JP7046173B2

JP7046173B2 - ブタｇ－ｃｓｆ変異体とその使用

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Publication number: JP7046173B2
Application number: JP2020520785A
Authority: JP
Inventors: コナーキャニングピーター; クルーセンニコラス; ハルヌールラシッドムド
Original assignee: Ambrx Inc; Elanco US Inc
Current assignee: Ambrx Inc; Elanco US Inc
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-10-10
Also published as: KR102461760B1; AU2021204727B2; US12286462B2; EP3694535A4; BR112020007037A2; KR20220150432A; NZ763428A; AU2021204727A1; AU2018348138A1; WO2019075053A1; CN111565736B; TWI820046B; KR102619071B1; RU2020113060A3; EP3694535A1; RU2020113060A; CN111565736A; TW201928058A; US20210054039A1; KR20200066628A

Description

本出願は、２０１７年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５７０，８７７号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、合成アミノ酸を含有する変異体ブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ－ＣＳＦ）ポリペプチドに関する。合成アミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子の結合によって修飾される。ＰＥＧ化（ペグ化された）ｐＧ－ＣＳＦ変異体は、ブタにおけるバクテリア感染の治療に使用される。ブタが周産期雌豚である場合、細菌感染は乳房炎、子宮炎、無乳症（ＭＭＡ）症候群である可能性がある。妊娠雌豚のバクテリア感染を減少させることにより、子豚の生存率が改善する。

食用動物生産における感染症の経済的影響は十分に立証されている。感染症は、利益を減少させ、製造コストを増大させ、食料品を危険にさらし、並びに動物の性能、健康及び福祉に影響を及ぼす。疾患は、新生動物、若齢動物（例えば、置換ストック）または成熟動物の罹患率および死亡率を引き起こし、食用動物生産に壊滅的な影響をもたらす可能性がある。

ブタでは、そのような疾患の１つは乳房炎、子宮炎、無乳症（ＭＭＡ）症候群である可能性がある。乳房炎は乳房のバクテリア感染である。１つまたは２つの腺のみが影響を受ける可能性があり、または、感染が複数の腺に広がる可能性がある。子宮炎は、泌尿生殖器の細菌感染症であり、ときに外陰部排出（vulvar discharge）として現れる。無乳症は、雌豚による母乳製造の減少、または総ロスである。ＭＭＡ症候群は、非常に多様であり得、上記の症状の全てを提示するわけではない。したがって、ＭＭＡ症候群は検出および診断が困難なことがあり、哺育中の子豚が空腹、体重減少、または死亡の徴候を示すまで検出されないことがある。

ＭＭＡ症候群は検出が困難であるため、予防的治療が好ましい。抗生物質、特に共用クラスの抗生物質の使用は、食品を生産する動物では推奨されないので、非抗生物質処置がブタの治療に好ましい。ｐＧ－ＣＳＦのようなサイトカインは、動物の好中球数を増加させることができるので、自然免疫系をプライミングしてバクテリア感染に迅速に反応させることができる。ｐＧ－ＣＳＦ変異体をＰＥＧで修飾することにより、サイトカインの薬物動態および安定性を延長することができ、したがってその効果を増強することができる。

乳牛の乳房炎の治療にＰＥＧ化されたウシＧ－ＣＳＦを使用することができる（国際公開第2010／011735号）。ＰＥＧ化されたヒトＧ－ＣＳＦについても記述している（国際公開第2000／044785号）。ウイルス感染（国際公開第2005／025593号）など呼吸器感染症の治療には、ＰＥＧ化されたワイルドタイプのブタＧ－ＣＳＦが提案されている。本書では様々な側面で明らかにされているように、ＰＥＧ化されたｐＧ－ＣＳＦの変異体は、ブタ血中の血球数を増加させ、周産期雌豚におけるＭＭＡ症候群の発生率を減少させ、および／または豚の生存を改善する。

