JP7120586B2 - 中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用 - Google Patents
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7120586B2 JP7120586B2 JP2021122762A JP2021122762A JP7120586B2 JP 7120586 B2 JP7120586 B2 JP 7120586B2 JP 2021122762 A JP2021122762 A JP 2021122762A JP 2021122762 A JP2021122762 A JP 2021122762A JP 7120586 B2 JP7120586 B2 JP 7120586B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- chinese
- sample
- copperhead
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
- C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/30—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/32—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed
- G01N2030/324—Control of physical parameters of the fluid carrier of pressure or speed speed, flow rate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、化学分析の検出及び応用の分野に関し、特に、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用に関する。
中国長白山マムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ）は、中国に特有な蛇種であり、主に中国東北部の長白山の山岳地帯に分布しており、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｓｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ Ｅｍｅｌｉａｎｏｖとも呼ばれる。中国長白山マムシ毒を原料として抽出した蛇毒トロンビンは、アルギニンエステラーゼ及びアミダーゼ活性を有するセリンプロテアーゼであり、血液凝固過程で重要な役割を果たすことができる。その構造及び機能はヒトトロンビンに類似するため、「トロンビン様酵素」と呼ばれる。臨床的には、主に出血性疾患、特に毛細血管出血の治療に使用され、患者の出血時間を大幅に短縮し、出血量を減らすことができる。高効率、迅速な効果、長期的な効果、利便性、安全性、トロンビン阻害剤に影響されない等の利点を有するため、出血性疾患に対処するときの、臨床医の主な選択肢となっている。現在、中国で市販されている蛇毒トロンビン類製品は、主にアメリカハブ、ヒャッポダ、ラッセルクサリヘビ及び中国長白山マムシに由来する。異なる種類の蛇に由来するトロンビン様酵素は構造及び作用メカニズムが異なるため、対応する薬理作用も異なる。そのため、種属由来源及び含有量を判断する、特異性が高く感度が高い方法の開発は、蛇毒トロンビン類製品の品質の管理に非常に重要である。
蛇毒は、蛇の毒腺から分泌される複雑な混合物であり、多種類のタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオシド、酵素、金属イオン及びその他の低分子物質を含む。蛇毒は、自然界のすべての毒素の中で最も複雑な物質である可能性がある。蛇毒には５０種類以上のタンパク質分解酵素が微量に含まれている。既存の中国長白山マムシ毒に対する品質標準は、その種属由来源が管理されておらず、トロンビン様酵素の含有量を特異的に測定する方法がない。既知の蛇毒中のトロンビン様酵素の含有量を測定する方法は、主にゲル電気泳動法及び力価測定法であり、これらの方法は複雑で精度が低く、蛇毒の品質を正確に反映することができない。そのため、便利で、高速で、定量が正確な中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の定性定量方法の開発は、幅広い社会的及び経済的利益がある。
従来技術の欠陥を克服するために、本発明によれば、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド、及び測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量の判定におけるその使用が提供される。本発明の方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、品質管理のレベルを高める。
上記発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を採用する。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのアミノ酸配列はＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのアミノ酸配列はＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。
さらに、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドを用い、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び／又は含有量を測定する方法であって、
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含む。
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２及び二重荷電８７７．４→８９２．４を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出する。
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含む。
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２及び二重荷電８７７．４→８９２．４を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出する。
さらに、前記中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチドの検出限界は２ｎｇ／ｍＬであり、定量限界は６ｎｇ／ｍＬである。
さらに、ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
さらに、ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
さらに、ステップ（２）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬをそれぞれ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
さらに、前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の液体クロマトグラフィー及び質量分析の条件は以下の通りである。
さらに、前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の液体クロマトグラフィー及び質量分析の条件は以下の通りである。
液体クロマトグラフィーの条件は、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；カラム：５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％、１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％、５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％である。
