JP7030093B2 - オキサチアジン様化合物を作製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、新たな化合物、新たな化合物を作製する方法、及びその使用に関する。

オキサチアジン様化合物は、特許文献１、及び特許文献２から知られている。

米国特許第３，２０２，６５７号明細書 米国特許第３，３９４，１０９号明細書

より強力な抗腫瘍活性及び抗菌活性を有し、毒性及び副作用が少なく、腫瘍細胞又は細菌細胞の治療に対する耐性が少ない化合物を提供するため、新たな化合物及びかかる化合物を作製する方法が当該技術分野において現在も必要とされている。

本発明によれば、新たなオキサチアジン様化合物、新たなオキサチアジン様化合物を作製する方法、オキサチアジン様化合物の作製に有用な化合物、及びそれらの使用が開示される。

ＬＮ－２２９細胞での細胞毒性アッセイにおける本発明の一実施形態の抗腫瘍活性をグラフで示す図である。 ＳＷ４８０（ヒト大腸腺癌）細胞での細胞毒性アッセイにおける本発明の一実施形態の抗腫瘍活性をグラフで示す図である。 （図３Ａ～図３Ｃ） タウロリジン及びタウルルタム（ＴＴ）による処理の後、ネズミのＳＭＡ５６０バルク神経膠腫細胞において誘導された細胞毒性を示す図である。細胞毒性を処理の２４時間後（図３Ａ）及び４８時間後（図３Ｂ）に判断した。タウロリジン（３４．６μｇ／ｍｌ）及びタウルルタム（１９．３μｇ／ｍｌ）に対するＥＣ_５０値を下のパネルに示す（図３Ｃ）。データを３回の独立した実験の平均値±ＳＤとして表す。 ネズミのＳＭＡ５６０神経膠腫癌幹細胞（ＣＳＣ）においてタウロリジン及びタウルルタム（ＴＴ）により誘導された細胞毒性の図である。データを平均値±ＳＤとして表す。 （図５Ａ～図５Ｃ） タウロリジン（図５Ａ）、タウルルタム（ＴＴ）（図５Ｂ）又はテモゾラミド（図５Ｃ）で２４時間処理した後の４名の多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の患者（ＧＢＭ３番、４番、５番、及び６番）から単離した癌幹細胞において誘導された細胞毒性の図である。データを平均値±ＳＤとして表す。 本発明に従って作製された化合物２２４４のＦＴＩＲスペクトルである。 本発明に従って作製された化合物２２５０のＦＴＩＲスペクトルである。 対照、タウロリジン処理（５００μＭ）、又は化合物２２５０処理（１０００μＭ）の試料を４８時間（Ａと標識される欄）処理し、残留する凝集物（Ｂと標識される欄）を安定性について試験するため濾した、多細胞性膵腫瘍（Ｐａｎｃ ＴｕＩ又はＢｘＰＣ－３）スフェロイドに対するスフェロイド毒性アッセイの結果を示す図である。 図９Ａ及び図９Ｂは、Ｐａｎｃ ＴｕＩ多細胞性スフェロイド培養物ＣＤ１３３含量のＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。 図１０Ａは、対照又はタウロリジンによる処理に対するＭｉａＰａｃａ２腫瘍体積を示す図である。１０Ｂは、対照又は化合物２２５０による処理に対するＭｉａＰａｃａ２腫瘍体積を示す図である。図１０Ｃは、対照又はタウロリジンによる処理に対するＰａｎｃＴｕ Ｉ腫瘍体積を示す図である。図１０Ｄは、対照又は化合物２２５０による処理に対するＰａｎｃＴｕ Ｉ腫瘍体積を示す図である。 図１１Ａは、対照、タウロリジン、又は化合物２２５０で処理した場合の１５日間に亘って観察された原発性膵腫瘍（Ｂｏ７３）の異種移植片モデルである。図１１Ｂは、対照、タウロリジン、又は化合物２２５０で処理した場合の２３日間に亘って観察された原発性膵腫瘍（Ｂｏ７０）の異種移植片モデルである。

或る特定の実施形態によれば、本発明は、オキサチアジン様化合物、また同様にその誘導体、並びにオキサチアジン様化合物及びその誘導体を調製する方法、及びそのための化合物に関する。

本発明の或る特定の実施形態によるオキサチアジン様化合物及びその誘導体は、抗腫瘍活性、抗菌活性、及び／又は他の活性を有する。

本発明の或る特定の実施形態によるオキサチアジン様化合物及びその誘導体を作製する方法は、抗腫瘍活性、抗菌活性、及び／又は他の活性を有する化合物の作製に対して有利な方法を提供する。或る特定の実施形態では、オキサチアジン様化合物及びその誘導体は、ヒト患者等の被験体の癌及び腫瘍の治療において特に有用である。したがって、或る特定の実施形態ではまた、本発明は、本明細書に記載される化合物を使用する癌及び腫瘍の治療に関する。例えば、膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫及び脳軟膜転移癌を含む中枢神経系癌、大腸癌、直腸癌及び結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、中皮腫、黒色腫、腎臓癌、肝臓癌、膵癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、噴門癌、胆嚢癌、皮膚癌、骨癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、リンパ肉腫、腺癌、線維肉腫等の癌、及びそれらの転移が、本発明の或る特定の実施形態による治療に対して考慮される疾患である。薬剤耐性腫瘍、例えば、固形腫瘍、非固形腫瘍及びリンパ腫である薬剤耐性腫瘍を含む多剤耐性（ＭＤＲ）腫瘍もまた、本発明の化合物を使用する或る特定の実施形態において有用である。現在、本明細書に記載された方法を使用して、あらゆる腫瘍細胞も治療することができると考えられている。

腫瘍幹細胞（癌幹細胞（ＣＳＣ）とも呼ばれる）は、切除の後に転移の形成及び腫瘍の再増殖に対する主な制御因子（drivers）であると考えられる。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物は、被験体の腫瘍幹細胞の治療において特に有用である。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物は、被験体の膠芽腫腫瘍幹細胞の治療において特に有用である。

或る特定の実施形態では、本発明は、酸化ストレス、アポトーシス及び／又は腫瘍部位における新たな血管の成長を阻害することによって（抗血管形成及び抗細管形成）、腫瘍細胞及び／又はＣＳＣを死滅させる、又はそれらの増殖を阻害する。腫瘍細胞及び／又はＣＳＣの死滅に対する主な作用機構は、酸化ストレスである。また、腫瘍細胞及び／又はＣＳＣは、本発明によるアポトーシスによって死滅され得る。より低い血中濃度では、本発明による化合物は、それらの抗血管形成作用及びそれらの抗細管形成作用によって腫瘍細胞の増殖を阻害することに有効であり、またこれらの化合物は、したがって緩和治療に有用である。

本発明のオキサチアジン様化合物及びその誘導体は、タウロリジン及びタウルルタムよりも血流中ではるかにゆっくりと代謝される。したがって、同様の効果を達成するために、より低用量のかかる化合物を患者に投与することができる。

予想外なことに、以下の通り、タウロリジンへの曝露の数分以内に、腫瘍細胞がアポトーシス細胞死のプログラムを開始することによって反応することがわかった：
１．タウロリジンの腫瘍細胞に対する主な損傷は、蛍光定量的に測定される、活性酸素種（ＲＯＳ）の増加である。
２．最初の工程としてのタウロリジンによる酸化ストレスの誘導は、グルタチオン又はＮ－アセチルシステイン等の還元剤の添加によってタウロリジンの抗腫瘍作用を妨げることができるという知見により支持される。
３．高いＲＯＳによって腫瘍細胞のミトコンドリアにもたらされた傷害は、それらの膜電位の喪失及びアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出を結果として生じる。
４．ＡＩＦは核に移動させられ、アポトーシス促進性遺伝子の発現を開始し、アポトーシスの目印として原形質膜の泡状突起（blebbing）を生じ、染色質凝縮及びＤＮＡ切断を生じる。
５．正常細胞とは対照的に、腫瘍細胞は酸化ストレスに非常に敏感である。これは、正常細胞を傷つけない、広範囲の腫瘍細胞に対するタウロリジンの作用を説明する。

また、本発明の化合物は、或る特定の実施形態では、ヒト患者等の被験体における微生物感染症の治療に有用である。或る特定の実施形態に従って治療され得る微生物感染症として、細菌感染症、真菌感染症、及び／又は、ウイルス感染症が挙げられる。

癌患者は易感染性の傾向があり、特に手術中及び／又は手術後に微生物感染症に、特にかかりやすくなる。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体の膠芽腫を治療するために利用する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体のＳ．アウレウス（S. aureus：黄色ブドウ球菌）感染症を治療するために利用する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体のＭＲＳＡを処理するため本発明に従って利用する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体のＥ．コリ（E. coli：大腸菌）を処理するため本発明に従って利用する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体のＨ．ピロリ（H. pylori：ピロリ菌）を処理するため、及び／又は被験体のＨ．ピロリと関連する癌（複数の場合がある）を治療するため、本発明に従って利用する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、被験体のＨＩＶを処理するため本発明に従って利用する。

或る特定の実施形態では、式Ｉ：

（式中、Ｒは、Ｈ、アルキル等、例えばメチル、エチル、プロピル（例えばイソプロピル）、ベンジル等である）による化合物を本発明に従って利用する。

或る特定の実施形態では、新たな化合物２２５０（テトラヒドロ１，４，５－オキサチアジン－４－ジオキシド又は１，４，５－オキサチアザン－４－ジオキシド）は、本発明に従って調製され、及び／又は利用される。本発明に従って作製された化合物２２５０に対するＦＴＩＲスペクトルを図８に示す。

或る特定の実施形態では、新たな化合物２２４５は、本発明に従って調製され、及び／又は利用される。

化合物２２５０は、Ｈ．ピロリによって引き起こされる若しくはそれと関連する腫瘍を含む胃腫瘍、又は胃への転移の結果としての腫瘍を予防及び治療する。

必要とされる化合物の量は、腫瘍サイズに依存する。一実施形態では、本発明は、外科的に腫瘍サイズを減少させ、１以上の上記化合物で処理することを含む。上記化合物は、腫瘍を減少させるため手術の前、手術中、又は手術後に投与されてもよい。本発明による化合物は、限定されないが、ゲル剤、カプセル剤、錠剤、静脈内注射（IV）、腹腔内注射（IP）を含む任意の好適な方法によって、及び／又は腫瘍に直接に投与されてもよい。

ゲル剤は、例えば２％～４％（例えば３％）の化合物２２５０等の本発明の活性化合物を単独で含んでもよく、又は単独で投与若しくは存在してもよいタウロリジン／タウルルタムと組み合わされて含んでもよく、また局所投与用であってもよい。かかるゲル剤を、口及び皮膚の扁平上皮細胞腫瘍を含む皮膚及び口の腫瘍を治療するために使用することができる。また、かかるゲル剤を、膣に対して坐剤で、又はシリンジにより投与することによって子宮頸癌又は子宮頚部異形成を治療するために使用することができる。本発明は、活性化合物を保持する坐剤の組み合わせを含んでいてもよい。

経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、提供される組成物は少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は充填剤又は増量剤（例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及びケイ酸）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアカシア）、保湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えばアガー、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、アルギン酸、或る特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えばカオリン及びベントナイトクレイ）、及び滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール固体、ラウリル硫酸ナトリウム）、並びにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合、その剤形は緩衝剤を含んでいてもよい。

本開示の化合物、特に化合物２２５０は、非常に水に溶けやすいことがわかった。或る特定の実施形態では、溶解度を増加させるのにＰＶＰは必要ではない。例えば、３．２％の溶液２２５０は等張である。これはタウロリジンに対する予想外の利点である。

化合物２２５０等の本発明の化合物（タウロリジン及び／又はタウルルタムの有無にかかわらず）は、該化合物が創傷治癒を妨げないことから、外科的腫瘍学に特に有用である。他のかかる抗腫瘍薬が創傷治癒を妨げ、縫合不全を促進することから、他の抗腫瘍薬の投与は、手術後５週間以上まで遅らせなければならない。かかる問題は、創傷治癒の問題又は縫合不全の問題を伴わずに、手術中及び手術直後に投与することができる、化合物２２５０等の本発明の化合物によって回避され得る。

同様のタイプの固体組成物を、高分子量ポリエチレングリコール等と同様にラクトース、すなわち乳糖等の賦形剤を使用する軟ゼラチンカプセル及び／又は硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として採用してもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、及び顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング剤及び薬学的製剤化技術においてよく知られている他のコーティング剤等のコーティング剤及びシェルを用いて作製することができる。上記コーティング剤は任意に乳白剤を含んでもよく、腸管の或る特定の部分において、任意に遅延して提供される組成物（複数の場合がある）のみを放出するか、又は該組成物を優先的に放出する組成物であってもよい。使用可能な包埋組成物の例として高分子物質及びワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物を、高分子量ポリエチレングリコール等と同様にラクトース、すなわち乳糖等の賦形剤を使用する軟ゼラチンカプセル及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として採用してもよい。

或る特定の実施形態では、カプセル剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ゼラチン及び魚ゼラチンの１以上を含む賦形剤処方を含んでいてもよい。或る特定の実施形態では、カプセル剤はタウロリジン及び／又はタウルルタムとともに化合物２２５０を含有していてもよい。カプセル剤はリコピン、エラグ酸（ポリフェノール）、クルクミン、ピペリン、デルフィニジン、レスベラトロール、イソチオシアン酸塩、例えばスルホラファン、カプサイシン、及びピペルロングミンの１種以上を更に含有することができる。

化合物２２５０等の本発明の活性化合物を、ゲムシタビン等の化合物と組み合わせてもよい。この組み合わせを、膵癌等の癌を治療するために使用することができる。また、タウロリジン及び／又はタウルルタムを、例えば膵癌を治療するためゲムシタビンと組み合わせてもよい。

或る実施形態では、栄養学上の癌の予防及び治療の製品は、１００ｍｇ～５００ｍｇの化合物２２５０を単独で、又は１００ｍｇ～５００ｍｇのタウロリジン及び／又はタウルルタムと、また１以上のリコピン、例えば２０ｍｇ～２００ｍｇのエラグ酸（ポリフェノール）、クルクミン、ピペリン（２０ｍｇ～２００ｍｇ）、デルフィニジン、レスベラトロール、イソチオシアネート（スルホラファン、カプサイシン、及びピペルロングミン）と組み合わせて含んでもよい。

予想外なことに、上記化合物が他の化学療法剤のように創傷治癒を阻害しないことから、手術中及び手術直後に上記化合物を投与することができる可能性があることがわかった。

予想外なことに、タウロリジン、タウルルタム、並びにオキサチアジン様化合物及びその誘導体が腫瘍幹細胞を死滅させることがわかり、それは化学療法剤のなかでも非常にまれであり、おそらく知られていない。典型的な化学療法剤は、腫瘍幹細胞に対して有効である場合、一般的にはヒト患者に極めて有毒である非常に高用量でのみ有効である。

予想外なことに、腫瘍細胞を死滅させるため必要とされるよりも低用量のタウロリジン及び／又はタウルルタムが腫瘍幹細胞を死滅させたことがわかった。

予想外なことに、オキサチアジン様化合物及びその誘導体が、タウロリジン及びタウルルタムの半減期よりも著しく長いヒト血液中における半減期を有することがわかった。したがって、これらの化合物は、患者の血流からそれほど急速に取り除かれず、その結果として、身体のクリアランス機構によって引き起こされる薬効の喪失を効果的に遅らせる。

予想外なことに、或る特定のオキサチアジン様化合物及びその誘導体が、組織へ直接適用された場合、灼熱感を減少し、これはタウロリジンで処理された患者でこの作用が観察されたのとは異なっていることがわかった。

予想外なことに、オキサチアジン様化合物及びその誘導体が、高い水溶性、経口及び静脈内注射（i.v.）を含む幅広い投与経路、延長された安定性及び半減期、並びに灼熱感の副作用の減少を含む、特に有利な特性の組み合わせを有することがわかった。

このように、化合物２２５０の半減期は、ヒト血液中で２４時間超であり、同じ試験を使用して約３０分間であることが分かったタウロリジンの半減期より著しく長い。

一実施形態では、本発明は、投与の約５分以内に化合物２２５０のベースライン血中濃度をもたらす、患者に化合物２２５０を投与することによって患者を治療することを含む。上記方法は、患者における化合物２２５０の血中濃度を約２０時間に亘ってベースライン血中濃度の約８０％に維持することを含む。

一実施形態では、本発明は、血中濃度をベースライン血中濃度の８０％に維持するため、化合物２２５０の１日投与量を毎日１回投与することによって、患者における抗腫瘍化合物の血中濃度を約２０時間に亘って患者のベースライン血中濃度の約８０％に維持することを含む。

１日投与量は、約０．１ｇ～約１００ｇ、例えば約５ｇ～約３０ｇであってもよい。１日投与量は、経口投与可能な組成物の形態で投与されてもよい。１日投与量は、カプセル剤、錠剤、又は薬学的に許容可能な溶液の形態で投与されてもよい。１日投与量は、約０．０１重量／体積％～約３重量／体積％の濃度で化合物２２５０を含む形態で投与されてもよい。１日投与量は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌの濃度で化合物２２５０を含む形態で投与されてもよい。１日投与量は、１以上の可溶化剤、例えば多価アルコールを含む形態で投与されてもよい。

或る実施形態では、上記化合物は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌの濃度で組成物において投与される。或る実施形態では、上記化合物は、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度で組成物において投与される。或る実施形態では、上記化合物は、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの濃度で組成物において投与される。また、上記組成物は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、又は約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌのタウロリジン及び／又はタウルルタムを含んでもよい。

或る実施形態では、上記化合物は約０．０１％～約３％の濃度で組成物において投与される。或る実施形態では、上記化合物は約０．１％～約２．５％の濃度で組成物において投与される。或る実施形態では、上記化合物は約１％～約２％の濃度で組成物において投与される。上記組成物は、約０．０１％～約３％、約０．１％～約２．５％、又は約１％～約２％のタウロリジン及び／又はタウルルタムを更に含んでもよい。

一実施形態では、オキサチアジン様化合物及びその誘導体は、腫瘍幹細胞を死滅させるためタウロリジン及び／又はタウルルタムを用いる併用療法として投与されてもよい。かかる実施形態によれば、予想外なことに、併用療法は、腫瘍幹細胞を死滅させるため、通常の腫瘍細胞を死滅させるのに必要とされるよりも低用量の薬物を必要とすることがわかった。

或る特定の実施形態では、オキサチアジン様化合物及びその誘導体は、該化合物の抗腫瘍効果の増加をもたらすビタミンＤ３と共に投与されてもよい。

一実施形態では、上記化合物は、約０．１ｇ～約１００ｇ、約１ｇ～約８０ｇ、約２ｇ～約５０ｇ、又は約５ｇ～約３０ｇの総１日投与量で被験体に投与される。

上記化合物の有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり１５０ｍｇ／ｋｇ～４５０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり３００ｍｇ／ｋｇ～４５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与単位である。

本明細書で使用されるように、純粋の用語は、不純物及び汚染物質について少なくとも約８０％純粋な物質を指す。或る実施形態では、純粋の用語は、不純物及び汚染物質について少なくとも約９０％純粋な物質を指す。或る特定の実施形態では、純粋の用語は、不純物及び汚染物質について少なくとも約９５％純粋な物質を指す。或る実施形態では、純粋の用語は、不純物及び汚染物質について少なくとも約９９％純粋な物質を指す。或る実施形態では、純粋の用語は、不純物及び汚染物質について少なくとも約９９．５％純粋な物質を指す。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物、組成物及び方法は、微粒子化された化合物の使用を包含する。或る実施形態では、本明細書で使用される「微粒子化」の用語は、約０．００５ミクロン～１００ミクロンの範囲の粒子径を指す。或る特定の実施形態では、本明細書で使用される「微粒子化」の用語は、約０．５ミクロン～５０ミクロンの範囲の粒子径を指す。或る特定の実施形態では、本明細書で使用される「微粒子化」の用語は、約１ミクロン～２５ミクロンの範囲の粒子径を指す。例えば、薬物粒子のサイズは、約１ミクロン、５ミクロン、１０ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、又は２５ミクロンであってもよい。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物、組成物及び方法は、ナノ粒子の使用を包含する。本明細書で使用される「ナノ粒子」の用語は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する任意の粒子を指す。或る実施形態では、ナノ粒子は３００ｎｍ未満の直径を有する。或る実施形態では、ナノ粒子は１００ｎｍ未満の直径を有する。或る実施形態では、ナノ粒子は５０ｎｍ未満、例えば約１ｎｍ～５０ｎｍの直径を有する。注射又は点滴に適した製剤は、化合物濃度が増加した溶液を提供するために、１以上の可溶化剤、例えばグルコース等の多価アルコールを含む等張液を含んでもよい。かかる溶液は、欧州特許第２５３６６２号に記載されている。上記溶液は、リンゲル溶液又はリンゲル乳酸塩溶液によって等張性を付与されてもよい。かかる溶液中の化合物の濃度は、１ｇ／リットル～６０ｇ／リットルの範囲であってもよい。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物の作製に対する例示的な化合物及び方法として、以下が挙げられる。

上記化合物は、結晶形態、例えば結晶化の後、及び／又は、アルコール、ケトン、エステル又はそれらの組み合わせにおける再結晶の後であってもよい。例えば、本発明の化合物は、結晶化されてもよく及び／又はエタノール等のアルコールから再結晶されてもよい。

本発明の例示的な化合物として以下が挙げられる。

ナノ粒子の形態で使用される場合、本発明の化合物はより高い血液レベルを達成することがわかった。一実施形態では、本発明は、化合物２２５０を単独で、又はタウロリジン及び／又はタウルルタムと組み合わせて含む。例えば、本発明は、カプセルに封入された本発明の化合物のナノ粒子を含む。

或る特定の実施形態では、また本発明は上記化合物の本明細書に記載される活性を、例えば上記活性の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％以上有する、上記の化合物の誘導体に関する。

或る特定の実施形態では、また本発明は、上記化合物の薬学的に許容可能な溶液を含む、本明細書に記載される化合物を含む組成物、及び上記組成物を含むカプセル剤及び錠剤等の経口投与可能な組成物に関する。

或る特定の実施形態では、本発明の化合物を、任意の好適な手段により、例えば溶液で、例えば点滴静注等によって、局所的に、全身的に被験体又は患者に投与することができる。

出発物質：
イセチオン酸、
特に硫酸カルビル（Carbylsulfat）、タウリン、タウリンアミド、
システイン、イセチオン酸

合成１
Ｉ．
ａ．硫酸カルビルを介したイセチオン酸

ｂ．タウリンを介したイセチオン酸
システイン、タウリンを介した生合成

化学合成
重亜硫酸塩を用いたエチレンオキシド

ＩＩ．イセチオン酸アミド（Isethionic Amide）ＨＯ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＳＯ_２－ＮＨ_２
ａ．

ｂ．硫酸カルビル＋ＮＨ_３

２２５０の代替可能な化学合成工程
ａ）スルファミン酸

ｂ）パラホルムアルデヒド、ヘキサメチレンテトラミン（ヘキサミン、ホルミン、ウロトロピン）

ｃ）

ｄ）

ｅ）

ｆ）

ｇ）

ｈ）

２２５０及び２２５５の幾つかの代わりの合成工程
Ｉ．出発物質２２５０／２２５５
ａ．

ｂ．硫酸カルビル＋Ｈ_２Ｏ

エチレンオキシド＋亜硫酸水素ナトリウムからのイセチオン酸ナトリウムの合成

ＩＩ．アミンと硫酸カルビルとの反応

ＩＩＩ．

例示的な合成プロトコル
Ｉ．２２４４の合成

２．１５ｇの純粋な１９０７を１００ｍｌの酢酸エチルエステルに溶解し、０．５ｇのパラジウム／活性炭を使用して触媒した。その溶液を、室温及び大気圧で水素化した。水素化を約１５時間後に完了し、水素の吸収量は４５０ｍｌであった。

水素化を各回窒素で３回排気した後、濾過助剤（ケイ藻土）を通して反応混合物を濾過した。無色透明の酢酸エチル溶液をロータリーエバポレータで濃縮乾固させた。
収量：１．２５ｇ、結晶化した２２４４により接種した（innoculated）。
融点：４２℃～４４℃
ＩＲ：２２４４に対応し、９９．３％純粋。

ＩＩ．２２４４の合成

５ｇ（０．０２３ｍｏｌ）の２２６４／１９０７を、還流下で３時間に亘って５０ｍｌの濃ＨＣｌ中で沸騰させた後、室温まで冷却させて、分液漏斗において３０ｍｌのジクロロメタンで分離した。水相をロータリーエバポレータで蒸発させ、乾燥させた。黄色の油が残り、２２４４結晶を用いて接種した後、ゆっくりと結晶化した。
ＩＲは物質２２４４に相当する。
酢酸エチルから再結晶化した。
０．７ｇを得た（２４％）。
融点：４４℃～４５℃
ＩＲは参照物質に相当する。

ＩＩＩ．２２４４の合成

（式中、Ｐｈはフェニル基である）

２３０ｍｇの２２６９を２ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）に溶解し、１５分間還流凝縮器で沸騰させて還流させた。透明な溶液を２０℃に冷却し、塩酸で酸性化した。得られた沈殿を真空下で濾過し、乾燥させた。
収量：１１０ｍｇ
融点：１１４℃～１１６℃。
ＩＲは、副生成物として９９％の安息香酸を示した。

酸性溶液をロータリーエバポレータ上で濃縮乾固し、固体を酢酸エステルと共に沸騰させた。酢酸エチル溶液を濾過し、真空下で濃縮乾固した。
重量：１１０ｍｇ。油は油で汚染され、２２４４（イセチオン酸アミド）に対するＩＲピークは不明瞭であった。
１１０ｍｇを酢酸エステルから再結晶化した。
収量：６５ｍｇ、融点：４３℃～４５℃
ＩＲは５２％の２２４４に相当した。

ＩＶ．２２４４の合成

（式中、Ｐｈはフェニル基である）

１．１５ｇの２２６９を、１０ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）に溶解し、１５分間沸騰させて還流させた。透明な溶液を２０℃に冷却し、塩酸で酸性化した。得られた沈殿を真空下で濾過し、乾燥させた。
収量：０．５ｍｇ
融点：１１４℃～１１６℃
ＩＲは、対照物質としての８２％の安息香酸副生成物を示した。加水分解は完了していない。

酸性溶液をロータリーエバポレータ上で濃縮乾固し、固体を酢酸エステルと共に沸騰させた。酢酸エチル溶液を濾過し、真空下で濃縮乾固した。
重量：０．８ｇ。油は油で汚染され、２２４４（イセチオン酸アミド）に対するＩＲピークは不明瞭であった。
０．８ｇを酢酸エステルから再結晶化した。
収量：１６０ｍｇ、融点：４３℃～４５℃
ＩＲは２６％の２２４４に相当した。

Ｖ．２２４４の合成

２１５ｇの０．１ｍｏｌ ２２６４及び１０００ｍｌの濃塩酸（約３６％）を還流下で３０分間、共に沸騰させた。２２６４は溶解し、油層が存在した。反応混合物を冷却し、分液漏斗に移し、そこで水相から油を分離した。イセチオン酸アミド（２２４４）を溶解させる酸性水溶液を、ほぼ乾燥するまでロータリーエバポレータで５０℃にて濃縮した。黄色の油性残渣を一晩冷蔵庫に入れ、３２．３ｇの透明な結晶を真空下で濾過した。融点４３℃～４５℃。
ＩＲ：酸素中、図７に示されるように次の波数、６５５．８２ｃｍ^－１、７２９．１２ｃｍ^－１、８４４．８５ｃｍ^－１、８９８．８６ｃｍ^－１、９４７．０８ｃｍ^－１、１００３．０２ｃｍ^－１、１０６０．８８ｃｍ^－１、１１３４．１８ｃｍ^－１、１２３６．４１ｃｍ^－１、１２８８．４９ｃｍ^－１、１３１７．４３ｃｍ^－１、１４０８．０８ｃｍ^－１、１５７２．０４ｃｍ^－１、３１０５．５ｃｍ^－１、３２０９．６６ｃｍ^－１、３３１３．８２ｃｍ^－１、及び３４２７．６２ｃｍ^－１にピークを有する。

母液を完全に乾燥するまで濃縮した。

ＶＩ．２２４４の合成

２１．５ｇの０．１ｍｏｌ ２２６４及び１００ｍｌの濃塩酸（約３６％）を、還流下で３０分間、共に沸騰させた。油層が形成され、分液漏斗において反応混合物を冷却し、そこで水相から油を分離した。イセチオン酸アミド（２２４４）が溶解された酸性水溶液を塩化メチレンと共に２回振蕩し、塩化メチレンを分離し、酸性水溶液を５０℃にてロータリーエバポレータで濃縮乾固した。黄色の油性残渣を一晩冷蔵庫に入れ、１２．３ｇの油を得た。融点：４１℃～４３℃。生成物の分析は、ＩＲによって２２４４に９９．８％相当することを示した。

蒸留実験：
１２．３ｇを高真空下で蒸留した。
外部温度 内部温度 真空
１９０℃～２１０℃ １８３℃～１８６℃ ０．１ｍｍ
重量：室温で固体であった９．３ｇの油。融点：４３℃～４５℃。

ＶＩＩ．２２４４の合成

２．０ｇの純粋な化合物１９０７を２００ｍｌの酢酸エステルに溶解し、０．５ｇのパラジウム／活性炭を添加し、該混合物を１００℃でオートクレーブして、５０℃で水素化した。６時間の実行時間の後、反応混合物を一晩冷却し、その後、濾過して真空下で濃縮乾固した。

重量：１．７ｇの油－ＣＨ_２Ｃｌ_２の添加及び振蕩の後、放置し、－その後、吸引濾過して重量：０．６ｇ、融点約４０℃を有する結晶性固体を得た。
分析のため、０．２ｇの酢酸エステルを２回添加して結晶化させた。融点 ４３℃～４４℃。

ＶＩＩＩ．２２４４の合成

２．１５ｇの純粋な１９０７を１００ｍｌの酢酸－エチルエステルに溶解した後、０．５ｇのパラジウム／活性炭に添加した。その後、該混合物を室温及び大気圧で水素化した。水素化をおよそ１５時間後に終了した。水素の吸収量はおよそ４５０ｍｌであった。その後、水素を窒素で３回排気し、流した（flushed）後、各反応混合物をケイ藻土（セライト）を通して濾過した。無色透明の溶液である酢酸エチルを、ロータリーエバポレータで蒸発乾固させた。

重量：２２４４の結晶を用いて接種した後、結晶化した１．２５ｇの油。
融点：４２℃～４４℃
ＩＲ：９９．３％の２２４４に相当する。

ＩＸ．２２５０の合成

１．２ｇの純粋な２２４５を、６０℃で完全に溶解する１５０ｍｌの酢酸に溶解した。０．３ｇのパラジウム／活性炭を添加し、７５℃で撹拌し、該混合物を大気圧で水素化した。

水素化を７日後に停止した。水素の吸着量はおよそ４８０ｍｌであった。

水素を窒素で３回排気してパージした。その後、７０℃で濾過助剤（ケイ藻土）を通して反応混合物を濾過した。透明で温かい氷酢酸溶液を室温まで冷却し、白色結晶を吸引濾過した。
重量：０．７４ｇ、融点：２２５℃～２２７℃
ＩＲ：２２４５は出発原料に相当する。

母液をロータリーエバポレータで濃縮乾固した。
重量：０．３８ｇの不純な材料を酢酸エチルで抽出した。該溶液を濃縮した。

酢酸エチル可溶性部分：昇華によって得られた半固体物質；数滴の水から再結晶して得られた０．１５ｇの半固体物質
収量：７０ｍｇ、融点：９５℃～９８℃
ＩＲは９８％の２２５０に相当した。

Ｘ．高収率の２－ベンジルエーテルエタンスルホン酸ナトリウムの１段階合成

１０．５ｇの２－ブロモエタンスルホン酸ナトリウムを、１１０ｍｌのベンジルアルコール及び１．１５ｇのナトリウムベンジルオキシドの溶液に添加した。

その後、混合物を還流下で４回沸騰させた。その後、該混合物を真空下で濃縮乾固した後、エチルアルコールと共に３回沸騰させた。アルコールを濾過し、濃縮乾固した。

収量は９．８ｇであり、ＵＶ及びＩＲによって確認された。

得られたエチルアルコール中の２－ベンジルエーテルエタンスルホン酸ナトリウムを沸騰させ、濾過した後、該溶液を冷却して溶液から純粋な２－ベンジルエーテルエタンスルホン酸ナトリウム結晶を結晶化させることによって純結晶を得た。

ＸＩ．２２５０の合成

６．３ｇのビニルスルホンアミド（２２５８由来）、５０ｍｌの濃ギ酸、及び１．１ｇのパラホルムアルデヒドを、還流しながら２時間に亘って化合させて化合物２２５０を産生した。その後、透明な酸性溶液をロータリーエバポレータで濃縮乾固した。

残渣は、５．９ｇの淡黄色のハチミツ様のシロップである。
ＩＲ：ビニルスルホンアミドと２２５０との混合物
２グラムを昇華させ、僅かな結晶を得た。
半固体物質の昇華：ＩＲ：９８％の２２５０に対応する。

ＸＩＩ．ビニルスルホンアミドの合成

ホルミルイセチオン酸塩化物を５０ｍｌのクロロホルムに入れ、３５０ｍｌのスルホン化フラスコに入れて－１０℃まで冷却した。その後、２５％のアンモニアガスを導入した。アンモニアガスの導入後、クロロホルム／ＮＨ_３の重量は５ｇであることがわかった。－３℃から２℃まで、上記混合物をゆっくり撹拌した。

９．０ｇの蒸留した２２４９に２０ｍｌのクロロホルムを滴加した。ＮＨ_４Ｃｌが直ちに沈殿した。その後、塩化アンモニウムを真空下で濾過し、透明なクロロホルム溶液を乾燥するまでロータリーエバポレータで濃縮した。
収量：６．３ｇの透明で薄い油。
ＩＲ：９６％のＣＨ_２＝ＣＨ－ＳＯ_２－ＮＨ_２（ビニルスルホンアミド）に対応する。

ＸＩＩＩ．２２６１の合成

３００ｇ（１．２６ｍｏｌ）の２２６０を、ＫＰＧ撹拌機を備える７５０ｍｌの多頸フラスコに計量した。４１５ｍｌのトリクロロエチレン＋オキシ塩化リン（密度は１０％のＰＯＣｌ_３中約１．４７に相当する）、並びに１５０ｍｌのオキシ塩化リン及び５．７ｍｌのＤＭＦを撹拌しながら１０５℃まで温めた。該混合物を５時間反応させた。

固体を真空によって濾過し、液体を水ポンプ真空下で蒸留した。濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄した。トリクロロエチレン及びオキシ塩化リンを蒸留して取り除いた後、洗浄－アセテートをフラスコへ移し、再度蒸留した。

２５０ｇ（１．０７ｍｏｌ－８５％）の黄色の液体を収集した。ＩＲは２２６１に相当する。

ＸＩＶ．２２５０及び２２５５の合成：

ＸＶ．化合物２２５０及び関連の化合物の新たな合成スキーム：
出発物質：

化合物（テトラヒドロ－オキサチアジン－ジオキシド）：

化学中間体
保護基：塩化ベンジル

保護基：クロロギ酸ベンジル

ＸＶＩ．前駆体化合物の合成

合成：
８３．９ｇのビニルスルホン酸ナトリウムを４００ｍｌのベンジルアルコールの溶液に添加し、０．５ｇのナトリウム（触媒量）を添加した。該混合物を撹拌しながら１５０℃まで温め、大半のビニルスルホン酸ナトリウムが溶液に溶解した。３時間後、上記混合物を一晩冷却し、厚い固体（thick solid）が結晶化した。この固体を真空濾過した後、エチルアルコール中に懸濁し、真空濾過して乾燥させた。
収量：９４．０ｇ、ＩＲ：所望の化合物（６１．２％純粋）に相当する。

ＸＶＩＩ．１９０５の合成

６０グラムのビニルスルホン酸ナトリウムを、１０００ｍｌのベンジルアルコール及び０．５ｇのナトリウムの溶液に添加した。その後、全混合物を還流下で撹拌し、加熱した。およそ３時間後、過剰量のベンジルアルコールを真空によって蒸留して除去し、残りをアルコールと共に沸騰させた。アルコール溶液を濾過し、濃縮し、約１／２まで結晶化した。３７．３ｇの黄色の綿花様物質が得られた。

また、上記手順を２５０ｇのビニルスルホン酸ナトリウム及び２リットルのベンジルアルコールを用いて繰り返し、上記の通り処理し、約２０８ｇを結晶化した。

また、上記手順を１００ｇのビニルスルホン酸ナトリウム及び１リットルのベンジルアルコールを用いて繰り返し、上記の通り処理し、約１０５ｇを結晶化した。

また、上記手順を２００ｇのビニルスルホン酸ナトリウムを用いて繰り返し、上記の通り処理し、約１３０ｇを結晶化した。

ＸＶＩＩＩ．１９０６の合成

６．７ｇの１９０５（再結晶化）を５０ｍｌの塩化チオニル及び１ｍｌのジメチルホルムアミドに添加した。ナトリウム塩は直ちに溶解し、該混合物を４０℃～５０℃に加熱し、２０℃で一晩放置し、濃縮されるまで真空にした（vacuumed）。収量：９．８ｇ、それを５０ｍｌのＮａＯＨ ２Ｎに添加して、十分撹拌した。ＮａＯＨ溶液をＣＨＣｌ_３で洗浄した後、濃ＨＣｌと共に振蕩して沈殿させ、Ｎａ_２ＳＯ_４で捕捉した後、乾燥して蒸留した。

上記プロセスを、１０００ｍｌの塩化チオニル及び１０ｍｌのジメチルホルムアミドと混合した２０８ｇの１９０５を用いて繰り返した。上記混合物を還流し、過剰量の塩化チオニルを乾燥するまで蒸留して取り除いた。収量は２５０ｇであり、上記のように処理した。

ＸＩＸ．１９０７の合成

９．８ｇの１９０６をクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）（混濁）に溶解し、１５０ｍｌの濃アンモニア水の一部に濃縮して、撹拌した。撹拌を４０℃～５０℃に加熱しながら、３時間継続した。その後、該混合物を真空下で乾燥し、濃縮した。
収量：３．１ｇの黒っぽい油

３．１ｇの黒っぽい油を５０ｍｌのＮａＯＨ ２Ｎに添加し、十分撹拌した。ＮａＯＨ溶液をＣＨＣｌ_３で洗浄した後、濃ＨＣｌと共に振蕩して沈殿させ、Ｎａ_２ＳＯ_４で捕捉した後、乾燥し、蒸留した。収量：２．５ｇの油

分析のため、０．５ｇの試料を１６０℃の温度で濃縮して固体とし、酢酸エチル／ベンゼンから３回結晶化した。
融点：７５℃～７６℃
分子式：Ｃ_９Ｈ_１３ＮＯ_３Ｓ
ＭＷ：２１５．２
算出値：Ｃ＝５０．２３％、Ｈ＝６．０９％、Ｎ＝６．５１％、Ｓ＝１４．８６％
実測値：Ｃ＝５０．１４％、Ｈ＝６．１５％、Ｎ＝６．３５％、Ｓ＝１４．７９％

ＸＸ．１９０８の合成

１．２ｇの１９０７を２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、０．４ｇのＰｄ活性炭を添加した。該混合物を４時間に亘って１００℃及び５０℃で水素化オートクレーブ（hydrogenated autoclave）において水素化した。該混合物を室温にて週末の間、圧力下で放置した。その後、酢酸エチル溶液を濾過し、真空下で乾燥させた。
収量：１．１ｇの油。

ＸＸＩ．１９０８の合成

２グラムの１９０７を２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、０．５ｇのＰｄ／パラジウム／活性炭を添加した。該混合物を１００℃及び５０℃で高圧オートクレーブにおいて水素化した。６時間後に、該反応混合物を一晩冷ました後、濾過して、残油に乾燥するまで真空下で蒸留させた。
収量：１．７ｇの油。
ＣＨ_２Ｃｌ_２を添加し、撹拌して放置し、結晶化させ、真空下で吸引により分離した。
重量：０．６ｇ、融点約４０℃。
分析：
酢酸エチルから０．２ｇを２回再結晶化した。
融点：４３℃～４４℃
分子式：Ｃ_２Ｈ_７ＮＯ_３Ｓ
ＭＷ：１２５
算出値：Ｃ＝１９．２２％、Ｈ＝５．６５％、Ｎ＝１１．２１％、Ｓ＝２５．６５％
実測値：Ｃ＝１９．２０％、Ｈ＝５．６７％、Ｎ＝１１．０７％、Ｓ＝２５．７３％

ＸＸＩＩ．１９０９の合成
１９．９グラムの１９０６を１００ｍｌのクロロホルムに溶解し、２３グラムの純粋なベンジルアミン及び２００ｍｌの純粋なクロロホルムの溶液に添加した。直ちに、ベンジルアミン塩酸塩が沈殿し、反応混合物は温かくなった。その後、該混合物を還流し、塩酸塩化合物を吸引によって分離して、透明なＣＨＣｌ_３母液を乾燥のため真空に置いた。

収量：ゆっくりと固体になった２７ｇの黄色の透明の油。

その２７ｇを約２０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、該溶液がほぼ混濁するようにＮ－ヘキサン（適量）を添加した。該混合物を冷却しながら一晩放置すると、結晶化した。
収量：９．２ｇ、融点：５０℃～５３℃

分析のため、ｎ－ヘキサン中１ｇを３回再結晶化した。融点５６℃～５７℃。

ＸＸＩＩＩ．２２６０の合成

０．６７５ｍｏｌのイセチオン酸ナトリウム塩（１００．０ｇ）及び２．０２ｍｏｌの塩化ベンジル（２３３ｍＬ）を、ＫＰＧ撹拌機を備えた７５０ｍＬの多頸フラスコにおいて混合した。上記混合物を、７０℃の内部温度（９５℃の外部温度）で加熱した後、トリエチルアミン（１２０ｍＬ）を１時間に亘って滴加して、外部温度を１２５℃まで上昇させ、維持した。その後、外部温度は１４０℃まで上昇し、内部温度は１３０℃まで上昇した。固体が撹拌機に密集したが、懸濁液へと戻った。塩酸の蒸気が発生した。

３０ｍＬのトリエチルアミンを滴加した後、更に１．５時間反応させた。粘着性の黄色がかった懸濁液を形成した。生成物を内部温度５０℃まで冷却した後、３００ｍＬの水を添加し、２０分間激しく撹拌して、該混合物を２Ｌの分液漏斗に移した。その後、フラスコを１００ｍＬの水で濯いだ。

合わせた水相を、２８０ｍＬのジクロロメタンで２回洗浄した。

水相を、該溶液が飽和されるまで、ＫＣｌ（約１３０ｇのＫＣｌ）を添加する間、４０℃に保持した。襞付き濾紙を通して該混合物を濾過し、冷蔵庫に一晩保存した。

残った固体を抽出し、乾燥して３０．８５ｇ、収率１７．９％を得た。
ＩＲ：前駆物質に類似するＯＨバンドが存在する。

母液をＫＣｌで再び処理し、一晩冷蔵庫（３５℃～４０℃）に保存した。

ＫＣｌによる２回目の沈澱に由来する固体を濾過して乾燥させ、６０．０ｇ＝３４．９％を生じ、ＩＲは所望の生成物に相当する。

固体１：１５０ｍＬのＥｔＯＨと共に沸騰させ、熱い間に濾過した。

ＫＣｌによる沈澱、沸騰及び結晶の繰り返しによって、３２ｇの生成物を１９％の収率で得た。

ＸＸＩＶ．２２５６の合成

それ以上気体が生成しなくなるまで、４０ｇの塩酸タウリンアミド、１８ｇの亜硝酸ナトリウム及び３００ｍｌの蒸留水を、還流下で共に沸騰させた。その後、透明な黄色の溶液を５０℃まで冷却した。

３０ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを、１０．５ｇのアセトアルデヒドに添加した。透明な黄色の溶液を週末真空下に放置し乾燥させた。結果は、重さ３７．６ｇの赤さび色のハチミツのような残渣であり、それをエチルアルコールで抽出した。アルコール溶液を濾過し、ロータリーエバポレータで濃縮乾固させた。得られた濃厚な油の残渣を、酢酸エチルで溶解させた。酢酸エチル溶液を濾過し、濃縮した。

これは、３０．７ｇのさびのような色の密度の高い油を生じた。その密度の高い油から白色結晶を単離した。融点は約１１４℃～１１６℃である。

ＩＲスペクトルは、得られた化合物が化合物２２５６の構造を有していることを確認した。

或る特定の実施形態では、当該技術分野で知られている実験用ガラス器具を備える昇華装置を、本発明による化合物を精製するための昇華技術において使用してもよい。或る特定の実施形態では、昇華容器を、真空下、及び減圧下で加熱する。化合物は、揮発し、不揮発性の残留不純物を残して、冷却された表面上に精製された化合物として凝結する。この冷却された表面は、しばしばコールドフィンガの形態をとる。加熱が終わり、真空が解放された後、昇華した化合物を冷却された表面から収集することができる。

一実施形態では、化合物２２５０の置換誘導体を作製してもよい。化合物２２５０の置換誘導体として、以下が挙げられる。

上記式中、Ｒは、Ｈ又はアルキル又はアリールであり得る。或る特定の実施形態では、ＲはＣ_１～Ｃ_６アルキルである。或る特定の実施形態では、Ｒはメチルである。

或る特定の実施形態では、化合物２２５０の誘導体は以下の反応機構に従って作製される。

一実施形態では、本開示は、腫瘍幹細胞を死滅させるのに有効な量のタウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物を、それを必要とする被験体に投与することによって腫瘍幹細胞を死滅させる方法を含む。腫瘍幹細胞を死滅させるのに有効な量のタウロリジン及び／又はタウルルタムは、腫瘍細胞を死滅させるのに必要なタウロリジン及び／又はタウルルタムの量よりも少ない。

或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約０．０１μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度で腫瘍幹細胞死滅組成物において投与される。或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約０．１μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度で腫瘍幹細胞死滅組成物において投与される。或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約１０μｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの濃度で腫瘍幹細胞死滅有効組成物において投与される。タウロリジンは、０．０１μｇ／ｍｌでｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織培養における腫瘍幹細胞の死滅に有効である。

或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約０．００１％～約２％の濃度で腫瘍幹細胞死滅組成物において投与される。或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約０．０１％～約１．５％の濃度で腫瘍幹細胞死滅組成物において投与される。或る実施形態では、タウロリジン、タウルルタム又はそれらの混合物は、約０．１％～約１％の濃度で腫瘍幹細胞死滅有効組成物において投与される。

一実施形態では、タウロリジン、タウルルタム、又はそれらの混合物を、腫瘍幹細胞死滅のため、それを必要とする被験体に約０．０１ｇ～約５０ｇ、約０．１ｇ～約３０ｇ、約０．５ｇ～約１０ｇ、又は約１ｇ～約５ｇの合計１日量で投与する。

タウロリジン、タウルルタム、又はそれらの混合物の腫瘍幹細胞死滅有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与単位である。

別の実施形態では、本開示は、タウロリジン及び／又はタウルルタムと組み合わせて使用してもよい、以下の化合物：

（式中、Ｒは各々独立してＨ、アルキル、又はアリールである）、

から選択される化合物を、それを必要とする患者に投与することによる腫瘍幹細胞を死滅させる方法を含む。かかる技術は、異なる半減期を有する少なくとも２つの化合物を使用することで得られる薬物動態の効果の幅を広げることにより、腫瘍幹細胞を死滅させる方法を提供する。一実施形態では、化合物２２５０をタウロリジン及び／又はタウルルタムと組み合わせて使用してもよい。

実施例１：
化合物２２５０の抗腫瘍活性
緒言
タウロリジンが強力な抗腫瘍剤であるという認識に基づき、Geistlich Pharmaにより類縁体２２５０が合成された。

材料及び方法
化学物質：化合物２２５０及びタウロリジン２％溶液は、本発明の譲受人であるウォルフーゼンのGeistlich Pharma AGにより提供された。

細胞株：ヒト大腸腺癌細胞株ＳＷ４８０と同じく、以前に記載されるように（Rodak et al. 2005）ヒト神経膠腫細胞株ＬＮ－２２９を使用した。

細胞毒性アッセイ：解離したＬＮ－２２９細胞を、１００μｌの培養培地中、１ウェル当たり１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートに蒔いた。およそ２４時間後、細胞が７０％～８０％の培養密度に達した時、培地を交換し、化合物番号２２５０（４．０μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌ）、タウロリジン（４．０μｇ／ｍｌ～１０００μｇ／ｍｌ）、又は標準培地による処理を開始した。３連の培養物を各試料について用意した。２５℃での２４時間のインキュベーションの後、残った接着性の生存細胞を、記載されるように（Rodack et al. 2005）クリスタルバイオレットを使用して染色した。細胞生存率を５４０ｎｍの吸光度を測定することによって特定した。結果を、１００％の細胞と生存する細胞のパーセンテージとの差によって与えられる死滅率として表す。ＥＣ_５０値は、５０％の細胞死を誘導する濃度に対応する。

結果
陽性対照：ヒト膠芽腫細胞（ＬＮ－２２９）を２４時間に亘ってタウロリジンと共にインキュベートした後、濃度依存性細胞毒性をＥＣ_５０＝４５μｇ／ｍｌと決定し（表１、図１）、この値は、この細胞株を用いて得られた先の結果に対応する（Rodack et al. 2005）。

２２５０の試験：２２５０をタウロリジンと同じ実験条件下でインキュベートした場合、同様の細胞生存率の濃度依存的な喪失が観察された。細胞死を誘導する半数効果濃度はＥＣ_５０＝５０μｇ／ｍｌであった。（表１、図１）。

ＳＷ４８０細胞の細胞毒性に関する結果を図２に示す。

考察
化合物２２５０は、タウロリジン型の新規な抗腫瘍剤の探索において新たな道筋を提示する。生物学的には、該化合物はタウロリジンと同じくらい強力である。化学的には、該化合物は、タウロリジンとは著しく異なる特徴を示す。エーテル－酸素によってＮＨ基を置換することにより、タウロリジンの二環構造が回避される。化合物２２５０は単環構造であり、タウルルタムの近縁の構造類縁体である。

機構的には、上記結果は、２２５０がメトキシ基を欠くことから、タウロリジンの抗腫瘍活性がメトキシ誘導体の形成によらないと考えられることを示す。上記化合物は、腫瘍細胞の泡状突起を生じる。

要約
化合物２２５０は、ヒト膠芽腫細胞（細胞株ＬＮ－２２９）で決定されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて強力な抗腫瘍活性を示す。その薬効（ＥＣ_５０＝４５μｇ／ｍｌ）は、同じ細胞株で試験したタウロリジン（ＥＣ_５０＝５０μｇ／ｍｌ）に匹敵する。

上記値は３連の実験で測定され、ＯＤは５４０ｎｍ±標準偏差（ＳＤ）での吸光度である。高い値は高い細胞生存率に対応する。

実施例２：
新たな化合物２２５０（テトラヒドロ１，４，５－オキサチアジン－４－ジオキシド）を試験すると、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）及びエシェリキア・コリ（Escherichia coli）に対する非常に高レベルの抗菌活性を有することがわかった。スタフィロコッカス・アウレウスに対する抗菌活性は、タウルルタムより約２倍高かった。

実施例３：
パンチプレート試験において化合物２２５０を試験したところ、ＭＲＳＡ株１８８、１８９、１９３、１９４、及び１９５に対して非常に活性であることがわかった。

抗菌活性と抗腫瘍活性とを併せて示すことにより、化合物２２５０は外科的腫瘍学に特に適している。

実施例４：
本明細書において化合物２２５０、２２５５、２２４５、Ａ１、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、又はＢ３と識別される各化合物を本明細書で同定された癌の癌細胞株に対して試験したところ、かかる細胞株に対して活性であることがわかる。

実施例５：
本明細書において化合物２２５０、２２５５、２２４５、Ａ１、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、又はＢ３と識別される各化合物を、本明細書で同定された癌を有する患者に投与すると、かかる癌の治療に有効であり、患者における使用に安全であることがわかる。これらの化合物の各々をビタミンＤ３、その誘導体、代謝産物、又は類縁体と共に投与すると、その組み合わせが該化合物の抗腫瘍効果を増すことがわかる。

実施例６：
ヒト新鮮血中での化合物２２５０の半減期を、ＧＣ、ＰＹＥ Ｕｎｉｃａｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２０４ ＦＩＤにより３７℃にてｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した。
ベースライン値：４９．０ｐｐｍ
１時間後：５０．６ｐｐｍ
２時間後：４７．６ｐｐｍ
２０時間後：３８．６ｐｐｍ～３９．０ｐｐｍ

したがって、化合物２２５０の半減期はヒト血液中で２４時間超であり、同じ試験を使用して約３０分間とわかったタウロリジンの半減期よりも著しく長い。

実施例７：
新たに診断された患者（５４±１０歳の中年）に由来するＷＨＯ悪性度ＩＶの高悪性度の神経膠腫の組織試料を機械的に細かく刻み、酵素により消化し、解離した細胞を濾過した。単離した腫瘍細胞をバルク細胞（bulk cells）として培養した。ニューロスフェア条件下（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を使用する）でニューロスフェアの形成によって、ネズミのＳＭＡ５６０神経膠腫細胞株又は新たに単離したヒト膠芽腫細胞から癌幹細胞（ＣＳＣ）を単離した。

細胞毒性アッセイ
バルク神経膠腫細胞を培養し、以前に記載されるように（Rodak et al., J. Neurosurg. 102, 1055-1068, 2005）２４時間又は４８時間に亘ってタウロリジン又はタウルルタムと共にインキュベートした。ＣＳＣを７日間培養した後、タウロリジン、タウルルタム、又はテモゾラミドに２４時間曝露した。残った接着性細胞の数を染色し（クリスタルバイオレット又はアラマーブルー）、吸光度測定（５４０ｎｍ）によって定量した。未処理の対照培養物において生存する細胞の数に対する生存細胞のパーセンテージとして細胞生存を表した。結果を％死滅率、又は細胞毒性の半数効果（half-maximal cytotoxicity）に必要とされる用量であるＥＣ_５０で与える。

結果
マウスに由来する癌細胞及び癌幹細胞に対するタウロリジン及びタウルルタムの細胞毒性
マウスＳＭＡ５６０神経膠腫細胞株を使用して腫瘍バルク細胞及びＣＳＣを提供した。ＳＭＡ５６０バルク細胞と様々な濃度のタウロリジン及びタウルルタム（６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションの後、２４時間及び４８時間のインキュベーション後に細胞毒性を判定した。タウロリジン及びタウルルタムの両方について、２４時間と４８時間とのインキュベーション時間の間に薬効の大きな差を伴わず、明らかな用量依存的な細胞毒性が見られた（図３Ａ、図３Ｂ）。ＥＣ_５０値は、タウロリジンに対して３４．６μｇ／ｍｌ、及びタウルルタムに対して１９．３μｇ／ｍｌであった（図３Ｃ）。

マウスＣＳＣをＳＭＡ５６０神経膠腫細胞株から作製し、７日間培養した。上記と同じ濃度のタウロリジン及びタウルルタムでＣＳＣを処理し、２４時間後に細胞毒性を判定した。図４に示されるように、タウロリジン及びタウルルタムはいずれも、ネズミのＣＳＣに対してタウロリジンについて１２．５μｇ／ｍｌのＥＣ_５０、及びタウルルタムについて１０μｇ／ｍｌのＥＣ_５０で用量依存的な細胞毒性を示した。これらの値は、タウロリジン及びタウルルタムがＣＳＣに対して有効であることを初めて実証する。

タウロリジン及びタウルルタムは４名の異なる膠芽腫患者から単離されたヒトＣＳＣにおいて細胞死を誘導する。
ＣＳＣを４名の患者から切除された膠芽腫組織から単離した。上記と同じ濃度範囲のタウロリジン及びタウルルタムを適用し、薬物とのインキュベーションの２４時間後に細胞毒性を測定した。試験した４つ全ての膠芽腫ＣＳＣ（ＧＢＭ３番、４番、５番、及び６番）は、タウロリジン及びタウルルタムに対して同様に感受性であった（図５Ａ、図５Ｂ）。タウロリジンの平均ＥＣ_５０値は１３±２μｇ／ｍｌであり、タウルルタムのＥＣ_５０値は１１±１．４μｇ／ｍｌであった（表２）。これらの実験では、タウロリジン及びタウルルタムの細胞毒性能を、５μＭ～１０００μＭの濃度範囲で適用されたテモゾラミド（ＴＩＭ）のものと比較した（図２Ｃ）。ＴＭＺの平均ＥＣ_５０値は６８．５±２６μｇ／ｍｌであった（表２）。興味深いことに、この濃度は、患者で測定されたＴＭＺのピーク血漿レベル（１３．７μｇ／ｍｌ）よりもはるかに高い（Portnow et al., Clin Cancer Res 15, 7092-7098, 2009）。

結果は、タウロリジン及びタウルルタムの両方がＣＳＣに対して有効であることを実証し、この知見が、２つの種、すなわちマウス及びヒトに由来する神経膠腫ＣＳＣについて確立された。

マウス神経膠腫細胞株（ＳＭＡ５６０）からマウスＣＳＣを作製した。注目すべきことに、ＥＣ_５０値に基づくと、ＣＳＣは、対応する神経膠腫バルク細胞よりもタウロリジン及びタウルルタムに対して更に感受性であった（タウロリジンに対して約３倍、及びタウルルタムに対して２倍）（図３、図４）。

