[go: up one dir, main page]

JP7109730B2 - Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps - Google Patents

Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps Download PDF

Info

Publication number
JP7109730B2
JP7109730B2 JP2018095287A JP2018095287A JP7109730B2 JP 7109730 B2 JP7109730 B2 JP 7109730B2 JP 2018095287 A JP2018095287 A JP 2018095287A JP 2018095287 A JP2018095287 A JP 2018095287A JP 7109730 B2 JP7109730 B2 JP 7109730B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
cells
proliferation ability
cell proliferation
evaluating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018095287A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2019200151A (en
Inventor
真由 小川
浩輔 高木
和史 合田
崇 杉山
隆史 安部
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evident Corp
Original Assignee
Evident Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evident Corp filed Critical Evident Corp
Priority to JP2018095287A priority Critical patent/JP7109730B2/en
Publication of JP2019200151A publication Critical patent/JP2019200151A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP7109730B2 publication Critical patent/JP7109730B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

特許法第30条第2項適用 https://www.eventscribe.com/2018/SLAS2018/PosterTitles.asp?order=number&h=Posters、2018年1月31日 SLAS2018(年次国際学会のポスター発表)、2018年2月5日~2018年2月7日Article 30, Paragraph 2 of the Patent Law applies https://www. event scribe. com/2018/SLAS2018/PosterTitles. asp? order=number&h=Posters, January 31, 2018 SLAS2018 (poster presentation at an annual international conference), February 5, 2018 - February 7, 2018

本発明は、細胞集塊(スフェロイド)の形状をイメージング(画像)により解析することによって当該細胞集塊の細胞増殖能を評価する方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method of evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster (spheroid) by analyzing the shape of the cell cluster by imaging (image).

細胞の増殖能は、細胞の健全性の指標の1つであり、細胞増殖能を定量化することによって、がん化の有無や腫瘍の悪性度の指標としたり、薬効や細胞毒性を評価することができる。例えば、創薬において、細胞分裂をターゲットとしたタキサン系などを含む抗がん剤が多数開発されている。これらの抗がん剤の薬効評価に際して、細胞の増殖能に対する影響を評価することは重要である。 The proliferative capacity of cells is one of the indicators of the health of cells, and by quantifying the cell proliferative capacity, it can be used as an indicator for the presence or absence of canceration and the degree of malignancy of tumors, as well as for evaluating drug efficacy and cytotoxicity. be able to. For example, in drug discovery, many anticancer agents including taxanes targeting cell division have been developed. When evaluating the efficacy of these anticancer agents, it is important to evaluate their effects on cell proliferation.

細胞の増殖能を測定する方法としては、例えば、BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)、EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)などの核酸アナログを使用する方法がある。これらの核酸アナログは、DNA合成を行う細胞に取り込まれる。このため、これらの核酸アナログの取り込みの有無をこれらの抗体を用いた免疫染色により検出することによって、当該細胞がDNAの複製期間にあたる細胞周期S期を経験したか否かが判別できる。 Examples of methods for measuring cell proliferation ability include methods using nucleic acid analogues such as BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) and EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine). These nucleic acid analogues are taken up by cells undergoing DNA synthesis. Therefore, by detecting the presence or absence of uptake of these nucleic acid analogues by immunostaining using these antibodies, it is possible to determine whether or not the cells have undergone cell cycle S phase, which corresponds to the DNA replication period.

また、分裂期の細胞を検出することによって細胞増殖能を調べる方法として、例えば、サイクリンE型タンパク質等の細胞周期のうちの特定の期に特異的に発現するタンパク質の発現量を指標とする方法がある(例えば、特許文献1参照。)。当該方法では、検体を細胞ごとにばらばらにして、細胞周期特異的なタンパク質を蛍光標識し、フローサイトメーターにより蛍光強度ごとに細胞を分離し、当該タンパク質の発現量の多い細胞を分裂期の細胞として計数する。また、平面培養した幹細胞を、微速度撮影ホフマン・モジュレーション・コントラスト顕微鏡法によって観察し、細胞の形態を直接観察して分裂の有無を調べる方法がある(例えば、特許文献2参照。)。 In addition, as a method of examining cell proliferation ability by detecting cells in the mitotic phase, for example, a method of using the expression level of a protein that is specifically expressed in a specific phase of the cell cycle, such as a cyclin E-type protein, as an index. There is (for example, see Patent Document 1). In this method, the sample is separated for each cell, the cell cycle-specific protein is fluorescently labeled, the cells are separated by fluorescence intensity using a flow cytometer, and the cells with high expression of the protein are classified as mitotic cells. count as In addition, there is a method in which planar cultured stem cells are observed by time-lapse Hoffmann modulation contrast microscopy to directly observe cell morphology to examine the presence or absence of division (see, for example, Patent Document 2).

一方で、細胞が娘細胞を作る現象である細胞分裂は、細胞周期の中でもダイナミックな現象である。間期に染色体が倍になり、分裂期に核膜の消失・紡錘体の形成、染色体の分離、細胞質分裂が起こる。分裂期には紡錘体が形成されるが、この構造は主に微小管から成るため、微小管を染色することで、分裂期にいる細胞を可視化することができる。そこで、臨床現場においては、患者から腫瘍組織の細胞塊を採取し、この細胞塊から薄層切片を作製し、これを染色して得られた核分裂像(核分裂期にある細胞の画像)に基づいて増殖能を評価して病理診断する手法が一般的である。病理診断では、悪性度評価に組織標本上の単位視野あたりの核分裂像数(Mitotic Index:単位視野あたりの全細胞に占める分裂している細胞(M期)の細胞の比率)を用いることで、治療効果の予測や再発の危険性(再発リスク)の評価などがなされる。特にがんの悪性度診断において、核分裂像は重要な診断項目になっている。がん組織中で核分裂が多く見られるものほど、細胞分裂の速度が速く、がんの増殖が速く、悪性度が高いといえる。このため、がん細胞増殖能を示す核分裂指数や、細胞分裂の異常を示す異型核分裂像の検出は、臨床でも頻出している。 On the other hand, cell division, a phenomenon in which a cell creates daughter cells, is a dynamic phenomenon even within the cell cycle. Chromosomes double during interphase, and loss of the nuclear membrane, formation of the mitotic spindle, segregation of chromosomes, and cytokinesis occur during mitosis. During mitosis, the mitotic spindle is formed, and since this structure is mainly composed of microtubules, microtubule staining allows visualization of mitotic cells. Therefore, in clinical practice, a cell mass of tumor tissue is collected from a patient, a thin section is prepared from this cell mass, and a nuclear division image (image of cells in the nuclear division) obtained by staining this is based on A common method is to evaluate the proliferative ability and make a pathological diagnosis. In pathological diagnosis, the number of mitotic figures per unit field of view on tissue specimens (Mitotic Index: the ratio of dividing cells (M phase) cells to all cells per unit field of view) is used to evaluate malignancy. Prediction of therapeutic effects and evaluation of the risk of recurrence (recurrence risk) are performed. Especially in the malignancy diagnosis of cancer, the fission figure is an important diagnostic item. It can be said that the more nuclear fission seen in a cancer tissue, the faster the rate of cell division, the faster the growth of the cancer, and the higher the degree of malignancy. For this reason, mitotic index indicating cancer cell proliferative ability and atypical mitotic figures indicating abnormal cell division are frequently detected clinically.

特表2004-529322号公報Japanese Patent Publication No. 2004-529322 特表2013-507643号公報Japanese Patent Publication No. 2013-507643

しかし、細胞塊の異なる部位で薄切された切片は、がん腫瘍のある一平面を見ているにすぎない。このため、切片ごとに増殖活性を示す細胞の数が違っており、細胞塊全体の病態や分裂期細胞の局在を把握することが難しい。特に、分裂期に形成される紡錘体の細胞内の配置と観察面(平面断層画像)の角度が適当でない場合には、分裂期細胞を単一の薄層切片又は平面断層画像から識別することは困難である。また、薄層切片の作製から核分裂像の取得までは、作業のステップが多く、時間も掛かる煩雑な作業である。 However, sliced slices from different parts of the cell mass only show one plane of the cancer tumor. Therefore, the number of cells exhibiting proliferative activity varies from section to section, making it difficult to understand the pathology of the entire cell mass and the localization of mitotic cells. In particular, when the intracellular arrangement of the mitotic spindles formed during the mitotic phase and the angle of the viewing plane (planar tomographic image) are not appropriate, mitotic cells can be identified from a single thin section or planar tomographic image. It is difficult. In addition, from the preparation of thin slices to the acquisition of nuclear fission images, there are many steps, and the work is time-consuming and complicated.

また、平面培養した細胞について細胞増殖能を測定する方法では、本来三次元構造を持つ生体組織中の細胞の増殖能を反映しているとは限らない、という問題がある。より生体内での増殖能を評価するためには、細胞集塊のような三次元構造の細胞の増殖能を評価することが好ましい。一方で、例えば、分裂期細胞数を特定するために、細胞集塊の細胞をばらばらにしてフローサイトメーターを用いる方法では、細胞集塊中の分裂期細胞が存在する位置の情報がなく、細胞集塊中の細胞の位置と増殖能の関連付けをすることが困難であった。 In addition, there is a problem that the method of measuring the cell proliferation ability of cells cultured on a plane does not always reflect the proliferation ability of cells in a biological tissue that originally has a three-dimensional structure. In order to evaluate the in vivo proliferative ability, it is preferable to evaluate the proliferative ability of three-dimensionally structured cells such as cell clusters. On the other hand, for example, in the method of using a flow cytometer to separate the cells of the cell clump to specify the number of mitotic cells, there is no information on the position of the mitotic cells in the cell clump. It has been difficult to correlate cell location in clumps with proliferative capacity.

本発明は、細胞の三次元構造体である細胞集塊を用いて、その形状をイメージングにより解析することによって当該細胞集塊の細胞増殖能を評価する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for evaluating the cell proliferation ability of a cell clump, which is a three-dimensional structure of cells, by analyzing the shape of the clump by imaging.

