JP7051491B2

JP7051491B2 - 変異β－グルコシダーゼ

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Publication number: JP7051491B2
Application number: JP2018031809A
Authority: JP
Inventors: 大視掛下; 望柴田; 順一炭谷; 祐太朗馬場; 修治谷; 剛司川口
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Publication date: 2022-04-11
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Description

本発明は、変異β－グルコシダーゼに関する。

セルロースを含有するバイオマス材料（以下、「バイオマス」ということがある）中のセルロースから糖を製造し、それを発酵法などでエタノールをはじめとするエネルギーや化学品へ変換する技術が知られている。近年の環境問題への取り組みの観点から、バイオマスの工業的利用に関する様々な技術開発が進み、バイオマスを利用した燃料や化学品の大規模製造も実現化している。

バイオマスは、セルロース繊維と、それを取り巻く、キシランを主に含むヘミセルロース、及びリグニンとから構成されている。バイオマスを原料とした糖の製造では、セルロースやヘミセルロースの糖化効率を高めることが重要であり、そのためには、セルロースやヘミセルロースを加水分解するセルラーゼやヘミセルラーゼなどのバイオマス糖化酵素が必要となる。例えば、セルロースを効率よくグルコースへ分解するためには、少なくとも（1）結晶性及び非結晶性のセルロース繊維の末端からセロビオース単位で糖を切り出すセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）、（2）非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖に切れ目を入れるエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、及び（3）これらの酵素により生成したセロビオースを加水分解してグルコースを生成するβ－グルコシダーゼ（ＢＧＬ）の３種類のセルラーゼが協調して作用する必要がある。

バイオマスの糖化に使用されるセルラーゼを生産する菌として、トリコデルマ属（Trichoderma）微生物、例えば、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）やトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）が有名である。しかしながら、トリコデルマ属微生物由来のセルラーゼを用いたバイオマス糖化では、β－グルコシダーゼ活性が相対的に低いことが指摘されている（非特許文献１）。アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）のβ－グルコシダーゼをトリコデルマ属微生物で発現させ、トリコデルマ属微生物由来酵素のバイオマス糖化活性を高める技術が開発されている（例えば非特許文献１、特許文献１）。

バイオマスの酵素分解の際、バイオマス糖化酵素は基質であるセルロースやヘミセルロースに吸着する。こうしたバイオマス基質へのバイオマス糖化酵素の吸着は、生産的吸着と呼ばれる。一方、バイオマス糖化酵素は、該酵素に分解されない成分、例えばリグニン、灰分、その他成分などへも吸着し、これは非特異的吸着と呼ばれる。バイオマスを糖化酵素で糖化した後の残渣成分は主にリグニンであるため、リグニンへのバイオマス糖化酵素の非特異的吸着は、その酵素活性を低下させる原因となり得る。リグニンの存在がアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のβ－グルコシダーゼの活性を低下させたことが報告されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。

リグニン存在下での酵素活性が向上したバイオマス糖化酵素が報告されている。特許文献２には、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）等の微生物に由来するセロビオハイドロラーゼ（ＣＢＨ）IIにおいて、負電荷のアミノ酸への置換、正電荷のアミノ酸の除去等の改変により、非セルロース素材への吸着が低減したことが開示されている。特許文献３には、リグニンによる不活性化が低減したトリコデルマ・リーゼＦａｍｉｌｙ６セルラーゼの変異体が開示されている。特許文献４には、リンカーペプチドを改変してリグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたセルラーゼ変異体が開示されている。特許文献５には、リグニン存在下での活性が向上及び／又はリグニンとの結合を抑えたトリコデルマ・リーゼＣｅｌ６Ａの糖質結合モジュール（ＣＢＭ）の変異体が開示されている。

国際公開公報第２０１３／１１５３０５号特表２０１１－５２３８５４号公報国際公開公報第２０１０／０１２１０２号国際公開公報第２０１０／０９６９３１号国際公開公報第２０１１／０９７７１３号

森川康、バイオマス分解酵素研究の最前線、2012、シーエムシー出版、p10-19 J Biol Chem, 2013, 288(46):32991-33005 Analyst, 2009, 134(11):2267-2272 Biotechnol Prog, 2007, 23(2):398-406.

本発明は、より効率的にバイオマスを糖化することができるβ－グルコシダーゼ変異体を提供する。

本発明者らは、非特異的吸着性が低く、バイオマス糖化反応において高い活性を維持することができるβ－グルコシダーゼ変異体を見出した。

したがって、本発明は、下記（i）及び(ii)から選択される変異β－グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ－グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）該（i）のポリペプチドを含み、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド、
を提供する。

また本発明は、当該変異β－グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、当該ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、当該ポリヌクレオチド又はベクターを含む形質転換体を提供する。
また本発明は、当該変異β－グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤を提供する。
また本発明は、当該変異β－グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法を提供する。

さらに本発明は、変異β－グルコシダーゼの製造方法であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をアスパラギンに置換することを含む、方法を提供する。

本発明の変異β－グルコシダーゼは、非特異的吸着性が低く、バイオマス糖化反応で生じる糖化残渣存在下でも高い活性を維持することができる。したがって本発明の変異β－グルコシダーゼは、バイオマス糖化反応において高いβ－グルコシダーゼ活性を発揮する。本発明の変異β－グルコシダーゼを用いることにより、バイオマスの糖化効率を向上させることができる。

