JP7203427B2 - ヒト人工多能性幹細胞を操作して肝臓組織を作製する方法 - Google Patents

Description

関連出願の引用
本願は、２０１７年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／４５９，００３号の利益を主張する。この出願の全体は、本明細書に参考として援用される。

分野
本願は、幹細胞の分野、詳細には、人工多能性幹細胞からヒト肝細胞を作製するための方法に関する。

政府支援の謝辞
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＤＫ０９９２５７の下、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

背景
肝臓移植は、生体ドナーもしくは死体ドナー由来の肝臓の一部または死体全肝を用いる、重篤な末期肝疾患に対する唯一の治癒的療法である。肝臓移植待機者名簿に掲載されている人の３分の１しか、移植を受けられず、肝臓の需要は、次の２０年間で２３％上昇すると予測されている。臓器の入手可能性は、実施可能な肝臓移植の数の制約条件となっている。

ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、自己の細胞／操作された肝臓の治療および疾患モデリングに対して肝細胞の供給源を提供することによって、肝疾患の研究および治療に一大革命を起こす可能性がある。しかしながら、インビトロではヒトｉＰＳＣを肝細胞（ｉＰＳＣ－Ｈｅｐ）に分化させることが進展しているにもかかわらず、ヒト初代成体肝細胞がインビボにおいて増殖して肝臓に完全に取って代わるその能力を再現し、臨床適用にとって十分な細胞数を生成する細胞には、到達していない。さらに、ｉＰＳＣから肝細胞への分化を指示するためのプロトコルは、たいてい、最適以下の肝機能しか有しない未熟な表現型をもたらした。これらの欠損は、ヒト肝疾患をげっ歯類において再現しようとする試みを阻み、ｉＰＳＣ－Ｈｅｐの臨床上の潜在性に対する懐疑論の原因となった。機能的な人工多能性幹細胞由来肝細胞（ｉＰＳ－Ｈｅｐ）が無限に入手可能になるならば、肝臓の再増殖（repopulation）および操作された肝臓組織が、そのタスクに最適である。自己の組織から、機能する肝臓細胞の即時に入手可能かつ無尽蔵の供給源を作り出せれば、肝不全を有する患者において早期の介入が可能になる。近年のゲノム編集技術の進歩と組み合わせることで、そのような肝臓細胞は、荒廃した肝臓に基づく先天性代謝異常を処置するために広く使用でき、生涯にわたる免疫抑制薬のレジメンの必要性および免疫抑制薬の合併症を取り除く。したがって、正常な成体肝細胞と同一の機能および再生－反応性を有するヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐを臨床的に妥当な数で確実に作製するための有効な系が必要とされている。

要旨
１つの実施形態において、ヒト肝細胞を作製するための方法が本明細書中に開示される。その方法は、ａ）有効量のアクチビンＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４を含む第１の培地中でヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を約２～約３日間培養して、中内胚葉細胞を作製する工程；ｂ）ＦＧＦ－２およびＢＭＰ－４の非存在下において有効量のアクチビンＡを含む第２の培地中でその中内胚葉細胞を約２～約３日間培養して、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）細胞を作製する工程；ｃ）有効量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む第３の培地中でその胚体内胚葉を約８～約１４日間培養して、肝臓前駆細胞を作製する工程であって、その培地は、低グルコース培地である、工程；ｄ）有効量のＨＧＦ、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏ ｄｅｏｘｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コレステロール、パルミチン酸、オレイン酸、リファンピシンを含む第４の培地中でその肝臓前駆細胞を培養して、ヒト肝細胞を作製する工程であって、第４の培地は、低グルコース培地である、工程を含む。その方法は、免疫無防備状態の動物においてヒト肝細胞を拡大する工程も含み得る。

別の実施形態において、ヒト肝細胞を作製するための方法が開示され、その方法は、ａ）有効量のアクチビンＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４を含む第１の培地中でヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を約２～約３日間培養して、中内胚葉細胞を作製する工程；ｂ）ＦＧＦ－２およびＢＭＰ－４の非存在下において有効量のアクチビンＡを含む第２の培地中でその中内胚葉細胞を約２～約３日間培養して、胚体内胚葉細胞を作製する工程；ｃ）有効量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む第３の培地中でその胚体内胚葉を約８～約１４日間培養して、肝臓前駆細胞を作製する工程であって、その培地は、低グルコース培地（０．２～２グラム／リットルのグルコース）である、工程；およびｄ）その肝臓前駆細胞を免疫無防備状態の非ヒトトランスジェニック動物の肝臓に移植する工程；およびｅ）その免疫無防備状態の非ヒトトランスジェニック動物の肝臓から肝細胞を回収する工程を含む。１つの非限定的な具体例では、そのトランスジェニック動物は、肝細胞において発現される誘導性Ｃａｓｐ９導入遺伝子を有するＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットである。

なおも別の実施形態では、トランスジェニックラットが開示され、そのトランスジェニックラットは、融合タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結された、肝臓において発現されるプロモーター（例えば、アルブミンプロモーターもしくはトランスサイレチンプロモーターおよび／またはアルファ－１－抗トリプシンプロモーター）を含む導入遺伝子を有するＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットであり、その融合タンパク質は、ＦＫＢＰ１２およびカスパーゼ９を含み、そのトランスジェニックラットの肝臓においてヒト肝細胞が拡大され得る。

本発明の上記のおよび他の目的、特徴および利点は、添付の図面に照らして進める以下の詳細な記載からさらに明らかになる。

ヒトｉＰＳ－ｈｅｐを用いた、免疫無防備状態のラットにおける肝臓再増殖のためのワークフローの模式図。

ヒトｉＰＳＣを用いた肝臓分化の１つの方法の模式図。限定培地を細胞上に順次加えて、胚体内胚葉（ステージ１および２）を惹起し、肝特異化（ステージ３）を誘導する。ステージ３の終わりに、ｉＨｅｐ細胞を剥離し、サイズによって選別して、再播種する。それらの細胞に、肝成熟化（ステージ４）を誘導するための限定培地を加える。

単一細胞継代の１日後のｈＩＰＳＣの光学顕微鏡写真。

図４Ａ～４Ｂ。ステージ２（図２を参照のこと）の後のｈＩＰＳＣの胚体内胚葉の特徴づけ。Ａ）胚体内胚葉誘導後の細胞におけるＳＯＸ１７の免疫蛍光法。核をＤＡＰＩで対比染色した。Ｂ）ＲＴｑＰＣＲによって評価した、多能性細胞および胚体内胚葉細胞におけるＯｃｔ３／４およびＳＯＸ１７の発現。

ヒト肝臓遺伝子の遺伝子アレイ。肝臓遺伝子を発生中のそれらの発現に従ってクラスター化したところ、それらの遺伝子は、相対的な経路発現と関連した。発生の後期に発現した経路を同定し、それらの発現に従って分類した。

肝特異化細胞として定義される肝特異化（ステージ３）中のヒトｉＰＳ細胞の特徴づけ。ヒト成体肝細胞、ヒト胎児肝細胞およびステージ３のｉＰＳＣ由来肝細胞（ｉＨｅｐ）の細胞におけるＨＮＦ４（緑色）、アルブミン（緑色）およびαフェトプロテイン（赤色）の免疫蛍光法。核をＤＡＰＩで対比染色した。

肝特異化細胞として定義される肝特異化（ステージ３）後のヒトｉＰＳ細胞の遺伝子発現の特徴づけ。未分化ヒトｉＰＳ細胞、胚体内胚葉細胞、およびＤｕｎｃａｎプロトコル（Ｓｉ－Ｔａｙｅｂら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５１（１）：２９７－３０５，２０１０を参照のこと）として知られる公知の公開プロトコル（２つの異なるステージ；２および３において）、本開示のプロトコル（ステージ３）を用いて肝細胞に分化したヒトｉＰＳ細胞、ｉＣｅｌｌ－ｈｅｐ（ＣＤＩ）、ヒト胎児肝細胞およびヒト成体肝細胞におけるＲＴｑＰＣＲによって評価された、発生因子（Ｏｃｔ３．４、ＳＯＸ１７）、肝臓核因子（ＨＮＦ４、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１ａ、ＦＯＸＡ１）および肝臓特異的代謝因子（ＰＰＡＲａ、ＬＸＲ、ＣＡＲ、Ｃｅｂｐａ）の発現。

ｉＨｅｐとして定義される肝成熟化（ステージ４）後のヒトｉＰＳ細胞の遺伝子発現。ヒト成体肝細胞、ヒト胎児肝細胞およびステージ４のｉＨｅｐ細胞におけるＨＮＦ４（緑色）、アルブミン（緑色）およびαフェトプロテイン（赤色）の免疫蛍光法。核をＤＡＰＩで対比染色した。

ヒト新鮮成体肝細胞、ヒトＩＰＳＣおよびヒトｉＨｅｐ細胞（ステージ４、本開示の方法）におけるｍｉｒ－１２２の相対的発現。

肝成熟化後のｉＨｅｐ（ステージ４）の大集団および小集団の遺伝子発現。ヒトｉＰＳ細胞の肝特異化（ステージ３）の後、得られた細胞を回収し、重量に基づく遠心分離によって大集団（細胞ペレット）と小集団（上清中の細胞）とに分離する。次いで、両方の集団を肝成熟化（ステージ４）に供する。次いで、ステージ４の細胞の小集団および大集団における肝臓の核因子（ＨＮＦ４、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１）および代謝因子（ＰＰＡＲａ、ＰＸＲ、ＬＸＲ、ＣＡＲ、ＲＸＲ、ＡＢＣＡ１、ｃＭＥＴ、ＵＧＴＡ１、ＦＡＨ、Ｃｅｂｐａ）の発現を、ＲＴｑＰＣＲによってヒト成体肝細胞と比較して評価した。大集団および小集団は、遺伝子発現およびミトコンドリア量に基づいて決定される。

図１１Ａ～１１Ｂ。ｉＨｅｐの小集団および大集団（ステージ４）におけるミトコンドリアプロファイルの特徴づけ。Ａ）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ色素によるミトコンドリアの蛍光。核をＤＡＰＩで対比染色した。Ｂ）ミトコンドリアＤＮＡの相対的発現を、ｑＰＣＲによって評価した。

ｉＨｅｐの小集団および大集団（ステージ４）の脂質プロファイルの特徴づけ。１００万個の細胞あたりのｍｍｏｌ単位での細胞内の脂質含有量。

図１３Ａ～１３Ｂ。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞において、構築物の機能性を証明できた。エタノールによって刺激された細胞と比べて、ｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ Ｃａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞では１ｎｍｏｌ／ｌの最大量でＡＰ１９０３の効果があった。エタノールで処置された細胞と同様に、ＡＰ１９０３で処置されたがトランスフェクトされていない細胞も、いかなる効果も示さなかった。（Ｂ）次いで、肝臓特異的発現のためのアルブミンプロモーターの制御下Ｃａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのためのプラスミドを作製した。 図１３Ａ～１３Ｂ。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞において、構築物の機能性を証明できた。エタノールによって刺激された細胞と比べて、ｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ Ｃａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞では１ｎｍｏｌ／ｌの最大量でＡＰ１９０３の効果があった。エタノールで処置された細胞と同様に、ＡＰ１９０３で処置されたがトランスフェクトされていない細胞も、いかなる効果も示さなかった。（Ｂ）次いで、肝臓特異的発現のためのアルブミンプロモーターの制御下Ｃａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのためのプラスミドを作製した。

両方のプラスミドによってコードされる遺伝子（ｉＣＡＳＰ９およびｅＧＦＰ）が、トランスフェクトされたＨ４－ＩＩ－Ｅ－Ｃ３細胞において十分に発現される。

図１５Ａ～１５Ｂ。Ｉｌ２ｒｇ（Ａ）およびＲａｇ２（Ｂ）遺伝子に対する標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性変異についての配列決定アッセイ。複数の欠失および挿入がそれぞれダッシュおよび文字によって描かれており、最上部の行に示されているＷＴ配列（配列番号３４および３５）とアラインメントされている。配列番号３４および３６～４６が、図１５Ａに示されており、配列番号３５および４７～４８が、図１５Ｂに示されている。

ヒト胎児肝細胞（２１週齢）およびヒトｉＨｅｐ（本開示の方法）の移植は、特異的なヒトアルブミンの発現によって示されるように、３０日後、生着および再増殖しているヒト肝細胞の大コロニーの存在を実証した。さらに、同様のレベルの、ＨＮＦ４遺伝子のゲノムＤＮＡが、３０日後の移植肝臓において検出された。

ＸＳＣＩＤ移植ラットの肝臓におけるヒト特異的マーカーの存在を裏付けるために、ヒト特異的ミトコンドリアおよび特異的ヒトシトクロムＣＹＰ３Ａ４も使用する。３つのヒト特異的マーカーの発現は、再増殖コロニーの同様のパターンに従う。

レトロルシン／肝切除術によって前処置され、本方法（本開示の方法）、Ｄｕｎｃａｎのプロトコルのいずれかおよび商業的に入手可能なヒトｉＰＳ－肝細胞（ＣＤＩ，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いてヒトｉＨｅｐを移植されたＸＳＣＩＤラット肝臓の免疫組織化学解析。

図１９Ａ～１９Ｂ。ｈｉＰＳ－ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９／ＧＦＰの特徴づけ。Ａ）ドキシサイクリンを用いたときおよび用いないときの、ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ細胞の明視野顕微鏡法および蛍光顕微鏡法。Ｂ）ＲＴｑＰＣＲによって評価された、ドキシサイクリンを用いたときおよび用いないときの、ｈｉＰｓ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９／ＧＦＰ細胞におけるＣａｓ９／ＧＦＰシステムの相対的発現。

図２０Ａ～２０Ｂ。ｈｉＰＳ－ｓｈＭＩＲ－ＳＩＲＴ１細胞におけるＳＩＲＴ１ノックダウンの特徴づけ。Ａ）ＲＴｑＰＣＲによって評価された、ドキシサイクリンを用いたときおよび用いないときの、ｈｉＰＳ－ｓｈＭＩＲ－ＳＩＲＴ１クローンにおけるＳＩＲＴ１発現量。Ｂ）ドキシサイクリンを用いたときおよび用いないときの、ｈＦＦ－ｓｈＭＩＲ－ＳＩＲＴ１、ｈｉＰＳ－ｓｈＭＩＲ－ＳＩＲＴ１およびｈｉＰＳ－ＴａｇＲＦＰにおけるＳＩＲＴ１発現のウエスタンブロット解析。ＧＡＤＰＨをローディングコントロールとして使用した。

ｐＥＡＬＢ１２３－ｉＣａｓｐ９＿ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドの模式図。

図２２Ａ～２２Ｂ。肝臓再増殖の前および後のヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐ（本開示の方法）の機能的な肝成熟化。（Ａ）肝臓指向性の分化プロトコルの終わりに、ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐは、成熟ヒト特異的シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）を発現せず、アルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）および尿素を、単離されたばかりのヒト胎児肝細胞（在胎齢２２週）のレベルで産生しなかった（各群ｎ＝３）。（Ｂ）ちょうど３０日（ｄ）後に、再生中のラット肝臓では、ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐのコロニーが、成熟酵素ＣＹＰ３Ａ４を発現した。

図２３Ａ～２３Ｂ。ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐおよびヒト初代胎児ｈｅｐの増殖。（Ａ）初代ヒト胎児肝細胞は、恒常的に複製する。ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐおよびヒト初代胎児ｈｅｐ（各群ｎ＝３）のいずれかの培養中の増殖能を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）免疫蛍光法（明ドット（ｂｒｉｇｈｔ ｄｏｔｓ））標識によって１２時間（ｈ）にわたって測定し、定量した。ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐは、肝臓分化後に恒常的な増殖を示した。スケールバー：１００ｕｍ。（Ｂ）ＢｒｄＵで標識された細胞のパーセンテージのグラフが提供されている。３つの異なる区域、および１区域あたり少なくとも１００個のＢｒｄＵ免疫蛍光法で陽性の核を定量した。

図２４Ａ～２４Ｂ。ヒト成体肝細胞、ヒト胎児肝細胞およびヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐの、免疫無防備状態のラットにおけるロバストな肝臓再増殖。（Ａ）ラット動物に、ヒト成体肝細胞（ｎ＝２５）、胎児肝細胞（ｎ＝２３）またはヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐ（開示のプロトコル）のいずれかを移植した。ヒト特異的アルブミンの免疫組織化学によって示されるように、９０日に、肝臓の（or the liver）ほぼ８０％が、ヒト成体肝細胞またはヒト胎児肝細胞に取って代わられ、肝臓のほぼ７０％が、ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐ（開示のプロトコル）に取って代わられた。（Ｂ）移植の９０日後にヒトアルファ１抗トリプシンを測定するための酵素結合免疫吸着測定法は、ラット肝臓内にヒト肝細胞が存在することを裏付けた。ＥＬＩＳＡによって血清をアルファ１抗トリプシンについて解析した（ｎ＝４、各実験群）。

図２５Ａ～２５Ｂ。ラットからのヒト化肝臓の単離。（Ａ）ラット肝臓にコラゲナーゼ溶液を灌流して、単一細胞をもたらす。（Ｂ）消化された肝臓を濾過し、遠心分離して、肝細胞だけを精製する。

図２６Ａ～２６Ｂ。ヒト肝細胞の磁気ベースの精製。（Ａ）得られた単一細胞懸濁物を、磁気活性化細胞選別を用いてラット細胞を枯渇させるための磁気マイクロビーズを含むラット特異的抗体で標識する。（Ｂ）得られた細胞懸濁物は、ラットＭＨＣクラス１に対する抗体（ＲＴ１Ａ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて免疫磁気標識され得る。次いで、細胞をＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）において陽性画分と陰性画分とに選別する。抗体濃度および磁気カラムが異なる種々のプロトコル（Ａ～Ｆ群）を試験し、ヒト細胞が高富化されるように最適化したところ、ＦＡＣＳ解析によって示されるとおり、最良に最適化されたプロトコルでは、収集された陰性細胞画分において最大９９．９％のヒト細胞に達した。 図２６Ａ～２６Ｂ。ヒト肝細胞の磁気ベースの精製。（Ａ）得られた単一細胞懸濁物を、磁気活性化細胞選別を用いてラット細胞を枯渇させるための磁気マイクロビーズを含むラット特異的抗体で標識する。（Ｂ）得られた細胞懸濁物は、ラットＭＨＣクラス１に対する抗体（ＲＴ１Ａ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて免疫磁気標識され得る。次いで、細胞をＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）において陽性画分と陰性画分とに選別する。抗体濃度および磁気カラムが異なる種々のプロトコル（Ａ～Ｆ群）を試験し、ヒト細胞が高富化されるように最適化したところ、ＦＡＣＳ解析によって示されるとおり、最良に最適化されたプロトコルでは、収集された陰性細胞画分において最大９９．９％のヒト細胞に達した。

配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されているように、ヌクレオチド塩基に対しては標準的な文字略語およびアミノ酸に対しては３文字コードを用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖だけしか示されていないが、相補鎖は、表示された鎖の参照によって包含されると理解される。配列表は、参照により本明細書中に援用されるＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １３，２０１８，７２．０ＫＢ］として提出される。

詳細な説明
免疫不全マウスを機能的に再増殖させることができることは、肝臓再増殖ができない肝細胞様細胞と対比して肝細胞を作製したことに対するベンチマークになった。これまで、幹細胞由来のヒト肝細胞様細胞の生着は、限定的でしかなかったことが報告されている。ヒト人工多能性細胞を利用して、免疫無防備状態の動物において肝臓を再増殖させ得る肝細胞および肝細胞前駆細胞を作製する効率的な肝分化プロトコルが、本明細書中に開示される。免疫無防備状態のラットモデルの開発も開示され、そのラットモデルでは、肝細胞が、これらのラットの肝臓に生着し得、拡大し得、再増殖し得る。

本開示の方法を用いると、自家移植によって肝不全を処置するための前臨床ステップとして、ヒト肝細胞を作製することができる。さらに、異種核酸（例えば、Ｃａｓ９またはｓｈＲＮＡをコードする核酸に作動可能に連結されたドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｌｉｎｅ）プロモーターであるがこれらに限定されない）を含むヒトｉＰＳ細胞の操作も開示される。次いで、これらの細胞は、ｓｇＲＮＡをコードする核酸を導入することによって目的の任意の遺伝子を標的とするため、または移植および肝臓再増殖の後に目的の任意の遺伝子をダウンレギュレートするために使用することができる（例えば、図１を参照のこと）。

用語
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版されたＫｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版されたＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の再調査を容易にするために、以下に特定の用語の説明を提供する：

アクチビン：細胞の分化および増殖を含むいくつかの生物学的プロセスの制御に関与する、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーのメンバー。アクチビンＡは、膜貫通レセプターセリン／トレオニンキナーゼの複合体を介してその生物学的作用を媒介し、特定のアクチビンＡレセプターに結合する、このファミリーのメンバーである。それは、２つのサブユニットから構成される二量体である。アクチビンＡは、ＰＯＵクラス５ホメオボックス１（Ｏｃｔ－３／４）、ｎａｎｏｇ、ｎｏｄａｌおよびｎｏｄａｌシグナル伝達制御因子、左右決定因子１および２（Ｌｅｆｔｙ－ＢおよびＬｅｆｔｙ－Ａ）のような多能性のマーカーのＳＭＡＤ依存性活性化転写を介して幹細胞維持の制御に関与する。アクチビンＡは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンなどのいくつかのホルモンの転写も刺激する。アクチビンＡに対する例示的な配列は、２０１７年１月２０日に利用可能であるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２１９２（参照により本明細書中に援用される）に提供されている。

変更する：有効量の目的の物質またはパラメータ（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞の特性）の変化。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは酵素活性の変更は、細胞の生理学的特性（例えば、細胞の分化、増殖または老化）に影響し得る。その物質の量は、生成される物質の量の差異、所望の機能を有する物質の量の差異またはその物質の活性化の差異によって、変化し得る。その変化は、増加または減少であり得る。その変更は、インビボまたはインビトロにおけるものであり得る。いくつかの実施形態において、変更することは、物質の有効量（レベル）、細胞の増殖および／もしくは生存、または酵素などのタンパク質の活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の増加または減少である。

動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。哺乳動物という用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方を含む。

生物学的サンプルまたはサンプル：被験体の細胞、組織または体液（例えば、末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄、尿、唾液、組織生検材料、外科的検体および剖検材料）から得られたサンプル。