本発明は、下記の細胞集塊の細胞増殖能評価方法等を提供する。
[1] 細胞集塊の細胞増殖能を評価する方法であって、
(a)少なくとも核酸と微小管を蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を焦点位置の異なる2枚以上取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された2 枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築する工程と、
(c)前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊中の分裂期にある細胞を識別する工程と、
(d)前記工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数に基づき、前記細胞集塊の細胞増殖能を評価する工程と、
を有
前記工程(c)において、分裂期にある細胞の識別を、微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の、細胞当たりの蛍光強度の最大値と、細胞当たりの総輝度値を細胞当たりの平均輝度値で除した値に基づいて行う、
細胞集塊の細胞増殖能評価方法。
[2] 前記工程(a)において、核酸と微小管がそれぞれ蛍光特性の異なる蛍光物質で標識されており、各焦点位置について、核酸を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像と微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像とを取得する、前記[1]の細胞集塊の細胞増殖能評価方法。
[3] さらに、前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊を構成する細胞の総数を計数し、
前記工程(d)において、前記工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数と、前記細胞集塊を構成する細胞の総数とに基づき、前記細胞集塊の細胞増殖能を評価する、前記[1]又は[2]に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法。
[4] 薬効化合物の薬効を評価する方法であって、
前記薬効化合物で処理した細胞集塊の細胞増殖能を、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、
さらに、前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊中の核異型の細胞を識別
前記細胞集塊中の核異型の細胞の割合を算出し、
前記細胞増殖能と、前記核異型の細胞の割合に基づいて、前記薬効化合物の薬効を評価する、薬効評価方法。
[5] 薬効化合物の薬効を評価する方法であって、
薬効化合物で処理した細胞集塊の細胞増殖能を、前記[1]~[]のいずれかの細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果と前記細胞集塊の大きさとを指標にして、前記薬効化合物の薬効を評価する、薬効評価方法。
[6] 動物から採取された生体組織の細胞増殖能を、前記[1]~[]のいずれかの細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果に基づき、前記生体組織の腫瘍の存在の有無又はその悪性度を判定する、腫瘍の判定方法。
The present invention provides the following methods for evaluating the cell growth potential of cell aggregates, and the like.
[1] A method for evaluating the cell proliferation ability of cell clumps, comprising:
(a) imaging a cell aggregate in which at least nucleic acids and microtubules are labeled with a fluorescent substance using a fluorescence microscope at a resolution at which individual cells can be identified, and obtaining a planar tomographic image of the fluorescence emitted from the fluorescent substance; a step of obtaining two or more images with different focal positions;
(b) constructing a stereoscopic image of the cell cluster by superimposing two or more planar tomographic images obtained in step (a);
(c) analyzing the stereoscopic image constructed in step (b) to identify mitotic cells in the cell cluster;
(d) assessing the cell proliferative potential of the cell cluster based on the number of mitotic cells identified in step (c);
has
In the step (c), cells in the mitotic phase are identified by determining the maximum fluorescence intensity per cell and the total luminance value per cell of the fluorescence emitted from the microtubule-labeled fluorescent substance. Based on the value divided by the average luminance value,
A method for evaluating cell proliferation ability of cell clusters.
[2] In the step (a), the nucleic acid and the microtubule are labeled with fluorescent substances having different fluorescence properties, respectively. The method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to the above [1], wherein a planar tomographic image of fluorescence emitted from a fluorescent substance labeling the tube is obtained.
[3] Furthermore, analyzing the stereoscopic image constructed in the step (b) to count the total number of cells that make up the cell cluster ,
In the step (d), the cell proliferation ability of the cell clump is evaluated based on the number of cells in the mitotic phase identified in the step (c) and the total number of cells constituting the cell clump. , the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to the above [1] or [2].
[4] A method for evaluating efficacy of a medicinal compound, comprising:
The cell proliferation ability of the cell cluster treated with the medicinal compound is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to any one of claims 1 to 3,
Furthermore, analyzing the stereoscopic image constructed in the step (b) to identify nuclear atypia cells in the cell cluster,
calculating the percentage of cells with nuclear atypia in the cell cluster,
A drug efficacy evaluation method, wherein the drug efficacy of the medicinal compound is evaluated based on the cell proliferation ability and the percentage of cells with the nuclear atypia .
[5] A method for evaluating efficacy of a medicinal compound, comprising:
The cell proliferation ability of the cell clusters treated with a medicinal compound is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell clusters according to any one of [1] to [ 3 ] above, and the obtained evaluation results of the cell proliferation ability and the above A method for evaluating the efficacy of the medicinal compound using the size of the cell cluster as an index.
[6] The cell proliferation ability of the biological tissue collected from the animal is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to any one of [1] to [ 3 ] above, and the obtained evaluation result of the cell proliferation ability. A method for judging a tumor, which judges the presence or absence of a tumor in the biological tissue or the degree of malignancy thereof based on the above.

本発明に係る細胞集塊の細胞増殖能評価方法では、細胞集塊を構成する細胞の少なくとも核酸と微小管を蛍光標識し、個々の細胞が識別可能な解像度で蛍光画像を撮像し、得られた蛍光画像をイメージング解析することにより、分裂期にある細胞を識別し、この識別された分裂期にある細胞の数に基づき、細胞増殖能を評価する。このため、本発明に係る細胞集塊の細胞増殖能評価方法により、立体的構造を形成している状態における細胞の細胞増殖能を定量的に、かつ細胞塊から薄層切片を作製してこれを染色する方法よりも簡便に評価することができる。 In the method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster according to the present invention, at least nucleic acids and microtubules of cells constituting the cell cluster are fluorescently labeled, and a fluorescence image is captured at a resolution at which individual cells can be identified. Cells in the mitotic phase are identified by performing imaging analysis on the obtained fluorescence image, and the cell proliferation ability is evaluated based on the number of the identified cells in the mitotic phase. Therefore, by the method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster according to the present invention, the cell proliferation ability of cells in a state of forming a three-dimensional structure is quantitatively obtained, and a thin layer section is prepared from the cell cluster. can be evaluated more easily than the method of staining.

実施例1において、細胞集塊の核酸(青色蛍光)及び微小管(緑色蛍光)の蛍光標識画像を示す。Fluorescently labeled images of nucleic acids (blue fluorescence) and microtubules (green fluorescence) of cell clumps in Example 1 are shown. 図2(a)は、図1中の分裂期細胞及び非分裂期細胞の拡大画像であり、図2(b)は、図2(a)の蛍光標識画像を模式的に示した図である。FIG. 2(a) is an enlarged image of mitotic cells and non-mitotic cells in FIG. 1, and FIG. 2(b) is a diagram schematically showing the fluorescence-labeled image of FIG. 2(a). . 実施例1において、各細胞を、横軸がLmax、縦軸がLmeanとしてプロットした散布図を示す。1 shows a scatter diagram in which each cell in Example 1 is plotted with Lmax on the horizontal axis and Lmean on the vertical axis. 実施例1において、各細胞集塊の分裂期細胞の数を測定した結果を示した図である。1 is a diagram showing the results of measuring the number of mitotic cells in each cell cluster in Example 1. FIG. 実施例2において、各細胞を、横軸がLmax、縦軸がLmeanとしてプロットした散布図を示す。2 shows a scatter diagram in which each cell in Example 2 is plotted with Lmax on the horizontal axis and Lmean on the vertical axis.

本発明に係る細胞集塊の細胞増殖能評価方法(以下、「本発明に係る細胞増殖能評価方法」ということがある。)は、細胞集塊の細胞増殖能を評価する方法であって、下記(a)~(d)の工程を有する。
(a)少なくとも核酸と微小管を蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を焦点位置の異なる2枚以上取得する工程。
(b)前記工程(a)において取得された2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築する工程。
(c)前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊中の分裂期にある細胞を識別する工程。
(d)前記工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数に基づき、前記細胞集塊の細胞増殖能を評価する工程。
The method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster according to the present invention (hereinafter sometimes referred to as the "method for evaluating the cell proliferation ability according to the present invention") is a method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster, It has the following steps (a) to (d).
(a) imaging a cell aggregate in which at least nucleic acids and microtubules are labeled with a fluorescent substance using a fluorescence microscope at a resolution at which individual cells can be identified, and obtaining a planar tomographic image of the fluorescence emitted from the fluorescent substance; A step of acquiring two or more images with different focal positions.
(b) A step of constructing a stereoscopic image of the cell clump by superimposing two or more planar tomographic images obtained in step (a).
(c) analyzing the stereoscopic image constructed in step (b) to identify mitotic cells in the cell cluster;
(d) assessing the cell proliferative potential of the cell cluster based on the number of cells in mitosis identified in step (c);

本発明に係る細胞増殖能評価方法では、細胞集塊を構成する細胞について、細胞ごとにばらばらにすることなく三次元構造を保ったまま、核酸と微小管を蛍光標識し、焦点位置の異なる2枚以上の平面断層画像を取得し、得られた蛍光画像をイメージング解析することにより、三次元の細胞集団のうち、分裂期にある細胞の数を測定する。得られた分裂期細胞数に基づき、細胞集塊の細胞増殖能を評価する。本発明に係る細胞増殖能評価方法により、細胞集塊を構成する細胞について、分裂期細胞か非分裂期細胞かの情報が、当該細胞集塊における位置情報と紐づいて取得できる。また、細胞集塊全体における分裂期細胞数を測定して細胞増殖能を評価することもでき、これにより、細胞集塊の極一部にすぎない薄層切片の細胞に基づいて細胞増殖能を評価する従来の方法よりも、より精度の高い評価が可能である。また、薄切する前の細胞塊の状態で細胞増殖活性を評価するため、本発明に係る細胞増殖能評価方法により、薄層切片の作製といった煩雑な作業を回避することができ、より効率的に細胞増殖能を評価することができる。 In the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, nucleic acids and microtubules are fluorescently labeled while maintaining the three-dimensional structure of the cells that make up the cell clump without separating each cell. The number of cells in the mitotic phase in a three-dimensional cell population is measured by acquiring at least one planar tomographic image and performing imaging analysis on the obtained fluorescence image. Based on the number of mitotic cells obtained, the cell proliferation ability of the cell cluster is evaluated. According to the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, information on whether a cell constituting a cell cluster is a mitotic cell or a non-mitotic cell can be obtained in association with positional information in the cell cluster. It is also possible to assess cell proliferative potential by measuring the number of mitotic cells in the entire cell clump, which allows us to estimate cell proliferative capacity based on thin slices of cells, which are only a fraction of the cell clump. Evaluation with higher precision than the conventional method of evaluation is possible. In addition, since the cell proliferation activity is evaluated in the state of the cell mass before slicing, the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention can avoid complicated work such as preparation of thin slices, and is more efficient. cell proliferation ability can be evaluated.

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、細胞集塊が構築可能な接着性細胞であれば特に限定されるものではない。当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、例えば、動物から採取された細胞そのものであってもよく、初代培養細胞であってもよく、さらに継代培養された細胞であってもよく、動物から採取された細胞やそれを培養した細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。当該細胞集塊を構築する接着性細胞が由来する生物種は、動物であれば特に限定されるものではなく、例えば、ヒトであってもよく、非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物としては、サル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ等の実験動物、家畜、又は愛玩動物である動物が好ましい。 The cell aggregates to be evaluated for cell proliferation ability in the present invention are not particularly limited as long as they are adhesive cells capable of constructing cell aggregates. The adherent cells that construct the cell cluster may be, for example, the cells themselves collected from an animal, primary cultured cells, or subcultured cells. Cells collected from animals or cultured cells thereof may be subjected to various treatments, and cultured cell lines may also be used. The biological species from which the adhesive cells that construct the cell cluster are derived is not particularly limited as long as it is an animal, and may be, for example, a human or a non-human animal. Preferred non-human animals are primates such as monkeys, laboratory animals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, horses, sheep, dogs and cats, livestock animals, and pets.

当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、胚性幹細胞(ES細胞)、誘導多能性幹細胞(iPS細胞)、間葉系幹細胞(MSC)等の多分化能を備えた細胞であってもよく、多分化能を備えた細胞から分化誘導して得られた細胞であってもよい。また、生殖細胞であってもよく、上皮細胞、肝細胞、筋細胞などの分化後の成熟した体細胞であってもよい。 Adhesive cells that construct the cell cluster include cells with multipotency such as embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and mesenchymal stem cells (MSCs). Alternatively, cells obtained by inducing differentiation from pluripotent cells may be used. In addition, germ cells may be used, and mature somatic cells after differentiation such as epithelial cells, hepatocytes, and muscle cells may be used.