本発明は、以下のコンセンサス配列を有するブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ－ＣＳＦ）変異体：
X₁PLSPASSLPQSFLLKX₂LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLCX₃PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX₄EDLRX₄APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号１３）
を提供する。変数Ｘ_１は、配列番号２および９におけるジペプチドメチオニンアラニン、配列番号７および１０におけるジペプチドノルロイシンアラニン、配列番号４および１１におけるアラニンであり得、または、配列番号８および１２におけるように存在しない。変数Ｘ_２は、配列番号２、４、７および８のようなシステインであり得、または、Ｘ_２は配列番号９、１０、１１および１２のようなセリンであってもよい。変数Ｘ_３は、合成アミノ酸であり得る。合成アミノ酸は、配列番号１３に示されるように、４３位（配列番号３に示されるような成熟野生型ｐＧ－ＣＳＦに対する位置）に存在し得る。合成アミノ酸は、パラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）であり得る。変数Ｘ_４は、配列番号２、４、８、９、１１、および１２におけるようなメチオニンであり得るか、またはＸ_４は、配列番号７および１０におけるようなノルロイシンであり得る。ｐＡＦ合成アミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子に共有結合することができる。ＰＥＧは、約２０ｋＤ～約５０ｋＤの分子量、または約３０ｋＤの分子量を有することができ、好ましくは、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧ分子である。

本発明は、以下の配列を有するブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ－ＣＳＦ）変異体：
MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC[pAF]PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号２）
を提供し、ここで、４３位に存在するパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）合成アミノ酸は、３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧ分子に共有結合している。

本発明は、本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれか、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明は、治療有効量の本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかを、それを必要とするブタに投与することを含む、ブタにおける細菌感染を治療するための方法を提供する。細菌感染は乳房炎、子宮炎および無乳症（ＭＭＡ）症候群であり得る。処置が必要なブタは周産期の雌豚であり得る。ｐＧ－ＣＳＦ変異体の治療有効量は、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重、または約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重、または約４０μｇ／ｋｇ動物体重であり得る。本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの投与は、分娩前７日以内（すなわち、妊娠の１０７日目またはその後）または分娩時に少なくとも１回行われ得る。いくつかの態様において、ブタにおける細菌感染を処置する方法は、分娩後１４日以内（すなわち、分娩後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日以内、または１４日以内）に本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ改変体のいずれかの第２の投与を含み得る。

本発明は、治療有効量の本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかを、それを必要とするブタに投与することを含む、ブタにおける自然免疫応答（先天性免疫応答）を刺激するための方法を提供する。刺激が必要なブタは周産期の雌豚であり得る。他の態様では、刺激を必要とするブタは免疫系を損なったまたは免疫系が弱体化したブタであり得る。さらなる態様において、刺激を必要とするブタは、例えば細菌感染またはウイルス感染を含む感染症を発症する、または発症するリスクがあるブタであり得る。ある態様において、本方法は、サイトカイン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、および／またはインターロイキン（ＩＬ））の産生を刺激し、および／または樹状細胞（ＤＣ）、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、および骨髄球（例えば、肥満細胞、骨髄芽球（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、単球、およびマクロファージ））などの免疫細胞の量を活性化または増加させることができる。これらの態様のいくつかの実施形態において、該方法は、例えば、好中球ミエロペルオキシダーゼ－過酸化水素－ハロゲン化物媒介抗菌機能を増加させることによって、好中球抗菌機能を刺激または増強し得る。

自然免疫応答を刺激する方法において、ｐＧ－ＣＳＦ変異体の治療有効量は、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重、または約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重、または約４０μｇ／ｋｇ動物体重であり得る。本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの投与は、分娩前７日以内（すなわち、妊娠の１０７日目またはその後）または分娩時に少なくとも１回行われ得る。いくつかの態様において、ブタにおける細菌感染を処置する方法は、分娩後１４日以内（すなわち、分娩後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日以内、または１４日以内）に本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ改変体のいずれかの第２の投与を含み得る。

