがい、試料を走査する方法を示す図である。 第５実施例にしたがい、試料を走査する方法を示す図である。 一実施例にしたがい、試料を走査する装置を備えた顕微鏡の概略図である。

図１～図５には、種々異なる実施例に基づき、試料を走査する方法が示されている。この方法では、ドットパターンを形成するために、全体的に参照符号１２が付されておりかつＬ１Ｐ０、Ｌ１Ｐ１などで通し番号が振られた、第１波長Ｌ１を有する少なくとも２つの照明点と、第２波長Ｌ２を有する１つの照明点１３と、が生成される。以下では全体的に参照符号１０が付されているドットパターンは、試料１０２の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域４０を走査するために移動される。ドットパターン１０の移動は、ドットパターン１０の照明点１２、１３に対応付けられかつ以下では全体的に参照符号１４が付されている走査ラインを生成するために第１方向に沿って行われ、また走査ライン１４にそれぞれ続いて生成される走査ライン１４を生成するために第２方向に沿って行われる。

ドットパターン１０を移動させる際に、少なくとも１つのあらかじめ定められた領域４０が、第１方向に沿って連続的に走査され、第２方向に沿って段階的に走査される。第２方向に沿ったあらかじめ定められた領域４０の段階的な走査は、全体的に参照符号１６が付された走査ステップにおいて行われる。図１～図３では、第２方向に沿った、すなわち図１～図３において上から下への照明点１２、１３のそれぞれの位置は、時間的に連続しかつ０ではじまって通し番号が振られている複数の走査ステップ１６において示されている。

試料は、全体的に参照符号１８が付されておりかつ０ではじまって通し番号が振られている、時間的に連続する複数の走査パスにおいて走査される。それぞれの走査パス１８において、第１波長Ｌ１を有する照明点１２により、図１～図３においてそれぞれの走査パス１８の右側に示されているそれぞれ１つの第１走査領域４２が走査される。第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、それぞれの走査パス１８において、図１～図３において同様にそれぞれの走査パス１８の右側に示されているそれぞれ１つの第２走査領域４３が走査される。

図１には、第１実施例にしたがい、第１波長Ｌ１を有する２つの照明点１２と、第２波長Ｌ２を有する１つの照明点１３と、によって、試料を走査する方法が示されている。第１波長Ｌ１を有する２つの照明点１２は、第２方向に沿って３つの走査ライン１４の間隔で配置されている。第２波長Ｌ２を有する照明点１３は、第２方向において、第１波長Ｌ１を有する（Ｌ１Ｐ０によって番号付けされている）第１照明点１２に対して１つの走査ライン１４の間隔で配置されており、これにより、ドットパターン１０の３つの照明点１２、１３が、第２方向に沿って一直線上に配置されている。

第２方向に沿った、あらかじめ定められた領域４０の段階的な走査は、それぞれの走査ステップ１６において、第２方向に沿って２つの走査ライン１４だけドットパターン１０を移動することによって行われる。互いに対応する走査ステップ１６における、すなわち同じ通し番号を有する走査ステップ１６におけるドットパターン１０の位置は、（１が番号付けされている）第２走査パス１８において、（０が番号付けされている）第１走査ステップ１８に比べて、第２方向に１つの走査ライン１４だけシフトされている。

２つの走査パス１８のそれぞれにおいて、第１波長Ｌ１を有する照明点１２により、あらかじめ定められた領域４０を完全に含む第１走査領域４２が走査される。第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、それぞれの走査パス１８において、あらかじめ定められた領域４０の２つ目毎の走査ライン１４が走査される。連続する２つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、第３走査領域４４が走査され、この第３走査領域４４は、あらかじめ定められた領域４０を完全に含み、図１では最も右側に示されている。したがって、あらかじめ定められた領域４０は、連続する２つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３によって完全に走査される。

有利には、それぞれの走査パス１８において、検出によって得た結果を個々に使用可能である。これらの結果から、第１波長Ｌ１および第２波長Ｌ２に対応付けられる画像を生成可能である。第１波長Ｌ１に対応付けられる画像の表示は、走査パス１８の後毎に行うことができる。第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示は、２つ目の走査パス１８の後毎に行うことができる。したがって第１波長Ｌ１に対応付けられる画像の表示は、第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示の２倍の画像繰り返し率で行うことができる。