当該細胞集塊を構築する接着性細胞としては、正常細胞であってもよく、がん細胞のようにいずれかの生理機能に異常が生じている細胞であってもよく、いずれかの生理機能に異常が生じている細胞と正常細胞との両方であってもよい。 Adhesive cells that construct the cell clusters may be normal cells, or cells with abnormal physiological functions such as cancer cells. It may be both a cell in which an abnormality has occurred and a normal cell.

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、1種類の細胞のみから構築されていてもよく、2種類以上の細胞から構築されていてもよい。2種類以上の細胞から構築される場合、同種の生物種由来の細胞のみから構築された細胞集塊であってもよく、2種以上の生物種由来の細胞から構築された細胞集塊であってもよい。 A target cell cluster whose cell proliferation ability is evaluated in the present invention may be constructed from only one type of cell, or may be constructed from two or more types of cells. When constructed from two or more types of cells, it may be a cell cluster constructed only from cells derived from the same biological species, or a cell cluster constructed from cells derived from two or more biological species. may

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、常法により構築することができる。具体的には例えば、内壁表面が細胞低接着性のU底培養用容器に、所定の数の細胞を含む細胞懸濁液を注入し、所定時間静置することによって、細胞集塊を形成することができる。当該U底培養用容器としては、スフェロイド形成に一般的に用いられている市販の細胞培養用容器や、ウェルの底面及び内壁面を細胞低接着性物質でコートしたウェルプレート等を用いることができる。 A target cell cluster whose cell proliferation ability is to be evaluated in the present invention can be constructed by a conventional method. Specifically, for example, a cell suspension containing a predetermined number of cells is injected into a U-bottom culture vessel whose inner wall surface has low cell adhesion and allowed to stand for a predetermined period of time to form a cell clump. be able to. As the U-bottom culture vessel, a commercially available cell culture vessel generally used for spheroid formation, a well plate in which the bottom surface and inner wall surface of the wells are coated with a low-cell-adhesive substance, or the like can be used. .

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、動物から採取された生体組織自体又はこれを適当な大きさに切断したものであってもよい。動物、例えば、がん患者をはじめとするがんの発症が疑われる動物、担がんモデル動物、抗がん剤候補化合物による処理や発がん処理を行った実験動物等から採取された生体組織の細胞集塊の細胞増殖能を、本発明に係る細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果に基づき、当該生体組織の腫瘍の存在の有無又はその悪性度を判定することができる。細胞増殖能が高いと評価された場合には、当該生体組織には腫瘍が存在している、又は当該生体組織に存在している腫瘍の悪性度は高い、と判定される。一方で、細胞増殖能が低いと評価された場合には、当該生体組織には腫瘍が存在していない、又は当該生体組織に存在している腫瘍の悪性度は低い、と判定される。腫瘍の存在の有無やその悪性度の情報を得ることは、腫瘍の判定や抗がん剤の薬効評価において重要である。 In the present invention, the target cell aggregates whose cell proliferative ability is evaluated may be biological tissues themselves collected from animals or cut into appropriate sizes. Living tissues collected from animals, such as cancer patients and other animals suspected of developing cancer, cancer-bearing model animals, experimental animals treated with anticancer drug candidate compounds or carcinogenic treatments, etc. The cell proliferation ability of the cell cluster is evaluated by the cell proliferation ability evaluation method according to the present invention, and the presence or absence of a tumor in the biological tissue or its malignancy is determined based on the obtained evaluation result of the cell proliferation ability. be able to. When the cell proliferative ability is evaluated as high, it is determined that a tumor exists in the biological tissue or that the tumor existing in the biological tissue has a high degree of malignancy. On the other hand, when the cell proliferation ability is evaluated as low, it is determined that no tumor exists in the biological tissue, or that the malignancy of the tumor present in the biological tissue is low. Obtaining information on the presence or absence of a tumor and its malignancy is important in determining tumors and evaluating the efficacy of anticancer agents.

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、予めゲルに包埋させておいてもよい。細胞集塊を包埋するゲルとしては、1種以上の細胞外マトリックスを構成する成分により構築されるゲルであることが好ましい。細胞集塊を細胞外マトリックスからなるゲルで包埋させることにより、生体内の細胞環境を模すことができ、より生体内に近い環境下での細胞増殖能を評価することができる。細胞外マトリックスを構成する成分としては、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。細胞集塊のゲルへの包埋は、常法により行うことができる。例えば、構築された細胞集塊を含む細胞培養用容器に、溶融させた状態のゲルを当該細胞集塊全体が浸漬するために充分な量注入し、静置してゲルを硬化させることにより、細胞集塊をゲルに包埋させることができる。当該ゲルとしては、細胞外マトリックスを構成する成分を含み、細胞培養のための基材に使用される市販のゲルを用いることもできる。 A target cell aggregate whose cell proliferation ability is to be evaluated in the present invention may be pre-embedded in a gel. The gel for embedding the cell aggregates is preferably a gel composed of one or more extracellular matrix-constituting components. By embedding the cell clumps in a gel consisting of an extracellular matrix, it is possible to mimic the in vivo cell environment and evaluate the cell proliferation ability in an environment that is more like the in vivo environment. Components constituting the extracellular matrix include collagen, elastin, fibronectin, laminin, entactin, heparin sulfate and the like. Embedding of cell aggregates in gel can be performed by a conventional method. For example, by injecting a sufficient amount of a melted gel into a cell culture vessel containing the constructed cell aggregates so that the entire cell aggregates are immersed, and allowing the gel to harden by standing still, Cell clumps can be embedded in a gel. As the gel, a commercially available gel that contains a component that constitutes an extracellular matrix and that is used as a substrate for cell culture can also be used.

細胞増殖能をより精度よく評価するため、本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、予め一定期間培養したものであってもよい。細胞集塊の培養は、当該細胞集塊を構成する細胞と同種の細胞を平面培養する場合と同様にして培養することができる。例えば、細胞集塊は、細胞集塊を構成する細胞と同種の細胞を平面培養する場合に一般的に用いられる細胞培養用液体培地に浸漬させた状態で、二酸化炭素濃度又は酸素濃度が制御された環境下、25~40℃、好ましくは28~37℃で培養することができる。培養環境の二酸化炭素濃度及び酸素濃度は、培養する細胞の種類等を考慮して適宜調整することができる。培養環境としては、例えば、二酸化炭素濃度が4~6容量%、酸素濃度が1~22容量%の範囲内で制御されていることが好ましい。 In order to evaluate the cell proliferation ability more accurately, the cell aggregates to be evaluated for the cell proliferation ability in the present invention may be cultured in advance for a certain period of time. The cell clump can be cultured in the same manner as the cells of the same type as the cells forming the cell clump are cultured in a plane. For example, the cell clumps are immersed in a liquid medium for cell culture generally used for planar culture of cells of the same type as the cells that make up the cell clumps, and the carbon dioxide concentration or oxygen concentration is controlled. It can be cultured at 25 to 40°C, preferably 28 to 37°C, in a clean environment. The carbon dioxide concentration and oxygen concentration in the culture environment can be appropriately adjusted in consideration of the type of cells to be cultured. As the culture environment, for example, it is preferable that the carbon dioxide concentration is controlled within the range of 4 to 6% by volume and the oxygen concentration is controlled within the range of 1 to 22% by volume.

本発明において細胞増殖能が評価される対象の細胞集塊は、少なくとも核酸と微小管が蛍光物質で標識されている。核酸を標識する蛍光物質と微小管を標識する蛍光物質は、同じ蛍光特性の蛍光物質であってもよいが、核酸と微小管をそれぞれ蛍光特性の異なる蛍光物質で標識する方が好ましい。なお、蛍光特性が異なるとは、励起光照射により発される蛍光の波長が、区別して検出し得るほど異なることを意味する。 In the present invention, at least nucleic acids and microtubules are labeled with a fluorescent substance in the target cell aggregates whose cell proliferation ability is evaluated. The fluorescent substance for labeling nucleic acids and the fluorescent substance for labeling microtubules may have the same fluorescent properties, but it is preferable to label nucleic acids and microtubules with fluorescent substances having different fluorescent properties. In addition, different fluorescence characteristics means that the wavelengths of fluorescence emitted by excitation light irradiation are different enough to be distinguished and detected.

細胞内の核酸を蛍光標識することにより、主に細胞核が蛍光染色される。つまり、核酸から発される蛍光画像を解析することにより、細胞核の形状、1細胞当たりに含まれている細胞核の数なども判別することができ、細胞のおおよその細胞周期を判別することもできる。また、細胞集塊の各局所領域における細胞密度を測定することもできる。 By fluorescently labeling intracellular nucleic acids, mainly cell nuclei are fluorescently stained. In other words, by analyzing the fluorescence image emitted from the nucleic acid, it is possible to determine the shape of the cell nucleus, the number of cell nuclei contained in each cell, and the approximate cell cycle of the cell. . It is also possible to measure the cell density in each localized region of the cell clump.

核酸の蛍光物質による標識は、細胞集塊を蛍光性核酸染色剤で染色することにより行うことができる。蛍光性核酸染色剤は、DAPI(4’,6-diamino-2-phenylindole)、PI(propidium iodide)、Hoechst33258、Hoechst33342、7-AAD(7Amino actinomycin D)等の公知の蛍光性核酸染色剤の中から、適宜選択して用いることができる。 Nucleic acids can be labeled with a fluorescent substance by staining the cell cluster with a fluorescent nucleic acid stain. Fluorescent nucleic acid stains include known fluorescent nucleic acid stains such as DAPI (4′,6-diamino-2-phenylindole), PI (propidium iodide), Hoechst33258, Hoechst33342, 7-AAD (7Aminoactinomycin D). can be appropriately selected and used from the above.

微小管の蛍光物質による標識は、例えば、微小管を構成するチューブリンに対する抗体を用いて蛍光免疫染色することにより行うことができる。蛍光免疫染色は常法により行うことができる。 Labeling of microtubules with a fluorescent substance can be performed, for example, by fluorescent immunostaining using an antibody against tubulin that constitutes microtubules. Fluorescent immunostaining can be performed by a conventional method.

工程(a)においては、蛍光標識された細胞集塊を、蛍光物質の種類ごとに、それぞれの励起光の照射下の蛍光顕微鏡で撮像し、当該蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を取得する。すなわち、各焦点位置について、細胞核を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像と微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像とを取得する。この際、個々の細胞が識別可能な解像度の平面断層画像を取得する。蛍光顕微鏡としては、例えば、光電子増倍管等の検出器が取り付けられた共焦点レーザー顕微鏡やライトシート顕微鏡等を用いることができる。各細胞が個別に識別可能な平面断層画像を画像解析することによって、分裂期か否かの判定がより明確に行うことができる。 In step (a), the fluorescently-labeled cell aggregates are imaged with a fluorescence microscope under illumination of respective excitation light for each type of fluorescent substance, and a planar tomographic image of the fluorescence emitted from the fluorescent substance is obtained. get. That is, for each focal position, a planar tomographic image of fluorescence emitted from the fluorescent substance labeling the cell nuclei and a planar tomographic image of fluorescence emitted from the fluorescent substance labeling the microtubules are acquired. At this time, a planar tomographic image with a resolution that allows individual cells to be identified is acquired. As a fluorescence microscope, for example, a confocal laser microscope or a light sheet microscope equipped with a detector such as a photomultiplier tube can be used. By image analysis of planar tomographic images in which each cell can be individually identified, it is possible to more clearly determine whether or not cells are in the mitotic phase.