本発明は、本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの治療有効量を周産期の雌豚に投与することを含む、子豚死亡率を低下させるための方法を提供する。ｐＧ－ＣＳＦ変異体の治療有効量は、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重、または約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重、または約４０μｇ／ｋｇ動物体重であり得る。本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの投与は、分娩前７日以内（すなわち、妊娠の１０７日目またはその後）または分娩時に少なくとも１回行われ得る。いくつかの態様では、子豚死亡率を低下させる方法は、分娩後１４日以内（すなわち、分娩後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日以内、または１４日以内）に本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの周産期雌豚への第２の投与を含み得る。

本発明は、ブタにおける細菌感染のための薬剤の製造における、本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの使用を提供する。細菌感染はＭＭＡ症候群であり得る。ブタは周産期の雌豚であり得る。本発明は、子豚の死亡率を低下させるための薬剤の製造における、本明細書に記載のｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかの使用を提供する。

本発明は、治療における使用のための、本明細書中に記載されるｐＧ－ＣＳＦ変異体のいずれかを提供する。治療は、ブタにおけるバクテリア感染症候群の処置であり得る。細菌感染はＭＭＡ症候群であり得る。ブタは周産期の雌豚であり得る。治療は子豚の死亡率の低下であり得る。ｐＧ－ＣＳＦ変異体は、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重、または約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重、または約４０μｇ／ｋｇ動物体重で周産期の雌豚に投与し得る。ｐＧ－ＣＳＦ変異体は、分娩前７日以内（すなわち、妊娠１０７日目以降）または分娩時に、少なくとも１回投与し得る。分娩後１４日以内に周産期の雌豚に２回目の投与をし得る。

「細菌感染症」とは、動物の表皮、粘液膜、腺、眼、耳、泌尿生殖器、消化管、肺、血液、または臓器上又は内部で１種以上のバクテリア種が増殖することをいう。バクテリアは、アクロモバクター、アクチノバチルス、放線菌、バチルス、ボルダテラ、ブルセラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エリシペロスリクス、エシェリヒア、ヘモフィルス、クレブシエラ、レプトスピラ、リステリア、マイコプラズマ、パスツレラ、プロテウス、シュードモナス、サルモネラ、スフェロフォラス、ブドウ球菌、連鎖球菌、またはビブリオの属内に分類される種であり得る。

本明細書で使用する「ブタ」という用語は、ピッグ、特に家畜豚（スース・スクローファ・ドメスティクス（Sus scrofa domesticus）またはスース・ドメスティクス（Sus domesticus））を指し、小型豚ならびに肉生産のために飼育された品種を含むことができ、「ピッグ」、「豚」または「ブタ」とは、すべての豚品種を含むことを意味する。

周産期雌豚は、妊娠最終週から分娩後最初の数週間までの妊娠雌豚と定義される。分娩、または出産は、典型的には妊娠１１４日目頃に起こる。周産期雌豚は、妊娠約１００日目から分娩後約１４日までの妊娠雌豚とすることができた。子豚は、出生～生後３週齢頃における離乳までのブタである。

「合成アミノ酸」は、２０個の一般的なアミノ酸またはピロリジンまたはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指す。そのような合成のアミン酸の例としては、パラ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）、アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、およびN－アセチルグルコサミニル－Ｌ－トレオニンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの合成アミノ酸およびポリペプチドへのそれらの組み込みおよびその後の修飾は、国際公開第2010／011735号および国際公開第2005／074650号に記載されている。

本明細書中で使用される場合、用語「処理すること」、「処理する」、または「処理」は、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を抑制する、遅らせる、停止させる、減少させる、改善する、または逆転させることを含む。いくつかの態様において、本開示は、１以上のそのような症状、障害、状態、または疾患を発症するリスクのある動物において観察または検出されない、症状、障害、状態、または疾患の予防的処置に特異的な方法を提供する。いくつかの態様において、処置は、治療的に適用される。

用語「有効量」は、使用される場合、ブタにおけるバクテリア感染の予防、治療、または低減などの所望の効果を有する、投与されるｐＧ－ＣＳＦ変異体の量を指す。ブタが周産期の雌豚である場合、雌豚のバクテリア感染を治療することで子豚の生存率を改善することができる。有効量は、雌豚の体重などの要因によって変化し得る。