図２には、第２実施例にしたがい、試料を走査する方法が示されている。わかり易くするために図２は、一点鎖線において互いに隣接する３つの部分図２Ａ～部分図２Ｃに分けられている。図２に示された第２実施例は、試料１０２が、第１波長Ｌ１を有する３つの照明点１２と、第２波長Ｌ２を有する１つの照明点１３と、によって走査されることにより、図１に示された第１実施例と実質的に異なっている。ドットパターン１０の全部で４つの照明点１２、１３は、第２方向に沿って一直線上に配置されている。第１波長Ｌ１を有する３つの照明点１２は、第２方向に沿って４つの走査ライン１４の間隔で配置されている。第２波長Ｌ２を有する照明点１３は、第２方向において、第１波長Ｌ１を有する（Ｌ１Ｐ０によって番号付けされている）第１照明点１２に続いて１つの走査ライン１４の間隔で配置されている。

第２方向に沿った、あらかじめ定められた領域４０の段階的な走査は、図示された第２実施例において、それぞれの走査ステップ１６において、第２方向に沿って３つの走査ライン１４だけドットパターン１０を移動することによって行われる。互いに対応する走査ステップ１６における、すなわち同じ通し番号を有する走査ステップ１６におけるドットパターン１０の位置は、直に連続する走査パス１８において、第２方向の方向にそれぞれ１つの走査ライン１４だけシフトされている。

図２に示された第２実施例では、第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、それぞれの走査パス１８において、あらかじめ定められた領域４０の３つ目毎の走査ライン１４が走査される。したがって連続する３つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、第３走査領域４４が走査され、この第３走査領域４４は、あらかじめ定められた領域４０を完全に含み、図２Ｃでは最も右側に示されている。したがってあらかじめ定められた領域４０は、図２に示された第２実施例では、連続する３つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３によって完全に走査される。

したがって第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示は、図示された第２実施例において、３つ目の走査パス１８の後毎に行うことができる。したがって第１波長Ｌ１に対応付けられる画像の表示は、第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示の３倍の画像繰り返し率で行うことができる。

図３には、第３実施例にしたがい、試料を走査する方法が示されている。わかり易くするために図３は、一点鎖線において互いに隣接する４つの部分図３Ａ～部分図３Ｄに分けられている。図３に示された第３実施例は、試料１０２が、第１波長Ｌ１を有する４つの照明点１２と、第２波長Ｌ２を有する１つの照明点１３と、によって走査されることにより、図１に示された第１実施例と実質的に異なっている。ドットパターン１０の全部で５つの照明点１２、１３は、第２方向に沿って一直線上に配置されている。第１波長Ｌ１を有する４つの照明点１２は、第１波長Ｌ１を有するそれぞれ２つの照明点１２を有する２つのグループ２０に分けられている。２つのグループ２０のそれぞれの第１波長Ｌ１を有する２つの照明点１２は、第２方向に沿って２つの走査ライン１４の間隔で配置されている。２つのグループ２０は互いに、３つの走査ライン１４の間隔を有する。第２波長Ｌ２を有する照明点１３は、第２方向において、第１波長Ｌ１を有する（Ｌ１Ｐ０によって番号付けされている）第１照明点１２に対して１つの走査ライン１４の間隔で配置されている。

第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、それぞれの走査パス１８において、あらかじめ定められた領域４０の４つ目毎の走査ライン１４が走査される。したがって連続する４つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３により、第３走査領域４４が走査され、この第３走査領域４４は、あらかじめ定められた領域４０を完全に含み、図３Ｄでは最も右側に示されている。したがってあらかじめ定められた領域４０は、図３に示された第３実施例では、連続する４つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３によって完全に走査される。

図示された第３実施例において、第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示は、４つ目の走査パス１８の後毎に行うことができる。したがって第１波長Ｌ１に対応付けられる画像の表示は、第２波長Ｌ２に対応付けられる画像の表示の４倍の画像繰り返し率で行うことができる。

図４には、第４実施例にしたがい、試料を走査する方法が示されている。わかり易くするために図４は、一点鎖線において互いに隣接する４つの部分図４Ａ～部分図４Ｄに分けられている。図４に示された第４実施例は、４つの照明点１２が、第２方向に沿ってそれぞれ５つの走査ライン１４の間隔で等間隔に配置されていることにより、図３に示された第３実施例と実質的に異なっている。

したがってあらかじめ定められた領域４０は、図４に示された第４実施例では、図３に示された第３実施例と同じように、連続する４つの走査パス１８において、第２波長Ｌ２を有する照明点１３によって完全に走査される。

図５には、第５実施例にしたがい、試料を走査する方法が示されている。図５に示された第５実施例は、Ｌ１Ｐ０と記された第１波長Ｌ１を有する第１照明点とＬ１Ｐ１と記された第１波長Ｌ１を有する第２照明点とが、第２方向に沿って一直線上にないことにより、図１に示された第１実施例と実質的に異なっている。さらに、第１波長Ｌ１を有する第１照明点と第２波長Ｌ２を有するＬ２と記された照明点とは、部分的に重なり合っている。