工程(a)において取得する平面断層画像は、一顕微鏡視野につき、蛍光顕微鏡の焦点位置が異なる平面断層画像を2枚以上取得する。細胞集塊の焦点位置が最小となる位置から最大となる位置までを等間隔で順次焦点位置を移動させて一連の平面断層画像群を取得することが特に好ましい。例えば共焦点レーザー顕微鏡では、共焦点領域を細胞集塊の高さ方向(Z軸方向)へ少しずつずらしながら(対物レンズと細胞集塊とを光軸に対して直交する方向に相対的に移動させながら)、当該細胞集塊のZ軸方向に直交する断面の平面断層画像を順次撮像することによって、焦点位置の異なる複数枚の平面断層画像を取得することができる。 For the planar tomographic images acquired in step (a), two or more planar tomographic images with different focal positions of the fluorescence microscope are acquired for each microscope field. It is particularly preferable to acquire a series of plane tomographic images by sequentially moving the focal position at equal intervals from the position where the focal position of the cell clump is the smallest to the position where the focal position is the largest. For example, in a confocal laser microscope, the confocal region is gradually shifted in the height direction (Z-axis direction) of the cell clump (the objective lens and the cell clump are relatively moved in the direction perpendicular to the optical axis). By sequentially capturing planar tomographic images of cross sections of the cell cluster perpendicular to the Z-axis direction, a plurality of planar tomographic images having different focal positions can be acquired.

また、核酸と微小管に加えて、細胞の生理学的な状態や生理活性を解析するために有用な生体分子の蛍光標識も行い、それぞれの蛍光の平面断層画像を取得してもよい。具体的には、工程(a)において取得した平面断層画像と同一の顕微鏡視野について、それぞれの蛍光の励起光を順次照射し、各蛍光の平面断層画像を撮像する。取得された高解像度の平面断層画像の画像解析を行うことにより、それぞれの細胞の生理学的な状態や生理活性をも解析することができる。 In addition to nucleic acids and microtubules, fluorescent labeling of biomolecules useful for analyzing the physiological state and physiological activity of cells may also be performed, and planar tomographic images of each fluorescence may be acquired. Specifically, the same microscope field of view as the planar tomographic image acquired in step (a) is sequentially irradiated with the excitation light of each fluorescence, and a planar tomographic image of each fluorescence is captured. By performing image analysis of the acquired high-resolution planar tomographic images, it is possible to analyze the physiological state and physiological activity of each cell.

この取得された一連の平面断層画像群を互いに重ね合わせることにより、細胞集塊の立体画像を構築することができる(工程(b))。この一連の平面断層画像群を取得する際の各平面断層画像の焦点位置の距離は、各平面断層画像をより滑らかに重ね合わせられるように、細胞集塊を構成する細胞よりも小さいことが好ましく、例えば、0.5~5μmとすることができる。一連の平面断層画像群からの立体画像の構築は、例えば、CT(コンピュータ断層撮影法)等の技術分野において公知の画像構築法により行うことができる。 A stereoscopic image of the cell clump can be constructed by superimposing the obtained series of planar tomographic images (step (b)). The distance of the focal position of each planar tomographic image when acquiring this series of planar tomographic images is preferably smaller than the cells constituting the cell clump so that the planar tomographic images can be superimposed more smoothly. , for example, 0.5 to 5 μm. A stereoscopic image can be constructed from a series of planar tomographic images by an image construction method known in the technical field, such as CT (computed tomography).

構築された細胞集塊の立体画像を解析して、前記細胞集塊中の分裂期にある細胞を識別する(工程(c))。分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞は、その核酸標識画像と微小管標識画像に基づき、常法により識別することができる。具体的には、非分裂期にある正常細胞は、細胞内に1個の細胞核が存在しているため、核酸標識画像ではこの球状の細胞核全体が染色されている。また、微小管は細胞全体に張り巡らされているため、微小管標識画像では、細胞質全体が薄く染色されているように観察される。一方で、分裂期にある細胞は、細胞核内にあった核酸は凝集して染色体が構成されており、微小管も紡錘体を構成する。つまり、核酸標識画像では染色体特有の形状の構造物が観察され、微小管標識画像では紡錘体特有の形状の構造物が観察される。この標識画像の相違により、分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞を識別できる。 A stereoscopic image of the constructed cell clump is analyzed to identify cells in the mitotic phase in the cell clump (step (c)). Cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase can be distinguished by a conventional method based on the nucleic acid-labeled image and the microtubule-labeled image. Specifically, since a normal cell in the non-mitotic phase has one cell nucleus in the cell, the entire spherical cell nucleus is stained in the nucleic acid-labeled image. In addition, since microtubules are spread over the entire cell, the entire cytoplasm appears to be lightly stained in the microtubule-labeled image. On the other hand, in mitotic cells, the nucleic acids in the cell nucleus aggregate to form chromosomes, and microtubules also form mitotic spindles. That is, a structure with a shape peculiar to chromosomes is observed in the nucleic acid-labeled image, and a structure with a shape peculiar to the spindle is observed in the microtubule-labeled image. Cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase can be distinguished from each other by the difference in the labeled images.

分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞の識別は、目視でも可能であるが、画像解析により立体画像から両細胞を自動的に分類することが好ましい。なお、本発明において、標識画像の解析は、公知の画像解析の手法を適宜組み合わせることにより行うことができる。自動分類を行う場合、分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞の識別は、微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の細胞当たりの蛍光強度の最大値(以下、「最大輝度値(Lmax)」ということがある。)に基づいて行うことができる。 Cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase can be distinguished visually, but it is preferable to automatically classify the cells from the three-dimensional image by image analysis. In the present invention, the analysis of the marker image can be performed by appropriately combining known image analysis techniques. When automatic classification is performed, cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase are distinguished by the maximum fluorescence intensity per cell (hereafter referred to as the “maximum luminance value”) emitted from the microtubule-labeled fluorescent substance. (Lmax)").

なお、ここでいう輝度とは、例えば濃淡画像においては濃淡を表す値であり、画像中の各ボクセルの明るさを表す値である。また、ここでいう体積とは、領域の正確な体積の数値のみならず、領域に含まれるボクセルの数を意味してもよい。 It should be noted that the luminance referred to here is a value representing the gradation in a grayscale image, for example, and is a value representing the brightness of each voxel in the image. Moreover, the volume here may mean not only the numerical value of the exact volume of the region but also the number of voxels included in the region.

非分裂期にある細胞の微小管標識画像は、細胞質全体が薄く染色されている、言い換えると細胞質全体に輝度が分散している。これに対して、分裂期にある細胞の微小管標識画像は、核付近の紡錘体が強く染色されている、言い換えると輝度が核に集中している。このため、微小管標識画像において、分裂期にある細胞は、非分裂期にある細胞よりも、最大輝度値が大きい。このため、分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞は、Lmaxの値に基づいて識別することができる。例えば、Lmaxについて予め分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞を識別するための閾値を設定しておき、当該閾値よりもLmaxが大きい細胞を、分裂期にある細胞に分類する。当該閾値は、例えば、分裂期にあることが確認されている細胞と分裂期にないことが確認されている細胞について、同様にして取得した微小管標識蛍光画像から実験的に求めることができる。 Microtubule-labeled images of cells in the non-dividing phase show that the entire cytoplasm is lightly stained, in other words, the brightness is dispersed throughout the cytoplasm. In contrast, microtubule-labeled images of mitotic cells show strong staining of spindles near the nucleus, in other words, the brightness is concentrated in the nucleus. Therefore, in the microtubule-labeled image, cells in the mitotic phase have a larger maximum luminance value than cells in the non-mitotic phase. Therefore, cells in the dividing phase and cells in the non-dividing phase can be distinguished based on the value of Lmax. For example, a threshold for distinguishing cells in the mitotic phase from cells in the non-mitotic phase is set in advance for Lmax, and cells with Lmax greater than the threshold are classified as cells in the mitotic phase. The threshold can be experimentally determined from microtubule-labeled fluorescence images similarly acquired for cells confirmed to be in the mitotic phase and cells confirmed not to be in the mitotic phase, for example.

また、微小管標識画像において、分裂期にある細胞は、非分裂期にある細胞よりも、細胞当たりの染色領域(ボクセル)が狭い。ここで、細胞当たりの微小管染色領域の体積(Sm:単位はボクセル)は、細胞当たりの総輝度値(Ltotal)を、細胞当たりの平均輝度値(Lmean)で除した値(Ltotal/Lmean)である。つまり、微小管標識画像において、分裂期にある細胞は、非分裂期にある細胞よりも、Ltotal/Lmeanが小さく、Lmaxが大きい。そこで、分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞の識別は、LmaxとLtotal/Lmeanの値に基づいて識別することもできる。LmaxとLtotal/Lmeanの両方について予め分裂期にある細胞と非分裂期にある細胞を識別するための閾値を設定しておき、Lmaxが設定された閾値よりも大きく、かつLtotal/Lmeanが設定された閾値よりも小さい細胞を、分裂期にある細胞に分類する。これらの閾値は、例えば、分裂期にあることが確認されている細胞と分裂期にないことが確認されている細胞について、同様にして取得した微小管標識蛍光画像から実験的に求めることができる。 In microtubule labeling images, cells in the mitotic phase have a narrower stained area (voxel) per cell than cells in the non-mitotic phase. Here, the volume of the microtubule-stained region per cell (Sm: unit is voxel) is the value (Ltotal/Lmean) obtained by dividing the total brightness value (Ltotal) per cell by the average brightness value (Lmean) per cell. is. That is, in the microtubule labeling image, cells in the mitotic phase have a smaller Ltotal/Lmean and a larger Lmax than cells in the non-mitotic phase. Therefore, cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase can also be distinguished based on the values of Lmax and Ltotal/Lmean. For both Lmax and Ltotal/Lmean, a threshold is set in advance for distinguishing between cells in the mitotic phase and cells in the non-mitotic phase, and Lmax is greater than the set threshold and Ltotal/Lmean is set. Cells smaller than the threshold are classified as cells in mitosis. These thresholds can be experimentally determined from microtubule-labeled fluorescent images similarly acquired for cells confirmed to be in the mitotic phase and cells confirmed not to be in the mitotic phase, for example. .

Lmax、Ltotal、及びLmeanを求めるために、まず、核酸標識画像から、細胞核領域を決定し、この細胞核領域に基づいて細胞領域を決定する。具体的には、以下の方法で、細胞領域を決定することができる。 In order to obtain Lmax, Ltotal, and Lmean, first, the cell nucleus region is determined from the nucleic acid labeled image, and the cell region is determined based on this cell nucleus region. Specifically, the cell area can be determined by the following method.