質量分析の条件は、エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセル出口電圧：１０Ｖ、コリジョンセル入口電圧ＥＰ：１０Ｖ；衝突エネルギーＣＥ：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧ＤＰ：１３５Ｖである。
前記方法において、前記測定されるサンプルは蛇毒である。
前記方法において、前記測定されるサンプルは蛇毒である。
（１）大量の実験的研究及びタンパク質データベースの比較により、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドセグメント（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が見出された。アメリカハブ、ラッセルクサリヘビ及びヒャッポダ等の蛇種に由来するトロンビン様酵素のアミノ酸配列にはこのセグメントのアミノ酸配列が含まれないため、測定されるサンプルの蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量の判断に適用できる。
（２）本発明に開示の定性定量方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、中国長白山マムシ毒の品質管理レベルを大幅に向上でき、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素製品の臨床使用、有効性及び安全性を確保できる。
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
以下の実施例で使用される試薬及び溶液の調製方法は以下の通りである。
（１）試薬：トリプシン（Ｓｉｇｍａ，バッチ番号ＳＬＢＳ８９５６）、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素（錦州奥鴻薬業、純度９８．５％）、塩酸グアニジン（ＶＥＴＥＣ、バッチ番号ＷＸＢＣ４２６１Ｖ）、トリヒドロキシアミノメタン（戸市、バッチ番号２０１８１２０６）、ジチオトレイトール（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｄ９１１ＢＡ００１１）、ヨードアセトアミド（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｂ３２６ＢＡ１９４３）。他の試薬はいずれも分析試薬である。
（２）２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液：７９．０６ｍｇ重炭酸アンモニウムを秤量し、４０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
（３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液：１５．４２ｍｇジチオトレイトールを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（４）ヨードアセトアミド（ＩＡ）溶液（使用時に調製）：１８．５ｍｇヨードアセトアミドを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（５）０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）：トリプシン８．０ｍｇを秤量し、２０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
以下の実施例で使用される試薬及び溶液の調製方法は以下の通りである。
（１）試薬：トリプシン（Ｓｉｇｍａ，バッチ番号ＳＬＢＳ８９５６）、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素（錦州奥鴻薬業、純度９８．５％）、塩酸グアニジン（ＶＥＴＥＣ、バッチ番号ＷＸＢＣ４２６１Ｖ）、トリヒドロキシアミノメタン（戸市、バッチ番号２０１８１２０６）、ジチオトレイトール（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｄ９１１ＢＡ００１１）、ヨードアセトアミド（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｂ３２６ＢＡ１９４３）。他の試薬はいずれも分析試薬である。
（２）２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液：７９．０６ｍｇ重炭酸アンモニウムを秤量し、４０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
（３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液：１５．４２ｍｇジチオトレイトールを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（４）ヨードアセトアミド（ＩＡ）溶液（使用時に調製）：１８．５ｍｇヨードアセトアミドを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（５）０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）：トリプシン８．０ｍｇを秤量し、２０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
実施例１
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのスクリーニング及び決定
１、装置
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｕｓｉｏｎ高分解能質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００ナノリットル液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ），Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのスクリーニング及び決定
１、装置
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｕｓｉｏｎ高分解能質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００ナノリットル液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ），Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）
２、クロマトグラフィー質量分析条件
カラム：実験室で作製した０．２ｍｍ×３．５ｃｍ（粒子径５μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ Ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩、濃縮し、実験室で作製した７５μｍ×２５ｃｍ（粒子径３μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱナノリットル分析カラムを用いて分離した。移動相Ａは２％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であり、移動相Ｂは９８％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であった。ナノリットル分離ポンプの流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。グラジエント溶出の設定を表１に示す。