「投与する」とは、開示された化合物および該化合物を含有する組成物の治療有効量の注射を意味する。例えば、限定されないが、投与は、筋肉内（ｉ．ｍ．）または皮下（ｓ．ｃ．）であり得る。

用語「約」は、当業者によって理解され、そしてそれが使用される文脈に依存してある程度変化する。本明細書中で使用される場合、「約」は、±１０％、±５％、または±１％（すなわち、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％）の変化を包含することを意味する。

本発明のｐＧ－ＣＳＦ変異体は、哺乳動物細胞、大腸菌、枯草菌、またはシュードモナスフルオレッセンスなどの細菌細胞、および／または真菌もしくは酵母細胞を含む種々の細胞において容易に産生され得る。宿主細胞は、当該分野で周知の技術を使用して培養され得る。目的のポリヌクレオチド配列（例えば、ｐＧ－ＣＳＦの変異体および発現コントロール配列）を含むベクターは、公知の方法によって宿主細胞にトランスフェクトされ得、これは、細胞宿主の型に依存して変化する。例えば、塩化カルシウム形質転換法は、原核細胞のために一般に利用され、一方、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションは、他の真核宿主細胞のために使用され得る。タンパク質精製の種々の方法が使用され得、そしてこのような方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)およびScopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)に記載される。

ＰＥＧ化されたｐＧ－ＣＳＦ変異体は、公知方法に従って処方され、薬学的に有用な組成を調製することができる。いくつかの態様において、配合組成は、適切な希釈剤または高純度の水溶液で、任意の薬学的に許容可能な担体、保存剤、賦形剤または安定剤とともに再構成される安定な凍結乾燥産物である（Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995を参照のこと）。

ＰＥＧ化されたｐＧ－ＣＳＦ変異体は、薬学的に許容される緩衝液と、許容される安定性を提供するように調整されたｐＨと、投与のために許容されるｐＨとを用いて処方され得る。いくつかの非限定的な例では、投与に許容されるｐＨは、約５～約８（すなわち、約５、約６、約７、または約８）の範囲であってもよい。さらに、本発明のＰＥＧ化されたｐＧ－ＣＳＦ組成物は、容器（例えば、バイアル、カートリッジ、ペン送達デバイス、シリンジ、静脈内投与チューブまたは静脈内投与バッグ）中に配置され得る。

以下の実験例は、ｐＧ－ＣＳＦ変異体、および周産期の雌豚におけるＭＭＡ症候群などのブタにおけるバクテリア感染の処置におけるそれらの使用を説明するものである。雌豚におけるバクテリア感染の発生率を低下させることも、子豚の死亡率を低下させる。当業者には他の実施形態および使用が明らかであり、本発明はこれらの特定の例示的な例または好ましい実施形態に限定されないことが理解されるであろう。

実施例１
部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発により選択した位置にＴＡＧ終止コドンを導入することにより、ブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ‐ＣＳＦ）ｃＤＮＡの異なる変異体（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６８４８１．１）を生成する。また、シグナル配列をコードするｃＤＮＡの部分は、単一のメチオニンコドン（すなわち、ＡＴＧ）によって置き換えられる。例えば、改変されたシグナル配列を有する野生型成熟ｐＧ－ＣＳＦをコードするｃＤＮＡは：

であり（配列番号２）、ここで、「ｘ」は、以下に記載されるように、合成アミノ酸で置換されたＨ４３残基を示す。

変異体をコードするプラスミドを、合成アミノ酸パラ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）の組み込みのために、増殖（増幅）された遺伝子コード系成分を含有する大腸菌細胞に形質転換する。形質転換された細胞を、ｐＡＦを補充した培地中で増殖させ、ｐＡＦが示された部位に組み込まれたｐＧ－ＣＳＦを発現するように誘導する。発現系は、例えば、国際公開第2010／011735号（本明細書中に参考として援用される）に記載されており、そして当該分野で一般的に公知である。