まず、立体画像の画素(ボクセル)当たりの蛍光輝度値に基づき、予め設定しておいた閾値(蛍光標識された領域と蛍光標識されていない領域を区別するための閾値)を用いて二値化処理を行う。当該閾値は、例えば、各標識画像中の細胞が存在していないことが明らかな領域(バックグラウンド)の1画素当たりの輝度値やその統計値等から決定してもよく、経験的に取得された閾値であってもよい。 First, based on the fluorescence intensity value per pixel (voxel) of the stereoscopic image, binarization is performed using a preset threshold value (threshold value for distinguishing between fluorescently labeled regions and non-fluorescently labeled regions). process. The threshold may be determined, for example, from the brightness value per pixel in a region (background) where it is clear that no cells are present in each labeled image, the statistical value thereof, or the like, and is empirically obtained. threshold.

得られた二値化画像から核酸標識領域や微小管標識領域を決定する画像解析は、例えば特開2011-75278号公報に記載の方法等の公知の画像解析方法を利用して行うことができる。具体的には、例えば、輝度値が設定された閾値より上の画素を1、それ以外を0というように二値化を行い、さらに1となった画素からなる一塊の領域をメインオブジェクトとして認識する。このオブジェクト中の各画素の輝度値の勾配から、当該オブジェクトの境界を分離し、閉じた領域を抽出し、これを個々の核酸標識領域や微小管標識領域として決定する。この決定された核酸標識領域を、各細胞の細胞核領域とする。 Image analysis for determining nucleic acid-labeled regions and microtubule-labeled regions from the resulting binarized image can be performed using a known image analysis method such as the method described in JP-A-2011-75278. . Specifically, for example, binarization is performed by assigning 1 to pixels whose luminance value is higher than a set threshold, and 0 otherwise, and a cluster of pixels consisting of pixels with a value of 1 is recognized as the main object. do. From the gradient of the luminance value of each pixel in this object, the boundaries of the object are separated, closed regions are extracted, and these are determined as individual nucleic acid-labeled regions and microtubule-labeled regions. This determined nucleic acid-labeled region is used as the cell nucleus region of each cell.

細胞密度が高く、細胞が込み合っているような場合には、領域分割を行う手法の一つとして知られているウォーターシェッド(Watershed)アルゴリズム手法を用いることが好ましい。該手法は、マークと呼ばれる領域の中心を隣接画素へと広げていくことによって領域を得るものであり、この機能を同時に使用することにより、個々の細胞を認識するよう設定する。 When the cell density is high and the cells are crowded, it is preferable to use the Watershed algorithm technique, which is known as one of the techniques for segmentation. The method obtains a region by extending the center of the region, called a mark, to adjacent pixels, and using this function simultaneously sets it to recognize individual cells.

各細胞の細胞領域は、細胞核周辺の領域として推定し、決定された細胞核領域に対して膨張処理(Dilation)を行うことにより決定する。この決定された各細胞領域について、微小管標識画像から、Lmax、Ltotal、及びLmeanを求める。すなわち、細胞領域に含まれている全画素の輝度値の総量をLtotal、最高輝度値をLmax、平均輝度値をLmeanとして測定する。 The cell area of each cell is determined by estimating the area around the cell nucleus and performing dilation on the determined cell nucleus area. For each determined cell region, Lmax, Ltotal, and Lmean are obtained from the microtubule labeling image. That is, the total luminance value of all pixels included in the cell region is measured as Ltotal, the maximum luminance value as Lmax, and the average luminance value as Lmean.

Lmaxに基づいて、立体画像中の細胞集塊を構成する細胞から、予め設定された閾値よりもLmaxが大きい細胞を抽出し、これを分裂期にある細胞として分類する。LmaxとLtotal/Lmeanの両方に基づいて、立体画像中の細胞集塊を構成する細胞から、予め設定された閾値よりもLmaxが大きく、かつ予め設定された閾値よりもLtotal/Lmeanが小さい細胞を抽出し、これを分裂期にある細胞として分類することも好ましい。本発明に係る細胞増殖能評価方法では、各細胞の細胞集塊における位置情報も紐づいているため、細胞集塊中の分裂期にある細胞の数が計数できるだけではなく、その局在をも把握することができる。 Based on Lmax, cells having Lmax larger than a preset threshold are extracted from the cells forming the cell clump in the stereoscopic image, and classified as cells in the mitotic phase. Based on both Lmax and Ltotal/Lmean, cells forming cell clumps in a stereoscopic image are selected to have Lmax larger than a preset threshold and Ltotal/Lmean smaller than a preset threshold. It is also preferred to extract and classify these as cells in mitosis. In the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, since the positional information of each cell in the cell cluster is also linked, it is possible not only to count the number of cells in the mitotic phase in the cell cluster, but also to determine their localization. can grasp.

細胞集塊においては、集塊の内部の細胞は、周辺部の細胞よりも蛍光輝度値が低くなる傾向にある。つまり、細胞集塊中の細胞は、その位置によって蛍光強度の輝度値がばらつく場合がある。そこで、例えば、LmaxをLmeanで規格化することによって、このばらつきの問題を解決してより評価精度を高めることができる。 In a cell clump, cells inside the clump tend to have lower fluorescence intensity values than cells in the surrounding area. That is, cells in a cell clump may have different luminance values of fluorescence intensity depending on their positions. Therefore, for example, by normalizing Lmax by Lmean, it is possible to solve this variation problem and improve the evaluation accuracy.

例えば、以下の式(1)に基づき、LmaxをLmeanで規格化することができる。下記式中、「Lmax’」は、規格化されたLmaxである。 For example, Lmax can be normalized by Lmean based on the following equation (1). In the following formula, "Lmax'" is normalized Lmax.

Lmax’=α*(Lmax -γ)/(Lmean -β) (1) Lmax'=α*(Lmax−γ)/(Lmean−β) (1)

上記式(1)中、α、β、γは以下の通りに求められる。まず、各細胞を、横軸がLmax、縦軸がLmeanとしてプロットした散布図を作製し、この散布図について、最小二乗法で近似直線を求める。Lmax’が1の場合、式(1)は近似直線に乗る。すなわち、Lmeanから予想されるLmaxの値が実測値と等しい場合、Lmax’を1とする。このため、式(1)中、αは近似直線の傾きに等しく、βは0であり、α*γは近似直線の切片に-1を乗じた値である。 In the above formula (1), α, β and γ are obtained as follows. First, a scatter diagram is prepared by plotting each cell with Lmax on the horizontal axis and Lmean on the vertical axis, and an approximate straight line is obtained from this scatter diagram by the method of least squares. When Lmax' is 1, equation (1) fits on an approximate straight line. That is, Lmax' is set to 1 when the value of Lmax expected from Lmean is equal to the measured value. Therefore, in equation (1), α is equal to the slope of the approximation line, β is 0, and α*γ is the intercept of the approximation line multiplied by -1.

こうして得られたLmax’に閾値を設定し、Lmax’がこの閾値以下の細胞を、分裂期にある細胞として抽出して分類する。当該閾値は、Lmax’よりも小さい範囲内で、例えば、Otsuの方法(https://imagej.nih.gov/ij/plugins/otsu-thresholding.html)により自動的に取得することができる。これにより、抽出して分類された細胞集団に対する分裂期にある細胞の割合を高めることができ、分裂期にある細胞をより精度よく評価できる。 A threshold value is set for the Lmax' thus obtained, and cells with Lmax' values below this threshold value are extracted and classified as cells in the mitotic phase. The threshold can be automatically obtained, for example, by Otsu's method (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/otsu-thresholding.html) within a range smaller than Lmax'. As a result, the ratio of cells in the mitotic phase to the extracted and classified cell population can be increased, and the cells in the mitotic phase can be evaluated more accurately.

また、細胞集塊内では、紡錘体は様々な方向に形成されており、細胞集塊に対して一の角度の断面(一般的にはXY平面)に対してのみ解析する場合には、当該断面中の細胞において紡錘体が形成されている角度によっては、紡錘体が識別できず、分裂期細胞として認識できないおそれもある。これに対して、本発明に係る細胞増殖能評価方法では、構築された立体画像に対して解析することにより、様々な方向に形成された紡錘体を精度よく認識することができ、分裂期細胞の定量的解析の精度を改善することができる。 In addition, spindles are formed in various directions within the cell cluster, and when analyzing only a cross section at one angle (generally the XY plane) with respect to the cell cluster, the Depending on the angle at which the spindle is formed in the cells in the section, the spindle may not be identified and may not be recognized as a mitotic cell. On the other hand, in the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, by analyzing the constructed stereoscopic image, spindles formed in various directions can be recognized with high accuracy. can improve the accuracy of the quantitative analysis of

識別された分裂期にある細胞の数に基づき、細胞集塊の細胞増殖能を評価する(工程(d))。細胞集塊を構成する細胞の細胞増殖能が高いほど、当該細胞集塊に存在する分裂期にある細胞の数は多くなる。このため、分裂期にある細胞の数が多い細胞集塊を構成する細胞は、分裂期にある細胞の数が少ない細胞集塊を構成する細胞よりも、細胞増殖能が高いと評価できる。 Based on the identified number of cells in mitosis, the cell clump is assessed for cell proliferation (step (d)). The higher the cell proliferative capacity of the cells forming the cell clump, the greater the number of cells in the mitotic phase present in the cell clump. Therefore, it can be evaluated that cells forming a cell cluster with a large number of cells in the mitotic phase have a higher cell proliferation ability than cells forming a cell cluster with a small number of cells in the mitotic phase.

また、工程(b)において構築された立体画像を解析して、当該細胞集塊を構成する細胞の総数を計数した上で、工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数と、当該細胞集塊を構成する細胞の総数とに基づき、当該細胞集塊の細胞増殖能を評価することもできる。具体的には、細胞集塊を構成する細胞の細胞増殖能が高いほど、当該細胞集塊を構成する細胞の総数に対する分裂期にある細胞の数の割合(分裂期細胞比率)(%)が高くなる。このため、分裂期細胞比率が高い細胞集塊を構成する細胞は、分裂期細胞比率が低い細胞集塊を構成する細胞よりも、細胞増殖能が高いと評価できる。 Further, after analyzing the stereoscopic image constructed in step (b) and counting the total number of cells constituting the cell cluster, the number of cells in the mitotic phase identified in step (c), The cell proliferation ability of the cell cluster can also be evaluated based on the total number of cells constituting the cell cluster. Specifically, the higher the cell proliferation ability of the cells that make up the cell cluster, the more the ratio of the number of cells in the mitotic phase to the total number of cells that make up the cell cluster (mitotic cell ratio) (%). get higher Therefore, cells forming a cell cluster with a high mitotic cell ratio can be evaluated as having a higher cell proliferation ability than cells forming a cell cluster with a low mitotic cell ratio.