質量分析条件：陽イオンモードで分析を行った。スプレー電圧は２．０ｋＶ、イオントランスファーキャピラリーの温度は２７５℃、Ｓ－Ｌｅｎｓ伝送効率は６０％に設定された。一次質量分析はＯｒｂｉｔｒａｐを質量分析計として採用し、解像度は６０，０００、収集範囲は３５０－１６５０であった。二次質量分析はＩＴを質量分析計として採用し、Ｒａｐｉｄ Ｓｃａｎモードでスキャンし、Ｔｏｐ２０データ依存モデルで前駆体イオンの選択を行い、ＨＣＤモードで断片化した。断片化エネルギーＮＣＥは３５％に設定された。
カラム：実験室で作製した０．２ｍｍ×３．５ｃｍ（粒子径５μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ Ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩、濃縮し、実験室で作製した７５μｍ×２５ｃｍ（粒子径３μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱナノリットル分析カラムを用いて分離した。移動相Ａは２％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であり、移動相Ｂは９８％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であった。ナノリットル分離ポンプの流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。グラジエント溶出の設定を表１に示す。
３、データ採取
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素５ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ反応させ、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集し、ナノリットル液体クロマトグラフィーにより分離して注入し、高分解能質量分析により一次及び二次マススペクトルを採取した。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素５ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ反応させ、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集し、ナノリットル液体クロマトグラフィーにより分離して注入し、高分解能質量分析により一次及び二次マススペクトルを採取した。
４、データベース検索、スクリーニング及び決定
ＮＣＢＩ及びＵｎｉＰｒｏｔを用いて関連する蛇タンパク質ライブラリと毒液タンパク質ライブラリとを統合し、蛇と毒液データベースを構築した。Ｕｎｉｐｒｏｔによって提供されたＰｅｐｔｉｄｅｍａｓｓ機能によりトリプシン酵素を模倣して異なる蛇種の蛇毒トロンビン様酵素タンパク質を分解し、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素タンパク質の配列と他の種の配列とを比較することにより他の種に対する中国長白山マムシの特徴的なポリペプチド配列を取得し、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．２）によりデータベースで質量分析データを検索し、（１）８～２５アミノ酸、（２）人為的に修飾されやすいペプチドセグメントをできるだけ回避、（３）酵素切断時に漏れた切断部位がない等の原則に従って、質量分析応答と分離状況を組み合わせて「ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ」は中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドとして使用できることを決定した。測定結果は、特徴的なペプチドの分子量及び二次質量分析はいずれも理論値と一致することを示している。結果を図１、２に示す。
ＮＣＢＩ及びＵｎｉＰｒｏｔを用いて関連する蛇タンパク質ライブラリと毒液タンパク質ライブラリとを統合し、蛇と毒液データベースを構築した。Ｕｎｉｐｒｏｔによって提供されたＰｅｐｔｉｄｅｍａｓｓ機能によりトリプシン酵素を模倣して異なる蛇種の蛇毒トロンビン様酵素タンパク質を分解し、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素タンパク質の配列と他の種の配列とを比較することにより他の種に対する中国長白山マムシの特徴的なポリペプチド配列を取得し、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．２）によりデータベースで質量分析データを検索し、（１）８～２５アミノ酸、（２）人為的に修飾されやすいペプチドセグメントをできるだけ回避、（３）酵素切断時に漏れた切断部位がない等の原則に従って、質量分析応答と分離状況を組み合わせて「ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ」は中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドとして使用できることを決定した。測定結果は、特徴的なペプチドの分子量及び二次質量分析はいずれも理論値と一致することを示している。結果を図１、２に示す。
実施例２
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりサンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素を定性・定量分析した。
１、装置
ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００トリプル四重極質量分析計、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）、Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）。
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりサンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素を定性・定量分析した。
１、装置
ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００トリプル四重極質量分析計、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）、Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）。
２、クロマトグラフィー質量分析条件
液体クロマトグラフィー条件：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％；１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％；５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％。
質量分析条件：エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；定量イオン対：質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→８９２．４；定性イオン対：ｍ／ｚ８７７．４（二重荷電）→５５０．２。ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセルの出口電圧１０Ｖ；入口電圧ＥＰ １０Ｖ；衝突エネルギー（ＣＥ）：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧（ＤＰ）：１３５Ｖ。
液体クロマトグラフィー条件：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％；１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％；５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％。
