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JP7104710B2 - ＴＣＲαホーミングエンドヌクレアーゼバリアント - Google Patents

ＴＣＲαホーミングエンドヌクレアーゼバリアント Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１６年１０月２８日出願の米国仮特許出願第６２／４１４，２６６号、および２０１６年１０月１１日出願の米国仮特許出願第６２／４０６，６８９号の利益を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿０７７＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは１１４ＫＢであり、２０１７年１０月１１日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本開示は、改良されたゲノム編集ポリペプチドおよび組成物に関する。より具体的には、本開示は、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子を編集するために有用であるヌクレアーゼバリアントおよび組成物に関する。
がんの世界的な負担は１９７５年～２０００年の間に２倍となった。がんは、世界中の疾病率および死亡率の２番目に高い要因であり、２０１２年において新たな症例はおよそ１４１０万件、がん関連死は８２０万件となっている。最もよく見られるがんは、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たながん症例件数は、今後２０年以内で２２００万件に上昇すると予想される。
免疫系は、ヒトがんの検出および撲滅において主要な役割を有する。形質転換細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原特異的Ｔ細胞の活性化を通して破壊される。したがって、がんは、免疫学的障害、すなわち、この疾患を恒久的に抑制および排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。がんをより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発されたある特定の免疫療法介入は、Ｔ細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。
より最近では、Ｔ細胞の単離、修飾、増殖、および再注入に基づく養子細胞免疫療法戦略が探索されており、初期段階の臨床試験で試験されている。Ｔ細胞はしばしば、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構に起因して、がん免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、Ｔ細胞ベースのがん免疫療法の未だ理解されていない可能性を強調している。
故に、種々の形態のがんおよび他の免疫障害を治療するための、より有効で、標的化され、より安全、かつ持続的な療法が必要とされている。その上、高い効率性をもって内在性ＴＣＲ遺伝子を正確かつ再現可能に破壊し得る方法および組成物が必要とされている。ほとんどのがんに対する今日の標準治療は、これらの基準のいくつかまたは全てを満たしていない。
本開示は一般的に、一部分において、ヒトＴＣＲα遺伝子のエクソン１にある標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントおよびｍｅｇａＴＡＬ、ＨＥバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含有する組成物、ならびにこれらを用いる方法に関する。
種々の実施形態において、本開示は、一部分において、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断するＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを企図し、ここで、このバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む。
様々な実施形態において、本開示は、一部分において、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断するＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドであって、このバリアントは、配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む。
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠失している。
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠失している。
さらなる実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠失している。
幾つかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠失している。
さらなる実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠失している。
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠失している。
特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントは、配列番号７～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列に結合する。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
さらなる実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群より選択される。
さらなる実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１０．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１２．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１３．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１４．５個のＴＡＬＥ反復単位、または約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
幾つかの実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１９に示されるポリヌクレオチド配列に結合する。
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１０．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列に結合する。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０に示されるポリヌクレオチド配列に結合し、かつこれを切断する。
特定の実施形態において、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個の亜鉛フィンガーモチーフを含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
幾つかの実施形態において、エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
さらなる実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
種々の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
特定の実施形態において、本開示は、一部分において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを企図する。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号１６～１９のいずれか１つに示される配列を含む。
幾つかの実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡが提供される。
ある実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドを含む細胞が提供される。
さらなる実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。
さらなる実施形態において、本明細書において企図されるベクターを含む細胞が提供される。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドにより編集された細胞が提供される。
特定の実施形態において、細胞は造血細胞である。
幾つかの実施形態において、細胞はＴ細胞である。
ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。
特定の実施形態において、細胞は免疫エフェクター細胞である。
さらなる実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
特定の実施形態において、細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断するＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドであって、前記バリアントは、配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む、ポリペプチド。
（項目２）
ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断するＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドであって、前記バリアントは、配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む、ポリペプチド。
（項目３）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠失している、項目１または項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠失している、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠失している、項目３に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠失している、項目１または項目２に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠失している、項目６に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記生物学的に活性な断片は、対応する野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠失している、項目６に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントは、配列番号７～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記ＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記ポリペプチドは、配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目１～１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１３）
ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、項目１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群より選択される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１０．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１２．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１３．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１４．５個のＴＡＬＥ反復単位、または約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１９に示されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目１４または項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１０．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列に結合する、項目１４または項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記ポリペプチドは、配列番号２０に示されるポリヌクレオチド配列に結合し、かつそれを切断する、項目１４～１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個の亜鉛フィンガーモチーフを含む、項目１４に記載のポリペプチド。
（項目２０）
ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、項目１～１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２１）
ウイルス自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、項目１～２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、項目２０または項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、項目２０～２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記ポリペプチドは、配列番号１０～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目１～２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記ポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
前記ポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２８）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目２９）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ。
（項目３０）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
（項目３１）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目３２）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
（項目３３）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
（項目３４）
項目２７に記載のベクターを含む細胞。
（項目３５）
項目１～２７のいずれか１項に記載のポリペプチドにより編集された細胞。
（項目３６）
前記細胞は造血細胞である、項目３２～３５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３７）
前記細胞はＴ細胞である、項目３２～３６のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３８）
前記細胞はＣＤ３ ＋ 、ＣＤ４ ＋ 、および／またはＣＤ８ ＋ 細胞である、項目３２～３７のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３９）
前記細胞は免疫エフェクター細胞である、項目３２～３８のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４０）
前記細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、項目３２～３９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４１）