例えば、細胞増殖能が所望の程度よりも高い細胞の存在の有無や存在量の評価を目的とする場合には、細胞集塊に含まれる分裂期にある細胞の数又は分裂期細胞比率が、予め設定した閾値よりも多い場合に、当該細胞集塊を構成する細胞は細胞増殖能が高いと評価することができる。逆に、細胞増殖能が所望の程度よりも低い細胞の存在の有無や存在量の評価を目的とする場合には、細胞集塊に含まれる分裂期にある細胞の数又は分裂期細胞比率が、予め設定した閾値よりも少ない場合に、当該細胞集塊を構成する細胞は細胞増殖能が低いと評価することもできる。これらの閾値は、評価の目的に応じて適宜実験的に求めることができる。 For example, when the purpose is to evaluate the presence or absence of cells whose cell proliferative ability is higher than the desired level and the abundance, the number of cells in the mitotic phase contained in the cell clump or the ratio of mitotic cells is When the number of cells is greater than a preset threshold value, it can be evaluated that the cells forming the cell cluster have high cell proliferation ability. Conversely, when the purpose is to evaluate the presence or absence of cells whose cell proliferative capacity is lower than the desired level and the amount of cells present, the number of cells in the mitotic phase contained in the cell cluster or the ratio of mitotic cells , it is also possible to evaluate that the cell proliferating ability of the cells constituting the cell clump is low when it is less than a preset threshold value. These thresholds can be experimentally determined appropriately according to the purpose of evaluation.

また、本発明に係る細胞増殖能評価方法では、個々の細胞が識別可能な解像度で撮像した平面断層画像から構築された立体画像を用いるため、個々の細胞について、その核酸標識画像から核異型の細胞を識別することもできる。細胞増殖能と核異型の細胞の比率との両方を用いることで、例えば、抗がん剤の薬効評価等をより効率よく行うことができる。 In addition, in the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, a stereoscopic image constructed from planar tomographic images obtained by imaging individual cells at a resolution that allows identification is used. Cells can also be identified. By using both the cell proliferation ability and the ratio of nuclear atypical cells, for example, efficacy evaluation of anticancer agents can be performed more efficiently.

また、本発明において得られた立体画像から、細胞集塊の大きさ(体積)を測定することもできる。例えば、細胞集塊の立体画像から得られた二値化画像を、一画像に細胞集塊全体が収まる程度に縮小した画像を、細胞集塊の大きさの解析用画像とする。この縮小した解析用画像中の蛍光標識された領域を、細胞集塊領域として認識する。この縮小した解析用画像では、細胞集塊(蛍光標識された領域)は、略球体の一塊としてあらわされる。細胞増殖能と細胞集塊の大きさとの両方を用いることで、例えば、抗がん剤などの外部刺激による腫瘍サイズの変化と分裂期細胞数の変化との関連付けも可能になる。 Moreover, the size (volume) of the cell cluster can also be measured from the stereoscopic image obtained in the present invention. For example, an image obtained by reducing a binarized image obtained from a stereoscopic image of a cell clump so that the entire cell clump can fit in one image is used as an image for analysis of the size of the cell clump. The fluorescence-labeled region in this reduced image for analysis is recognized as the cell cluster region. In this reduced analysis image, the cell cluster (fluorescently labeled area) is represented as a substantially spherical mass. By using both cell proliferative capacity and cell aggregate size, it is also possible to correlate changes in tumor size and changes in mitotic cell number due to external stimuli such as anticancer drugs.

細胞集塊を特定の環境下で培養し、培養後の細胞集塊に対して本発明に係る細胞増殖能評価方法を実施することにより、当該細胞集塊を構成する細胞の当該環境下における細胞増殖能を評価することができる。例えば、細胞集塊を外部から刺激した後に、当該細胞集塊を蛍光物質で標識し、この蛍光標識した細胞集塊に対して本発明に係る細胞増殖能評価方法を実施することにより、細胞集塊を外部から刺激した状態における細胞増殖能を評価することができる。この外部からの刺激は、一過性のものであってもよく、細胞を増殖させるために必要な培養の間中、継続してもよい。 By culturing a cell clump under a specific environment and performing the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention on the cultured cell clump, the cells constituting the cell clump under the environment Proliferative capacity can be evaluated. For example, after externally stimulating a cell clump, the cell clump is labeled with a fluorescent substance, and the fluorescently labeled cell clump is subjected to the cell proliferation potency evaluation method according to the present invention to obtain a cell clump. Cell proliferation ability can be evaluated in the state of externally stimulating the mass. This external stimulus may be transient or may continue throughout the culture required to grow the cells.

外部からの刺激が生理活性物質の場合、例えば、細胞集塊を、生理活性物質を含む培養培地に浸漬させる、又は細胞集塊が浸漬している培養培地に生理活性物質を添加し、そのまま充分な時間培養することによって、細胞集塊を生理活性物質によって刺激することができる。培養時間によっては、生理活性物質を含む培養培地を、生理活性物質を含まない新たな培養培地に交換して培養を継続してもよい。 When the external stimulus is a physiologically active substance, for example, the cell aggregates are immersed in a culture medium containing a physiologically active substance, or the physiologically active substance is added to the culture medium in which the cell aggregates are immersed, and the substance is sufficiently By culturing for an appropriate period of time, cell aggregates can be stimulated with a physiologically active substance. Depending on the culture time, the culture medium containing the physiologically active substance may be replaced with a new culture medium containing no physiologically active substance to continue the culture.

生理活性物質とは、種々の生体反応を制御に関与する物質を意味する。本発明において外部刺激として使用する生理活性物質としては、ビタミンやホルモン、抗体等のような生体内に本来存在する物質であってもよく、酵素阻害剤、医薬品の有効成分となる化学合成品等のような生体内には本来存在しない物質であってもよい。また、生理活性物質は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の複合タンパク質、糖類、多糖類、脂質、核酸、低分子化合物のいずれであってもよい。 A physiologically active substance means a substance that participates in the control of various biological reactions. The physiologically active substance used as an external stimulus in the present invention may be a substance that originally exists in the body such as vitamins, hormones, antibodies, etc., enzyme inhibitors, chemically synthesized products that are active ingredients of pharmaceuticals, etc. It may be a substance that does not originally exist in the body, such as . The physiologically active substance may be any of complex proteins such as proteins, peptides, and glycoproteins, sugars, polysaccharides, lipids, nucleic acids, and low-molecular-weight compounds.

本発明に係る細胞増殖能評価方法は、生体内の細胞の環境に近しい三次元構造体である細胞集塊を用いて細胞増殖能を評価する。このため、薬効化合物の薬効評価に対して本発明に係る細胞増殖能評価方法を用いることにより、平面培養された細胞を用いた場合よりも、より生体に投薬した場合得られる薬効に近い薬効評価が可能になる。当該薬効化合物としては、特に限定されるものではなく、抗がん剤をはじめとする各種医薬品の有効成分であってもよく、各種医薬品の候補化合物であってもよい。 The cell proliferation potency evaluation method according to the present invention evaluates cell proliferation potency using a cell clump, which is a three-dimensional structure close to the environment of cells in vivo. Therefore, by using the cell proliferation potency evaluation method according to the present invention for the efficacy evaluation of a medicinal compound, the efficacy evaluation is closer to the efficacy obtained when administered to a living body than when using flat cultured cells. becomes possible. The medicinal compound is not particularly limited, and may be an active ingredient of various pharmaceuticals including anticancer agents, or a candidate compound of various pharmaceuticals.

例えば、がん患者から採取されたがん細胞を含む細胞集塊を抗がん剤を含む培養培地に浸漬させ、そのまま充分な時間培養した後に本発明に係る細胞増殖能評価方法を実施することにより、抗がん剤で処理された状態における当該がん患者のがん細胞の細胞増殖能を評価することができる。抗がん剤処理により、未処理のがん細胞よりも細胞増殖能が低下したと評価された場合には、当該抗がん剤によりがん細胞の細胞増殖が抑制されている、すなわち、当該がん患者のがん細胞は当該抗がん剤に対して感受性であり、よって当該がん患者に当該抗がん剤を投与することによって有効な抗がん効果が期待できる、と評価できる。 For example, a cell clump containing cancer cells collected from a cancer patient is immersed in a culture medium containing an anticancer drug, cultured for a sufficient period of time, and then subjected to the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention. Thus, the cell proliferation ability of cancer cells of the cancer patient can be evaluated in a state treated with an anticancer drug. If the anticancer drug treatment is evaluated to have a lower cell growth potential than untreated cancer cells, the anticancer drug suppresses the cell growth of the cancer cells, that is, the Cancer cells of cancer patients are sensitive to the anticancer drug, and therefore, it can be evaluated that an effective anticancer effect can be expected by administering the anticancer drug to the cancer patient.

また、抗がん剤の候補化合物のスクリーニングにおいて、評価対象試料であるがん細胞からなる細胞集塊を、候補化合物を含む培養培地に浸漬させ、そのまま充分な時間培養した後に本発明に係る細胞増殖能評価方法を実施する。コントロールの細胞集塊よりも細胞増殖能が低下した場合には、当該候補化合物は抗がん効果があると評価することができる。一方で、コントロールの細胞集塊に対して細胞増殖能の低下が観察されなかった場合には、当該候補化合物は抗がん効果ないと評価することができる。 In addition, in the screening of candidate compounds for anticancer agents, a cell cluster composed of cancer cells, which is a sample to be evaluated, is immersed in a culture medium containing a candidate compound, and cultured for a sufficient period of time. A method for evaluating proliferation ability is carried out. When the cell proliferative ability is lower than that of the control cell cluster, the candidate compound can be evaluated as having an anticancer effect. On the other hand, when no decrease in cell proliferation ability is observed in control cell aggregates, the candidate compound can be evaluated as having no anticancer effect.

抗がん剤等の薬効化合物の薬効評価においては、細胞集塊の大きさに対する影響も重要な情報である。そこで、薬効化合物で処理した細胞集塊の細胞増殖能を、本発明に係る細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果と当該細胞集塊の大きさとを指標にして、当該薬効化合物の薬効を評価することも好ましい。 In evaluating the efficacy of medicinal compounds such as anticancer agents, the influence on the size of cell aggregates is also important information. Therefore, the cell proliferation ability of cell aggregates treated with a medicinal compound is evaluated by the method for evaluating cell proliferation ability according to the present invention, and the obtained evaluation results of cell proliferation ability and the size of the cell aggregates are used as indicators. , it is also preferable to evaluate the efficacy of the medicinal compound.

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

[実施例1]
ヒト結腸腺癌に由来する培養細胞株HT29細胞の細胞集塊に対してパクリタキセル処理し、分裂期にある細胞を識別した。
[Example 1]
Cell clumps of cultured cell line HT29 cells derived from human colon adenocarcinoma were treated with paclitaxel to identify mitotic cells.

<細胞集塊の構築>
具体的には、HT29細胞(ATCCから入手)を、低吸着U底プレート(住友ベークライト社製)に各ウェルあたり250個ずつ播種し、1週間培養し、細胞集塊を形成させた。
<Construction of cell clumps>
Specifically, HT29 cells (obtained from ATCC) were seeded on a low-adsorption U-bottom plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) at 250 per well and cultured for 1 week to form cell aggregates.