骨形成タンパク質（ＢＭＰ）：異所の部位において骨形成を誘導することができた脱石灰化した骨の抽出物において最初に同定されたタンパク質の１ファミリー。ＢＭＰは、骨材料に微量で見られる（およそ１マイクログラム／ｋｇ乾燥重量骨）。このファミリーのほとんどのメンバー（ＢＭＰ－１を除く）は、タンパク質のトランスフォーミング成長因子－βファミリーに属する。
ＢＭＰは、脱石灰化した骨および骨肉腫細胞から単離され得る。ＢＭＰは、また、胚の種々の上皮組織および間葉系組織において発現されることが示されている。ＢＭＰは、骨形成を開始する前に間葉系型細胞から軟骨細胞および骨芽細胞への分化を誘導するように作用するタンパク質である。ＢＭＰは、骨折部位の近くだけでなく異所の位置でも軟骨形成細胞および骨形成細胞の分化を促進する。これらのタンパク質のいくつかは、骨芽細胞においてアルカリホスファターゼおよびコラーゲンの合成を誘導する。一部のＢＭＰは、骨芽細胞に直接作用し、それらの成熟を促進すると同時に、筋性分化を抑制する。他のＢＭＰは、代表的な線維芽細胞から軟骨細胞への変換を促進し、非骨原性細胞型において骨芽細胞表現型の発現を誘導することもできる。ＢＭＰには、ＢＭＰ－１～ＢＭＰ－１５（例えば、ＢＭＰ－２およびＢＭＰ－４）が含まれる。ＢＭＰ－２およびＢＭＰ－４およびＢＭＰ－７は、骨形成を促進すると示された。ＢＭＰ２／４は、ＢＭＰ４の分泌シグナルがＢＭＰ２の分泌シグナルで置き換えられたハイブリッド遺伝子である（Ｐｅｎｇら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ４：９５－１０４，２００１（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。ＢＭＰ－１の例示的なアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｉｄ）配列は、２０１７年２月１１日に入手可能であるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＫＲ７０９４４６．１（参照により本明細書中に援用される）に提供されている。

細胞培養物：制御された条件下で成長した細胞。初代細胞培養物は、生物から直接採取された、最初の継代培養の前の、細胞、組織または臓器の培養物である。細胞は、細胞の成長および／または分裂を促す条件下の成長培地に入れられると、培養中に拡大され、より大きな細胞集団となる。細胞が培養中に拡大されるとき、細胞増殖速度は、代表的には、それらの細胞数が２倍になるのに必要な時間の長さ（別名、倍加時間として知られている）によって測定される。

肝硬変：小葉の正常な微視的構造が失われていること、および壊死性の実質組織が、最終的には臓器を不規則な結節へと収縮させ、分割する結合組織の線維帯で再生的に取って代わられることを特徴とする慢性肝疾患の一群のことを指す。肝硬変は、非常に長い潜伏期を有し、通常その後、急激な腹痛、および吐血、就下性浮腫または黄疸を伴う腫脹が生じる。進行期には、腹水、著しい黄疸、門脈圧亢進症、拡張蛇行静脈および中枢神経系障害が存在することがあり、それらは、肝性昏睡の結果になり得る。

収集する：本明細書中で使用されるとき、拡大されたヒト肝細胞を「収集する」とは、単離されたヒト肝細胞を注射されたマウス（レシピエントマウスとも称される）から、拡大された肝細胞を取り出すプロセスのことを指す。収集は、必要に応じて、他の細胞型から肝細胞を分離することを含む。１つの実施形態において、拡大されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損マウスの肝臓から収集される。いくつかの例では、拡大されたヒト肝細胞は、ＦＲＧマウスまたはＦ^ｐｍＲＧマウスの肝臓から収集される。

インターロイキンレセプターの共通γ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）：インターロイキンレセプターの共通ガンマ鎖をコードする遺伝子。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７およびＩＬ－１５をはじめとしたいくつかのインターロイキンに対するレセプターの構成要素である（Ｄｉ Ｓａｎｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７－３８１，１９９５）。Ｉｌ２ｒｇを欠損している動物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞を欠く。Ｉｌ２ｒｇは、インターロイキン－２レセプターガンマ鎖としても知られる。

凍結保存された：本明細書中で使用されるとき、「凍結保存された」とは、液体窒素中などの零度未満の低温に冷却することによって保存または維持された細胞または組織のことを指す。これらの低温では、細胞死に導き得る生化学反応を含むいずれの生物学的活性も、効果的に停止される。細胞膜に組み込まれ、その構造を変化させる凍結保存剤を用いることにより、細胞生存能を維持することができる。

低下した肝機能：肝臓の健康状態または機能を測定するいくつかのパラメータのうちのいずれか１つの異常な変化。低下した肝機能は、本明細書中で「肝機能不全」とも称される。肝機能は、当該分野で周知のいくつかの手段（例えば、肝臓の組織像の検査および肝臓酵素または他のタンパク質の測定であるがこれらに限定されない）のいずれか１つによって評価できる。例えば、肝機能不全は、肝臓のネクローシス、炎症、線維症、酸化的損傷または異形成によって示すことができる。場合によっては、肝機能不全は、肝細胞癌などの肝がんによって示される。肝機能不全を評価するために検査され得る肝臓酵素および肝臓タンパク質の例としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。肝機能不全は、全般的な肝不全ももたらし得る。肝機能を検査するための手順は、当該分野で周知であり、例えば、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７：２２９８－２３０７，１９９３）およびＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１９２８－１１９３３，１９９９）によって教示されたものである。

欠損：本明細書中で使用されるとき、「欠損」とは、ｍＲＮＡ発現および／または機能的なＦタンパク質を実質的に減少させるかまたは無くす変異を目的の遺伝子に含む、マウスなどの動物のことを指す。本明細書中で使用されるとき、機能タンパク質の「発現の喪失」という用語は、発現の完全な喪失のことだけを指すのではなく、機能タンパク質の発現の実質的な減少（例えば、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の減少）も含む。１つの実施形態において、その動物は、ホモ接合性の破壊（例えば、ホモ接合性の欠失）を目的の遺伝子に含む。破壊には、例えば、挿入、欠失、１つもしくはそれを超える点変異またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。Ｒａｇ１欠損、Ｒａｇ２欠損およびＩｌ２ｒｇ欠損とは、ｍＲＮＡ発現または機能タンパク質の産生を実質的に減少させるかまたは無くす変異を、それぞれＲａｇ１、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇに含む動物のことを指す。Ｒａｇ１、Ｒａｇ２およびＩｌ２ｒｇノックアウトマウスは、以前に報告されており、商業的に入手可能である。

胚体内胚葉：ブラキュリ（brachyury）（ｂｒａｃｈ^＋）を発現しない細胞であって、分化誘導条件の存在下において、消化管、肺細胞、肝臓細胞、膵臓細胞および関連構造を含む内臓の上皮細胞を生成することができる細胞。

枯渇させる：減少させることまたは除去すること。本明細書中で使用されるとき、「マクロファージの枯渇」とは、動物におけるマクロファージを排除するか、除去するか、減少させるか、または殺滅するプロセスのことを指す。マクロファージが枯渇した動物は、必ずしも完全にマクロファージを欠くわけではなく、少なくとも、マクロファージの数または活性の減少を示す。１つの実施形態において、マクロファージの枯渇は、機能的なマクロファージの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または１００％の減少をもたらす。

分化：比較的特殊化されていない細胞（例えば、胚性幹細胞または他の幹細胞）が、成熟した細胞に特徴的な特殊化された構造的特徴および／または機能的特徴を獲得するプロセスのことを指す。同様に、「分化する」とは、このプロセスのことを指す。代表的には、分化している間、細胞構造は変わり、組織特異的タンパク質が出現する。

破壊：本明細書中で使用されるとき、遺伝子における「破壊」とは、任意の挿入、欠失もしくは点変異またはそれらの任意の組み合わせのことを指す。いくつかの実施形態では、破壊によって、ｍＲＮＡおよび／または機能タンパク質の発現が部分的または完全に失われる。

胚性幹細胞：必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞。この用語には、好ましくは、胚の残りの部分を破壊せずに、その胚の１つまたはそれを超える割球から単離された細胞が含まれる。この用語には、体細胞核移植によって作製された細胞も含まれる。「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）は、必要に応じて細胞株として連続的に継代されている、ヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞を含む。ｈＥＳ細胞は、精子もしくはＤＮＡと卵細胞の受精、核移植、単為生殖によって得られてもよいし、ＨＬＡ領域がホモ接合であるｈＥＳ細胞を作製する手段によって得られてもよい。ヒトＥＳ細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、またはクロマチンのリプログラムおよびその後のリプログラムされたクロマチンが原形質膜に取り込まれることによって作製された、接合体、割球または胚盤胞期の哺乳動物胚から作製されるかまたは得られることにより、胚性細胞が作製され得る。ヒト胚性幹細胞としては、ＭＡＯ１、ＭＡＯ９、ＡＣＴ－４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト胚性幹細胞は、その起源またはそれらを作製するために使用される特定の方法に関係なく、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ－４およびアルカリホスファターゼの発現、ならびに（ｉｉｉ）免疫無防備状態の動物に移植されたときに奇形腫をつくる能力に基づいて同定され得る。

生着する：動物に細胞または組織を植え付けること。本明細書中で使用されるとき、レシピエントマウスにおけるヒト肝細胞の生着とは、ヒト肝細胞が注射後にレシピエントマウスに植え付けられるプロセスのことを指す。生着したヒト肝細胞は、レシピエントマウスにおいて拡大することができる。本明細書中に記載されるように、「有意な生着」とは、肝臓における肝細胞の少なくとも約１％がヒト細胞であるレシピエントマウスのことを指す。「高度に生着した」マウスは、肝細胞の少なくとも約６０％がヒト細胞である肝臓を有するマウスである。しかしながら、生着効率は、それより高い場合があり、例えば、マウスの肝臓における肝細胞の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％が、ヒト肝細胞である。

拡大する：量を増加させること。本明細書中で使用されるとき、ヒト肝細胞を「拡大する」とは、ヒト肝細胞の数が増加するように細胞分裂が生じるのを可能にするプロセスのことを指す。

いくつかの実施形態において、「拡大」は、細胞培養物中の細胞の数または量が細胞分裂に起因して増加するプロセスである。同様に、用語「拡大」または「拡大される」とは、このプロセスのことを指す。用語「増殖する」、「増殖」または「増殖される」は、語「拡大する」、「拡大」または「拡大される」と交換可能に使用されてもよい。代表的には、拡大期の間は、細胞は、分化して、成熟した細胞を形成することはなく、分裂して、より多くの細胞を形成する。

本明細書中に記載されるように、ヒト肝細胞は、レシピエントラットにおいて拡大し得る。拡大から生じるヒト肝細胞の数は、異なり得る。いくつかの実施形態において、レシピエントラットにおけるヒト肝細胞の拡大は、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００倍の増加をもたらす。

発現：ある遺伝子のコードされた情報が、細胞の、活動の（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ）一部、非活動の一部、または構造の一部に変換されるプロセス（例えば、タンパク質の合成）。遺伝子発現は、外部シグナルによって影響され得る。例えば、細胞がホルモンに曝露されると、ホルモン誘導性遺伝子の発現が刺激され得る。異なるタイプの細胞は、同一のシグナルに異なって応答し得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡを経てタンパク質までの経路におけるいずれかの箇所で制御され得る。制御には、転写、翻訳、ＲＮＡの輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対する調節、または産生された後の特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化（compartmentalization）もしくは分解を介した調節が含まれ得る。

線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）：任意の動物に由来する任意の好適な線維芽細胞成長因子およびその機能的フラグメント（例えば、レセプターに結合して、そのレセプターの活性化に関連する生物学的作用を誘導するもの）。種々のＦＧＦが公知であり、それらとしては、ＦＧＦ－１（酸性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦ－２（塩基性線維芽細胞成長因子、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ－３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ－４（ｈｓｔ／Ｋ－ＦＧＦ）、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９およびＦＧＦ－９８が挙げられるが、これらに限定されない。「ＦＧＦ」とは、線維芽細胞成長因子タンパク質（例えば、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９またはＦＧＦ－９８）またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体のことを指す。ＦＧＦは、任意の動物種に由来し得る。１つの実施形態において、ＦＧＦは、げっ歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物のＦＧＦである。ＦＧＦのうちの多くのもののアミノ酸配列および作製するための方法は、当該分野で周知である。

ヒトｂＦＧＦ（ＦＧＦ－２とも呼ばれる）のアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，４３９，８１８号に開示されている。ウシｂＦＧＦ（ＦＧＦ－２）のアミノ酸配列およびその組換え発現のための様々な方法は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，１５５，２１４号に開示されている。これらの１４６個の残基の形態を比較すると、それらのアミノ酸配列は、２つの残基だけが異なり、ほぼ同一である。組換えＦＧＦ－２および他のＦＧＦは、米国特許第４，９５６，４５５号に詳細に記載されている技法を用いて、医薬品品質（９８％またはそれを超える純度）に精製され得る。

ＦＧＦ誘導物質には、ＦＧＦの活性なフラグメントが含まれる。その最も単純な形態において、その活性なフラグメントは、メチオニンアミノペプチダーゼによる処理などの、Ｎ末端のメチオニンの除去に対する周知の技法を用いて、Ｎ末端のメチオニンを除去することによって作製される。２番目に望ましい切断型には、リーダー配列を有しないＦＧＦが含まれる。当業者は、リーダー配列のことを、細胞膜の通過を促進するが、活性にとって必要でなく、成熟タンパク質には見られない、タンパク質のＮ末端における一続きの疎水性残基として認識している。ヒトおよびマウスのｂＦＧＦは、商業的に入手可能である。

成長因子：細胞の成長、生存および／または分化を促進する物質。成長因子には、成長刺激物質（マイトジェン）として機能する分子、細胞遊走を刺激する因子、走化性物質として機能するかまたは腫瘍細胞の細胞遊走もしくは侵入を阻害する因子、細胞の分化機能を調節する因子、アポトーシスに関与する因子、あるいは成長および分化に影響せずに細胞の生存を促進する因子が含まれる。成長因子の例は、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ－２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）ならびにアクチビン（ａｃｔｖｉｎ）－Ａである。

肝病原体：肝臓の細胞に感染する任意の病原体（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生虫の病原体）のことを指す。いくつかの実施形態において、肝病原体は、ＨＢＶまたはＨＣＶなどの「肝指向性ウイルス」（肝臓を標的とするウイルス）である。

肝細胞癌（ＨＣＣ）：ＨＣＣは、代表的にはウイルス性肝炎、肝臓毒または肝硬変に起因する肝臓炎症を有する患者において生じる、肝臓の原発性悪性腫瘍である。

肝細胞：肝臓の細胞質塊の７０～８０％を構成する細胞の１タイプ。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質貯蔵、および炭水化物の変換、コレステロール、胆汁酸塩およびリン脂質の合成、ならびに外来性および内在性の物質の解毒、改変および排出に関与する。肝細胞は、胆汁の形成および分泌も惹起する。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子のプロトロンビン群を産生し、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体および糖タンパク質を合成するための主要部位である。さらに、肝細胞は、薬物および殺虫剤などの外来性化合物、ならびにステロイドなどの内因性化合物を代謝する、解毒するおよび不活性化する能力を有する。「肝細胞前駆体」は、肝細胞に分化する未熟な細胞である。これらの細胞は、肝未熟マーカーを発現し得る（例えば、ヒト胎児肝細胞は、アルブミンおよびアルファフェトプロテインを発現する）。「ヒト肝特異化細胞」は、本開示の方法を用いる分化のステージ３の後の細胞であり、肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４ａ）をコードするｍＲＮＡとＨＮＦ４ａタンパク質の両方を、正常なヒト単離成体肝細胞に匹敵するレベルで発現する未熟な肝細胞である。ヒト肝特異化細胞はまた、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰａ）のｍＲＮＡを、ヒト胎児肝細胞（２０～２４週の在胎期間（ｇｅｓｔｅｔｉｏｎａｌ ａｇｅ））に匹敵するレベルで発現する。ＩＰＳ細胞由来肝細胞（ｉＨｅｐ）は、本明細書中に開示される方法を用いた、分化のステージ４の後の細胞である。これらの細胞は、以下のマーカー：ＨＮＦａ、肝臓Ｘレセプター（ＬＸＲ）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼファミリー１メンバーＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）に対するｍＲＮＡおよびタンパク質をすべて、正常ヒト単離成体肝細胞に匹敵するレベルで発現する。ＩＰＳ細胞由来肝細胞（ｉＨｅｐ）はまた、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）およびＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベルを、正常ヒト単離成体肝細胞によって発現されるレベルのおよそ５０％のレベルで発現する。「ｉＨｅｐ」は、薬物および殺虫剤などの外来性化合物、ならびにステロイドなどの内因性化合物を代謝する、解毒するおよび不活性化する能力が低下しているので、成熟したヒト肝細胞とは異なる。

肝細胞成長因子（ＨＧＦ）：癌原性ｃ－Ｍｅｔレセプターに結合した後にチロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することによって、細胞の成長、細胞の運動性および形態形成を制御する成長因子。肝細胞成長因子は、間葉系細胞によって分泌され、多機能性サイトカインとして、主に上皮起源の細胞に対して作用する。その有糸分裂誘発、細胞運動性およびマトリックス浸潤を刺激する能力は、血管新生、腫瘍形成および組織再生における中心的役割をそれに与える。ヒト肝細胞成長因子に対する例示的なアミノ酸配列およびｍＲＮＡ配列は、参照により本明細書中に援用されるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿０００６０１．５、２０１６年１０月８日に提供されている。

ヘテロ接合性：対応する染色体遺伝子座に異なる対立遺伝子を有すること。例えば、特定の遺伝子変異がヘテロ接合性の動物は、その遺伝子の一方の対立遺伝子に変異を有するが、他方には有しない。

ホモ接合性：１つまたはそれを超える遺伝子座に同一の対立遺伝子を有すること。本明細書中で使用されるとき、「破壊がホモ接合性」とは、ある遺伝子の両方の対立遺伝子の同一の破壊（例えば、挿入、欠失または点変異）を有する生物のことを指す。

免疫無防備状態または免疫不全：免疫系の少なくとも１つの必須機能を欠いていること。本明細書中で使用されるとき、「免疫無防備状態の」動物または「免疫不全の」動物は、免疫系の特定の構成要素を欠いているか、または免疫系の特定の構成要素の機能を欠いている動物である。１つの実施形態において、マウスまたはラットなどの免疫無防備状態の（免疫不全の）動物は、機能的なＢ細胞、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を欠いている。別の実施形態において、免疫無防備状態の（免疫不全の）動物は、マクロファージをさらに欠いている。いくつかの実施形態において、「免疫無防備状態の（免疫不全の）動物」は、以下の遺伝的変更：Ｒａｇ１^－／－、Ｒａｇ２^－／－、Ｉｌ２ｒｇ^－／－、ＳＣＩＤ、ＮＯＤおよびヌードのうちの１つまたはそれを超えるものを含む。免疫不全の系統は、当該分野で周知であり、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）またはＴａｃｏｎｉｃ（Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）などから商業的に入手可能である。いくつかの実施形態において、免疫無防備状態の（免疫不全の）動物は、１つまたはそれを超える免疫抑制剤を投与されたラットである。

免疫抑制剤：免疫系の１つまたはそれを超える態様（例えば、液性免疫系もしくは細胞免疫系または補体系の構成要素）の機能または活性を低下させる任意の化合物。本開示の特定の実施形態において、免疫抑制剤は、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンもしくはアザチオプリンまたはそれらの組み合わせである。

公知の免疫抑制剤としては、（１）代謝拮抗物質（例えば、プリン合成阻害剤（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、ピリミジン合成阻害剤（例えば、レフルノミドおよびテリフルノミド（ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ））および抗葉酸剤（例えば、メトトレキサート））；（２）マクロライド（例えば、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡおよびピメクロリムス）；（３）ＴＮＦ－α阻害剤（例えば、サリドマイドおよびレナリドミド）；（４）ＩＬ－１レセプターアンタゴニスト（例えば、アナキンラ）；（５）ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）阻害剤（例えば、ラパマイシン（シロリムス）、デフォロリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムスおよびバイオリムスＡ９）；（６）コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）；および（７）いくつかの細胞性標的または血清標的のいずれか１つに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

例示的な細胞性標的およびそれらのそれぞれの阻害剤化合物としては、補体成分５（例えば、エクリズマブ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、アフェリモマブおよびゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ））；ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）；ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）；ＢＡＹＸ（例えば、ネレリモマブ（ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ））；インターフェロン（例えば、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ））；ＩＬ－６（例えば、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ））；ＩＬ－１２およびＩＬ－１３（例えば、レブリキズマブおよびウステキヌマブ）；ＣＤ３（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３、オテリキシズマブ（ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ビジリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ４（例えば、クレノリキシマブ、ケリキシマブおよびザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＤ１１ａ（例えば、エファリツマブ）；ＣＤ１８（例えば、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ２０（例えば、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ）；ＣＤ４０（例えば、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ６２Ｌ／Ｌ－セレクチン（例えば、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ））；ＣＤ１４７／バシギン（ｂａｓｉｇｉｎ）（例えば、ガビリモマブ（ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ））；ＣＤ１５４（例えば、ルプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ））；ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＡＴ（例えば、ベルチリムマブ（ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ））；インテグリン（例えば、ナタリズマブ）；ＩＬ－６レセプター（例えば、トシリズマブ）；ＬＦＡ－１（例えば、オズリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ））；およびＩＬ－２レセプター／ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ））が挙げられるが、これらに限定されない。

他の免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）としては、ゾリモマブアリトックス（ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、アトロリムマブ（ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、ドルリキシズマブ（ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ（ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ（ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マスリモマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、パキセリズマブ（ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ（ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトックス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベパリモマブ（ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン；ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）；アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）；アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）；リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）；およびＴＮＦ阻害剤（例えば、エタネルセプト）が挙げられる。

免疫抑制：免疫系の活性または機能を低下させる作用のことを指す。免疫抑制は、免疫抑制剤化合物を投与することによって達成され得るか、または疾患もしくは障害の作用であり得る（例えば、ＨＩＶ感染に起因する免疫抑制または遺伝的欠陥に起因する免疫抑制）。

人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）：ある特定の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に得られる多能性幹細胞の１タイプ。ＩＰＳＣは、哺乳動物などの任意の生物から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＩＰＳＣは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類またはヒトから作製される。ヒト由来のＩＰＳＣは、例示的なＩＰＳＣである。

ＩＰＳＣは、多くの点（例えば、ある特定の幹細胞の遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに効力および分化可能性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｂｉｌｉｔｙ））においてＥＳ細胞と類似している。ＩＰＳＣを作製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＩＰＳＣは、代表的には、ある特定の幹細胞関連遺伝子（例えば、Ｏｃｔ－３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２）を成体線維芽細胞などの非多能性細胞にトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルス）を介して達成され得る。例えば、細胞は、レトロウイルス系を用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ、またはレンチウイルス系を用いてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８でトランスフェクトされ得る。３～４週間後、トランスフェクトされた細胞のうちの少数が、多能性幹細胞と形態学的におよび生化学的に似るようになり始め、代表的には、形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択によって単離される。１つの例において、成人細胞由来のＩＰＳＣは、Ｙｕらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５４）：１２２４，２００７）またはＴａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｃｅｌｌ １３１（５）：８６１－７２，２００７）によって作製される。ＩＰＳＣは、ｉＰＳ細胞としても知られる。ｉＰＳ－Ｈｅｐは、ＩＰＳＣに由来する成熟した肝細胞である。

単離された：その構成要素が天然に存在する環境（例えば、細胞）内の他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびにオルガネラから実質的に分離されているかまたは精製されている、「単離された」生物学的構成要素、例えば、核酸、タンパク質（抗体を含む）またはオルガネラ。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。