質量分析条件：エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；定量イオン対：質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→８９２．４；定性イオン対：ｍ／ｚ８７７．４（二重荷電）→５５０．２。ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセルの出口電圧１０Ｖ；入口電圧ＥＰ １０Ｖ；衝突エネルギー（ＣＥ）：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧（ＤＰ）：１３５Ｖ。
３、溶液の調製
３．１対照サンプル溶液の調製
実施例１でスクリーニングした特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解し、目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を対照サンプル系列標準溶液として収集した。
３．１対照サンプル溶液の調製
実施例１でスクリーニングした特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解し、目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を対照サンプル系列標準溶液として収集した。
３．２テストサンプル溶液の調製
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集した。
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集した。
３．３ブランク溶液の調製
２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液２００μＬを精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解１０し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をブランク溶液として収集した。
２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液２００μＬを精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解１０し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をブランク溶液として収集した。
４、測定法
前記測定される溶液をそれぞれ２μＬ取り、「２、クロマトグラフィー質量分析条件」に記載の条件で測定し、対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液濃度を算出し、測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。
前記測定される溶液をそれぞれ２μＬ取り、「２、クロマトグラフィー質量分析条件」に記載の条件で測定し、対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液濃度を算出し、測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。
５、特異性の評価
テストサンプル溶液、ブランク溶液及び対照サンプル溶液をそれぞれ２μＬ取り、液体クロマトグラフィー－質量分析を行った結果、ブランク溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に干渉ピークが現れる一方、テストサンプル溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に応答ピークが現れた。これは、この方法が特異性が良好であることを示している（図１）。
テストサンプル溶液、ブランク溶液及び対照サンプル溶液をそれぞれ２μＬ取り、液体クロマトグラフィー－質量分析を行った結果、ブランク溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に干渉ピークが現れる一方、テストサンプル溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に応答ピークが現れた。これは、この方法が特異性が良好であることを示している（図１）。
６、検出限界と定量限界
０．０２μｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を取り、水で希釈して濃度が６ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を調製し、それぞれを２μＬ取り、高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル溶液の濃度が２ｎｇ／ｍＬである場合、特徴的なポリペプチドの定量イオン対の信号対雑音比は３．４であり、濃度が６ｎｇ／ｍＬである場合、信号対雑音比は１１．８であった。従って、検出限界は２ｎｇ／ｍＬ、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであった（図３）。
０．０２μｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を取り、水で希釈して濃度が６ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を調製し、それぞれを２μＬ取り、高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル溶液の濃度が２ｎｇ／ｍＬである場合、特徴的なポリペプチドの定量イオン対の信号対雑音比は３．４であり、濃度が６ｎｇ／ｍＬである場合、信号対雑音比は１１．８であった。従って、検出限界は２ｎｇ／ｍＬ、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであった（図３）。
７、直線性と範囲
「３．１対照サンプル溶液の調製」に記載の方法に従って最終濃度が０．０２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの対照サンプル系列標準溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標として線形回帰方程式：ｙ＝７８３４１１ｘ－１０３２９（Ｒ２＝０．９９８）を計算した結果、０．０２μｇ／ｍＬ～０．４μｇ／ｍＬの範囲内では、特徴的なポリペプチドの濃度とピーク面積は線形関係にあった（図２）。
「３．１対照サンプル溶液の調製」に記載の方法に従って最終濃度が０．０２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの対照サンプル系列標準溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標として線形回帰方程式：ｙ＝７８３４１１ｘ－１０３２９（Ｒ２＝０．９９８）を計算した結果、０．０２μｇ／ｍＬ～０．４μｇ／ｍＬの範囲内では、特徴的なポリペプチドの濃度とピーク面積は線形関係にあった（図２）。
８、再現性
テストサンプル溶液の調製方法に従って、６つの溶液を並行して調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、並行して測定した６回の含有量ＲＳＤは２．２％であり、方法の再現性が良好であることを示している。
テストサンプル溶液の調製方法に従って、６つの溶液を並行して調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、並行して測定した６回の含有量ＲＳＤは２．２％であり、方法の再現性が良好であることを示している。
９、精度の評価
テストサンプル溶液を取り、６回の連続注入を繰り返し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対としてピーク面積を測定した結果、ＲＳＤは２．６％であった。これは、装置の精度が良好であることを示している。