<パクリタキセル処理>
次いで、得られた細胞集塊の培養培地に、紡錘体分裂阻害剤であるパクリタキセル(タキソール、BMS社製)を、終濃度が0、8、80、又は800nMとなるように添加し、48時間培養して処理した。なお、パクリタキセル処理により、細胞は分裂期が終了できなくなるため、分裂期細胞数が増加する。
<Paclitaxel treatment>
Then, paclitaxel (Taxol, manufactured by BMS), which is a spindle division inhibitor, was added to the culture medium of the obtained cell aggregates to a final concentration of 0, 8, 80, or 800 nM, and the mixture was incubated for 48 hours. cultured and treated. In addition, paclitaxel treatment prevents cells from completing the mitotic phase, resulting in an increase in the number of mitotic cells.

<細胞集塊の蛍光標識>
次いで、得られた細胞集塊を、1% TritonX-100/4%パラホルムアルデヒドに浸漬させて4℃で一晩静置して固定した。次いで、メタノール濃度が25容量%、50容量%、75容量%、95容量%であるメタノール/PBSに、順次30分間ずつ、4℃で浸漬させた後、100%メタノールに5時間、4℃で浸漬させた。続いて、3% Normal Goat Serum/PBSで、4℃で一晩ブロッキングした。
<Fluorescent Labeling of Cell Clusters>
The resulting cell clumps were then immersed in 1% TritonX-100/4% paraformaldehyde and fixed overnight at 4°C. Then, it was immersed in methanol/PBS with a methanol concentration of 25% by volume, 50% by volume, 75% by volume, and 95% by volume at 4°C for 30 minutes each, and then in 100% methanol for 5 hours at 4°C. soaked. Subsequently, it was blocked overnight at 4°C with 3% Normal Goat Serum/PBS.

ブロッキング後の細胞集塊を、1%NGS/PBSに200倍希釈したalexa Fluor 488標識抗Tubulin 抗体(eBioscience社製)に4℃で一晩浸漬させた後、希釈したHoechst33342に常温で6時間以上浸漬させた。その後、ScaleS4(透明化液)に浸漬させて37℃で一晩振とうさせた。 After blocking, the cell aggregates were immersed in an alexa Fluor 488-labeled anti-Tubulin antibody (manufactured by eBioscience) diluted 200-fold in 1% NGS/PBS overnight at 4°C, and then soaked in diluted Hoechst33342 at room temperature for 6 hours or more. soaked. Then, it was immersed in ScaleS4 (clearing liquid) and shaken overnight at 37°C.

<立体画像の構築>
蛍光標識後の細胞集塊を、共焦点レーザー顕微鏡「FV1200」(オリンパス社製)で撮像した。20倍対物レンズ(LUCPLFLN×20)で、Zスライスの厚みが細胞核の大きさ以下となるようにして撮像した。それぞれの蛍光標識サンプルに対して撮像された一連の平面断層画像群を重ね合わせて立体画像を構築した。得られた立体画像に対して、二値化処理し、二値化画像を得た。
<Construction of 3D image>
Cell clusters after fluorescent labeling were imaged with a confocal laser microscope "FV1200" (manufactured by Olympus). Imaging was performed with a 20-fold objective lens (LUCPLFLN×20) so that the thickness of the Z-slice was equal to or less than the size of the cell nucleus. A stereoscopic image was constructed by superimposing a series of planar tomographic images captured for each fluorescently labeled sample. The obtained stereoscopic image was binarized to obtain a binarized image.

図1に、細胞集塊の核酸(青色蛍光)及び微小管(緑色蛍光)の蛍光標識画像を示す。図1中の分裂期細胞及び非分裂期細胞の拡大画像を図2(a)に示す。図2(b)は、図2(a)の蛍光標識画像を模式的に示した図である。図2(b)の微小管染色領域は、色が濃い領域が、図2(a)において蛍光強度が比較的強かった領域を示す。非分裂期細胞は、細胞の中心に細胞核が青く標識されており、その周囲が微小管で薄く緑色に標識されていた。分裂期細胞は、細胞の中心部の核酸で標識されている領域に、微小管から形成された紡錘体が強く緑色で蛍光標識されていた(図2(b)中、微小管染色領域中の濃色部分)。 FIG. 1 shows fluorescently labeled images of nucleic acids (blue fluorescence) and microtubules (green fluorescence) in cell clumps. Enlarged images of mitotic cells and non-mitotic cells in FIG. 1 are shown in FIG. 2(a). FIG. 2(b) is a diagram schematically showing the fluorescent labeled image of FIG. 2(a). In the microtubule-stained regions in FIG. 2(b), darker regions indicate regions where fluorescence intensity was relatively strong in FIG. 2(a). Non-dividing cells had a blue-labeled nucleus in the center of the cell, surrounded by thin microtubules and green-labeled. In mitotic cells, spindles formed from microtubules were strongly fluorescently labeled in green in the nucleic acid-labeled region in the center of the cell (Fig. 2(b), in the microtubule-stained region dark part).

<細胞領域の決定>
二値化画像から、一塊の領域をメインオブジェクトとして認識し、このオブジェクト中の各画素の輝度値の勾配から、当該オブジェクトの境界を分離し、閉じた領域を抽出し、これを個々の核酸標識領域や微小管標識領域として決定した。この決定された核酸標識領域を、各細胞の細胞核領域とした。各細胞の細胞領域に対して膨張処理(Dilation)を行うことにより細胞領域を決定した。
<Determination of cell area>
From the binarized image, a cluster of regions is recognized as the main object, the boundary of the object is separated from the gradient of the brightness value of each pixel in this object, a closed region is extracted, and this is used as an individual nucleic acid label. determined as the area or microtubule-labeled area. This determined nucleic acid-labeled region was used as the cell nucleus region of each cell. The cell area was determined by dilating the cell area of each cell.

<Lmax、Ltotal、及びLmeanの測定>
決定された各細胞領域について、微小管標識画像から、細胞領域に含まれている全画素の輝度値の総量をLtotal、最高輝度値をLmax、平均輝度値をLmeanとして測定した。
<Measurement of Lmax, Ltotal, and Lmean>
For each determined cell region, the total luminance value of all pixels included in the cell region was measured as Ltotal, the maximum luminance value as Lmax, and the average luminance value as Lmean from the microtubule-labeled image.

図3に、各細胞を、横軸がLmax、縦軸がLmeanとしてプロットした散布図を示す。この散布図のうち、Lmaxが3000以上であり、かつLtotal/Lmeanが5×10以下である細胞(図中、四角で囲った領域)を分裂期細胞として抽出して分類した。分裂期細胞の数を図4に示す。この結果、図3の四角で囲われた領域の細胞の数は、パクリタキセルの濃度依存的に増大しており、当該領域により分裂期細胞を抽出できていることが確認された。 FIG. 3 shows a scatter diagram plotting each cell with Lmax on the horizontal axis and Lmean on the vertical axis. From this scatter diagram, cells with Lmax of 3000 or more and Ltotal/Lmean of 5×10 4 or less (boxed area in the figure) were extracted and classified as mitotic cells. The numbers of mitotic cells are shown in FIG. As a result, the number of cells in the area enclosed by the square in FIG. 3 increased in a paclitaxel concentration-dependent manner, confirming that mitotic cells could be extracted from this area.

[実施例2]
ヒト結腸腺癌に由来する培養細胞株HT29細胞の細胞集塊中の分裂期にある細胞を識別した。
[Example 2]
Mitotic cells were identified in clumps of cultured cell line HT29 cells derived from human colon adenocarcinoma.

実施例1と同様にして構築した細胞集塊に対して、実施例1と同様にして、核酸と微小管を蛍光標識し、蛍光画像を取得して立体画像を構築した。実施例1と同様にして、構築された立体画像を二値化し、細胞領域を決定し、各細胞のLmax、Ltotal、及びLmeanを測定した。 Nucleic acids and microtubules were fluorescently labeled in the same manner as in Example 1 for the cell clusters constructed in the same manner as in Example 1, and fluorescence images were acquired to construct a three-dimensional image. In the same manner as in Example 1, the constructed stereoscopic image was binarized, the cell area was determined, and Lmax, Ltotal, and Lmean of each cell were measured.

図5に、各細胞を、横軸がLmax、縦軸がLmeanとしてプロットした散布図を示す。この散布図について、最小二乗法で近似直線を求めたところ、y=0.4634*x-67.721(x:Lmax、y:Lmean)であった。 FIG. 5 shows a scatter diagram plotting each cell with Lmax on the horizontal axis and Lmean on the vertical axis. When an approximate straight line was obtained from this scatter diagram by the method of least squares, it was y=0.4634*x-67.721 (x: Lmax, y: Lmean).

次いで、下記式(1)に基づき、LmaxをLmeanで規格化した。下記式中、「Lmax’」は、規格化されたLmaxである。 Then, Lmax was normalized by Lmean based on the following formula (1). In the following formula, "Lmax'" is normalized Lmax.

Lmax’=α*(Lmax -γ)/(Lmean -β) (1) Lmax'=α*(Lmax−γ)/(Lmean−β) (1)

Lmeanから予想されるLmaxの値が実測値と等しい場合、Lmax’を1とする。よって、上記式(1)中、αは0.4634、βは0、α*γは67.721であった。 If the value of Lmax expected from Lmean is equal to the measured value, then Lmax' is set to 1. Therefore, in the above formula (1), α was 0.4634, β was 0, and α*γ was 67.721.

こうして得られたLmax’に対して、(x:Lmax、y:Lmean)=(1500, 250)及び(4300, 770)の2点を通る直線を境界線とした。図中、斜め線がこの境界線を示す。なお、(1500, 250)はLmeanの最小値を示す細胞であり、(4300, 770)はLmaxの最大値を示す細胞である。 A straight line passing through two points (x: Lmax, y: Lmean)=(1500, 250) and (4300, 770) was defined as a boundary line for Lmax' thus obtained. In the figure, oblique lines indicate this boundary line. (1500, 250) is the cell showing the minimum value of Lmean, and (4300, 770) is the cell showing the maximum value of Lmax.

この境界線は、Lmax’が2.5の値の線である。そして、図5の散布図中、Lmax’≧2.5の細胞(図中、三角で囲まれた領域)を分裂期細胞として抽出し分類した。この領域の中から100個の細胞をランダムに抽出し、標識画像を目視で確認したところ、分裂期細胞の割合は87%であった。 This boundary line is the line with a value of 2.5 for Lmax'. Then, in the scatter diagram of FIG. 5, cells with Lmax'≧2.5 (regions surrounded by triangles in the figure) were extracted and classified as mitotic cells. Randomly extracting 100 cells from this region and visually confirming the labeled image, the ratio of mitotic cells was 87%.

一方で、図5の散布図から、Lmaxの値のみで分裂期細胞を抽出した場合、具体的には、Lmax≧4000の細胞を分裂期細胞として抽出し分類したところ、この領域の中から100個の細胞をランダムに抽出し、標識画像を目視で確認した結果、分裂期細胞の割合は11%であった。これらの結果から、規格化することにより、分裂期細胞の認識精度を改善できることが確認された。 On the other hand, when mitotic cells were extracted based only on the value of Lmax from the scatter diagram of FIG. As a result of randomly extracting individual cells and visually confirming the labeled images, the ratio of mitotic cells was 11%. From these results, it was confirmed that normalization can improve the recognition accuracy of mitotic cells.

Claims (6)

細胞集塊の細胞増殖能を評価する方法であって、
(a)少なくとも核酸と微小管を蛍光物質で標識された細胞集塊を、蛍光顕微鏡を用いて個々の細胞が識別可能な解像度で撮像し、前記蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像を焦点位置の異なる2枚以上取得する工程と、
(b)前記工程(a)において取得された2枚以上の平面断層画像を重ね合わせることにより、前記細胞集塊の立体画像を構築する工程と、
(c)前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊中の分裂期にある細胞を識別する工程と、
(d)前記工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数に基づき、前記細胞集塊の細胞増殖能を評価する工程と、
を有
前記工程(c)において、分裂期にある細胞の識別を、微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の、細胞当たりの蛍光強度の最大値と、細胞当たりの総輝度値を細胞当たりの平均輝度値で除した値に基づいて行う、
細胞集塊の細胞増殖能評価方法。
A method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster, comprising:
(a) imaging a cell aggregate in which at least nucleic acids and microtubules are labeled with a fluorescent substance using a fluorescence microscope at a resolution at which individual cells can be identified, and obtaining a planar tomographic image of the fluorescence emitted from the fluorescent substance; a step of obtaining two or more images with different focal positions;
(b) constructing a stereoscopic image of the cell cluster by superimposing two or more planar tomographic images obtained in step (a);
(c) analyzing the stereoscopic image constructed in step (b) to identify mitotic cells in the cell cluster;
(d) assessing the cell proliferative potential of the cell cluster based on the number of mitotic cells identified in step (c);
has
In the step (c), cells in the mitotic phase are identified by determining the maximum fluorescence intensity per cell and the total luminance value per cell of the fluorescence emitted from the microtubule-labeled fluorescent substance. Based on the value divided by the average luminance value,
A method for evaluating cell proliferation ability of cell clusters.
前記工程(a)において、核酸と微小管がそれぞれ蛍光特性の異なる蛍光物質で標識されており、各焦点位置について、核酸を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像と微小管を標識した蛍光物質から発される蛍光の平面断層画像とを取得する、請求項1に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法。 In the step (a), nucleic acids and microtubules are each labeled with fluorescent substances having different fluorescence characteristics, and for each focal position, a planar tomographic image of fluorescence emitted from the nucleic acid-labeled fluorescent substance and microtubules are labeled. 2. The method for evaluating the cell proliferation ability of a cell clump according to claim 1, wherein a planar tomographic image of fluorescence emitted from the fluorescent substance is obtained. さらに、前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊を構成する細胞の総数を計数し、
前記工程(d)において、前記工程(c)において識別された分裂期にある細胞の数と、前記細胞集塊を構成する細胞の総数とに基づき、前記細胞集塊の細胞増殖能を評価する、請求項1又は2に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法。
Furthermore, by analyzing the stereoscopic image constructed in the step (b), counting the total number of cells that make up the cell cluster ,
In the step (d), the cell proliferation ability of the cell clump is evaluated based on the number of cells in the mitotic phase identified in the step (c) and the total number of cells constituting the cell clump. 3. The method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to claim 1 or 2.
薬効化合物の薬効を評価する方法であって、
前記薬効化合物で処理した細胞集塊の細胞増殖能を、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、
さらに、前記工程(b)において構築された立体画像を解析して、前記細胞集塊中の核異型の細胞を識別
前記細胞集塊中の核異型の細胞の割合を算出し、
前記細胞増殖能と、前記核異型の細胞の割合に基づいて、前記薬効化合物の薬効を評価する、薬効評価方法。
A method for evaluating efficacy of a medicinal compound, comprising:
The cell proliferation ability of the cell cluster treated with the medicinal compound is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to any one of claims 1 to 3,
Furthermore, analyzing the stereoscopic image constructed in the step (b) to identify nuclear atypia cells in the cell cluster,
calculating the percentage of cells with nuclear atypia in the cell cluster,
A drug efficacy evaluation method, wherein the drug efficacy of the medicinal compound is evaluated based on the cell proliferation ability and the percentage of cells with the nuclear atypia .
薬効化合物の薬効を評価する方法であって、
薬効化合物で処理した細胞集塊の細胞増殖能を、請求項1~のいずれか一項に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果と前記細胞集塊の大きさとを指標にして、前記薬効化合物の薬効を評価する、薬効評価方法。
A method for evaluating efficacy of a medicinal compound, comprising:
The cell proliferation ability of the cell cluster treated with a medicinal compound is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of the cell cluster according to any one of claims 1 to 3 , and the evaluation result of the obtained cell proliferation ability; A drug efficacy evaluation method, wherein the drug efficacy of the drug compound is evaluated using the size of the cell cluster as an index.
動物から採取された生体組織の細胞増殖能を、請求項1~のいずれか一項に記載の細胞集塊の細胞増殖能評価方法により評価し、得られた細胞増殖能の評価結果に基づき、前記生体組織の腫瘍の存在の有無又はその悪性度を判定する、腫瘍の判定方法。 The cell proliferation ability of a biological tissue collected from an animal is evaluated by the method for evaluating the cell proliferation ability of a cell cluster according to any one of claims 1 to 3 , and based on the obtained evaluation result of the cell proliferation ability. , a method for determining a tumor, which determines the presence or absence of a tumor in the living tissue or the degree of malignancy thereof.
JP2018095287A 2018-05-17 2018-05-17 Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps Active JP7109730B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018095287A JP7109730B2 (en) 2018-05-17 2018-05-17 Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018095287A JP7109730B2 (en) 2018-05-17 2018-05-17 Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019200151A JP2019200151A (en) 2019-11-21
JP7109730B2 true JP7109730B2 (en) 2022-08-01

Family

ID=68611274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018095287A Active JP7109730B2 (en) 2018-05-17 2018-05-17 Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP7109730B2 (en)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008099625A (en) 2006-10-20 2008-05-01 Olympus Corp Analysis method for cell cycle
WO2010035049A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Isis Innovation Limited Microtumours
JP2011075278A (en) 2009-09-29 2011-04-14 Olympus Corp Method of analyzing structure composing cell nucleus and method of analyzing form of cell nucleus
WO2013165008A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 公益財団法人がん研究会 Small compound targeting at tacc3
JP2014066702A (en) 2012-09-06 2014-04-17 Olympus Corp Image analysis method of cells in laminated structure and evaluation method of laminated structure for cornea transplant
CN104697970A (en) 2015-03-17 2015-06-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Three-dimensional recombination method for observing proliferation and distribution of cells in carrier
JP2016509596A (en) 2013-01-11 2016-03-31 ノバルティス アーゲー MELK regulation for the treatment of breast cancer
WO2017029414A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Insphero Ag An in vitro 3d cell culture model-based tumor relapse assay
JP2017184659A (en) 2016-04-05 2017-10-12 日本メナード化粧品株式会社 Three-dimensional cultured epidermis model, manufacturing method thereof, and method of using three-dimensional cultured epidermis model

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008099625A (en) 2006-10-20 2008-05-01 Olympus Corp Analysis method for cell cycle
WO2010035049A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Isis Innovation Limited Microtumours
JP2011075278A (en) 2009-09-29 2011-04-14 Olympus Corp Method of analyzing structure composing cell nucleus and method of analyzing form of cell nucleus
WO2013165008A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 公益財団法人がん研究会 Small compound targeting at tacc3
JP2014066702A (en) 2012-09-06 2014-04-17 Olympus Corp Image analysis method of cells in laminated structure and evaluation method of laminated structure for cornea transplant
JP2016509596A (en) 2013-01-11 2016-03-31 ノバルティス アーゲー MELK regulation for the treatment of breast cancer
CN104697970A (en) 2015-03-17 2015-06-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Three-dimensional recombination method for observing proliferation and distribution of cells in carrier
WO2017029414A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Insphero Ag An in vitro 3d cell culture model-based tumor relapse assay
JP2017184659A (en) 2016-04-05 2017-10-12 日本メナード化粧品株式会社 Three-dimensional cultured epidermis model, manufacturing method thereof, and method of using three-dimensional cultured epidermis model

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Corinne Lorenzo,Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy,Cell Division,2011年,6:22,pp.1-8,http://www.celldiv.com/content/6/1/22
理化学研究所,細胞まるごと三次元画像データの自動解析法を開発-画像処理と数理計算の融合により巨大データを精密に解く新手法-,研究成果(プレスリリース),2015年,pp.1-10,https://www.riken.jp/press/2015/20151105_1/

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019200151A (en) 2019-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wälchli et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain
Paul et al. Tissue architectural cues drive organ targeting of tumor cells in zebrafish
EP3473727B1 (en) Method for analyzing state of cells in spheroid
US20080015448A1 (en) Stromal collagen in the diagnosis and characterization of breast cancer
Almstedt et al. Real-time evaluation of glioblastoma growth in patient-specific zebrafish xenografts
US10914726B2 (en) Method for evaluating protrusion-forming ability of cell spheroids
US20240177302A1 (en) Cellular diagnostic and analysis methods
Aguilar Cosme et al. Morphological response in cancer spheroids for screening photodynamic therapy parameters
Patntirapong et al. Assessment of bisphosphonate treated-osteoblast behaviors by conventional assays and a simple digital image analysis
JP2025505359A (en) Method and application for measuring the flux rate of water molecules across cell membranes, method and system for measuring magnetic resonance imaging markers of gliomas - Patents.com
Li et al. Label-free multiphoton imaging to assess neoadjuvant therapy responses in breast carcinoma
JP2023541824A (en) Automated analysis of cell cultures
US20130066199A1 (en) Tumor margin detection method based on nuclear morphometry and tissue topology
Barbone et al. X-ray multiscale 3D neuroimaging to quantify cellular aging and neurodegeneration postmortem in a model of Alzheimer’s disease
JP7109730B2 (en) Method for evaluating cell proliferation ability of cell clumps
Comin et al. An image processing approach to analyze morphological features of microscopic images of muscle fibers
EP3477304A1 (en) Method relating to evaluation of tumor tissue of experimental animal
US20100272651A1 (en) Method for assessing potential for tumor development and metastasis
Sinakevitch et al. A combined MRI, histological and immunohistochemical rendering of the rhesus macaque locus coeruleus (LC) enables the differentiation of three distinct LC subcompartments
US20180103845A1 (en) Method for assessing irritancy to biological samples
US12013398B2 (en) Compositions and methods for treatment of invasive cancers
Desa Understanding the role of collagen fiber internal structure in solid tumor metastasis and chemoresistance using second-harmonic generation imaging
Ley Imaging of early distal tarsal osteoarthritis in Icelandic horses
JP7166348B2 (en) Cell analysis device and cell analysis method
Mey et al. Protocol for assessing regional pathology in the rodent optic nerve using longitudinal cryosections and cross-sectional electron microscopy

Legal Events

Date Code Title Description
A80 Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80

Effective date: 20180517

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210304

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20211206

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211221

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220217

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220607

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712

Effective date: 20220629

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220629

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7109730

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250