前記細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、項目３２～３９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４２）
前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、項目３２～４１のいずれか１項に記載の細胞。
ＴＣＲα遺伝子定常領域のエクソン１における標的部位に対して設計されたＩ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントについてのオンおよびオフターゲット部位（配列番号１７および２１）の比較を示す。 「ＣＣＧ」トリヌクレオチド配列（配列番号１７および６７）について高い選択性のあるモジュラ―ＨＥバリアントから得られた一連のアミノ酸を第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアント（配列番号６）にグラフトして、第二世代ＴＣＲα ＨＥバリアント（ＴＣＲα２．０）を作製するための戦略図を示す。ＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントは、所望の基質位置において「ＣＣＧ」について高い選択性を保持する。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 基質位置ｐ４５６における第一世代ＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．０ ＨＥバリアントについての増強された選択性プロファイルを示す。パネル（Ａ）は、６４個の可能なヌクレオチド組み合わせについての酵母表面ディスプレイ切断プロットを示し、パネル（Ｂ）は、これらの活性のヒートマップを示す。 ＣＤ３表面発現を読み出しとして用いるＴＣＲα遺伝子座における遺伝子編集効率の代表的データを示す。第一世代ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（Ａ）（配列番号６）は、ＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号７）で処理されたＴ細胞と比較して、ヒト初代Ｔ細胞における増大した遺伝子編集効率を示す。 ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬ（Ｃ）（配列番号８）を作製するためのＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬ（Ｂ）における標的化された変異（Ｅ１７８Ｄ）の導入が、ＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬのオンターゲット選択性を保持しながら、第一世代ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ（Ａ）のオンターゲット切断活性を修復することを示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 生物情報学的に導き出された推定上のオフターゲット部位を用いる酵母表面ディスプレイプロファイリングによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 ｍｅｇａＴＡＬ処理初代Ｔ細胞のゲノムＤＮＡから作製されたアンプリコンのディープシーケンスによるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬの増大された選択性を示す。 ＴＡＬＥ反復を１０．５個から１１．５個へ増大させるためのさらなるＴＡＬＥ ＲＶＤのＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬへの付加（Ａ）は、初代Ｔ細胞におけるＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬのオンターゲット活性（配列番号６８および６９）をさらに増大させる（Ｂ）ことを示す。 異なるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓファミリーメンバーに由来する合理的に設計された最小限のＮ末端ＴＡＬドメインの付加は、Ｘ．ｏｒｙｚａｅ Ｎ末端ＴＡＬドメインを含有する第一世代ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬと比較して、同様の、または幾つかの場合においては控えめの、活性増大を生じることを示す。
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥのアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号４は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号５は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するようにリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するようにリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号８は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するようにリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号１４は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号１５は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号１６は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位に結合し、かつこれを切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号１７は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にあるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント標的部位である。
配列番号１８は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある１０．５個のＲＶＤ ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
配列番号１９は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある１１．５個のＲＶＤ ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
配列番号２０は、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にあるｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
配列番号２１は、配列番号１７を標的とするＴＣＲαヌクレアーゼに関するヒトＫＡＴ２Ｂ遺伝子におけるオフターゲット部位である。
配列番号２２～２４は、ＮＴＤバリアントｍｅｇａＴＡＬをコードするアミノ酸配列である。
配列番号２５～２７は、ＮＴＤバリアントｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号２８は、マウスＴｒｅｘ２をコードするアミノ酸配列である。
配列番号２９は、マウスＴｒｅｘ２をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３０～４０は、種々のリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１～６５は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
前述の配列において、Ｘは、存在する場合には任意のアミノ酸を指し、またはアミノ酸の不在を指す。
Ａ．概説
本開示は一般的に、一部分において、改良されたゲノム編集組成物およびその使用方法に関する。ゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、既存の細胞ベースの免疫療法と比較して、望ましくない自己免疫応答の減少した危険性に起因する改良された安全性、より予測可能な治療用遺伝子発現による正確に標的を定められた療法、腫瘍微小環境における増加した持続性、および増加した有効性を含むがこれらに限定されない、多数の利点を提示する。任意の特定の理論に拘束されることを望まないが、種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、改良された安全性ならびに増大された標的部位特異性、選択性、および触媒活性のために遺伝子操作された、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼおよびｍｅｇａＴＡＬを含む。
特定の実施形態において、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子の修飾は、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を破壊するもしくは実質的に破壊する、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を減少させ、かつ／またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の１つ以上の機能を損なう、実質的に損なう、もしくは破壊するか、またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）を機能不全にする。特定の実施形態において、ＴＣＲα機能には、細胞表面へのＣＤ３の動員、抗原のＭＨＣ依存性認識および結合、ＴＣＲαβシグナル伝達の活性化が含まれるが、これらに限定されない。
種々の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位に結合し、かつそれを切断するように設計された、ヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖切断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって、修復され得る。ある特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを用いて修復され得る、１本鎖ＤＮＡ切断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対して相同性を有する配列が両側に位置する、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。
好ましい一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを標的化するＴＣＲα遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子を標的化する既存のホーミングエンドヌクレアーゼまたはｍｅｇａＴＡＬと比較して、標的部位に対して増大された結合部位選択性または特異性を有する。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを標的化するＴＣＲα遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子を標的化する既存のホーミングエンドヌクレアーゼまたはｍｅｇａＴＡＬと比較して、高い触媒活性を保持しながら、標的部位に対して改良された結合部位選択性または特異性を有する。
好ましい一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２を含む。
特定の実施形態の実践は、特にそれとは反対の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｊｕｌｙ ２００８更新）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．、１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ およびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．、１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
Ｂ．定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書で使用される。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
「および／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
一実施形態において、範囲、例えば、１～５、約１～５、または約１～約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１～５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる」とは、「からなる」という句の後に続く全てのものを含み、かつこれらに限定されることを意味する。故に、「からなる」という句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素は存在しないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。故に、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通した種々の箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件を最小限に変化させた生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は一般的に、生物内で行われる活動を指す。一実施形態において、細胞のゲノムは、インビボで遺伝子操作、編集、または修飾される。
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより高い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、遺伝子操作されたＴＣＲもしくはＣＡＲ発現の増加、ＨＲもしくはＨＤＲ効率の増加、結合部位選択性の増加、結合部位特異性の増大、オンターゲット結合の増加、免疫エフェクター細胞増殖、活性化、持続性の増加、および／またはがん細胞死殺傷能力の増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生み出される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）である増加を含み得る。
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより低い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、内在性ＴＣＲ発現または機能の減少、オフターゲット結合の減少、免疫エフェクター細胞疲弊に関連するバイオマーカーの発現の減少などが含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生み出される応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）である減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に同様のまたは同等の生理的応答（すなわち、下流作用）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。同等の応答は、参照応答と有意に異なるまたは測定可能な異なる（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）ことはないものである。
「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での、１つの分子の別の分子への結合、例えば、ＤＮＡに対するポリペプチド結合のＤＮＡ結合ドメイン、を説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０５Ｍ－１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）を伴って標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、１０１２Ｍ－１、または１０１３Ｍ－１以上のＫａを伴って標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインとは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、少なくとも１０１３Ｍ－１、またはそれ以上のＫａを伴う結合ドメインを指す。