糖化残渣との反応後における変異β－グルコシダーゼの相対活性。白色バー：酵素濃度５．６μｇ／ｍＬ、黒色バー：酵素濃度５５．８μｇ／ｍＬ。

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列間の同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔｓｉｚｅｔｏｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関して記述する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．６％以上、さらに好ましくは９９．７％以上、さらに好ましくは９９．８％以上の同一性をいう。

本明細書において、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加に関する「１～複数個」とは、好ましくは１～１６０個、より好ましくは１～８０個、さらに好ましくは１～４０個、さらに好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個を意味する。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメントプログラム（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９４，２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌＷ２やＣｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａを使用することもできる。ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＣｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。

当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、そこの当該アミノ酸残基又はヌクレオチドは「相当する位置のアミノ酸残基」又は「相当する位置のヌクレオチド」と称される。

本明細書において、「β－グルコシダーゼ」（あるいは「ＢＧＬ」とも称する）とは、β－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドをいう。本明細書において、「β－グルコシダーゼ活性」とは、糖のβ－グリコシド結合を加水分解する活性をいい、好ましくは、セロビオースを加水分解してグルコースを生成する活性をいう。タンパク質のβ－グルコシダーゼ活性は、例えばｐＮＰ（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法により、４－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシドから酵素分解により遊離するｐＮＰの量を測定することによって決定することができる。β－グルコシダーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。

本明細書において、「バイオマス」とは、植物や藻類が生産するセルロースを含むセルロース系バイオマスをいう。バイオマスの具体例としては、カラマツやヌマスギ等の針葉樹や、アブラヤシ（幹部）、ヒノキ等の広葉樹などから得られる各種木材；ウッドチップなどの木材の加工物又は粉砕物；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎もしくは葉などの植物の茎、葉、果房など；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類；藻類、などからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、木材の加工物又は粉砕物、植物の茎、葉、果房などが好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスがさらに好ましい。該バイオマスは、単独で又は２種以上を混合して使用してもよい。また上記バイオマスは乾燥されていてもよい。

本明細書において、「糖化残渣」とは、バイオマス中のセルロース、ヘミセルロースを糖化酵素で糖化した後の残存固形分をいう。糖化残渣の成分としては例えばリグニンが挙げられる。酵素の「糖化残渣吸着性」の高さは、例えば、糖化残渣と酵素とを反応させて、該糖化残渣に酵素を吸着させた後、反応液の上清に残存する当該酵素の活性を測定し、該糖化残渣と反応させなかった場合の酵素活性に対する相対活性を求めることによって算出することができる。例えば、糖化残渣吸着率は以下の式で表すことができる。
糖化残渣吸着率（％）＝１００－相対活性（％）
相対活性（％）＝（糖化残渣との反応後の酵素試料の酵素活性／糖化残渣と未反応の酵素試料の酵素活性）×１００
上記相対活性がより低い酵素ほど、より高い糖化残渣吸着性を有する。糖化残渣としては、例えば、公知のセルラーゼもしくはセルラーゼ製剤（例えば、ノボザイムズ社製Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２）を用いてアルカリ混合粉砕バガスを２４時間５０℃で糖化した後の固形残渣、又はリグニンを用いることができる。糖化残渣と酵素との反応には、例えば、５０℃で１時間の処理を採用することができる。酵素の糖化残渣吸着性の測定のための具体的手順の例は、後述の実施例に詳述されている。

本発明は、変異β－グルコシダーゼを提供する。本発明の変異β－グルコシダーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するβ－グルコシダーゼを改変して、所定の位置のアミノ酸残基をアスパラギンに置換することによって製造することができる。本発明の変異β－グルコシダーゼは、当該置換前のβ－グルコシダーゼ（親β－グルコシダーゼ）と比べて、糖化残渣（例えばリグニン）吸着性（又は非特異的吸着性）が低く、糖化残渣存在下で酵素活性が低下しにくい。また本発明の変異β－グルコシダーゼは、親β－グルコシダーゼと比べて、バイオマスに対するβ－グルコシダーゼ活性が向上している。

したがって、一態様において、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列であって、配列番号１の７８７位、７９０位、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置にアスパラギンを有するアミノ酸配列を含み、かつβ－グルコシダーゼ活性を有する、変異β－グルコシダーゼを提供する。好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列である。

好ましい実施形態において、本発明の変異β－グルコシダーゼは、下記（i）及び(ii)から選択される：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ－グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）該（i）のポリペプチドを含み、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列である。

別の態様において、本発明は、変異β－グルコシダーゼの製造方法を提供する。該方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をアスパラギンに置換すること、を含む。
好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列である。

本発明の変異β－グルコシダーゼ又はその製造方法において、当該配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列の好ましい例としては、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列；配列番号４～６のいずれかで示されるアミノ酸配列；及び、配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された（ただし配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは９０％以上同一な）アミノ酸配列、が挙げられる。

本明細書においては、上記アミノ酸置換を行う前の、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有する（ただし配列番号１の７８７位、７９０位及び７９７位に相当する位置のアミノ酸残基がアスパラギンではない）アミノ酸配列を含むβ－グルコシダーゼを、本発明の変異グルコシダーゼの親β－グルコシダーゼ（又は、単に親β－グルコシダーゼもしくは親ＢＧＬ）ということがある。

当該親ＢＧＬの例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる、アスペルギルス・アクリータス（Aspergillus aculeatus）のβ－グルコシダーゼ１（本明細書においてＡａＢＧＬ１ともいう、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１０９６８．１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４８８２５．１）が挙げられる。