「単離された肝細胞」とは、臓器ドナーなどの特定の供給源から得られた肝細胞のことを指す。いくつかの実施形態において、「単離された肝細胞」は、ドナーの身体から取り出された肝細胞である。いくつかの実施形態において、「単離された肝細胞」は、懸濁物中の肝細胞または組織片内に含まれている肝細胞である。特定の例において、単離された肝細胞は、他の細胞型から実質的に分離もしくは精製された肝細胞、または脂肪組織もしくは線維性組織などの他の組織タイプから精製された肝細胞である。

哺乳動物：この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含む。哺乳動物の例としては、ヒトならびに家畜（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）動物および実験動物（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギおよびマウス）が挙げられるが、これらに限定されない。

マーカーまたは標識：例えば、ＥＬＩＳＡ、分光測定法、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光法、顕微鏡法、ノーザン解析またはサザン解析によって、検出が可能な作用物質（agent）。例えば、マーカーは、核酸分子またはタンパク質に結合され得、それにより、その核酸分子またはタンパク質の検出が可能になる。マーカーの例としては、放射性同位体、ニトロイミダゾール（ｎｉｔｏｒｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光物質、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。標識するための方法および様々な目的に適切なマーカーの選択の指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８）に論じられている。

いくつかの実施形態において、マーカーは、フルオロフォア（「蛍光標識」）である。フルオロフォアは、特定の波長の光に曝露されることによって励起されたとき、例えば異なる波長の、光を発する（すなわち、蛍光を発する）、化学的化合物である。フルオロフォアは、その発光プロファイルすなわち「色」に関して記載され得る。緑色フルオロフォア、例えば、Ｃｙ３、ＦＩＴＣおよびオレゴングリーンは、通常、５１５～５４０λの範囲の波長における発光によって特徴づけられる。赤色フルオロフォア、例えば、テキサスレッド、Ｃｙ５およびテトラメチルローダミンは、通常、５９０～６９０λの範囲の波長における発光によって特徴づけられる。他の実施形態において、マーカーは、抗体によって認識されるタンパク質タグ、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグまたはｃ－Ｍｙｃタグである。

培地または成長培地：特定の細胞集団の成長（細胞の増殖／拡大）を支援するのに必要な栄養分と培養条件との合成セット。１つの実施形態において、それらの細胞は、ｉＰＳＣなどの幹細胞である。別の実施形態において、それらの細胞は、肝細胞前駆細胞または肝細胞である。成長培地は、一般に、炭素源、窒素源、およびｐＨを維持するための緩衝剤を含む。１つの実施形態において、成長培地は、幹細胞の成長を向上させる様々な栄養分が補充された、ＤＭＥＭなどの基礎培地を含む。さらに、その基礎培地には、ウマ、仔ウシまたはウシ胎仔の血清などの添加物が補充され得る。「低グルコース」培地は、約０．２～約２グラム／リットルのグルコースを含む。

中内胚葉細胞：ブラキュリ（ｂｒａｃｈ^＋）を発現する細胞であって、分化誘導条件の存在下において、中胚葉および中胚葉誘導体（例えば、心筋および骨格筋、血管平滑筋、内皮および造血細胞）を産生することができ、肝臓細胞を含む内胚葉および内胚葉誘導体も産生することができる細胞。

ヌードマウス：胸腺を変質させるかまたは胸腺を無くし、多数のＴ細胞の減少に起因する免疫系の阻害をもたらす、遺伝的変異を有するマウス系統のことを指す。そのマウスの表現型の外観は、体毛がない。ヌードマウスは、フォークヘッドボックスＮ１（Ｆｏｘｎ１）遺伝子の自然の欠失がある。

作動可能に連結された：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係性であるように配置されるとき、その第１の核酸配列は、その第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのプロモーターは、そのコード配列に作動可能に連結されている。通常、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、近接しており、２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、それらは、同じ読み枠にある。

薬学的に許容され得るキャリア：本発明において有用な薬学的に許容され得るキャリアは、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、本明細書中に開示される融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的におよび生理学的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態）の場合、従来の無毒性の固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。

医薬品：被験体または細胞に適切に投与されたとき、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学的化合物または組成物。「インキュベートする」は、薬物が細胞と相互作用するための十分な長さの時間を含む。「接触させる」は、固体または液体の形態の薬物を細胞とインキュベートすることを含む。

多能性幹細胞：（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されると奇形腫を誘導することができ；（ｂ）３つすべての胚葉の細胞型に分化することができ（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞型に分化することができ）；（ｃ）胚性幹細胞の１つまたはそれを超えるマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３表面抗原、ＳＳＥＡ－４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１などを発現する）が、胚および胚体外膜を形成できない（全能でない）、幹細胞。

例示的な多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚性幹細胞、ならびに卵割期胚または桑実胚期胚の１つまたはそれを超える割球に由来する（必要に応じて、その胚の残りの部分を破壊せずに）胚性幹細胞が挙げられる。これらの胚性幹細胞は、受精、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖および雄性発生を含む無性生手段（asexual mean）によってもたらされた胚性物質から作製され得る。ＰＳＣは、すべての胚外組織（例えば、インビボにおける胎盤またはインビトロにおけるトロホブラスト）に寄与する能力を欠いているので、ＰＳＣ単独では、子宮に移植されても胎仔または成体の動物に発達できない。

多能性幹細胞には、因子（本明細書中でリプログラミング因子と称される）の組み合わせを発現させることまたはその発現を誘導することによって、体細胞をリプログラムすることにより作製される「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」も含まれる。ｉＰＳＣは、胎生期、出生後、新生児、若年期または成体の体細胞を使用して作製され得る。ある特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラムするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（時折、Ｏｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態において、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラムする、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子または４つのリプログラミング因子を発現させることによってリプログラムされる。ｉＰＳＣは、胚性幹細胞に特性が似ている。

ポリヌクレオチド：任意の長さの核酸配列（例えば、直鎖状配列）。ゆえに、ポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが含まれ、染色体に見られる遺伝子配列も含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、天然のホスホジエステル結合によってつなぎ合わされたヌクレオチドが複数つなぎ合わされたものである。オリゴヌクレオチドは、６～３００ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドアナログとは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが天然に存在しない部分を有する部分のことを指す。例えば、オリゴヌクレオチドアナログは、天然に存在しない部分（例えば、変更された糖部分または糖間結合）を含み得る（例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド）。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的なアナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し得、その機能的なアナログには、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子が含まれる。

ポリペプチド：３つまたはそれを超える共有結合的に付着されたアミノ酸。この用語は、タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質ドメインを包含する。「ＤＮＡ結合」ポリペプチドは、ＤＮＡに特異的に結合する能力を有するポリペプチドである。

用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質ならびに組換え的にまたは合成的に作製されたタンパク質を網羅するように明確に意図されている。用語「ポリペプチドの機能的フラグメント」とは、そのポリペプチドの活性を保持するポリペプチドのすべてのフラグメントのことを指す。生物学的に機能的なフラグメントは、例えば、抗体分子に結合することができるエピトープほど小さいポリペプチドフラグメントから、細胞内での表現型変化の特徴的な誘導またはプログラミングを受けることができる大きいポリペプチドまで、サイズが異なり得る。「エピトープ」は、抗原との接触に応答して生成される、免疫グロブリンに結合することができるポリペプチドの領域である。したがって、インスリンの生物学的活性を含むより小さいペプチド、すなわちインスリンの保存的バリアントは、有用であるものとして含められる。

用語「実質的に精製されたポリペプチド」は、本明細書中で使用されるとき、それが天然に伴っている他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まないポリペプチドのことを指す。１つの実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に伴っている他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を少なくとも５０％、例えば、少なくとも８０％含まない。別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に伴っている他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を少なくとも９０％含まない。なおも別の実施形態において、ポリペプチドは、それが天然に伴っている他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を少なくとも９５％含まない。

保存的置換は、１つのアミノ酸を、サイズ、疎水性などが似ている別のアミノ酸で置き換える。保存的置換の例を下記に示す。

保存的であるか否かを問わずアミノ酸変化をもたらすｃＤＮＡ配列におけるバリエーションは、コードされるタンパク質の機能的同一性および免疫学的同一性を保存するために最小限に抑えられるべきである。タンパク質の免疫学的同一性は、それが抗体によって認識されるかを判定することによって評価され得る；そのような抗体によって認識されるバリアントは、免疫学的に保存されている。任意のｃＤＮＡ配列バリアントが、好ましくは、２０以下の、好ましくは、１０より少ないアミノ酸置換を、コードされるポリペプチドに導入し得る。バリアントアミノ酸配列は、例えば、天然のアミノ酸配列と８０％、９０％またはさらには９５％もしくは９８％同一であり得る。

プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を指示する一連の核酸調節配列である。プロモーターは、必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩタイププロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）を転写開始部位の付近に含む。プロモーターは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。

プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち、構成的に活性／「オン」状態であるプロモーター）、誘導性プロモーター（すなわち、そのプロモーターの状態である活性／「オン」または不活性／「オフ」が、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物またはタンパク質の存在によって制御される、プロモーター）、空間的に限定されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得るか、または時間的に限定されたプロモーターであり得る（すなわち、そのプロモーターは、胚発生の特定の段階、または生物学的プロセス、例えば、マウスの毛嚢サイクルの特定の段階において「オン」状態または「オフ」状態である）。

誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）制御プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、エストロゲンレセプター制御プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲンレセプター；エストロゲンレセプター融合物などを含むがこれらに限定されない分子によって制御され得る。

レシピエント：本明細書中で使用されるとき、「レシピエントラット」は、本明細書中に記載される単離されたヒト肝細胞を注射されるラットである。代表的には、ヒト肝細胞の一部（パーセンテージは変動し得る）が、レシピエントマウスに生着する。１つの実施形態において、レシピエントラットは、免疫不全ラットである。

組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有する核酸、または切り離された２つの配列セグメントを人工的に組み合わせることによって作製された配列を有する核酸である。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技法によって達成されることが多い。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされるタンパク質である。

リコンビナーゼ活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）：免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性化に関与する遺伝子。ＲＡＧ１タンパク質は、ＤＮＡ基質の認識に関与するが、安定な結合および切断の活性には、ＲＡＧ２も必要である。

リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座およびＴ細胞レセプター遺伝子座の組換えに関与する遺伝子。Ｒａｇ２遺伝子を欠損している動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを起こすことができず、機能的なＴ細胞およびＢ細胞が完全に喪失している（Ｓｈｉｎｋａｉら、Ｃｅｌｌ ６８：８５５－８６７，１９９２）。

連続移植：ヒト肝細胞をインビボにおいて拡大するためのプロセスであって、そのプロセスでは、第１のマウスにおいて拡大された肝細胞が収集され、さらなる拡大のために、第２のマウスに注射などによって移植される、プロセス。連続移植は、第３、第４またはさらなるマウスをさらに含み得る（Ｏｖｅｒｔｕｒｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１０７８－９１０７，１９９７）。

重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス：Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを起こすことができないがゆえに機能的なＴ細胞およびＢ細胞を欠くマウスの系統のことを指す。ＳＣＩＤマウスは、補体系のいくつかの成分を活性化する能力も損なわれている。ＳＣＩＤマウスは、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ変異がホモ接合性である。

幹細胞：変更されない娘細胞を作製するユニークな能力（自己再生；細胞分裂は、親細胞と同一の少なくとも１つの娘細胞を作製する）および特殊化された細胞型を生じるユニークな能力（潜在力）を有する細胞。幹細胞には、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖細胞系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、成体複能性前駆細胞（ＭＡＰＣ）、成体複能性生殖細胞系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）および無制限体性幹細胞（ＵＳＳＣ）が含まれるが、これらに限定されない。インビボでの幹細胞の役割は、動物の通常の生活において破壊された細胞を置き換えることである。一般に、幹細胞は、無制限に分裂できる。分裂後、幹細胞は、幹細胞として残存してもよいし、前駆細胞になってもよいし、最終分化まで進んでもよい。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の完全に分化した機能的な細胞を作製することができる細胞である。一般に、前駆細胞は、分裂できる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞として残存してもよいし、最終分化まで進んでもよい。１つの実施形態において、幹細胞は、肝細胞を生じる。

治療薬：被験体に適切に投与されたとき、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる、化学的化合物、小分子または他の組成物（例えば、アンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン）。本明細書中で使用されるとき、「候補作用物質」は、それが特定の疾患または障害に対する治療薬として機能し得るか判定するためのスクリーニングのために選択された化合物である。

力価：本開示の文脈において、力価とは、サンプル中の特定の病原体の量のことを指す。

導入遺伝子：ある生物の細胞またはゲノムに導入された外来性核酸配列。

トランスジェニック動物：その細胞の一部に染色体外のエレメントとして存在するかまたは生殖系列ＤＮＡ（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列）に安定に組み込まれた、非内在性（異種）核酸配列を有する非ヒト動物、通常、哺乳動物。異種核酸は、当該分野で周知の方法に従って、遺伝子操作、例えば、宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝子操作によって、そのようなトランスジェニック動物の生殖系列に導入される。「導入遺伝子」は、かかる異種核酸、例えば、発現構築物の形態の異種核酸（例えば、「ノックイン」トランスジェニック動物の作製の場合）、または標的遺伝子内にもしくは標的遺伝子に隣接して挿入されたとき、標的遺伝子の発現を低下させる異種核酸（例えば、「ノックアウト」トランスジェニック動物の作製の場合）を指すことを意味する。遺伝子の「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能を低下させる、遺伝子配列における変更、好ましくは、標的遺伝子の発現が検出不可能になるかまたはわずかになるような、遺伝子配列における変更を意味する。トランスジェニックノックアウト動物は、標的遺伝子のヘテロ接合性ノックアウトまたは標的遺伝子のホモ接合性ノックアウトを含み得る。「ノックアウト」には、コンディショナルノックアウトも含まれ、コンディショナルノックアウトでは、例えば、その動物が標的遺伝子の変更を促進する物質に曝露されることにより、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えば、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムにおけるＣｒｅ）が導入されることにより、または標的遺伝子の変更を出生後に指示するための他の方法で、標的遺伝子の変更が生じ得る。

移植する（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）または移植する（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）：１つの被験体から別の被験体にまたは同じ被験体の別の領域に臓器、組織または細胞を移植する（ｇｒａｆｔｉｎｇ）プロセスのことを指す。

未分化：胚起源または成体起源の分化細胞と識別する、未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特色を示す細胞。したがって、いくつかの実施形態において、未分化細胞は、細胞系譜特異的マーカーを発現しない。

ベクター：ベクターが宿主細胞において複製する能力および／または組み込む能力を妨害せずに、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてその複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたはそれを超える選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントも含み得る。組み込みベクターは、それ自体を宿主核酸に組み込むことができる。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするのに必要な制御配列を含むベクターである。１つの実施形態において、ベクターは、プラスミドベクターである。別の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）である。

別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。ゆえに、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドに対して与えられるすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されているとさらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単なる例証であって、限定していると意図されない。

肝細胞を作製するための方法
ヒト体細胞を使用してヒト人工ｉＰＳＣを調製し、さらにそれを使用して、ヒト肝細胞を作製することができる方法が、本明細書中に提供される。そのヒトｉＰＳＣまたはヒト肝細胞は、異種プロモーターに作動可能に連結された核酸分子で形質転換され得る。必要に応じて、その核酸分子は、Ｃａｓ９をコードするか、または阻害性ＲＮＡに転写される。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するための方法
ｉＰＳＣ細胞は、未分化状態でインビトロにおいて無限に維持され得るが、実質的に任意の細胞型に分化することができる。

体細胞
出発体細胞は、目的の任意の細胞であり得る。哺乳動物起源（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットなど）の生殖細胞以外の任意の細胞を、ｉＰＳＣ作製のための出発物質として使用することができる。１つの実施形態において、幹細胞は、ヒト幹細胞である。例としては、とりわけ、角化上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、内分泌細胞、肝臓細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、血液および免疫系の細胞、神経系の細胞（神経細胞およびグリア細胞を含む）、色素細胞ならびに前駆細胞（造血幹細胞を含む）が挙げられる。細胞分化の程度、細胞が収集される動物の齢などに制限はなく；未分化前駆細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化した成熟細胞ですら、本発明における体細胞の供給源として同様に使用できる。体細胞は、成体細胞または胎児細胞であり得る。非限定的な具体例において、体細胞は、線維芽細胞である。別の非限定的な具体例において、体細胞は、肝細胞である。

体細胞の供給源としての個体の選択は、特に限定されない。得られた細胞を被験体に移植する場合、同種異系の細胞が使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、被験体とＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）がマッチしない。いくつかの実施形態において、得られたｉＰＳＣが、ヒトの再生医療に使用されるとき、細胞は、処置されるべき被験体の体細胞、またはその患者のＨＬＡ型と同じもしくは実質的に同じＨＬＡ型を有する別の被験体の体細胞から収集され得る。したがって、幹細胞は、自己由来であり得るか、または実質的に同じＨＬＡ型であり得る。「実質的に同じＨＬＡ型」は、ドナーのＨＬＡ型が、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘導することによって得られた移植細胞が被験体に移植されたとき生着し得る程度に患者のＨＬＡ型とマッチすることを示す。被験体は、必要に応じて、免疫抑制剤で処置され得る。１つの例において、それは、主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲという３つの主要遺伝子座、ＨＬＡ－Ｃｗをさらに含む４つの主要遺伝子座）が同一であるＨＬＡ型を含む。

ヒトから単離された体細胞は、核リプログラムのステップに供される前に、細胞の選択に従ってそれらの培養に適すると知られている培地を用いて前培養され得る。そのような培地の非限定的な具体例としては、約５～２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ヒトなどの哺乳動物由来の特定の細胞型を増殖させるための適切な組織培養条件を容易に確かめることができる。いくつかの実施形態において、完全にゼノフリーなヒトｉＰＳＣを得るために、ＦＣＳなどの非ヒト動物由来の成分を培地に含めない場合がある。様々な体細胞の培養に適したヒト由来成分（特に、成長因子などの組換えヒトタンパク質）、非必須アミノ酸、ビタミンなどが補充された基本培地を含む培地は、商業的に入手可能であり；当業者は、体細胞の供給源に従って、適切なゼノフリー培地を選択することができる。ゼノフリー培地を用いて前培養された体細胞は、適切なゼノフリー細胞解離液を用いて培養容器から分離、回収され、その後、それらは、核リプログラミング物質と接触される。

別段下記に明確に示されない限り、一般に細胞は、約３５～３８℃、通常３７℃、約４～６％ＣＯ_２、通常５％ＣＯ_２において培養される。

Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする核酸分子に作動可能に連結されたドキシサイクリン誘導性プロモーターを含む構築物
米国特許仮出願番号６２／３６９，６９８（参照により本明細書中に援用される）に開示されているように、体細胞は、Ｃａｓ９をコードする核酸に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーターを含む核酸分子を導入するためにトランスフェクトされ得る。これらの体細胞を用いることにより、ｉＰＳＣを作製することができ、そのｉＰＳＣは、本明細書中に開示される方法を用いて肝細胞に分化され得る。次いで、組換えを誘導するために、ＳｇＲＮＡが、そのｉＰＳＣまたはｉＰＳＣ由来肝細胞に導入され得る。

当業者は、本システムおよび方法において任意のＣａｓ９タンパク質を使用できることを認識する。このプロモーターは、Ｃａｓ９の誘導性発現を提供する。Ｔｅｔ－Ｏｎシステムでは、ｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンによって結合された場合のみ、オペレーター（ドキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）プロモーター）に結合することができる。したがって、そのプロモーターは、ドキシサイクリンによって活性化される。本明細書中に開示されるシステムは、３Ｇ ＴＥＴ技術に基づく誘導性発現プラットフォームを利用する。このプロモーターの配列を下記に示す（配列番号１）。

ドキシサイクリン誘導性プロモーターは、非常に高感度であり、もれなく転写を提供する。誘導性遺伝子操作を用いることにより、本明細書中に開示される方法を用いて、目的の遺伝子のノックダウン、ノックインまたは二重ノックイン－ノックダウンを作製することができる。ドキシサイクリン誘導性プロモーターの１形態が、Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇシステムである。このシステムは、これらの２つのエレメントから構成される：（１）ユビキチンＣプロモーターの支配下において構成的に発現される、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子誘導性プロモーター（ｒｔＴＡ）；（２）目的の配列の転写を調節するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）。ＴＲＥは、最小プロモーターの上流に配置された１９ｂｐの細菌ｔｅｔ－Ｏ配列の７つのリピートから構成され、Ｔｅｔ－Ｏｎの非存在下では非常に低い基礎発現を有する。ｒｔＴＡタンパク質は、ドキシサイクリンに結合された場合のみ、ＴＲＥに結合する。ドキシサイクリンをこのシステムに加えると、目的の配列（蛍光レポーター遺伝子；Ｃａｓ９など）の転写が惹起される。例示的な構築物を図１に示す。さらなる好適なプロモーターは、例えば、公開されている米国特許出願番号２０１４／０１０７１９０（参照により本明細書中に援用される）に開示されている。

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９をコードする核酸配列に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーターが、体細胞に導入される。有用な１つのＣａｓ９は、下記の配列番号２に示されているような、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来のものである。

他の実施形態において、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９ペプチドは、文献に記載されている変異（Ｆｏｎｆａｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｆｅｂ；４２（４）：２５７７－９０；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｆｅｂ ２７；１５６（５）：９３５－４９；Ｊｉｎｅｋ Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１；およびＪｉｎｅｋ Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｍａｒ １４；３４３（６１７６）に記載されている機能的な変異を含むがこれらに限定されない）のうちの１つまたはそれを超える変異を含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるシステムおよび方法は、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、一本鎖ニッカーゼとして作用するＣａｓ９変異体、または改変されたヌクレアーゼ活性を有する他の変異体とともに使用され得る。

Ｃａｓ９ペプチドは、活性化Ｃａｓ９（Ｃａｓ９ａ）であり得る。好適なＣａｓ９配列には、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４が含まれる。好適なＣａｓ９分子は、例えば、Ｃｈａｖｅｚら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２：３２６－３２８，Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２０１５（参照により本明細書中に援用される）に開示されている。必要に応じて、相乗的なアクチベーターが、Ｃａｓ９とともにコードされ得る。インターネットのｓａｍ．ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、短ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いることにより、ヌクレアーゼＣａｓ９を標的部位に導いて、二本鎖切断を生じ、ＤＮＡ編集を起こすＤＮＡ修復プロセスを刺激する。オフターゲット効果を回避するために、改変Ｃａｓ９を、報告されたオフターゲット効果なしに、利用することができる（ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１）。ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は、所望の鋳型配列が送達され、相同組換え修復という細胞機構によって使用される限り、機能喪失だけでなく機能獲得も可能にする。さらに、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１は、ｓｇＲＮＡライブラリーを用いたホールゲノム機能喪失スクリーニングに使用され得る。全ゲノムスクリーニングに向けて機能獲得を可能にするために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９相乗活性化媒介物（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＳＡＭ）複合体が使用され得る。これは、不活性なＣａｓ９－ＶＰ６４融合物および活性化ヘルパータンパク質から構成されるタンパク質複合体である（ＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１）。この複合体は、ｓｇＲＮＡと相互作用することにより、標的遺伝子のロバストな転写性活性化を保証する。このシステムは、機能獲得スクリーニングのために本方法において使用され得る。

Ｃａｓ９は、遺伝子を阻害するために使用され得る（Ｃａｓ９ｉ）。これは、ｓｇＲＮＡによってガイドされたとき、二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断によって機能喪失を誘導し、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機構を活性化させる、触媒活性のＣａｓ９である。したがって、Ｃａｓ９の使用は、遺伝子の機能喪失をもたらす。単一のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡのライブラリーが、機能喪失スクリーニングに使用され得る。ＣＲＩＳＰＲノックアウトライブラリーまたは単一のｇＲＮＡは、標的化された遺伝子において挿入または欠失を誘導することによって遺伝子を非機能的にする。

Ｃａｓ９は、触媒活性のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＨＮＨ様エンドヌクレアーゼおよびＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼを含む。したがって、いくつかの実施形態において、二本鎖ＤＮＡ切断をもたらすために、ＨＮＨ様エンドヌクレアーゼが、ｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインが、非相補ＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、特定のｓｇＲＮＡを用いて特定のゲノム標的にガイドされ得る（下記を参照のこと）。

必要に応じて、マーカーをコードする核酸分子も、ドキシサイクリン誘導性プロモーターまたは別のプロモーターに作動可能に連結され得る。マーカーとしては、酵素および蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質または内部タンパク質を含む；細胞によって合成されるかまたは取り込まれる）；核酸（例えば、ｍＲＮＡまたは酵素活性の核酸分子）または多糖であり得る。目的の細胞型のマーカーに特異的な抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能なそのような任意の細胞構成要素の決定基が含められる。マーカーは、生化学的アッセイもしくは酵素アッセイ、または遺伝子産物の機能に依存する生物学的応答によっても同定され得る。これらのマーカーをコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され得る。さらに、他の遺伝子（例えば、幹細胞が分化するのに影響し得るかまたは機能もしくは生理機能に影響し得る遺伝子）も含まれ得る。

非限定的な具体例において、マーカーは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質である。他の実施形態において、マーカーをコードする核酸分子は、ドキシサイクリンプロモーターに作動可能に連結されない。

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９をコードする核酸に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーターが、ベクターに含められる。いくつかの目標（例えば、制御された高コピー数を達成すること、および細菌におけるプラスミド不安定性の潜在的な原因を回避すること、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞での使用に適合するプラスミド選択のための手段を提供すること）を考慮に入れて、プラスミドがデザインされた。ヒト細胞において使用するためのプラスミドの２つの要件に特に注意が払われた。第１に、それらは、大腸菌における維持および発酵に適しており、大量のＤＮＡを生成および精製することができる。第２に、それらは、安全であり、ヒト患者および動物において使用するために適している。第１の要件は、細菌の発酵中に比較的容易に選択され得るおよび安定に維持され得る高コピー数プラスミドを必要とする。第２の要件は、選択マーカーおよび他のコード配列などのエレメントへの注意を必要とする。いくつかの実施形態において、有用なプラスミドは、（１）高コピー数複製起点、（２）選択マーカー（例えば、カナマイシン、ピューロマイシン、ネオマイシンなどによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子であるがこれらに限定されない）、（３）転写終結配列（チロシナーゼエンハンサーを含む）、および（４）様々な核酸カセットを組み入れるためのマルチクローニング部位；および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための当該分野で公知のプラスミドベクターは数多く存在する。これらとしては、米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号（これらは参照により本明細書中に援用される）に開示されているベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

核酸を導入するために、ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１５３３１５３６）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９９２，Ｃｕｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：３９－６；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６－６２９；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：４４０７－４４１２；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１－２５８４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２，Ｃｅｌｌ，６８：１４３－１５５；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：２２３３－２２３９；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ－Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１：２４１－２５６）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：４９５－４９９）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９１－１２３；Ｏｎら、１９９０，Ｇｅｎｅ，８９：２７９－２８２）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：６７－９０；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２９５２２９６５；Ｆｉｎｋら、１９９２，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１１－１９；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１：３３７－３７１；Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４０：２１８９－２１９９）、シンドビスウイルス（Ｈ．Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１６１－１１６７；米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８－２２；Ｉ．Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３７１－１１３７７）、ヒトヘルペスウイルスベクター（ＨＨＶ）（例えば、ＨＨＶ－６およびＨＨＶ－７）、ならびに鳥類起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４：７４９－７５４；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３３９１－３３９７）、マウス起源のレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１－２４；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：４３１－４３７；Ｓｏｒｇｅら、１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，４：１７３０－１７３７；Ｍａｎｎら、１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５４：４０１－４０７）およびヒト起源のレトロウイルス（Ｐａｇｅら、１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：５３７０－５２７６；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２７３１－２７３９）を含むウイルスベクターが利用され得る。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターが使用され得る。ベクターは、商業的供給源（例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手することができる。好適なベクターは、例えば、米国特許出願公開番号２０１０／０２４７４８６（参照により本明細書中に援用される）に開示されている。非限定的な具体例において、ベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、麻疹ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。細胞の感染に対するレンチウイルスの利点は、導入遺伝子の持続的な発現が可能である点である。レンチウイルス（Ｌｅｉｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）としては、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヒツジのビスナウイルス（ＶＩＳＮＡ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３－２６７，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１－８７５，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７１（９）：６６４１－６６４９，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボとインビトロの両方における遺伝子導入および核酸配列の発現に使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルス（ここで、好適な宿主細胞は、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを有する２つまたはそれを超えるベクターでトランスフェクトされる）は、米国特許第５，９９４，１３６号（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。

組換えレンチウイルスは、エンベロープタンパク質と、特定の細胞型のレセプターに標的化するための抗体または特定のリガンドとを連結することによって、特定の細胞型に標的化され得る。標的特異的ベクターを作製するために、目的の配列（制御領域を含む）が、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、ウイルスベクターに挿入される。組換えレンチウイルスは、天然の感染性ウイルスを構成しているある特定の遺伝子が排除され、標的細胞に導入されるべき目的の核酸配列で置き換えられるように、遺伝的に改変され得る。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込み得る。次いで、そのように移入された遺伝物質は、宿主細胞内で転写され、おそらくタンパク質に翻訳される。他の実施形態において、レンチウイルスベクターは、そのベクターがエピソームの形態で存在するような、非組み込みレンチウイルスベクターである。

レンチウイルスベクターは、ベクター内にコードされている遺伝子の発現の改善を助ける追加のエレメントをさらに含み得る。長末端反復（ＬＴＲ）などの、標的細胞のゲノムへのベクターの組み込みに必要な領域。したがって、レンチウイルスベクターは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲを含み得る。「５’ＬＴＲ」とは、内在性配列を欠失させるおよび／もしくは変異させるならびに／または異種配列を付加することによって、対応する天然の５’ＬＴＲから改変されてもよいし、改変されなくてもよい、レトロウイルスまたはレンチウイルスの５’長末端反復のことを指す。５’ＬＴＲは、天然のものまたは合成のものであり得る。「３’ＬＴＲ」とは、内在性配列を欠失させるおよび／もしくは変異させるならびに／または異種配列を付加することによって、対応する天然の（すなわち、野生型レトロウイルスに既存である）３’ＬＴＲから改変されてもよいし、改変されなくてもよい、レトロウイルスまたはレンチウイルスの３’長末端反復のことを指す。３’ＬＴＲは、天然のものまたは合成のものであり得る。

レンチウイルスＰｓｉ（ψ）配列などのキャプシド形成配列が、ベクターに含められ得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの核外輸送を向上させる配列（例えば、ＨＩＶ－１ ＲＥＶ応答エレメント（ＲＲＥ）配列を含む配列）が、ベクターに含められ得る。ＲＮＡの核外輸送を向上させる別の配列は、ＣＴＥ配列である（Ｏｈら、２００７，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００７ Ｊｕｎ．５；４：３８．）。これらの配列は、組み込まれたレンチウイルスベクターのコピー数の決定にも有用である。ＤＮＡの核内輸送を増強させる他の配列は、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＶＩＳＮＡおよびＣＡＥＶ由来のレンチウイルスのｃＰＰＴ ＣＴＳ配列である。これらの配列のいずれもが、ベクターに含められ得る。

別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、３’長末端反復領域（ＬＴＲ）における欠失の結果としての、別の形態の自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターである。いくつかの例において、そのベクターは、ウイルスプロモーター内に欠失を含む。ＨＩＶ ＬＴＲなどのレンチウイルスのＬＴＲは、ウイルスプロモーターを含む。このプロモーターは、比較的非効率であるが、例えば、ｔａｔによってトランス活性化されると、ｔａｔ媒介性のトランス活性化が転写速度を約１００倍高めるので、そのプロモーターは、効率的になる。いくつかの状況において、ウイルスプロモーターの存在は、導入遺伝子に作動可能に連結された異種プロモーターの転写に干渉し得る。そのような干渉を最小限に抑え、導入遺伝子の発現をよりうまく制御するために、レンチウイルスのプロモーターは、欠失されてもよい。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、５’から３’の向きで、５’ＬＴＲ（野生型または改変型）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ｃポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、転写制御領域、Ｃａｓ９に連結されたドキシサイクリンプロモーター、必要に応じた転写制御エレメント、および３’ＬＴＲを含む。

ＤＮＡのトランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、従来の機械的手順（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクター）が挙げられる。

ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。

マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼまたはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼまたはｎａｎｏｌｕｃ）または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記方法は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸を導入する工程も含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される方法は、ｉＰＳＣの形成を誘導する前に、ｓｇＲＮＡをコードする核酸を体細胞に導入する工程を含み得る。他の実施形態において、本明細書中に開示される方法は、Ｃａｓ９に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーターを含むｉＰＳＣに、ｓｇＲＮＡをコードする核酸を導入する工程を含み得る。さらなる実施形態において、本明細書中に開示される方法は、ｉＰＳＣ（Ｃａｓ９に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーターを含む）が分化するように誘導した後に、ｓｇＲＮＡをコードする核酸を分化細胞に導入する工程を含み得る。

ｓｇＲＮＡをコードする核酸は、構成的プロモーターに連結され得る。好適なプロモーターとしては、Ｕ６プロモーターまたはユビキチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、これらのプライマーは、ｉＰＳＣまたはそのｉＰＳＣから分化した細胞へのｓｇＲＮＡをコードする核酸を配列決定するとき、使用される。好適なプライマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
hU6-F 5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’（配列番号３２）
LKO.1 5’ 5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’（配列番号３３）

他の実施形態において、誘導性プロモーターが使用され、ｓｇＲＮＡが出発体細胞に導入される。ｓｇＲＮＡは、ｉＰＳＣから分化した細胞にも導入され得る。組換えが所望であるとき、いくつかの状況において、発現は、この誘導性プロモーターから誘導され得る。したがって、発現は、出発体細胞、ｉＰＳＣ、またはｉＰＳＣから分化した細胞において誘導され得る。これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：

Ｐａｐａｄｋｉｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：８９－１１３，２００４（参照により本明細書中に援用される）からの表。当業者は、有用なプロモーターを容易に特定できる。

プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ユビキチンプロモーターであるがこれに限定されない）であり得る。下記を参照のこと。

Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドシステムは、Ｃａｓ９を、標的ＤＮＡにおける所望の二本鎖（ｄｓ）切断の遺伝子座に導く２－ＲＮＡ構造を形成するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と塩基対形成した成熟ｃｒＲＮＡからなる。いくつかの実施形態において、塩基対形成したｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの組み合わせは、配列特異的Ｃａｓ９ ｄｓＤＮＡ切断を指示する能力を保存しているガイド配列（例えば、ｓｇＲＮＡ）を生成するように単一ＲＮＡキメラとして操作される（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１７ Ａｕｇ ２０１２：３３７；８１６－８２１を参照のこと）。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９－ガイド配列複合体は、目的の遺伝子内の標的配列において一方または両方の鎖を切断する。したがって、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；Ｍａｌｉ，Ｐ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８－１０３４）およびｓｇＲＮＡ分子は、目的の遺伝子の配列特異的な標的認識、切断およびゲノム編集に使用される。１つの実施形態において、切断部位は、特定のヌクレオチド（例えば、２０ヌクレオチドの標的の１６、１７または１８番目のヌクレオチドであるがこれらに限定されない）に存在する。１つの非限定的な例において、切断部位は、２０ｎｔの標的配列の１７番目のヌクレオチドに存在する（図１および図３を参照のこと）。切断は、二本鎖切断であり得る。切断部位は、任意の遺伝子のコード領域に存在し得るか、または非コード領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンなど）に存在し得る。いくつかの実施形態において、機能喪失がもたらされる。他の実施形態において、機能獲得がもたらされる。

いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡ分子は、標的ゲノム標的がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有するように選択される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡによるＤＮＡ認識およびその結果としてのエンドヌクレアーゼによる切断には、標的の直ぐ後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、５’－ＮＧＧ－３’）が存在することが必要である。

いくつかの実施形態において、ＰＡＭから約３塩基対上流の部位において切断が生じる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、二本鎖核酸配列を切断する。

いくつかの実施形態において、ガイド配列は、配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。二次構造は、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムが、最小のギブス自由エネルギーの計算に基づいている。そのような１つのアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）である。折り畳みアルゴリズムの別の例は、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用するオンラインウェブサーバーであるＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒら、２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；およびＰＡ Ｃａｎ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照のこと）。ガイド配列は、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕに見られるＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲデザインツールまたはｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰに見られるＥ－ＣＲＩＳＰツールを用いてデザインされ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびガイド配列をデザインするためのさらなるツールは、Ｎａｉｔｏ Ｙら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４ Ｎｏｖ ２０およびＭａら、ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１３（２０１３），Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２７０８０５に記載されている。ｃｒＲＮＡは、１８～４８ヌクレオチド長であり得る。ｃｒＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり得る。１つの例において、ｃｒＲＮＡは、２０ヌクレオチド長である。さらなる実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、予め最適化され、８３ヌクレオチド長である。配列番号３を参照のこと。下記を参照のこと：

上で述べたように、本明細書中に開示されるシステムは、ｓｇＲＮＡなどの１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列に作動可能に連結された、プロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１プロモーターであるがこれらに限定されない）を含み得る。

Ｕ６プロモーターは、以下の核酸配列を含み得る：

Ｕ６ ｓｇＲＮＡ配列は、下記に開示され、ｔｒａｃｒＲＮＡに下線が引かれている。トレーサー配列は、ＲＮＡ転写を終結させるための７つのチミジンを含む。小文字の「ｇ」、「ｇａ」および２つ目の「ｇ」は、ＳａｐＩｒｅｖ部位とＳａｐＩ部位との境界であり、ｓｇＲＮＡをコードする核酸が挿入されている。

いくつかの実施形態において、１つより多いＤＮＡ切断が、１つより多いｓｇＲＮＡを使用することによって導入され得る。例えば、２つの切断を達成するように、２つのｓｇＲＮＡが利用され得る。２つまたはそれを超えるｓｇＲＮＡが、標的核酸において２つまたはそれを超える切断事象を配置するために使用されるとき、ある実施形態では、その２つまたはそれを超える切断事象は、同じまたは異なるＣａｓ９タンパク質によって行われ得ると企図される。例えば、２つの二本鎖切断を配置するために２つのｓｇＲＮＡが使用されるとき、両方の二本鎖切断をもたらすために、単一のＣａｓ９ヌクレアーゼが使用され得る。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ａ）タイプＩＩ Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたドキシサイクリンプロモーター、ｂ）真核細胞において目的の遺伝子とハイブリダイズする１つまたはそれを超えるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓガイドＲＮＡをコードする１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む１つまたはそれを超えるベクターの使用を含む。構成要素（ａ）および（ｂ）は、同じまたは異なるベクター上に位置し得、それによって、１つまたはそれを超えるガイドＲＮＡが、真核細胞において目的の遺伝子を標的とし、Ｃａｓ９タンパク質が、目的の遺伝子を切断する。このようにして、目的の遺伝子の配列が、標的細胞において改変される。好適なベクターは、上記に開示されている。

本開示の方法は、発現の増加または減少を含む、目的の任意の遺伝子を標的とするために使用され得る。したがって、任意の遺伝子をノックインまたはノックアウトするための方法が、本明細書中に開示される。

いくつかの標的は、それらが肝臓に存在するかまたは肝臓の状態が代謝障害である限りにおいて、アミロイドニューロパチー（ＴＴＲ、ＰＡＬＢ）；アミロイドーシス（ＡＰＯＡ１、ＡＰＰ、ＡＡＡ、ＣＶＡＰ、ＡＤ１、ＧＳＮ、ＦＧＡ、ＬＹＺ、ＴＴＲ、ＰＡＬＢ）；肝硬変（ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＣＩＲＨ１Ａ、ＮＡＩＣ、ＴＥＸ２９２、ＫＩＡＡ１９８８）；肝臓脂肪症（ＳＩＲＴ１、ＥＧＦＲ、ＧＨ、ＳＩＲＴ６）；嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ、ＡＢＣＣ７、ＣＦ、ＭＲＰ７）；糖原病（ＳＬＣ２Ａ２、ＧＬＵＴ２、Ｇ６ＰＣ、Ｇ６ＰＴ、Ｇ６ＰＴ１、ＧＡＡ、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰＢ、ＡＧＬ、ＧＤＥ、ＧＢＥ１、ＧＹＳ２、ＰＹＧＬ、ＰＦＫＭ）；肝細胞腺腫、１４２３３０（ＴＣＦ１、ＨＮＦ１Ａ、ＭＯＤＹ３）、早期発症型肝不全および神経障害（ＳＣＯＤ１、ＳＣＯ１、ＨＮＦ４ａ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＨＮＦ１ａ、ＦＸＲ、ＬＸＲ、ＰＰＲａ、ＦＯＸＯ１、ＰＧＣＡ、ＰＸＲ、ＣＡＲ、ＲＸＲ、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ、ＡＢＣＡ１、ＣＸ３２、ＡＢＣＢ１１）、肝リパーゼ欠損（ＬＩＰＣ）、肝芽腫、がんおよび癌（ＣＴＮＮＢ１、ＰＤＧＦＲＬ、ＰＤＧＲＬ、ＰＲＬＴＳ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＬＦＳ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＰＲＩ、ＭＥＴ、ＣＡＳＰ８、ＭＣＨ５；腎髄質嚢胞症（Medullary cystic kidney disease）（ＵＭＯＤ、ＨＮＦＪ、ＦＪＨＮ、ＭＣＫＤ２、ＡＤＭＣＫＤ２）；フェニルケトン尿症（ＰＡＨ、ＰＫＵ１、ＱＤＰＲ、ＤＨＰＲ、ＰＴＳ）；多発性嚢胞腎および多嚢胞性肝疾患（ＦＣＹＴ、ＰＫＨＤ１、ＡＲＰＫＤ、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ４、ＰＫＤＴＳ、ＰＲＫＣＳＨ、Ｇ１９Ｐ１、ＰＣＬＤ、ＳＥＣ６３））；肝臓再生（ＧＨ、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、ＳＨＣ、ＳＯＳ、ＧＲＢ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＥＲＫ１／２、ＦＡＫ、Ｐ１３０、ＣＲＫＩＩ、ＭＥＫＫ、ＪＮＫ、Ｐ３８、ＩＲＳ１－３、Ｐ１３Ｋ、ＡＫＴ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ＧＨＲ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＡＬＳ、ＳＯＣＳ２、ＳＨＰ１、ＥＧＦＲ、ＡＲ、Ｐ２１、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦａ、Ｃ－ＳＲＣ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、Ｐ１１０、Ｐ８５、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＧＳＫ３Ｂ、ＩＫＫ、ＮＦＫＢ、ＣＲＥＢ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ＰＩＰ２、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃ－ＭＹＣ、ＡＤＡＭ１７、ＰＤＧＦａ、ＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、Ｃ／ＥＢＰａ、ｐ２７）、代謝欠陥（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｅｆｉｃｉｎｃｉｅｓ）（ＯＴＣ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＴＤＯ、ＰＥＰＣＫ、ＵＧＴ１Ａ１、Ａ１ＡＴ、ＴＡＴ、ＡＤＨ１、ＣＰＳ）、肝臓解毒（ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８）；胆管細胞の機能（ＣＦＴＲ、ＳＯＸ９、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１ｂ）である。他の好ましい標的としては、ＰＣＳＫ９；Ｈｍｇｃｒ；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＡｐｏＢ；およびまたはＬＤＬのうちの１つまたはそれを超えるものが挙げられるのうちのいずれか１つまたはそれを超えるものが挙げられる（include any one or more of include one or more of）。当然のことながら、本開示の方法は、代謝障害を標的とすることに限定されない。これらの標的は、単に例として提供される。

非限定的な特定の実施形態において、目的の遺伝子は、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ６、ＳＬＣ５Ａ５またはβ－カテニンである。

Ｂ．阻害性核酸分子
阻害性核酸は、目的の任意のタンパク質の発現および／または活性を低下させる。出発体細胞、すなわち得られたｉＰＳＣは、そのような阻害性ＲＮＡをコードする核酸でも形質転換され得る。したがって、ｉＰＳＣは、転写されて阻害性ＲＮＡを生成する核酸分子に作動可能に連結された、肝臓特異的プロモーターなどのプロモーターを含み得る。さらに、ｓｈＲＮＡ配列は、目的の遺伝子に対する活性なｓｈｍｉｒ配列の同定に使用され得る。ｓｈｍｉｒ配列は、ドキシサイクリンによって活性化される誘導性プロモーターの支配下に置かれている。ドキシサイクリンの存在下では、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）が、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）内のｔｅｔＯオペレーター配列を認識する。このシステムは、目的の遺伝子のノックダウンをもたらすｓｈｍｉｒを活性化する。このダウン技術を用いることにより、ゲノム内の任意の遺伝子を８０％超までノックダウンすることができる。いくつかの例では、例えばＳＩＲＴ１に対するｓｈｍｉｒ鋳型オリゴヌクレオチドカセットが、ヒトＥＦ１ａプロモーターの支配下でシャトルプラスミドにクローニングされている。

いくつかの非限定的な具体例において、特定の完全長ＳＩＲＴ１標的ｃＤＮＡのコード領域が、ＰＣＲ増幅され、ｐＶａｌ－標的をもたらす確認ベクターｐＶａｌなどのベクターのＥＧＦＰコード領域の下流にクローニングされる。シャトルプラスミドのＥＦ１ａ標的領域は、組換えクローニングによってｐＶａｌ－標的に移入される。ＮＩＨ－３Ｔ３細胞が、約５０％の培養密度において確認プラスミドでトランスフェクトされ、標準的な細胞培養条件下で４８時間インキュベートされる。次いで、全ＲＮＡが単離され、１μｇが、ランダムヘキサマーおよびオリゴ－ｄＴプライマーの混合物を用いて逆転写される。ＮＴ－ｓｈＲＮＡコントロールベクターによってコードされるマーカー転写物を内部参照遺伝子として用いて、そのベクターでトランスフェクトされた細胞において見られる標的ｃＤＮＡ発現レベルと比べた標的ｃＤＮＡ発現レベルの定量によって、Ｓｈｍｉｒのサイレンシング効率が確認される。検証基準（＞８０％ノックダウン、完全なノックアウトまたはノックイン）を満たすシステムを、ｐｃＬＶｉ（３Ｇ）レンチウイルスベクターにクローニングした。

いくつかの例において、そのような阻害核酸分子は、肝臓において発現される遺伝子の発現または活性を少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはさらには１００％低下させる。１つの実施形態は、標的の発現の干渉または阻害に使用され得るＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えば、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡであるがこれらに限定されない）である。肝臓において発現される遺伝子を特異的に標的とするＲＮＡｉは、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能である。

一般に、ｓｉＲＮＡは、ＤｉｃｅｒまたはＤＣＬ酵素による比較的長い二本鎖ＲＮＡ分子の切断によって生成される（Ｚａｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６：１２６５－１２６９，２００２；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－３６６，２００１）。動物および植物では、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣにアセンブルされ、ＲＩＳＣの配列特異的なリボ核酸分解（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を導き、それによって、細胞質においてｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ標的分子が切断される。核でも、ｓｉＲＮＡは、ヘテロクロマチン関連ヒストンおよびＤＮＡメチル化を導き、個々の遺伝子または大きなクロマチンドメインの転写サイレンシングをもたらす。

本開示は、肝臓において発現される遺伝子の発現の干渉または阻害に適したＲＮＡを使用でき、そのＲＮＡは、発現の干渉または阻害が望まれる標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の一部と実質的に同一の配列を有する約１９～約４０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含む。本開示の目的上、発現の干渉または阻害が望まれる標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と「実質的に同一の」ＲＮＡの配列は、約３０パーセント以下しか異ならず、いくつかの実施形態では、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と約１０パーセント以下しか異ならない。特定の実施形態において、そのＲＮＡの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と全く同一である。

したがって、有用なｓｉＲＮＡは、約１５～約４０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ、および各鎖に０～５ヌクレオチドの長さを有する３’または５’オーバーハングを含み、その二本鎖ＲＮＡの配列は、目的のタンパク質をコードする核酸のｍＲＮＡまたは転写物の一部と実質的に同一である（上記を参照のこと）。特定の例において、その二本鎖ＲＮＡは、目的のタンパク質をコードする核酸と実質的に同一の約１９～約２５ヌクレオチド、例えば、２０、２１または２２ヌクレオチドを含む。さらなる例において、その二本鎖ＲＮＡは、目的のタンパク質をコードする核酸と１００％同一の約１９～約２５ヌクレオチドを含む。この文脈において、「約」とは、整数の量だけを指すことに注意（ｎｏｔ）されたい。１つの例において、「約」２０ヌクレオチドとは、１９～２１ヌクレオチド長のヌクレオチドのことを指す。

二本鎖ＲＮＡにおけるオーバーハングに関して、そのオーバーハングの長さは、一方のオーバーハングの長さが他方の鎖におけるオーバーハングの長さに依存しないという点において、それらの２本の鎖で独立している。具体例において、３’または５’オーバーハングの長さは、少なくとも一方の鎖において０ヌクレオチドであり、いくつかの場合において、それは、両方の鎖において０ヌクレオチドである（したがって、平滑末端のｄｓＲＮＡである）。他の例では、３’または５’オーバーハングの長さは、少なくとも一方の鎖において１ヌクレオチド～５ヌクレオチドである。より詳細には、いくつかの例において、３’または５’オーバーハングの長さは、少なくとも一方の鎖において２ヌクレオチドであるか、または両方の鎖において２ヌクレオチドである。特定の例において、ｄｓＲＮＡ分子は、両方の鎖において２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。

したがって、提供される１つの特定のＲＮＡ実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、２０、２１または２２ヌクレオチドを含み、３’オーバーハングの長さは、両方の鎖において２ヌクレオチドである。本明細書中に提供されるＲＮＡの実施形態において、二本鎖ＲＮＡは、約４０～６０％のアデニン＋ウラシル（ＡＵ）および約６０～４０％のグアニン＋シトシン（ＧＣ）を含む。より詳細には、具体例において、二本鎖ＲＮＡは、約５０％ＡＵおよび約５０％ＧＣを含む。

少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを例えば二本鎖ＲＮＡのセンス鎖にさらに含むＲＮＡも本明細書中に記載される。特定の例において、修飾リボヌクレオチドは、少なくとも一方の鎖の３’オーバーハング、またはより詳細にはセンス鎖の３’オーバーハングに存在する。修飾リボヌクレオチドの例としては、検出可能な標識（例えば、ローダミンまたはＦＩＴＣなどのフルオロフォア）を含むリボヌクレオチド、チオホスフェートヌクレオチドアナログ、デオキシヌクレオチド（この塩基分子はリボ核酸であるので、修飾されているとみなされる）、２’－フルオロウラシル、２’－アミノウラシル、２’－アミノシチジン、４－チオウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、５－（３－アミノアリル）－ウラシル、イノシンまたは２’Ｏ－Ｍｅ－ヌクレオチドアナログが挙げられることが特に企図される。

目的の遺伝子に対するアンチセンス分子およびリボザイム分子も、本明細書中に開示される方法において有用である。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６２：４０，１９９０）。細胞において、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞は、二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は、そのｍＲＮＡの翻訳に干渉する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、それらは、容易に合成され、目的のタンパク質を産生する標的細胞に導入されたとき、それより大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が低いからである。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためにアンチセンス法を使用することは、周知である（例えば、Ｍａｒｃｕｓ－Ｓａｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９，１９８８を参照のこと）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。アンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いた化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を高めるようにもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を高めるようにデザインされた多様な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、とりわけ、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシンが挙げられる。

転写を止めるためにオリゴヌクレオチドを使用することは、オリゴヌクレオチドが二重らせんのＤＮＡに巻きついて三本鎖ヘリックスを形成する三重鎖ストラテジーとして知られている。ゆえに、これらの三重鎖化合物は、選択された遺伝子におけるユニークな部位を認識するようにデザインされ得る（Ｍａｈｅｒら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｄｅｖ．１（３）：２２７，１９９１；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６（６）：５６９），１９９１。このタイプの阻害性オリゴヌクレオチドも、本明細書中に開示される方法において有用である。

リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似の様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子であり、リボザイムもまた有用である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾によって、ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識し、切断する分子を操作することが可能である（Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０，１９８８）。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活性化されるという点である。

リボザイムには基本的なタイプが２つあり、すなわち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５，１９８８）および「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基長の配列を認識し、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、１１～１８塩基長の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種にもっぱら存在する確率が高くなる。その結果として、特定のｍＲＮＡ種を不活性化する場合、ハンマーヘッド型リボザイムが、テトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基の認識配列が、それより短い認識配列よりも好ましい。

様々な送達系が知られており、それらを用いることにより、ｓｉＲＮＡおよび他の阻害性核酸分子を治療薬として投与することができる。そのような系としては、例えば、リポソームによる被包、微小粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、治療的分子を発現することができる組換え細胞（例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９，１９８７を参照のこと）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての治療的核酸の構築などが挙げられる。Ｃａｓ９を導入するための上記に開示されたいずれのベクターも、阻害性核酸を導入するためにも使用することができる。

ｉＰＳＣを作製するためのリプログラミング
当業者に公知の方法を用いて人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するために、体細胞がリプログラムされ得る。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製できる。例えば、米国特許出願公開番号２００９０２４６８７５、米国特許出願公開番号２０１０／０２１００１４；米国特許出願公開番号２０１２０２７６６３６；米国特許第８，０５８，０６５号；米国特許第８，１２９，１８７号；米国特許第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６９６６６Ａ１および米国特許第８，２６８，６２０号（これらは参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。一般に、核リプログラミング因子を用いることにより、体細胞から多能性幹細胞が作製される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つまたは少なくとも４つが使用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４が、使用される。

体細胞からｉＰＳＣを誘導することができる一般に１つまたはそれを超える因子である核リプログラミング物質またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）で細胞が処理される。核リプログラミング物質には、一般に、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２、またはこれらの分子をコードする核酸が含まれる。ｐ５３の機能的な阻害剤、Ｌ－ｍｙｃまたはＬ－ｍｙｃをコードする核酸、およびＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂまたはＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸が、さらなる核リプログラミング物質として使用され得る。Ｎａｎｏｇも、核リプログラミングに使用され得る。米国特許出願公開番号２０１２／０１９６３６０に開示されているように、ｉＰＳＣを作製するための例示的なリプログラミング因子としては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７またはＳｏｘ１８で置き換えることができ；Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置き換え可能である）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇで置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；または（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇで置き換え可能である）が挙げられる。１つの非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃが、使用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２が使用される。例えば、米国特許第７，６８２，８２８号（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。これらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２が含まれるが、これらに限定されない。他の例では、それらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２が使用される。他の非限定的な例において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＳａｌ４が使用される。

これらの核リプログラミング物質のマウスｃＤＮＡ配列およびヒトｃＤＮＡ配列は、ＷＯ２００７／０６９６６６（参照により本明細書中に援用される）で述べられているＮＣＢＩアクセッション番号に照らして入手可能である。１つもしくはそれを超えるリプログラミング物質またはこれらのリプログラミング物質をコードする核酸を導入するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開番号２０１２／０１９６３６０および米国特許第８，０７１，３６９号（この両方が参照により本明細書中に援用される）に開示されている。

細胞は、核リプログラミング物質とともに培養された後、例えば、幹細胞の培養に適した条件下で培養され得る。マウス細胞の場合、培養は、通常の培地に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を分化抑制因子として加えて行われる。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を加えることが望ましい。

いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終結させるために放射線または抗生物質で処置されたマウス胎仔線維芽細胞の共存下で培養される。フィーダーとしてよく使用されるマウス胎仔線維芽細胞としては、ＳＴＯ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５０３）などが挙げられ；ｉＰＳＣを誘導する場合、有用な細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子およびＬＩＦ遺伝子をＳＴＯ細胞（ＳＮＬ７６／７ ＳＴＯ細胞；ＥＣＡＣＣ ０７０３２８０１）（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．＆ Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｃｅｌｌ ６２，１０７３－１０８５，１９９０）などに安定的に組み込むことによって作製され得る。マイトマイシンＣで処置されたＭＥＦは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手可能である。ガンマ照射されたＭＥＦは、一般に、Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔｅｍから商業的に入手可能である。一般に、体細胞には、ＭＥＦの非存在下においてリプログラミング因子を形質導入する。いくつかの実施形態において、形質導入の約７～８日後に、それらの細胞は、ＭＥＦ上に再播種される。

重要な多能性因子であるＮＡＮＯＧの発現および胚性幹細胞特異的な表面抗原（ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１）が、完全に再プログラムされたヒト細胞を同定するために日常的に使用されている。機能的なレベルにおいて、ｉＰＳＣは、胚の３つすべての胚葉から系統に分化する能力も示す。

いくつかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣを作製するように体細胞を誘導する際、それらの細胞がドキシサイクリンに曝露されると、１０％超のヒト人工多能性幹細胞が、Ｃａｓ９を発現する。さらなる実施形態では、細胞がドキシサイクリンに曝露されると、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％または約５０％超のヒト人工多能性幹細胞が、Ｃａｓ９を発現する。非限定的な具体例では、細胞がドキシサイクリンに曝露されると、約３５％～約４５％（例えば、約３８％～約４２％、例えば約４０％）のヒト人工多能性幹細胞が、Ｃａｓ９を発現する。この文脈において、「約」は、１パーセント以内を示唆する。他の実施形態において、細胞がドキシサイクリンに曝露されると、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％超のヒト人工多能性幹細胞クローンまたはコロニーが、Ｃａｓ９を発現する。非限定的な具体例では、細胞がドキシサイクリンに曝露されると、３５％～４５％（例えば、３８％～４２％、例えば４０％）のヒト人工多能性幹細胞クローンまたはコロニーが、Ｃａｓ９を発現する。

ｉＰＳＣの分化
ヒトｉＰＳＣをヒト肝細胞に分化させるためのいくつかの方法が、本明細書中に開示される。本開示の方法において、インビトロ工程を用いることにより、ヒトＩＰＳＣからヒト肝細胞が作製される。必要に応じて、そのヒト肝細胞は、免疫無防備状態の動物（例えば、免疫無防備状態のトランスジェニックラットであるがこれに限定されない）において拡大され得る。

いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞を作製するための方法が、本明細書中に提供される。その方法は、ａ）有効量のアクチビンＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４を含む第１の培地中でヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、中内胚葉細胞が作製されるのに十分な長さの時間にわたって培養する工程を含む。特定の分化誘導条件の存在下において、中内胚葉細胞は、肝臓細胞を含む内胚葉および内胚葉誘導体を作製することができ、中胚葉および中胚葉誘導体（例えば、心筋および骨格筋、血管平滑筋、内皮ならびに造血細胞）を作製することもできる。いくつかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣは、第１の培地中で２～３日間（例えば、２、２．５または３日間）培養される。培養条件は、一般に、約３７℃および大気酸素（例えば、約２１％酸素）における標準的な培養条件である。

いくつかの非限定的な例において、第１の培地は、例えば、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（例えば、約１００～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ）を含み得る。したがって、第１の培地は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含み得る。さらなる非限定的な例において、第１の培地は、約１０～約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２（例えば、約２０～約５０ｎｇのＦＧＦ－２）を含み得る。したがって、第１の培地は、約２０、２５、３０、３５、４０、３５または５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含み得る。さらなる非限定的な例において、第１の培地は、約２０～約１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４（例えば、約３０～約９０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４）を含み得る。したがって、第１の培地は、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４を含み得る。その培地は、いくつかの非限定的な例において、毎日または１日おきに取り替えられ得る。第１の培地中でＩＰＳＣを培養することにより、中内胚葉細胞が作製される。

次いで、中内胚葉細胞が、外から加えられたＦＧＦ－２およびＢＭＰ－４の非存在下において有効量のアクチビンＡを含む第２の培地中で、胚体内胚葉細胞が作製されるのに十分な長さの時間にわたって培養される。いくつかの実施形態において、中内胚葉細胞は、第２の培地中で約２～約３日間（例えば、２、２．５または３日間）培養されることにより、胚体内胚葉細胞が作製される。いくつかの非限定的な例において、第２の培地は、例えば、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（例えば、約１００～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ）を含み得る。したがって、第１の培地は、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含み得る。さらなる非限定的な例において、第２の培地は、有効量のＬ－グルタミンをさらに含む。例えば、第２の培地は、約０．５～約２％体積／体積（ｖ／ｖ）のＬ－グルタミン（例えば、約０．５％、１．０％、１．５％または２％Ｌ－グルタミンを含み得る。第２の培地は、例えば、毎日または１日おきに取り替えられ得る。

胚体内胚葉は、有効量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む第３の培地中で培養される。いくつかの実施形態において、第３の培地は、約１～約３パーセント体積／体積（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（例えば、約１、１．５、２、２５または３パーセントｖ／ｖのＤＭＳＯ）を含む。さらなる実施形態において、第３の培地は、約２０～約１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦ（例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ ＨＧＦ）を含む。非限定的な具体例において、第３の培地は、約２０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。さらなる非限定的な例において、第３の培地は、有効量のＬ－グルタミンをさらに含む。例えば、第３の培地は、約０．５～約２％体積／体積（ｖ／ｖ）のＬ－グルタミン（例えば、約０．５％、１．０％、１．５％または２％Ｌ－グルタミン）を含み得る。通常、第３の培地は、低グルコース培地であり、例えば、０．２～２グラム／リットルのグルコースを含む。胚体内胚葉は、第３の培地中で約８～約１４日間（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間）培養されることにより、肝特異化細胞（ステージ３）が作製される。第３の培地は、毎日または１日おきに補充され得る。

いくつかの実施形態において、肝特異化細胞は、免疫無防備状態の動物に移植される。下記を参照のこと。したがって、肝特異化細胞は、免疫無防備状態の動物において肝細胞に分化し、また、免疫無防備状態の動物において拡大される。

必要に応じて、肝特異化細胞は、有効量のＨＧＦ、ウルソデオキシコール酸、コレステロール、パルミチン酸、オレイン酸、リファンピシン、および必要に応じてコレステロールを含む第４の培地中で培養されることにより、ヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞（ｉＨｅｐ）が作製される。通常、第４の培地は、低グルコース培地であり、例えば、約０．２～約２グラム／リットルのグルコースを含む。第４の培地は、毎日または１日おきに補充され得る。

いくつかの実施形態において、第４の培地は、約２０～約１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦ（例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬのＨＧＦ）を含む。非限定的な具体例において、第４の培地は、約２０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦを含む。さらなる実施形態において、第４の培地は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭウルソデオキシコール酸（例えば、約７５～約１２５ｍＭウルソデオキシコール酸、例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０ｍＭウルソデオキシコール酸）を含む。さらなる実施形態において、第４の培地は、約１０μＭ～約５０μＭパルミチン酸（例えば、２０μＭ～約４０μＭパルミチン酸）を含む。非限定的な具体例において、第４の培地は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０μＭパルミチン酸を含む。さらなる実施形態において、第４の培地は、約１０μＭ～約５０μＭオレイン酸（例えば、２０μＭ～約４０μＭオレイン酸）を含む。非限定的な具体例において、第４の培地は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０μＭオレイン酸を含む。なおもさらなる実施形態において、第４の培地は、約１０μＭ～約５０μＭリファンピシン（例えば、２０μＭ～約４０μＭリファンピシン）を含む。非限定的な具体例において、第４の培地は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０μＭリファンピシンを含む。

さらなる実施形態において、第４の培地は、有効量のＬ－グルタミン、ＤＭＳＯおよび／またはデキサメタゾンをさらに含む。例えば、第４の培地は、約０．５～約２％ｖ／ｖのＬ－グルタミン（例えば、約０．５％、１．０％、１．５％または２％Ｌ－グルタミン）を含み得る。さらなる例において、第４の培地は、約１～約３パーセントｖ／ｖのＤＭＳＯ（例えば、約１、１．５、２、２．５または３パーセントｖ／ｖのＤＭＳＯ）を含む。さらなる例において、第４の培地は、約０．５～約２ｍＭデキサメタゾン（例えば、約０．５、１．０、１．５または２ｍＭデキサメタゾン）を含む。

上記の方法は、ヒトｉＨｅｐをインビボにおいて（例えば、免疫無防備状態の非ヒト動物の肝臓において）拡大する工程も含み得る。この拡大は、下記の項に開示される。

他の実施形態において、本開示の方法によって作製された細胞は、それらの細胞が凍結されたとき生存可能であるように、細胞膜に組み込まれ、その構造を変化させ得る凍結保存剤を使用することなどによって、凍結保存され得る。凍結保存剤の例示的な非限定的な例は、グリセロールおよびＤＭＳＯである。

哺乳動物宿主における肝細胞の拡大
本開示の方法は、肝特異化（ステージ３）細胞および／またはヒトｉＨｅｐ（ステージ４）を免疫無防備状態の非ヒト動物に移植する工程を含み得る。任意の免疫無防備状態の非ヒト動物を、本明細書中に開示される方法において使用することができる。いくつかの非限定的な具体例において、免疫無防備状態の非ヒト動物は、ラット、マウス、ブタまたはウサギである。免疫無防備状態の非ヒト動物は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のマウスもしくはラットを有し得るか、またはヌードマウスもしくはヌードラットであり得る。他の例では、免疫無防備状態の動物は、フマリルアセト酢酸（ｆｕｍａｒｙｌａｅｔｏａｃｅｔａｔｅ）ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）欠損のマウス、ラットおよび／またはブタである。特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５９３７；米国特許出願番号１４／２４１，３１６および米国特許第９，０００，２５７号（すべてが参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。

肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐは、当該分野で公知の任意の好適な手段を用いて任意の組織に移植され得る。１つの実施形態において、収集されたヒト肝特異化細胞および／またはｉＨｅｐは、レシピエント動物の脾臓に、注射などによって移植される。別の実施形態において、拡大されたヒト成熟肝細胞（ステージ５の後）は、レシピエント動物の肝臓に移植される。

ヒト肝特異化細胞および／またはｉＨｅｐは、ヒト成熟肝細胞の作製および拡大を可能にするのに十分な時間にわたってレシピエント動物において保持される。拡大のための正確な時間は、日常的な実験によって経験的に決定され得る。１つの実施形態において、ヒト肝細胞は、最大６ヶ月間拡大される。別の実施形態において、ヒト成熟肝細胞は、少なくとも約４週間、少なくとも約６週間、少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２４週間、少なくとも約２８週間、少なくとも約３６週間、少なくとも約４８週間、少なくとも約７２週間および少なくとも約９６週間、拡大される。ヒト肝細胞の拡大の程度は、様々であり得る。いくつかの実施形態において、レシピエントラットにおけるヒト肝細胞の拡大は、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍の増加をもたらす。

肝臓におけるヒト肝細胞の生着、成熟および拡大の成功には、いくらかの程度の肝機能不全を有する免疫無防備状態の動物が必要である。異なる種々のタイプの免疫無防備状態のマウス（ＲＡＧ－２ノックアウトマウスまたはＳＣＩＤマウスを含み、この両方がＢ細胞およびＴ細胞を欠く）のマウス肝臓では、ヒト肝細胞が再増殖されてきた（米国特許第６，５０９，５１４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０７３３８；米国特許出願公開番号２００５－０２５５５９１（参照により本明細書中に援用される））。いくつかのグループが、げっ歯類において初代ヒト肝細胞を生着させ、拡大させた（米国特許第６，５０９，５１４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／０７３３８；米国特許出願公開番号２００５－０２５５５９１）。Ｄａｎｄｒｉら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３３：９８１－９８８，２００１）は、ヒト肝細胞の、マウス肝臓での再増殖の成功を報告した。それ以来、他のグループも、マウスにおけるヒト肝臓細胞生着の成功を報告した。さらに、ＰＣＴ公開番号２００８／１５１２８３（参照により本明細書中に援用される）は、Ｆａｈ欠損動物、および肝細胞を拡大するためのそれらの使用を開示している。

いくつかの実施形態において、レシピエントは、その動物における天然の肝臓細胞の成長反応を阻害する作用物質で処置される。その因子は、例えば、放射線照射、またはレトロルシン、またはチロシンキナーゼ阻害剤である抗悪性腫瘍剤（例えば、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）であるがこれに限定されない）、または抗悪性腫瘍性アルキル化剤（例えば、シスプラチンであるがこれに限定されない）であり得る。簡潔には、ヒト肝細胞をレシピエントに移植する前に、レシピエントの肝臓細胞の成長反応を阻害するのに十分な長さの時間にわたって、有効量の作用物質がレシピエントに投与される。

リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）およびインターロイキンレセプターの共通ガンマ鎖（Ｉｌ２ｒｇ）が欠損している二重変異ラットは、ヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞をインビボにおいて拡大するための効率的なインビボシステムを提供する。したがって、いくつかの実施形態、免疫無防備状態の非ヒト動物は、Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－動物（例えば、マウスまたはラット）である。いくつかの非限定的な例において、本方法は、Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－が欠損しているラットを使用し得る。

１つの実施形態において、上記ラットは、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９）をコードする核酸分子も含むＲａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットである。例示的なＣａｓｐ９アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ００１２２９（２０１７年１月２０日、参照により本明細書中に援用される）に開示されている。Ｃａｓｐ９をコードする核酸は、肝臓において発現されるプロモーター（肝臓特異的プロモーター）（例えば、アルブミンプロモーターもしくはトランスサイレチンプロモーターおよび／またはアルファ－１－抗トリプシンプロモーターであるがこれらに限定されない）に作動可能に連結され得る。肝臓特異的プロモーターの非限定的な例は、Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＬＳＰＤ，ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ／）に提供されており、例えば、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたはＴＴＲ最小プロモーター（ＴＴＲｍ）、アルファ１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、アルブミン（ＡＬＢ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）プロモーターまたは最小プロモーター、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）プロモーター、ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）プロモーター、ヘモペキシン（ＨＰＸ）プロモーターまたは最小プロモーター、ニコチンアミドＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）プロモーターまたは最小プロモーター、（肝臓）カルボキシエステラーゼ１（ＣＥＳ１）プロモーターまたは最小プロモーター、プロテインＣ（ＰＲＯＣ）プロモーターまたは最小プロモーター、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）プロモーターまたは最小プロモーター、マンナン結合レクチンセリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）プロモーターまたは最小プロモーター、ヘプシジン（ｈｅｐｃｉｄｉｎ）抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）プロモーターまたは最小プロモーター、およびセルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＣ（アンチトロンビン），メンバー１（ＳＥＲＰＩＮＣ１）プロモーターまたは最小プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは、有意な程度の、導入遺伝子の肝臓特異的発現をインビボにおいて（および／または肝細胞／肝細胞株においてインビトロで）もたらす。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＦＫＢＰ１２などのＦＫ５０６結合タンパク質をコードする核酸にも作動可能に連結され得る。選択的なアポトーシスが含められ得る。Ｄｉ Ｓｔａｓｉら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ ３；３６５（１８）：１６７３－８３およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１１４６８６２（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。

外来性Ｃａｓｐ９をコードする遺伝子を含む免疫無防備状態のラット（Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－）が、インビボにおけるヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞（ｉＨｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞の生着および拡大のために使用され得ることが本明細書中に記載される。

いくつかの実施形態において、トランスジェニックラットは、融合タンパク質、詳細には、カスパーゼ９（Ｃａｓｐ９、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ００１２２９、２０１７年２月１１日、参照により本明細書中に援用される）に融合されたＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）（例えば、ＦＫＢＰ１２）をコードする核酸に作動可能に連結された肝臓特異的組織プロモーターを含む。ＦＫＢＰ１２（例えば、ＧＥＮＢＮＡＫ（登録商標）番号ＡＨ００２８１８、２０１７年２月１１日、参照により本明細書中に援用される）は、Ｃａｓｐ９に直接融合され得るか、またはＦＫＢＰ１２とＣａｓｐ９との間にリンカーが含められ得る。そのリンカーは、例えば、４～１０アミノ酸長（例えば、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長）であり得る。好適なリンカーは、当該分野で公知である。非限定的な具体例において、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターおよび／またはトランスサイレチンプロモーターおよび／またはアルファ－１－抗トリプシンプロモーターである。

カスパーゼ－９は、アポトーシスおよびサイトカインプロセシングに関わるシステインプロテアーゼのカスパーゼファミリーのメンバーである。細胞は、アポトーシス刺激を受けると、ミトコンドリアがシトクロムｃを放出し、次いで、そのシトクロムｃは、ｄＡＴＰとともに、哺乳動物のＣｅｄ－４ホモログであるＡｐａｆ－１に結合する。Ｆ３６がＶに置換した、完全な成熟コード配列を有するヒト１２ｋＤａ ＦＫ５０６結合タンパク質は、合成二量体化薬であるＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１－９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １ １，１５６６－７２（１９９３）（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。

有用なプラスミドの１つの非限定的な具体例は、本明細書中に開示されるｐＥＡＬＢ１２３－ｉＣａｓｐ９＿ＩＲＥＳ－ＧＦＰである。そのｐＥＡＬＢ１２３－ｉＣａｓｐ９＿ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドを、プラスミドｐＥＡＬＢ１２３ＣＡＴ（Ｗｅｎ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５，１４：２６７－７２（参照により本明細書中に援用される）からアルブミン／αフェトプロテインのラットプロモーター／エンハンサー配列、およびプラスミドｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ Ｃａｓｐ９．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ２ Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１５５６７、Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０５：４２４７－５４（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）からＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）－ｐ３０Ｃａｓｐａｓｅ９配列をクローニングすることによって構築した。このプラスミドにおいて使用されるラットアルブミンプロモーターは、ラット肝細胞だけで発現されることから、ラット肝細胞だけが、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）－ｐ３０Ｃａｓｐａｓｅ９配列を発現し得ることが保証される。この改変されたカスパーゼ９システムは、改変されたＦＫ結合タンパク質に融合されて、誘導化合物の存在下における条件的な二量体化を可能にする。ｐＥＡＬＢ１２３ＣＡＴから使用される配列は、以下である：

ｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ Ｃａｓｐ９．ＩＲＥＳ．ＧＦＰから使用される配列は、以下である：

コードされる例示的なアミノ酸配列は、以下である：
iCasp9:

GFP:

AmpR:

ＬａｃＺアルファ：
PFAIQAAQLLGRAIGAGLFAITP（配列番号１３）
リンカー：
以下によってコードされる、ＡｌｂプロモーターとｉＣａｓｐ９との間のリンカー：
ATTACGCCACC（配列番号１４）
ｉＣａｓｐ９とＩＲＥＳ／ＧＦＰとの間のリンカー：
GA

以下の構成要素が、有用な構築物に含められ得る。
ＭＬＶ－ＬＴＲ：
CGTCTGTACTAGT（配列番号１５）
開始アルファフェトプロテインエンハンサー：
CCGCGGACACTGC（配列番号１６）
複合体３エンハンサー：

複合体２エンハンサー：

複合体１エンハンサー：

終結アルファフェトプロテインエンハンサー：
TTCTGACCTCTGCAG（配列番号２０）

Ａｌｂ１２３プロモーター：

HNF1:
GGTTAATGATCTACC（配列番号２２）
ＴＡＴＡボックス：
TATATTAT

Icasp9:

IRES:

GFP:

ポリＡ：

ＬａｃＯ：
AATTGTTATCCGCTCACAATTCC（配列番号２７）
ＣｏｌＥ１開始点：

AmpR:

ＬａｃＺアルファ：
CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCA（配列番号３０）
Ｍ１３－フォワード：
TGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号３１）。

ＦＫＢＰ１２およびＣａｓｐ９を含む融合タンパク質に作動可能に連結されたアルブミンプロモーターを有する導入遺伝子は、本明細書中で「ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９」と称される。理論に拘束されるものではないが、アルブミンプロモーターは、肝臓細胞においてのみ発現を提供する。ＦＫＢＰ１２構成要素は、条件的な二量体化を提供し、詳細には、二量体化の小分子化学誘導物質（small molecule chemical induce）、すなわちＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７でトランスジェニック動物を処置した際に条件的な二量体化を提供する。ＡＰ１９０３の化学式は、Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０である。ＡＰ２０１８７の化学式は、Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０である。これらの分子を下記に示す。

したがって、いくつかの実施形態において、ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９を含む導入遺伝子を含むラットが、本開示の方法において使用される。そのラットは、例えば、Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットであり得る。いくつかの実施形態において、そのラットは、細胞質内のカスパーゼ－３を活性化して、レシピエントラットの肝細胞においてアポトーシスを直接引き起こす、有効量の二量体化の化学誘導物質（ＡＰ１９０３および／またはＡＰ２０１８７）で処置される。二量体化の化学誘導物質（ＡＰ１９０３）は、いくつかの経路（腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下および経口）によって投与され得る。用量は、ラット肝細胞の成長を阻害し得る、例えば、約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１～約１０ｍｇ／ｋｇ）であり得る。これらの化合物の投与および効果は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／１４６８６２（参照により本明細書中に援用される）に開示されている。

図１３Ｂおよび図２１は、例示的な有用な構築物を示している。例示的な完全な核酸配列を下記に提供する：

ヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞の生着および拡大は、驚いたことに、免疫無防備状態のラット（例えば、ＡＬＢ－ｉＣａｓ９導入遺伝子を含むＲａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラット）において非常に効率的である。例えば、１００万～１０００万個、例えば、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万または９００万個のヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞が、ラットに注射され得る。１０％効率と仮定すると、１００，０００～１’０００，０００個のヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞が、レシピエントラットにおいて生着する。次いで、後の拡大からの平均収量は、約１億個～約１０億個のヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞であり、これは、１００～１０００倍の細胞数増加に等しい。本開示のラットは、ヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞の連続移植にも使用され得る。連続移植は、複数のラットを必要とし得、ヒト肝特異化細胞および／またはヒトｉＨｅｐおよび／またはヒト成熟ｉ肝細胞および／またはヒト胎児肝細胞および／またはヒト成体肝細胞のさらなる拡大をもたらし得る。

インビボにおいてヒト肝細胞を拡大する方法が本明細書中に開示され、その方法は、単離されたヒト肝細胞を注射などによって免疫無防備状態の非ヒト動物（例えば、免疫無防備状態のラット（であるがこれに限定されない））に移植する工程、およびそのヒト肝細胞を拡大する工程、および拡大されたヒト肝細胞を免疫無防備状態の非ヒト動物から回収する工程を含む。

例示的な使用
肝細胞の導入によって患者の肝臓組織を再構成することは、肝臓移植を予想した一時的な処置として、または孤立性代謝欠損（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３－６１，１９９８）を有する患者に対する最終的処置として、急性肝不全を有する患者にとって有望な治療の選択肢である。肝細胞の再構成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝的に改変された肝細胞を導入するため、あるいは疾患、物理的損傷もしくは化学的損傷または悪性疾患の結果として失われた肝細胞に取って代わるために、用いられ得る（米国特許第６，９９５，２９９号）。例えば、家族性高コレステロール血症に罹患している患者の遺伝子治療においてトランスフェクトされた肝細胞を使用することが報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３５，１９９４）。さらに、拡大されたヒト肝細胞を使用して人工肝臓補助デバイスを占める（populate）ことができる（米国特許第９，４８５，９７１号（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。本開示の方法によって作製される細胞に対する例示的な使用は、例えば、米国特許第９０９０８７８号に提供されている。いくつかの例示的な使用を下記に列挙する。

本開示の方法は、被験体の肝臓を再構成するための肝細胞を作製することができる。肝細胞の導入（「肝細胞移植」とも称される）によって患者の肝臓組織を再構成することは、肝臓移植を予想した一時的な処置として、または孤立性代謝欠損（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５：５３－６１，１９９８）もしくは肝硬変を有する患者に対する最終的処置として、急性肝不全を有する患者にとって有望な治療の選択肢である。肝不全は、肝炎などの感染によっても引き起こされ得る。

治療的な肝臓再構成を達成する際の主な障壁は、「同種移植片拒絶反応」（宿主の細胞とドナーの細胞が遺伝的かつ表現型的に異なる場合）と称される現象である、宿主による移植肝細胞の免疫拒絶である。同種移植片拒絶反応の予防において、免疫抑制剤は、部分的にしか成功していない（Ｊａｖｒｅｇｕｉら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５：３５３－３６７，１９９６；Ｍａｋｏｗｋａら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ４２：５３７－５４１，１９８６）。

本明細書中で作製されるヒト肝細胞は、被験体のＭＨＣとマッチし得、かつ／または被験体自身の細胞から作製され得るので、それらは、自家性である。いくつかの実施形態において、その肝細胞は、外来性遺伝子を含む。他の実施形態において、その肝細胞は、遺伝的欠損を修正するためにヒト宿主に移植される。例示的な使用を下記に開示する。

（１）肝機能不全および／または肝不全の治療：
本明細書中に開示される方法によって作製された細胞を投与することによって、肝臓の欠陥を処置する方法が開示される。これらの細胞は、肝臓の欠陥（例えば、中毒性肝疾患、代謝性肝疾患、急性肝壊死、アセトアミノフェンの作用、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、クリグラー・ナジャー、遺伝性チロシン血症、家族性肝内胆汁分泌停止（ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｓ）３型、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠乏、および尿素回路障害であるがこれらに限定されない）を有する任意の被験体に投与され得る。本開示の方法によって作製された細胞は、肝炎（例えば、慢性ウイルス性Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎および急性Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎）またはサイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスによる感染症を処置するためにも使用され得る。本開示の方法によって作製された細胞は、トキソプラズマ症、肝脾住血吸虫症によって引き起こされる肝機能不全、梅毒、レプトスピラ症およびアメーバ症に関連する肝機能不全を処置するためにも使用され得る。本開示の方法によって作製された細胞は、代謝疾患（例えば、ヘモクロマトーシス、ジルベール症候群、デュビン・ジョンソン症候群およびローター症候群であるがこれらに限定されない）を処置するためにも使用され得る。本開示の方法によって作製された細胞は、アルコール性肝疾患（例えば、脂肪肝、線維症、硬化症、肝硬変および中毒性肝疾患などの状態であるがこれらに限定されない）を処置するためにも使用され得る。

（２）バイオ人工肝臓（ＢＡＬ）デバイス
末期肝不全を有する患者において、ＢＡＬデバイスを使用すれば、肝臓移植までの時間を埋めることができる。ＢＡＬデバイスは、肝臓が行う解毒機能を支援するようにデザインされているので、急性肝不全に関連するＣＮＳ合併症のリスクおよび重症度を低下させる。ＢＡＬデバイスは、３つの患者群：劇症肝不全を有する患者、目前に迫る移植を待っている患者、および肝臓移植を早期に失敗した患者にとって有益であり得る。いくつかの肯定的な結果が、肝不全を有する患者において見られたが、ＢＡＬデバイスの有用性のさらなる調査は、好適な細胞が不足していることによって妨げられている。現在のところ、腫瘍細胞接種、免疫応答および人獣共通感染症の可能性に関連し得る腫瘍由来細胞株または動物細胞が、使用されている。大量のヒト肝細胞（ｈｅｐａｔａｏｃｙｔｅ）が利用可能になれば、最適化された（ｏｐｔｉｍａｉｎｚｅｄ）ＢＡＬデバイスの作製によって、肝臓が自発的に再生するまでまたはドナーの肝臓が入手可能になるまで患者をつなぐことができることになる。

（３）薬学的試験
創薬では、１つまたはそれを超える化合物を、肝細胞の機能または表現型を調節する能力についてスクリーニングすることが必要である。したがって、本開示の方法によって作製された細胞は、薬理学的作用物質の効果を判定するためのアッセイにおいて使用され得る。これらのアッセイは、本開示の方法によって作製された細胞に対してインビトロにおいて行われ得るか、または本開示の方法によって作製された肝細胞を移植された動物においてインビボで行われ得る。

これらのアッセイでは、タンパク質またはＲＮＡが評価され得る。これは、当該分野で利用可能な周知の技法のいずれか（例えば、ＦＡＣＳおよび他の抗体ベースの検出方法、ならびにＰＣＲおよび他のハイブリダイゼーションベースの検出方法）によって行われ得る。試験される作用物質の１つまたはそれを超える生物学的効果についての生物学的アッセイを行うこともできる。発現／分泌に対するアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ドットブロットおよび免疫組織化学が挙げられるが、これらに限定されない。

大規模なコンビナトリアルライブラリーを用いて細胞をスクリーニングすることによって、作用物質を同定することができる。これらの化合物ライブラリーは、有機小分子、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡアプタマー、ペプチド、抗体、非抗体タンパク質、サイトカイン、ケモカインおよび化学誘引物質を含むがこれらに限定されない作用物質のライブラリーであり得る。

いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞（またはトランスジェニック動物において拡大され、収集されたヒト肝細胞）を移植されたラットなどのトランスジェニック動物を使用することにより、薬物代謝および薬物動態のいくつかのパラメータのうちのいずれか１つが評価される。例えば、薬物代謝、インビボにおける薬物／薬物相互作用、薬物半減期、排泄／排出の経路、尿、便、胆汁、血液または他の体液中の代謝産物、シトクロムｐ４５０誘導、腸肝再循環および酵素／トランスポーター誘導を評価する研究が行われ得る。

いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞（またはトランスジェニック動物において拡大され、収集されたヒト肝細胞）を移植されたトランスジェニックラットなどのトランスジェニック動物を使用することにより、化合物（治療薬または候補作用物質（例えば、小分子または生物製剤）、環境トキシンまたは生物学的トキシンを含む）または遺伝子送達系の毒性および安全性が評価される。例えば、ヒト肝細胞の細胞周期増殖が評価され得る（例えば、化合物への曝露後のがんのリスクを判定するために）。肝細胞に対する毒性も、組織学的検査、アポトーシス指標、肝機能検査などによって評価され得る。肝細胞代謝の解析（例えば、安定な同位体前駆体の感染後の代謝産物の解析）も行われ得る。

特定の薬物の有効性も、ヒト肝細胞を移植されたラットなどのトランスジェニック動物において評価され得る。そのような薬物としては、例えば、高脂血症／アテローム性動脈硬化症、肝炎およびマラリアを処置するための薬物が挙げられる。

いくつかの実施形態において、ヒト肝細胞（または本開示のトランスジェニックラットにおいて拡大され、収集されたヒト肝細胞）を含む本開示のトランスジェニックラットは、遺伝子治療プロトコルおよびベクターを調べるために使用される。例えば、以下のパラメータが評価され得る：ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む遺伝子送達ビヒクルの形質導入効率；遺伝的ペイロードの組み込みの頻度および位置（組み込み部位の解析）；遺伝的ペイロードの機能性（遺伝子発現レベル、遺伝子ノックダウン効率）；および遺伝的ペイロードの副作用（インビボのヒト肝細胞における遺伝子発現またはプロテオミクスの解析）。

選別された新鮮ヒト肝細胞は、臨床上の自家細胞移植に使用することができる。患者由来のｉＰＳ細胞が、代謝性遺伝的肝疾患（例えば、尿素回路障害、分岐鎖アミノ酸障害、クリグラー・ナジャー症候群、原発性高シュウ酸尿症、家族性高コレステロール血症、ニーマン・ピックｃ型、コレステリルエステル貯蔵病、ウィルソン病、新生児ヘモクロマトーシス、チロシン血症、糖原病、アルファ－１－抗トリプシン欠損症（alpha-1-antitrypsisn deficiency）、ミトコンドリア欠損症、フェニルケトン尿症であるがこれらに限定されない）を引き起こす単一変異を有する場合、これらの患者由来のｉＰＳ－肝細胞は、遺伝子編集され、門脈経路を用いた患者の肝臓への細胞注入によって直接患者に移植して戻され得る。これらの患者由来のｉＰＳ－肝細胞は、自家移植のための肝臓移植片を生物工学処理するためにも使用され得る。例えば、公開番号：ＷＯ２０１５１６８２５４（参照により本明細書中に援用される）の特許のＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＡＲＴＩＦＩＣＩＡＬ ＯＲＧＡＮＳ，ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ。

本開示は、以下の非限定的な実施例によって例証される。

実施例１
例示的な方法
ヒトｉＰＳＣを作製するための方法の模式図を図２に示す。
Ａ－単一細胞継代による分化の惹起
・分化を開始する前に、分化しているｈｉＰＳコロニーをマークし、吸引する。
・ｈｉＰＳコロニーが６０％コンフルエンスに達したら、それらを慎重にＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理によって単一細胞として剥離する。
・ｈｉＰＳ細胞を３００Ｇで遠心分離し、ｍＴｅＳＲに再懸濁する。
・５０万～２００万個のｈｉＰＳ細胞を、ＧＦＲでコーティングされた６ウェルプレートにプレーティングし、低酸素恒温器において一晩維持する。

Ｂ－胚体内胚葉の分化（ステージ１および２）
・細胞が、２０～３０％のコンフルエンスに達したら（図３）、ＲＰＭＩ、インスリン補充なしのＢ２７、１％の非必須アミノ酸、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２を含む限定培地を、その細胞に２日間にわたって毎日加え、細胞を通常の０_２恒温器に入れる（ステージ１）。
・ＲＰＭＩ、インスリン補充なしのＢ２７、１％の非必須アミノ酸、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡを含む限定培地を、その細胞に２日間にわたって毎日加え、細胞を通常の０_２恒温器に入れる。
・４日間の分化の後、細胞のサブセットを胚体内胚葉分化について試験する（ステージ２）。
・内胚葉（Ｅｎｄｏｄｅｒｍｉｃ）細胞を、免疫蛍光法（赤色）を用いてＳＯＸ１７発現について試験する。すべての核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色する（図４Ａ）。肝特異化（ステージ３）を進めるためには、８０％超の細胞がＳＯＸ１７を発現する必要がある。
・続いて、他の内胚葉細胞をＲＮＡ解析によって検証する。全ＲＮＡを１つのウェルから単離する。１μｇを、ランダムヘキサマーとオリゴ－ｄＴプライマーとの混合物を用いて逆転写する。ＳＯＸ１７、Ｏｃｔ３／４に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行う（図４Ｂ）。

Ｃ－肝特異化および成熟化の処方の方法
・初期、中期、後期の胎児肝および成体肝を階層的にクラスター化して、発生中にヒト肝臓から差次的に発現された遺伝子を明らかにした（図５）。
・この解析によって、肝発生中の栄養および代謝に関連する重要な発生経路が特定された。解糖代謝経路および胆汁酸産生経路が、肝発生に不可欠であることが明らかになった。したがって、本発明者らは、低グルコース培地を用いる本発明者らのステージ３の処方（肝特異化）、ならびに胆汁酸およびコレステロール剤を用いたステージ４の処方（肝成熟化）を開発した。

Ｄ－肝特異化（ステージ３）
・４５％ＤＭＥＭ 低グルコース１ｇ／ｌ、４５％Ｆ－１２、１０％ノックアウト血清、１％非必須アミノ酸、０．５％Ｌ－グルタミン、１％２０ｕｇ／ｍｌ ＨＧＦおよび１％ＤＭＳＯを含む限定培地を、１０日間にわたって１日おきに細胞に加える。
・肝成熟化（ステージ４）に進む前に肝特異化について試験する場合、細胞のサブセット。
・肝細胞を免疫蛍光法によってＨＮＦ４（緑色）、アルブミン（緑色）およびα－フェトプロテインについて試験する。すべての核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色する。８０％超の細胞が、ＨＮＦ４およびアルブミンを発現し、１０％未満の細胞が、α－フェトプロテインを発現する（図６）。
・続いて、細胞をＲＮＡ解析によって検証する。全ＲＮＡを１つのウェルから単離する。１μｇを、ランダムヘキサマーとオリゴ－ｄＴプライマーとの混合物を用いて逆転写する。ｈｉＰＳ、胚体内胚葉、ＤｕｎｃａｎのプロトコルのｉＣｅｌｌ－Ｈｅｐ（ＣＤＩ）、胎児肝細胞および成体肝細胞と比較した肝転写因子および肝代謝因子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行う（図７）。

以前は、肝細胞を作製するためにＥＳ細胞を使用した（Ｓｏｔｏ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ａ，ら、Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｉｌｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｌｉｖｅｒ－ａｓｓｉｓｔ ｄｅｖｉｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＳ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６ Ｎｏｖ；２４（１１）：１４１２－９およびＳｏｔｏ－Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ａ，ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｎｏｎｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（２）：３４７－５６（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。本開示のプロトコルを用いて、得られた肝細胞様細胞においていくつかの肝細胞核因子が高発現であったことが明らかになった。このプロトコルは、ＳＯＸ１７（胚体内胚葉マーカー）を発現する８０～９０％の細胞をもたらす２段階の胚体内胚葉誘導、成体型のヒトＨＮＦ４α（肝細胞において最も重要な核因子）を発現する９０％の細胞をもたらす１段階の肝特異化を含む。さらに、肝臓再生に関連する転写因子が、得られた細胞において、ヒト成体肝細胞とヒト胎児肝細胞との間のレベルで発現された（ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１α、ＦＯＸＡ１、ＰＰＡＲα、ＬＸＲ、ＰＸＲおよびＣＡＲおよびＣＥＢＰａ）。

他のヒトｉＰＳ由来肝細胞（例えば、Ｄｕｎｃａｎプロトコルを用いたもの（Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ Ｋ，ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ ＳＡ． Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊａｎ；５１（１）：２９７－３０５）または商業的に入手可能なヒトｉＰＳ由来肝細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＤＩ，ａ Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ｃｏｍｐａｎｙ）は、有意に低いレベルのこれらの肝臓特異的転写因子を示す。したがって、優れた効果が本開示のプロトコルを使用して実証された。

Ｅ－肝細胞の剥離
・細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン、ＴｒｙｐｌｅまたはＡｃｃｕｔａｓｅ処理のいずれかによって剥離する。
・細胞を５０Ｇで２分間遠心分離する。
・ペレットにした細胞（大集団）および上清に含まれる細胞（小集団）を、別々に１ウェルあたり１００万個の細胞で再播種する。ヒトｉＰＳ細胞の肝特異化（ステージ３）の後、得られた細胞を回収し、遠心分離によって重量に基づいて、大集団（細胞ペレット）および小集団（上清中の細胞）に分離する。次いで、両集団を肝成熟化（ステージ４）に供する。
・細胞を通常の恒温器に一晩入れる。

Ｆ－肝成熟化（ステージ４）
・細胞が、３０～４０％コンフルエンスに達したら、４５％ＤＭＥＭ 低グルコース１ｇ／ｌ、４５％Ｆ－１２、１０％ノックアウト血清、１％非必須アミノ酸、０．５％Ｌ－グルタミン、０．１％ゲンタマイシン／アンホテリシン－Ｂ、１％ペニシリン（Ｐｅｎｎｉｃｉｌｌｉｎ）／ストレプトマイシン、１％５０ｕｇ／ｍｌ ＨＧＦ、１％ＤＭＳＯ、０．５ｕＭデキサメタゾン、０．１％アスコルビン酸、脂肪酸非含有の０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ヒドロコルチゾン、０．１％トランスフェリン、０．１％インスリン、１００ｕＭウルソデオキシコール酸、１×コレステロール、２０ｕＭパルミチン酸、３０ｕＭオレイン酸、２０ｕＭリファンピシンを含む限定培地を、その細胞に４日間にわたって１日おきに加える。
・成熟肝細胞を、免疫蛍光法によってＨＮＦ４（緑色）、アルブミン（緑色）およびα－フェトプロテインについて試験する。すべての核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色する。９０％超の細胞が、ＨＮＦ４およびアルブミンを発現し、５％未満の細胞が、α－フェトプロテインを発現する（図８）。

得られた肝臓細胞を、脂肪酸と胆汁酸との組み合わせ、生体異物および成長因子に曝露して、細胞のほぼ１００％が、アルファフェトプロテイン（未熟肝マーカー）の検出可能な発現なしにアルブミンを発現し、分泌する表現型をもたらす成熟化工程が、組み入れられた（図８）。

・成体肝において最も頻度の高いｍｉＲＮＡであり、肝臓ホメオスタシスにとって重要な因子である、Ｍｉｒ－１２２レベルをマイクロＲＮＡ ｑＰＣＲによって確かめる。全マイクロＲＮＡを１つのウェルから単離する。１μｇを、ランダムヘキサマーの混合物を用いて逆転写する。ｍｉｒ－１２２に対するｑＲＴ－ＰＣＲを行う（図９）。

Ｇ－小集団 対 大集団の特徴づけ
・分化の終わりに（ステージ４）、小集団と大集団の両方の細胞を特徴づける。
・ＦＡＣＳ解析を用いて細胞をサイズで選別する。大集団の細胞は、小集団の細胞よりも粒状であることが明らかになった。
・細胞をＲＮＡ解析によって解析する。両集団の全ＲＮＡを１つのウェルから単離する。１μｇを、ランダムヘキサマーとオリゴ－ｄＴプライマーとの混合物を用いて逆転写する。大集団および小集団における肝転写因子および肝代謝因子に対するｑＲＴ－ＰＣＲを、成体肝細胞と比較して行う。大集団の細胞は、成体肝細胞により近いプロファイルを有する（図１０）。

肝成熟化後の大集団および小集団からのステージ４のｉＨｅｐの遺伝子発現解析は、大集団のｉＨｅｐが、より高いレベルの肝臓特異的核因子（ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１α、ＦＯＸＡ１、ＰＰＡＲα、ＬＸＲ、ＰＸＲおよびＣＡＲおよびＣＥＢＰａ）ならびに臨床的に関連する肝酵素および膜レセプター（ＡＢＣＡ１、ｃＭＥＴ、ＵＧＴＡ１、ＦＡＨ）を発現することを示す。

・代謝活性を評価するために、小集団および大集団の細胞を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭキットによって、およびｍｔＤＮＡ含有量を測定することによって、ミトコンドリア含有量について試験する。大集団の細胞は、より高いｍｔＤＮＡ含有量を有し、成体肝細胞に似ている（図１１Ａおよび１１Ｂ）。
・小集団および大集団の細胞を、Ｅｎｚｙｃｈｒｏｍ^ＴＭ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによって脂質含有量について定量する。大集団の細胞は、肝細胞の重要な特徴である細胞内トリグリセリドをより多く有する（図１２）。
・ステージ４の大集団の細胞は、再増殖研究に使用される、成熟した定義されたｉＨｅｐである。

実施例２
Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９ラットの操作
Ａ－ｉＣａｓｐ９自殺プラスミドの機能試験および肝臓特異的発現に向けたｉＣａｓｐ９プラスミドのクローニング。
ヒトｉＰＳ－Ｈｅｐが再増殖したラット肝臓は、げっ歯類細胞とヒト細胞との両方によって再構成され得るので、そのヒト構成要素を肝臓の１００％まで最大にし、肝臓の灌流／単離後にヒト細胞を精製する系は、有益である。自殺システムは、形質導入細胞（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ ｃｅｌｌｓ）においてアポトーシスを効率的に誘導することによって、これらのプロセスを増強するようにデザインされ得る。ヒトカスパーゼ－９から操作された自殺遺伝子によってコードされる誘導性カスパーゼ－９（ｉＣａｓｐ９）を組み入れた。このシステムは、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｉｃ）ではなく、細胞周期非依存的様式で形質導入細胞を殺滅し得る。ｉＣａｓｐ９は、変異させたＦＫ５０６結合タンパク質でカスパーゼ動員ドメインを置き換えて条件的二量体化を可能にすることによって操作された融合タンパク質である。したがって、二量体化の化学誘導物質（ＡＰ１９０３）の存在下において、二量体化したｉＣａｓｐ９は、細胞質内のカスパーゼ－３を直接活性化して、形質導入細胞においてアポトーシスを直接引き起こす。したがって、本発明者らは、ラットアルブミンプロモーターをコードすることによって肝臓細胞において特異的に発現され得るｉＣａｓｐ９自殺システムを作製することに決めた（図１３を参照のこと）。

ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ－Ｃａｓｐ９＿ＩＲＥＳ－ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ）でトランスフェクトする。

・トランスフェクション効率を評価するために、細胞を、ＴａｇＲＦＰコントロールプラスミド（ＤＮＡの総量の１／１０）でコトランスフェクトする。
・３日目に、トランスフェクトされた細胞および陰性コントロールをモニターし、カウントし、カスパーゼ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｇ８０９１）に向けて播種する（１Ｅ０４細胞／９６ウェル）。トランスフェクションあたり／陰性コントロール細胞を以下のとおり播種した。

小分子（二量体化の化学誘導物質）ＡＰ１９０３（ＡｐｅｘＢｉｏ）の濃度につき、２ウェル。陰性コントロールについて同量。シャトルコントロールの場合も、濃度ごとにウェルに播種する。

・４日目に、ＡＰ１９０３による刺激を開始する（０；０，１；１；１０ｎｍｏｌ／ｌ）。シャトルコントロールは、スタノール（ｓｔｈａｎｏｌ）のみで処理された細胞を含む。直ちにＴ＝０ｈを測定し、Ｔ＝２４ｈを終点として測定する（図１３）。
・ｉＣａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ構築物を、ラットアルブミンプロモーターｐＥＡｌｂ１２３とともにクローニングする。
・Ｈ４－ＩＩ－Ｅ－Ｃ３におけるｉＣａｓｐ９発現（ｍＲＮＡ）を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって定量する。細胞をプラスミドｐＥＡｌｂ１２３－ｉＣａｓｐ９－ＩＲＥＳ－ＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ３－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ（陽性コントロール）でトランスフェクトする。
・細胞を回収し、ＲＮＡを単離する。ｉＣＡＳＰ９およびｅＧＦＰ特異的ＰＣＲプライマーを使用して、発現を測定する（図１４）。

実施例３
Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－（ＦＲＧ）ラットの操作
ＳＣＩＤマウスは、生物医学的研究において同種異系組織移植および異種組織移植のための宿主として広く使用されている。しかしながら、実験用ラットは、生理学的研究、薬理学的研究、毒物学的研究および移植研究にとっての理想モデルであり、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ラットにおける効率的なゲノム操作ツールであることが判明してきた。ゆえに、本発明者らは、この技術を使用して、ダブルノックアウトＲａｇ２およびＩｌ２ｒｇ（Ｆ３４４－Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－［ＦＲＧ］）ラットを作製する（図１５Ａおよび１５Ｂを参照のこと）。

・Ｉｌ２ｒｇ遺伝子のエキソン２およびＲａｇ２遺伝子のエキソン３を標的とするｇＲＮＡのデザインは、ｇＲＮＡ－Ｉｌ２ｒｇ、ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴおよびｇＲＮＡ－Ｒａｇ２、ＴＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴである。
・そのデザインされたｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを、マイクロマニピュレータ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ，Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐａｎ）を用いて、受精したＦ３４４卵母細胞にマイクロインジェクトする。
・一晩培養した２細胞胚を偽妊娠のＷｉｓｔａｒ雌ラットの卵管に移す。
・８匹の新生仔動物のジェノタイピングから、それらのすべてが、４ｂｐ～２７ｂｐの欠失および１ｂｐの挿入を含む変異をＩｌ２ｒｇ遺伝子の標的化配列に有することが明らかになった。
・２５匹の新生仔動物のジェノタイピングから、それらのうちの２匹が、１８ｂｐの欠失および２ｂｐの挿入を含む変異をＲａｇ２遺伝子の標的化配列に有することが明らかになった。

実施例４
Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットへの自殺システムＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９の組み入れ
レシピエントラットの肝臓をドナーのヒトｉＰＳ由来肝細胞に置き換えるために、ｉＣａｓｐ９自殺システムを、ＣＲＩＳＰＲ媒介ノックイン法によってＳＣＩＤ（Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－）ラットに組み入れる。
・ラットＲｏｓａ２６遺伝子座の「セーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）」の組み込み部位を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによってＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９プラスミドで標的とする。
・２つのｇＲＮＡを構築する：１つは、ラットＲｏｓａ２６遺伝子座を標的化してゲノムＤＮＡを切断し、もう１つは、ＡＬＢプロモーター配列の５’を標的化してプラスミドＤＮＡを並行して切断するためのものである。２つの８０ｂｐ一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を、それらの２つの切断末端をライゲートするようにデザインする。
・１００ｎｇ μｌ^－１のＣａｓ９ ｍＲＮＡ、５０ｎｇ μｌ^－１の２つの各ｇＲＮＡ、５０ｎｇ μｌ^－１の２つの各ｓｓＯＤＮおよび５ｎｇ μｌ^－１のＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９プラスミドの混合物をＦ３４４ラット胚にマイクロインジェクトする。
・２細胞胚を偽妊娠のＷｉｓｔａｒラットに移して、ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９ノックイン（ＫＩ）ラットを得る。
・ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９ ＫＩラットをＦＲＧ（Ｒａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－）ラットと交配させると、自殺システムＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９がレシピエントＦＲＧラットの肝臓に組み入れられる。
・二量体化の化学誘導物質（ＡＰ１９０３）の処理によって、細胞質内のカスパーゼ－３が活性化されて、レシピエントＦＲＧラット肝細胞においてアポトーシスが直接引き起こされる。
・二量体化の化学誘導物質（ＡＰ１９０３）は、いくつかの経路（腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下および経口）によって種々の用量（０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ）で投与され得る。

実施例５
ヒトｉＰＳ由来肝細胞を用いたＸＳＣＩＤ（Ｉｌ２ｒｇ^－／－）ラットの肝臓再増殖
Ａ－肝細胞移植に向けた肝臓のプレコンディショニング
重篤な症例の急性肝不全およびある特定の遺伝性の代謝肝疾患（例えば、１型チロシン血症、アルファ－１抗トリプシン欠損症）によって引き起こされる傷害は、そ移植された正常な肝細胞または補助的な肝臓移植片にとって成長の利点をもたらす、天然の肝臓の再生能を完全に停止し得る。この知識に基づいて、肝細胞移植を用いた肝臓再増殖の動物モデルを作った。同様に、肝細胞移植後の肝臓再増殖のモデルを開発し、それによって、ピロリジジンアルカロイド（レトロルシン）で予め処置された動物の肝臓においてドナー由来細胞の選択的な成長が達成される。レトロルシンは、常在の肝細胞の有糸分裂阻害および老化を引き起こして、そのアルカロイドへの曝露後に移植されたドナー由来細胞の選択的な増殖をもたらす。このモデルでは、単離された肝細胞を２／３部分肝切除術と併せて送達したとき、移植後２～３ヶ月以内にレシピエント肝臓のほぼ完全な置き換えが観察される。ゆえに、この再生－プレコンディショニングレジメンを用いる。

・体重が１００～１４０ｇのラットの腹腔内に、レトロルシン（Ｓｉｇｍａ）（各３０ｍｇ／ｋｇ）を２週間あけて２回注射する。
・１００％エタノール中のレトロルシン原液（１０ｍｇ／ｍＬ）を希釈する。注射の前に、原液を、滅菌食塩溶液で希釈して、動物１匹あたりの正確な用量に調整する（３０ｍｇ／ｋｇ）。通常、エタノールの最終濃度は、１０％またはそれ未満であるべきである。レトロルシンは、異なる経路（腹腔内、静脈内、皮下および筋肉内）を用いて投与され得る。
・腹腔内注射の場合、針の穿刺点を配置する。
・膝のすぐ上の腹部を横断する仮想の線を引く。針をこの線に沿って、正中線近くかつ動物の右側に挿入する。
・ラットは、通常、レトロルシンの最後の注射の４週間後に実験に使用する。
・レトロルシン投与の肝臓プレコンディショニング効果は、肝臓照射によっても代用される。小動物照射研究プラットフォームを用いて５０Ｇｙの肝臓への選択的に投与。プレコンディショニング照射の２４時間後に細胞移植を行う。

Ｂ－ヒトｉＰＳ由来肝細胞の移植のためのプロトコル
・２％イソフルランと酸素（１～２リットル／分）との混合物による麻酔誘導のために、ラットをチャンバーに入れる。
・麻酔誘導後、電気バリカンで腹壁を剪毛する。スタイロフォーム（Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ）パッドでできた手術台の上に動物を置き、ゴムバンドおよびプッシュピンを用いて４本の脚すべてをその台に固定し、顔面を遠い側の麻酔システムのノズルに向ける。
・開腹術中の麻酔を誘導するために、３～４％の酸素流とともにイソフルラン吸入を開始する。
・腹壁を消毒剤（ベタジンの後、７０％エタノール）で消毒する。過剰な消毒剤を滅菌ガーゼで拭き取って、内臓がこれらの消毒剤に曝露されるのを回避する。
・剣状突起から恥骨まで、腹部の皮膚および筋肉を長い正中線で切開する。鉗子を用いて下部腹壁を両側性に引っ込めること（retracting）によって、腹腔を露出させる。プッシュピンまたは１８Ｇの針を用いて鉗子をその台の適切な位置に固定して、十分な露出を行い、よく見えるようにする。
・腹部切開を行った後、麻酔維持のためにイソフルラン流量を１～２％に低下させる。
・開腹術後、食塩溶液で湿らせた滅菌ガーゼを小腸の下に置く。湿らせた綿棒を用いて、その滅菌ガーゼの上に小腸をねじらずにやさしく整列させる。湿らせたガーゼで小腸を包み、小腸を腹腔の左側に位置させて、腹部大動脈を露出させる。
・２／３肝切除術に向けて、鉗子を用いて２－０絹縫合糸を左側葉の基部（肝門の近く）に置く。縫合糸の右端を鉗子で保持しつつ、綿棒の先端（cotton tip）を用いて、左側葉を元の位置まで回転させて、縫合糸がその左側葉を一回りするようにする。次いで、左側葉上部にわたって縫合糸の２端を結んで、できるだけ左側葉の基部の近くに結び目を配置させる。結ばれた側葉を縫合糸のすぐ上で切断する。
・中葉を特定し、縫合糸を断端（stump）と中葉との間に置く。中葉を縫合糸の上に引き下ろす。結び目の線に従って、縫合糸の２端を結ぶ。結ばれた中葉を縫合糸の上で切断すると、結び目の上に虚血性の基部およびなおも灌流されている中葉の小部分が下にできる。
・２／３肝切除術の後、３００～５００マイクロリットルのＤＭＥＭ培養培地に懸濁された５００万個の細胞を脾臓内に（ｉｎｔｒａｓｐｌｉｎｅｃａｌｌｙ）注射する。
・次いで、腹部に温かい食塩水を灌注し、４－０Ｖｉｃｒｙｌで筋肉および皮膚を２層に閉じる。失われた血液を補うために、さらなる食塩水を投与し得る。すべての手技を、滅菌実験室フード内において滅菌された状態で行う。

Ｃ－ヒトｉＰＳ由来肝細胞を用いた肝臓再増殖の経時的な特徴づけ
免疫欠損マウスを機能的に再増殖させることができることは、肝臓再増殖ができない肝細胞様ファクシミリ（ｆａｃｓｉｍｉｌｅ）と対比して真の肝細胞を作製したことに対するベンチマークになった。興味深いことに、他のプロトコルを用いたときは、幹細胞由来のヒト肝細胞様細胞の生着は、限定的でしかなかったことが報告されている。結局、自己の肝臓細胞の臨床移植には、多数の肝臓細胞を作製する必要がある。したがって、肝臓再増殖に使用され、十分な数の高度に機能的なｉＰＳＣ－Ｈｅｐを作製するための、肝臓再増殖用の動物モデルを確立するために、５００万個のｉＰＳＣ－Ｈｅｐまたはヒト胎児から単離された肝細胞（胎児Ｈｅｐ）をＸＳＣＩＤラットの脾臓に移植した。移植の前に、レシピエント動物をレトロルシン（特異的に肝細胞の細胞周期を阻害する薬物）で前処置し、移植時に７０％部分肝切除術を行うことにより、下記の肝臓プレコンディショニングについての項に示されるような、移植された細胞にとって選択的成長の利点がある環境を作った。

・コントロール群として、ヒト胎児肝細胞を移植に使用した。
・ヒト胎児肝細胞を、２０～２３週の妊娠期間において妊娠を終結させた後に得られた胎児肝臓から単離した。
・初代ヒト胎児肝細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（タイプＸＩ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ－Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，Ｃａｔ．＃Ｃ７６５７）を含むＥＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中においてラボシェーカー上で４０分間、組織を消化することによって単離した。
・生存率をトリパンブルー排除試験によって評価したところ、常に＞８５％であった。
・単離手順後に、下記に示されるような移植に向けて胎児肝細胞を調製した。
・ヒトｉＰＳ－肝細胞（本明細書中に開示される方法を用いて調製される）を、本明細書中に開示されるように分化させる。
・ヒトｉＰＳ－肝細胞（Ｄｕｎｃａｎプロトコル）を以下の刊行物（Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ Ｋ，Ｎｏｔｏ ＦＫ，Ｎａｇａｏｋａ Ｍ，Ｌｉ Ｊ，Ｂａｔｔｌｅ ＭＡ，Ｄｕｒｉｓ Ｃ，Ｎｏｒｔｈ ＰＥ，Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，Ｄｕｎｃａｎ ＳＡ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊａｎ；５１（１）：２９７－３０５（参照により本明細書中に援用される））に示されているように分化させる。
・ヒトＣＤＩ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）ｉＰＳ－肝細胞をＣＤＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｕｌａｒｄｙｎａｍｉｃｓ．ｃｏｍ）から購入した。
・すべての実験群の移植されたＸＳＣＩＤラットからの肝臓を、肝細胞移植の３０日後および６０日後に回収した。その肝臓組織を４％ＰＦＡで固定し、パラフィンに包埋する。３０日に、肝臓の各葉の組織切片を、ヒト特異的アルブミン（Ｂｅｔｈｙｌ）（図１６）、ならびにヒト特異的ミトコンドリア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＣＹＰ３Ａ４（Ａｂｃａｍ）（図１６）に対する免疫組織化学検査に供した。
・さらに、ヒト細胞の存在を判定するために、３０日にラット肝臓のホモジネートを調製し、ゲノムＤＮＡを抽出した。ヒトＨＮＦ４遺伝子を、ｔａｑｍａｎプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＲＰＬＰ０＿ＣＣＫＡＫ１Ｋ，Ｃａｔ＃ ４４００２９４およびＨｓ０７２１８４０１＿ｃｎ ＨＮＦ４ ｃｏｐｙ Ｃａｔ＃ ４４００２９１、両方の種の検出用）を用いるＤＮＡ ＰＣＲによって定量した（図１７）。
・他のヒトｉＰＳ－肝細胞の再増殖能および他の標準的なプロトコルを比較するために、商業的に入手可能なヒトｉＰＳ－肝細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＤＩ，ａ Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ｃｏｍｐａｎｙ）を、レトロルシンで処置され、肝切除されたＸＳＣＩＤラットに移植した。また、ｉＰＳ－肝細胞を、文献に以前に報告されたＤｕｎｃａｎプロトコル（Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ Ｋ，Ｎｏｔｏ ＦＫ，Ｎａｇａｏｋａ Ｍ，Ｌｉ Ｊ，Ｂａｔｔｌｅ ＭＡ，Ｄｕｒｉｓ Ｃ，Ｎｏｒｔｈ ＰＥ，Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，Ｄｕｎｃａｎ ＳＡ．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊａｎ；５１（１）：２９７－３０５（参照により本明細書中に援用される））を用いて分化させた。