テストサンプル溶液を取り、６回の連続注入を繰り返し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対としてピーク面積を測定した結果、ＲＳＤは２．６％であった。これは、装置の精度が良好であることを示している。
１０、安定性評価
テストサンプル溶液を取り、処理した後、８℃で静置し、それぞれ０、２、４、６、８、１６及び２４時間目に注入して測定し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した結果、ピーク面積ＲＳＤは３．０％であった。これは、テストサンプル溶液中の特徴的なポリペプチドが８℃で２４時間以内で安定であることを示している。
テストサンプル溶液を取り、処理した後、８℃で静置し、それぞれ０、２、４、６、８、１６及び２４時間目に注入して測定し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した結果、ピーク面積ＲＳＤは３．０％であった。これは、テストサンプル溶液中の特徴的なポリペプチドが８℃で２４時間以内で安定であることを示している。
１１、回収率の測定
特徴的なポリペプチドの含有量が既知の蛇毒サンプル（含有量０．５３μｇ／ｍｇ）１９．８０ｍｇを精密秤量し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して１０ｍＬまで希釈し、２００μＬ／組で９組取り、それぞれに適量の特徴的なポリペプチド対照サンプル溶液を加え、「３．２テストサンプル溶液の調製」に記載の方法により回収率測定溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、３つの並行回収率はいずれも９１．１８％～１０７．８４％の範囲内にあり、平均回収率は９６．２３％であり、ＲＳＤは６．６％であった。この方法は回収率が良好であった。
特徴的なポリペプチドの含有量が既知の蛇毒サンプル（含有量０．５３μｇ／ｍｇ）１９．８０ｍｇを精密秤量し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して１０ｍＬまで希釈し、２００μＬ／組で９組取り、それぞれに適量の特徴的なポリペプチド対照サンプル溶液を加え、「３．２テストサンプル溶液の調製」に記載の方法により回収率測定溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、３つの並行回収率はいずれも９１．１８％～１０７．８４％の範囲内にあり、平均回収率は９６．２３％であり、ＲＳＤは６．６％であった。この方法は回収率が良好であった。
１２、サンプル検出
「３、溶液の調製」、「４、測定法」に記載の方法により中国長白山マムシ毒（２０１８０６０１Ｆ、２０１８０７０２Ｆ、２０１７０８０２）と標識されたサンプル、アメリカハブ蛇毒（２００４１７１、２００４１７２、２００４１７３、２００４１７４）と標識されたサンプル、及び蛇種が未知の蛇毒サンプル（２０２００３０４、２０２００４０５）を検出した。
「３、溶液の調製」、「４、測定法」に記載の方法により中国長白山マムシ毒（２０１８０６０１Ｆ、２０１８０７０２Ｆ、２０１７０８０２）と標識されたサンプル、アメリカハブ蛇毒（２００４１７１、２００４１７２、２００４１７３、２００４１７４）と標識されたサンプル、及び蛇種が未知の蛇毒サンプル（２０２００３０４、２０２００４０５）を検出した。
１２．１定性分析
前記蛇毒サンプルの前処理方法及び分析方法により検出した結果、質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→５５０．２及び８７７．４（二重荷電）→８９２．４イオン対を用いて作成したテストサンプルのイオン電流クロマトグラムにおいて、３バッチの中国長白山マムシ毒サンプルはいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間（０．８８分間）と一致したピークが現れ、４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒はいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間にピークが現れなかった。従って、３バッチの中国長白山マムシ毒にはいずれも特徴的なポリペプチドＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが検出され、中国長白山マムシに由来することが確認された。４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒にはいずれもこの特徴的なポリペプチドが検出されなかったため、この６パッチの蛇毒は中国長白山マムシに由来するものではないことを示している。
前記蛇毒サンプルの前処理方法及び分析方法により検出した結果、質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→５５０．２及び８７７．４（二重荷電）→８９２．４イオン対を用いて作成したテストサンプルのイオン電流クロマトグラムにおいて、３バッチの中国長白山マムシ毒サンプルはいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間（０．８８分間）と一致したピークが現れ、４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒はいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間にピークが現れなかった。従って、３バッチの中国長白山マムシ毒にはいずれも特徴的なポリペプチドＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが検出され、中国長白山マムシに由来することが確認された。４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒にはいずれもこの特徴的なポリペプチドが検出されなかったため、この６パッチの蛇毒は中国長白山マムシに由来するものではないことを示している。
１２．２定量分析
特徴的なポリペプチド（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が検出されたサンプルに対して、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらにサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。結果を表６に示す。３バッチの粗毒の含有量はいずれも０．４μｇ／ｍｇ以上であった。従って、この方法は、サンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の含有量の測定に適用できる。
以上の実施例は本発明の好適な実施形態であり、本発明の実施形態は実施例に制限されず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で行われた変更、修飾、組み合わせ、置換、簡素化はいずれも同等置換であり、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
特徴的なポリペプチド（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が検出されたサンプルに対して、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらにサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。結果を表６に示す。３バッチの粗毒の含有量はいずれも０．４μｇ／ｍｇ以上であった。従って、この方法は、サンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の含有量の測定に適用できる。
Claims (7)