当該親ＢＧＬの別の例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドの例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアスペルギルス属由来ＢＧＬが挙げられ、好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列と８２．９％配列同一なアスペルギルス・ニガー（A. niger）ＣＢＳ５１３．８８由来ＢＧＬであるＡｎ１８ｇ０３５７０（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＰ＿００１３９８８１６．１）、及び配列番号１のアミノ酸配列と８２．５％配列同一なアスペルギルス・カワチ（A. kawachii又はA. awamori var. kawachi）ＮＢＲＣ４３０８由来ＢＧＬ（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１９９１３．１）が挙げられる。

当該親ＢＧＬのさらに別の例としては、上述したＡａＢＧＬ１、Ａｎ１８ｇ０３５７０、又はアスペルギルス・カワチ由来ＢＧＬ（配列番号１～３）の変異体が挙げられる。このような変異体としては、配列番号１～３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された（ただし配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは９０％以上同一な）アミノ酸配列からなるβ－グルコシダーゼが挙げられる。このような変異体は、天然に生じた変異体であってもよいが、人工的に作製されてもよい。

当該親ＢＧＬのさらに別の例としては、上述したＡａＢＧＬ１、Ａｎ１８ｇ０３５７０、アスペルギルス・カワチ由来ＢＧＬ（配列番号１～３）、又はそれらの変異体と分泌シグナル配列とが連結した、ＢＧＬプレタンパク質が挙げられる。該プレタンパク質の好ましい例としては、各々配列番号４～６で示されるアミノ酸配からなる、分泌シグナル配列を有するＡａＢＧＬ１、Ａｎ１８ｇ０３５７０及びアスペルギルス・カワチ由来ＢＧＬのプレタンパク質が挙げられる。該プレタンパク質の別の例としては、配列番号４～６のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された（ただし配列番号１と少なくとも８０％同一、好ましくは９０％以上同一な）アミノ酸配列からなるＢＧＬプレタンパク質が挙げられる。

好ましくは、上述した親ＢＧＬは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の７８７位に相当する位置にリシンを、７９０位に相当する位置にグルタミン酸を、及び７９７位に相当する位置にスレオニンを有する。

本発明の変異ＢＧＬは、例えば、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明の変異ＢＧＬは、当該変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。すなわち、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はこれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、当該形質転換体を適切な培地で培養し、導入したポリヌクレオチドを発現させることで、本発明の変異ＢＧＬが生産される。生産された変異ＢＧＬを該培養物から単離又は精製することにより、本発明の変異ＢＧＬを取得することができる。

したがって、本発明はさらに、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主に導入することを含む、形質転換体の製造方法を提供する。さらに本発明は、該ポリヌクレオチド又はベクターを含有する形質転換体を提供する。さらに本発明は、当該形質転換体を培養することを含む、変異ＢＧＬの製造方法を提供する。

本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドは、該変異ＢＧＬのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的又は化学的に合成することができる。例えば、本発明の変異キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドは、上述した親ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド（以下、親ＢＧＬ遺伝子ともいう）において、配列番号１の７８７位、７９０位及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を、アスパラギンをコードするヌクレオチド配列（コドン）へと変異させることによって、調製することができる。当該変異したポリヌクレオチドを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基がアスパラギンに置換された変異ＢＧＬを得ることができる。

親ＢＧＬ遺伝子の例としては、上述した配列番号１で示されるＡａＢＧＬ１をコードするポリヌクレオチド、配列番号２で示されるＡｎ１８ｇ０３５７０をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３で示されるアスペルギルス・カワチ由来ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらの分泌シグナル配列を有するプレタンパク質（配列番号４～６）をコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましい例としては、ＡａＢＧＬ１（配列番号１）又はそのプレタンパク質（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）が挙げられる。これらのポリヌクレオチドは、当該分野で用いられる任意の方法により取得することができる。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、アスペルギルス・アクリータスの全ゲノムＤＮＡを抽出した後、配列番号７の配列を元に設計したプライマーを用いたＰＣＲにより標的核酸を選択的に増幅し、増幅した核酸を精製することで得ることができる。

あるいは、親ＢＧＬ遺伝子の例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列からなる上述した親ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドの例としては、上述したＡａＢＧＬ１、Ａｎ１８ｇ０３５７０又はアスペルギルス・カワチ由来ＢＧＬ（配列番号１～３）の変異体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。親ＢＧＬ遺伝子は、天然に存在する遺伝子であってもよいが、配列番号１～３の配列に基づいて人工的に作製されてもよい。例えば、配列番号１～３のアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば配列番号７）に対して紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、得られた変異遺伝子がコードするポリペプチドのβ－グルコシダーゼ活性を調べる。所望の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を選択することによって、親ＢＧＬ遺伝子を得ることができる。必要に応じて、シークエンシング等により遺伝子配列を確認することができる。このような変異の手順は、当業者に周知である。

親ＢＧＬ遺伝子への目的の変異の導入は、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２－８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＩＩＳｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＭｕｌｔｉＳｉｔｅ－ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。あるいは、親ＢＧＬ遺伝子への部位特異的変異導入は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（ＨｏｒｔｏｎＲ．Ｍ．ｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１－６８）、メガプライマー法などの公知の手法により行うことができる。

例えば、親ＢＧＬ遺伝子への部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親ＢＧＬ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えてアスパラギンをコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し、選択することができる。

変異プライマーは、ホスホロアミダイト法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。また変異プライマーは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親ＢＧＬ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。