トランスフェクトされたｃＤＮＡ変異体の発現はアラビノースによって誘発され、細胞は収穫され、標的ｐＧ－ＣＳＦｐＡＦ部位変異体は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分離され、精製される。活性化された３０ｋＤの直鎖状アミノオキシ（aminoxy）－ＰＥＧは、組み込まれたｐＡＦに対して部位（サイト）特異的に結合されている。ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ結合を、過剰のＰＥＧおよび結合されていないｐＧ－ＣＳＦ変異体からクロマトグラフィーにより精製する。

実施例２
ＰＥＧ化されたｐＧ－ＣＳＦ（ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ）変異体のインビトロ生物活性は、Ｍ－ＮＳＦ－６０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ－１８３８）の増殖を誘発する変異体の性能によって測定される。最大増殖（ＥＣ_５０）の５０％をもたらすことができる変異体の濃度を、野生型（ＷＴ）ｐＧ－ＣＳＦを用いて作成した検量線との対比により決定する。例１に示された発現の結果およびここで説明した生物学的アッセイに基づいて、ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ変異体を選択し、さらなる検討を行う。

選択した候補ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ変異体のインビボ活性をげっ歯類モデルで試験した。Sprague Dawleyラット（３／群）は、ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ変異体を用いて０．２５ｍｇ／ｋｇ体重で処置される。０（投与前）、１、３、６、２４、４８、５６、７２、９６、１４４、１９２、および２６４時間で薬物動態（ＰＫ）分析のために血液試料を採取し、２４、４８、７２、および９６時間で完全血球数（ＣＢＣ分析）のために試料を採取する。ＣＢＣ分析における主要な測定は、存在する好中球数である。Ｈ４３変異体は、試験した他の変異体よりも高いレベルの好中球開発を刺激する。すべての変異体は類似したＰＫ輪郭を有する。

実施例３
ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦを以下のように調製する。実施例１と同様に、トランスフェクトされたｃＤＮＡ変異体の発現をアラビノースで誘導し、細胞を回収し、ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ部位変異体を単離し、変性させ、再折り畳みし、CAPTO Adhere Impres（GE Healthcare Lifesciences）を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により精製する。簡単に述べると、ペグ化されていないｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を、１～５ｍｇ／ｍＬの濃度の樹脂になるまでカラムにロードする。カラムを５カラム容量（ＣＶ）の３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で洗浄する。ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体の溶出は、溶出緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、Ｐｈ４．５）の直線勾配を用いて、０～１００％溶出緩衝液で２０ＣＶにわたって洗うことによって行う。

ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦの質量分析（ＭＳ）に基づいて、単離されたペプチドは、配列番号２によって表されるメインピークおよびいくつかの異なる混入物質を含む。混入物には、Ｎ－末端メチオンの喪失（配列番号４）、Ｎ－末端メチオニンおよびアラニンの両方の喪失（配列番号８）、およびＮ－末端メチオニンのノルロイシンへの置換（配列番号７）が含まれる。大腸菌による高密度発酵処理では、アミノ酸メチオニンの代わりにノルロイシンが誤って取り込まれることが知られている。ノルロイシン取り込みは、以下の１つ以上を使用することによって低減される：発酵溶液にメチオニンを供給する；規定媒体の代わりに複合媒体で発酵させる（複合媒体は、限定されるものではないが、グリセリン、塩類、アミノ酸、ビタミン、酵母エキス、植物および動物加水分解物、ペプトン、およびトリプトンを含む、１つ以上の非規定成分をその中に有する）；および／または誘発後の発酵反応混合物の温度を低下させる。

ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を、Capto SP Impresクロマトグラフィーを使用し、１０ｋＤａＭＷＣＯ接線流ろ過カセットを使用して３０ｍＭ酢酸ナトリウム、４％ショ糖、ｐＨ４．０に緩衝液交換した後、陽イオン交換クロマトグラフィープールから採取する。次いで、ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を、製造業者の説明書に従って、アミコン超遠心フィルタを使用して約８．０ｍｇ／ｍＬに濃縮する。濃縮後、３０Ｋ直鎖状ＰＥＧ（ＰＥＧは、例えば、NOF America CorporationまたはEMD Merckから商業的に購入することができる）を、ＰＥＧ対ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体の６：１モル比で添加する。次いで、ＰＥＧ／ｐＧ－ＣＳＦ変異体混合物を約２８℃で少なくとも２１時間インキュベートする。この方法は、ＰＥＧとコンジュゲートされるｐＧ－ＣＳＦ変異体の＞９８％をもたらす。次いで、ペグ化変異体を、上記のようにＣＥＸによって精製することができる。Ｍ－ＮＳＦ－６０細胞バイオアッセイ（実施例２）で試験した場合、ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体は、少なくとも０．４０ｎｇ／ｍＬのＥＣ_５０を有し、良好結合および効力特性を実証する。

試料を１．５ｍｌチューブ中で、０℃で凍結し、室温の水浴中で解凍することにより５サイクルにわたって解凍および解凍する。凍結融解の５サイクルにわたる高分子量（ＨＭＷ）タンパク質プロファイルについて有意な影響は観察されず、溶液中での変異体の安定性を実証する。

２つのさらなるｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を作製して、５０℃での変異体のリフォールディング効率および熱安定性を改善することを試みる。システイン１７は、アラニン（Ｃ１７Ａ）またはセリン（Ｃ１７Ｓ、配列番号９～１２）のいずれかに変化する。これらの突然変異はリフォールディング収率を改善しないが、Ｃ１７Ａは熱安定性を低下させた。ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ／Ｃ１７ＳのＥＣ_５０はわずかに改善され、０．２６ｎｇ／ｍＬである。

実施例４
ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を雌豚に投与し、血中好中球の変化を特徴付ける。１．５～５歳、平均体重２６９．７ｋｇの６匹の雌豚に、ネック側に４０μｇ／ｋｇのＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を筋肉内注射する。ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２５０ｍＭアルギニン、ｐＨ６．０中に８．２ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁する。処置開始後、動物に併用薬を投与しない。有害事象は観察されない。

投与０日前および投与２、７、１０、１４、１７および２１日後に採血する。好中球数を各雌豚について測定し、処置の平均を各日について測定する。ＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体の単回投与による処置は、３週間にわたる血中好中球数の測定可能な増加をもたらす（表１）。さらなる投与量は、より高い好中球レベルの維持を刺激すると予想される。

表１．１日平均血中好中球数に対するＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体の影響

実施例５
周産期の雌豚にＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体を投与し、乳房炎、子宮炎、無乳症（ＭＭＡ）症候群および子豚の生存に対する効果を特徴づける。

妊娠９５～１００日の雌豚を分娩用枠箱に入れ、各雌豚の妊娠１０７日まで衛生的な飼育方法を行う。１０７日目に、血液を収集し、次いで、雌ブタ（１群あたり２５匹）を、実施例４におけるような４０μｇ／ｋｇのＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦＨ４３ｐＡＦ変異体または陰性対照としての塩化ナトリウム溶液のいずれかで処置する。その後、雌豚を非衛生的な状態に置き、ＭＭＡの発症を促す。衛生的でない状態は、寝わらおよび廃棄物を蓄積させために、分娩用枠箱の格子状床にマットを配設することを含む。また、枠箱を汚染するために、水、糞、及び松のこくずの混合物（２：１：１）が使用される。雌豚には子宮収縮薬やコルチコステロイド薬は投与されない。臨床所見および直腸温は、妊娠１０７日目から１日１回朝に各雌豚から採取し、ＭＭＡの診断まで継続し、その時点で、雌豚はすべての試料を採取し、その後、治療を受けて研究から除外され、衛生的な枠箱の状態に戻る。採取された試料には、血液、直腸温、および感染した唾液のスワブが含まれる。

分娩は典型的には妊娠１１４日目に起こる。子豚を体重測定し、生後１２時間以内にタグ付けする。子豚の臨床観察を１日２回行い、生後３、７、２１日目にも体重を測定する。

疾患のプロトコルごとの定義を用いると、２群間にほとんど差は認められなかった。しかしながら、外陰部排出を疾患の定義から除外した場合、疾患の発生率はＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦ投与群で５０％以上低下した。また、投与群は対照群と比較して離乳子豚数が多かった（表２）。

表２．ＭＭＡ発生率および子豚の生存率に対するＰＥＧ－ｐＧ－ＣＳＦの影響

Claims

配列：
X₁PLSPASSLPQSFLLKX₂LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX₃EDLRX₃APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号１３）
からなるブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ－ＣＳＦ）変異体、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、乳房炎、子宮炎および無乳症（ＭＭＡ）症候群を治療するための医薬組成物であって、
Ｘ_１は、メチオニンアラニン、ノルロイシンアラニン、アラニンのみ、およびアミノ酸なしの群から選択され、
Ｘ_２はシステインまたはセリンであり、
Ｘ_３は、メチオニンまたはノルロイシンであり、
４３位に存在するパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）合成アミノ酸は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に共有結合している、
医薬組成物。
前記ＰＥＧが約２０ｋＤ～約５０ｋＤの分子量を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＰＥＧが約３０ｋＤの分子量を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
前記ＰＥＧが直鎖状である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
アミノ酸配列：
MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPEL
APALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAG
GVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号２）
からなるブタ顆粒球コロニー刺激因子（ｐＧ－ＣＳＦ）変異体、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、乳房炎、子宮炎および無乳症（ＭＭＡ）症候群を治療するための医薬組成物であって、
４３位に存在するパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）合成アミノ酸は、３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧに共有結合している、
医薬組成物。
ブタにおける乳房炎、子宮炎および無乳症（ＭＭＡ）症候群を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とするブタに投与することを含む方法。
前記ブタが周産期雌豚である、請求項６に記載の方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重である、請求項６または７に記載の方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重である、請求項６または７に記載の方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約４０μｇ／ｋｇ動物重量である請求項６または７に記載の方法。
前記投与が分娩前７日以内に少なくとも１回行われる、請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記投与を分娩時に行う、請求項６～１１のいずれか１項に記載の方法。
分娩後１４日以内の２回目の投与をさらに含む、請求項６～１２のいずれか１項に記載の方法。
子豚の死亡率を低下させるための方法であって、治療有効量の
配列：
X ₁ PLSPASSLPQSFLLKX ₂ LEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPELAPALDILQLDVTDLATNIWLQX ₃ EDLRX ₃ APASLPTQGTVPTFTSAFQRRAGGVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号１３）からなるｐＧ－ＣＳＦ変異体であって、４３位に存在するパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）合成アミノ酸は、３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧに共有結合している、ｐＧ－ＣＳＦ変異体、または、
アミノ酸配列：
MAPLSPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCATHKLC(pAF)PQELVLLGHSLGLPQASLSSCSSQALQLTGCLNQLHGGLVLYQGLLQALAGISPEL
APALDILQLDVTDLATNIWLQMEDLRMAPASLPTQGTVPTFTSAFQRRAG
GVLVVSQLQSFLELAYRVLRYLAEP（配列番号２）からなるｐＧ－ＣＳＦ変異体であって、４３位に存在するパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）合成アミノ酸は、３０ｋＤ直鎖状ＰＥＧに共有結合している、ｐＧ－ＣＳＦ変異体、または、
請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物を周産期の雌豚に投与することを含む方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約１０～１００μｇ／ｋｇ動物体重である、請求項１４に記載の方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約３０～５０μｇ／ｋｇ動物体重である、請求項１４に記載の方法。
前記治療有効量のｐＧ－ＣＳＦが、約４０μｇ／ｋｇ動物重量である、請求項１４に記載の方法。
前記投与が分娩前７日以内に少なくとも１回行われる、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記投与を分娩時に行う、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
分娩後１４日以内の２回目の投与をさらに含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。