図６には、一実施例にしたがい、試料１０２を走査する装置１１０を備えた顕微鏡１００の概略図が示されている。顕微鏡１００にはさらに、対物レンズ光学系１０４と、第１検出ユニット１０６と、第２検出ユニット１０８と、観察ビーム路１１２と、が含まれている。図６に示された顕微鏡１００は、特に、図１～図５に示された複数の実施例のうちの１つによる、本発明の方法を実施するのに適している。

試料１０２を走査する装置１１０には、ドットパターン１０を生成する照明ユニット１１４と、照明ユニット１１４を制御する制御ユニット１１６と、全体的に参照符号１１８によって示される、例えばレンズ、絞り、フィルタまたはプリズムのような別の光学素子と、が含まれている。

照明ユニット１１４は、第１波長Ｌ１を有する照明点１２を生成する第１光源ユニット１２０と、第２波長Ｌ２を有する照明点１３を生成する第２光源ユニット１２２と、を有する。照明ユニット１１４はさらに、ドットパターン１０を生成する第１波長選択ビームスプリッタ１２４を有する。第１光源ユニット１２０は、第１波長Ｌ１を有するビーム１２７を生成する第１光源１２６と、第１波長Ｌ１を有するビーム１２７から、第１波長Ｌ１を有する複数の照明点１２を生成するビームマルチプリケーションユニット１２８、例えばビームスプリッタまたは音響光学変向器（ＡＯＤ：akustooptischer Deflektor）と、を有する。照明ユニット１１４はさらに、第１方向および第２方向に沿ってドットパターン１０を移動する（例えば１つまたは複数の走査ミラーを含む）走査ユニット１３０を有する。図示された実施例において、走査ユニット１３０は、観察ビーム路１１２の外部に配置されている。択一的には走査ユニット１３０は、観察ビーム路１１２内に配置することができ、これにより、試料１０２から放出される検出光１３８、１３９が戻る際の走査移動もしくはスキャン移動が廃止される。これは一般に「内部」（"descanned"）配置とも称される。

制御ユニット１１６は、走査ユニット１３０により、試料１０２の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域４０を走査するドットパターン１０が、ドットパターン１０の照明点１２、１３にそれぞれ対応付けられている走査ライン１４を生成するために第１方向に沿い、また走査ライン１４にそれぞれ続いて生成される走査ライン１４を生成するために第２方向に沿って移動される、ように照明ユニット１１４の走査ユニット１３０を制御する。

観察ビーム路１１２は、試料１０２と第１検出ユニット１０６との間にある。観察ビーム路１１２には、対物レンズ光学系１０４と、第２波長選択ビームスプリッタ１３２と、第３波長選択ビームスプリッタ１３４と、全体的に参照符号１３６で示される、例えばレンズ、絞り、フィルタまたはプリズムのような別の光学素子と、が配置されている。

第２波長選択ビームスプリッタ１３２は、第１波長Ｌ１を有する光および第２波長Ｌ２を有する光を反射し、第１波長Ｌ１に対応付けられる第３波長Ｌ１’を有する光に対して透過である。第２波長選択ビームスプリッタ１３２により、照明ユニット１１４によって生成されたドットパターン１０が、照明ビーム路としても使用される観察ビーム路１１２に入力結合され、対物レンズ光学系１０４の方向に反射される。

対物レンズ光学系１０４は、試料１０２上に、または試料１０２内にドットパターン１０を結像する。そこではドットパターン１０により、第３波長Ｌ１’を有する検出光１３８および第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９を放射させるために色素が励起される。試料１０２から放出される、第３波長Ｌ１’を有する検出光１３８と、試料１０２から放出される、第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９と、は、対物レンズ光学系１０４によって観察ビーム路１１２に導かれる。

第３波長選択ビームスプリッタ１３４は、第４波長Ｌ２’を有する光を反射し、第１波長Ｌ１を有する光と第２波長Ｌ２を有する光と第３波長Ｌ１’を有する光とに対しては透過である。第３波長選択ビームスプリッタ１３４により、試料１０２から放出される、第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９は、観察ビーム路１１２から出力結合されて、第２検出ユニット１０８に導かれる。

第１検出ユニット１０６は、第３波長Ｌ１’を有する光に対してのみ透過である第１放射フィルタ１４０と、例えばＣＣＤチップとして構成されている第１センサ素子１４２と、を有する。第１センサ素子１４２により、試料１０２から放出される、第３波長Ｌ１’を有する検出光１３８が検出される。第１センサ素子１４２によって検出される、第３波長Ｌ１’を有する検出光１３８は、特に、第１波長Ｌ１に対応付けられる画像を生成するためのベースとして使用可能である。択一的には第１センサ素子１４２が、複数の点検出器を有することも可能であり、この際には、第１波長Ｌ１を有するそれぞれの照明点１２に、固有の点検出器が対応付けられる。

第２検出ユニット１０８は、第４波長Ｌ２’を有する光に対してのみ透過である第２放射フィルタ１４４と、例示的には１チャネル検出器として構成されている第２センサ素子１４６と、全体的に参照符号１４８で示される、例えばレンズ、絞り、フィルタまたはプリズムのような別の光学素子と、を有する。第２センサ素子１４６により、試料１０２から放出される、第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９が検出される。第２センサ素子１４６によって検出される、第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９は、特に、第２波長Ｌ２に対応付けられる画像を生成するためのベースとして使用可能である。

顕微鏡１００の択一的な一実施形態では、第３波長Ｌ１’を有する検出光１３８も、第４波長Ｌ２’を有する検出光１３９も共に第１センサ素子１４２によって検出される。したがって択一的なこの実施形態による顕微鏡１００は、第２検出ユニット１０８を必要とせず、波長選択ビームスプリッタ１３４を必要としない。択一的なこの実施形態において、第２波長選択ビームスプリッタ１３２は、第２波長Ｌ２に対応付けられる第４波長Ｌ２’を有する光に対しても透過である。択一的なこの実施形態による顕微鏡１００は、第１放射フィルタ１４０の代わりに、第３波長Ｌ１’および第４波長Ｌ２’にしたがって、第１検出ユニット１０６に入射する光を分離する画像分離装置（"image splitting device"）を有する。

１０ ドットパターン
１２、１３ 照明点
１４ 走査ライン
１６ 走査ステップ
１８ 走査パス
２０ グループ
１００ 顕微鏡
１０２ 試料
１０４ 対物レンズ光学系
１０６、１０８ 検出ユニット
１１０ 装置
１１２ 観察ビーム路
１１４ 照明ユニット
１１６ 制御ユニット
１１８、１３６、１４８ 光学素子
１２０、１２２ 光源ユニット
１２４、１３２、１３４ 波長選択ビームスプリッタ
１２６ 光源
１２７ ビーム
１２８ ビームマルチプリケーションユニット
１３０ 走査ユニット
１３８、１３９ 検出光
１４０、１４４ 放射フィルタ
１４２、１４６ センサ素子

Claims (18)