本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当該遺伝子をベクターに導入することによって作製することができる。当該ポリヌクレオチドを導入すべきベクターの種類としては、特に限定されず、タンパク質産生に通常用いられるベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましく、タンパク質の高発現を誘導するプラスミドベクターがより好ましい。当業者は、宿主細胞の種類にあわせて、好適なベクターを選択することができる。タンパク質発現用プラスミドベクターは、宿主に応じて作製してもよいが、市販品を使用してもよい。ベクターの例としては、酵母発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３－３８９）、ｐＭＡ９１（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６２：１６１５－１６１８）などが挙げられる。

当該ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域を含むＤＮＡ断片又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、当該ベクターにおいては、上記本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドに、プロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御領域が作動可能に連結されていてもよい。あるいは、当該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、本発明のベクターを導入する宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養をコードする遺伝子を含むベクターを用いてもよい。

当該制御領域の好適な例としては、Ｐ－Ｎｏ８１４２プロモーター（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３－３８９）、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）由来ｃｂｈ１プロモーター配列（ＣｕｒｒＧｅｎｅｔ，１９９５，２８（１）：７１－７９）などが挙げられる。あるいは、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、βキシロシダーゼなどの糖化酵素を発現するプロモーターを使用してもよい。あるいは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどの代謝経路の酵素のプロモーターを使用してもよい。

本発明の変異ＢＧＬをコードする配列と上記制御領域や、マーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ－ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。ベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御領域の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。

本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はこれを含むベクターを含有する形質転換体は、該ベクターを宿主へ導入するか、又は該ポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入すればよい。宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。

本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。該ＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め該ＤＮＡ断片と上述した制御領域とを作動可能に連結した断片を作製し、当該連結断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。

本明細書において、ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドと制御領域が「作動可能に連結されている」とは、該ポリヌクレオチドと制御領域が、該ポリヌクレオチドにコードされるＢＧＬが該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。

当該形質転換体の宿主の例としては、酵母、糸状菌、細菌などの微生物が挙げられる。酵母の例として、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Escherichia coli）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、リステリア属（Listeria）、バチルス属（Bacillus）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、ＪＢｉｏｓｃｉＢｉｏｅｎｇ，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＬｅｔｔ，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、リゾプス属（Rhizopus）などが挙げられ、このうち、酵素生産性の観点からはトリコデルマ属が好ましい。

斯くして得られた、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、当該ポリヌクレオチドが発現して、本発明の変異ＢＧＬが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて当業者が適宜選択することができる。

あるいは、本発明の変異ＢＧＬは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。

上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異ＢＧＬは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で変異ＢＧＬをコードするポリヌクレオチドと分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたＢＧＬは菌体外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたＢＧＬは、公知の手段でさらに精製されてもよい。

後述の実施例に示すとおり、本発明の変異β－グルコシダーゼは、変異前のβ－グルコシダーゼ（親ＢＧＬ）と比べて、糖化残渣（例えばリグニン）吸着性（又は非特異的吸着性）が低く、糖化残渣存在下で活性が低下しにくい。かつ、本発明の変異β－グルコシダーゼは、親ＢＧＬと比べて、バイオマスに対するβ－グルコシダーゼ活性が向上している（図１、表２）。したがって、本発明の変異β－グルコシダーゼは、バイオマス糖化用の酵素として有用である。

したがって、本発明はさらに、本発明の変異β－グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤を提供する。さらに本発明は、本発明の変異β－グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法を提供する。

本発明のバイオマス糖化剤は、好ましくは本発明の変異β－グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化用の酵素組成物（以下、本発明の酵素組成物ということもある）である。本発明の酵素組成物は、本発明の変異ＢＧＬを含み、また糖化効率の向上の観点から、好ましくは、さらに本発明の変異ＢＧＬ以外の他のバイオマス糖化酵素を含む。当該他のバイオマス糖化酵素は、動物、植物、微生物由来の酵素であればよい。当該他のバイオマス糖化酵素の例としては、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、本発明の変異ＢＧＬ以外のＢＧＬ等の本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼや、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ等のヘミセルラーゼなどが挙げられ、好ましくは本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼであり、より好ましくはセロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上である。これらのバイオマス糖化酵素は、単独で使用されても２種以上の組合せで使用されてもよい。バイオマス糖化効率の向上の観点から、本発明の酵素組成物は、セロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選ばれる１種以上を含むことが好ましい。

本発明の酵素組成物に含まれる本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼの具体例としては、これらに限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ；トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）由来のセルラーゼ；バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ－Ｎ１４５（ＦＥＲＭＰ－１９７２７）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ－Ｎ２５２（ＦＥＲＭＰ－１７４７４）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ－Ｎ１１５（ＦＥＲＭＰ－１９７２６）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ－Ｎ４４０（ＦＥＲＭＰ－１９７２８）、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ－Ｎ６５９（ＦＥＲＭＰ－１９７３０）などの各種バチルス株由来のセルラーゼ；パイロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼ；フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼが好ましい。また、上記の微生物に対して外来性に導入したセルラーゼ遺伝子を発現させて得られた組換えセルラーゼを用いてもよい。具体例としては、トリコデルマ・リーゼに対してアスペルギルス・アクリータス由来のβ－グルコシダーゼ遺伝子を導入して得られたＸ３ＡＢ１株（ＪＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，１７４１－１７４９）が生産するセルラーゼＪＮ１１が挙げられる。あるいは、上記他のセルラーゼを含むセルラーゼ製剤を本発明の酵素組成物に含有させて、本発明の変異ＢＧＬと併用してもよい。当該セルラーゼ製剤の具体例としては、セルクラスト（登録商標）１．５Ｌ（ノボザイムズ社製）、ＴＰ－６０（明治製菓株式会社製）、Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標）ＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ^TMＤＵＥＴ（ジェネンコア社製）、及びウルトラフロ（登録商標）Ｌ（ノボザイムズ社製）などが挙げられる。