代替的に、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、またはそれ未満）として定義されてもよい。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位についての１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表面ディスプレイを用いるか、または結合会合もしくは標識リガンドを用いる置換アッセイにより、容易に測定することができる。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高い、バックグラウンド結合よりも約５倍高い、バックグラウンド結合よりも約１０倍高い、バックグラウンド結合よりも約２０倍高い、バックグラウンド結合よりも約５０倍高い、バックグラウンド結合よりも約１００倍高い、もしくはバックグラウンド結合よりも約１０００倍高い、またはそれを超える。
「選択的に結合する」、または「選択的に結合した」、または「選択的に結合している」、または「選択的に標的化する」という用語は、複数のオフターゲット分子の存在下における標的分子に対する１つの分子の優先的な結合（オンターゲット結合）を説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬがオフターゲットＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍も高い頻度で、オンターゲットＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。
「オンターゲット」は、標的部位配列を指す。
「オフターゲット」は、標的部位配列に類似するが、同一ではない配列を指す。
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合するおよび／または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。標的部位または標的配列のただ１つのみの鎖を指すポリヌクレオチド配列または配列番号を参照する場合、ヌクレアーゼバリアントにより結合および／または切断された標的部位または標的配列は、２本鎖であり、かつ、その参照配列およびその相補配列を含むことが理解されるだろう。好ましい一実施形態では、標的部位は、ヒトＴＣＲα遺伝子の配列である。
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに、調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かに関わらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子は、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調整配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、レプリコンオリジン、マトリックス連結部位、ならびに遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体または染色体外付加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノム内の特定の部位に標的化されても標的化されなくてもよい。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的ではない。
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を修復、補正、崩壊、および／または修飾する、細胞のゲノムの標的部位における遺伝性物質の置換、削除、および／または導入を指す。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位またはその近傍においてＤＮＡ損傷を生成するために、任意選択でドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のヌクレアーゼバリアントを細胞に導入することを含む。
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、臨床結果を含む有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するために十分な、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「有効量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
「予防上有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために十分な、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必然的ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力等の因子に応じて異なり得る。治療上有効量はまた、治療上有益な効果が任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。治療的量が指示されるとき、特定の実施形態で企図される組成物の、投与されるべき正確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、重量、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個体差を考慮して決定され得る。
Ｃ．ヌクレアーゼバリアント
本明細書の特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、ＴＣＲα遺伝子における標的部位をゲノム編集するのに好適であり、また、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）、ならびに任意選択で、本明細書で企図される１つ以上のリンカーを含む。「リプログラミングされたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は互換的に使用され、これらは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ここで、このヌクレアーゼは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある二本鎖ＤＮＡ標的配列に結合し、かつこれを切断するように、親または自然発生ヌクレアーゼから設計および／または修飾される。
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的配列、好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７、より好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７の「ＡＴＴＣ」配列に結合し、かつそれを切断する。
ヌクレアーゼバリアントは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前のヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
ＴＣＲα遺伝子における標的配列に結合し、かつそれを切断するヌクレアーゼバリアントの例示的な例は、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含むが、これらに限定されない。
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＴＣＲα遺伝子における標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するためにリプログラミングされる。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１、好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７、より好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７の「ＡＴＴＣ」配列に二本鎖切断を導入する。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、互換的に使用され、１２～４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス、およびＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたは天然に見出されるホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基底活性を増大するように修飾された野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
「遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「リプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ」、「リプログラミングされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ここで、このホーミングエンドヌクレアーゼは、ＴＣＲα遺伝子におけるＤＮＡ標的配列に結合し、かつこれを切断するように親または自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、配列番号６と比較して、標的部位に対する増大された選択性を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば、配列番号６と比較して、触媒活性を保持しながら、標的部位に対する増大された選択性を含む。
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、自然発生ＨＥまたはＨＥバリアントにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を作製することによって、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素とともに、Ｔ細胞に導入され得る。ＨＥバリアントおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖－側鎖間および側鎖－ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。故に、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の自然またはＨＥバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、自然ＨＥ（または以前に作製されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされてもよい。ライブラリは、切断アッセイを用いて、各々予測されるＴＣＲα標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒｒａｄｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１－６８８０を参照されたい）。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖１つあたり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または１本鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みによって特徴付けられる、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的および特異的な切断は、新規の高度に特異的かつ選択的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場となる。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。
ＬＨＥの例示的な例としては、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、リプログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号７～８を参照されたい。
一実施形態において、ＴＣＲα遺伝子を標的とするリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、天然Ｉ－ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性な断片（配列番号１～５）から作製される。好ましい実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とするリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから作製された。
一実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子に結合し、かつこれを切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号７または配列番号８に示されるようなＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントおよびその生物学的に活性な断片のＤＮＡ認識インターフェースを伴って、少なくとも９９％の配列同一性を含む。
特定の一実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子に結合し、かつこれを切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号７または配列番号８に示されるようなＩ－ＯｎｕＩ、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースにおいて、１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＣＲαエクソン１定常領域標的部位を切断し、かつ配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む。
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＣＲαエクソン１定常領域標的部位を切断し、かつ配列番号１～５のいずれか１つ、またはその生物学的に活性な断片の、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｇ７３Ｓ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｓ１７６Ａ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｔ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｓ２０１Ａ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｒ、Ｓ２３３Ｒ、Ｄ２３６Ｅ、およびＶ２３８Ｅを含む。
特定の実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子に結合し、かつこれを切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号７または配列番号８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号７～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
特定の実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
２．ｍｅｇａＴＡＬ
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するためにリプログラミングされる。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１、好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７、より好ましくは、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にある配列番号１７における「ＡＴＴＣ」配列においてＤＳＢを導入する。「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＣＲα遺伝子におけるＤＮＡ標的配列に結合し、かつそれを切断するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意選択で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素とともに、細胞に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物のトランスクリプトームを操作するための植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ－エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、新たに（ｄｅ ｎｏｖｏ）遺伝子操作されるか、または自然発生ＴＡＬＥから、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅに由来のＡｖｒＢｓ３、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍに由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から、遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導し、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、および同特許で引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に３３～３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的に反復の１２位および／または１３位に、反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態においては、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。
特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊［（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する］が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例としては、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに挙げられ、同特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５～１５個の反復単位、より好ましくは７～１５個の反復単位、より好ましくは９～１５個の反復単位、およびより好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一の切頭型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸－２０～－１）とを含む。故に、特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５～３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは７．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは９．５～１５．５個の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドと、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むＴＡＬエフェクター構造を含む。幾つかの実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種に由来する。他の実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインの１つ以上は、異なる種に由来する。
本明細書で使用されるとき、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個～少なくとも１４０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１～＋１２２から少なくとも約＋１～＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１～＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも２０～少なくとも８５またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５アミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、標的配列に結合し、それを切断するようにリプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意選択で、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意選択で互いに接合されたＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、任意選択でＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬはリンカーポリペプチドに融合され、これがホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されることが、企図される。故に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性、選択性、および効率を増加させる。
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、リプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約４、５、または６ヌクレオチド、好ましくは、５または６ヌクレオチド以内上流のヌクレオチド配列に結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント（配列番号１７）により結合され、かつそれにより切断されるヌクレオチド配列の６ヌクレオチド上流である、配列番号１８で示されるヌクレオチドに結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号１８である。
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント（配列番号１７）により結合され、かつそれにより切断されるヌクレオチド配列の５ヌクレオチド上流である、配列番号１９で示されるヌクレオチドに結合する、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号１９である。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸～１３７個のアミノ酸のＮＴＤ、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５個の結合反復単位、約２０個のアミノ酸～約８５個のアミノ酸のＣＴＤ、およびＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。特定の実施形態において、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤの任意の１個、２個、または全ては、任意の適切な組み合わせで、同一の種または異なる種から設計することができる。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１０～１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態において、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１７または配列番号２０に示されるヌクレオチド配列に結合し、かつそれを切断する、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。
３．エンドプロセシング酵素
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントとエンドプロセシング酵素の１つ以上のコピーとを用いる細胞のゲノム編集を含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、２Ａ配列により、またはＩＲＥＳ配列により分離される、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、エンドプロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、自己切断型ペプチドにより分離されるエンドプロセシング酵素のタンデムコピーに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントエンドプロセシング酵素単一ポリペプチド融合物をコードするポリヌクレオチドを含む。
「エンドプロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の露出末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖ハイブリッド、および合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含む）であり得る。エンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加することにより、１つ以上のヌクレオチドを除去することにより、リン酸基を除去もしくは修飾することにより、および／または水酸基を除去もしくは修飾することにより、露出したポリヌクレオチド鎖末端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位における末端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、ファインゲージニードルに通過させること、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリングおよび噴霧により）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤により生成された末端を修飾し得る。
特定の実施形態において、特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬとＤＮＡエンドプロセシング酵素を用いる細胞のゲノム編集を含む。
「ＤＮＡエンドプロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの露出末端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、平滑末端または付着末端（５’もしくは３’突出部分を伴う末端）を修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位における末端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、ファインゲージニードルに通過させること、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリングおよび噴霧により）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤により生成された末端を修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加することにより、１つ以上のヌクレオチドを除去することにより、リン酸基を除去もしくは修飾することにより、および／または水酸基を除去もしくは修飾することにより、露出したＤＮＡ末端を修飾し得る。
本明細書において企図される特定の実施形態における使用に適するＤＮＡエンドプロセシング酵素の例示的な例は、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
本明細書において企図される特定の実施形態における使用に適するＤＮＡエンドプロセシング酵素のさらなる例示的な例は、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメインを伴わないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エキソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルスインテグレーションタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、アンタークティックホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、およびＵＬ－１２を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書において企図される細胞のゲノムを編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、３’もしくは５’末端のいずれかにおけるホスホジエステル結合を破壊する加水分解反応により、ポリヌクレオチド鎖の末端におけるホスホジエステル結合を切断する酵素またはドメインを指す。
本明細書において企図される特定の実施形態における使用に適するエキソヌクレアーゼの例示的な例は、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、およびラットＴＲＥＸ１を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、３’－５’エキソヌクレアーゼ、好ましくは、Ｔｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくは、Ｔｒｅｘ２、さらにより好ましくは、ヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。
Ｄ．ポリペプチド
種々のポリペプチドが本明細書において企図され、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１～１２および２２～２４に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換えおよび／または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然または非天然の両方の、当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
本明細書で使用される「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」および同様の用語は、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からのインビトロ合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と有意に会合していない。
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそのバリアントを含むが、これらに限定されない。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において天然ポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、天然であり得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成によって生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドへの１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を導入することによってヒトＴＣＲα遺伝子の標的部位に結合し、かつそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドには、本明細書で企図される任意の参照配列に対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントが、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なリペプチド断片の例示的な例は、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどを含む。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の天然に存在するポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態では、生物学的活性は、標的配列についての結合活性および／または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約１７００アミノ酸長さのアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書において示されるポリペプチドは、「Ｘ」として示される１つ以上のアミノ酸を含み、アミノ酸配列番号において「Ｘ」が存在する場合には、任意のアミノ酸を指す。１つ以上の「Ｘ」残基は、本明細書において企図される特定の配列番号において示されるアミノ酸配列のＮ－およびＣ－残基に存在してもよい。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号において示される残りのアミノ酸配列は生物学的に活性な断片とみなされ得る。
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、例えば、配列番号６～７、またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１０～１２）の生物学的に活性な断片を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端せん断および／またはＣ末端せん断を含み得る。特定の一実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠失しているか、その削除を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸を欠失しているか、その削除を含む。特定の一実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠失しているか、その削除を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸を欠失しているか、その削除を含む。好ましい一実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸を欠失しているか、その削除を含む。
特定の一実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、または８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの削除を含み、および／または以下の１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの削除を含む。
特定の一実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、または８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの削除または置換を含み、および／または以下の１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの削除または置換を含む。
特定の一実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、または８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの削除を含み、および／または以下の１または２個のＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの削除を含む。
特定の一実施形態において、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、または８個の以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの削除または置換を含み、および／または以下の１または２個のＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの削除または置換を含む。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む様々な方法で変更することができる。かかる操作のための方法は、一般に当該技術分野で既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７）およびそれらで引用されている参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等の、またはさらに改良された、バリアントポリペプチドを作製するためポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましいとき、当業者は、例えば、表１に従って例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させ得る。
Figure 0007104710000001
アミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得る決定するためのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく行われ得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望である場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で開示されているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドが、提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のヌクレアーゼ、ならびに１つ以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドを含む。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント；リンカーまたは自己切断型ペプチド；ならびに５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼおよび３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むがこれらに限定されないエンドプロセシング酵素を含む。
融合ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含むことができ、これらは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン等、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的に、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限りは、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学結合によって産生することができるか、または一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
融合ポリペプチドは、任意選択で、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確保するのに十分な距離により、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子：（１）可撓性延長配座を採用する能力、（２）第１のおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できない能力、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含むとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的に、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１～２００アミノ酸長、１～１００アミノ酸長、または１～５０アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。
例示的なリンカーは、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマーＧ）ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ１－５Ｓ１－５）ｎ、式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５個の整数である；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号３０）；ＤＧＧＧＳ（配列番号３１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号３２）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号３３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ、式中、ｎ＝１、２、３、４または５である（配列番号３４）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３、１１５６－１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号３５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３６）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）ら、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号３７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号３８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号３９）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号４０）を含むが、これらに限定されない。代替として、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングし得るコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８、６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５、５８９－５９４を参照されたい）。代表的なプロテアーゼ切断部位としては、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号４１）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４２）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４３）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。
Figure 0007104710000002
Figure 0007104710000003
Ｅ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素をコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、また、組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００またはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用されるとき、「コドン最適化された」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増大するためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコードを置換することを指す。コドン最適化に影響する因子は、以下：（ｉ）２つ以上の生体もしくは遺伝子間のコドンバイアス、または合成的に構築されたバイアステーブルの変動、（ｉｉ）生体、遺伝子、または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度における変動、（ｉｉｉ）文脈を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）ｔＲＮＡをデコードすることによるコドンの変動、（ｖ）トリプレットの全体または一部のいずれかのＧＣ％によるコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば、自然発生配列に類似の程度における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的役割、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基づくＤＮＡ配列の機能についての以前の知識、（ｘ）各アミノ酸についてのコドンセットの系統的変動、および／または（ｘｉ）疑似翻訳開始部位の孤立除去、の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化した糖とのＮ－グリコシド結合における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、中性塩基、および当該分野において認識される種々の修飾塩基を含むことが理解される。かかる塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）では、糖は、デオキシリボースであり、すなわち、リボース中に存在する糖はヒドロキシル基を欠失している。例示的な天然の窒素塩基は、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）（またはＲＮＡの文脈においては、ウラシル（Ｕ））を含む。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。ヌクレオチドは通常、モノ、ジ－、またはトリリン酸エステルである。ヌクレオチドは、糖、リン酸、および／または塩基部分において非修飾であるか、または修飾されることができる（また互換的に、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、ＷＯ ９２／０７０６５およびＷＯ ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、２１８３－２１９６）により要約されている。
ヌクレオチドは、糖のＣ－５に結合したヒドロキシル基上に生じるエステル化を伴う、ヌクレオシドのリン酸エステルとしても見なされ得る。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、糖とのＮ－グリコシド結合における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、当該技術分野において、天然塩基を含むことが認識され、また、周知の修飾塩基を含むことも認識される。かかる塩基は一般的に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオシドは一般的に、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および／または塩基部分において非修飾であるか、または修飾されることができる（また互換的に、ヌクレオシドアナログ、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、および非標準ヌクレオシドとも称される）。上記したように、修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、２１８３－２１９６）により要約されている。
ポリヌクレオチドの例示的な例としては、配列番号１～１２および２２～２４をコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号１３～１６および２５～２７に示されるポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
種々の例示的実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書において企図されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ウイルスベクターおよび導入用プラスミド、を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列でハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドで実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加または欠失され、または修飾される、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の変更が、参照ポリヌクレオチドに行われ得、それによって、変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野で十分に理解される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％と同一するヌクレオチド配列がハイブリダイズのままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５°Ｃ低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。標的配列が、一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が、平衡状態で占有されている。
本明細書で使用される、「配列同一性」または、例えば、「配列５０％同一性」という記述は、比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。故に、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性の割合を得ることができる。典型的に、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５～１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドを比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０～約１００個、より一般的には約１００～約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のユニット１９．３に見出すことができる。
本明細書で使用される、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、天然で存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素を含むが、これらに限定されない、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、およびポリ（Ａ）テールを含む。
本明細書で使用されるとき、「５’キャップ」または「５’キャップ構造」または「５’キャップ部分」は、ｍＲＮＡの５’末端に取り込まれた化学的修飾を指す。５’キャップは、核外輸送、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’－末端転写センスヌクレオチドとの間の５’－ｐｐｐ－５’－トリホスフェート結合を含む５’キャップを含むことができる。次いで、この５’－グアニル化キャップはメチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル化残基を生成することができる。
本明細書において企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態における使用に適する５’キャップの例示的な例は、非メチル化５’キャップアナログ、例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；メチル化５’キャップアナログ、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ジメチル化５’キャップアナログ、例えば、ｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；トリメチル化５’キャップアナログ、例えば、ｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ジメチル化対称性５’キャップアナログ、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ａ；ならびに逆転写５’キャップアナログ、例えば、逆転写キャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップ、設計された３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびそれらのテトラホスフェート誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ、９：１１０８－１１２２（２００３）を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、トリホスフェート結合を介して最初に転写されたヌクレオチドの５’－末端に７－メチルグアニル化（「ｍ７Ｇ」）結合され、７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ［式中、Ｎはヌクレオシドである］を生じる、５’キャップを含む。
幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップがキャップ０構造（キャップ０構造は、塩基１および２に連結されたリボースの２’－Ｏ－メチル残基を欠失している）、キャップ１構造（キャップ１構造は、塩基２において２’－Ｏ－メチル残基を有する）、またはキャップ２構造（キャップ２構造は、塩基２および３の両方に連結された２’－Ｏ－メチル残基を有する）である、５’キャップを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群より選択された、グアノシン１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、および４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンからなる群より選択された１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プソイドシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドシチジン、および４－メトキシ－１－メチル－プソイドシチジンからなる群より選択された、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、および２－メトキシ－アデニンからなる群より選択された、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、およびＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群より選択された、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジン、１つ以上の５－メチル－シトシン、および／または１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジンを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シトシンを含む。
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するため、ｍＲＮＡを安定化するため、翻訳を促進するための補助のために、ポリ（Ａ）テールを含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは少なくとも約５００個の、もしくはそれを超えるアデニンヌクレオチドであるか、またはその間の任意の数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、もしくは２７５個の、もしくはそれを超えるアデニンヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さは、約１０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、もしくは約２５０～約３００個のアデニンヌクレオチド、またはその範囲内にある任意の数のアデニンヌクレオチドである。
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）および３’（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向で注記され得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、３’から５’の方向で書かれた５’から３’の配列または５’から３’の方向で書かれた３’から５’の配列を指す。
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補的鎖は、３’ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、左に５’末端および右に３’末端を有する逆相補鎖、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、入手可能な様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞中へ送達することにより発現させることができる。
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、および置き換え可能な要素、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの追加の例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルスおよび組込み欠損レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、前記ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。
特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
本明細書で使用される、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７～８３）ならびにＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８－６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販の脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２－９）、およびＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８－９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、およびＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号６６）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ、１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、およびＫｏｚａｋ、１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。
特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリ（Ａ）テールからコード配列の３’末端の付加によってｍＲＮＡの安定性を促進し、および故に、転写効率の増加に寄与し得る。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列により誘導される。哺乳動物プレ－ｍＲＮＡについてのコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識要素を有する。典型的には、大部分の非バリアントＡＡＵＡＡＡヘキサマーは、ＵまたはＧＵ残基リッチなより可変な要素の２０～５０ヌクレオチド上流に位置する。初期転写物の切断は、これらの２つの要素間で起こり、５’切断産物に対して最大２５０個のアデノシンの付加を伴う。特定の実施形態において、コアポリ（Ａ）配列は、合成ポリ（Ａ）配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。ポリ（Ａ）配列の例示的な例は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野において周知の別の適切な異種性もしくは内在性ポリ（Ａ）配列を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスおよびウイルス法の両方により、造血細胞、例えば、Ｔ細胞に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってまたは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される特定の実施形態での使用に好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；およびＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態で企図される。
Ｆ．細胞
特定の実施形態において企図される方法により製造されたゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα遺伝子中に１つ以上の遺伝子編集を含み、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの徴候を予防、治療、または緩和するための改良された細胞に基づく療法を提供する。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される方法によって製造されたゲノム編集された免疫エフェクター細胞が、インビボでの増加した改良された安全性、有効性、および持続性を含む優れた特性が染み込んでいると考えられる。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集された細胞は、自己移植／自家（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自己移植（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。本明細書で使用される、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される、「自家」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される、「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対照の細胞を指す。本明細書で使用される、「異種」は、相対的に細胞に異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、場合により、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外基質を実質的に含まない、非自然発生細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞等を指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞の集団」という用語は、本明細書の別の箇所に記載されているような、同種細胞または異種細胞型からなる任意の数および／または組み合わせから構成され得る複数の細胞を指す。例えば、Ｔ細胞の導入については、細胞の集団は、末梢血から単離または得ることができる。細胞の集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の編集されるべき標的細胞型を含む。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当該技術分野において周知の方法を用いて、異種細胞集団から、単離または精製することができる。
本明細書において企図される組成物および方法を用いて編集可能であるゲノムの細胞型の例示的な例は、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
好ましい一実施形態において、ゲノム編集組成物および方法を用いて、造血細胞、より好ましくは、免疫細胞、さらにより好ましくは、Ｔ細胞を編集する。
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、免疫エフェクター細胞、調節性Ｔ細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞は免疫エフェクター細胞である。一実施形態において、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、本明細書で企図される組成物および方法によって編集されるＴＣＲα対立遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態で企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
「強力なＴ細胞」、および「幼若Ｔ細胞」は、特定の実施形態において交換可能に使用され、Ｔ細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカー；ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、およびＬＡＧ３の発現を欠いている。
Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、多くの源から得られ得る。
特定の実施形態において、細胞の集団は、本明細書において企図されるＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。
特定の実施形態において、細胞の集団は、本明細書において企図されるＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントポリペプチドまたはｍｅｇａＴＡＬポリペプチドを含む、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。
特定の実施形態において、細胞の集団は、本明細書において企図されるＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬをコードするベクターを含む、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。
特定の実施形態において、細胞の集団は、本明細書において企図されるＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを含む、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。
Ｇ．組成物および製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、およびゲノム編集組成物、およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、単一の細胞または細胞の集団におけるヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態では、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、Ｔ細胞または免疫エフェクター細胞におけるＴＣＲα遺伝子を編集するために使用される。
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および場合により、エンドプロセシング酵素、例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、上記で開示されたポリヌクレオチド送達方法、例えば、電気穿孔法、脂質ナノ粒子等により細胞中に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および場合により、３’－５’エキソヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物は、上記で開示されたポリヌクレオチド送達方法により細胞中に導入される。組成物は、エラーを起こしやすいＮＨＥＪによりゲノム編集された細胞、またはゲノム編集された細胞の集団を作製するために使用され得る。
種々の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、トナー修復テンプレートを含む。組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および場合により、エンドプロセシング酵素を発現しているか、または発現することになる細胞へと送達され得る。一実施形態において、組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、またはｍｅｇａＴＡＬ、および場合により、３’－５’エキソヌクレアーゼを発現しているか、または発現することになる細胞へと送達され得る。ドナー修復テンプレートの存在下におけるゲノム編集酵素の発現は、ＨＤＲによりゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を作製するために使用することができる。
組成物としては、薬学的組成物が挙げられるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。必要に応じて、組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与することができることも理解されよう。組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加の薬剤が組成物に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に釣り合った他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適である、これらに組成物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で使用される。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療用細胞とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的に許容される担体の例示的な例は、無菌液体、例えば、細胞培養液、水であるか、および石油、動物、野菜、または合成起源の、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む油であり得る。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射用溶液のために使用することができる。特定の実施形態における適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。任意の従来の培地または剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分も組成物中に組み込むことができる。
一実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に適する。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与に適する。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、または髄腔内投与に適する。薬学的に許容される担体は、無菌水溶液、細胞培養液、または分散液を含む。薬学的に活性のある物質についてのかかる培地および剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の培地または剤が導入された細胞と適合しない場合を除き、医薬組成物中でのその使用が企図される。
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は一般的に、改変されたＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において企図される細胞に基づく組成物を含む組成物は、腸内もしくは非経口投与により別々に投与することができ、または所望の治療目的を成し遂げるために他の適切な化合物を組み合わせて投与することもできる。
薬学的に許容される担体は、治療するヒト対象への投与に適合性を付与するために、十分に高い純度、かつ十分に低い毒性のものである必要がある。さらに、組成物の安定性を維持または増大する必要がある。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、組成物の他の成分と組み合わされるとき、念頭にある計画された投与法に伴って、所望の容積、濃度等を提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）であり得るが、これらに限定されない。本明細書において企図される組成物についての他の適切な薬学的に許容される担体は、水、食塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。
かかる担体溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の適当な添加剤を含み得る。本明細書で使用されるとき、「緩衝液」という用語は、その化学構成物が、有意なｐＨ変化を伴うことなく、酸または塩基を中和する、溶液または液体を指す。本明細書において企図される緩衝液の例は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、５％の水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常／生理的食塩水（０．９％のＮａＣｌ）を含むが、これらに限定されない。
薬学的に許容される担体は、組成物のｐＨを約７に維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、約６．８～約７．４、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４の範囲のｐＨを有する。さらなる別の実施形態に置いて、組成物は約７．４のｐＨを有する。
本明細書において企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地であり得る。組成物は懸濁液であり得る。本明細書で使用されるとき、「懸濁液」という用語は、細胞が固形支持体に結合されていない、非接着状態を指す。例えば、懸濁液として維持された細胞、攪拌または激しく攪拌されてもよく、培養ディッシュなどの支持体に接着されない。
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、懸濁液中に配合され、ここで、ゲノム編集されたＴ細胞は、許容される液体培地または溶液、例えば、生理食塩水または無血清培地、点滴用（ＩＶ）袋などの中に分散される。許容される希釈剤は、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、Ｒｉｎｇｅｒ溶液、等張塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、無血清細胞培養液、および低温貯蔵に適する培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地を含むが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集されたＴ細胞の集団を含む組成物を貯蔵するのに適する。治療用組成物は、ヒト患者に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、および胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
幾つかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与のために好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、簡易化およびより良好な定義された組成物、低減された度合いの汚染物質、感染剤の潜在源の除外、およびより低い費用を含む、血清含有培地にわたっていくらかの利点を有する。種々の実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択で、タンパク質を含み得ない。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換え、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
特定の組成物中に使用された無血清培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい一実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で製剤化される。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後に、高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中に使用された凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物汚染を実質的に含まない。エンドトキシンに関して「実質的に含まない」とは、細胞の用量あたりのエンドトキシンが、１日あたり５ＥＵ／ｋｇ体重の総エンドトキシンであり、平均的な７０ｋｇのヒトについては細胞の総用量あたり３５０ＥＵである、生物学的薬剤についてＦＤＡにより認められているもの未満であることを意味する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレトロウイルスベクターを用いて導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ～約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤は、１つ以上のリプログラミングされたヌクレアーゼ、および場合によりエンドプロセシング酵素をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含むことが企図されるが、これらに限定されない。
生体外送達のための例示的な製剤は、当該技術分野において周知の種々のトランスフェクション剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔法、熱ショック、および種々のリポソーム配合物（すなわち、脂質介在トランスフェクション）も含んでもよい。下記でより詳細に説明されるリポソームは、水性液体画分を封じ込める脂質二重層である。ＤＮＡは（その電荷のために）カチオン性リポソームの外側表面と自発的に会合し、これらのリポソームは細胞膜と相互作用し得る。
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、心室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および製剤を含む、種々の治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な用量および治療レジメンの開発も同様に周知である。本明細書において企図される特定の実施形態が他の製剤、例えば、薬学分野において周知であるもの、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、ｖｏｌｕｍｅ Ｉおよびｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載されているものを含み得ることは当業者に理解され、これらの文献は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本明細書において引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変され得る種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
実施例１
ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とするＩ－ＯＮＵＩバリアントの選択性の改良
準最適（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）選択性の領域を、ヒトＴＣＲα遺伝子の定常領域におけるエクソン１を標的とするＩ－ＯｎｕＩバリアント（配列番号６）（「オリジナルＴＣＲα Ｉ－ＯｎｕＩバリアント」）のＤＮＡ認識インターフェース領域において同定した。標的部位におけるｐ４、ｐ５、およびｐ６位は、塩基対置換に対して相対的に耐性があることが見出された。これらの位置において、ＴＣＲαオンターゲット部位（ｐ４５６におけるＣＣＧ）（配列番号１７）およびＫＡＴ２Ｂ遺伝子のイントロンにおける頻繁なオフターゲット部位（ｐ４５６におけるＡＣＡ、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５を参照されたい）（図１、配列番号２１）におけるヌクレオチドは異なる。これらの位置で増強された選択性を伴うドメインを含むＩ－ＯｎｕＩバリアントを開発して、全体的な選択特性を改良し、ＫＡＴ２Ｂオフターゲット部位（配列番号２１）における活性を特異的に低下させた。
自身の天然の標的部位に複合化した野生型Ｉ－ＯｎｕＩタンパク質（例えば、配列番号１～５）の結晶構造を検査することにより、ｐ４５６位に接触するか、それに近接する可能性のある８つのアミノ酸残基のサブセットを同定した。ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とする別のＩ－ＯｎｕＩバリアントを局所分析することにより、オリジナルＴＣＲα標的化Ｉ－ＯｎｕＩバリアントと比較してＣＣＧに対して有意により大きな選択性を有するアミノ酸を同定した。ＴＣＲα標的化Ｉ－ＯｎｕＩバリアントにおける高いＣＣＧトリプレット選択性に関与するアミノ酸を、オリジナルＴＣＲα Ｉ－ＯｎｕＩバリアント中に挿入し、ＴＣＲα２．０ Ｉ－ＯｎｕＩバリアント（配列番号７）を作製した（図２）。酵母表面ディスプレイを用いて、ｐ４５６基質位置における全６４個のヌクレオチドの組み合わせに対して、ＴＣＲα２．０ Ｉ－ＯｎｕＩバリアント酵素活性を評価した（図３）。ＴＣＲα２．０ Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、有意により良好な基質識別性を示し、オリジナルＴＣＲα Ｉ－ＯｎｕＩバリアントよりもはるかに少数の基質を切断することを示した。
実施例２
ＴＣＲα ２．０ ＭＥＧＡＴＡＬの触媒活性の改良
ＴＣＲα遺伝子座の分断は、細胞表面に対するＣＤ３の輸送を防止する。ＣＤ３発現は、蛍光標識された抗ＣＤ３抗体およびフローサイトメトリーを用いて、測定することができる。遺伝子編集効率は、ＣＤ３蛍光に対して反比例する。
初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ３およびＣＤ２８を用いて活性化し、ｍｅｇａＴＡＬとしてフォーマットされたオリジナルＴＣＲα ＨＥバリアント（例えば、配列番号１３）またはｍｅｇａＴＡＬとしてフォーマットされたＴＣＲα２．０ ＨＥバリアント（例えば、配列番号１４）のいずれかをコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。ｐ４５６基質位置において有意に増強された選択性を示すにも関わらず、ＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬは、オリジナルＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬと比較して増大したＣＤ３発現により示される、触媒活性の低下を示す（図４）。続いて、ゲノムＤＮＡをｍｅｇａＴＡＬ処理細胞から単離し、標的部位における分解によるインデルのトラッキング（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）（ＴＩＤＥ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４を参照されたい）と組み合わせたＰＣＲを用いて、触媒活性の低下を確認した。
別のＩ－ＯｎｕＩバリアントにおける触媒活性を増大した単一のアミノ酸置換、Ｅ１７８Ｄを、ＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬの活性部位に挿入し、ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号８）を作製した。ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号１５）をコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡを、初代ヒトＴ細胞中に電気穿孔した。ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＣＲα２．０ ｍｅｇａＴＡＬと比較して、ＣＤ３ノックダウンを１０倍増大した。図５。
実施例３
ＴＣＲα２．１ Ｉ－ＯＮＵＩバリアントおよびＴＣＲα２．１ ＭＥＧＡＴＡＬは、増強されたオン対オフターゲット識別性を示す。
治療用ゲノム編集は、非常に低頻度のオフターゲット編集事象に起因するある程度の危険性を有する。ゲノム編集酵素は、既存の方法（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６を参照されたい）を用いて、オフターゲット編集事象について深く特徴付けることが可能である。
ＴＣＲα標的配列（配列番号１７）に類似する２２ｂｐ配列についてヒトゲノムをスキャンする生物情報学的アルゴリズムを用いて、潜在的なオフターゲット部位を同定した。生物情報学的探索から得られた上位７６４個の２２ｂｐ配列を、酵母表面ディスプレイを用いて、オリジナルＴＣＲα ＨＥバリアントおよびＴＣＲα２．１ ＨＥバリアントによる切断について個別に分析した。ＴＣＲα２．１ ＨＥバリアントは、オリジナルＴＣＲα ＨＥバリアントと比較して、ＴＣＲα標的配列について増大された選択性を示し（図６）、これは、実施例１において得られた結果と一致する。
７６４個の基質パネルから基質を切断した上位５０個の配列情報を用いて、第２の生物情報学的探索を実施して、探索にさらに情報を付与した。オリジナルＴＣＲαおよびＴＣＲα２．１ ＨＥバリアントによる切断について、これらを個別に分析した。精製されたＴＣＲα２．１ ＨＥバリアントは、オリジナルＴＣＲα ＨＥバリアントと比較して、増強された選択特性を示した。
組込み欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ、Ｇａｂｒｉｅｌ ２０１１を参照されたい）を用いる第２のアッセイを用いて、インビボで生成したさらなるオフターゲット部位を同定した。簡潔に言うと、酵素処理および疑似処理した細胞内の二本鎖切断の部位において、ＩＤＬＶを捕獲する。次いで、ＩＤＬＶ組込みの頻度および位置をマッピングし、２つの集団間で比較した。疑似処理した試料と比較して、酵素処理した試料における特定のゲノム部位におけるＩＤＬＶ取込み頻度の増大は、酵素的切断を示す。この方法を用いて、オリジナルＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬの初代オフターゲット部位は、ＫＡＴ２Ｂ遺伝子のイントロン６（配列番号２１、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）において同定された。
ｍｅｇａＴＡＬ処理されたドナー由来の初代Ｔ細胞から作製されたアンプリコンのディープシーケンスにより、同定された推定上のオフターゲット部位を評価した（図７）。ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬは、ＫＡＴ２Ｂ遺伝子座におけるオフターゲット編集を削除し、オリジナルＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬと比較して潜在的なオフターゲット部位における活性低下を伴うオンターゲットについての増強された選択性を示した。
実施例４
ＴＡＬ ＤＮＡ結合ドメインの延長は、ＴＣＲαゲノム編集を増大する。
ＭｅｇａＴＡＬは、所望の標的配列に対する結合親和性を増大するための、またはそれに対処する、メガヌクレアーゼ構造に対するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン融合を含む（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照されたい）。ＴＣＲα遺伝子座におけるオンターゲット編集効率をさらに増大させるために、さらなるＴＡＬＥ ＲＶＤを、Ｃ末端ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに付加して、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインアレイの合計長を１０．５個から１１．５個のＲＶＤ反復に増大させ、１１．５個のＲＶＤ ＴＣＲα ２．１ ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号１２）を作製した。１１．５個のＲＶＤ ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、オリジナルＴＡＬＥ結合部位（配列番号１８）および３’末端上のさらなるヌクレオチド（配列番号１９）を認識する。
１０．５個のＲＶＤおよび１１．５個のＲＶＤ ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡを用いて、ヒト初代Ｔ細胞を電気穿孔した。１１．５個のＲＶＤ ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬは、フローサイトメトリーを用いるＣＤ３ノックダウンにより測定したときに、１０．５個のＲＶＤ ＴＣＲα２．１ ｍｅｇａＴＡＬを用いるＴＣＲα編集と比較して、ＴＣＲα編集を３０～５０％増大した（図８）。
実施例５
バリアントＮ末端テール構造
ＭｅｇａＴＡＬは、Ｎ末端ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣ末端ドメインを含むＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）構造に融合したホーミングエンドヌクレアーゼを含む、ハイブリッドヌクレアーゼである。幾つかのＴＡＬＥ構造は、およそ１３６個のアミノ酸からなる最小限のＮ末端領域（「デルタ－１５４」）、可変数の３４個のアミノ酸ＲＶＤ含有反復（切頭型の２０個のアミノ酸反復で終了する）、およびおよそ６３個のアミノ酸からなる最小限のＣ末端領域を含む。
前述の実施例において記載されたホーミングエンドヌクレアーゼに融合されたＴＡＬＥ構造は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＬＥタンパク質に由来する配列を含む。Ｘ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＬＥドメイン配列に加えて、最小限のＮ末端ＴＡＬＥドメイン（ＮＴＤ）領域は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉなどのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓファミリーの他のメンバーに由来し得る。Ｎ末端ＴＡＬＥドメインの複数の配列アライメントは、Ｘ．ＯｒｙｚａｅがＸ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓおよびＸ．ｃｉｔｒｉにそれぞれ８５％および８７％配列類似性を共有することを示した。ＴＡＬ活性が代替的なＮＴＤ種を用いてさらに増強可能であるかを評価するために、内在性Ｘ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓおよびＸ．ｃｉｔｒｉ配列における以下のアミノ酸：Ｖ１５２Ｇ、Ｄ１５３Ｋ、Ｄ１６５Ｅ、Ｅ１６６Ｋ、Ｉ１６７Ｌ、Ｐ１６９Ｌ、Ａ１７３Ｐ、Ｔ１７４Ｉ、Ｑ１８０Ｅ、Ｍ１８３Ｉ、Ｈ１９１Ｑ、Ｖ２０５Ｉ、Ｖ２０７Ａ、Ｉ２２４Ｖ、Ｖ２２７Ｉ、Ａ２３６Ｖ、Ｇ２４９Ｓ、Ｇ２５７Ｓ、Ｖ２７１Ｉ（例えば、配列番号２１）；Ｖ１５２Ｇ、Ｄ１５３Ｋ、Ｔ１７０Ｋ、Ｖ１７１Ａ、Ｖ１８３Ｉ、Ａ２００Ｐ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３９Ｖ、Ａ２４４Ｖ、Ｅ２４５Ｑ、Ｇ２５７Ｓ、Ｌ２６０Ｖ、Ｖ２７１Ｉ、（例えば、配列番号２４）；Ｔ１７０Ｋ、Ａ２００Ｐ、Ｑ２３０Ｈ、Ｗ２３１Ｃ、Ｓ２３２Ｇ、Ａ２３６Ｔ、Ａ２３９Ｖ、Ａ２４４Ｖ、Ｅ２４５Ｑ、Ｇ２５７Ｓ（例えば、配列番号２３）を合理的に置換および組み合わせることにより、ハイブリッドＮＴＤを作製した。ハイブリッド配列（例えば、配列番号２２、２３、２４）は、Ｘ．Ｏｒｙｚａｅ Ｎ末端ＴＡＬドメインに対して８０％類似性を示した。これらの最小限のＴＡＬＥドメインの各々を個別に、オリジナルＴＣＲα Ｉ－ＯｎｕＩバリアントｍｅｇａＴＡＬのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端にグラフトした。ＴＡＬＥ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）バリアントまたはＸ．ｏｒｙｚａｅ ＮＴＤを含むバリアントｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロ転写されたｍＲＮＡを、ヒト初代Ｔ細胞に電気穿孔して、ＴＣＲα遺伝子座における編集率を評価した。ＣＤ３発現のフローサイトメトリー分析は、ＮＴＤバリアントドメインを含むＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬが、Ｘ．ｏｒｙｚａｅ ＮＴＤを含むオリジナルＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬに対して、同様の活性を示し、幾つかの場合においては、若干より高い活性を示すことを実証した（図９）。
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態への特許請求の範囲に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (10)

  1. Ｉ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断し、前記標的部位が、配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列であり、
    前記ポリペプチドは、１０．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含むか、または、前記ポリペプチドは、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１９に示されるポリヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含み、
    前記ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸残基１８０Ｈ、２０１Ａ、２２５Ｒ、および２３８Ｅを含む、ポリペプチド。
  2. Ｉ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、ヒトＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的部位を切断し、前記標的部位が、配列番号１７に示されるポリヌクレオチド配列であり、
    前記ポリペプチドは、１０．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１８に示されるポリヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含むか、または、前記ポリペプチドは、１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含み、かつ配列番号１９に示されるポリヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含み、
    前記ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸残基１７８Ｄ、１８０Ｈ、２０１Ａ、２２５Ｒ、および２３８Ｅを含む、ポリペプチド。
  3. 前記ポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記ポリペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
  5. （ａ）ペプチドリンカーおよび／またはウイルス自己切断型２Ａペプチド、ならびに
    （ｂ）３’－５’エキソヌクレアーゼ
    をさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  6. 前記３’－５’エキソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２である、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ。
  8. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  9. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
  10. 前記細胞は、造血細胞、Ｔ細胞、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞、免疫エフェクター細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞あるいはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項９に記載の細胞。
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BOISSEL S. et al.，Nucleic Acid Research，2014年，Vol.42 No.4，p.2591-2601

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