- アミノ酸配列がＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲであることを特徴とする、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド。
- 請求項１に記載の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドを用い、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び／又は含有量を測定する方法であって、
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含み、
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、前記中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドを対照サンプルに取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、前記液体クロマトグラフィーの条件は、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；カラム：５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％、１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％、５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％であり、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムにおいて、対照の前記特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルに前記アミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の前記特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の含有量を算出することを特徴とする、方法。 - 前記中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドの検出限界は２ｎｇ／ｍＬであり、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りであり、
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - ステップ（２）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りであり、
前記特徴的なポリペプチドの対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬをそれぞれ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の質量分析の条件は、
エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセル出口電圧：１０Ｖ、コリジョンセル入口電圧ＥＰ：１０Ｖ；衝突エネルギーＣＥ：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧ＤＰ：１３５Ｖであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 前記測定されるサンプルは蛇毒であることを特徴とする、請求項２から６のいずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010752988.2 | 2020-07-30 | ||
| CN202010752988.2A CN111896651B (zh) | 2020-07-30 | 2020-07-30 | 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022027576A JP2022027576A (ja) | 2022-02-10 |
| JP7120586B2 true JP7120586B2 (ja) | 2022-08-17 |
Family
ID=73182656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021122762A Active JP7120586B2 (ja) | 2020-07-30 | 2021-07-27 | 中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11467141B2 (ja) |
| JP (1) | JP7120586B2 (ja) |
| CN (1) | CN111896651B (ja) |
| AU (1) | AU2021100681A4 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114689703B (zh) * | 2020-12-25 | 2024-02-27 | 锦州奥鸿药业有限责任公司 | 长白山白眉蝮蛇蛇毒的反相hplc指纹图谱检测方法 |
| CN113237987B (zh) * | 2021-04-20 | 2024-04-23 | 北京赛升药业股份有限公司 | 一种白眉蝮蛇降纤酶hplc检测方法及应用 |
| CN113502279B (zh) * | 2021-09-10 | 2021-12-10 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种蝮蛇蛇毒磷脂酶a2特征多肽及其应用 |
| CN113514585B (zh) * | 2021-09-15 | 2021-11-30 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶的种属来源、含量的方法与应用 |
| CN113866312B (zh) * | 2021-09-29 | 2022-11-08 | 湖南师范大学 | Pirin同源蛋白的特征肽及其应用 |
| CN114113381B (zh) * | 2021-11-12 | 2024-01-30 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 |
| CN116106554B (zh) * | 2022-11-30 | 2023-08-01 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种利用液相色谱-质谱联用检测鹿角胶含量的方法 |
| CN116814588B (zh) * | 2023-04-23 | 2024-02-27 | 山东省食品药品检验研究院 | 圆斑蝰蛇磷脂酶a2特征多肽及其应用 |
| CN118311276B (zh) * | 2024-06-07 | 2024-08-27 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种人凝血酶原复合物的种属鉴别的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1884507A (zh) | 2006-07-06 | 2006-12-27 | 上海交通大学 | 降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6291247B1 (en) * | 1994-05-11 | 2001-09-18 | Queen's University At Kingston | Methods of screening for factors that disrupt neurotrophin conformation and reduce neurotrophin biological activity |
| US20020064517A1 (en) * | 1998-04-30 | 2002-05-30 | Stewart A. Cederholm-Williams | Fibrin sealant as a transfection/transformation vehicle for gene therapy |