本発明の酵素組成物に含まれるセロビオハイドロラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼ、パイロコッカス・ホリコシ由来の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、などが挙げられる。これらの中で、糖化効率の向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、トリコデルマ・ビリデ、又はフミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のセロビオハイドロラーゼがより好ましい。

本発明の酵素組成物に含まれるエンドグルカナーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーゼ、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium celluloriticus）、フミコーラ・インソレンス、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、バチルス（Bacillus）、サーモビフィダ（Thermobifida）、セルロモナス（Cellulomonas）由来の酵素などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ・リーゼ、フミコーラ・インソレンス、バチルス、セルロモナス由来のエンドグルカナーゼが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のエンドグルカナーゼがより好ましい。

本発明の酵素組成物に含まれる本発明の変異ＢＧＬ以外のＢＧＬの例としては、アスペルギルス・ニガー由来のＢＧＬ（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製ＢＧＬ）、ならびにトリコデルマ・リーゼ又はペニシリウム・エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来のＢＧＬなどが挙げられる。このうち、バイオマス糖化効率向上の観点から、ノボザイム１８８、トリコデルマ・リーゼ由来ＢＧＬが好ましく、トリコデルマ・リーゼ由来のＢＧＬがより好ましい。

本発明の酵素組成物に含まれるヘミセルラーゼの例としては、トリコデルマ・リーゼ由来のヘミセルラーゼ；バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｎ５４６（ＦＥＲＭＰ－１９７２９）由来のキシナラーゼ；アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ビリデ、フミコーラ・インソレンス、又はバチルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ；サーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、又はサーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼ；バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）由来のβ－キシロシダーゼ；セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）由来β－キシロシダーゼ、などが挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、バチルス・エスピー、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・ビリデもしくはストレプトマイセス由来のキシラナーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ－キシロシダーゼが好ましく、バチルス・エスピーもしくはトリコデルマ・ビリデ由来のキシナラーゼ、又はセレノモナス・ルミナンティウム由来のβ－キシロシダーゼがより好ましい。あるいは、好ましいヘミセルラーゼの例としては、特開２０１３－２４３９５３号公報、特開２０１３－２４３９５４号公報、特開２０１５－１６７５５２号公報、特開２０１６－１１９８７７号公報、特開２０１７－０１２００６号公報、又は特開２０１７－０３５００１号公報に記載の変異キシラナーゼが挙げられる。

本発明のバイオマス糖化剤（又は本発明の酵素組成物）中における本発明の変異ＢＧＬの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上さらに好ましくは２質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下、さらにより好ましくは３０質量％以下であるか、あるいは、総タンパク質量中、好ましくは０．５～７０質量％、より好ましくは１～５０質量％、さらに好ましくは２～４０質量％、さらにより好ましくは２～３０質量％である。好ましくは、本発明のバイオマス糖化剤（又は本発明の酵素組成物）の総タンパク質量は３～２５質量％である。

本発明の酵素組成物中における本発明の変異ＢＧＬ以外の他のセルラーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上であり、且つ好ましくは９９質量％以下、より好ましくは９５質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは１０～９９質量％、より好ましくは３０～９５質量％、さらに好ましくは５０～９５質量％である。

本発明の酵素組成物中におけるエンドグルカナーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上であり、且つ好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、さらに好ましくは４０質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは１～７０質量％、より好ましくは５～５０質量％、さらに好ましくは１０～４０質量％である。

本発明の酵素組成物中におけるヘミセルラーゼの含有量は、その総タンパク質量中、好ましくは０．０１質量以上％、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは０．５以上質量％であり、且つ好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であるか、あるいは、その総タンパク質量中、好ましくは０．０１～３０質量％、より好ましくは０．１～２０質量％、さらに好ましくは０．５～２０質量％である。

本発明の糖の製造方法は、上記本発明の変異ＢＧＬでバイオマスを糖化することを含む。当該方法においては、本発明の変異ＢＧＬとして、上述した本発明の酵素組成物を使用してもよい。当該本発明の方法における糖化処理の条件は、本発明の変異ＢＧＬ及び併用するその他酵素が失活しない条件であれば特に限定されない。適切な条件は、バイオマスの種類や前処理工程の手順、使用する酵素の種類により当業者が適宜決定することができる。

当該糖化処理においては、バイオマスを含む懸濁液に、本発明の変異ＢＧＬを添加することが好ましい。該懸濁液中のバイオマスの含有量は、糖化効率又は糖生産効率向上（すなわち糖生産時間の短縮）の観点から、好ましくは０．５～２０質量％、より好ましくは３～１５質量％、さらに好ましくは５～１０質量％である。

当該懸濁液に対する本発明の変異ＢＧＬの使用量は、バイオマスの種類、形状及び量、ならびに併用する酵素の種類及び性質などにより適宜決定される。好ましくは、バイオマス質量に対して、変異ＢＧＬの質量として０．０４～６００質量％、より好ましくは０．１～１００質量％、さらに好ましくは０．１～５０質量％である。