移植の６０日後に、処置された肝臓を回収し、ラット肝臓内のヒト肝細胞の存在について解析した。商業的に入手可能なヒトｉＰＳ－肝細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＤＩ，ａ Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ｃｏｍｐａｎｙ）およびＤｕｎｃａｎプロトコルを用いて作製されたヒトｉＰＳ－肝細胞は、門脈の周囲に細胞が生着しているだけで、再増殖の証拠はない。対照的に、本開示の方法によって作製されたヒトｉＰＳ－肝細胞（「Ａｌｅｘプロトコル」とも呼ばれる）は、ラット肝臓で再増殖しているヒト肝細胞の大きなコロニーの存在を示す（図１８）。

下記の表に、試験した構成要素を列挙する。

実施例６
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術とともにｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９を用いた、機能的なゲノム編集およびスクリーニングに向けたラットにおけるヒト肝臓の作製
Ａ－ヒトｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９の作製
・ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９を、米国特許仮出願番号６２／３６９，６９８（参照により本明細書中に援用される）に開示されている方法を用いて操作した。
・Ｃａｓ９効率について試験するために、ドキシサイクリンを０，５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、細胞を４８時間培養した。
・ＧＦＰレポータータンパク質の存在を蛍光顕微鏡法によってモニターした（図１９Ａ）。
・全ＲＮＡを各ウェルから単離し、１μｇを、ランダムヘキサマーとオリゴ－ｄＴプライマーとの混合物を用いて逆転写した。各Ｃａｓ９／ＧＦＰシステムの発現を、非誘導細胞および参照遺伝子に関連する標的ｃＤＮＡ発現レベルの定量によって決定した（図１９Ｂ）。

Ｂ－ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９ゲノム編集（ｅｄｉｔｉｏｎ）およびスクリーニングのインビボアッセイ
ウイルスによるｓｇＲＮＡの作製
・単一ｓｇＲＮＡ（Ａｄｄｇｅｎｅ）のプールされたプラスミドライブラリーを、レンチウイルスパッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を用いてＨＥＫ－２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
・トランスフェクションの後、培養培地を回収し、ベクター原液を濃縮した。
単一のまたはプールされた（ｐｏｌｌｅｄ）ｓｇＲＮＡによるｈｉＨｅｐｓ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９形質導入
・ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９細胞を、「１－ｈｉＰＳ細胞から肝細胞への分化（1- Differentiation of hiPS cells into hepatocytes）」において開発された方法を用いてｉＨｅｐに分化させた。
・形質導入の２日前に、ドキシサイクリンをｈｉＨｅｐｓ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９細胞の培地に加えた。
・次いで、ｈｉＨｅｐｓ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９細胞にｓｇＲＮＡレンチウイルスを形質導入した。翌日、確かに形質導入された細胞を、抗生物質選択によって選択する。

インビボスクリーニング
・確かに形質導入されたｈｉＨｅｐｓ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－Ｃａｓ９細胞は、本開示の方法（「細胞治療用の患者特異的ｉＰＳ由来肝細胞の作製」を参照のこと）を用いて、免疫不全のラット肝臓（Ｉｌ２ｒｇ^－／－またはＲａｇ２／－、Ｉｌ２ｒｇ^－／－、ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９モデル）を再増殖できる。
・機能的アッセイ評価は、スクリーニング検査の特色（例えば、増殖；腫瘍形成；冬眠に対する細胞応答など）に依存する。
・インビボスクリーニングは、レーザーキャプチャーによる解剖および次世代シーケンシングによるさらなる解析を含む。

Ｃ－ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ｓｈＲＮＡ技術を用いた遺伝子機能のための、ラットにおけるヒト肝臓の作製
１．遺伝子ノックダウンシステム
・ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ｓｈＭＩＲ－ＳＩＲＴ１を操作した（米国特許仮出願番号６２／３６９，６９８（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
・ＳＩＲＴ１のノックダウン効率について試験するために、ドキシサイクリンを０，５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、細胞を４８時間培養した。
・全ＲＮＡを各ウェルから単離し、１μｇを、ランダムヘキサマーとオリゴ－ｄＴプライマーとの混合物を用いて逆転写した。各ＳＩＲＴ１の発現を、非誘導細胞および参照遺伝子に関連する標的ｃＤＮＡ発現レベルの定量によって決定した（図２０Ａ）。
・タンパク質を抽出し、ＳＩＲＴ１発現について解析した（図２０Ｂ）。

２．ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ｓｈＲＮＡ－ＳＩＲＴ１を用いた、ラットにおけるヒト肝臓の作製
・ｈｉＰＳ－Ｔｅｔ－Ｏｎ－ＳｈＲＮＡ－ＳＩＲＴ１細胞は、「１－ｈｉＰＳ細胞から肝細胞への分化」において開発された方法を用いてｉＨｅｐに分化することができ、開発された方法（「細胞治療用の患者特異的ｉＰＳ由来肝細胞の作製」を参照のこと）によって、免疫不全のラット肝臓（Ｉｌ２ｒｇ^－／－またはＲａｇ２／－、Ｉｌ２ｒｇ^－／－、ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９モデル）を再増殖できる。
・完全な再増殖の後、ドキシサイクリン（スクロース水中、２ｍｇ／ｍＬ）を加えることによって、ＳＩＲＴ１に対する特異的かつ条件的なノックダウンを有するヒト化ラット肝臓モデルが提供される。

実施例７
細胞治療用の患者特異的ｉＰＳ由来肝細胞の作製
ｉＰＳＣ細胞は、未分化状態でインビトロにおいて無限に維持され得るが、実質的に任意の細胞型に分化することができる。体細胞を用いて、目的の１つまたはそれを超える遺伝子のノックインおよび／またはノックアウトが非常に効率的である人工多能性幹細胞を調製する方法が、本明細書中に提供される。

Ａ－移植に向けたラットにおけるヒトｉＰＳ由来肝細胞の大量作製
・Ｙａｍａｎｋａプロトコル（例えば、米国特許出願公開番号２００９０２４６８７５、米国特許出願公開番号２０１０／０２１００１４；米国特許出願公開番号２０１２０２７６６３６；米国特許第８，０５８，０６５号；米国特許第８，１２９，１８７号；米国特許第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６９６６６Ａ１および米国特許第８，２６８，６２０号（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）を用いて、ｉＰＳ細胞を患者の血液または皮膚生検材料から誘導する。一般に、核リプログラミング因子を用いることにより、体細胞から多能性幹細胞が作製される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つまたは少なくとも４つが使用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４が使用される。
・ｉＰＳ細胞は、本明細書中に記載されるような肝細胞に分化でき、完全に機能的で完全に成熟した自己の肝細胞を作製するために、免疫無防備状態の動物（例えば、肝臓をプレコンディショニングしたＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ＡＬＢ－ｉＣａｓｐ９またはＸＳＣＩＤラット）に移植される。
・これらの患者由来のｉＰＳ－肝細胞は、臨床上の自家細胞移植に使用することができる。患者由来のｉＰＳ細胞が、代謝性遺伝的肝疾患（例えば、尿素回路障害、分岐鎖アミノ酸障害、クリグラー・ナジャー症候群、原発性高シュウ酸尿症、家族性高コレステロール血症、ニーマン・ピックｃ型、コレステリルエステル貯蔵病、ウィルソン病、新生児ヘモクロマトーシス、チロシン血症、糖原病（glycogenstorage disease）、アルファ－１－抗トリプシン欠損症、ミトコンドリア欠損症、フェニルケトン尿症であるがこれらに限定されない）を引き起こす単一変異を有する場合。これらの患者由来のｉＰＳ－肝細胞は、遺伝子編集され、門脈経路を用いた患者の肝臓への細胞注入によって直接患者に移植して戻され得る。
・これらの患者由来のｉＰＳ－肝細胞は、自家移植のための肝臓移植片を生物工学処理する（bioengineering）ために使用され得る。例えば、ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＡＲＴＩＦＩＣＩＡＬ ＯＲＧＡＮＳ，ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳというタイトルのＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１６８２５４（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
・ヒト初代肝細胞およびｉＰＳＣ－Ｈｅｐ－ラット肝臓のロバストな拡大
有効な再生刺激を送達し得るラットモデルにおいて増殖する、本開示の動物モデルが作製したヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐを評価した。ヒト初代成体肝細胞またはヒト初代胎児肝細胞（試験された５人より多い異なるヒト成体細胞ドナーまたはヒト胎児細胞ドナー）または本開示のプロトコルを用いて作製されたヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐ（試験された３つより多い異なるヒトｉＰＳ細胞株）（図２４Ａ）を移植した９０日後に、ラット肝臓のほぼ７０～８０％が再増殖できることが明らかになった。移植の９０日後に、動物を屠殺し、肝臓組織を４％ＰＦＡで固定し、パラフィンに包埋した。肝臓の各葉の組織切片を、ヒト特異的アルブミンに対する免疫組織化学検査に供した。アルブミン陽性細胞の定量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて×２０倍率で、動物１匹あたり１０枚の画像におけるおよそ５００～８００個の肝細胞をカウントすることによって行った。さらに、血液サンプルをラットの外側尾静脈から移植後毎月採取して、血清を抽出した。血清ヒトアルファ－１－抗トリプシンを、ヒトアルファ－１－抗トリプシンＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて調べ、ヒト血清と比較した。ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐを用いたときの再生の程度は、単離されたばかりのヒト成体肝細胞およびヒト胎児肝細胞のそれに匹敵した（図２４Ａ）。これらの実験から、ラット肝臓が、初代ヒト成体肝細胞、初代（ｐｒｉｍａｔｅｒｙ）胎児肝細胞またはヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐを大量に再増殖できることが実証される。したがって、得られたヒト肝細胞を、種々の目的のために富化し、使用することができる。

実施例８
トランスジェニックラット作製用のプラスミド
ｐＥＡＬＢ１２３－ｉＣａｓｐ９＿ＩＲＥＳ－ＧＦＰプラスミドを、プラスミドｐＭＳＣＶ－Ｆ－ｄｅｌ Ｃａｓｐ９．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ ｚ９（Ｓｔｒａａｔｈｏｆら、Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０５：４２４７－５４（参照により本明細書中に援用される））（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１５５６７）からのＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）－ｐ３０Ｃａｓｐａｓｅ９配列とともに、プラスミドｐＥＡＬＢ１２３ＣＡＴ（Ｗｅｎ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ２００５，１０５：４２４７－５４（参照により本明細書中に援用される））からアルブミン／αフェトプロテインのラットプロモーター／エンハンサー配列をクローニングすることによって構築した。このプラスミドにおいて使用されるラットアルブミンプロモーターは、ラット肝細胞だけで発現されることから、ラット肝細胞だけが、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）－ｐ３０Ｃａｓｐａｓｅ９配列を発現できることが保証される。この改変されたカスパーゼ９システムを、改変されたＦＫ結合タンパク質に融合することにより、条件的二量体化が可能になる。小分子（二量体化の化学誘導物質、例えば、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７）を加えると、そのシステムは二量体化し、カスパーゼ９が活性化して、改変されたカスパーゼ９を発現している細胞のアポトーシスを急速にもたらす。図１３Ａ～Ｂおよび図２１を参照のこと。

実施例９
再生している肝臓におけるヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐの肝成熟化
分化したヒトｉＰＳＣが初代肝細胞として機能する能力を決定するために、成熟ヒト特異的シトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）の発現を、培養細胞の免疫蛍光法によって調べた。本明細書中に開示される方法を用いて作製されたヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐは、単離されたばかりの正常なヒト成体肝細胞と比べて、成熟ＣＹＰ３Ａ４を発現しなかった。さらに、培養中にヒトアルファ－１－抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）および尿素を産生する能力を調べた（図２２Ａ）。ヒトアルファ－１－抗トリプシンＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＡＢＮＯＶＡ^ＴＭ尿素アッセイキット（ＡＢＮＯＶＡ^ＴＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＫＡ１６５２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を製造者の指示に従って用いて、コントロールと比較して、培養培地を試験した。ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐは、単離されたばかりの初代ヒト肝細胞と比べて、３０％のＡ１ＡＴおよび２０％の尿素を産生した（図２２Ａ）。再増殖された免疫抑制ラットにおける細胞移植後のＣＹＰ３Ａ４の発現を免疫蛍光法によって調べたところ、ＣＹＰ３Ａ４の発現が３０日（ｄ）に見られることが見出された。これらの結果は、ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐは、インサイチュにおいて成熟する能力を有すること、およびゆえにインビボバイオリアクターへの移植後に成体の肝機能を示し得ることを示した。

実施例１０
ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐはインビトロにおいて増殖する
ＨｉＰＳＣ－Ｈｅｐの増殖能をＢｒｄＵの組み入れによって評価した。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０ｕＬ／ｍＬの濃度で培地に１２時間（ｈ）投与した。ＤＡＰＩで対比染色したＢｒｄＵの免疫蛍光法によって、増殖を解析した。３つの異なる区域、およびＢｒｄＵ免疫蛍光法で陽性の１区域あたり少なくとも１００個の核を定量した。正常な胎児肝臓細胞は、成長し続け、ラット肝臓に実験的に注入されると、再生刺激（または肝実質の喪失）に応答して選択的に増殖できる（Ｄａｂｅｖａら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２０００；１５６：２０１７－３１）。およそ３０％のヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐおよび１０％の単離されたばかりのヒト胎児Ｈｅｐが、ＢｒｄＵ陽性だった（図２３Ａ）。これらのデータは、ヒトｉＰＳＣ－Ｈｅｐが、活発な細胞周期を有し、肝臓分化後にインビトロにおいて増殖することを示す。

実施例１１
ヒト肝臓細胞の高富化
ヒト細胞を単離し、ラット細胞の存在を排除するために、２５％ヒト肝臓細胞および７５％ラット肝臓細胞を含む細胞懸濁物を調製した。ヒト／ラット細胞懸濁物を、ラットＭＨＣクラス１（ＲＴ１Ａ）で免疫磁気標識し、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって選別した。抗体濃度を最適化するためにいくつかのプロトコルを試験し、インキュベーション時間を試験した。種々の濃度の抗フィコエリトリン（ＰＥ）超高純度マイクロビーズおよびＭＡＣＳカラムタイプを用いて、Ａ～Ｆ群を試験した。細胞画分をフローサイトメトリーによってヒト白血球抗原（ＨＬＡ－１ ＡＢＣ）および（ＲＴ１Ａ）の発現について解析した（Ａ～Ｆ群、図２６Ｂ）。高純度の単離が達成された。

Ａ－肝臓の単離（図２５）
・ヒト化肝臓ラット由来の初代肝細胞を、イソフルラン麻酔下での肝臓灌流によって単離した。簡潔には、まず肝臓に、下大静脈（ＩＶＣ）を通ってＥＧＴＡを灌流した後、Ｌ－緩衝液、最後にＬＩＢＥＲＡＳＥ^ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）を１０～１５分間灌流した。
・細胞培養フード内で、細胞細胞スクレーパ（cell a cell scraper）を用いて、振盪しながら細胞を優しく分散させた。
・単離後、細胞をＰＢＥ緩衝液（ヒト肝細胞培地＋０．５％ＢＳＡ＋０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に収集し、遠心分離し、洗浄し、血球計を用いてカウントした。

Ｂ－ＭＡＣＳ（登録商標）セパレータ技術によるヒト細胞の選別
・細胞を、１：１００～１：５希釈された抗ラット抗体（すなわち、ＰＥ標識された、抗ＲＴ１Ａまたは任意のラット特異的マーカー）とともに、１ｍＬ／１０×１０^６個の細胞の濃度において４℃で３０分間インキュベートした。
・細胞を、５×１０^６個の細胞に対して１ｍＬのＰＢＥ緩衝液（ヒト肝細胞培地＋０．５％ＢＳＡ＋０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５０Ｇで５分間遠心分離した。

細胞を、１：１０～１：２．５希釈された抗ＰＥマイクロビーズ（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）とともに、１ｍＬ／１００×１０^６個の細胞の濃度において４Ｃで１４分間インキュベートした。

細胞を、５×１０^６個の細胞に対して１ｍＬのＰＢＥ緩衝液（ヒト肝細胞培地＋０．５％ＢＳＡ＋０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５０Ｇで５分間遠心分離した。

細胞をＰＢＥ緩衝液に再懸濁し、ＣＳカラム（ＭＡＣＳ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用するＭＡＣＳセパレータの磁場によって選別した。

細胞の純度を、ヒト（ＨＬＡ－１）およびラット（ＲＴ１Ａ）膜マーカーに対するフローサイトメトリー解析によって評価した。様々なＲＴ１Ａ抗体濃度および２つの異なる磁気カラムを用いて、種々のプロトコルを試験した（Ａ～Ｆ群）（図２６Ｂ）。最善のプロトコルは、ヒト肝臓細胞をおよそ９９．９％に富化したことから（図２６Ｂ）、細胞懸濁物からラット細胞が完全に枯渇したことが示された。このプロトコルは、１回の選別につき最大１０億個の肝臓細胞（ラット全肝臓からの細胞懸濁物を選別するための十分な能力）を、ヒト細胞をほぼ完全に富化できた状態で選別するために使用することができる。これらの結果は、表面マーカーＲＴ１Ａに基づく磁気細胞選別が、ヒト集団を富化するために有効であることを示している。これらの研究は、磁気ベースの選別を用いてヒト細胞を高度に富化できることを実証している。

開示された発明の原理が適用され得る多くの可能性のある実施形態を考慮すると、例証された実施形態は、本発明の単なる好ましい例であって、本発明の範囲を限定すると見なされるべきでないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および趣旨の中に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。

Claims (32)

1. ヒト肝細胞を作製するための方法であって、
   ａ）有効量のアクチビンＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４を含む第１の培地中でヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を約２～約３日間培養して、中内胚葉細胞を作製する工程；
   ｂ）ＦＧＦ－２およびＢＭＰ－４の非存在下において有効量のアクチビンＡを含む第２の培地中で該中内胚葉細胞を約２～約３日間培養して、胚体内胚葉細胞を作製する工程；
   ｃ）有効量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む第３の培地中で該胚体内胚葉細胞を約８～約１４日間培養して、肝特異化細胞を作製する工程であって、該培地は、低グルコース培地である、工程；および
   ｄ）有効量のＨＧＦ、ウルソデオキシコール酸、コレステロール、パルミチン酸、オレイン酸、リファンピシンを含む第４の培地中で該肝特異化細胞を培養して、それにより、ヒトｉＰＳＣ由来ヒト肝細胞を作製する工程であって、該第４の培地は、低グルコース培地である、工程
   を含む、方法。
2. 前記第１の培地が、約５０～約２００ｎｇ／ＭＬのアクチビンＡ、約１０～約５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２および約２０～約１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２の培地が、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記第２の培地が、有効量のＬ－グルタミンをさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の培地および前記第２の培地が、毎日補充される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記第３の培地が、約１～約３パーセント体積／体積（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯおよび約２０～約１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第３の培地が、約０．５～約２％ｖ／ｖのＬ－グルタミンをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第４の培地が、約２０～約１５０μｇ／ｍＬ ＨＧＦ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭウルソデオキシコール酸、約１０μＭ～約５０μＭパルミチン酸、約１０μＭ～約５０μＭ約オレイン酸および約１０μＭ～約５０μＭリファンピシンを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記第４の培地が、有効量のＬ－グルタミン、ＤＭＳＯおよび／またはデキサメタゾンをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記第４の培地が、約０．５～約２％ｖ／ｖのＬ－グルタミンをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記第４の培地が、約１～約３％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記第４の培地が、約０．５～約２ｍＭデキサメタゾンを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記第３の培地および前記第４の培地が、１日おきに補充される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ｅ）前記肝特異化細胞および／または前記ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞を免疫無防備状態の非ヒト動物の肝臓に移植することによって、該肝特異化細胞および／または該ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞を拡大し、ヒト肝細胞を作製する工程、および
    ｆ）該拡大された肝特異化細胞および／または該ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞および／または該ヒト肝細胞を回収する工程
    をさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記免疫無防備状態の非ヒト動物が、トランスジェニックラットである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記トランスジェニックラットが、肝臓特異的プロモーターを含む導入遺伝子を有するＲａｇ２^－／－Ｉｌ２ｒｇ^－／－ラットでありであり、該プロモーターは、融合タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されており、該融合タンパク質は、ＦＫＢＰ１２およびカスパーゼ９を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記プロモーターが、アルブミンプロモーターである、請求項３２に記載の方法。
18. 前記肝特異化細胞および／または前記ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞が、約３日間～約２４ヶ月間にわたって、前記トランスジェニックラットにおいて拡大される、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記肝特異化細胞および／または前記ヒトｉＰＳＣ由来肝細胞を前記肝臓に移植する前に、前記免疫無防備状態の非ヒト動物の非ヒト肝細胞の成長を阻害する工程を含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 非ヒト肝細胞の成長を阻害する工程が、有効量の放射線またはレトロルシンを前記免疫無防備状態の非ヒト動物に投与する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 約０．５×１０^６～約１０×１０^６個のヒト肝細胞が、前記免疫無防備状態の非ヒトトランスジェニック動物に移植される、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. ヒト肝細胞を作製するための方法であって、
    ａ）有効量のアクチビンＡ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－４を含む第１の培地中でヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を約２～約３日間培養して、中内胚葉細胞を作製する工程；
    ｂ）ＦＧＦ－２およびＢＭＰ－４の非存在下において有効量のアクチビンＡを含む第２の培地中で該中内胚葉細胞を約２～約３日間培養して、胚体内胚葉細胞を作製する工程；および
    ｃ）有効量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含む第３の培地中で該胚体内胚葉を約８～約１４日間培養して、肝特異化細胞を作製する工程であって、該培地は、低グルコース培地である、工程
    を含む、方法。
23. 前記第１の培地が、約５０～約２００ｎｇ／ＭＬのアクチビンＡ、約１０～約５０ｎｇのＦＧＦ－２および約２０～約１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－４を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第２の培地が、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
25. 前記第２の培地が、有効量のＬ－グルタミンをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記第１の培地および前記第２の培地が、毎日補充される、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記第３の培地が、約１～約３パーセントｖ／ｖのＤＭＳＯおよび約２０～約１５０μｇ／ｍＬのＨＧＦを含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記第３の培地が、約０．５～約２％ｖ／ｖのＬ－グルタミンをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第３の培地が、１日おきに補充される、請求項２２～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記ｉＰＳＣが、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸分子で形質転換される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ヒト肝細胞が、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記異種核酸が、ｓｈＲＮＡであるか、またはＣａｓ９をコードする、請求項３０または請求項３１に記載の方法。

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