４名のヒト膠芽腫患者から新たに単離されたヒトＣＳＣは、タウロリジン及びタウルルタムの両方に対して同様に非常に化学感受性であった。細胞毒性に対するＥＣ_５０値は、それぞれ１３±２ｕｇ／ｍｌ及び１１±１．４μｇ／ｍｌであった（表２）。これらの値は、ヒトＣＳＣが、それらのネズミの対応物と同様に、５０μｇ／ｍｌの範囲のＥＣ_５０値を示すヒト膠芽腫バルク細胞よりも、タウロリジン及びタウルルタムに対してより感受性（約３倍～４倍）であることを実証する（Rodak et al., J. Neurosurg., 102, 1055-68, 2005）。

実施例８：
ネズミの神経膠腫細胞株に由来する癌幹細胞及びヒト癌幹細胞に対し、タウロリジン及びタウルルタムを試験した。タウロリジン及びタウルルタムは、４名の膠芽腫患者から新たに単離されたヒト癌幹細胞（タウロリジンについてＥＣ_５０＝１３±２μｇ／ｍｌ、タウルルタムについてＥＣ_５０＝１１±１．４μｇ／ｍｌ）に対するのと同じく、ネズミの神経膠腫細胞株に由来する癌幹細胞に対して強力な抗腫瘍活性（タウロリジンについてＥＣ_５０＝１２．５μｇ／ｍｌ、タウルルタムについてＥＣ_５０＝１０μｇ／ｍｌ）を付与することが分かった。

実施例９
膵臓幹細胞様多細胞性スフェロイド培養物に対する抗腫瘍効果
多細胞性スフェロイドは、成長を刺激する３次元構造で成長する腫瘍細胞、微小環境条件、及び実際の腫瘍の幹細胞様特性で構成される。多細胞性腫瘍スフェロイド（ＭＣＴＳ）モデルは、単層培養物で見られる多くの欠陥を補うものである。２００μｍ～５００μｍの大きさのスフェロイドは、腫瘍に類似する形態学的及び機能的な特徴を有しつつ、酸素、栄養素、及び分解産物の化学勾配を発生させる。したがって、ＭＣＴＳモデルを利用するアッセイは、薬物浸透の評価を可能とし、単層培養物と比較してｉｎ ｖｉｖｏでの成功をより予測しやすい。ＭＣＴＳアッセイは、標準的な単層とｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍との間の中間の複雑さの腫瘍モデル系である。

膵腫瘍細胞（Ｐａｎｃ Ｔｕ－１、ＢｘＰＣ－３、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２、ＡＳＰＣ１）及び原発性膵腫瘍細胞（Ｂｏ８０）を、特殊な幹細胞培地中、超低接着性プレートに蒔いた。

膵腫瘍細胞（ＡＳＰＣ１、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２、Ｐａｎｃ ＴｕＩ、ＢｘＰＣ－３）及び原発性膵腫瘍細胞（Ｂｏ８０）を単層培養物で成長させた後、特殊な幹細胞培地の条件下にて超低接着性プレートに蒔き、多細胞性スフェロイドを形成させて、セルストレーナーを通して凝集物を排除した。

腫瘍細胞株ＡｓＰＣ－１、ＢｘＰＣ－３、及びＨＣＴ－１１６において、７５０μＭ～１０００μＭの化合物２２５０で細胞生存の半数阻害を達成した。これらの効果は、神経膠腫細胞株ＬＮ－２２９で観察されたものと類似する。細胞死の誘導は、アポトーシス及びネクローシス（おそらくはネクロトーシス）によるものであった。このプログラムされた細胞死の誘導は、還元剤であるＮ－アセチルシステインの添加によって妨げられ、カスパーゼは関与しないことがわかった。したがって、酸化還元による作用機構（redox-directed mechanism of action）が存在する。

膵腫瘍細胞（ＡｓＰＣ－１、ＢｘＰＣ－３、及びＨＣＴ－１１６）の成長は、細胞毒性を誘発するのに必要な濃度よりもはるかに低い、３００μＭの半数効果濃度の化合物２２５０によって阻害された。

図８に示されるように、多細胞性膵腫瘍（Ｐａｎｃ ＴｕＩ又はＢｘＰＣ－３）スフェロイドを、対照と、４８時間に亘るタウロリジン処理（５００μＭ）試料又は化合物２２５０処理（１０００μＭ）試料として試験した（Ａと標識される欄）。処理の後、全細胞懸濁物を各々、４５μｍの細胞ストレーナーに再度通し、安定性について残渣凝集物を分析した（Ｂと標識される欄）。

図９Ａ及び図９Ｂは、Ｐａｎｃ ＴｕＩ多細胞性スフェロイド培養物のＣＤ１３３含量のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＣＤ１３３は、既知の、よく確立された幹細胞の目印である。結果は、Ｐａｎｃ ＴｕＩの多細胞性スフェロイド培養物中のＣＤ１３３陽性細胞の量は、単層培養物で成長させたＰａｎｃ ＴｕＩ（Ｂ）と比較して、１０倍富化されたことを示す。アイソタイプＩｇＧを陰性対照として使用した（Ａ）。結果は、タウロリジン及び化合物２２５０が多細胞性スフェロイド培養物のような膵臓幹細胞に対して抗腫瘍活性を有することを実証する。

実施例１０
悪性膵癌におけるタウロリジン及び化合物２２５０の抗腫瘍剤としてのｉｎ ｖｉｖｏ研究
タウロリジン及び化合物２２５０の効果をヌードマウス（ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕ）で分析した。１×１０^７腫瘍細胞（ＰａｎｃＴｕ－Ｉ及びＭｉａＰａｃａ ２）を脇腹に皮下注入した。動物を３つの群、すなわち対照群、タウロリジンによる腹腔内注射治療（ＴＲＤ）群、及び化合物２２５０による腹腔内注射治療（ＮＤＴＲＬＴ）群に無作為化した。

治療を開始する前に腫瘍を２００ｍｍ^３の大きさまで成長させた。マウスを５００ｍｇ／ｋｇ＊体重（ＢＷ）で隔日に処理した。

図１０Ａに示されるように、タウロリジンの投与は、対照と比較してＭｉａＰａｃａ２腫瘍体積を有意に減少した（約２倍）。

図１０Ｂに示されるように、化合物２２５０の投与は、対照と比較してＭｉａＰａｃａ２腫瘍体積を有意に減少した（３倍超）。

図１０Ｃに示されるように、タウロリジンの投与は、対照と比較してＰａｎｃＴｕＩ腫瘍体積を有意に減少した（約３倍）。

図１０Ｄに示されるように、化合物２２５０の投与は、対照と比較してＰａｎｃＴｕＩ腫瘍体積を有意に減少した（約２倍）。

適用したタウロリジン及び化合物２２５０の用量は、研究中マウスに対して何ら毒作用を示さなかった。いずれの腫瘍細胞株モデルでも腫瘍成長の有意な減少を得た。

腫瘍成長（体積）は、対照に対して９日目以降（ＰａｎｃＴｕＩ）及び１１日目以降（ＭｉａＰａｃａ２）に有意に減少された。５００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与の用量は、明らかな毒性の兆候のない十分な認容性を示した。

図１１Ａに示されるように、原発性膵腫瘍（Ｂｏ７３）の異種移植片モデルを１５日間観察したところ、タウロリジンの投与は対照と比較して相対腫瘍体積を僅かに減少し、化合物２２５０の投与は対照と比較して相対腫瘍体積を更に減少することがわかった。しかしながら、おそらくは研究期間が短かったこと、また腫瘍の成長速度が遅かったため、腫瘍体積における差は統計学的には関連がなかった。図１１Ｂでは、原発性膵腫瘍（Ｂｏ７０）の異種移植片モデルを２３日間観察したところ、タウロリジン及び化合物２２５０の投与が対照と比較して腫瘍体積を有意に減少することが観察された。

タウロリジン及び／又は化合物２２５０の例えば腹腔内の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長を阻害する。

Claims (6)

1. 化合物２２５０又は化合物２２５０と化合物２２５５の混合物を以下の反応：
   

   

   により調製する方法。
2. 化合物２２５０を以下の反応：
   

   

   により調製する方法。
3. 化合物２２４４が、以下の通り：
   

   

   化合物２２６４を反応させて製造される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 化合物２２６４が、以下の通り：
   

   

   化合物２２６１を反応させて製造される、請求項３に記載の方法。
5. 化合物２２６０
   

   

   をＤＭＦ中の塩化チオニル又はオキシ塩化リンで塩素化して化合物２２６１を製造することを更に含む、請求項４に記載の方法。
6. ビニルスルホンアミドを用いて、以下の反応：
   

   

   により、化合物２２５０を調製する方法。

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