当該糖化処理の反応ｐＨは、糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点から、好ましくはｐＨ４～９、より好ましくはｐＨ５～８、さらに好ましくはｐＨ５～７である。当該糖化処理の反応温度は、糖化効率の向上、糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点から、２０～９０℃が好ましく、より好ましくは２５～８５℃、さらに好ましくは３０～８０℃、さらに好ましくは４０～７５℃、さらに好ましくは４５～６５℃、さらに好ましくは４５～６０℃、さらに好ましくは５０～６０℃である。当該糖化処理の反応時間は、バイオマスの種類、形状及び量や、酵素量などに合わせて適宜設定することができる。糖化効率又は糖生産効率向上、及び生産コスト低減の観点からは、好ましくは１～５日間、より好ましくは１～４日間、さらに好ましくは１～３日間である。

さらに、バイオマスの糖化効率又は糖生産効率向上の観点からは、本発明の糖の製造方法は、バイオマスを本発明の変異ＢＧＬで糖化する前に、該バイオマスを前処理する工程をさらに含むことが好ましい。当該前処理としては、例えば、アルカリ処理、粉砕処理及び水熱処理からなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。当該前処理としては、糖化効率向上の観点から、アルカリ処理が好ましく、糖化効率をさらに向上させる観点から、アルカリ処理と粉砕処理を行うことが好ましく、アルカリ処理と粉砕処理を並行して行うことがより好ましい。該粉砕処理は、湿式粉砕であっても乾式粉砕であってもよいが、乾式粉砕が好ましい。より好ましくは、固体のアルカリとバイオマスとを一緒に粉砕処理にかけアルカリ処理と並行して乾式粉砕を行う（アルカリ混合粉砕処理）。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下の物質、製造方法、用途、方法等を本明細書に開示する。ただし、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕下記（i）及び(ii)から選択される変異β－グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ－グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）該（i）のポリペプチドを含み、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
〔２〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列が、
配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、
配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
である、〔１〕記載の変異β－グルコシダーゼ。
〔３〕好ましくは、親β－グルコシダーゼと比べて糖化残渣吸着性が低い、〔１〕又は〔２〕記載の変異β－グルコシダーゼ。
〔４〕好ましくは、親β－グルコシダーゼと比べてバイオマスに対するβ－グルコシダーゼ活性が向上している、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の変異β－グルコシダーゼ。
〔５〕好ましくは、前記親β－グルコシダーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列の７８７位に相当する位置にリシンを、７９０位に相当する位置にグルタミン酸を、及び７９７位に相当する位置にスレオニンを有する、〔３〕又は〔４〕記載の変異β－グルコシダーゼ。

〔６〕該〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異β－グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕該〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔８〕該〔６〕のポリヌクレオチド又は該〔７〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔９〕好ましくは糸状菌である、〔８〕記載の形質転換体。
〔１０〕該〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異β－グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤。
〔１１〕該〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異β－グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法。

〔１２〕変異β－グルコシダーゼの製造方法であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をアスパラギンに置換することを含む、方法。
〔１３〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の７８７位に相当する位置にリシンを、７９０位に相当する位置にグルタミン酸を、及び７９７位に相当する位置にスレオニンを有する、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記変異β－グルコシダーゼが、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドと比べて、糖化残渣吸着性が低い、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。
〔１５〕好ましくは、前記変異β－グルコシダーゼが、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドと比べて、バイオマスに対するβ－グルコシダーゼ活性が向上している、〔１２〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドが、
配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は、
配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなる、〔１２〕～〔１５〕のいずれか１項記載の方法。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。

実施例１変異ＢＧＬ発現プラスミドの構築
アスペルギルス・アクリータスのβ－グルコシダーゼ１（ＡａＢＧＬ１；配列番号１）に対して以下の変異を導入した変異体をコードする発現プラスミドを構築した：Ｓ６４１Ｔ、Ｒ７３８Ｔ、Ｒ７４５Ｎ、Ｋ７８７Ｎ、Ｅ７９０Ｎ、Ｖ７９３Ｎ、Ｔ７９７Ｎ、Ｄ８０７Ｔ、Ｖ８１４Ｎ、Ｓ８２６Ｎ。

ＰＣＲ－ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ法により、分泌シグナル配列を有するＡａＢＧＬ１プレタンパク質をコードする遺伝子（ＡａＢＧＬ１遺伝子、配列番号７）に変異導入した。すなわち、表１に記載の各変異導入用プライマーとＢＧＬ１－Ｒプライマーを用いて、アスペルギルス・アクリータスＮｏ．Ｆ－５０株ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して付属のプロトコルに従い、ＡａＢＧＬ１遺伝子の変異導入部位から下流側の遺伝子を増幅した。増幅断片はアガロースゲル電気泳動によって分離し回収した。得られた増幅断片をメガプライマーとしてＢＧＬ１－Ｆプライマーとともに用いて、Ｆ－５０株ゲノムＤＮＡを鋳型として同様の方法でＰＣＲを行い、変異が導入された全長ＡａＢＧＬ１遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡ断片をプライマー由来のNot I及びSph Iサイトで切断し、糸状菌発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３－３８９）の同サイトに組み込んで発現プラスミドを構築した。ＤＮＡ断片に変異が正しく導入されていることをシークエンシングにより確認した。

実施例２変異ＢＧＬ発現株の作製
形質転換体の作製はＧｏｍｉらの方法（ＡｇｒｉｃＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９８７，５１：２５４９－２５５５）に従って行った。すなわち、ＭＭ（ＮＨ₄ ⁺）平板培地（１．０％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％Ａｍｍｏｎｉｕｍｔａｒｔｒａｔｅ、０．１３％ＫＣｌ、０．１３％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．３８％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０００１１％Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ、０．０００１１％Ｈ₃ＢＯ₃、０．０００１６％ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０００１６％ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．００５％ＥＤＴＡ、０．０００５％ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０００５％ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、０．００２２％ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ｐＨ６．５）に生育したアスペルギルス・オリザ（A. oryzae）ｎｉａＤ３００株に５ｍＬのＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．０１％ＮａＣｌ）を加え、スプレッダーを用いて胞子を懸濁した。この胞子懸濁液をＭＭ（ＮＨ₄ ⁺）液体培地２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフルつき三角フラスコ）に加え、３０℃、１６０ｒｐｍで１晩振盪培養した。適度に生育させて培養を終了し、ミラクロス上で集菌し、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（以下、ＰＢ；０．８ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４）で洗浄した。回収した菌体を５０ｍＬ容遠心管に入れ、Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ社製）３０ｍｇ、Ｌｙｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｒｄｒｉｃｈ社製）５０ｍｇの入ったＰＢ１０ｍＬに懸濁し，ゆっくりと振盪しながらインキュベート（３０℃、９０ｍｉｎ）した。また、３０分毎にピペッティングすることで菌体をほぐした。その後、プロトプラストのみを回収するためにミラクロスでろ過し、得られたろ液を遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。沈殿をＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒＩ（以下、ＴＢＩ；０．８ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭＣａＣｌ₂）１０ｍＬに懸濁し、遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。その後、上清を除去し、沈殿を２００μＬのＴＢＩに懸濁したものをプロトプラスト溶液とした。プロトプラスト数を顕微鏡により確認し、およそ１０⁷個／ｍＬのプロトプラストをその後の操作に用いた。

実施例１で得られた発現プラスミドＤＮＡ約１０μｇを含む溶液に等量の２×ＴＢＩを加え、これをプロトプラスト溶液に添加した。さらにその０．２倍量のＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒＩＩ（以下、ＴＢＩＩ；５０％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、５０ｍＭＣａＣｌ₂）を加え、穏やかに混合して１０ｍｉｎ氷上に静置した。その後１ｍＬのＴＢＩＩを加え、室温で１５ｍｉｎ静置した。次に１０ｍＬのＴＢＩを加え、遠心分離（４℃、２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。上清を除去し，沈殿を２００μＬのＴＢＩに懸濁し、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ（以下、ＲＥ；１．０％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％ＮａＮＯ₃、４．６８％ＮａＣｌ、０．１３％ＫＣｌ、０．１３％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．３８％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０００１１％Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ、０．０００１１％Ｈ₃ＢＯ₃、０．０００１６％ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０００１６％ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．００５％ＥＤＴＡ、０．０００５％ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０００５％ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ、０．００２２％ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ｐＨ６．５）に乗せ、トップアガー（ＲＥ、０．７％寒天）を重層した。得られた形質転換体は核を純化するためにモノクロ化を行った。すなわち、マイクロチューブに２００μＬのＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎを加えたものを２つ用意し、形質転換体が生育したＲＥ培地プレートから白金耳の先端に付着させた形質転換体の胞子を片方のＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁した。そこから２μＬ取り、もう片方のＴｗｅｅｎ／ｓａｌｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎと混合することで１００倍希釈した。その溶液から１００μＬをＭＭ（ＮＯ₃ ^-、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）（ＭＭ（ＮＨ₄ ⁺）のＡｍｍｏｎｉｕｍｔａｒｔｒａｔｅの代わりにＮａＮＯ₃を添加し、さらにＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加したもの）平板培地にスプレッドし、３０℃で３～４日間静置培養した。そこに生育してきたコロニーから１株選択し，ＭＭ（ＮＯ₃ ^-）平板培地に単離した。得られた形質転換体を５ｍＬのＭＭ（ＮＯ₃ ^-）液体培地にて３０℃で４日間培養した。

実施例３変異ＢＧＬの精製
実施例２で得られた変異ＢＧＬ発現株から変異ＢＧＬ酵素を精製し、そのＢＧＬ活性を、ｐＮＰ（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）法にて測定した。培養上清を希釈して酵素溶液を調製した。１．５ｍＭｐＮＰ－Ｇｌｃ溶液（１００ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）を基質溶液とした。３７℃で５ｍｉｎプレインキュベートした１００μＬの酵素溶液に、１．５ｍＭの基質溶液を等量混合することで酵素反応を開始した。３７℃、１０ｍｉｎの反応後、２ｍＬの１ＭＮａ₂ＣＯ₃溶液を加えて反応を停止させた。その後４０５ｎｍの吸光度を測定し、ｐＮＰの吸光係数（ε４０５ｎｍ＝０．０１８５ｍＬ／ｎｍｏｌ・ｃｍ^－１）を用いて遊離したｐＮＰ濃度を算出し、酵素活性を求めた。ブランクには、酵素溶液１００μＬに１ＭＮａ₂ＣＯ₃ ２ｍＬ、基質溶液１００μＬの順に加えた酵素反応が生じない液を用いた。１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離させる酵素量を１Ｕｎｉｔと定義し、以下の式により培養上清の酵素活性を算出した。
酵素活性（Ｕｎｉｔ／ｍＬ）＝Ａ４０５／１８．５×２．２ｍＬ／（１０ｍｉｎ）×（１／０．１ｍＬ）×培養上清の希釈率

その結果、Ｓ６４１Ｔ、Ｒ７３８Ｔ、Ｒ７４５Ｎ、Ｋ７８７Ｎ、Ｅ７９０Ｎ、Ｖ７９３Ｎ、Ｔ７９７Ｎ、Ｄ８０７Ｔ、Ｖ８１４Ｎ、又はＳ８２６Ｎ変異体を含む上清がＢＧＬ活性を示した。

次いで、ＢＧＬ活性が確認された培養上清から変異ＢＧＬを精製した。精製はＢａｂａら（ＡＭＢＥｘｐｒｅｓｓ，２０１５，５：３）の方法に従い、以下の手順で行った。各変異酵素高発現株を５％Ｇｌｃ、１．５％Ｎａ₂ＮＯ₃を単一炭素源，窒素源としたＭＭ（ＮＯ₃ ^-）液体培地１，２００ｍＬ（２００ｍＬ×６)で３日間培養した後、ブフナー漏斗を用いて集菌した。５Ｌのイオン交換水で洗浄後、菌体を１２００ｍＬのＲｅｌｅａｓｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（０．０２％Ｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ、１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬＣｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）中に懸濁し、３０℃、１６０ｒｐｍで２日間振盪した。振盪後，ブフナー漏斗を用いてろ液を回収し、粗酵素液とした。２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）で平衡化を行ったＤＥＡＥＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍに粗酵素を吸着させ、４Ｌの２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）で洗浄し、続いて０－０．３ＭＮａＣｌ溶液（２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）１Ｌのリニアグラジエントで溶出した。Ａ２８０の値でメインのピークを示した溶出画分を回収してＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡａＢＧＬ１に相当する１３０ｋＤａのバンドの存在を確認した。さらに、回収した画分にＡｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅを３０％飽和となるように添加し、予め３０％飽和Ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ（２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）で平衡化したＢｕｔｙｌＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍに吸着させ、３０－０％飽和Ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ溶液（２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．０）１Ｌのリバースリニアグラジエントで溶出した。Ａ２８０の値でメインのピークを示した溶出画分を回収してＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡａＢＧＬ１に相当する１３０ｋＤａのバンドの存在を確認した。

実施例４糖化残渣への吸着試験
実施例３で精製した変異ＢＧＬについて、糖化残渣への吸着性を調べた。アルカリ処理バガス２ｇ及びトリコデルマ・リーゼＰＣ－３－７株由来セルラーゼ培養液１０ｍｇ（５ｍｇ／ｇｂｉｏｍａｓｓとなるよう添加、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）を０．２ｍｇ／ｍＬＳｏｄｉｕｍａｚｉｄｅを含む４０ｍＬの５０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）に溶解し，５０℃で２４時間反応させた。反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）し、沈殿を回収した。回収した沈殿を蒸留水４０ｍＬで懸濁し、再び遠心分離して洗浄した。洗浄した沈殿を３６ｍＬの蒸留水に懸濁することでセルラーゼ糖化アルカリ処理バガスの糖化残渣を調製した（約９０％ｖ／ｖ）。この糖化残渣４００μＬに対して、２０ｍＭＮａ－ａｃｅｔａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）５０μＬ、ならびに５．６もしくは５５．８μｇ／ｍＬの野生型ＡａＢＧＬ１（ＷＴ）もしくは変異酵素を５０μＬ添加し、５０℃で１時間、１６０ｒｐｍで振とうしながら酵素反応を行った。反応後、反応液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）して上清を回収した。回収した上清の残存ＢＧＬ活性を、実施例３と同様の手順でｐＮＰ法を用いて測定し、糖化残渣を添加していない反応液上清の残存ＢＧＬ活性を１００％としたときの相対活性（％）を求めた。
結果を図１に示す。調べた変異ＢＧＬの中で、Ｋ７８７Ｎ、Ｅ７９０Ｎ及びＴ７９７Ｎ変異体は野生型ＡａＢＧＬ１（ＷＴ）と比べて残存活性が高く、糖化残渣への吸着が低下していた。

これらＫ７８７Ｎ、Ｅ７９０Ｎ及びＴ７９７Ｎ変異体について、比活性を調べた。実施例３で精製した酵素を用いて、そのＢＧＬ活性を実施例３と同様の手順でｐＮＰ法にて測定し、以下の式により酵素の比活性を算出した。
比活性（Ｕｎｉｔ／ｍｇ）＝酵素活性（Ｕｎｉｔ／ｍＬ）／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）
いずれの変異体も野生型と比べて比活性が向上していた（表２）。したがって、これらの変異ＢＧＬが、野生型酵素と比べて糖化残渣への吸着性が低く、糖化残渣存在下で活性が低下しにくいこと、したがってバイオマス中でより高いβ－グルコシダーゼ活性を発揮できることが示された。

以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

Claims

下記（i）及び(ii)から選択される変異β－グルコシダーゼ：
（i）配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基がアスパラギンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ－グルコシダーゼ活性を有する、ポリペプチド；
（ii）該（i）のポリペプチドを含み、かつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド。
請求項１記載の変異β－グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド。
請求項２記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
請求項２のポリヌクレオチド又は請求項３記載のベクターを含む形質転換体。
糸状菌である、請求項４記載の形質転換体。
請求項１記載の変異β－グルコシダーゼを含有するバイオマス糖化剤。
請求項１記載の変異β－グルコシダーゼでバイオマスを糖化することを含む、糖の製造方法。
変異β－グルコシダーゼの製造方法であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつβ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１の７８７位に相当する位置、７９０位に相当する位置、及び７９７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置のアミノ酸残基をアスパラギンに置換することを含む、方法。