1. 顕微鏡法において試料（１０２）を走査する方法であって、
   ドットパターン（１０）を形成するために少なくとも３つの照明点（１２、１３）を生成し、
   前記ドットパターン（１０）の前記照明点（１２、１３）にそれぞれ対応付けられている走査ライン（１４）を生成するために第１方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動させ、前記走査ライン（１４）を第２方向に順次ずらして、各位置において前記第１方向に走査を行うことで前記試料（１０２）の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域（４０）を走査し、前記走査ライン（１４）を前記第２方向に順次ずらす際、少なくとも１つの走査ライン（１４）の間隔をあけてずらし、
   前記ドットパターン（１０）は、第１波長（Ｌ１）を有する少なくとも２つの照明点（１２）と、前記第１波長（Ｌ１）とは異なる第２波長（Ｌ２）を有するただ１つの照明点（１３）と、を有し、
   前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）により、ただ１回の走査の繰り返し（１８）で、あらかじめ定められた前記領域（４０）を完全に走査し、
   前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、前記第２波長（Ｌ２）を有する前記照明点（１３）により、少なくとも２回の走査の繰り返し（１８）で、あらかじめ定められた前記領域（４０）を完全に走査する、
   方法。
2. 前記第１方向および／または前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、あらかじめ定められた前記領域（４０）を連続的に走査する、
   請求項１記載の方法。
3. 前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、前記第２波長（Ｌ２）を有する前記照明点（１３）により、前記第１波長（Ｌ１）を有する照明点（１２）の個数に一致する走査の繰り返し（１８）の回数で、あらかじめ定められた前記領域（４０）を完全に走査する、
   請求項１または２記載の方法。
4. 一走査ステップ（１６）において、前記第２方向に沿い、少なくとも２つの走査ライン（１４）だけ前記ドットパターンが移動されるように、前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記ドットパターン（１０）の前記照明点（１２、１３）を前記第２方向に沿った一直線上に配置する、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）を等間隔に配置する、
   請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）間の、前記走査ライン（１４）において定められる間隔、および／または一走査ステップ（１６）において前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）が移動される走査ライン（１４）の個数は、前記第１波長（Ｌ１）を有する照明点（１２）の個数に依存する、
   請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）間の、複数の走査ライン（１４）において定められる前記間隔は、前記第１波長（Ｌ１）を有する照明点（１２）の個数＋１に等しい、
   請求項７記載の方法。
9. 前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）と前記第２波長（Ｌ２）を有する前記照明点（１３）とは、重ならない照明点である、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. 顕微鏡法において試料（１０２）を走査する装置（１１０）であって、
    前記装置（１１０）は、ドットパターン（１０）を形成するために少なくとも３つの照明点（１２、１３）を生成する照明ユニット（１１４）を備えており、
    前記装置（１１０）は、前記照明ユニット（１１４）を制御する制御ユニット（１１６）を有し、前記制御ユニット（１１６）は、前記照明ユニット（１１４）を制御し、これにより、前記照明ユニット（１１４）によって、前記ドットパターン（１０）の前記照明点（１２、１３）にそれぞれ対応付けられている走査ライン（１４）を生成するために第１方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動させ、前記走査ライン（１４）を第２方向に順次ずらして、各位置において前記第１方向に走査を行うことで前記試料（１０２）の少なくとも１つのあらかじめ定められた領域（４０）を走査し、前記走査ライン（１４）を前記第２方向に順次ずらす際、少なくとも１つの走査ライン（１４）の間隔をあけてずらし、
    前記照明ユニット（１１４）によって生成される前記ドットパターン（１０）は、第１波長（Ｌ１）を有する少なくとも２つの照明点（１２）と、前記第１波長（Ｌ１）とは異なる第２波長（Ｌ２）を有する１つの照明点（１３）と、を有し、
    前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）により、ただ１回の走査の繰り返し（１８）で、あらかじめ定められた前記領域（４０）を完全に走査し、
    前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する際に、前記第２波長（Ｌ２）を有する前記照明点（１３）により、少なくとも２回の走査の繰り返し（１８）で、あらかじめ定められた前記領域（４０）を完全に走査する、
    装置（１１０）。
11. 前記照明ユニット（１１４）は、前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）を生成する第１光源ユニット（１２０）と、前記第２波長を有する前記照明点を生成する第２光源ユニットと、を有し、前記照明ユニット（１１４）は、前記ドットパターン（１０）を生成するユニットを有する、
    請求項１０記載の装置（１１０）。
12. 前記ドットパターン（１０）を生成する前記ユニットは、少なくとも１つの第１波長選択ビームスプリッタ（１２４）を有する、
    請求項１１記載の装置（１１０）。
13. 前記第１光源ユニット（１２０）により、前記第１波長（Ｌ１）を有するビーム（１２７）が生成され、前記照明ユニット（１１４）は、ビームマルチプリケーションユニット（１２８）を有し、前記ビームマルチプリケーションユニット（１２８）により、前記第１波長（Ｌ１）を有する前記ビーム（１２７）から、前記第１波長（Ｌ１）を有する複数の前記照明点（１２）が生成される、
    請求項１１または１２記載の装置（１１０）。
14. 前記ビームマルチプリケーションユニット（１２８）に、少なくとも１つの音響光学変向器（ＡＯＤ：akustooptischer Deflektor）または少なくとも１つのビームスプリッタが含まれている、
    請求項１３記載の装置（１１０）。
15. 前記照明ユニット（１１４）は、前記第１方向および／または前記第２方向に沿って前記ドットパターン（１０）を移動する走査ユニット（１３０）を有する、
    請求項１０から１４までのいずれか１項記載の装置（１１０）。
16. 前記第１波長（Ｌ１）を有する前記照明点（１２）と前記第２波長（Ｌ２）を有する前記照明点（１３）とは、重ならない照明点である、
    請求項１０から１４までのいずれか１項記載の装置（１１０）。
17. 請求項１０から１６までのいずれか１項記載の装置（１１０）を有する顕微鏡。
18. 前記顕微鏡は、
    前記第１波長（Ｌ１）を前記試料（１０２）に照射した際に検出される第３波長（Ｌ１’）を有する、前記試料（１０２）から放出される検出光（１３８）を検出する第１検出ユニット（１０６）と、
    前記第２波長（Ｌ２）を前記試料（１０２）に照射した際に検出される第４波長（Ｌ２’）を有する、前記試料（１０２）から放出される検出光（１３９）を検出する第２検出ユニット（１０８）と、
    を有する、
    請求項１７記載の顕微鏡。

Images