| CN101979409A (zh) * | 2010-10-14 | 2011-02-23 | 广州医学院 | 用于促进细胞增殖的蝎毒多肽及其制备方法和药用用途 |
| CN103304630B (zh) * | 2012-03-07 | 2014-09-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 东亚钳蝎蝎毒中的gpcr活性多肽及其提取分离和应用 |
| US10633416B2 (en) * | 2014-09-30 | 2020-04-28 | Bgi Shenzhen Co., Ltd | Conotoxin polypeptide κ-CPTx-bt104, and method for preparation thereof and application thereof |
| CN106220713B (zh) * | 2016-08-08 | 2017-09-01 | 大连医科大学 | 一种蝎毒耐热合成肽及其用途 |
| CN107102152B (zh) * | 2017-05-17 | 2019-04-23 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 尿液中心肌梗死的蛋白标志物及其在诊断和预后中的用途 |
-
2020
- 2020-07-30 CN CN202010752988.2A patent/CN111896651B/zh active Active
-
2021
- 2021-02-03 AU AU2021100681A patent/AU2021100681A4/en not_active Ceased
- 2021-07-27 JP JP2021122762A patent/JP7120586B2/ja active Active
- 2021-07-29 US US17/389,322 patent/US11467141B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1884507A (zh) | 2006-07-06 | 2006-12-27 | 上海交通大学 | 降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Toxicon，2006年，Vol.48，pp.313-322 |
| Zhongguo yaoshi，2008年，Vol.22, No.11，pp.1008-1013 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111896651B (zh) | 2021-04-23 |
| CN111896651A (zh) | 2020-11-06 |
| JP2022027576A (ja) | 2022-02-10 |
| US11467141B2 (en) | 2022-10-11 |
| AU2021100681A4 (en) | 2021-04-22 |
| US20220034856A1 (en) | 2022-02-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7120586B2 (ja) | 中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用 | |
| US11584948B2 (en) | Quantitative detection method for snake venom thrombin-like enzyme (SVTLE) | |
| US11692186B2 (en) | Snake venom thrombin-like enzyme marker peptide of Agkistrodon halys pallas and its application in the species identification of hemocoagulase for injection | |
| CN110596262A (zh) | 利用液相色谱串联质谱测定蜂蜜中意蜂mrjp1蛋白含量的方法 | |
| CN112225782B (zh) | 测定covid-19疫苗中结构蛋白含量的特异性肽段及方法 | |
| CN113502279B (zh) | 一种蝮蛇蛇毒磷脂酶a2特征多肽及其应用 | |
| CN110850001B (zh) | 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp3的方法 | |
| CN110530999A (zh) | 一种驯鹿角的真伪鉴别方法 | |
| CN110736802B (zh) | 一种液相色谱串联质谱定量检测意蜂蜜中α-葡萄糖苷酶的方法 | |
| CN110850000A (zh) | 液相色谱串联质谱定量意蜂蜜mrjp2的方法 | |
| US11680947B2 (en) | Marker polypeptide of bothrops atrox-like thrombin and method thereof for detecting species source and content of snake venom-like thrombin and application | |
| CN110850002B (zh) | 液相色谱串联质谱定量中蜂蜜mrjp2的方法 | |
| CN103694342B (zh) | 检测人老龄化的多肽标志物 | |
| US11592449B2 (en) | Use of LC-MS/MS to quantitate protein biomarkers | |
| CN116148368A (zh) | 一种检测尿液中多种环境污染物及氧化损伤标志物的方法 | |
| CN117471007B (zh) | 一种血浆β-淀粉样蛋白检测方法 | |
| CN111398503B (zh) | 一种用于检测蜂王浆主蛋白4的试剂盒及检测方法 | |
| CN117186185A (zh) | 一种蜈蚣特征肽段及其应用 | |
| CA3041724C (en) | Methods and systems for measuring plasma renin activity | |
| CN106771223A (zh) | 可实现glast蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 | |
| CN116500149A (zh) | 一种蚓激酶的超高效液相色谱-串联质谱鉴别方法 | |
| CN119757604A (zh) | 一种新冠病毒n-蛋白的检测方法与试剂盒 | |
| CN116593621A (zh) | 一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析血浆样本中药物的方法 | |
| CN117288876A (zh) | 一种测定人血浆中甲酸的浓度的质谱检测方法 | |
| CN114544806A (zh) | 血清肉豆蔻酸作为哮喘诊断标志物的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210727 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20220404 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220426 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220516 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220705 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220727 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7120586 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |