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JP6991977B2 - 修飾デンドリマーナノ粒子ワクチン送達用組成物及び方法 - Google Patents

修飾デンドリマーナノ粒子ワクチン送達用組成物及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体を本明細書に援用する、２０１５年９月２３日に出願された、米国特許出願第６２／２２２，５１５号の優先権を主張するものである。
連邦政府によって支援された研究又は開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によってＤａｎｉｅｌ Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｌａｎｇｅｒに授与されたＮＩＨ助成金番号ＣＣＮＥ６９２４９４２、並びに米軍によってＤａｎｉｅｌ Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＲｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｌａｎｇｅｒに授与されたＪｏｉｎｔ Ｗａｒｆｉｇｈｔｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ助成金番号６９３０２１６に基づく政府支援によって成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
本発明は、一般に分子送達システムの分野に関し、より詳細には、核酸、抗原又は小分子を対象に送達して、疾患及び／又は病状を予防又は治療するためのデンドリマーナノ粒子に関する。
ワクチン接種は、依然として、感染症を防止する最も有効な方法である。世界保健機構（ＷＨＯ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の報告によれば、認可ワクチンは、現在、２５の感染症を防止するのに、又は防止及び抑制に寄与するのに、利用可能である（非特許文献１）。
しかし、現行のペプチドワクチン抗原送達手法は、迅速な製造能力、並びに免疫応答のタイプ、持続期間及び効力に影響する関連工学パラメータが制限された技術に頼ることが多い。一部のワクチン戦略は、タンパク質抗原を有効に使用するものの、カスタムペプチドは、免疫原性を欠き大規模な免疫賦活を必要とすることが多く、インビトロスクリーニングツールとして最も有用であるかもしれない。
最近、ＲＮＡが魅力的な抗原ベクターとして出現した。ｍＲＮＡがマウスモデルに使用され、短い（＜３０ａａ）新抗原配列の免疫療法の可能性を示した（非特許文献２）。しかし、免疫処置用ベクターとして、純粋なｍＲＮＡが、特に癌免疫療法の分野で研究され、様々な成功をおさめた。裸のｍＲＮＡの投与は、リンパ節に直接注射すると、抗腫瘍免疫を与えることができる（非特許文献３、４）。大型複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）も、ワクチン抗原を細胞に送達するために開発された。ｒｅｐＲＮＡは、宿主細胞のリボソーム機構と相互作用することによって、翻訳及び複製する。したがって、ＲｅｐＲＮＡは、翻訳ＲＮＡ分子数を増加させ、ひいては、抗原産生回数を増加させてｍＲＮＡよりも長い抗原発現を誘発するテンプレートを与える（非特許文献５）。
しかし、精製ＲＮＡは、周知のように不安定であり、例えば、ヌクレアーゼ、ヒドロキシラジカル、ＵＶ光、及びＭｇ２＋媒介性の系内攻撃によって、極度に劣化しやすい。さらに、細胞膜を通る移動の制限、及び大幅な肝臓での除去によって、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、特に大型複製ＲＮＡなどのＲＮＡベースの医薬化合物の適用可能性が極度に制限される。ＲｅｐＲＮＡの翻訳とそれに続く複製の両方によって、ＲｅｐＲＮＡは、リボソーム侵入又は遺伝子翻訳を容易に破壊し得るリボヌクレアーゼに特に敏感になる。したがって、完全な、機能的に生存可能なＲＮＡ分子を細胞内に送達することは、ＲＮＡベースの技術を治療に応用するのに中核的な難題として残っている。
非感染性ビリオン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）などの弱毒生ウイルスに基づくワクチンの開発は、ある程度成功している。残念ながら、現行の弱毒生ウイルスに基づくワクチン製造法は、長い製造時間を必要とする。受精卵に基づく方法、及びより新しい細胞バイオリアクター法は、数か月のリードタイムを必要とする。製造では、ＶＬＰは、培養細胞にも依存する。アデノウイルス、ＡＡＶ、ＣＭＶ、ｒＶＳＶ及び種々のアルファウイルスに基づくウイルス様粒子の形で投与される遺伝子ワクチンは、繰り返し投与を妨げる既存の、又は誘導される抗ベクター免疫のために、使用が制限される。
核酸及びタンパク質を哺乳動物細胞に送達する能力は、カチオン性ポリマー（ＣＰ：ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）の「ポリプレックス」などの生体材料ナノ粒子を用いても示された。しかし、ＣＰポリプレックス及び関連核酸は、塩及び血清成分によって不安定化されることが多く、生理学的流体中で分解又は凝集することもあり（非特許文献６、７）、カプセル剤を細胞に生体内送達するビヒクルとして非効率的と考えられる。さらに、多くのカチオン性ポリマーは、細胞毒性を示す（非特許文献７～１１）。
種々のナノ粒子形式が、皮内（非特許文献１２）、脾臓内（非特許文献１３）、皮下（非特許文献１４）、静脈内（非特許文献１２、１５）、更には鼻腔内（非特許文献１６）投与経路で有効性を示した。しかし、こうした手法で臨床試験に進んだのはほとんどない。ヒトにおける免疫防御の相関が報告されたものの、臨床効果は期待はずれであった（非特許文献１７～２０）。プロタミン複合型ｍＲＮＡの投与は、インフルエンザ感染の皮内免疫マウス、フェレット及びブタモデルにおいて成功のきざしを示した（非特許文献２１）。
ｒｅｐＲＮＡなどの大型ＲＮＡ分子に基づく治療法は、有効な生体内送達にとって更なる問題を提起した。ＲＮＡ分子は、無修飾で放置されると細胞内分解しやすく、ｍＲＮＡ発現は一過性であり、ＲＮＡ自体の固有の免疫原性のために翻訳抑制（非特許文献２２～２４）は、すべて、効力を制限する。ワクチンの配置に使用される送達化合物の免疫原性及び／又は毒性は、別の厄介な問題である。一部の用途に有効なカチオン性脂質は（非特許文献２５）、より高用量で使用すると、また、不十分に複合化されると、有毒である（非特許文献２６～２８）。それらは、効率的送達のために高い正のゼータ電位に依存し、それは、生体内の血清中での中和のために制約要因になり得る（非特許文献２９）。さらに、カチオン性脂質は免疫原性であり、それは、導入遺伝子発現を制限する可能性があり、安全を脅かす懸念を生じる（非特許文献３０）。ｍＲＮＡに反応したＩＦＮ産生は、実際、ｍＲＮＡワクチンの効力を制限し得る（非特許文献３１）。カチオン性脂質を用いて形成される脂質ナノ粒子も、一般に、その処方に追加の安定化剤を必要とし、最終製品のコスト及び複雑さが増す。
無処置の遺伝物質など、カプセル剤を対象の細胞中に効果的に送達する改善されたシステムが必要とされる。
世界保健機構、世界的ワクチン実行計画（Ｇｌｏｂａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎ）２０１１～２０２０、ジュネーブ、２０１２ Ｂｈａｄｕｒｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ２、ｅ４４、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃｓｉｓ（２０１３） Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ７０、９０３１～９０４０（２０１０） Ｖａｎ Ｌｉｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ７２、１６６１～１６７１（２０１２） ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、３、ｅ１７３（２０１４） Ａｌ－Ｄｏｓａｒｉら、ＡＡＰＳＪ．１１、６７１～６８１（２００９） Ｔｒｏｓ ｄｅ Ｉｌａｒｄｕｙａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．４０、１５９～１７０（２０１０） Ｇａｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ３２、８６１３～８６２５（２０１１） Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２５５０～２５６１（１９９４） Ｋａｆｉｌら、ＢｉｏＩｍｐａｃｔｓ１、２３～３０（２０１１） Ｌｖら、Ｊ Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．１１４、１００～１０９（２００６） Ｈｏｅｒｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０、１～７（２０００） Ｚｈｏｕら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１０、２７１９～２７２４（１９９９） Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｃ．ら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２１、２５１～２５９（２０１３） Ｍｏｃｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１４、８０２～８１４（２００７） Ｐｈｕａら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ、４、５１２８（２０１４） Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３１、１８０～１８８（２００８） Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３２、４９８～５０７（２００９） Ｒｉｔｔｉｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１９、９９０～９９９（２０１１） Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３、３９９～４０６（２０１１） Ｐｅｔｓｃｈら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０、１２１０～１２１６（２０１２） Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７９、１２５４２～１２５５０（２００４） Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４、９９７～１００１（２００６） Ｌｅｖｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２５６、７６３８～７６４１（１９８１） Ｇｅａｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０９、１４６０４～１４６０９（２０１２） Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３、７３０５～７３０９（１９９６） Ｌｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ５、９３０～９３７（１９９８） Ｌｖら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１１４、１００～１０９（２００６） Ｍｉｒｓｋａら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ Ｂ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、４０、５１～５９（２００５） Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ－Ｌａｃｅｙら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ、８、１５３～１６１（２０１１） Ｐｏｌｌａｒｄら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２１、２５１～２５９（２０１３）
したがって、本発明の一目的は、免疫原性及び細胞毒性を極力、又は全く発揮しない送達ビヒクルによって、核酸、タンパク質及び小分子を細胞内送達するための組成物及び方法を提供することである。
本発明の更なる一目的は、２個以上のｒｅｐＲＮＡ分子を細胞の内部に同時に送達するための方法及び組成物を提供することである。
本発明の更なる一目的は、標的宿主細胞による外来遺伝子の持続的発現のための組成物、方法及び装置を提供することである。
本発明の更なる一目的は、治療用分子を対象の細胞に送達するための方法及び組成物を提供することである。
大型ｒｅｐＲＮＡ分子を含めて、核酸、抗原、小分子などの治療薬、予防薬及び／又は診断薬を対象に送達するための修飾デンドリマーナノ粒子（「ＭＤＮＰ」：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を提供し、対象の細胞に開発された。ＭＤＮＰは、細胞内抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効率的に増殖させ、特異抗原に対する抗体応答を増強する。ナノ粒子は、１種以上のアルキル化デンドリマーと、疎水性端部を介してＮＰに結合したＰＥＧ－脂質ポリマーなどの１種以上の両親媒性ポリマーと、送達される治療薬、予防薬又は診断薬とを含む。
送達される薬剤は、一般に、ポリヌクレオチド、タンパク質若しくはペプチド、又は小分子である。好ましい例としては、複製ＲＮＡ、最も好ましくは、抗原をコードする複製ＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態においては、ナノ粒子は、対象の細胞中で異なる速度で発現され得る同じ又は異なる抗原をコードし得る２個以上の複製ＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、ナノ粒子は、１個以上の複製ＲＮＡ及び１個以上のメッセンジャーＲＮＡを含む。メッセンジャーＲＮＡの１個以上は、複製ＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域を含むように修飾することができる。
別の実施形態においては、ナノ粒子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、少なくとも２４ヌクレオチド長である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの対応する標的遺伝子に対する干渉作用を生じ得る１個以上のＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、ＲＮＡは、ＲＮＡ：デンドリマー約５：１のモル比でナノ粒子内に含まれる。ナノ粒子は、一般に、サイズが３０ｎｍ～４５０ｎｍ（両端を含む）、好ましくは６０ｎｍ～１９０ｎｍ（両端を含む）である。
一般に、ナノ粒子は、ポリプロピレンイミンテトラミン、ポリ（アミドアミン）などの１種以上のアルキル化デンドリマーで形成される。例示的なアルキル化デンドリマーとしては、第１～７世代デンドリマーが挙げられる。一部の実施形態においては、デンドリマーの１種以上がエポキシド末端アルキル鎖の付加によって修飾される。エポキシド末端アルキル鎖は、サイズが１～３０個の炭素（両端を含む）、好ましくは６～１６個の炭素（両端を含む）の範囲、最も好ましくは６個の炭素であり得る。
一部の実施形態においては、疎水性固定化ポリマーのポリマー成分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、及びエチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、多糖類、又はコポリマー、及びそれらの混合物であり得る。一部の実施形態においては、疎水性固定化ポリマーのポリマー成分は、分子量１２０Ｄａ～２５，０００Ｄａ（両端を含む）、好ましくは２，０００Ｄａのポリエチレングリコールである。ある実施形態においては、疎水性固定化ポリマーは、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］である。一般に、ナノ粒子のデンドリマーとポリエチレングリコールの質量比は、２０：１～５：１、好ましくは１１．５：１である。一部の実施形態においては、ナノ粒子は、約１０～１５，０００ヌクレオチド長である１個以上のリボ核酸配列を含む。デンドリマーとリボ核酸の質量比は、１０：１～１．５：１、好ましくは５：１とすることができる。
対象に投与するための、核酸、抗原又は小分子の送達のためのナノ粒子、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、ワクチンも提供される。一部の実施形態においては、ワクチンは、１種以上の抗原を対象の細胞中で異なる速度で発現する２個以上の複製ＲＮＡを含むナノ粒子を含む。
ＲＮＡペイロードの略図である。複製ＲＮＡの「全レプリコン」を示し、右から左に、５’キャップ、５’非翻訳領域、それぞれｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３及びｎｓＰ４ドメインを含む多サブユニットＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、抗原、３’非翻訳領域及び３’ポリ（Ａ）テールを示す。全レプリコンＲＮＡからＲｄＲｐによって産生される複数の末端ｍＲＮＡ転写産物が、全レプリコンの下に示され、右から左に、それぞれ５’キャップ、抗原、３’非翻訳領域及び３’ポリ（Ａ）テールを含む。 ＲＮＡペイロードの略図である。図１Ａと同じ複製ＲＮＡの「全レプリコン」を含むペイロード、及び複製ｍＲＮＡによってコードされたＲｄＲｐと同じ非翻訳領域を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）構築物を示す。全レプリコンとｍＲＮＡ構築物の両方からＲｄＲｐによって産生される複数の末端ｍＲＮＡ転写産物が、全レプリコンの下に示され、右から左に、それぞれ５’キャップ、抗原、３’非翻訳領域及び３’ポリ（Ａ）テールを含む。 ＲＮＡペイロードの略図である。ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びレプリコンＲＮＡそれぞれの相対的サイズを示す模式図である。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。ＰＥＩデンドリマーの第１～３世代（Ｇ１～Ｇ３）の分子構造。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。ＤＡＢ－Ａｍ４デンドリマーの第１～４世代（Ｇ１～Ｇ４）の分子構造。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。ＰＡＭＡＭデンドリマーの第０～３世代（Ｇ０～Ｇ３）の分子構造。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。ＰＡＭＡＭデンドリマーの第０～３世代（Ｇ０～Ｇ３）の分子構造。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。イオン性デンドリマー系ナノ材料を処方するのに使用することができるＣ６～Ｃ１８のサイズのエポキシドの分子構造。 細胞内カーゴの送達のための３成分系を示す略図である。ＲＮＡカプセル剤を含む３成分（イオン性デンドリマー、脂質固定化ＰＥＧ及びＲＮＡ）を示す図である。 層状のデンドリマー材料（１２）、疎水性（１６）成分と親水性（１８）成分を含む両親媒性ポリマー（１４）、及びカプセルＲＮＡ（２０）を含むように図２Ｂに示したように処方される修飾デンドリマー系ナノ粒子（１０）の図である。 対数目盛のＭＤＮＰ（修飾デンドリマーナノ粒子）直径（ｎｍ）に対する強度（％）を示す線グラフである。エラーバー±Ｓ．Ｄ．及びｎ＝３。 非形質転換ＢＨＫ細胞、従来のｍＲＮＡ並びにＶＥＥ及びＳＦＶゲノムに基づくレプリコンＲＮＡで形質転換されたＢＨＫ細胞によって媒介された、ＢＨＫ細胞におけるホタルルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を示すヒストグラムである。技術的３つ組のエラーバー±Ｓ．Ｄ．。 それぞれＰＧ１．Ｃ１２（▲）、ＰＧ１．Ｃ１５（●）、ＰＥＩ（◇）、遊離ＲＮＡ（■）及びＰＢＳ（ｘ）の各々に対する、０～１１０分間の時間にわたる規準化ＦＲＥＴシグナル（０．９～１．７）を示す線グラフである。Ｎ＝４～８及びエラーバー±Ｓ．Ｄ．。 １日、３日、２０日及び３０日それぞれの時点のナノ粒子ワクチン日数にわたる０～４５，０００の発光（任意の単位）を示すヒストグラムである。Ｎ＝４及びエラーバー±Ｓ．Ｄ．。 例示的なワクチン接種計画を示す略図であり、修飾デンドリマーナノ粒子（３０）、試験動物への筋肉内注射（３２）、筋細胞における腫瘍関連抗原の産生及び放出（３４）、それに続いて、抗原特異的抗体及び細胞傷害性Ｔ細胞の産生をもたらす、抗原に対する免疫応答（３６）、免疫マウスへの腫瘍細胞の注入（４０）による抗原を発現する腫瘍細胞の調製（３８）、その結果、腫瘍細胞の認識（４２）、及び免疫系による腫瘍細胞の破壊（４４）を利用する。 それぞれ非免疫、裸のｍＲＮＡ、裸のＳＦＶｒｅｐ、ｍＲＮＡ ＭＤＮＰ及びＳＦＶ ＭＤＮＰの各々に対して、経時的に（ｎ＝２、曝露後１０～２８日）腫瘍サイズ（０～２００ｍｍ２）を示す線グラフである。 それぞれ非免疫、裸のｍＲＮＡ、裸のＳＦＶｒｅｐ、ｍＲＮＡ ＭＤＮＰ及びＳＦＶ ＭＤＮＰの各々に対して、経時的に（曝露後１０～２８日）マウス（ｎ＝１０）の生存（％）を示す線グラフである。 遊離ｍＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルｍＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 遊離ＶＥＥｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルＶＥＥｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 遊離ＳＦＶｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルＳＦＶｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 負の対照と正の対照の両方に対するＣＦＳＥと細胞数を示すグラフである。検出可能なタンパク質発現を、各パネルにおいて、それぞれクロス（発現なし、図５Ｇの負の対照を参照）及び発現ありのチェック印（図５Ｇの正の対照を参照）で示す。 遊離ｍＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルｍＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 遊離ＶＥＥｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルＶＥＥＶｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 遊離ＳＦＶｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 ナノカプセルＳＦＶｒｅｐＲＮＡのＣＦＳＥに対する数（細胞）を示すグラフである。 非免疫対照に対するＣＦＳＥと細胞数を示すグラフである。検出可能なタンパク質発現を、各図６Ａ～６Ｇにおいて、発現なしのクロス（図６Ｇの負の対照を参照）及び発現ありのチェック印（図６Ｄ参照）で示す。 移入後４日目／ナノカプセルｒｅｐＲＮＡ ＶＥＥＶ－ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ４０μｇで免疫後３日目のＯＴ－１細胞の細胞数とＣＦＳＥを示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）のグラフである。実験結果は、２匹の試験動物、それぞれマウス１（図７Ａ）及びマウス２（図７Ｂ）の各々の独立した実験で同じである。 移入後４日目／ナノカプセルｒｅｐＲＮＡ ＶＥＥＶ－ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ４０μｇで免疫後３日目のＯＴ－１細胞の細胞数とＣＦＳＥを示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）のグラフである。 ３日目におけるＯＴ１増殖を示すグラフであり、非免疫試料の各々、並びにそれぞれ裸のｍＲＮＡ、ＭＤＮＰ ｍＲＮＡ、裸のＶＥＥＶ、ＭＤＮＰ ＶＥＥＶ、裸のＳＦＶ及びＭＤＮＰ ＳＦＶで免疫された試料の各々の増殖％を示す。 １４日目におけるＯＴ１増殖を示すグラフであり、非免疫試料の各々、並びにそれぞれ裸のｍＲＮＡ、ＭＤＮＰ ｍＲＮＡ、裸のＶＥＥＶ、ＭＤＮＰ ＶＥＥＶ、裸のＳＦＶ及びＭＤＮＰ ＳＦＶで免疫された試料の各々の増殖％を示す。 それぞれＰＢＳ、５ｍｅＣ／ΨｍＲＮＡ及びＶＥＥＶ試料の各々において、ＯＤ６５０におけるＩ型ＩＦＮ（□）及びＩＩ型ＩＦＮ（■）の相対量を示すヒストグラムである。生物学的３つ組に対するエラーバー±ＳＤ。 それぞれ非免疫、ＭＤＮＰ ＶＰ４０ ４０μｇ、裸のｃＯＶＡ４０μｇ、ＭＤＮＰｃＯＶＡ０．４μｇ、ＭＤＮＰｃＯＶＡ４μｇ及びＭＤＮＰ４０μｇの各々に対する、非刺激細胞に対して規準化された、ペプチド刺激培養上清のＩＦＮｇ濃度を示すヒストグラムである。 それぞれナノカプセルｍＲＮＡ、ＳＦＶ及びＶＥＥからの経時的抗原産生を示す、発現の時間経過を示す図である。 層状のデンドリマー材料（５２）、両親媒性ポリマー（５４）を含み、各々異なる抗原（抗原Ａ～Ｃ）をコードする３個のナノカプセルｒｅｐＲＮＡ（５６）、（５８）、（６０）を含めた複数の核酸ペイロード、及び第４の抗原（抗原Ｄ）をコードするｍＲＮＡ構築物（６２）を含み、ナノカプセルｒｅｐＲＮＡ（６４）の５’非翻訳配列がｍＲＮＡ（６６）と同じである、修飾デンドリマー系ナノ粒子（５０）の略図である。 それぞれ非形質移入及びＶＥＥ ＨＡ形質移入試料の各々の細胞数（モードに対して規準化、０～１００）とＨＡタンパク質数を示すグラフである。 それぞれｃＯＶＡ免疫及びＨＡ免疫動物の各々に対して経時的に（感染後日数）平均体重（感染前％）を示す線グラフである。安楽死カットオフは、８０％感染前体重であり、線で示した。 各曝露前後のｃＯＶＡ免疫マウスＮｏ．１～３及びＨＡ免疫マウスＮｏ．１～３それぞれの４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．を示すヒストグラムである。 ワクチン接種（－－）及び非ワクチン接種（・・・）マウスそれぞれに対するＨ１Ｎ１感染後（日数）の経時的生存％を示す線グラフである。 それぞれアジュバント（●）、ＧＰ（■）、ＧＰ／ＶＰ４０（▲）及びアジュバント／ＧＰ／ＶＰ４０（▼）を含む各試料の追加免疫後１４日目における１／１００希釈血清中のＥＢＯＶ ＧＰ ＩｇＧのＯＤを示す線グラフである。 非免疫対照（●、０／７）、ＧＰで免疫された（■、６／７）、ＧＰ／ＶＰ４０で免疫された（▲、６／７）、及びポリ／ＧＰ／ＶＰ４０で免疫された（▼、４／７）動物それぞれに対する、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）曝露後のマウス生存率を示す線グラフである。 それぞれ２回の４０μｇ ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ（対照）、２回の４０μｇ裸のＧＰレプリコン（■）、２回の０．４μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ（▲）、２回の４．０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ（▼）、２回の４０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ（◆）、及び１回の４０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ（○）の各々に対する抗体価を示すグラフである。 それぞれ２回の４０μｇ ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ（対照）、２回の４０μｇ裸のＧＰレプリコン、２回の０．４μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ、２回の４．０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ、２回の４０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰ、及び１回の４０μｇ ＧＰ ＭＤＮＰで非免疫された動物に対する、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）曝露後のマウス生存率を示す線グラフである。 ワクチン接種（－）及び非ワクチン接種（対照）マウスそれぞれに対する、Ｔ．ゴンヂ（ｇｏｎｄｉｉ）感染後（日数）の経時的生存％を示す線グラフである。 ワクチン接種（●）及び非ワクチン接種（□、対照）マウスそれぞれに対する、Ｔ．ゴンヂ感染後（日数）の経時的平均相対体重（％）を示す線グラフである。 ワクチン接種（Ｔ．ゴンヂ）及び非ワクチン接種（Ｔ．対照）マウスそれぞれに対する、Ｔ．ゴンヂ曝露後日数（０～１７５日）と生存％を示す線グラフである。 ワクチン接種（●）及び非ワクチン接種（□、Ｔ．対照）マウスそれぞれに対する、Ｔ．ゴンヂ感染後（０～１７５日）の経時的平均相対体重（％）を示す線グラフである。 ２種のＭＤＮＰワクチン、すなわち、対照（ザイールエボラウイルスに対するＮＰ製剤）及びＺＩＫＶ（ジカウイルスに対するＮＰ製剤）それぞれの各々に対する（ＩｇＧ）抗体エンドポイント力価を示すグラフである。 ＯＶＡ（対照）ペプチド又はＺＩＫＡ（ジカウイルス由来のペプチド）それぞれによる刺激後の、独立に、２種のＭＤＮＰワクチン、すなわち、対照（ザイールエボラウイルスに対するＮＰ製剤）及びＺＩＫＶ（ジカウイルスに対するＮＰ製剤）の各々に対する、免疫処置後のＩＦＮγＣＤ８＋脾細胞パーセントを示すグラフである。 Ｈｍｇａ２＋細胞で誘導される、ワクチンを用いた（▼）及び用いない（●）ｄ＞５、２＜ｄ＜５及びｄ＜２群の各々に対する、腫瘍数（０～６）と腫瘍直径（ｍｍ）を示すグラフである。 Ｈｍｇａ２－細胞で誘導される、ワクチンを用いた（▼）及び用いない（●）ｄ＞５、２＜ｄ＜５及びｄ＜２群の各々に対する、腫瘍数（０～６）と腫瘍直径（ｍｍ）を示すグラフである。
Ｉ．定義
「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを導入することができる原核及び真核細胞を指す。
「疎水性固定化ポリマー」、両親媒性ポリマー及び「脂質ポリマー」という用語は、１個以上の脂肪族基に共有結合したポリマーを指すのに区別なく使用される。
「デンドリマー」という用語は、内部コアと、この内部コアに結合し、内部コアから延びる繰返し単位の層（又は「世代」）とを有し、各層が１個以上の分岐点を有し、末端基の外面が最外側の世代に結合した、分子構造を含むように意図されるが、それに限定されない。デンドリマーは、規則性デンドリマー又は「星形」分子構造を有する。
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル、アルケニル又はアルキニル基、分枝鎖アルキル、アルケニル又はアルキニル基、シクロアルキル、シクロアルケニル又はシクロアルキニル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル、シクロアルケニル又はシクロアルキニル基、及びシクロアルキル置換アルキル、アルケニル又はアルキニル基を含めて、飽和又は不飽和脂肪族基を指す。別段の記載がない限り、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その骨格に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖の場合Ｃ１～Ｃ３０、分枝鎖の場合Ｃ３～Ｃ３０）、より好ましくは２０個以下の炭素原子、好ましくは１２個以下の炭素原子、最も好ましくは８個以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に３～１０個の炭素原子を有し、より好ましくは環構造中に５、６又は７個の炭素を有する。アルキル基は、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、チオ、エーテル、エステル、カルボキシ、オキソ及びアルデヒド基を含めて、ただしそれらに限定されない、１個以上の基で置換することもできる。アルキル基は、１個以上のヘテロ原子を含んでもよい。「低級アルキル」とは、１～６個の炭素、好ましくは１～５個の炭素、より好ましくは１～４個の炭素、最も好ましくは１～３個の炭素を意味する。
「アミン」及び「アミノ」という用語は、当該技術分野で認知されており、非置換アミンと置換アミンの両方、例えば、下記一般式で表すことができる部分を指す。
Figure 0006991977000001
式中、Ｒ９、Ｒ１０及びＲ’１０は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、－（ＣＨ２）ｍ－Ｒ８であり、又はＲ９及びＲ１０は、それらが結合しているＮ原子と一緒に、４から８個の原子を環構造中に有する複素環を完成し、Ｒ８は、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環又は多環であり、ｍはゼロ又は１から８の整数である。好ましい実施形態においては、Ｒ９又はＲ１０の一方のみをカルボニルとすることができ、例えば、Ｒ９、Ｒ１０及び窒素は、一緒にイミドを形成しない。更により好ましい実施形態においては、「アミン」という用語は、例えばＲ９とＲ１０の一方がカルボニルである、アミドを包含しない。更により好ましい一実施形態においては、Ｒ９及びＲ１０（及び場合によってはＲ’１０）は各々独立に、水素、アルキル若しくはシクロアルキル、アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はアルキニルである。したがって、「アルキルアミン」という用語は、（アルキルに関して上述したような）置換又は非置換アルキルが結合した上記アミン基を指し、すなわち、Ｒ９とＲ１０の少なくとも一方はアルキル基である。
「アミド」という用語は、アミノ置換カルボニルとして当該技術分野で認知されており、下記一般式で表すことができる部分を含む。
Figure 0006991977000002
式中、Ｒ９及びＲ１０は、上で定義したとおりである。
「ナノ材料」という用語は、少なくとも１つの寸法が約１ナノメートル～１ミクロンである材料を指す。
「デンドリマー系ナノ粒子」又は「ＭＤＮＰ」という用語は、デンドリマー及び疎水性固定化ポリマー、並びに一般にペイロード分子を含む外面を含む、ナノスケール粒子、送達ビヒクルを指す。一般に、ペイロード分子は、粒子内に封入される。
「形質転換」及び「形質移入」という用語は、当該技術分野で公知の幾つかの技術による細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する。
標的に「特異的に結合する」という用語は、他の生物学的製剤の不均一な集団の存在下で、分子の存在の決定因である結合反応を指す。
「移行シグナル」又は「局在配列」又は「認識配列」又は「ターゲティングシグナル」又は「認識配列」又は「認識タグ」又は「認識ポリヌクレオチド」は、区別なく使用され、特定の細胞、組織、細胞小器官又は細胞内領域に分子を誘導するシグナルを指す。シグナルは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは炭水化物部分とすることができ、又は結合分子を所望の場所に誘導するのに十分な有機若しくは無機化合物とすることができる。
「ベクター」という用語は、挿入セグメントの複製を引き起こすように別の核酸配列セグメントをその中に挿入することができる複製ＲＮＡ、プラスミド、ファージ、コスミドなどの核酸分子又はポリヌクレオチドを指す。上記ベクターは、発現ベクターとすることができる。
「複製ＲＮＡ」、「ｒｅｐＲＮＡ」、「レプリコンｍＲＮＡ」、「ｍＲＮＡレプリコン」及び「レプリコンＲＮＡ」という用語は、区別なく使用され、感染性子孫ビリオンを産生することができない、複製能力のある、子孫のできないＲＮＡウイルスゲノムを指す。一般にｒｅｐＲＮＡとして使用するために修飾されるウイルスゲノムとしては、「プラス鎖」ＲＮＡウイルスが挙げられる。これらの修飾ウイルスゲノムは、複製のためのｍＲＮＡとテンプレートの両方として機能する。「発現ベクター」という用語は、１個以上の発現制御配列を含むベクターを指す。
「核酸」という用語は、ヌクレオチド及びヌクレオシドの任意の天然又は合成線状連続アレイ、例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含めたＤＮＡ、複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ガイド鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及びそれらの誘導体を指す。こうした核酸を「構築物」又は「プラスミド」と総称する。核酸の代表例としては、ウイルスベクター、バクテリオファージ核酸由来のベクター、及び化学合成ＤＮＡ又はＲＮＡのような合成オリゴヌクレオチドなど、ただしそれらに限定されない、発現、クローニング、コスミド及び形質転換ベクターを含めた細菌プラスミドベクターが挙げられる。「核酸」という用語は、更に、５－ブロモウラシルなど、ただしそれだけでないハロゲン化ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチドなどの誘導体化ヌクレオチドなど、ただしそれらに限定されない、修飾又は誘導体化ヌクレオチド及びヌクレオシドも含む。
「遺伝子」又は「複数の遺伝子」という用語は、ＲＮＡ全体、タンパク質全体、又はこうしたＲＮＡ全体若しくはタンパク質全体の任意の部分の合成用遺伝情報をコードするＲＮＡとＤＮＡの両方を含めて、単離又は修飾核酸配列を指す。特定の生物のゲノムの天然に一部ではない遺伝子は、「外来性遺伝子」、「異種遺伝子」又は「外来遺伝子」と称され、特定の生物のゲノムの天然に一部である遺伝子は「内在性遺伝子」と称される。ゲノムＤＮＡに関連して使用される「遺伝子」という用語は、介在非翻訳領域及び調節領域を含み、５’及び３’末端を含むことができる。
「発現される」又は「発現」という用語は、遺伝子の２本の核酸鎖の一方の領域に少なくとも部分的に相補的なＲＮＡ核酸分子へのＤＮＡからの転写を指す。「発現される」又は「発現」という用語は、タンパク質若しくはポリペプチド又はその一部を生じる前記ＲＮＡ核酸分子からの翻訳も指す。
「抗原」という用語は、適応免疫応答の受容体の標的として働く任意の物質（例えば、病原体又は癌若しくは前癌細胞によって発現される、又はそれに関連する成分などのペプチド、タンパク質、核酸、脂質、小分子）を指す。抗原は、病原体、癌又は前癌細胞の構成成分であり得る。
「病原体」という用語は、疾患を引き起こす生物又は他の実体を指す。例えば、病原体は、プリオン、ウイルス、細菌などの原核生物、原生動物、真菌などの真核生物であり得る。病原体は、適応免疫応答を発生させることができる抗原源であり得る。
「ポリペプチド」という用語は、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは、アミノ酸残基配列として記述される。これらの配列は、アミノ（Ｎ）からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に左から右に記述される。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列は、以下に示すように３文字又は１文字表記で命名される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
「抗体」という用語は、特に明示しない限り、最も広い意味で使用される。したがって、「抗体」は、天然、又は従来のハイブリドーマ技術によって製造されるモノクローナル抗体などの人工のものとすることができる。抗体としては、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びにこれらの抗体の抗原結合ドメイン及び／又は１個以上の相補性決定領域を含む断片が挙げられる。「抗体」とは、任意の形態の抗体又はその抗原結合断片を指し、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含む。
「個体」、「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、区別なく使用され、ヒト、マウス、ラットなどのげっ歯類、及び他の実験動物を含めて、ただしそれらに限定されない哺乳動物を指す。
「生体適合性」という用語は、それ自体が宿主（例えば、動物又はヒト）に有毒でなく、単量体若しくはオリゴマーのサブユニット又は他の副生物を有毒な濃度で宿主中で生成する速度で分解しない（ポリマーが分解する場合）、１種以上の材料を指す。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこうした媒体及び剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。従来の媒体又は薬剤が活性化合物に不適合な場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補充の活性化合物を組成物に混ぜ込むこともできる。
ＩＩ．タンパク質、小分子及び核酸を細胞の内部に送達するための組成物
治療薬、予防薬及び診断薬を対象の細胞に送達するのを促進する組成物が開発された。核酸などの分子を細胞の内部に送達する効力は、抗原提示細胞による取り込み、ファゴソーム／リソソームエスケープ、核酸非パッケージング、細胞内移動などの障壁を克服することと強く相関する。遺伝物質の場合、持続的な遺伝子発現も考慮事項である。血流中で効果的に存続し、標的細胞による取り込みを可能にするには、送達ビヒクルは、免疫原性が最小でなければならない。臨床的に妥当であるためには、送達ビヒクルは、細胞毒性が最小でなければならない。
組成物は、無毒、非免疫原性、生分解性ナノ粒子内に封入又はカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬を含み、治療薬、予防薬及び診断薬を細胞内空間に効率的に送達するために生体内で真核細胞による取り込みに適したサイズである。送達ビヒクルは、治療薬、予防薬及び診断薬を体内の免疫監視及び劣化から保護し、カプセル活性薬剤の血清中半減期を延ばすことができる。送達ビヒクルは、場合によっては、特異性及び標的細胞による取り込みを高める１個以上のターゲティングモチーフを含むことができる。
Ａ．修飾デンドリマー系ナノ粒子（ＭＤＮＰ）
ＭＤＮＰは、細胞内部への広範な分子の有用な送達ビヒクルである。ＭＤＮＰは、リピドイド様形態の１００ｎｍスケール粒子に自己組織化する合成多成分構造体である。ＭＤＮＰは、大型複製ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、小分子などの１個以上の核酸を包む球状の層状構造体である。核酸、タンパク質及び小分子を含む容器としてＭＤＮＰを使用する治療薬、予防薬及び診断薬の細胞内送達用組成物は、ワクチン試薬、治療法、及び基礎研究用ツールを含めて、様々な適用例について記述されている。
ＭＤＮＰは、イオン化可能であり低ｐＨで正に帯電するデンドリマー、１種以上の両親媒性ポリマー、並びに対象の細胞に送達される１種以上の治療薬、予防薬及び／又は診断薬から処方される。一般に、ＭＤＮＰは、無毒、非免疫原性であり、一般に、真核細胞による取り込みに適したサイズである。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、特定の細胞型又は細胞型のグループによる取り込みを阻止又は促進するサイズである。例えば、ＭＤＮＰは、マクロファージなどの抗原提示細胞による取り込みを促進又は阻止するように設計することができる。単一の修飾デンドリマー系ナノ粒子の例示的サイズは、最長寸法が３０ｎｍ～１，０００ｎｍの範囲であり、例えば、ＭＤＮＰは、平均サイズが３０ｎｍ～４５０ｎｍ（両端を含む）、例えば５０ｎｍ～３００ｎｍ（両端を含む）、より好ましくは６０ｎｍ～２５０ｎｍ（両端を含む）とすることができる。ナノ粒子サイズは、コアデンドリマーを置換するアルキル鎖の長さによって影響され得る。それは、両親媒性ポリマーの量、及びカプセル剤のサイズによっても影響され得る。
１．イオン性デンドリマー系ナノ材料
一般に、デンドリマーは、イオン化可能であり、低ｐＨ値で正に帯電する。デンドリマーは、一般に、連続的な世代がその上に結合する、特定の数の反応基を有する明確なコア構造に由来する繰返し層、すなわち世代から構成される。デンドリマーは、第０～７世代とすることができる。デンドリマーの世代が高いほど、溶解性が大きく減少する。デンドリマーの構造的多様性、世代の数、及び可能な脂質修飾の範囲のため、薬物送達システムの開発は途方もない組み合わせの可能性がある。一般に、デンドリマー系ナノ材料は、エポキシド末端分子を用いて処方される。
連続的な各デンドリマー世代は、前の世代に共有結合することができる。コア構造の反応基の数は、ｎ－方向性（ｎ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を決定し、結合して次世代を形成することができる構造体の数を規定する。
樹状構造における分岐の数は、コアを含めて、単量体構成要素の分岐価数に依存する。例えば、コアが第一級アミンである場合、アミン窒素は二価であり、１→２分岐モチーフを生じるであろう。
デンドリマーは、好ましくは、本明細書で「アルキル化デンドリマー」と称するアルキル化デンドリマーである。例示的なデンドリマー材料としては、ポリ（アミド－アミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリエステル、ポリリジン、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ－Ａｍ４）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリリジン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、及び／又は芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられるが、それらに限定されない。
デンドリマーは、カルボキシ、アミン及びヒドロキシ末端を有することができ、第１世代デンドリマー（Ｇ１）、第２世代デンドリマー（Ｇ２）、第３世代デンドリマー（Ｇ３）、第４世代デンドリマー（Ｇ４）、第５世代デンドリマー（Ｇ５）、第６世代デンドリマー（Ｇ６）、第７世代デンドリマー（Ｇ７）、第８世代デンドリマー（Ｇ８）、第９世代デンドリマー（Ｇ９）又は第１０世代デンドリマー（Ｇ１０）を含めて、ただしそれらに限定されない、任意の世代のものとすることができる。ＭＤＮＰは、１０を超える世代のデンドリマーから形成することもできる。
ＰＡＭＡＭクラスのデンドリマーは、それらの生分解性を高め、したがってヒトへの治療応用に関して寛容性を向上させることができる内部アミド結合を含む。アミノ表面は、極性、高反応性第一級アミン表面基を含む。アミノ官能性ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面は、カチオン性であり、負に帯電した分子とのイオン相互作用によって、又は第一級アミンの多数の周知の共有結合性官能基化試薬を用いて、誘導体化することができる。
Figure 0006991977000003
 式Ｉ：第０世代（Ｇ０）ポリ（アミド－アミン）（ＰＡＭＡＭ）の分子構造。
ＭＤＮＰがＰＡＭＡＭデンドリマーから形成されるときには、第０～７世代ＰＡＭＡＭデンドリマーが一般に使用される。例えば、ＭＤＮＰを第０世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｇ０）、第１世代（Ｇ１）ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代（Ｇ２）ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代（Ｇ３）ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代（Ｇ４）ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代（Ｇ５）ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代（Ｇ６）ＰＡＭＡＭデンドリマー又は第７世代（Ｇ７）ＰＡＭＡＭデンドリマーから形成することができる。連続的に増加する世代（Ｇ０～Ｇ３）のＰＡＭＡＭデンドリマーの構造を示す例示的なスキームを下記スキームＩに示す。
ＰＡＭＡＭは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号５９７３０９）を含めて、複数の供給源から市販されている。
第０～３世代（Ｇ０～Ｇ３）のＰＡＭＡＭデンドリマーの分子構造を図２Ａに示す。
ポリエチレンイミン（ポリアジリジンとしても知られる）は、アミン基の繰返し単位及び炭素２個の脂肪族（ＣＨ２ＣＨ２）スペーサを有するポリマーである。
Figure 0006991977000004
 式ＩＩ：ポリエチレンイミンモノマー、及びポリ（エチレン－イミン）（ＰＥＩ）モノマーの繰返し単位。
ＭＤＮＰがＰＥＩデンドリマーから形成されるときには、第０～７世代ＰＥＩデンドリマーが一般に使用される。例えば、ＭＤＮＰを第０世代ＰＥＩデンドリマー（Ｇ０）、第１世代（Ｇ１）ＰＥＩデンドリマー、第２世代（Ｇ２）ＰＥＩデンドリマー、第３世代（Ｇ３）ＰＥＩデンドリマー、第４世代（Ｇ４）ＰＥＩデンドリマー、第５世代（Ｇ５）ＰＥＩデンドリマー、第６世代（Ｇ６）ＰＥＩデンドリマー又は第７世代（Ｇ７）ＰＥＩデンドリマーから形成することができる。連続的に増加する世代（Ｇ１～Ｇ３）のＰＥＩデンドリマーの構造の例示的なスキームを下記スキームＩＩに示す。
ＰＥＩは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号４８２５９５）を含めて、複数の供給源から市販されている。
第１～３世代（Ｇ１～Ｇ３）のＰＥＩデンドリマーの分子構造を図２Ａに示す。
ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ Ａｍ４）は、４個の表面第一級アミノ基を有する１，４－ジアミノブタンコア（４炭素コア）を有するポリマーである。
Figure 0006991977000005
 式ＩＩＩ：第１世代（Ｇ１）ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン（ＤＡＢ－Ａｍ４）の分子構造。
ＭＤＮＰがＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーから形成されるときには、第０～７世代ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーが一般に使用される。例えば、ＭＤＮＰを第０世代ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー（Ｇ０）、第１世代（Ｇ１）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー、第２世代（Ｇ２）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー、第３世代（Ｇ３）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー、第４世代（Ｇ４）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー、第５世代（Ｇ５）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー、第６世代（Ｇ６）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマー又は第７世代（Ｇ７）ＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーから形成することができる。連続的に増加する世代（Ｇ１～Ｇ３）のＤＡＢ－ＡＭ４デンドリマーの構造の例示的なスキームを下記スキームＩＩＩに示す。
ＤＡＢ－Ａｍ４は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号４６０６９９）を含めて、複数の供給源から市販されている。
第１～４世代（Ｇ１～Ｇ４）のＤＡＢ－Ａｍ４デンドリマーの分子構造を図２Ａに示す。
ＭＤＮＰは、１種以上の異なるデンドリマーで形成することができる。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、化学的性質が他のデンドリマーと類似していても、異なってもよい（例えば、第１のデンドリマーをＰＡＭＡＭデンドリマーとすることができ、第２のデンドリマーをＰＯＰＡＭデンドリマーとすることができる）。一部の実施形態においては、第１又は第２のデンドリマーは、追加の薬剤を更に含むことができる。デンドリマー複合体は、複数のデンドリマーを含むことができる。例えば、ナノ粒子は第３のデンドリマーを含むことができ、第３のデンドリマーは、少なくとも１種の別のデンドリマーと複合化される。第３の薬剤を第３のデンドリマーと複合化することができる。別の一実施形態においては、第１及び第２のデンドリマーが各々第３のデンドリマーと複合化され、第１及び第２のデンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーであり、第３のデンドリマーがＰＯＰＡＭデンドリマーである。追加のデンドリマーを組み込むこともできる。複数のデンドリマーを利用するときには、複数の薬剤を組み込むこともできる。一般に、末端エポキシドを有するデンドリマー上の第一級アミンと第二級アミンの反応は、アルキル鎖で置換されたデンドリマーを生成する。
ａ．エポキシド
一般に、デンドリマーは、アルキルエポキシドとの反応によって修飾される。一部の実施形態においては、アルキルエポキシドは、デンドリマー上に存在するアミノ基と反応して、アルキル化デンドリマーを形成する。
エポキシドは、式ＩＶに示す構造を有することができる。式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０（両端を含む）、好ましくはＣ６～Ｃ１８の任意の線状アルキル基とすることができる。
Figure 0006991977000006
 式ＩＶ：繰返し単位を含むエポキシドの一般構造式。式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０（両端を含む）の任意の線状アルキル基とすることができる。
Figure 0006991977000007
 式Ｖ：エポキシドの代表的な基の構造式（Ｃ６～Ｃ１８）
例示的なエポキシドとしては、２－トリデシルオキシラン（Ｃ１５Ｈ３０Ｏ）及び１，２－エポキシドデカン（Ｃ１２Ｈ２４Ｏ）が挙げられる。
エポキシドを含むデンドリマーの修飾の例示的なスキームを下記スキームＩに示す。スキームＩは、アルキル鎖上に末端エポキシドを有するデンドリマー内の第一級アミンと第二級アミンの反応によるデンドリマー－脂質の合成経路を示す。一般に、反応は、エタノール溶媒、９０℃の反応温度、及び暗所で最低７２時間の反応時間を必要とする。
Figure 0006991977000008
 スキームＩ：ＭＤＮＰの形成に使用されるイオン性デンドリマー系ナノ材料を形成する例示的な反応スキーム。
２．両親媒性ポリマー
ＭＤＮＰは、生体適合性、非免疫原性、無毒であるＰＥＧ－脂質複合物などの親水性－疎水性ポリマーを含む。
ａ．疎水性成分
疎水性二重層又は脂質二重層内の会合に十分適合した１タイプの疎水性成分は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などのリン脂質、コレステロール、セラミド、リゾ脂質、リゾリン脂質、及びスフィンゴ脂質である。ＰＥと結合ポリマーの結合は、エステル及び／又はカルバミン酸誘導体を含むことができる。ＰＥは、飽和又は不飽和ＰＥとすることができる。セラミドは、短鎖（例えば、Ｃ８）、中間鎖（例えば、Ｃ１４）若しくは長鎖（例えば、Ｃ２０）脂肪アミド、又は脂肪酸（例えば、オレイン酸）誘導体とすることができる。中性及びアニオン性脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（卵ＰＣ、大豆ＰＣなど）、１，２－ジアシル－グリセロ－３－ホスホコリン；ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）；糖脂質；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質、セラミドガラクトピラノシド、ガングリオシド、セレブロシドなどのスフィンゴ糖脂質（１－セラミジルグルコシドとしても知られる）；脂肪酸、コレステロール、その誘導体などのカルボン酸基を含むステロール；並びに１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンを含めた１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、又は１，２－ジオレオイルグリセリルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジヘキサデシルホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ）、１，２－ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及び１，２－ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）が挙げられるが、それらに限定されない。
ＴＡＰ脂質とも称されるトリメチルアンモニウム塩、例えば、硫酸メチル。適切なＴＡＰ脂質としては、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル－）、ＤＭＴＡＰ（ジミリストイル－）、ＤＰＴＡＰ（ジパルミトイル－）及びＤＳＴＡＰ（ジステアロイル－）が挙げられるが、それらに限定されない。別の適切なカチオン性脂質としては、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジアシルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン、Ｎ－［１－（２，３－ジオロイルオキシ（ｄｉｏｌｏｙｌｏｘｙ））プロピル］－Ν，Ν－ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）が挙げられる。
ｂ．親水性成分
ポリβアミノエステル及び１，２－アミノアルコール脂質を含めて、多種多様な親水性ポリマーが挙げられる。一部の実施形態においては、ポリマーは、アルキル修飾ポリ（エチレングリコール）などのアルキル修飾ポリマーである。別の例示的なポリマーとしては、ポリ（アルキレングリコール）、多糖、ポリ（ビニルアルコール）、ポリピロリドン、ポリオキシエチレンブロックコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びそれらのコポリマーが挙げられる。好ましい親水性ポリマーは、生体適合性であり（すなわち、重大な炎症反応又は免疫応答を誘導しない）、無毒である。適切な親水性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなどのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、多糖類、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、並びにそれらのコポリマー、ターポリマー及び混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
好ましい実施形態においては、１種以上の親水性ポリマー成分は、ポリ（アルキレングリコール）鎖を含む。ポリ（アルキレングリコール）鎖は、１～５００個の繰り返し単位、より好ましくは４０～５００個の繰り返し単位を含むことができる。適切なポリ（アルキレングリコール）としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン１，２－グリコール、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリプロピレン１，３－グリコール、及びそれらのコポリマーが挙げられる。
一部の実施形態においては、１種以上の親水性ポリマー成分は、別の生体適合性ポリマー（例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）又はポリカプロラクトン）で構成される１個以上のブロックと一緒にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の１個以上のブロックを含むコポリマーである。１個以上の親水性ポリマーセグメントは、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含む１個以上のブロックと一緒にＰＥＯの１個以上のブロックを含むコポリマーとすることができる。具体例としては、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲＳ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などのＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯのトリブロックコポリマーが挙げられる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。ＰＥＧは、最も一般的に使用される遮蔽剤の１つである。ＭＤＮＰに含まれる両親媒性ＰＥＧのサイズ、相対量及び分布は、生成する修飾デンドリマー系ナノ粒子（ＭＤＮＰ）の構造的特徴、電荷密度などの生物物理学的特性に影響し得る。
ＭＤＮＰの物性は、両親媒性ＰＥＧのサイズ、相対量及び分布（すなわち、ＰＥＧ化の程度）に直接関連する。改変し得る例示的な性質としては、１タイプ以上の真核細胞によるＭＤＮＰの取り込みの有効性、治療薬、予防薬及び診断薬の細胞内送達の速度及び有効性、並びにＭＤＮＰの免疫原性及び細胞毒性が挙げられる。ある実施形態においては、ＰＥＧ化は、ＭＤＮＰの電荷中和をもたらす。
一般に、両親媒性ＰＥＧとしては、短鎖オリゴエチレングリコールが挙げられる。例示的なオリゴエチレングリコールとしては、ジ－エチレングリコール、トリ－エチレングリコール、テトラ－エチレングリコール、ペンタ－エチレングリコール、ヘキサ－エチレングリコールなどが挙げられる。
Figure 0006991977000009
 式ＶＩ：短鎖オリゴエチレングリコール（ｎ＝１～６）ＰＥＧモノマーの繰返し単位
一部の実施形態においては、両親媒性ポリマーは、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）と複合化されたリン脂質である。ある実施形態においては、脂質に連結されたＰＥＧ又はｍＰＥＧは、分岐又は「多腕」ＰＥＧである。ＭＤＮＰは、スルフヒドリル又はチオピリジン末端基を有する少なくとも２個の分枝を有する多腕ポリエチレングリコールを含むことができるが、スクシンイミジル又はマレイミド末端などの別の末端基を有するＰＥＧポリマーを使用することもできる。
ＭＤＮＰは、分子量の異なるポリエチレングリコールポリマーを含むことができる。例えば、ＰＥＧは分子量が約１００Ｄａ（すなわち、ＰＥＧ１００Ｄａ）～約１２，０００ｋＤａ（すなわち、ＰＥＧ１２ＫＤａ）（両端を含む）とすることができる。ＭＤＮＰは、単一種の両親媒性ＰＥＧ、又は２つ以上の異なる種の両親媒性ＰＥＧから形成することができる。例えば、ＭＤＮＰは、分子量の異なる複数種の脂質固定化ＰＥＧを用いて形成することができる。
ＭＤＮＰは、単一の両親媒性ポリマー種、又は複数の異なる両親媒性ポリマー種の混合物を用いて形成することができる。両親媒性ポリマーは、付加物で修飾することができる。例えば、両親媒性ポリマーを同じ又は異なる１種以上の異なる付加物で修飾することができる。したがって、修飾デンドリマー系ナノ粒子は、場合によっては同じ又は異なる付加物の混合物を含む、１種以上の脂質固定化ポリマーを用いて形成することができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］（Ｃ１４－ＭＰＥＧ）分子を用いて処方される。Ｃ１４－ＭＰＥＧは、一般に、分子量３５０Ｄａ～１２，０００Ｄａ、より好ましくは１，０００Ｄａ～５，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００ＤａのｍＰＥＧ成分を含む。
例示的な脂質固定化ｍＰＥＧは、分子構造が式ＶＩＩで示される１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ１４－ｍＰＥＧ（２０００））である。
Figure 0006991977000010
 式ＶＩＩ：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の分子構造
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、両親媒性ポリマーＣ１４－ｍＰＥＧ２０００を用いて処方される。別の実施形態においては、ＭＤＮＰは、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（３５０）、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（５５０）、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（７５０）、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（１０００）、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（３０００）、Ｃ１４－ｍＰＥＧ（５０００）などの異なる分子量のｍＰＥＧを含むＣ１４－ｍＰＥＧ分子を用いて処方される。一部の実施形態においては、ＰＥＧは、ｍＰＥＧ５０００（すなわち、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－５０００］）である。脂質成分は、飽和又は不飽和脂肪酸部分を含むことができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ）分子を用いて処方される。ＤＳＰＥ－ＭＰＥＧは、一般に、分子量３５０Ｄａ～１２，０００Ｄａ、より好ましくは１，０００Ｄａ～５，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００ＤａのｍＰＥＧ成分を含む。
例示的な脂質固定化ｍＰＥＧは、分子構造が式ＶＩＩＩで示される１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００））である。
Figure 0006991977000011
 式ＶＩＩＩ：１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の分子構造
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、両親媒性ポリマーＤＳＰＥ－ｍＰＥＧを用いて処方される。別の実施形態においては、ＭＤＮＰは、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（３５０）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（５５０）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（７５０）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（１０００）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（３０００）、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（５０００）などの異なる分子量のｍＰＥＧを含むＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ分子を用いて処方される。脂質成分は、飽和又は不飽和脂肪酸部分を含むことができる。
別の実施形態においては、ＭＤＮＰは、両親媒性ポリマーＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］｝（Ｃ８ＭＰＥＧセラミド）分子を用いて処方される。Ｃ８ＭＰＥＧセラミド分子は、一般に、分子量７５０Ｄａ～５，０００Ｄａ、より好ましくは１，０００Ｄａ～５，０００Ｄａ、最も好ましくは２，０００ＤａのｍＰＥＧ成分を含む。
例示的なセラミド固定化ｍＰＥＧは、分子構造が式ＩＸで示されるＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝（Ｃ８ＭＰＥＧ２０００セラミド）である。
Figure 0006991977000012
 式ＩＸ：Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００］｝の分子構造
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、セラミド固定化ポリマーＣ８ＭＰＥＧ２０００セラミドを用いて処方される。別の実施形態においては、ＭＤＮＰは、Ｃ８ＭＰＥＧ７５０セラミド、Ｃ１６ＭＰＥＧ７５０セラミド、Ｃ８ＭＰＥＧ２０００セラミド、Ｃ１６ＭＰＥＧ２０００セラミド、Ｃ８ＭＰＥＧ５０００セラミド、Ｃ１６ＭＰＥＧ５０００セラミドなどの異なる分子量ｍＰＥＧを含むＣ８ＭＰＥＧセラミド分子を用いて処方される。
一部の実施形態においては、１種以上の両親媒性ポリマーは、異なる構造的及び機能的特性をポリマーに付与する１個以上の部分の付加によって修飾される。例えば、一部の実施形態においては、１種以上の両親媒性ポリマーがポリペプチド又は別の小分子の付加によって修飾される。修飾脂質結合ポリマーを使用して、修飾のない同じＭＤＮＰに比べて、１つ以上の異なる機能的又は構造的特性を修飾デンドリマー系ナノ粒子（ＭＤＮＰ）に付与することができる。例示的な機能的又は構造的特性としては、修飾デンドリマー系ナノ粒子（ＭＤＮＰ）の流体力学的体積、疎水性、抗原性、受容体結合特異性及び血清中半減期の変化が挙げられる。
３．治療薬、予防薬及び診断薬
ＭＤＮＰは、細胞内空間に送達する１種以上の治療薬、予防薬及び診断薬を含む。一部の実施形態においては、１種以上の治療薬、予防薬及び診断薬は、外来遺伝子配列をコードするｍＲＮＡ、ｒｅｐＲＮＡなどの核酸である。一部の実施形態においては、外来遺伝子配列は、ウイルス、病原体、微生物又は癌に特異的な１種以上の抗原をコードする。
ＭＤＮＰは、封入された治療薬、予防薬及び診断薬を化学、光及び酵素分解から保護する。ＭＤＮＰ内に封入されたＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼ、ヒドロキシラジカル、ＵＶ光、及びＭｇ２＋媒介性の系内攻撃による劣化に対して安定化され、ＲＮＡを安定化し生体内で細胞に送達するための化学修飾が不要である。ＭＤＮＰの高い安定性によって、長期間の貯蔵が可能になり、エアロゾル、溶液、粉体などでの分散を含めて、広範囲の適用法が可能になる。
ａ．核酸
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰ内にカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬は、１個以上の核酸を含む。核酸治療薬、予防薬及び診断薬の代表例としては、発現ベクターなどのＤＮＡプラスミドベクター、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、ｒｅｐＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集のためのガイドＲＮＡ／単一ガイドＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子が挙げられる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰ内にカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬は、レシピエント細胞における１個以上の遺伝子の発現のための１個以上の核酸発現ベクターを含む。一部の実施形態においては、遺伝子は、宿主生物に外来のものである。別の実施形態においては、遺伝子は、宿主生物に生来のものである。ある実施形態においては、遺伝子は、１個以上の対立遺伝子の変種など、生物に一般に付随するものの修飾変異体である。
核酸発現ベクターの代表例としては、ウイルスベクター、バクテリオファージ核酸由来のベクター、及び化学合成ＤＮＡを含めた合成オリゴヌクレオチドなど、ただしそれらに限定されない、発現、クローニング、コスミド及び形質転換ベクターなどのＤＮＡプラスミドベクター、並びに複製ＲＮＡを含めたＲＮＡベクターが挙げられる。一般に、挿入セグメントの複製及び発現を引き起こすように遺伝子セグメントをその中に挿入することができる任意の発現ベクターを、対象の細胞中に送達するために、修飾デンドリマー系ナノ粒子中に含むことができる。
一般に、ＭＤＮＰの核酸発現ベクターは、対象の細胞などの標的細胞において異種核酸配列を発現するように設計され、１個以上の発現制御配列を含む。発現ベクターは、プロモーター、プロモーターに作動可能に結合した異種核酸配列、異種核酸配列に作動可能に結合した真核生物転写ターミネーター、及び複製開始点を含むことができる。
一般に、宿主細胞に適合した種に由来するレプリコン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選抜を行うことができる標識配列を有する。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾の特徴的特異的機序を有する。哺乳動物細胞に使用される発現ベクターは、通常、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列と一緒に、複製開始点（必要に応じて）、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモーターを含む。
ある実施形態においては、ＭＤＮＰは、１個以上のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む。ＲＮＡは、大量に製造するのに費用効果が高く、商業的に合成されたＤＮＡ前駆体由来の任意の所与の発見配列からほぼ即日の迅速性で内毒素なしに生成することができる。それは、ゲノム組み込みのリスクがなく、細胞質に接近するだけで機能するので、ＤＮＡよりも安全で投与が容易である。さらに、アルファウイルス又はフラビウイルスゲノムに基づく自己複製ｍＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）が利用可能であるため、極めて低用量で、最大の免疫原性及び抗原産生レベルを達成することができる。
ある実施形態においては、ＭＤＮＰは、レプリコンとしても知られる１個以上の複製リボ核酸（ｒｅｐＲＮＡ）を含む。複製ＲＮＡは、ワクチン抗原をコードする遺伝子を含めた遺伝子を送達する能力がある自己増幅ＲＮＡである。ｒｅｐＲＮＡは、子孫ビリオンの生成に必要なウイルス構造タンパク質を欠く弱毒ウイルスゲノムである。しかし、ｒｅｐＲＮＡは、翻訳及び複製の能力を保持し、したがってｍＲＮＡの翻訳の半減期を効果的に増加させることができる。したがって、１個以上の外来遺伝子をコードするｒｅｐＲＮＡを細胞に送達すると、１個以上の外来遺伝子をコードする等モル量の従来のｍＲＮＡの細胞への送達によるのに比べて、細胞における外来遺伝子の翻訳及び発現を効果的に増加させることができる。一部の実施形態においては、ｒｅｐＲＮＡは、非細胞変性ｒｅｐＲＮＡである。
アルファウイルス自己増幅ｒｅｐＲＮＡは、一般に、５’Ｃａｐ；５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、第１のオープンリーディングフレーム内でコードされた非構造遺伝子（例えば、ＮＳＰ１－４）、ゲノムプロモーター領域（例えば、２６Ｓサブゲノムプロモーター）、第２のオープンリーディングフレーム、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及び３’ポリアデニル化テールを含む。ｒｅｐＲＮＡ分子は、一般に、コードされた遺伝子配列のサイズに応じて、９，０００～２０，０００ヌクレオチド長である（図１Ａ～１Ｃ参照）。
非構造遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする。一般に、ＲｄＲｐは、従来のｍＲＮＡをエンドヌクレオーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｓｅ）及び自己触媒分解に対して保護するために使用される古典的なヌクレオチド修飾を許容しない。したがって、ナノカプセル化は、ワクチンプラットホームにおける有効な配置に必要である。ｒｅｐＲＮＡは、モジュール方式であり、第２のオープンリーディングフレームを、外来性の対象遺伝子（ＧＯＩ：ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）などの完全な遺伝子に合わせて配列するように設計することができる。
第２のオープンリーディングフレーム内でコードされた抗原遺伝子などの１個以上の所望の遺伝子配列を含むｒｅｐＲＮＡを使用することができる。ｒｅｐＲＮＡが宿主細胞の細胞質に入ると、ｒｅｐＲＮＡ ＮＳ遺伝子によってコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）が細胞内で発現される。ＲｄＲｐは、次いで、ｒｅｐＲＮＡ全体、又はｒｅｐＲＮＡでコードされた抗原のＲｄＲｐ複製物のみ（すなわち、サブゲノムプロモーターによって）を複製することができる。
ｒｅｐＲＮＡは、完全長レプリコンのより多くの複製物、及び第２のオープンリーディングフレームに含まれる遺伝子をコードするｍＲＮＡのより多くの複製物を合成することができるので、レプリコンＲＮＡは、ＲＮＡによって媒介される遺伝子送達の総合効率を増加させる。宿主細胞リボソームは、完全長レプリコン複製物又はより短い抗原のみのｍＲＮＡを連続して翻訳して、ｒｅｐＲＮＡによってコードされた遺伝子の発現を高める（図１Ａ参照）。
自己複製ＲＮＡは、容易に送達されて標的細胞の正しいサイトゾル移行の成功を保証できるよりも多数のｍＲＮＡテンプレートを生成し得る。ｒｅｐＲＮＡの自己複製性は、天然の感染性ウイルス粒子のそれを厳密に模倣したものであり、液性細胞免疫防御と細胞毒性細胞免疫防御の両方のアームを誘導するのにより効率的である。
単一ｒｅｐＲＮＡは、１個以上の外来遺伝子をコードする核配列を含むことができる。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１個以上の外来遺伝子配列各々をコードする１個以上のｒｅｐＲＮＡを含む。
異なるウイルスゲノムに由来するｒｅｐＲＮＡは、異なる機能特性を外来遺伝子の発現及び転写に付与することができる。例えば、同じ外来遺伝子をコードする異なるｒｅｐＲＮＡ種は、外来遺伝子の転写の異なる速度及び異なる半減期を生じ得る。一般に、遺伝子の翻訳効率（翻訳の活性化又は完全な阻害を含む）は、ＵＴＲによって制御することができる。
一部の実施形態においては、単一のＭＤＮＰは、異なるウイルスゲノムに由来する１個を超える異なるｒｅｐＲＮＡを含む。異なるウイルスゲノムに由来する２個以上のｒｅｐＲＮＡを同じＭＤＮＰ内にカプセル化すると、ｒｅｐＲＮＡは、同じ又は異なる外来遺伝子の１個以上をコードすることができる。１個を超えるｒｅｐＲＮＡを単一のＭＤＮＰ内にカプセル化するときには、ｒｅｐＲＮＡは、ｒｅｐＲＮＡの同じ種でも異なる種でもよい。
一般に、ｒｅｐＲＮＡは、「プラス鎖」ＲＮＡウイルスの修飾によって生成される。修飾ウイルスゲノムは、細胞内自己複製のためのｍＲＮＡとテンプレートの両方として機能する。これは、ｍＲＮＡテンプレートの初期の複製及び形成を促進するためにそれら自体のポリメラーゼと一緒に送達されなければならない「マイナス鎖」ウイルスとは対照的である。後者の送達は、ウイルス様粒子の使用により依存し、合成粒子による送達にはあまり適切でない。例示的なｒｅｐＲＮＡとしては、アルファウイルス及びフラビウイルス属に属するウイルスの修飾ウイルスゲノムを含む。
アルファウイルスは、ウイルスのＩＶ族トガウイルス科に属する。一般に、これらのウイルスは、５’キャップ及び３’ポリＡテールを含めて、全ゲノム長が１１，０００～１２，０００ヌクレオチドである。４個の非構造タンパク質遺伝子が、ゲノムの５’側２／３でコードされる。複製は、宿主細胞の細胞質内で起こる。アルファウイルスゲノムの修飾に基づくｒｅｐＲＮＡの形成は、当該技術分野において確立されている（Ａｔｋｉｎｓら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、１０：ｅ３３（２００８）、Ｋｈｒｏｍｙｋｈ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、２：５５５～５６９（２０００）、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ４：２８～３４（２００２）、及びＲａｙｎｅｒ、Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．、１２：２７９～２９６（２００２））。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰ内のｒｅｐＲＮＡカプセル化は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）（カバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス、エバーグレイズウイルス、モッソ ダス ペドラス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ）ウイルス、ムカンボウイルス、パラマナ（Ｐａｒａｍａｎａ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、リオネグロウイルス、トロカラ（Ｔｒｏｃａｒａ）ウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルスサブタイプを含む）；セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）（ベバラ（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス及びセムリキ森林ウイルスサブタイプを含む）；シンドビスウイルス（ＳＶ）；東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）；バーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）；ミッデルブルクウイルス（ＭＶ）；ンズム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（ＮＶ）；及び西部ウマ脳炎（ＷＥＥＶ）（アウラウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス キジラガク（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、シンドビスウイルス、オケルボ（Ｏｃｋｅｌｂｏ）ウイルス及びワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルスサブタイプを含む）を含めて、ただしそれらに限定されない修飾アルファウイルス種に由来する。
フラビウイルスは、フラビウイルス科のウイルス属に属する。フラビウイルスは、５’キャップを含むが３’ポリＡテールを欠く、約１０，０００～１１，０００ヌクレオチドのプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。一般に、フラビウイルスゲノムは、３種の構造タンパク質及び８種の非構造タンパク質をコードする。フラビウイルスは、細胞質中で複製し、構築され、ヒトを含めた哺乳動物宿主に主に感染する。フラビウイルスゲノムの修飾に基づくｒｅｐＲＮＡの形成は、当該技術分野において確立されている（Ｋｏｆｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、１９５１～１９５６（２００４）、ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ２０１４、２、７３５～７５４（２００４））。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰ内にカプセル化されたｒｅｐＲＮＡは、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、アロア（Ａｒｏａ）ウイルス；日本脳炎ウイルス；デングウイルス（ＤＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス及び黄熱病ウイルスを含めて、ただしそれらに限定されない修飾フラビウイルス種に由来する。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、メッセンジャーリボ核酸配列（ｍＲＮＡ）を含む。ｍＲＮＡは、５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、翻訳開始コドンを含むコード領域、完全な遺伝子のヌクレオチド配列、翻訳終止コドン、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、３’末端に付加した１００～２００アデニンを含めたポリＡ付加部位を含む、遺伝子の一本鎖転写物である。ｍＲＮＡ分子は、一般に、コードされた遺伝子配列のサイズに応じて、２００～１０，０００ヌクレオチド長である。
宿主細胞の細胞質内の真核生物ｍＲＮＡは、リボソームによって翻訳され、翻訳効率（翻訳の活性化又は完全な阻害を含む）は、ＵＴＲによって制御することができる。３’又は５’ＵＴＲに結合するタンパク質は、ｍＲＮＡに結合するリボソームの能力を媒介することによって翻訳に影響し得る。翻訳は、細胞質中に浮遊する、又はシグナル認識粒子によって小胞体に誘導される、リボソームで行うことができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰ内にカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬は、対象の細胞中で発現され得る遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子である。ｍＲＮＡは、ペプチド抗原などの外来遺伝子をコードすることができる。１個以上の外来遺伝子をコードする１個以上のｍＲＮＡを単一のＭＤＮＰ内に封入することができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、同じｍＲＮＡの２個以上の分子を含む。別の実施形態においては、ＭＤＮＰは、２個以上の異なるｍＲＮＡを含む。例えば、単一のＭＤＮＰは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０又は２０個を超える異なるｍＲＮＡを含むことができる。２種以上のｍＲＮＡが単一のＭＤＮＰ内にカプセル化されるときには、２種以上のｍＲＮＡが等モル比（すなわち、１：１）又は不等モル比（すなわち、＞１：１）で存在することができる。例えば、２種のｍＲＮＡがＭＤＮＰ内に１：１、２：１、３：１、４：１、１０：１又は１０：１を超えるモル比で存在することができる。
ＭＤＮＰ内にカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬が、発現ベクター、ｍＲＮＡなどの１個以上の核酸を含むときには、ベクターは、レシピエント細胞内の発現のための１個以上の遺伝子領域をコードすることができる。一般に、遺伝子は、標的細胞に対して外来（すなわち、異種）遺伝子である。異種核酸配列は、１種以上の遺伝子産物の産生の目的で、及び／又はレシピエントにおける遺伝子発現を調節する目的で、ＲＮＡの一部若しくは全体、又はタンパク質の一部若しくは全体の合成のための遺伝情報をコードする任意の核酸配列とすることができる。一部の実施形態においては、異種核酸は、抗原をコードする。別の実施形態においては、異種核酸配列は、宿主細胞における生物学的反応を惹起及び／又は加減する要素をコードする。例えば、異種タンパク質は、１個以上の遺伝子の発現を阻害することができる。
異種核酸配列の例示的なリストは、抗原、リボザイム、酵素、ペプチド、構造タンパク質、構造ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集のためのガイドＲＮＡ／単一ガイドＲＮＡ）、転写因子、シグナル伝達分子、及びそれらの断片又は変異体をコードする遺伝子を含む。一実施形態においては、異種配列は、抗原をコードする。
異種配列は、場合によっては、特定の場所（例えば、細胞内の小器官）にターゲティング可能な核酸配列（すなわち、ターゲティング配列）を含むことができる。一部の実施形態においては、異種配列は、抗原をコードする。
ある実施形態においては、異種核酸配列は、機能性核酸である。標的遺伝子の転写、翻訳又は機能を阻害する機能性核酸について記述する。
機能性核酸は、標的分子との結合、特異反応の触媒などの特定の機能を有する核酸分子である。以下でより詳細に考察するように、機能性核酸分子は、以下の非限定的カテゴリに分類することができる：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ及び外部ガイド配列。機能性核酸分子は、標的分子によって保有される比活性のエフェクター、阻害物質、調節物質及び刺激物質として働くことができ、又は機能性核酸分子は、他の分子とは無関係に新規活性を保有することができる。
機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、糖鎖などの任意の巨大分子と相互作用することができる。したがって、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡと相互作用することができ、又は標的ポリペプチド自体と相互作用することができる。機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子の配列相同性に基づいて、別の核酸と相互作用するように設計されることが多い。別の状況では、機能性核酸分子と標的分子の間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子の配列相同性に基づくのではなく、特異的認識を生じさせる三次構造の形成に基づく。したがって、組成物は、標的タンパク質の発現又は機能を抑制するように設計された１種以上の機能性核酸を含むことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、アプタマーなどの上記機能性核酸の生体内発現のためのベクターを製造し、使用する方法は、当該技術分野で公知である。
ある実施形態においては、機能性核酸は、アンチセンス分子である。アンチセンス分子は、標準又は非標準の塩基対合によって、標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、例えばＲＮＡｓｅＨによって媒介されるＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解によって、標的分子の破壊を促進するように設計される。或いは、アンチセンス分子は、転写、複製などの標的分子上で通常は起こるプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も利用可能な領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化する多数の方法が存在する。例示的な方法としては、ＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いたインビトロ選択実験及びＤＮＡ修飾試験が挙げられる。アンチセンス分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。
ある実施形態においては、機能性核酸は、アプタマーである。アプタマーは、好ましくは特異的様式で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループ、Ｇカルテットなどの明確な二次及び三次構造に折り畳まれる１５～５０塩基長の小さい核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ、テオフィリンなどの小分子、及び逆転写酵素、トロンビンなどの大分子に結合することができる。アプタマーは、１０－１２Ｍ未満の標的分子からのＫｄで極めて堅固に結合することができる。アプタマーは、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、極めて高度の特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と、分子上の単一位置しか異ならない別の分子との結合親和性差が１０，０００倍を超えるアプタマーが単離された。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのＫｄの少なくとも１／１０、１／１００、１／１０００、１／１０，０００又は１／１００，０００倍の標的分子とのＫｄを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子と比較するときには、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。
機能性核酸は、リボザイムとすることができる。リボザイムは、分子内又は分子間で化学反応を触媒する能力のある核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムなどの天然の系に見られるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する様々なタイプのリボザイムについて記述する。天然の系には見られないが、特異反応を新規に触媒するように設計されたリボザイムについても記述する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、一般に、標的基質の認識及び結合と、それに続く切断によって、核酸基質を切断する。この認識は、大部分が標準又は非標準の塩基対相互作用に基づくことが多い。標的基質の認識は標的基質配列に基づくので、この性質によって、リボザイムは、核酸の特異的切断のターゲティングに特に良好な候補になる。
機能性核酸は、三本鎖形成オリゴヌクレオチド分子とすることができる。三本鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸と相互作用することができる分子である。三本鎖分子が標的領域と相互作用すると、ワトソン－クリックとフーグスティーンの両方の塩基対合に依存した複合体を形成する３本のＤＮＡ鎖が存在する、三本鎖と呼ばれる構造が形成される。三本鎖分子は、標的領域と高い親和性及び特異性で結合することができるので好ましい。三本鎖形成分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。
機能性核酸は、外部ガイド配列とすることができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ：ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、この複合体はＲＮａｓｅ Ｐによって認識され、次いでＲＮａｓｅ Ｐが標的分子を切断する。ＥＧＳは、最適なＲＮＡ分子を特異的に標的にするように設計することができる。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体が天然ｔＲＮＡ基質を模倣するようにするＥＧＳを用いることによって、実質的にあらゆるＲＮＡ配列を切断するように動員することができる。同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ指向的切断を利用して、真核細胞内の所望の標的を切断することができる。種々の標的分子の切断を容易にするＥＧＳ分子の製造及び使用方法の代表例は、当該技術分野で公知である。
一部の実施形態においては、機能性核酸は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）によって遺伝子発現抑制を誘導する。標的遺伝子の発現は、ＲＮＡ干渉によって極めて特異的な様式で効果的に抑制することができる。
所与の遺伝子の干渉作用を有するＲＮＡポリヌクレオチドは、対応する相補配列を有する特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解し、タンパク質の産生を阻止することによって、遺伝子を下方制御する（Ｓｌｅｄｚ及びＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｂｌｏｏｄ、１０６（３）：７８７～７９４（２００５）参照）。ＲＮＡ分子がｍＲＮＡと相補的ワトソン－クリック塩基対を形成すると、それは、アクセサリータンパク質によるｍＲＮＡ切断を誘導する。ＲＮＡの供給源は、外部供給源からのウイルス感染、転写又は導入であり得る。
遺伝子発現抑制は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加によって最初に認められた（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６～１１、Ｎａｐｏｌｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９～８９、Ｈａｎｎｏｎ、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ、４１８：２４４～５１）。ｄｓＲＮＡは、細胞に入ると、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素によって、２個のヌクレオチドオーバーハングを３’末端に含む２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：１８８～２００（２００１）、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４０９：３６３～６（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：２９３～６（２０００）、Ｎｙｋａｎｅｎら、Ｃｅｌｌ、１０７：３０９～２１（２００１）、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｃｅｌｌ、１１０：５６３～７４（２００２））。ｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡの効果又はそれらの使用は、どのタイプの機序にも限定されない。
一実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの間の配列相同領域内のｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解を誘発する。配列特異的遺伝子発現抑制は、酵素ダイサーによって生成されるｓｉＲＮＡを模倣した合成低分子二本鎖ＲＮＡを用いて、哺乳動物細胞において実施することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４～４９８（２００１））（Ｕｉ－Ｔｅｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、４７９：７９～８２（２０００））。ｓｉＲＮＡは、化学的に若しくはインビトロで合成することができ、又は細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる低分子二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。例えば、国際公開第０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端と塩基対を形成したときに標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを記述している。これらのｓｉＲＮＡの製造方法を参照により本明細書に援用する。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズム及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（オースティン、テキサス）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（アシュランド、マサチューセッツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ラフィエット、コロラド）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、バージニア）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ボールダー、コロラド）及びＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、オランダ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔなどのキットを用いてインビトロで合成することもできる。
したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１個以上のｓｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡを発現する１個以上のベクターを含む。ベクターからのｓｉＲＮＡの生成は、より一般的には、低分子ヘアピン型ＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写によってなされる。例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘導ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクターなど、ｓｈＲＮＡを含むベクターの製造キットが利用可能である。一部の実施形態においては、機能性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである。
ｂ．抗原
一部の実施形態においては、外来核酸配列は、ワクチン抗原をコードする。抗原は、対象生物に外来性である任意のタンパク質又はペプチドを含み得る。好ましい抗原は、ＣＤ４受容体（ＣＤ４Ｔ細胞）を発現する白血球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫エフェクター細胞による監視のために、対象の抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）の表面に提示され得る。一般に、抗原は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌又は動物起源である。一部の実施形態においては、抗原は、癌抗原である。癌抗原は、腫瘍細胞上でのみ発現される、及び／又は腫瘍細胞生存に必要である、抗原であり得る。ある種の抗原は、当業者によって免疫賦活性である（すなわち、有効な免疫認識を刺激する）と認識され、それが由来する生物又は分子に対して有効な免疫を提供する。
Ｂ細胞抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖、糖類、脂質、核酸、小分子（単独で、又はハプテンと一緒に）、又はそれらの組合せであり得る。Ｔ細胞抗原は、タンパク質又はペプチドである。抗原は、ウイルス、細菌、寄生生物、植物、原生動物、真菌、組織、又は癌細胞、白血病細胞などの形質転換細胞に由来する可能性があり、細胞全体又はその免疫原性成分、例えば、細胞壁成分若しくはその分子成分であり得る。適切な抗原は、当該技術分野で公知であり、商業的な政府及び科学的供給源から入手可能である。抗原は、腫瘍又はウイルス若しくは細菌源に由来する精製又は部分精製ポリペプチドであり得る。抗原は、異種発現系においてポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現することによって産生される組換えポリペプチドであり得る。抗原タンパク質の全部又は一部は、送達のためにＤＮＡ又はＲＮＡ分子によってコードされ得る。抗原は、単一抗原として供給され、又は組み合わせて供給され得る。抗原は、ポリペプチド又は核酸の複合混合物としても供給され得る。
ウイルス抗原
一部の実施形態においては、抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス抗原は、以下のウイルス科のいずれかのウイルスを含めて、ただしそれらに限定されない任意のウイルスから単離することができる：アレナウイルス科、アルテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、バドナウイルス、バルナウイルス科、ビルナウイルス科、ブロモウイルス科、ブニヤウイルス科、カリチウイルス科、カピロウイルス、カルラウイルス、カリモウイルス、サーコウイルス科、クロステロウイルス、コモウイルス科、コロナウイルス科（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ：ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ウイルスなどのコロナウイルス）、コルチコウイルス科、シストウイルス科、デルタウイルス、ダイアンソウイルス、エナモウイルス、フィロウイルス科（例えば、マールブルグウイルス及びエボラウイルス（ＥＢＯＶ）（例えば、ザイール、レストン、コートジボワール又はスーダン系統））、フラビウイルス科、（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス１、デングウイルス２、デングウイルス３及びデングウイルス４）、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科（例えば、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５及び６、並びにサイトメガロウイルス）、ハイポウイルス科、イリドウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、オルトミクソウイルス科（例えば、Ｈ１Ｎ１系統などのインフルエンザウイルスＡ、並びにＢ及びＣ）、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹、流行性耳下腺炎及びヒト呼吸器合胞体ウイルス）、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス及びアフトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、ワクシニア及び疱瘡ウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）１及びＨＩＶ２などのレンチウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）、並びにトティウイルス科。適切なウイルス抗原としては、デングタンパク質Ｍ、デングタンパク質Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２及びデングＤ１ＮＳ３の全部又は一部も挙げられる。ウイルス抗原は、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、すなわち単純ヘルペス１及び２；肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス；パラインフルエンザ、水痘－帯状疱疹、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇｌａｖｉｒｕｓ）、エプスタインバー、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ウマ脳炎、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱、リンパ性脈絡髄膜炎などの特定の系統に由来し得る。一般に、ｒｅｐＲＮＡによってコードされたウイルス抗原は、ｒｅｐＲＮＡが発現された天然ウイルスゲノムには由来しない。
一部の実施形態においては、ウイルス抗原は、オルソミクソウイルス科の１種以上のウイルス、例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス、トゴトウイルス及びクアランジャウイルスに由来する。例示的なＡ型インフルエンザウイルスサブタイプとしては、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ７Ｎ７が挙げられる。例示的なインフルエンザウイルス抗原としては、ＨＡ１及びＨＡ２サブユニットなどの赤血球凝集素、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒｏｍｉｎｉｄａｓｅ）、ＰＢ１、ＰＢ２ＰＡ及びＰＢ１－Ｆ２の１種以上などのウイルスＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、カプシドタンパク質、ＮＳ１、ＮＥＰなどの非構造タンパク質、核タンパク質、Ｍ１、Ｍ２などの基質タンパク質、孔タンパク質などの１種以上のタンパク質又は糖タンパク質が挙げられる。一部の実施形態においては、Ａ型インフルエンザウイルス抗原としては、赤血球凝集素ＨＡ１糖タンパク質の抗原性部位を含めて、赤血球凝集素（ＨＡ）若しくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質又はＨＡ若しくはＮＡの断片の１種以上が挙げられる。例示的一実施形態においては、ＭＤＮＰは、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ＨＡタンパク質をコードするＲＮＡを含む。
一部の実施形態においては、ウイルス抗原は、エボラウイルス属の１種以上のウイルス、例えば、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＵＤＶ）、タイフォレストエボラウイルス（ＴＡＦＶ）、レストンエボラウイルス（ＲＥＳＴＶ）及びブンデブージョエボラウイルス（ＢＤＢＶ）に由来する。例示的一実施形態においては、ＭＤＮＰは、ザイールエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、又はザイールエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）の１種以上の断片をコードするｒｅｐＲＮＡなどのＲＮＡを含む。
一部の実施形態においては、ウイルス抗原は、フラビウイルス属の１種以上のウイルス、例えば、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）に由来する。
細菌抗原
一部の実施形態においては、抗原は、細菌抗原である。細菌抗原は、アクチノミセス、アナベナ、バチルス、バクテロイデス、デロビブリオ、ボルデテラ、ボレリア、カンピロバクター、カウロバクター、クラミジア、クロロビウム、クロマチウム、クロストリジウム、コリネバクテリウム、サイトファーガ、デイノコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ハロバクテリウム、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス、ヘモフィルスインフルエンザタイプＢ（ＨＩＢ）、ハイフォミクロビウム、レジオネラ、レプトスピロシス（Ｌｅｐｔｓｐｉｒｏｓｉｓ）、リステリア、髄膜炎菌Ａ、Ｂ及びＣ、メタノバクテリウム、ミクロコッカス、マイコバクテリウム（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ、ミクソコッカス、ナイセリア、硝酸菌、オシラトリア、プロクロロン、プロテウス、シュードモナス、ロドスピリルム（Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、リケッチア、サルモネラ、シゲラ、スピリルム、スピロヘータ、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、ストレプトミセス、スルフォロブス、サーモプラズマ、硫黄菌、及びトレポネーマ、ビブリオ、並びにエルシニアを含めて、ただしそれらに限定されない任意の細菌から生じ得る。
寄生生物抗原
一部の実施形態においては、抗原は、寄生生物抗原である。例示的な寄生生物アレルゲンとしては、クリプトコッカス ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ カプスラツーム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ノカルジア アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、リケッチア リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ）、リケッチア チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、マイコプラズマ ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、プラスモディウム ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、トリパノソーマ ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、エントアメーバ ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、トキソプラズマ ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、トリコモナス バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）及びシストソーマ マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）が挙げられるが、それらに限定されない。これらは、スポロゾイト周囲タンパク質、スポロゾイト表面タンパク質、肝臓ステージ抗原、頂端膜結合タンパク質、又はメロゾイト表面タンパク質の全部若しくは一部などの胞子虫抗原、プラスモディウム抗原を含む。
一部の実施形態においては、寄生生物抗原は、トキソプラズマ属の１種以上の原生動物、例えば、Ｔ．ゴンヂ、及びネオスポラ、ハモンジア（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）、フレンケリア（Ｆｒｅｎｋｅｌｉａ）、イソスポーラ、サルコシスティスなどの関連する属の種などの原生動物由来の１種以上の抗原である。Ｔ．ゴンヂ由来の例示的な抗原としては、ＧＲＡ６、ＲＯＰ２Ａ、ＲＯＰ１８、ＳＡＧ１、ＳＡＧ２Ａ及びＡＭＡ１遺伝子産物が挙げられる。
アレルゲン及び環境抗原
一部の実施形態においては、抗原は、アレルゲン又は環境抗原である。
例示的なアレルゲン及び環境抗原としては、花粉アレルゲン（木、草本、草及びイネ科草本花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入、唾液及び毒液アレルゲン）、動物の毛及びフケアレルゲン、食品アレルゲンなどの天然アレルゲン由来の抗原が挙げられるが、それらに限定されない。
木、イネ科草本及び草本由来の重要な花粉アレルゲンは、とりわけ、カバノキ（カバノキ属）、ハンノキ（ハンノキ属）、ハシバミ（ハシバミ属）、シデ（クマシデ属）及びオリーブ（オリーブ属）、ヒマラヤスギ（クリプトメリアアンド ジュニペルス（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａａｎｄ Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ））、スズカケノキ（プラタナス）を含めたブナ目、モクセイ目、マツ目及びスズカケノキ科、すなわち、ドクムギ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、シラゲガヤ属、クサヨシ属、ライムギ属及びモロコシ属のイネ科草本を含めたイネ目、とりわけ、ブタクサ属、ヨモギ属及びヒカゲミズ属の草本を含めたキク目及びイラクサ目から生ずる。使用することができる別のアレルゲン抗原としては、ヒョウヒダニ属及びシワダニ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）属のチリダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、サヤアシニクダニ（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、ニクダニ属及びケナガコナダニ属由来のアレルゲン、ゴキブリ、小昆虫及びノミ、例えば、チャバネゴキブリ属、ゴキブリ属、ユスリカ属及びイヌノミ属由来のアレルゲン、ネコ、イヌ及びウマなどの哺乳動物、トリ由来のアレルゲン、ミツバチ（ミツバチ上科）、スズメバチ（スズメバチ上科）及びアリ（アリ上科）を含めた膜翅目由来のものなどの刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔｓ）由来のものを含めた毒液アレルゲンが挙げられる。使用することができる更に別のアレルゲン抗原としては、アルテルナリア属及びクラドスポリウム属などの真菌由来の吸入アレルゲンが挙げられる。
例示的な食品アレルゲンとしては、牛乳（例えば、ラクトース）、卵、ナッツ、甲殻類、魚、及びマメ科植物（ピーナッツ及びダイズ）、果実、トマトなどの野菜が挙げられる。
抗原がアレルゲンであるときには、ＭＤＮＰは、送達アレルゲンに対してＴｈ１（細胞性）又はＴｈ２（液性）分極に特異的な免疫応答を誘導する１個以上の免疫調節性分子、又は免疫調節性分子をコードする１個以上の核酸を含むことができる。
腫瘍抗原
一部の実施形態においては、抗原は、腫瘍抗原である。癌遺伝子発現産物、選択的にスプライスされた発現産物、変異遺伝子産物、過剰発現遺伝子産物、異常発現遺伝子産物、腫瘍ウイルスによって産生される抗原、癌胎児性抗原、並びに改変細胞表面糖脂質を含むタンパク質、及び改変グリコシル化プロファイルを有するタンパク質を含めて、ただしそれらに限定されない、多数のクラスの腫瘍抗原が存在する。
ＭＤＮＰに含まれる、又はＭＤＮＰによってコードされた、例示的な腫瘍抗原としては、アルファ－アクチニン－４、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂｃｒ－Ａｂｌ融合タンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、Ｃａｓｐ－８、ベータ－カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、上皮性腫瘍抗原、ＥＦ２、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ－フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ１１、ｈｓｐ７０－２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ－１、２及び３、ｎｅｏ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲａ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ、Ｎ－ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｂａｇｅ－１、Ｇａｇｅ ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ－Ｋ－ｍｅｌ、Ｌａｇｅ－１、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）；Ｍａｇｅ－Ａ１、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ－Ｃ２、ＮＡ－８８、ＮＹ－Ｅｓｏ－１／Ｌａｇｅ－２、ＳＰ１７、ＳＳＸ－２、及びＴＲＰ２－Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ－１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ－Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｂ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、ａ－フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ－１、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、チロシナーゼ、ＴＰＳなど、ただしそれらに限定されない、腫瘍関連又は腫瘍特異性抗原が挙げられる。例示的な腫瘍抗原は、モデル黒色腫腫瘍抗原Ｔｒｐ１である。
ある実施形態においては、腫瘍抗原は、「癌胎児性」タンパク質、正常タンパク質の選択的にスプライスされた変異体など、通常は胚形成中に発現される遺伝子の遺伝子産物であり、正常な成体組織におけるその発現が制限される遺伝子の遺伝子産物である。癌胎児性抗原は、一般には胎児発生中にのみ存在するが、ある種の癌を有する成体に見られる、タンパク質である。これらのタンパク質は、癌を有する個体の血中でしばしば測定され、腫瘍の診断とその後の処置の両方に利用することができる。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１種以上の癌胎児性タンパク質を含み、又はコードする。例示的な癌胎児性タンパク質は、Ｈｍｇａ２タンパク質である。
ｃ．別の治療薬又は予防薬
ＭＤＮＰ内にカプセル化することができる、又はＭＤＮＰの表面に結合することができる、活性剤の非限定的なリストは、抗感染薬、免疫調整剤、ホルモン、抗酸化剤、ステロイド、抗増殖剤及び診断薬を含む。治療薬は、薬物、又はプロドラッグ、類似体などの薬物の改変体を含み得る。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、ペプチド薬物、色素、抗体、又は抗体の抗原結合断片の送達に使用される。
治療薬
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１種以上の治療薬を包む。
ＭＤＮＰに付随し得る治療薬の例としては、ベータ－ラクタム抗生物質（アンピシリンなどのペニシリン、更にはセフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セフィドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）及びセフポドキシムプロキセチルから選択されるセファロスポリンを含む）；テトラサイクリン抗生物質（ドキシサイクリン及びミノサイクリン）；ミクロライド（ｍｉｃｒｏｌｉｄｅｓ）抗生物質（アジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシン及びクラリスロマイシン）；フルオロキノロン（シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン）ノルフロキサシン、抗酸化薬はＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含む；非ステロイド性薬物などの抗炎症薬（例えば、インドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウム及びイブプロフェン）；ステロイド性抗炎症薬（例えば、デキサメタゾン）；抗増殖剤（例えば、パクリタキセル（タキソール）、ＱＰ－２ビンクリスチン、メトトレキサート、アンジオペプチン、マイトマイシン、ＢＣＰ６７８、アンチセンスｃ－ｍｙｃ、ＡＢＴ５７８、アクチノマイシンＤ、ＲｅｓｔｅｎＡＳＥ、１－クロル－デオキシアデノシン、ＰＣＮＡリボザイム及びセレコキシブ）シロリムス、エベロリムス及びＡＢＴ－５７８）、パクリタキセル、及びアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、イホスファミド、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン）、抗腫瘍性抗生物質（例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、エトポシド、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン及びミトキサントロン）、代謝拮抗物質（例えば、デオキシコホルマイシン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、アザチオプリン、２－クロロデオキシアデノシン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド、アザシチジン、ゲムシタビン、リン酸フルダラビン及びアスパラギナーゼ）を含めた抗腫瘍薬；有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドセタキセル、エストラムスチン）；抗体、抗体断片又は炭水化物／多糖を含む分子標的薬（例えば、イマチニブ、トレチノイン、ベキサロテン、ベバシズマブ、ゲムツズマブオゴミシン（ｏｇｏｍｉｃｉｎ）及びデニロイキン ジフチトクス）；並びにコルチコステロイド（例えば、フルオシノロンアセトニド及びメチルプレドニゾロン）が挙げられるが、それらに限定されない。
免疫調節剤
ある実施形態においては、ＭＤＮＰは、送達抗原に対してＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１、細胞性）又はＴヘルパー細胞２（Ｔｈ２、液性）分極に特異的な免疫応答を誘導するように生成される、１個以上の免疫調節性分子、又は免疫調節性タンパク質をコードする核酸を包む。
これは、防御と相関するＴｈ経路を増進することによって抗原に関連する疾患に対する機能的免疫を高める、又は抗原に対する不適当な免疫応答と相関するＴｈ経路から免疫応答を引き離すことによって寛容性が得られる可能性がある。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、液性応答を低下させ、かくしてアレルギーに対処するために、アレルゲンに対する細胞性免疫を惹起するタンパク質をコードする分子又はＲＮＡを含む。この原理を適用して、例えば、Ｔｈ２応答を惹起して、多発性硬化症又は関節リウマチのＴｈ１に関連する症状を抑えることによって、自己免疫疾患の原因である自己抗原に対して寛容化することができる。例示的な免疫調節性分子としては、合成受容体リガンド若しくはタンパク質、サイトカイン又は他のシグナル伝達分子が挙げられる。
非炎症性抗体アイソタイプ（すなわち、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ４））に向かい、アレルギー反応に関連する免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）アイソタイプから離れる、Ｂ細胞のクラススイッチが望ましい場合もある。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、非炎症性抗体アイソタイプに対するＢ細胞のクラススイッチを惹起することができる分子を含み、又はコードする。例示的な免疫調節性分子としては、ＩＬ－１０などのインターロイキンが挙げられる。
４．多重修飾デンドリマー系ナノ粒子
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１タイプを超えるカプセル剤分子を含む（すなわち「多重」ＭＤＮＰ）。例えば、ＭＤＮＰは、ｍＲＮＡ、ｒｅｐＲＮＡなどの１種を超えるＲＮＡを含むことができる。ｍＲＮＡ及びｒｅｐＲＮＡは、同じ又は異なる遺伝子をコードすることができる。一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、１種を超えるｒｅｐＲＮＡ及び１種を超えるｍＲＮＡを含むように設計される。ｒｅｐＲＮＡ及びｍＲＮＡは、同じ又は異なる遺伝子をコードすることができる。
ｍＲＮＡとｒｅｐＲＮＡが同じ多重ＭＤＮＰ内に封入されるときには、ｍＲＮＡ及びｒｅｐＲＮＡは、相補的５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むように操作することができる。例えば、ｒｅｐＲＮＡによってコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によって認識されるＵＴＲを含むようにｍＲＮＡを修飾することができる（「修飾ｍＲＮＡ」）。
同じ又は相補的ＵＴＲを含む修飾ｍＲＮＡとｒｅｐＲＮＡ種が宿主細胞の細胞質に同時に入ると、ｒｅｐＲＮＡによってコードされたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）が、レプリコンＵＴＲの認識を通して、修飾ｍＲＮＡを複製することができる。
この戦略のために、２タイプの増幅可能なペイロードが細胞質に同時に送達される。レプリコンＵＴＲを有する修飾ｍＲＮＡの添加は、１つの代わりに２つの増幅可能なペイロードが細胞に同時に送達されるので、システムの総合効率を高める。したがって、ｒｅｐＲＮＡは、完全長レプリコンのより多くの複製物、又はｒｅｐＲＮＡによってコードされた抗原のみの複製物（すなわち、サブゲノムプロモーターによる）、又は多重ＭＤＮＰ内に含まれる修飾ｍＲＮＡのより多くの複製物を合成することができる。
宿主細胞リボソームは、完全長レプリコン複製物又はより短い抗原のみのｍＲＮＡを連続して翻訳して、修飾ｍＲＮＡ及びｒｅｐＲＮＡによってコードされた遺伝子の発現を高める（図１Ｂ参照）。
したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、２つ以上のペイロードタイプを同時に輸送する多重ＭＤＮＰである。例えば、ＭＤＮＰは、１個以上のｒｅｐＲＮＡ、並びにレプリコンの５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み込む１個以上のｍＲＮＡを輸送することができる。１個以上のｒｅｐＲＮＡ及び１個以上のｍＲＮＡは、同じ又は異なる遺伝子をコードすることができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、２個以上の異なるペプチド抗原をコードする２個以上の遺伝子を含む。
更なる実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、１個以上のｒｅｐＲＮＡと、レプリコン付加核酸（ｒｅｐｌｉｃｏｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み込む１個以上のｍＲＮＡと、場合によっては、機能性核酸、タンパク質、小分子などの１種以上の追加の活性剤とを含むように処方することができる。
一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、１種を超える原生動物抗原をコードする１個以上のｒｅｐＲＮＡを含むように処方される。例示的一実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、Ｔ．ゴンヂのＧＲＡ６、ＲＯＰ２Ａ、ＲＯＰ１８、ＳＡＧ１、ＳＡＧ２Ａ及びＡＭＡ１遺伝子産物をコードする。
一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、オルソミクソウイルス科の１種以上のウイルス、例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ及びインフルエンザウイルスＣに由来する２種以上のウイルス抗原を含むように処方される。例示的一実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、季節性及び汎発性インフルエンザウイルス系統を含めて、同じ又は異なるＡ型インフルエンザウイルスサブタイプ由来の２種以上の抗原をコードするＲＮＡを含む。例えば、一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ７Ｎ７サブタイプの１つ以上に由来する２種以上の抗原を含む。一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、赤血球凝集素のＨＡ１サブユニット、赤血球凝集素のＨＡ２サブユニット、ノイラミニダーゼ、ＰＢ１、ＰＢ２ＰＡ及びＰＢ１－Ｆ２の１種以上などのウイルスＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、カプシドタンパク質、ＮＳ１、ＮＥＰなどの非構造タンパク質、核タンパク質、Ｍ１、Ｍ２などの基質タンパク質、孔タンパク質などのＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ７Ｎ７インフルエンザウイルスサブタイプの１つ以上に由来する２種以上のタンパク質又は糖タンパク質を含む。一部の実施形態においては、多重ＭＤＮＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ７Ｎ７サブタイプの２つ以上に由来する２種以上のＨＡ抗原を含む。
Ｂ．賦形剤、送達ビヒクル及び装置
ＭＤＮＰは、ナノ粒子を対象の体内に投与するのに適切な賦形剤を含む組成物中に処方することができる。
ある実施形態においては、ＭＤＮＰは、注射、例えば、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）によって、又は皮膚乱切によって、対象内に送達するのに適切な担体又は賦形剤中に処方される。典型的な担体は、食塩水、リン酸緩衝食塩水、グルコース溶液、及び他の注射用担体である。
したがって、送達ビヒクルを含む、又は含まない、ＭＤＮＰを含む製剤について記述する。ＭＤＮＰは、１種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に処方することができる。医薬組成物は、ＭＤＮＰの所望の目的、及び意図した用途に応じて、異なる投与機序用に処方することができる。非経口投与経路（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、眼内又は皮下注射）、局所若しくは経皮投与経路（受動的に、又はイオントフォレーシス若しくは電気穿孔法を用いて）による、又は生分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）挿入断片を用いた、投与用に処方された医薬組成物について記述する。
１．非経口投与
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、非経口注射による水溶液投与用に処方される。製剤は、懸濁液剤又は乳濁液剤の形とすることもできる。一般に、医薬組成物は、有効量の活性剤、ターゲティング成分及び場合によっては送達ビヒクルを含んで提供され、場合によっては、薬学的に許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤及び／又は担体を含む。こうした組成物は、希釈剤滅菌水と、種々の緩衝剤内容物（例えば、トリス－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の緩衝食塩水と、場合によっては洗浄剤及び可溶化剤（例えば、ポリソルベート２０又は８０とも称されるＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、バルク化物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤とを含む。非水溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、トウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤を凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。製剤は、例えば、細菌保持フィルタ濾過によって、殺菌剤を組成物に混ぜ込むことによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって、滅菌することができる。
２．肺、局所及び粘膜投与
ＭＤＮＰの組成物は、局所、滴下又は吸入適用用に処方することができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、肺、口、目、肺、鼻、口（舌下、頬）、膣、直腸粘膜などの粘膜への投与用に処方される。粘膜投与製剤は、一般に、噴霧乾燥薬物粒子であり、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁液剤又は乳濁液剤に混ぜ込むことができる。標準医薬品賦形剤は、任意の処方者から入手可能である。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、例えば、罹患した、損傷を受けた、又は裂けた皮膚の表面に直接適用することによって、皮膚に送達するために処方される。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、創傷又は手術部位に送達するために処方される。局所送達用に処方された組成物は、１種以上の浸透促進剤を含むことができる。
一実施形態においては、ＭＤＮＰは、鼻腔内投与、経口吸入などの肺送達用に処方される。気道は、空気と血流の間のガス交換に関与する構造体である。上下気道は、誘導気道と呼ばれる。終末細気管支は、呼吸細気管支に分岐し、呼吸細気管支は、次いで、最終的な呼吸領域である肺胞、すなわち肺深部に至る。肺深部、すなわち肺胞は、吸入された治療用エアロゾルの全身薬物送達のための最初の標的である。肺で活性である治療薬は、全身に投与することができ、肺吸収によって標的に向けることができる。エアロゾルという用語は、溶液でも懸濁液でもよい、粒子の微細なミストの任意の調製物を指し、噴霧剤を用いて生成されるか否かにかかわらない。エアロゾルは、超音波処理、高圧処理などの標準技術を用いて生成することができる。
肺製剤用担体は、乾燥粉末製剤用のものと溶液としての投与用のものに分類することができる。治療薬を気道に送達するためのエアロゾルは、当該技術分野で公知である。上気道を介した投与の場合、製剤は、点滴薬又は噴霧剤として鼻腔内投与用に、溶液、例えば、水又は緩衝若しくは非緩衝等張食塩水に、又は懸濁液として、処方することができる。好ましくは、こうした溶液又は懸濁液は、鼻汁と等張であり、ほぼ同じｐＨ、例えば、約ｐＨ４．０～約ｐＨ７．４又はｐＨ６．０～ｐＨ７．０である。緩衝剤は、生理的に適合すべきであり、単なる例として、リン酸緩衝剤などである。当業者は、経鼻及び／又は上気道投与用非侵害性水溶液の場合の適切な塩分及びｐＨを容易に決定することができる。
組成物は、吸入中に肺に送達することができ、空気力学的直径約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子として送達すると、肺上皮層を通って、血流に入ることができる。
粒径の大きい乾燥粉末製剤（「ＤＰＦ」：ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、凝集しにくいなど、流動性が改善され、エアロゾル化が容易であり、潜在的に食作用が少ない。吸入療法用乾燥粉末エアロゾルは、主に５ミクロン未満の範囲の平均直径で一般に生成されるが、好ましい範囲は、空気力学的直径で１～１０ミクロンである。（薬物を含まない）大型「担体」粒子は、治療用エアロゾルと一緒に送達され、とりわけ効率的エアロゾル化を助ける。そのすべてが当業者によく知られた、噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器を含めて、ただしそれらに限定されない、治療用製品の肺送達用に設計された広範囲の機械装置を使用することができる。
ＩＩＩ．修飾デンドリマー系ナノ粒子の製造方法
ＭＤＮＰの製造方法を示す。一般に、該方法は、アルキル化デンドリマーを１種以上の治療薬、予防薬及び診断薬の存在下で１種以上の両親媒性ポリマーと組み合わせることを含む。
ｒｅｐＲＮＡなどのカプセル剤を含むＭＤＮＰの製造方法について記述する。該方法は、例えば、大型ｒｅｐＲＮＡをＭＤＮＰにパッケージするのに使用することができる。
一般に、ＭＤＮＰを製造する方法は、ＭＤＮＰ内にパッケージされるカプセル剤の構造を何ら制限しない。例えば、ＭＤＮＰ内に封入された核酸は、長鎖でも短鎖でもよく、一本鎖でも二本鎖でもよく、任意の配列とすることができる。上記方法によって製造された治療薬、予防薬及び診断薬を含むＭＤＮＰの精製は、平凡なものであり、パッケージされていないカーゴの精製よりも単純であり得る。
核酸をＭＤＮＰに封入するときには、核酸は少なくとも純度８０％であり得る。別の実施形態においては、核酸は、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９０％、又は少なくとも純度９５％である。一般に、１個のＭＤＮＰは、少なくとも１分子の核酸を含む。
一実施形態においては、ＲＮＡは、修飾デンドリマー／ＲＮＡモル比約５：１でＭＤＮＰ内にパッケージされる。
Ａ．多重修飾デンドリマー系ナノ粒子の構築
一般に、ＭＤＮＰは、イオン性デンドリマーと、親水性固定化ポリマーと、治療薬、予防薬及び診断薬との混合によって処方される。混合は、マイクロ流体混合の使用などの当該技術分野で公知の任意の適切な手段によって行うことができる（Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ５０４８９７２（２０１５）、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３、１４３９７～１４４０１、ｄｏｉ：１０．１０２／ａｎｉｅ．２０１４０８２２１（２０１４））。
修飾デンドリマーと両親媒性ポリマーは、エタノールなどの適切な溶媒を用いて組み合わせることができる。ＲＮＡ分子がＭＤＮＰ内にカーゴとして含まれるときには、ＲＮＡをクエン酸緩衝剤（ｐＨ２～４）などの低ｐＨ緩衝剤で希釈することができる。
Ｂ．ＭＤＮＰの精製
ＭＤＮＰは、その特有のサイズ、性質及び高い安定性のため、構築後に基質から容易に精製することができる。上記方法によって製造された様々な治療薬、予防薬及び診断薬を含むＭＤＮＰの精製は、簡単であり、高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ：ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、濾過、沈降、スクロース勾配分離、親和性タグクロマトグラフィ、流動場分画多角度光散乱（ＦＦＦ－ＭＡＬＳ：ｆｌｏｗ－ｆｉｅｌｄ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）などの当該技術分野で公知の標準方法を用いて行うことができる。一部の実施形態においては、ナノ粒子は、例えば０．２ミクロンポリ（エーテルスルホン）フィルタを用いた、濾過によって精製することができる。
精製ナノ粒子は、光散乱などの当該技術分野で公知の任意の技術を用いて特徴づけることができる。
一部の実施形態においては、粒子は、成熟粒子の界面動電位、すなわちゼータ電位に基づいて特徴づけることができ、及び／又は単離することができる。ゼータ電位は、粒子間の静電気又は電荷斥力／引力の大きさの尺度である。ＰＢＳ中の完全に形成された粒子のゼータ電位は、約－２ｍＶ～約－２５ｍＶ（両端を含む）、例えば、－５ｍＶ～－２０ｍＶの範囲であり得る。粒子のゼータ電位を測定し、ゼータ電位に基づいて粒子を単離する方法は、当該技術分野で公知である。
一部の実施形態においては、粒子は、成熟粒子の分子量及び／又は流体力学的体積に基づいて特徴づけることができ、及び／又は単離することができる。粒子のコアの処方に使用される世代サイズに応じて、完全に形成された粒子の分子量を約２，０００Ｄａ～約８０，０００Ｄａ（両端を含む）の範囲にすることができる。粒子の分子量を測定し、分子量に基づいて粒子を単離する方法は、当該技術分野で公知である。
ＭＤＮＰは、様々な質量比の修飾デンドリマーと疎水性固定化ポリマーを含むように処方することができる。一般に、ＭＤＮＰは、疎水性固定化ポリマーよりも質量の多い修飾デンドリマーを含む。例えば、ＭＤＮＰは、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１５：１超などの２：１～２０：１の質量比の修飾デンドリマーと疎水性固定化ポリマーを含むように処方することができる。ある一実施形態においては、ＭＤＮＰは、修飾デンドリマーと疎水性固定化ポリマーの質量比が１１．５：１である。ＭＤＮＰ内にカプセル化された治療薬、予防薬及び診断薬の最終濃度は、理論物質収支計算によって求めることができる。一般に、ＭＤＮＰは、治療薬、予防薬及び診断薬よりも質量の多い修飾デンドリマーを含む。例えば、ＭＤＮＰは、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１０：１超などの２：１～１０：１の質量比の修飾デンドリマーと治療薬、予防薬及び診断薬を含むように処方することができる。カプセル剤がＲＮＡを含むある一実施形態においては、ＭＤＮＰは、修飾デンドリマーとＲＮＡの質量比が５：１である。
カプセル剤がＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡを含む一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、修飾デンドリマーとＲＮＡの質量比が２：１～１０：１（両端を含む）である。
ＩＶ．使用方法
ＭＤＮＰを使用する方法について述べる。ＭＤＮＰが、大きい核酸及び／又はポリペプチドを含むカプセル剤を対象の細胞に送達するための有効な生体適合性無毒ビヒクルを与えることが立証された。ＭＤＮＰは、非免疫原性でもあり、対象の血清中で、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、数週間、数か月などの長期間存続することができる。例えば、ＭＤＮＰは、宿主の免疫監視を回避して、ＭＤＮＰの血清中半減期を延長し、食胞及び／又は非食細胞タイプのリソソーム区画内に内部移行するように設計することができる。
ＭＤＮＰは、多数の細胞型によって容易に取り入れられ、封入された治療薬、予防薬及び診断薬を生物学的標的に効率的に送達する。例えば、ＭＤＮＰが宿主細胞の細胞質に移行すると、核酸、小分子及びタンパク質カプセル剤を細胞質空間に堆積することができる。カプセル剤が外来遺伝子を含むと、遺伝子は、宿主細胞中で発現され、免疫調節などの生物学的エフェクター機能を生じることができる。
したがって、ＭＤＮＰを使用する方法は、ＭＤＮＰを含む有効量の組成物を対象に投与して、１個以上の外来遺伝子又はポリペプチドを対象の細胞に送達することを含むことができる。一般に、細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞ではない。
ＭＤＮＰは、レシピエントの細胞において免疫調節効果などの生物学的効果を誘導することができる。例えば、ＭＤＮＰは、対象において所望の抗原に対する免疫応答を刺激するのに使用することができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、疾患に対する免疫応答を誘発する免疫原として働くＲＮＡ新抗原の安全で有効な送達ビヒクルである。
対象における標的遺伝子の発現又は機能を防止、抑制又は阻害する方法も提供する。
Ａ．核酸及びポリペプチドを送達する方法
ＭＤＮＰが、細胞内部への大型ｒｅｐＲＮＡを含めた核酸治療薬、予防薬及び診断薬を効果的に送達して、標的細胞における外来遺伝子の発現を増大させ得ることが立証された。一般に、ｒｅｐＲＮＡによってコードされた遺伝子の発現は、対象において、ＲＮＡが単独で送達されるときよりもｒｅｐＲＮＡがＭＤＮＰ内に送達されるときの方が大きい。例えば、ＭＤＮＰ内にカプセル化された１個以上の外来遺伝子をコードするｒｅｐＲＮＡを細胞に送達すると、等量の純粋なｒｅｐＲＮＡ単独の投与に比べて、又はＭＤＮＰ内にカプセル化された非複製ｍＲＮＡの細胞への送達に比べて、細胞内の外来ｍＲＮＡ配列の翻訳を促進し、外来ペプチドの長期発現を維持することができる。
ＭＤＮＰは、粒子が宿主細胞の内部に取り込まれるまで、核酸を分解から保護する。恐らく、ＭＤＮＰは、一般化されたエンドサイトーシスによって細胞内部に取り込まれる。ＭＤＮＰは、外来核酸及びポリペプチドを真核生物細胞に生体内で又はインビトロで送達することができる。一般に、送達は、標的細胞によるＭＤＮＰの接触及び内部移行を必要とする。内部移行は、１つ以上の異なる機序によって起こり得る。ＭＤＮＰと標的細胞の接触は、生体内で又はインビトロで起こり得る。一般に、接触は生体内で起こる。
したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを対象に投与する。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを対象の特定の身体部位に直接投与する。更なる実施形態においては、投与経路は、ＭＤＮＰを特定の器官に直接向ける。
ＭＤＮＰを含む医薬組成物は、局所投与又は全身投与のどちらが望ましいかによって、また、処置する領域に応じて、種々の様式で投与することができる。注射用製剤は、溶液剤若しくは懸濁液剤、注射前の懸濁液の溶液に適切な固形剤として、又は乳濁液剤として、従来の形態で調製することができる。ある実施形態においては、組成物を局所的に、例えば、注射によって治療部位に直接投与する。一部の実施形態においては、局所送達は、全身送達に付随する副作用又は毒性を低減することができ、局所的な用量が増加するため、向上した結果を得ることができる。
組成物は、１つ以上の手術部位に直接注射又は投与することができる。一般に、局所注射は、ＭＤＮＰ組成物の局所濃度を増加させ、それは全身投与で得ることができる局所濃度よりも高い。
一部の実施形態においては、全身投与されたＭＤＮＰは、ある期間にわたって血流中に存続し、カプセル剤を標的細胞に放出する。好ましくは、定常的な放出によって、標的細胞における外来核酸又はポリペプチドの所望の濃度を維持する。
ＭＤＮＰの組成物は、疾患の症候の発生前、発生中若しくは発生後の期間に、又は１つ以上の症候の発生前、発生中若しくは発生後の任意の組合せの期間に、投与することができる。例えば、症候の発生前に（すなわち、予測発生日前に）１、２、３、４、５、６ ７、１４、２１、２８、３５又は４８日ごとに１回以上の組成物を対象に投与することができる。症候の発生後に１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５又は４８日ごとに１回以上の組成物を対象に投与することができる。一部の実施形態においては、症状の改善が明らかになる前に、組成物を複数回投与する。例えば、一部の実施形態においては、対象は、疾患又は症状の改善が明らかになる前に、１、２、３、４、５、６ ７、１４、２１、２８、３５若しくは４８日又は週間にわたって、１、２、３、４、５、６ ７、１４、２１、２８、３５又は４８回投与される。
したがって、１個以上のＭＤＮＰを含む組成物は、標的細胞に送達される核酸又はポリペプチドの所望の効果に応じて、診断、予後、手術又は傷害に関連して様々な時間で投与することができる。ＭＤＮＰの投与開始のタイミングは、対象の要求に基づいて決定されるべきであり、それに応じて変動し得る。
一部の実施形態においては、単一用量のＭＤＮＰを対象に１回以上の大量瞬時投与として送達して、ＭＤＮＰの血中濃度、又はＭＤＮＰのペイロードの血中濃度を所望のレベルに上昇させる。大量瞬時投与は、注射などの任意の手段によることができる。大量瞬時投与の位置は、所望の効果、及び処置される標的器官又は組織に応じて変わり得る。特定の一実施形態においては、大量瞬時投与は、別の剤形の投与前に行われる。
例えば、ＭＤＮＰは、例えば、ターゲティング成分、ＰＥＧ化、ポリマー表面密度などの１つ以上の変更によって、血流中の滞留時間が変わるように設計することができる。したがって、ＭＤＮＰの所望の血中濃度は、所望のとおりに、同時に投与される製剤の組合せを用いて、又はある期間にわたって一連の投与として、所望の期間維持することができる。
Ｂ．ワクチン接種
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、外来タンパク質及び／又は核酸を対象に送達して、対象における所望の免疫応答を刺激することができる。ＭＤＮＰを介した抗原の送達は、ウイルス、細菌などの感染病原体に対する防御免疫を与える。修飾デンドリマーの非免疫原性は、エボラ曝露に対して防御する用量よりも５０倍高い用量でも（Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ５０４８９７２（２０１５）、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３、１４３９７～１４４０１（２０１４））、効率的導入遺伝子発現に有利な性質であり、自然免疫の刺激は、ｍＲＮＡペイロードのみの発現による。
ＭＤＮＰ内に封入された大型自己増幅ＲＮＡレプリコンを用いたワクチン接種方法を示す。該方法は、注射後早期にＩＦＮ応答を刺激せずに免疫系に対して強力で持続的な抗原提示を可能にする。強力なＩＦＮ応答は、アルファウイルス複製を妨害し、したがって、抗原用量を次第に制限する可能性がある。（Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ８１、１１２４６～１１２５５、（２００７）、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５、３７０６～３７１８（２００１））。
（後で考察する）ＯＶＡペプチド、ＨＡ抗原及びＥＢＯＶ ＧＰ抗原ペプチドをコードするｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰを用いて行われた実験によれば、ＭＤＮＰは、ｒｅｐＲＮＡを細胞に送達して、ある範囲のウイルスに対して、また、ＯＶＡペプチドに対しても、強力な免疫応答を発生させることができる。
別のタンパク質でこれらのペプチドを置換することができる。これらとしては、ウイルス、細菌、真菌、原生動物などの病原微生物、及び癌抗原に由来するタンパク質が挙げられる。したがって、ＭＤＮＰは、多種多様な病原微生物を標的にした、ＲＮＡによってコードされた抗原、新抗原などのワクチン薬剤を送達する安全で有効なプラットホームとして役立つことができる。
一般に、外来抗原を対象の細胞にＭＤＮＰによって送達すると、抗原を認識し、中和することができる抗体及び他の生体分子が産生される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に整列した抗原を、抗原特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞などの「ヘルパー」Ｔ細胞に提示することができる。こうした提示によって、信号がＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介して送られ、それによって、Ｔ細胞は提示されたものに特異的である免疫応答を開始する。
したがって、ＭＤＮＰを使用して、コードされた抗原に対する液性及び／又は細胞性免疫を惹起、緩和又は増強することができる。例えば、ＭＤＮＰは、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞の生物活性を誘導、増強又は緩和するのに有効な量の外来核酸及び／又はタンパク質を送達する。
一部の実施形態においては、抗原をコードする核酸配列を含むＭＤＮＰの対象への投与は、抗原に対する免疫を対象に付与する。免疫は、対象において、繰り返しの抗原曝露に対して急速な免疫細胞性及び／又は液性免疫応答を示すのに十分な蓄積のメモリーＴ細胞（すなわち、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞）及び／又は抗原特異的Ｂ細胞の産生として現れ得る。好ましくは、抗原をコードする核酸配列を含むＭＤＮＰの投与は、抗原が由来する生物（単数又は複数）に起因する感染又は疾患を予防する。
一般に、抗原をコードする核酸配列を含むＭＤＮＰの対象への投与は、等量の抗原又は抗原をコードする核酸単独の投与に比べて、抗原の取り込み及び対象の抗原提示細胞への抗原の送達を促進する。したがって、ＭＤＮＰを介した対象への抗原の投与は、等量の抗原又は抗原をコードする核酸単独の投与に比べて、対象における抗原に対する免疫応答を増強することができる。例えば、ＭＤＮＰは、対象の抗原提示細胞の表面におけるコードされた抗原の提示を増加、延長又は増強することができる。
ワクチンは、予防的又は治療的に投与することができる。ワクチンは、ワクチンスケジュールに従って投与することもできる。ワクチンスケジュールは、すべての投与のタイミングを含む一連のワクチン接種である。多くのワクチンは、十分な初期免疫応答を得るために、又は次第に薄れる応答を押し上げるために、有効性を最大にする複数回の投与を必要とする。ワクチンスケジュールは、当該技術分野で公知であり、最大の有効性が得られるように設計される。ＭＤＮＰ中で送達される１種以上の抗原に対する適応免疫応答は、ワクチン接種手順の有効性を測定する当該技術分野で公知の方法によってモニターすることができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、外来タンパク質及び／又は核酸を対象に送達し、宿主細胞によって発現され生物学的に処理された抗原に対して特異的に免疫応答を刺激する。したがって、ＭＤＮＰによって送達される抗原をコードする核酸を用いたワクチン接種方法は、宿主対象に特異的な翻訳後修飾を含む抗原に対して免疫を与えることができる。例えば、ＭＤＮＰによって送達される抗原をコードする核酸を用いたワクチン接種は、グリコシル化、脂質化（ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化を含む）、硫酸化、酸化、リン酸化、アデニル化、メチル化、アミド化などの宿主に生来の翻訳後修飾を含むタンパク質に対して免疫を与えることができる。これらの翻訳後修飾ペプチド抗原に対して対象によって引き起こされる免疫応答は、同じ抗原ペプチドの非天然発現体又は翻訳後修飾体に対して同じ宿主で引き起こされる免疫応答と同じでも異なってもよい。
１．複数のｒｅｐＲＮＡの場合のワクチン接種戦略
上述したように、ＭＤＮＰは、２個以上の異なるｒｅｐＲＮＡを含むことができる。２個以上の異なるｒｅｐＲＮＡは、同じ又は異なる外来免疫原性抗原を発現するように操作することができる。
一部の実施形態においては、ナノ粒子ワクチンは、各々抗原産生動力学が異なるｍＲＮＡ、ｒｅｐＲＮＡなどの異なるＲＮＡ種の組合せを含む。動力学の異なるＲＮＡを「多重化する」ことによって、投与後に１種以上の抗原を異なる時間で発現するようにＭＤＮＰ／ＲＮＡワクチンを設計することができる。多重ＭＤＮＰ／ＲＮＡワクチンは、異なるＲＮＡ種を各々含む異なるＭＤＮＰの混合物を含むことができ、又は各ＭＤＮＰを１つを超えるＲＮＡ種を含むように設計することができる。
単一の抗原をコードする単一種のｒｅｐＲＮＡなどの１つの種のＲＮＡを含むようにＭＤＮＰが設計されると、所望量の各ＭＤＮＰを混合することによって、所望の発現動力学を有する複合ＭＤＮＰワクチンを生成するようにワクチンを設計することができる。
対象の細胞における外来抗原をコードするＲＮＡの存続が有限であるため、ＭＤＮＰベースのＲＮＡワクチンは、自己制御式であり、宿主がＲＮＡを排出し、すべてのワクチン生成物が体によって除去されるまで、有限の時間抗原を産生するにすぎない。抗原産生は宿主細胞質で起こり、細胞の核中の遺伝物質は決して操作されない。ｒｅｐＲＮＡ固有の自己増幅によって、ワクチン用量のわずかな増加が可能になり、抗原産生が非線形増加する。したがって、一部の実施形態においては、同じ抗原を発現する２個以上の異なるｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰを使用して、発現動力学の異なるレシピエントの細胞において抗原の発現を誘導することができる。例えば、同じ抗原を発現する２個以上の異なるｒｅｐＲＮＡの送達によって、発現産物の血清中半減期を変えることができる。
例えば、ｒｅｐＲＮＡは、レシピエント細胞内で同じ抗原の発現を異なる速度で誘導することができる。したがって、異なるｒｅｐＲＮＡが同じ抗原の発現を異なる速度で生じると、抗原の全血清中半減期を、１つの種のｒｅｐＲＮＡしか送達されないときに比べて、延長することができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰのカプセル剤を、１つを超えるＲＮＡ種を含むように操作して、投与後の長時間にわたって、又は一定時間にわたって、抗原を発現することができる。例えば、ＭＤＮＰは、同じ又は異なる抗原をコードするｍＲＮＡ及び１個以上のｒｅｐＲＮＡを含むことができ、対象内の抗原（単数又は複数）の発現動力学を別個のものにし、異ならせることができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、ＲＮＡ新抗原などのカーゴを対象に送達して、対象における抗原の発現を２つ以上の異なる時期にする。例えば、抗原をコードするｍＲＮＡ及び／又はｒｅｐＲＮＡは、１つのＲＮＡ種の翻訳に関連する抗原の第１の「発現時期」を生じ、抗原の血清中濃度を増加させることができる。抗原発現が減少し、抗原血清中濃度が減少すると、第２のＲＮＡ種の翻訳に関連する同じ又は異なる抗原の第２の「発現時期」によって、抗原の血清中濃度が引き続き増加する。したがって、抗原を発現する２個以上の異なるｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰをワクチン接種に使用するときには、ＭＤＮＰワクチンの単独投与のみに基づいて、抗原（単数又は複数）の血清中濃度の一次（すなわち「初回抗原刺激」）増加を与え、続いて抗原（単数又は複数）の血清中濃度の二次又は更なる後続の（すなわち「追加免疫」）増加を与えるように、ＭＤＮＰ治療薬、予防薬及び診断薬を操作することが望ましいことがある。例えば、１個を超えるｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰは、「自己追加免疫」ワクチンを与えることができる（図１０Ａ～１０Ｂ参照）。
ｒｅｐＲＮＡゲノムの選択は、ｒｅｐＲＮＡによってコードされた抗原の発現に影響し得る。例えば、ＭＤＮＰ／ｒｅｐＲＮＡワクチン投与後の所与の時点における抗原の血清中濃度は、特定のｒｅｐＲＮＡ遺伝子型と相関し得る（図５Ａ～５Ｇ及び図６Ａ～６Ｇ参照）。
コードされた遺伝子産物の発現の変化に関連するｒｅｐＲＮＡの核酸配列の修飾を利用して、所望の発現動力学を与えるように操作された修飾ｒｅｐＲＮＡの設計を支援することができる。一部の実施形態においては、ｒｅｐＲＮＡは、特異抗原又は群抗原に対する血清中濃度及び血清中半減期の測定に基づいて、多重ワクチンに含まれるように設計される。
したがって、「自己追加免疫」ＭＤＮＰ媒介ワクチンに含まれる、コードされた抗原の発現動力学が異なるｒｅｐＲＮＡは、ｒｅｐＲＮＡの核酸配列を変更することによって開発することができる。例えば、アルファウイルス由来のｒｅｐＲＮＡを使用して、外来抗原を宿主細胞において送達するときには、ｒｅｐＲＮＡの１種以上の非構造タンパク質を変化させて、ｒｅｐＲＮＡによってコードされた外来遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。
別の実施形態においては、ＭＤＮＰビヒクルは、例えば、ＭＤＮＰの血清中半減期を生体内で変えるＭＤＮＰの組成物の修飾によって、細胞に入り治療薬、予防薬及び診断薬をある速度で送達するように設計することができる。
更なる実施形態においては、ＭＤＮＰは、例えば同じ又は異なる投与経路によって、１箇所を超える身体位置に送達され、血清中半減期及びＭＤＮＰの細胞取り込み動力学が変化し、続いて抗原発現の場所及び速度が変化する。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、ｒｅｐＲＮＡを送達して、対象の細胞における抗原を発現させるときには、対象における同じ抗原特異的免疫応答を示すのに必要なｒｅｐＲＮＡのモル量は、同じ抗原特異的免疫応答を示すようにＭＤＮＰによって送達されたｍＲＮＡのモル量よりも少ない。一般に、対象における抗原特異的免疫応答を示すのに必要なｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰの量を、タンパク質抗原又は同じ抗原をコードするｍＲＮＡを含むＭＤＮＰの量よりも少なくすることができる。したがって、ｒｅｐＲＮＡを含むＭＤＮＰを使用して、対象へのＭＤＮＰの導入に付随する望ましくない効果を抑制する抗原特異的免疫応答を対象において誘導することができる。
ＭＤＮＰによって送達された異なるワクチン薬剤のスクリーニング方法についても記述する。一般に、該方法は、１種以上の異なる抗原又は抗原をコードする核酸を含むＭＤＮＰを対象に接種し、対象における免疫応答を評価することを含む。ＭＤＮＰ中で送達される１種以上の抗原に対する適応免疫応答は、ワクチン接種手順の有効性を測定する当該技術分野で公知の方法によってモニターすることができる。例えば、抗原特異的Ｔ細胞活性化の持続時間及び程度を、抗原発現動力学のマーカーとして使用することができる。抗原血清中濃度を使用して、抗原発現動力学を求めることもできる。
同じ又は異なる送達ビヒクル、同じ又は異なる手順、ワクチン接種スケジュール若しくは投与によって、異なる抗原又は抗原の組合せを接種した対象などの対照と結果を比較することができる。一部の実施形態においては、適切な対照は、非ワクチン接種対象である。
２．ワクチン接種される病原体／疾患
ＭＤＮＰは、１つ以上の疾患及び障害の対象に接種するのに有効な量のタンパク質及び核酸抗原を対象に送達することができる。ＭＤＮＰは、細菌、ウイルス、真菌、原生動物病原体などの多種多様な微生物病原体のワクチン接種プラットホームとして役立ち得る。
一部の実施形態においては、ワクチンの標的を、癌治療として１タイプの癌細胞にすることができる。あるいは、標的を多数の微生物病原体のいずれかにすることができる。ワクチン接種することができる例示的な疾患としては、ワクチンが現在入手可能である疾患が挙げられる。その代わりに、又はそれに加えて、ＭＤＮＰは、食品アレルゲン、環境アレルゲンなどの１種以上のアレルゲンに対する免疫寛容を対象に誘導するためのプラットホームとして役立ち得る。
ａ．癌
ある実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、対象を癌に対して免疫することができる。ＭＤＮＰは、癌と診断された対象に（すなわち、治療ワクチンとして）、又は癌を発症する素因若しくはリスクのある対象に（すなわち、予防ワクチンとして）、投与することができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰの組成物を、１種以上の追加の治療薬に加えて、癌患者に投与する。
理想的な癌治療を行うために、バイオインフォマティクスを使用して、各患者の独特の腫瘍エクソームの配列を決定して、新抗原を同定する。次いで、これらの新抗原の対応するｍＲＮＡを使用して、免疫を生じるのに必要な抗原を産生する。最後に、これらのｍＲＮＡは、新しい腫瘍増殖及び転移に対して耐久性の長期の防御を生じるために、免疫系の細胞傷害性Ｔ細胞と液性の両方のアームを活性化することができる、アジュバントを用いないナノ技術送達プラットホームを用いて、送達される。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、１種以上の腫瘍抗原、又は腫瘍抗原を発現する１個以上の核酸を含む。ＭＤＮＰを使用して、腫瘍又は腫瘍環境内に位置する腫瘍細胞及び非腫瘍細胞に対して免疫及び治療活性を示すことができる。ＭＤＮＰは、固形腫瘍及び血液の癌に対して防御及び／又は治療活性を示すように処方することができる。例示的な腫瘍細胞としては、急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病など、ただしそれらに限定されない慢性白血病を含めて、ただしそれらに限定されない白血病；真性赤血球増多症；ホジキン病、非ホジキン病など、ただしそれらに限定されないリンパ腫；くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び髄外形質細胞腫など、ただしそれらに限定されない多発性骨髄腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；有意性が未確定のモノクローナル高ガンマグロブリン血症；良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症；Ｈ鎖病；骨の肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜性骨肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など、ただしそれらに限定されない骨及び結合組織肉腫；神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起膠腫、非神経膠腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫を含めて、ただしそれらに限定されない脳腫瘍；腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、乳腺髄様癌、粘液乳癌、乳腺管状癌、乳頭癌、パジェット病、及び炎症性乳癌を含めて、ただしそれらに限定されない乳癌；褐色細胞腫及び副腎皮質癌を含めて、ただしそれらに限定されない副腎癌；乳頭様又は濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌、未分化甲状腺癌など、ただしそれらに限定されない甲状腺癌；膵島細胞腺腫、ガストリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及びカルチノイド又は島細胞腫瘍を含めて、ただしそれらに限定されない膵癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症及び尿崩症を含めて、ただしそれらに限定されない下垂体癌；虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫などの眼球黒色腫、及び網膜芽細胞腫を含めて、ただしそれらに限定されない眼癌；扁平上皮癌、腺癌及び黒色腫を含めて、ただしそれらに限定されない膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病を含めて、ただしそれらに限定されない外陰癌；扁平上皮癌及び腺癌を含めて、ただしそれらに限定されない子宮頚癌；子宮内膜癌及び子宮肉腫を含めて、ただしそれらに限定されない子宮癌；卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質性腫瘍を含めて、ただしそれらに限定されない卵巣癌；扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌及び燕麦細胞（小細胞）癌を含めて、ただしそれらに限定されない食道癌；腺癌、菌状（ポリポイド）、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫を含めて、ただしそれらに限定されない胃癌；結腸癌；直腸癌；肝細胞癌及び肝芽腫を含めて、ただしそれらに限定されない肝癌、腺癌を含めて、ただしそれらに限定されない胆嚢癌；乳頭、結節及びびまん性を含めて、ただしそれらに限定されない胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌を含めて、ただしそれらに限定されない肺癌；胚細胞腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的（典型的）、精母細胞性、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）を含めて、ただしそれらに限定されない精巣癌、腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫を含めて、ただしそれらに限定されない前立腺癌；腎癌（ｐｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；扁平上皮癌を含めて、ただしそれらに限定されない口腔癌；基底癌（ｂａｓａｌ ｃａｎｃｅｒ）；腺癌、粘膜表皮癌及び腺様嚢胞癌を含めて、ただしそれらに限定されない唾液腺癌；扁平細胞癌及びいぼ状を含めて、ただしそれらに限定されない咽頭癌；基底細胞癌、扁平上皮癌及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端黒子型黒色腫を含めて、ただしそれらに限定されない皮膚癌；腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂及び／又は尿管（ｕｔｅｒｅｒ））を含めて、ただしそれらに限定されない腎癌；ウィルムス腫瘍；移行上皮癌、扁平細胞癌、腺癌、癌肉腫を含めて、ただしそれらに限定されない膀胱癌を含めた、癌の腫瘍細胞が挙げられるが、それらに限定されない。ＭＤＮＰによって防止、処置又は抑制することができる癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、中皮腫、滑膜性腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌及び胃癌が挙げられる（こうした障害の総説としては、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、フィラデルフィア、及びＭｕｒｐｈｙら、１９９７、Ｉｎｆｏｒｍｅｄ Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ、Ｖｉｋｉｎｇ Ｐｅｎｇｕｉｎ、Ｐｅｎｇｕｉｎ Ｂｏｏｋｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、米国を参照されたい）。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、代替ワクチンを利用できない１種以上の癌に対して対象を免疫することができる。
ｂ．感染症
ＭＤＮＰは、細菌、ウイルス、真菌、原生動物病原体などの多種多様な微生物病原体に起因する１種以上の感染症の対象に接種するのに有効な量の抗原を対象のＡＰＣに送達することができる。
一部の実施形態においては、ワクチンの標的を多数の微生物病原体のいずれかとすることができる。ワクチン接種することができる例示的な疾患としては、炭疽、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に起因する疾患（例えば、子宮頚癌、食道癌）、ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヘモフィルス インフルエンザタイプｂ（Ｈｉｂ）、インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）、日本脳炎（ＪＥ：Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ライム病、麻疹、髄膜炎菌性（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）、サル痘、流行性耳下腺炎、百日咳、肺炎球菌性（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、ポリオ、狂犬病、ロタウイルス、風疹、帯状疱疹（帯状ヘルペス）、天然痘、テタヌス、トキソプラズマ症、腸チフス、結核（ＴＢ）、水痘（水疱瘡）、黄熱病を含めて、ワクチンが現在入手可能である疾患が挙げられる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、マラリア、ストレプトコッカス、エボラザイール、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ：Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、睡眠病、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ：Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ライノウイルス、水疱瘡、ヘンドラ、ＮＩＰＡウイルス、ジカウイルスなどを含めて、ただしそれらに限定されない疾患など、代替ワクチンを利用できない感染症又は病原体に対して対象を免疫することができる。
一部の実施形態においては、疾患は、トリなどの非哺乳動物対象に感染する病原体である。例示的なトリ対象としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、キジ及び他の商業的な家禽などの家畜化されたトリ（すなわち、家禽）、又はインコ、オウムなどのペットのトリが挙げられる。例えば、細菌ハイブリッドベクターは、伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｕｒｓａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）に対するワクチンをトリに接種するのに有用であり得る。ガンボロ病としても知られるＩＢＤ、幼鶏のファブリキウス嚢に影響を及ぼすウイルス性疾患。上記細菌ハイブリッドベクターを用いてワクチン接種することができる家禽の他の疾患及び障害としては、インフルエンザ、ラニケット；マレック病、鶏痘、家禽コレラ、軟卵症候群、感染性コリーザ、コクシジウム症、トリ脳炎、トリインフルエンザ、ニワトリ貧血及びサルモネラが挙げられる。
ｃ．アレルギー
ある実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、対象をアレルゲンに対して免疫することができる。ＭＤＮＰは、アレルギーと診断された対象、又はアレルギーの素因がある対象に投与することができる。一部の実施形態においては、ＭＤＮＰの組成物を、１種以上の追加の治療薬に加えて、アレルギー患者に投与する。
アレルギーは、その他の点では無害な物質に反応して起こる免疫系の異常反応である。アレルギーは、免疫系が、花粉、粉塵、獣毛などのアレルゲンに結合可能な特異抗体を産生することによって、外来微生物又は粒子に反応するタイプの免疫反応である。治療することができるアレルギー反応としては、遅延型過敏反応及び即時型過敏反応が挙げられる。
治療することができるアレルギーとしては、皮膚炎などの皮膚、食品アレルギーなどの消化管におけるアレルギー性鼻炎、枯草熱、喘息、結膜炎（急性カタル性結膜炎）などの上気道及び目、並びに蕁麻疹、発疹などの血流におけるアレルギー反応、血管性浮腫、アナフィラキシー、又はアトピー性皮膚炎が挙げられる。
Ｃ．遺伝子ターゲティング
ＭＤＮＰは、特定の標的生物内の特定の標的遺伝子に対して干渉作用を有するＲＮＡ（ｉＲＮＡ）の送達のための遺伝子ターゲティング戦略に使用することができる。一部の実施形態においては、ｉＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドの発現又は翻訳の配列特異的サイレンシングを誘導し、それによって遺伝子発現を減少させる、又は阻止することができる。例えば、ＭＤＮＰを使用して、ｉＲＮＡを送達して、標的遺伝子の発現の完全な欠如を誘導することができる。一部の実施形態においては、ｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現レベルを無処置対照よりも低下させることができる。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、ＲＮＡを送達する。ＲＮＡは、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドである。一般に、低分子干渉ＲＮＡは、２１～２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡは、宿主細胞内で発現され得る。
別の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ポリヌクレオチドを送達する。ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造をとる低分子ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、内在細胞酵素、例えば、酵素ダイサー及びダイサー様酵素の活性によって、標的細胞内の生物活性ｄｓＲＮＡに開裂し得る。別の実施形態においては、ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも２４ヌクレオチド長である長い二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）である。ｄｓＲＮＡは、標的生物内の内在細胞酵素、例えば、酵素ダイサー及びダイサー様酵素の活性によって、２１～２３ヌクレオチドの生物活性ｓｉＲＮＡにプロセシングされる。ｄｓＲＮＡは、下方制御の標的とされる１個以上の遺伝子に相補的であるヌクレオチド配列を含む。
１個以上の標的遺伝子は、任意の所望の配列のものとすることができる。一部の実施形態においては、ＲＮＡの配列は、標的遺伝子の配列に１００％相補的である。別の実施形態においては、ＲＮＡは、標的遺伝子に１００％未満相補的である。ある実施形態においては、ＲＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％又は少なくとも８０％相補的であり、したがって、例えば、遺伝子変異、進化的分岐及び系統多型のために起こり得る配列多様性が許容され得る。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを遺伝子ターゲティング戦略に使用することができる。例えば、ＭＤＮＰを使用して、標的細胞のゲノムの一本鎖又は二本鎖切断を誘発する薬剤を送達することができる。標的細胞のゲノムの一本鎖又は二本鎖切断を誘発する例示的なシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、塩基配列の複数の短い直接反復を含むＤＮＡ遺伝子座の頭字語である。原核生物ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核生物に使用される遺伝子編集（特異的遺伝子のサイレンシング、増強又は変更）としての使用に適応されている（例えば、Ｃｏｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：３３９（６１２１）：８１９～８２３（２０１３）及びＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６～２１（２０１２）を参照されたい）。Ｃａｓ遺伝子及び特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲを含む必要な配列を細胞に移入することによって、生物のゲノムを任意の所望の位置で切断及び修飾することができる。
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「直接反復配列」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセシング部分直接反復配列を包含する）、ガイド配列（やはり内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して「スペーサ」とも称される）、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の別の配列及び転写物を含めて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現、又は該遺伝子の活性の誘導に関与する転写物及び他の要素を総称するものである。ガイド配列に作動可能に結合した１個以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（例えば、直接反復配列－スペーサ－直接反復配列）は、プロセシング前にはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）、ヌクレアーゼによるプロセシング後にはｃｒＲＮＡとも称される。
一部の実施形態においては、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは連結され、キメラｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成する。ここで、成熟ｃｒＲＮＡは、部分ｔｒａｃｒＲＮＡに合成ステムループを介して融合して、Ｃｏｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：３３９（６１２１）：８１９～８２３（２０１３）及びＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６～２１（２０１２））に記載のように天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。単一融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物は、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ（又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ））とも称される。ｓｇＲＮＡ内では、ｃｒＲＮＡ部分を「標的配列」として同定することができ、ｔｒａｃｒＲＮＡはしばしば「足場」と称される。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、ｓｇＲＮＡを送達する。
Ｄ．追加の活性剤の送達
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、疾患又は障害の治療のために、対象の細胞への小分子治療薬などの追加の活性剤の送達に使用される。ある実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、対象の１つ以上の特定の細胞型を選択的に標的にして、治療薬、予防薬及び診断薬をその細胞型に送達する。
したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、感染症、癌、炎症性疾患などに対して有効な治療戦略を提供することができる。
Ｅ．投与量及び有効量
一部の生体内手法においては、ＭＤＮＰの組成物を対象に治療有効量で投与する。「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療する障害の１つ以上の症候を治療、阻害若しくは軽減するのに、又は所望の薬理的及び／又は生理的効果をもたらすのに、十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存した変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患又は障害、実施する処置などの種々の要因に応じて変わる。
上記すべての化合物の場合、更に研究を進めると、様々な患者において種々の症状の治療に適切な投与量レベルに関する情報が明らかになり、通常の技能を有する者は、レシピエントの治療状況、年齢及び全般的健康状態を考慮して、適切な投薬を確認することができるであろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、及び所望の治療期間に応じて決まる。
一般に、毎日０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルが哺乳動物などの対象、最も好ましくはヒトに投与される。一般に、静脈内注射又は注入の場合、投与量を少なくすることができる。好ましくは、組成物は、約１～約１０００μＭの改変原核細胞血清レベルが得られるように処方される。
例えば、ＭＤＮＰは、抗原を対象に送達し、Ｂ細胞、Ｔ細胞の増殖及びクローン増殖を誘導し、又はマクロファージの移動若しくは走化活性を誘導するのに有効な量とすることができる。したがって、一部の実施形態においては、カプセル剤を含むＭＤＮＰは、対象における抗原に対して一次免疫応答を刺激するのに有効な量である。好ましい一実施形態においては、有効量のＭＤＮＰは、無処置対照対象に比べて、対象の細胞における有意な細胞毒性を誘導しない。好ましくは、ＭＤＮＰの量は、無処置対照に比べて、対象における疾患又は障害の感染又は発生を防止又は抑制するのに有効である。
別の一実施形態においては、ＭＤＮＰは、標的遺伝子の発現量を減少させるのに、又は対象における標的遺伝子産物の血清中濃度を防止する、若しくは減少させるのに有効な量である。
特定の一実施形態においては、ＭＤＮＰは、抗原提示細胞による抗原の提示を誘導するのに有効な量である。例えば、ＭＤＮＰは、ＭＤＮＰによって対象の細胞に送達される遺伝子によってコードされた外来ポリペプチドに反応してＴ細胞活性化を誘導するのに有効な量とすることができる。更なる一実施形態においては、１個以上のＭＤＮＰは、対象における抗原に対する頑強な又は防御の免疫応答を刺激するのに必要な抗原量の削減に有効な量である。ＭＤＮＰは、ＭＤＮＰによってコードされた抗原に対する産生又は抗体を誘導するのに有効であり得る。
したがって、ＭＤＮＰは、対象における抗原特異的免疫細胞の量を増加させるのに有効であり得る。例えば、対象における抗原特異的免疫細胞の量を、無処置対照における量よりも増加させることができる。例えば、ＭＤＮＰは、細胞増殖、化学走性及びアクチン再構成を含めて、細胞性免疫活性を制御する幾つかのシグナル伝達経路を誘導するのに有効であり得る。好ましくは、有効量のＭＤＮＰは、細胞毒性を生じない。コードされた抗原又はアレルゲンに対する適応免疫を与える有効量のＭＤＮＰは、ＩＦＮを含めて、炎症性サイトカイン産生の有意な全身的増加を生じるべきではない。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰを使用して、単回投与のみによって、癌、感染症又はアレルゲンに対して対象を免疫することができる。したがって、一部の実施形態においては、単一投与のみが必要であり、追加免疫は不要である。別の実施形態においては、１回以上の追加の投与によって、第１又は以前の投与に対する免疫応答を押し上げると、防御免疫などの強化又は延長された免疫が得られる。
一般に、生体内でナノ粒子送達ビヒクルに対するサイトカイン応答がないと、抗ベクター免疫の発生が妨げられる。したがって、一部の実施形態においては、抗原をコードする同じ又は異なるＲＮＡを含む同じ又は異なる用量のＭＤＮＰを用いて、ＭＤＮＰの投与を繰り返し行って、例えば、同じ対象における種々の抗原又はアレルゲンに対する免疫を与えることができる。
Ｆ．対照
ＭＤＮＰの効果を対照と比較することができる。適切な対照は、当該技術分野で公知であり、例えば、未処理細胞又は無処置対象が挙げられる。一部の実施形態においては、対照は、処置された対象からの、又は無処置対象からの未処理組織である。好ましくは、対照の細胞又は組織は、処理細胞又は組織と同じ組織に由来する。一部の実施形態においては、無処置対照対象は、処置対象と同じ疾患若しくは症状を有する、又はそのリスクがある。例えば、一部の実施形態においては、無処置対照対象は、抗原に対して免疫応答を生じない。
Ｇ．組合せ
ＭＤＮＰは、治療又は予防処置計画の一部として、単独で、又は１種以上の追加の活性剤（単数又は複数）と組み合わせて、投与することができる。ＭＤＮＰは、第２の活性剤と同じ日に、又は異なる日に投与することができる。例えば、ＭＤＮＰを含む組成物を、１、２、３若しくは４日目に、又はそれらの組合せで投与することができる。
「組合せ」又は「組み合わせる」という用語は、２種以上の薬剤の随伴、同時又は連続投与を指すのに使用される。したがって、組合せは、随伴的に（例えば、混合物として）、別々ではあるが同時に（例えば、別々の静脈ラインを介して同じ対象に）、又は連続的に（例えば、化合物又は薬剤の１つを最初に投与し、続いて第２の薬剤を投与）投与することができる。
一部の実施形態においては、追加の予防薬又は治療薬を特異抗原に対するワクチンとすることができる。抗原は、ＭＤＮＰによってコードされたものと同じでも異なってもよい。
一部の実施形態においては、ＭＤＮＰは、ＭＤＮＰ送達ビヒクルの非存在下で対象における抗原に対する免疫応答に比べて、同じ抗原に対する免疫応答を増強する薬剤として有用である。
ＭＤＮＰを使用して、例えば、ＭＤＮＰ内にカプセル化されたＲＮＡによってコードされた１種以上の抗原又はアレルゲンに対する免疫応答を誘導するときには、有効量のＭＤＮＰの投与は、所望の免疫応答を誘発するのにアジュバントの同時投与を必要としない。したがって、一部の実施形態においては、ＭＤＮＰをアジュバント又は免疫刺激分子の非存在下で投与する。
実施例１ ワクチンとして使用されるＲＮＡ分子を含むＭＤＮＰの構築
材料及び方法
プラスミド及びクローニング
制限配列が隣接するｅＧＦＰコード配列の切り出し後に、哺乳動物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３－ＥＧＦＰ（Ｄｏｕｇ Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋからの提供（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１３０３１）のマルチクローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位に目的抗原をクローン化することによって、化学修飾も安定化ＵＴＲもない従来のｍＲＮＡを作製した。コザックコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１５、８１２５～８１４８（１９８７））、続いて所望の抗原コード配列を含むＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）クローニングキットを用いて挿入した。
ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）
Ｔａｓｕｋｕ Ｋｉｔａｄａ（Ｗｅｉｓｓ Ｌａｂ、ＭＩＴ）の好意で提供された野生型ＴＲＤ系統に基づくＶＥＥＶレプリコンプラスミドｐＴＫ１２６中に抗原をクローン化して、ＶＥＥＶサブゲノムプロモーター配列の下流にあるｍＶｅｎｕｓコード配列を置換することによってＶＥＥＶレプリコンＲＮＡベクターを作製した。ルシフェラーゼ発現ＶＥＥＶレプリコンｐＴＫ１５８もＴａｓｕｋｕ Ｋｉｔａｄａ（Ｗｅｉｓｓ Ｌａｂ、ＭＩＴ）によって提供された。
セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）
部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩにおける（Ｇｉｕｓｅｐｐｅ Ｂａｌｉｓｔｒｅｒｉ、Ａｒｉ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ｌａｂ、ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙの好意で提供された）ｐＳＦＶ１－ＧＦＰの制限酵素消化、続いてＰＣＲ断片延在位置８，１４５～９，２２６の連結と断片のすぐ上流のカスタムクローニング部位リンカーの付加によって構築された、ｐＳＦＶ１－ＪＣ１と呼ばれるプラスミドｐＳＦＶ１の修飾バージョン（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．＆Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９、１３５６～１３６１（１９９１））中に抗原をクローン化して、最初のプラスミドを再構築し、ただし抗原コード配列の挿入部位として役立つサブゲノムプロモーターの下流のｅＧＦＰコード配列の代わりに独特のＢａｍＨＩ拘束性部位を有することによって、ＳＦＶレプリコンＲＮＡベクターを作製した。
インフルエンザウイルス（ＨＡ）抗原
発現の準備ができた市販インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＷＳＮ／３３）ｃＤＮＡクローン、コドン最適化、完全長ＯＲＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．製品ＶＧ１１６９２－Ｃ）からインフルエンザＨＡコード配列を増幅した。
エボラザイールウイルス（ＥＢＯＶ）抗原
ＥＢＯＶ ＧＰ及びＶＰ４０コード配列を、それぞれｐＷＲＧ７０７７－ＧＰ及びｐＷＲＧ７０７７－ＶＰ４０から増幅した。
卵白アルブミン（ｃＯＶＡ）抗原
細胞質制限卵白アルブミン（ｃＯＶＡ）コード配列を、Ｍａｒｉａ Ｃａｓｔｒｏから提供されたベクターｐＣＩ－ｎｅｏ－ｃＯＶＡ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２５０９７）からＰＣＲによって増幅し（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０７、４７１６～４７２１、ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０９１１５８７１０７）、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングキットを用いて製造者の指示に従ってｐｃＤＮＡ３又はｐＳＦＶ１－ＪＣ１にクローン化した。
卵白アルブミン（ＯＶＡ）及びルシフェラーゼ
組織培養におけるルシフェラーゼ及びｃＯＶＡ発現、並びに生体内ＯＴ－１刺激の研究用ＲＮＡを、ＭＥＧＡスクリプトキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてインビトロ転写によって線状プラスミドベクターから生成させ、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステムキット（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．）を用いて５’キャッピングして、キャップ０構造７－メチルグアニル酸５’末端を生成し、Ａ－Ｐｌｕｓポリ（Ａ）ポリメラーゼテーリングキット（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．）を用いて３’ポリ（Ａ）テール化した。すべて、製造者の手順に従った。他の実験ではすべて、ＲＮＡのキャップ隣接５’ヌクレオチドをメチル化し、ｃａｐ－１構造を生成し、より効率的なタンパク質翻訳を確実にする、キャッピングステップにおける（ＳｃｒｉｐｔＣａｐ（商標）２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼキット、ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．製）２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼの（提供された手順に従った）封入を除いて、ＲＮＡを本質的に同じ方法で合成した。ＳａｃＩを用いた線形化後にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化された抗原を有するｐｃＤＮＡ３由来のプラスミドから従来のｍＲＮＡを合成した。これらのｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターと開始コドンのＫｏｚａｋコンセンサス配列の間、及び終止コドンと線形化に用いられるＳａｃＩ制限部位の下流の制限部位の間にある短いベクター由来の空間を除いて、５’又は３’ＵＴＲ配列を実質的に含まない。ＳｐｅＩを用いた線形化後にＳｐ６ＲＮＡポリメラーゼ転写によってｐＳＦＶ１－ＪＣ１由来のプラスミドからＳＦＶ系ＲＮＡレプリコンを構築した。
修飾デンドリマー合成
室温で定常撹拌下、ジクロロメタン（ＢＤＨ）中の２倍モル過剰の３－クロロ過安息香酸（Ｓｉｇｍａ）に１－ペンタデセン（ＴＣＩ）を滴下して、２－トリデシルオキシランを合成した。８時間反応後、反応混合物を等体積の過飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。各洗浄後、有機層を分離漏斗によって収集した。同様に、有機層を、次いで、１Ｍ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを有機相に添加し、終夜撹拌して、残留水を除去した。有機層を減圧濃縮すると、わずかに黄色の透明油状液体が生成した。この液体を減圧蒸留すると（約５０ｍＴｏｒｒ、約８０℃）、透明無色の２－トリデシルオキシランが生成した。エチレンジアミンコアを有する第１世代ポリ（アミドアミン）デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を次いで２－トリデシルオキシランと反応させた。２－トリデシルオキシランの化学量論量は、デンドリマー内のアミン反応部位（第一級アミンの場合２部位、第二級アミンの場合１部位）の総数の１．５倍に等しかった。反応物を清浄２０ｍＬ黄褐色ガラスバイアル中で混合した。バイアルに２００プルーフエタノールを溶媒として充填し、９０℃で７日間暗所で定常撹拌下反応させて、反応を確実に完了した。粗生成物をＣｅｌｉｔｅ（商標）５４５（ＶＷＲ）プレカラムに乗せ、ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎシリカカラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ）を備えたＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ Ｒｆ装置を用いたフラッシュクロマトグラフィによって、１００％ＣＨ２Ｃｌ２～７５：２２：３ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ水溶液（体積）で４０分間勾配溶出して精製した。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ：ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、８７．５：１１：１．５ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ水溶液（体積）溶媒系を用いて、修飾デンドリマーの存在について溶出画分を試験した。置換レベルの異なる修飾デンドリマーは、異なるバンドとしてＴＬＣプレート上に出現した。未反応２－トリデシルオキシラン及びポリ（アミドアミン）デンドリマーを含む画分を廃棄した。残留画分を混合し、傾斜高真空下で１２時間乾燥させ、使用するまで乾燥不活性雰囲気下で貯蔵した。すべての生成物が、配座異性体の混合物を含んだ。
ＲＮＡを含むＭＤＮＰの構築及び精製
Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ５０４８９７２（２０１５）、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３、１４３９７～１４４０１、ｄｏｉ：１０．１０２／ａｎｉｅ．２０１４０８２２１（２０１４）によって記述されたマイクロ流体混合装置を用いてナノ粒子を処方した。
手短に述べると、修飾デンドリマーと１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）をエタノール中で混合した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅを含まない、内毒素を含まない蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び無菌１００ｍＭ ｐＨ３．０ ＱＢクエン酸緩衝剤（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｉｎｃ．）でＲＮＡを最終クエン酸濃度１０ｍＭに希釈した。エタノール及びクエン酸の流れを気密ガラスシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．）に充填し、マイクロ流体混合装置を用いて、エタノールとクエン酸の流れを１：３体積流量比（５．３ｍＬ／ｍｉｎに等しい組み合わせ総流量）で組み合わせ、混合して、ナノ粒子を製造した。内毒素除去のために１．０Ｍ ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）で２４時間洗浄し、蒸気オートクレーブで滅菌したガラス製品を用い、２０，０００ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ＬｙｚｅｒＧ２透析カセットを用いて、ナノ粒子を内毒素のない無菌ＰＢＳで透析した。透析ナノ粒子を０．２ミクロンポリ（エーテルスルホン）フィルタ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて無菌濾過し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて特性を明らかにした。ＲＮＡの濃度を理論物質収支計算によって求め、ＮａｎｏＤｒｏｐ測定（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって確認した。最終ナノ粒子は、１１．５：１質量比の修飾デンドリマーと１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］及び５：１質量比の修飾デンドリマーとＲＮＡを含んだ。ＭＤＮＰのサイズ分布を動的光散乱及び透過型電子顕微鏡法によって評価した。
結果
アジュバントを含まないナノテクノロジー送達システムを用いた対象の細胞への複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）などの分子の送達のためにＭＤＮＰワクチンプラットホームを開発した。この目標に向かって、修飾されたイオン化可能な両親媒性デンドリマーを使用した大型自己増幅ｍＲＮＡ送達のための独特で効率の高い送達法が開発された（図１Ａ～１Ｃ及び図２Ａ～２Ｃ参照）。ＭＤＮＰの透過型電子顕微鏡法、及びナノ粒子のサイズ分布の分析によれば、低多分散性粒子（図２Ｄ）が、この方法を用いて型通りに製造された。
このＭＤＮＰワクチンプラットホームは、柔軟性が高く、各患者の独特の要求に合わせて数日で迅速に調整することができる。宿主細胞中で複数の抗原を同時に産生する能力（多重化）が示された。
レプリコンで構成されたＭＤＮＰは、ワクチン接種に使用することができる（すなわち、修飾デンドリマーワクチン（ＭＤＶ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）プラットホームとして）。ＭＤＶは、３成分系であり、イオン性デンドリマー系ナノ材料、両親媒性ＰＥＧ及びＲＮＡが組み合わされて、最終ワクチンナノ粒子を形成する。
ＭＤＮＰ配置戦略
ワクチンとして、ＭＤＮＰを多種多様な方法で配置することができる。一例においては、ＭＤＮＰは、１タイプの増幅可能なペイロード、すなわちレプリコンを含む（図１Ａ）。細胞質内で放出されると、レプリコンは、リボソームによって翻訳されて、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と抗原の両方を産生する。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）は、完全長レプリコンのより多くの複製物、又はサブゲノムプロモーターによって抗原のみの複製物を産生する。リボソームは、完全長レプリコン複製物又はより短い抗原のみの（従来の）ｍＲＮＡを翻訳し続ける。この戦略のために、１タイプの増幅可能なペイロードが細胞質に送達される。
別の戦略においては、ＭＤＮＰは、２タイプの増幅可能なペイロード、すなわちレプリコンと、レプリコンの３’及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡとを同時に輸送する（図１Ｂ）。この戦略においては、ＲｄＲｐは、レプリコンの最初、又はサブゲノムプロモーターにおいて、コピーを開始することができる。第１は、レプリコンである。第２は、レプリコンの５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を組み込むｍＲＮＡである。レプリコンのリボソーム翻訳によって生成するＲｄＲｐは、３通りで作用することができる：（１）レプリコン全体を複製すること、（２）レプリコンのサブゲノムプロモーターにおいて開始することによってｍＲＮＡのみを複製すること、及び（３）レプリコンＵＴＲを有する修飾ｍＲＮＡを複製すること。この戦略のために、２タイプの増幅可能なペイロードが細胞質に同時に送達される。サブゲノムプロモーターにおいて産生された短いｍＲＮＡは、リボソームによってのみ翻訳することができ、ＲｄＲｐではレプリコンＵＴＲがないのでコピーすることができない。しかし、ＲｄＲｐは、レプリコンＵＴＲを有するｍＲＮＡを複製することができる。したがって、レプリコンＵＴＲを有するｍＲＮＡの封入は、１つの代わりに２つの増幅可能なペイロードが細胞に同時に送達されるので、システムの総合効率を高める。
ＭＤＮＰは、１個以上の標的抗原に対して耐久性長期防御をもたらすために、免疫系の細胞傷害性Ｔ細胞と液性の両方のアームを活性化することができる。ＭＤＮＰワクチンは、数日で迅速に生成され、従来のワクチン製造に必要な多数の月数とは対照的である。その柔軟性のために、ＭＤＮＰプラットホームは、カスタマイズされた癌ワクチンを迅速に生成するために、膵癌、結腸癌及び白血病の腫瘍細胞モデルからの容易に利用可能なエクソーム配列データを容易に活用することができる（Ｂｈａｄｕｒｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ２、ｅ４４、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃｓｉｓ．２０１３．８）。
実施例２ 修飾デンドリマーＲＮＡナノ粒子は、血清中で３７℃及び４℃で安定である。
材料及び方法
統計解析
Ｔｕｋｅｙ多重比較補正を用いたＡＮＯＶＡによって平均を比較した。生存曲線では、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定を使用した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
初代細胞及び細胞系
Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７７２）及びＬ６ラット筋芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４５８）を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。分化のために、Ｃ２Ｃ１２細胞をコンフルエントまで増殖させ、次いで１０％ウマ血清を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）中で５日間維持し、その時点までに、単層の大部分は、大きい隣接融合筋管状構造を示した。ＤＣ２．４細胞を１０％不活性化ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミン及び６０ｕＭ２－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ中で維持した。マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ：ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）をＬｏｎｚａから入手し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持した。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ：ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、及び２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持した。１ウェル当たり４００ｎｇのカプセルＲＮＡを９６ウェル皿中の７０～９０％コンフルエント細胞単層上に適用し、２４時間後にルシフェラーゼアッセイで分析することによって、ＭＤＮＰ処置実験を行った（材料及び方法の本文参照）。
組織培養タンパク質発現アッセイ
ナノ粒子処理細胞中のルシフェラーゼ遺伝子発現をＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって製造者の手順に従って測定した。ＲＮＡ移入ＢＨＫ２１細胞におけるｃＯＶＡ、インフルエンザＨＡ及びＥＢＯＶ ＧＰの発現を免疫ブロットによって分析した。細胞を溶解し、タンパク質をＲＩＰＡ－ｂｅｎｚｏｎａｓｅ緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ノニデットＰ－４０、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコラート、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／μｌ ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、プロテアーゼ阻害剤［ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、製造者の推奨に従って使用］）で抽出し、免疫ブロット用にＰＶＤＦ膜に移す前にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。膜をＴＢＳ－Ｔ中の１０％乳でブロックし、以下の検出用抗体と一緒にブロッキング緩衝剤中で２～４時間室温でインキュベートした：ｃＯＶＡ検出の場合、抗卵白アルブミンウサギポリクローナル、ＨＲＰ複合、ａｂ２０４１５（Ａｂｃａｍ ｐｌｃ）１：３０００希釈；ＨＡ検出の場合、単鎖アルパカナノボディＶＨＨ６８（Ｄｏｕｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ５０３（７４７６）：４０６～４０９（２０１３））１：１０００希釈、続いて抗ペンタ－Ｈｉｓ ＨＲＰ複合物（Ｑｉａｇｅｎ）１：５０００希釈；ＥＢＯＶ ＧＰ検出の場合、マウスモノクローナル６Ｄ８ １：１０００希釈、続いて抗マウスＨＲＰ１：１００００希釈。強化ルミノールに基づく検出をＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ－ＥＣＬキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。移入細胞単層をトリプシン処理によって解離させ、増殖培地で１回洗浄し、ＰＢＳ中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７複合ＶＨＨ６８を用いて氷上で１５分間染色して、インフルエンザＨＡの細胞表面発現を分析した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、表面染色をＦＡＣＳによってＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で測定した。
ＦＲＥＴによるナノ粒子分解の実時間分析
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を使用して、模擬筋肉内病状下でナノ粒子の安定性を推定した。センス鎖の５’末端がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７色素で標識された脱塩ＨＰＬＣ精製ＲＮＡ二重鎖をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。等モル量の両タイプのＲＮＡを含むナノ粒子を処方し、最終ＲＮＡ濃度２μｇ／ｍＬに希釈した。近接状態（すなわち、無処置ＭＮＤＰ内）では、ＲＮＡは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアとして働くと考えられる。
四つ組で、希釈ナノ粒子１００μＬを不透明黒色９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＰＢＳで希釈した５０％ＡＢヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＬを各ウェルに添加した。負の対照ウェルは、遊離ｓｉＲＮＡを含んだ。正の対照ウェルは、ＰＥＩナノ粒子を含んだ。ＰＥＩナノ粒子は、１０ｗｔ％スクロース溶液中の８００ＭＷ ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ）とＲＮＡをＰＥＩとＲＮＡの質量比５：１でピペット操作を繰り返して形成された。プレートを透明接着プレートシールで密封し、３７℃に設定されたＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー中に置いた。ＭＤＮＰが分解すると、放出されたＲＮＡは、もはやＦＲＥＴシグナルを発生するほど接近していないと考えられる。ＦＲＥＴを測定するために、試料を５４０ｎｍで励起し、蛍光強度を６９０及び６２０ｎｍで５分ごとに２時間読んだ。ＦＲＥＴを６９０ｎｍ／６２０ｎｍ蛍光強度シグナル比として計算した。負の対照は遊離ＲＮＡであった。ＰＢＳを使用して、バックグラウンドレベルを求めた。ＦＲＥＴシグナルは、オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を最終ウェル内濃度２ｗｔ％まで添加し、３７℃で１時間混合した後に測定された完全に破断したナノ粒子の値に対して規準化された。
４℃で貯蔵後のナノ粒子分解の分析
４℃におけるワクチン安定性を求めるために、ルシフェラーゼレプリコンＲＮＡを含むナノ粒子を作製し、４℃で長期間貯蔵した。ＨｅＬａ細胞を一定量のナノ粒子で処理し、ルシフェラーゼ発現を１４時間後に分析した。
結果
ナノ粒子ベースのワクチンは、頑強な抗原発現を誘発し、ＲＮＡペイロードを周囲のリボヌクレアーゼ活性から保護し、理想的にはコールドチェーンを必要とせずに、これらの性質を長期間の貯蔵にわたって保持するべきである。
ＭＤＮＰがこれらの特性を示すかどうか試験するために、ホタルルシフェラーゼをコードするＶＥＥＶレプリコンＲＮＡをモデルナノカプセル化カーゴとして選択した。組織培養におけるＶＥＥＶによる発現は、試験した３種のＲＮＡベクター（従来のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶレプリコン及びＳＦＶレプリコン）の中で最強であるので（図２Ｅ）、ルシフェラーゼを選択した。したがって、ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡを、マイクロ流体に基づく製造法によるＭＤＮＰの処方に使用した（Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ５０４８９７２（２０１５）、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３、１４３９７～１４４０１、ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０８２２１（２０１４））。
筋肉内注射に対して最適化された単分散粒子（動的光散乱によって評価して平均直径１００～１５０ｎｍ）をこの方法によって型通りに製造した。ＦＲＥＴペア標識ＲＮＡをナノカプセル化し、続いて５０％ヒト血清中で２時間３７℃でインキュベーションすることによって、ＭＤＮＰの安定性を推定した。破断した粒子は、それらの標識ＲＮＡペイロードを放出し、ＦＲＥＴシグナルの強度を減少させる。
より安定なＭＤＮＰナノ材料を２－トリデシルオキシランを用いて合成し、より不安定な対照ＭＤＮＰには１，２－エポキシドデカンを使用した。ＭＤＮＰ中のナノカプセル化は、ナノ粒子がヒト全血清中で無傷のままであり、そのＲＮＡペイロードを放出しないので、優れた保護を示す。この安定性のために、ＲＮＡペイロードは、エンドヌクレアーゼ分解から保護される。
ＭＤＮＰは、化学的に破断したＭＤＮＰ、遊離ＲＮＡ、及びカチオン性ポリマーポリエチレンイミン中にナノカプセル化されたＲＮＡに比べて、安定なままであり、強いＦＲＥＴシグナルを維持した（図２Ｆ）。
ナノ粒子の４℃における長期間の貯蔵安定性についても試験した。貯蔵ＭＤＮＰ調製物を培養ＨｅＬａ細胞に適用して、ルシフェラーゼ発現を測定した。４℃で１、３、２０又は３０日間貯蔵した粒子を用いると、統計的に有意な生物発光変化が認められなかった（図２Ｇ）。したがって、最低３０日間貯蔵後に、ルシフェラーゼ移入効率の統計的に有意な変化が（Ｔｕｋｅｙ多重比較補正を用いた）ＡＮＯＶＡ分析によって形成検出されず、粒子が安定なままであり、ＲＮＡペイロードが無傷のままであることを示している。
修飾デンドリマーは、完全に合成であり、精製されており、ＲＮＡペイロードは、細胞の完全な非存在下で産生される。ＭＤＮＰナノ材料は、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３（５２）：１４３９７～１４４０１（２０１４）、Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ１５（５）：３００８～３０１６（２０１５）に記載の免疫処置に使用されるよりも１桁多い用量で、生体内の炎症性サイトカインの全身的な増加を回避することが証明された。これらの研究に使用される粒子調製物は、感染性混入物を含まず、実質的に内毒素を含まない（＜０．２２８ＥＵ／ｍＬ、これは、ウイルス／非ウイルスベクターの許容される内毒素負荷の１／４０である（Ｂｒｉｔｏら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ１００（１）：３４～３７（２０１１））。
実施例３ ＲＮＡを含むＭＤＮＰ（複数又は単数）は、癌細胞を選択的に標的にし、死滅させる
材料及び方法
ＭＤＮＰプラットホームを使用して、ｃＯＶＡ発現腫瘍細胞を含む癌腫瘍モデルを用いて、抗癌ワクチンを製造し、評価した。ＭＤＮＰプラットホームを使用して、従来のｃＯＶＡ発現ｍＲＮＡ若しくはセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）レプリコン、又はＴｒｐ１発現ＶＥＥＶレプリコンをマウスに接種した。
ＲＮＡ設計及び発現
理想的な癌治療を行うために、バイオインフォマティクスを使用して、各患者の独特の腫瘍エクソームの配列を決定して、「新抗原」を同定する。これらの新抗原の対応するｍＲＮＡを使用して、免疫を生じるのに必要な抗原を産生する。モデル抗原ＯＶＡを発現する腫瘍細胞は、腫瘍で発現される非野生型タンパク質配列に対する免疫処置を試験するモデル系として役立つ。免疫処置は、変異しないが癌細胞タイプが選択的に濃縮される抗原（例えば、黒色腫におけるＴｒｐ１）に対しても実施することができる。公知の方法を用いて、１個以上の遺伝子を反復ＰＣＲによって構築し、又はｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリからクローン化する。遺伝子は、プロモーター及びターミネーターと一緒に、所望のｍＲＮＡを発現するように設計されたＤＮＡ配列である。本質的に任意の長さ及び配列のＤＮＡを大腸菌中で高収率で産生することができる。任意の所望の配列のｍＲＮＡ又はｒｅｐＲＮＡを、当該技術分野で確立されたインビトロ転写技術によって鋳型ＤＮＡから産生することができる。
マウス
野生型雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、５～８週齢で使用した。マウスをＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈで飼育し、ＭＩＴ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって認可された手順に従って維持した。
腫瘍細胞系
ｃＯＶＡ及びＴｒｐ１発現腫瘍細胞（Ｂ１６細胞）を３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養維持した。腫瘍を発生させるために、５００，０００個のｃＯＶＡ発現細胞を野生型雌性ＢＬ／６マウスの背中に皮下注射した。Ｔｒｐ１研究の場合、約３００，０００個の細胞を注射した。
戦略
０及び１６日目に、４μｇ用量の修飾デンドリマーナノ粒子（ＭＤＮＰ）レプリコンワクチンを動物に接種した。２８日目に、図３に示すように、２５０，０００個の腫瘍細胞を腫瘍形成のためにマウスに注射した。Ｔｒｐ１免疫処置の場合、単一の４０μｇ用量を曝露の４週間前に投与した。
ワクチン接種
マウス（１群当たり２匹）を複合８μｇ用量の裸のｃＯＶＡ ｍＲＮＡ（裸のｍＲＮＡ）、裸のｃＯＶＡ ＳＦＶレプリコン（裸のＳＦＶｒｅｐ）、ｃＯＶＡ ｍＲＮＡ修飾デンドリマーナノ粒子ワクチン（ｍＲＮＡ ＭＤＮＰ）又はＳＦＶ ｃＯＶＡ修飾デンドリマーナノ粒子ワクチン（ＳＦＶ ＭＤＮＰ）で処置した。非免疫マウスは処置しなかった。ワクチン接種後、マウスに５００，０００個のｃＯＶＡ発現腫瘍細胞（Ｂ１６－ＯＶＡ）を注射した。１か月にわたって、修飾デンドリマープラットホームを利用したすべての処置は、腫瘍を生じなかった。
より厳密な実験では、１群当たり１０匹のマウスを、モデル黒色腫腫瘍抗原Ｔｒｐ１を発現する裸の又はＭＤＮＰ送達されたＶＥＥＶレプリコン４０μｇで１回免疫した。内在性Ｔｒｐ１を天然に発現する３００，０００個の腫瘍細胞（野生型Ｂ１６細胞）にマウスを曝露した。
結果
非免疫マウス、及び裸のｍＲＮＡで免疫したマウスは、安楽死を必要とする浸潤性腫瘍を形成した。裸のＳＦＶレプリコン注射は、結果が様々であり、１匹の動物は全く腫瘍を形成しなかった。それに対して、ＭＤＮＰプラットホームを介して従来のｃＯＶＡ ｍＲＮＡ及びＳＦＶ ｃＯＶＡレプリコンを接種した動物はすべて腫瘍を形成せず、１００％生存した（図４Ａ～４Ｂ）。より現実的な腫瘍ワクチン接種モデルである、より厳密なＴｒｐ１免疫処置研究では、ＭＤＮＰによって送達されるＴｒｐ１ ＶＥＥＶレプリコンの単一の大量瞬時投与は、生存時間を有意に改善した（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定によってｐ＝０．０２２）。
ＭＤＮＰは、多数のタイプのワクチン接種に使用することができるマルチプラットホーム技術である。それは、致死的なウイルス感染に対して、わずか１回で免疫を生じるのに使用することができる。将来の癌ワクチン研究は、多種多様な癌特異抗原に対する免疫を同時に生じるＲＮＡペイロードを組み込むことによって、ＭＤＮＰの多重化及び超多重化能力を活用することになるであろう。
実施例４ 修飾デンドリマー中にナノカプセル化されたＲＮＡは、抗原特異的Ｔ細胞を生体内で刺激する。
材料及び方法
戦略
送達に成功すると、ＲＮＡベクターによってコードされたタンパク質の翻訳は、トール様受容体（ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を含めた細胞パターン認識受容体（Ｈｅｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３、１５２６～１５２９（２００４）、Ｋａｒｉｋｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７９、１２５４２～１２５５０（２００４））、酸誘導遺伝子１（ＲＩＧ－Ｉ）（Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４、９９７～１００１（２００６））、及びＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）（Ｌｅｖｉｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２５６、７６３８～７６４１（１９８１））を活性化する、インビトロで転写された外来ＲＮＡの能力と組み合わせて、導入遺伝子由来のペプチドディスプレイをクラスＩ ＭＨＣ分子上で誘発し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するはずである。細胞質で発現される卵白アルブミン断片（ｃＯＶＡ）（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０７、４７１６～４７２１（２０１０））がモデル細胞内抗原として選択され、従来のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶレプリコン、及びＳＦＶレプリコンＲＮＡが産生されて、このタンパク質を発現した。
細胞系
すべての細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。ＢＨＫ２１細胞は、Ｔａｓｕｋｕ Ｋｉｔａｄａ（Ｗｅｉｓｓ Ｌａｂ、ＭＩＴ）の好意で提供され、５％ＦＢＳ及び２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＥＭＥＭ中で維持された。別段の記載がない限り、対数期増殖したＢＨＫ２１細胞を培養密度５０～７５％でＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ移入キット（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ）を用いて製造者の手順に従って移入した。ＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。
マウス
野生型雌性Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、５～８週齢で使用した。養子細胞移入のレシピエントとして役立つＣ５７ＢＬ／６Ｐｔｐｒｃａマウスを室内で維持し、５～８週齢で使用した。ＯＴ－１／Ｒａｇ２－／－マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃから購入した創始者の同系交配によって室内で維持した。
マウスをＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈで飼育し、ＭＩＴ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって認可された手順に従って維持した。マウスに表示ＭＤＮＰを０及び２１日目に筋肉内接種した。
ＩＦＮシグナル伝達レポーター細胞アッセイ
複合ＩＦＮα／β誘導性ＩＳＧ５４プロモーター及びＩＳＲＥ調節エレメントの制御下にあるＳＥＡＰレポーター遺伝子を有し、ＩＦＮ－γ受容体活性を欠くＢ１６細胞［「Ｉ型」レポーター細胞（Ｂ１６－ＢＬＵＥ（商標）ＩＦＮα／β細胞、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ］、又は同じレポーター構築物を有し、Ｉ型ＩＦＮ受容体活性を欠くＢ１６細胞［「ＩＩ型」レポーター細胞（Ｂ１６－ＢＬＵＥ（ＴＭ）ＩＦＮ－γ細胞、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）］に、５－メチルシチジン／シュードウリジン塩基修飾ｍＲＮＡを対照として（５ｍｅＣ／ΨｍＲＮＡ、Ｔｒｉｌｉｎｋ）又はＶＥＥＶレプリコンＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ試薬を用いて移入した。培地中のＳＥＡＰ活性を移入から２０時間後に比色分析によって定量化した。２０時間後、培養上清２０μＬを平底透明９６ウェル皿中のＱｕａｎｔｉｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１８０μＬに添加し、３０分間発色させることによって、ＳＥＡＰ活性について分析した。吸光度を６５０ｎｍで測定した。ＶＥＥＶレプリコンは、マウス細胞においてＩ型ＩＦＮ応答を刺激する。
四量体染色分析
免疫マウスの血液１００μＬを頬からＫ２ＥＤＴＡ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒコレクションバイアル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に採血し、赤血球をＶｅｒｓａＬｙｓｅ緩衝剤（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて１０分間室温で溶解した。ＰＥ複合ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的四量体（配列番号１）（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）染色をＡＰＣ複合抗ＣＤ８クローン５３－６．７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に３０分間室温でＰＢＳ＋１％不活性化ＦＢＳ中で行った。細胞を洗浄し、本文に記載のようにＦＡＣＳによって分析した。ＭＤＮＰ ｍＲＮＡ免疫実験では、６匹のマウスを免疫し、３匹の２群に無作為に分割し、１群を４及び１２日目に採血し、他方を８及び１６日目に採血して、１週間未満に複数回採取しないようにした。
組織のｍＲＮＡレベルの定量化
免疫後１１日目にマウスをＣＯ２窒息によって安楽死させた。器官及び組織をすぐに収集し、液体窒素で凍結した。凍結組織を微粉砕して粉末を形成し、組織溶解物を０．５ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を補充した組織及び細胞溶解緩衝剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）中で調製した。混合物を１４００ＲＰＭで２時間６５℃で混合し、１６，０００ＲＣＦで遠心分離して、残骸を除去した。上清（溶解物）のｍＲＮＡレベルを、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０発光ベース分岐ＤＮＡアッセイキット並びにｃＯＶＡ及びＧａｐｄｈに対するＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０プローブ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、製造者の手順に従って定量化した。発光シグナルをＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯプレートリーダーを用いて測定した。シグナルが飽和しないようにし、すべての発光シグナルがそれらの線形領域内に確実に残るようにするために、各組織及び標的遺伝子の検量線を、ＰＢＳ処置マウスからの試料を用いて作成して、アッセイ試料の最適な希釈度を決定した。処置群の相対発現を、標的遺伝子発光とＧａｐｄｈハウスキーパー遺伝子発光の比を計算することによって求めた。すべての値をＰＢＳ処置マウスの標的：ハウスキーパー遺伝子比に対して規準化した。
Ｔ細胞細胞内サイトカイン染色アッセイ
脾細胞を４０μｇＭＤＮＰ免疫処置後９日目にマウスから単離し、増殖培地中で培養した（別段の記載がない限り、すべての成分がＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製である：８％ＦＢＳ、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６２０）。免疫優性Ｈ－２Ｋｂ拘束性ＭＨＣクラスＩ ＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、又はＥＢＯＶ ＧＰ由来のＷＥ１５ペプチド（ＷＩＰＹＦＧＰＡＡＥＧＩＹＴＥ）（配列番号２）による刺激に反応したサイトカイン発現を、本質的にＭａｒｔｉｎｓら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９（２）：ｅ８９７３５（２０１４）によって記述されたように、細胞内サイトカイン染色及びＦＡＣＳ分析によって分析した。手短に述べると、１×１０７脾細胞／ｍＬを、ＩＬ－２（１０Ｕ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８＋抗ＣＤ４９ｄ（各０．５μｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＢＦＡ（最終２μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で、２μｇ／ｍｌペプチドと一緒に、又は２μｇ／ｍｌペプチドなしで、培養した。ＩＬ－２、抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ４９ｄをＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）による刺激では省略した。というのは、ＯＶＡワクチン接種マウスにおけるこのペプチドに対する脾臓の応答が、外因性同時刺激なしでも明白であるからである。０．１μｇ／ｍＬ ＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬイオノマイシンで非特異的に刺激した培養物をＦＡＣＳ分析の単色抗体染色対照として使用した。６時間の培養後、ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造者の手順に従って、ＦＩＴＣ複合抗ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ複合抗ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ複合抗ＩＦＮｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ複合ＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で細胞を染色した。染色試料をＦＡＣＳによってＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
養子移入及びＯＴ－１増殖アッセイ
ＯＴ－１細胞をトランスジェニック６～１２週齢ＯＴ－１／Ｒａｇ２－／－Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜及び鼠径リンパ節並びに脾臓から単離し、ＰＢＳに再懸濁させた。細胞を５分間室温でＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）を用いて最終濃度５ｕＭで標識し、次いで、注射用ＰＢＳに再懸濁する前に、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩで１回洗浄した。野生型ＣＤ４５．１マウス４～８週齢に、１５０万個の標識ＯＴ－１細胞を静脈内注射した。養子移入後４日目に鼠径リンパ節を解剖し、リンパ球をＦＡＣＳ分析用に単離した。細胞を７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００又はＡＰＣ複合抗ＣＤ４５．１、ＰＥ－Ｃｙ７又はＡＰＣ－Ｃｙ７複合抗ＣＤ４５．２、及びＰａｃｉｆｉｃブルー又はＰＥ複合抗ＣＤ８で染色した。染色試料をＦＡＣＳによってＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
Ｔ細胞活性化アッセイ
脾細胞をマウスから単離し、密度１０００万細胞／ｍｌで９６ウェル培養プレート中で増殖培地（別段の記載がない限り、すべての成分がＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製である：８％ＦＢＳ、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ１６２０）のみ、又は増殖培地中２μｇ／ｍｌ ＯＶＡ由来のペプチドの存在下で播いた。使用したペプチドは、免疫優性Ｈ－２Ｋｂ拘束性ＭＨＣクラスＩ ＯＶＡ由来のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）又はＨ－２Ｉ－ＡｂＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）であった。５日間の培養後、濃度１：２０希釈上清ＩＦＮγをＩＦＮγＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量化した。
結果
ＭＤＮＰカプセルＲＮＡは、ヒト上皮細胞系ＨｅＬａ、マウス及びヒト初代線維芽細胞、マウス樹状細胞系ＤＣ２．４、マウス及びラット骨格筋芽細胞系Ｃ２Ｃ１２及びＬ６、並びにＣ２Ｃ１２細胞系由来の分化型マウス筋管を含めて、培養中の多種多様な細胞型において発現に成功した（表１参照）。ＭＤＮＰの筋肉内注射は、生体内の注射部位で容易に検出可能な遺伝子発現を惹起することが認められた。
Figure 0006991977000013
免疫応答がＭＤＮＰシステムを用いて誘導されたかどうかを試験するために、細胞質で発現される卵白アルブミン断片（ｃＯＶＡ）をモデル細胞内抗原として使用した。従来のｍＲＮＡ、ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡ、及びＳＦＶレプリコンＲＮＡが産生されて、このタンパク質を発現した。
ｃＯＶＡタンパク質は、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞によって認識されるドミナントエピトープを含む（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０７、４７１６～４７２１（２０１０））。ＢＨＫ２１細胞に移入した１４時間後のｃＯＶＡ発現の発現が、従来のＴｒａｎｓＩＴ移入試薬を用いた免疫ブロットによって確認され、ＶＥＥＶレプリコンが最も有効であることが判明した。
抗原発現がＣＤ８＋Ｔ細胞を生体内でＭＤＮＰを用いて活性化するのに十分かどうか判定するために、ＯＴ－１ Ｒａｇ１－ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｈ－２Ｋｂ拘束性ＯＶＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する遺伝子導入系を養子実験におけるリンパ球供与体として使用した。
ＯＴ－１Ｔ細胞を投与したマウスに、パッケージされていない（「裸の」）ＲＮＡ、又は両側のｉ．ｍ．注射によってＭＤＮＰとしてカプセル化された同じＲＮＡを投与した。免疫後３日目（移入後４日目）に、ＯＴ－１Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈によって分析した（図５Ａ～５Ｇ、図８Ａ）。裸のＲＮＡで免疫されたマウスは、ＯＴ－１細胞の増殖を誘発しなかった。ＭＤＮＰを介してＲＮＡを投与したマウスにおいては、少なくとも６回の増殖を検出した。最強の増殖は、ｍＲＮＡ含有ＭＤＮＰで免疫されたマウスで認められた。
投与用量は、注射ＲＮＡの等価な質量に基づき、したがってレプリコンＲＮＡに比べて分子量差に基づいて約１０倍モル過剰の従来のｍＲＮＡを注射する。１０倍の用量のパッケージＶＥＥＶレプリコンＲＮＡは、実際、デンドリマーパッケージｍＲＮＡに類似したＯＴ－１増殖プロファイルを示した。移入後４日目／ＶＥＥＶ－ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ４０μｇで免疫後３日目に行われたＯＴ－１増殖アッセイの結果を図７Ａ～７Ｂに示す。
単一用量のＭＤＮＰ送達ＲＮＡが効率的な抗原提示をもたらし得るかどうか証明するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを裸又はＭＤＮＰで免疫し、ＣＦＳＥ標識ＯＴ－１細胞を１０日後に養子移入した。
移入後４日目（すなわち、免疫後１４日目）に、増殖を上述したように分析した（図６Ａ～６Ｇ）。裸のｍＲＮＡ免疫処置は、ＯＴ－１Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった。ｍＲＮＡ ＭＤＮＰは、免疫マウスの２／３で小さいが検出可能なＯＴ－１増殖をもたらした。裸のレプリコンによる免疫処置は、ＯＴ－１Ｔ細胞の不定の増殖を引き起こした。裸のＳＦＶで免疫されたマウスも極めて変わりやすい結果を示した。しかし、ＭＤＮＰシステムを用いると、ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡは、免疫マウスの大部分においてＯＴ－１Ｔ細胞の再現性のある一貫した増殖を引き起こした（６匹の動物の５匹で２０～５０％）（図８Ｂ）。ＭＤＮＰ送達ＳＦＶレプリコンＲＮＡは、ＯＴ－１増殖を誘導しなかった。２種のアルファウイルスレプリコンの発現プロファイルの差が、ナノカプセル化の短期の効果と相まって、原因であるかもしれない。
したがって、ＭＤＮＰ送達ＶＥＥＶレプリコンをワクチン候補として探究した。ＶＥＥＶ ＭＤＮＰが内在性Ｔ細胞応答を刺激し得ることを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを高い（４０μｇ）用量のｃＯＶＡ ＶＥＥＶ ＭＤＮＰで免疫した。９日後、免疫優性Ｈ２－ＫｂクラスＩ ＭＨＣ拘束性ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）を用いてインビトロで刺激した脾細胞において、細胞内ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２産生を測定した。２つの独立した実験においては、免疫マウスの内在性ＣＤ８＋脾細胞の＞１％が、別々の集団の強いＩＦＮ－γ＋細胞をペプチド刺激によって含んだ。免疫後１８日目に、四量体染色によって検出された、ＭＨＣクラスＩ結合ＳＩＩＮＦＥＫＬに対するＴＣＲ特異性を有する多量の循環ＣＤ８＋Ｔ細胞が、同様に免疫マウスにおいて認められた。比較のために、ｍＲＮＡをペイロードとして用いた同様の独立した実験において、より少ない循環四量体陽性細胞が検査の間に検出され、レベルは、１６日目までにほぼ検出不可能であった。アルファウイルスレプリコンが強力なＩ型ＩＦＮ応答を誘導すること（図８Ｃ）と相まって、これらの観察、並びにアポトーシス及び樹状細胞による抗原取り込みは、種々の標的抗原を用いた更なる実験のペイロード候補としてのＶＥＥＶの選択を更に正当化するものであった。ＭＤＮＰ ＶＥＥＶ免疫動物においては、抗原をコードするＲＮＡは、流入鼠径リンパ節において１１日目までに検出され、ＭＤＮＰによって送達されたレプリコンの免疫原作用が注射部位に限定されない可能性が提起されたことに留意されたい。ただし、注射部位は、恐らく、生体内で主要な実際の抗原産生源である。
ＭＤＮＰ送達ＶＥＥＶレプリコン構築物（ＶＥＥＶ ＭＤＮＰ）の活性を、ＨＩＶ１ Ｇａｇ特異的ヤギポリクローナルＩｇＧ ｖＴ－２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）移入から１４時間後に行われた免疫ブロットで測定して、更に別のウイルス構造ポリタンパク質ＨＩＶ１ Ｇａｇのワクチン候補として評価した。ＶＥＥＶレプリコンはＨＩＶ１ Ｇａｇの発現が明瞭に見えたのに対して、ｍＲＮＡ及びＳＦＶ媒介性移入は発現が見えなかった。
ＶＥＥＶ ＭＤＮＰが内在性Ｔ細胞応答を実現できることを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを漸増用量のｃＯＶＡ発現ＶＥＥ ＭＤＮＰで免疫した。９日後、インビトロで免疫優性Ｈ２－ＫｂクラスＩ ＭＨＣ拘束性Ｉ ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）で刺激された脾細胞においてＩＦＮｇ産生を測定した（図９）。
対照マウス、又は無関係な抗原をコードするＶＥＥ ＭＤＮＰ４０μｇで免疫されたマウスの脾細胞は、ペプチド処置後にＩＦＮγを産生しなかった。ｃＯＶＡ発現ＶＥＥＶ ＭＤＮＰ４０μｇで免疫されたマウスから得られた脾細胞は、ペプチドに反応してＩＦＮγが８～１４倍増加した。ＶＥＥＶ ＭＤＮＰ０．４μｇ又は４μｇで免疫されたマウスは、さほど増加を示さなかった。
実施例５ 単一用量のＨＡ発現ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡナノ粒子は、致死的なインフルエンザ曝露に対して防御の働きがある。
材料及び方法
抗ＨＡ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
高結合表面処理ポリスチレン９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌ組換えインフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ ＷＳＮ／３３タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）で終夜４℃で被覆した。プレートをブロッキング緩衝剤（１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２時間室温でブロックし、血清をウェルに二つ組でブロッキング緩衝剤中１：１００希釈で塗布し、２時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄緩衝剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキング緩衝剤で１：３０００希釈した抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝剤で５回洗浄した後、プレートをＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）を用いて２０～３０分間現像し、吸光度を４５０ｎｍで読む前に１体積の１Ｍ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。
インフルエンザ曝露
Ｂａｌｂ／ｃＪマウス（ｎ＝３）を、対照としての無関係な抗原（ｃＯＶＡ）、又はＨＡタンパク質をコードするＶＥＥ ＭＤＮＰで免疫し、それらを１４日後に致死量のインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３に曝露した。感染Ｂａｌｂ／ｃマウスの１００％を９日以内に死滅させる致死量（５×１０４ＣＥＩＤ５０）のインフルエンザＡ／ＮＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＡＴＣＣ）の鼻腔内投与によって免疫マウスを接種した。体重を毎日モニターし、２０％を超える減量が認められたときにマウスを安楽死させた。マウスは、感染前体重を越えたときに回復したとみなされ、感染の臨床徴候が認められないことを確実にするために健康を更に３週間モニターした。Ａ／ＷＳＮ／３３感染動物をＷｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの認可隔離室に収容した。
結果
ナノ粒子ベースのワクチンが致死的なウイルス曝露に対して防御する免疫を誘発し得るかどうか証明するために、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ＨＡタンパク質の発現を惹起するＲＮＡを作製した。
達成された発現レベルの点で、ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡは、組織培養実験において他の構築物より優れていた。３’ＵＴＲ安定化ｍＲＮＡ変異体（Ｗａｒｒｅｎ、Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ７、６１８～６３０、２０１０）でもＶＥＥＶレプリコンに匹敵するレベルでＨＡを産生した。ＶＥＥＶ ＲＮＡ発現ＨＡタンパク質の正しいプロセシング及び細胞表面への移動は、ＨＡ特異的単鎖抗体を用いた表面免疫染色によって確認された（Ｄｏｕｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ５０３、４０６～４０９、（２０１３））（図１１Ａ）。
対照マウスが７日目までに感染症に屈っしたのに対して、ＨＡ発現ナノ粒子免疫マウスは、少なくとも３週間曝露に耐え、実験終了時に感染の臨床徴候が残らなかった（図１１Ｂ）。抗ＨＡ ＩｇＧは、免疫後７日目のマウスの血清には検出されず、又は屠殺時（感染後６又は７日目（図１１Ｃ）の対照マウスでは検出されなかった。曝露後７日目に、ＨＡ反応性ＩｇＧは、ＨＡをコードするＶＥＥＶレプリコンナノ粒子で免疫された生存マウスにおいて容易に検出でき（図１１Ｃ～１１Ｄ）、修飾デンドリマーｍＲＮＡワクチンによる初回刺激が液性応答を増強したことを示している。
実施例６ 修飾デンドリマーナノ粒子送達ＶＥＥレプリコンＲＮＡは、致死的なＺＥＢＯＶ曝露からマウスを防御する
材料及び方法
エボラ糖タンパク質（ＧＰ：ｅｂｏｌａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を生きているザイールエボラウイルスに対する免疫を発生する抗原として選択した。ＶＥＥ－ＧＰとＶＥＥ－ＧＰ／ＶＰ４０ＭＤＮＰ（単数又は複数）ワクチン候補を致死的なＥＢＯＶ曝露に対してマウスを防御するそれらの能力について比較した。
ｃＯＶＡ ＭＤＮＰは、無関係な抗原をコードし、負の対照として使用される。パッケージされない裸のＧＰレプリコンをナノ粒子を含まない対照として使用した。
ＥＢＯＶ ＧＰ免疫処置
各群１０匹のマウス（ＶＥＥ－ＧＰ又はＶＥＥ－ＧＰ／ＶＰ４０、各ｎ＝１０）に、修飾デンドリマー中にナノカプセル化されたＲＮＡ４μｇを両側の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって接種し、２１日目に同じ用量を追加した。血清を１４、３５及び４８日目に収集して、循環ＥＢＯＶ ＧＰ特異的ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって測定した。
サイトカイン産生を測定するために、各群３匹のマウスを２５日目に安楽死させて、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及び細胞内サイトカイン染色のために脾細胞を単離した。残り７匹のマウスを４９日目にマウス適応ＥＢＯＶに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって曝露した。
ＥＢＯＶ ＧＰ血清ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの組換え哺乳動物エボラＧＰで４度で終夜被覆した。プレートをＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄し、次いでＰＢＳ－Ｔ５％脱脂乳を用いて２時間室温でブロックした。血清を１：１００から始まる半対数希釈で希釈し、ＧＰ被覆プレート上で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、示した二次ＨＲＰ抗体と一緒に４５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ＥＬＩＳＡをＴＭＢ基質／停止液を用いて現像し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで測定した。吸光度カットオフをバックグラウンド＋０．２Ｏ．Ｄ．として決定した。
ＥＢＯＶ曝露
マウスに標的力価１，０００ｐｆｕのｍａ－ＥＢＯＶを接種した（Ｋｕｈｎ ＪＨら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ、１５８（６）：１４２５～１４３２（２０１３））。すべての検討をＵＳＡＭＲＩＩＤバイオセーフティレベル４封じ込め施設で行った。０日目に開始し、生存期間継続して、臨床観察を記録し、動物の疾患進行を綿密にモニターした。瀕死の動物を施設認可の臨床スコアに基づいて安楽死させた。
用量反応実験
様々な用量のワクチンに対する応答を試験するために、マウスに０日、２１日目にワクチン接種し、４９日目に生ウイルスに曝露した。高用量初回抗原刺激のみの実験では、マウスに０日目にワクチン接種し、２８日目に生ウイルスに曝露した。
結果
ｃＯＶＡ対照は、致死的なエボラ曝露に対して防御を示さなかった。さらに、ＥＢＯＶ ＧＰに特異的な血清ＩｇＧは、ＺＥＢＯＶ ＶＬＰをＥＬＩＳＡで測定して、１４日目までに免疫マウスの大部分で無視し得る程度であり、４８日目に類似レベルのままであった（図１２Ａ）。
曝露後、すべての対照（非免疫）マウスが感染後７日目までに感染症に屈っしたのに対して、いずれの免疫処置群（ＶＥＥ－ＧＰ又はＶＥＥ－ＧＰ／ＶＰ４０）も１／７しか死ななかった。ＶＥＥＶ ＧＰ又はＶＥＥＶ ＧＰ／ＶＰ４０混合物で免疫された群の７匹のマウスのうち６匹は、検査期間を通して感染の臨床徴候を示さなかった（図１２Ｂ）。
用量反応実験においては、抗体価は、ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ対照で認められなかった。２×４０μｇの裸のＧＰレプリコン群は、低用量２×０．４μｇのＧＰ ＭＤＮＰ用量と類似の力価を示した（図１３Ａ）。抗体価の用量反応は、ＭＤＮＰを２回投与した動物で認められた。
特に、単一用量の４０μｇのＧＰ ＭＤＮＰは、高抗体価を優れた精度（低標準偏差）で示した。
ｃＯＶＡ ＭＤＮＰ群のすべてのマウスが７日目までに死んだ。２×４μｇ、２×４０μｇ及び１×４０μｇのＧＰ ＭＤＮＰ群は、１００％生存した。２×４０μｇの裸のＧＰレプリコンを投与した群は、２×０．４μｇのＧＰ ＭＤＮＰ用量を投与した群と同様の生存動態を示した（図１３Ｂ）。
総合すると、防御データによれば、ＭＤＮＰは、致死的なウイルス感染症の２つのマウスモデルにおいて防御をもたらす。修飾デンドリマーの非免疫原性は、エボラ曝露に対する防御用量よりも５０倍高い用量でも（図１２Ｂ）（Ｋｈａｎら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ、ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ５０４８９７２（２０１５）、Ｋｈａｎら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３、１４３９７～１４４０１、ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１４０８２２１（２０１４））、効率的導入遺伝子発現に有利な性質であり、自然免疫の刺激は、ｍＲＮＡペイロードのみの発現による。この方法は、大型自己増幅ＲＮＡレプリコンに適合し、注射後早期にＩＦＮ応答を刺激せずに免疫系に対して強力で持続的な抗原提示を可能にする。強力なＩＦＮ応答は、アルファウイルス複製を妨害し、したがって、抗原用量を次第に制限する可能性がある。（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ－Ｌａｃｅｙら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．８、１５３～１６１（２０１１）、Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．、８１、１１２４６～１１２５５（２００７）。
ＲＮＡベクターの選択は、従来のものでもレプリコンでも、抗原発現の強度及び持続性を決定するのに重要なパラメータである。ＳＦＶ、ＥＥＶ、ＶＥＥ及びＳＩＮを含めたアルファウイルス科のＲＮＡウイルスに基づくレプリコンは、それらの比較的小さいサイズ、遺伝子操作の容易さ、及び宿主細胞細胞質においてすべての構造遺伝子の非存在下で自律的に複製する能力のために、ワクチンベクターとして役立っている。
これらのベクターは、複製欠損型偽ウイルス粒子として送達されると、細胞培養系において構造遺伝子の相補性を必要とする。（Ｙｉｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｄ５、８２３～８２７（１９９９））。カチオン性リポソームは、生体内でのキメラＳＩＮ／ＶＥＥＶレプリコンワクチンの合成送達法として働き得る（Ｇｅａｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０９、１４６０４～１４６０９（２０１２）、Ｂｏｇｅｒｓら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ、ｄｏｉ：ｊｉｕ５２２［ｐｉｉ］１０．１０９３／ｉｎｆｄｉｓ／ｊｉｕ５２２（２０１４））が、致死的な病原体曝露に対する防御はまだ報告されていない。レプリコンの急速な送達は、自然免疫活性化を制限する。複製は、恐らく、抗原の単一サイクルの制限された細胞内産生がレプリコンを除去するのに十分な免疫応答を誘発するまで堅牢に進行する。（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ＆Ｇａｒｏｆｆ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９、１３５６～１３６１（１９９１）。
ＭＤＮＰ送達システムの完全な合成性は、重要な利点である。それは、産生のために生細胞に依存するステップを必要とせず、原則的には多数の個々のワクチン候補の迅速なスクリーニングを可能にする。マウスにおける安全で有効な用量（少なくとも４０μｇまで）は、有意な防御免疫を得るのに必要な用量よりも１桁大きい（図１３Ａ～１３Ｂ）。
幾つかの個々の抗原を処方して広範な多価ワクチンを生成するように抗原組成を多重化することが可能であるべきである。精製及び拡張性の容易さ、並びにコールドチェーンが不要であることは、合成ナノ粒子に基づくプラットホームの更なる開発を促進するものである。
実施例７ 修飾デンドリマーナノ粒子送達ＶＥＥレプリコンＲＮＡは、致死的なトキソプラズマ ゴンヂ曝露からマウスを防御する
材料及び方法
Ｊｅｒｏｅｎ Ｊ．Ｐ．Ｓａｅｉｊ Ｌａｂから提供されたＴ．ゴンヂ寄生生物の野生型ＰＲＵ－デルタＨＸＧＰＲＴ系統を既述のように調製した。マウスにタキゾイトを接種した。動物の体重減少、不十分な毛づくろい、嗜眠、斜視、脱水症状及び体温低下を含めて、病気の臨床徴候をモニターした。マウスが１０％を超える体重減少、激しい脱水症状、重篤な嗜眠、及び／又はかなりの体温低下を起こした場合には安楽死させた。
結果
ＭＤＮＰの大きいペイロード能力の証明として、６重ワクチンをＴ．ゴンヂ用に製造した。Ｔ．ゴンヂは、世界人口の１／３に汚染食品を介して感染するアピコンプレックス門の原生動物であり、免疫無防備状態の個体において脳トキソプラズマ症を引き起こす可能性があり、生／弱毒寄生生物、ＤＮＡ及びペプチドの注射によって免疫を生じる努力にもかかわらず、認可されたヒトワクチンがない（Ｚｈａｎｇら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、１２（１１）：１２８７～１２９９（２０１３））。米国におけるこの疾病の年間経費は、３０億ドルと推定される（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ、７５（７）：１２９２～１３０２（２０１２））。単一のＭＤＮＰに同時処方された複数のレプリコンを同時に発現する能力を確認した後、多重Ｔ．ゴンヂＭＤＮＰワクチンを製造した。６種のＴ．ゴンヂ特異抗原ＧＲＡ６、ＲＯＰ２Ａ、ＲＯＰ１８、ＳＡＧ１、ＳＡＧ２Ａ及びＡＭＡ１をＶＥＥＶレプリコンにコードし、等モル量をＭＤＮＰに同時処方した。これらの抗原が選択されたのは、寄生生物の複数の生活環ステージで発現されるタンパク質であり、複数の系統及びタイプで保存されるからである。動物に単一の４０μｇ用量のワクチンを接種した（図１２Ａ及び１２Ｂにおいてエボラ用に確立された有効量範囲内である６．６７μｇ／レプリコン）。対照として、ＶＥＥＶ ＨＡを無関係な抗原として含む適合用量のＭＤＮＰで動物を処理した。免疫後３２日目に、動物を致死量のＴ．ゴンヂＩＩ型系統ＰＲＵに曝露した（図１４Ａ～１４Ｂ）。１２日目までにすべての対照動物が感染に屈した。６重ＭＤＮＰワクチンを接種した残りの動物は、臨床徴候なしに６か月以上生存した。単回投与の有効性を試験した同様の長期実験においては、１回のＴ．ゴンヂワクチン４０μｇを受けてから３２日後にマウスを曝露すると、１００％防御が認められた（図１４Ｃ、１４Ｄ）。これは、Ｔ．ゴンヂに対する完全な防御性単回投与ｍＲＮＡレプリコンナノ粒子ワクチンを初めて実証したものである。
実施例８ 修飾デンドリマーナノ粒子送達ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡは、ジカウイルスに対して液性及び細胞性適応免疫応答を誘発する
材料及び方法
別の病原体であるジカウイルスの抗原成分を、ジカウイルスペプチドに対して免疫を生じる別の抗原として選択した。ワクチン候補をマウスにおけるジカウイルスに対して液性及び細胞性適応免疫応答を誘発する能力について比較した。
ザイールエボラウイルスに対するＭＤＮＰ製剤（上記実施例６参照）を負の対照ワクチンとして使用した。
結果
液性（図１５Ａ）及び細胞性（図１５Ｂ）適応免疫応答は、対照ワクチン（ザイールエボラウイルスに対するＮＰ製剤）接種マウスに比べて、ＮＰワクチン接種マウスの１００％でジカウイルスに対して生じた。
概要
遺伝子に基づくワクチン手法は、完全に合成で迅速にカスタマイズでき、アジュバントを含まない調製物中で製造できるので、従来法よりも幾つかの潜在的利点を有する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１３８（７）：５５０～５５９（２００３））。現行のウイルスに基づくワクチン製造法は、時間がかかり、２００９年のＨ１Ｎ１汎流行で経験したように、５か月を超えるリードタイムを必要とし、生産量はスケールアップ及び収率問題で複雑化し得る（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ２８（３０）：４７０９～４７１２（２０１０））。アデノウイルス、ｒＶＳＶ、ＡＡＶ、ＣＭＶなどのウイルスベクターによる遺伝子送達に基づくワクチンは、繰り返し投与を妨げる既存の又は誘導される抗ベクター免疫の更なる課題に直面している。ＭＤＮＰプラットホームは、その柔軟性、安全性及び効率のために、突然の大流行、進化する病原体、個々の患者の要求に対してより適切に答えることができる。このプラットホームを用いると、関連するＤＮＡ配列を最初に入手してからミリグラム規模のすぐに注射できるＭＤＮＰワクチンまでの製造のタイムラインは、わずか７日である。サイトゾルへのレプリコン送達を促進することによって、ＭＤＮＰは、Ｔ細胞と抗体応答の両方を刺激する内在性抗原産生を惹起する。さらに、ナノカプセル化は、ＲＮＡ配列に無関係であるので、各々が独特の抗原をコードする種々のレプリコンを生成し、同時にカプセル化することができる（図１０Ａ、１０Ｂ）。達成可能な用量（少なくとも４０μｇまで）は、有意な防御免疫を得るのに必要な用量よりも１桁大きい（図１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂ、１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ）。この治療指数範囲をヒトに換算すれば、複数の異なる抗原を単一の製剤に組み込むことが可能である。
免疫処置用ベクターとして、ｍＲＮＡが、特に癌免疫療法の分野で研究され、様々な成功をおさめた（Ｖａｎ Ｌｉｎｔら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、１４（２）：２３５～２５１（２０１５））。幾つかの要因が、ｍＲＮＡに基づく治療法を複雑にし、その有効性を制限している：（１）ＲＮＡ分子は、細胞内及び細胞外分解しやすい、（２）ｍＲＮＡ発現は一過性である、及び（３）翻訳抑制がＲＮＡに反応して起こり得る（Ｂａｕｍ Ａ＆Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ（２０１０）「ＲＮＡウイルスによるＩ型インターフェロンの誘導：細胞受容体及びそれらの基質（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｂｙ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」（Ｂａｕｍ＆Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、３８（５）：１２８３～１２９９（２０１０）、Ｈｅｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０３（５６６３）：１５２６～１５２９（２００４）、Ｋａｒｉｋｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７９（１３）：１２５４２～１２５５０（２００４）、Ｐｉｃｈｌｍａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１４（５８０１）：９９７～１００１（２００６）、Ｌｅｖｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５６（１４）：７６３８～７６４１（１９８１）。それでも、抗原をコードする裸のｍＲＮＡの投与は、リンパ節に直接注射すると、抗腫瘍免疫を与えることができる（Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７０（２２）：９０３１～９０４０（２０１０）、Ｖａｎ Ｌｉｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７２（７）：１６６１～１６７１（２０１２））。より受け入れやすい経路によってワクチンを配置するのに使用することができる送達化合物の免疫原性及び／又は毒性は、追加の合併症を引き起こす。一部の用途に有効なカチオン性脂質（Ｇｅａｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０９（３６）：１４６０４～１４６０９（２０１２）、Ｂｏｇｅｒｓら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ（２０１４））は、より高用量で使用され、複合化が不完全であると、有毒になり得る（Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３（１４）：７３０５～７３０９（１９９６）、Ｃｕｌｌｉｓら、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ３２（１－２）：３～１７（１９９８）、Ｌｖら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ、１１４（１）：１００～１０９（２００６））。さらに、カチオン性脂質は免疫原性である可能性があり、それは、導入遺伝子発現を制限し、安全上の懸念を生じ得る（Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ－Ｌａｃｅｙ Ｍら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ８（１）：１５３～１６１（２０１１））。脂質複合型ｍＲＮＡに反応したＩＦＮ産生は、ｍＲＮＡベースのワクチンの有効性を制限し得る（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２１（１）：２５１～２５９（２０１３））。種々のナノ粒子形式が、皮内（Ｈｏｅｒｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ３０（１）：１～７（２０００））、脾臓内（Ｚｈｏｕら、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ１０（１６）：２７１９～２７２４（１９９９））、皮下（Ｐｏｌｌａｒｄ Ｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２１（１）：２５１～２５９．（２０１３））、静脈内（Ｈｏｅｒｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ３０（１）：１～７（２０００）、Ｍｏｃｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ１４（９）：８０２～８１４（２００７））、更には鼻腔内（Ｐｈｕａら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ４：５１２８（２０１４））投与経路で様々なレベルの有効性を示した。抗原提示細胞の生体外移入とは無関係であるＲＮＡナノ粒子ワクチンの適用の成功例は、動物モデルに限られ（（Ｕｌｍｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ３０（３０）：４４１４～４４１８（２０１２）、及び（Ｗｅｉｎｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２１（３）：５０６～５０８（２０１３））に概説されている）、こうした手法はほとんど臨床試験に供されていない。ヒトにおける免疫防御の相関が報告されてはいるが、臨床効果は失望するものである（Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ３１（２）：１８０～１８８（２００８）、Ｗｅｉｄｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、３２（５）：４９８～５０７（２００９）、Ｒｉｔｔｉｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１９（５）：９９０～９９９（２０１１）、Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３（３）：３９９～４０６（２０１１））。ＳＦＶ、ＶＥＥＶ、ＳＩＮなどのアルファウイルス科のＲＮＡウイルスに基づくレプリコンは、細胞培養における構造遺伝子の相補性によって生成される複製欠損型偽ウイルス粒子として通常送達される、ワクチンベクターとして役立つ（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、Ｖｉｒｕｓｅｓ７（５）：２３２１～２３３３（２０１５））。
以前、ＰＲＩＮＴタンパク質粒子がｍＲＮＡレプリコンの非ウイルス性インビトロ送達用に探索された（Ｘｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ１０（９）：３３６６～３３７４（２０１３））。しかし、わずか２つの非ウイルス性生体内送達方法しか報告されていない。これらは、ＭＦ５９アジュバントの構成成分で乳化されたカチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含むカチオン性ナノエマルジョン（Ｂｒｉｔｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２２（１２）：２１１８～２１２９（２０１４）、Ｂｏｇｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ２１１（６）：９４７～９５５（２０１５））、ＤＬｉｎＤＭＡを中心にした脂質ナノ粒子（Ｈｅｋｅｌｅ Ａら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ２（２０１３）、Ｇｅａｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０９（３６）：１４６０４～１４６０９（２０１２））などであり、その両方が５成分系である。これらは、生体内でのキメラＳＩＮ／ＶＥＥＶレプリコンワクチンの合成送達方法として使用されたが、それらは、致死的な病原体曝露に対して防御を示していない（Ｈｅｋｅｌｅ Ａら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ２（２０１３）、Ｇｅａｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０９（３６）：１４６０４～１４６０９（２０１２））。それに対して、ＭＤＮＰ手法は、イオン性送達材料、脂質固定化ＰＥＧ及びレプリコンを利用した完全な合成３成分系であり、致死的なウイルス及び原虫感染症のマウスモデルで防御を示す。これは、致死的な曝露モデルにおいて多種多様な病原体に対して防御免疫を生じ得る最初の完全な合成ＲＮＡベースのレプリコンシステムである。この研究は、従来のｍＲＮＡでもレプリコンでも、ＲＮＡペイロードの選択が、抗原発現の強度及び持続性にかなり影響し得ることも示している（図２Ｆ～２Ｇ、図８ａ～８ｂ）。
ＭＤＮＰ送達技術は、エボラ及びＴ．ゴンヂ防御に必要な用量の５００倍の用量を用いたときに、ＩＦＮを含めた炎症性サイトカイン産生の全身的増加を生じない（Ｋｈａｎ ＯＦら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ５３（５２）：１４３９７～１４４０１（２０１４）、Ｋｈａｎ ＯＦら、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ１５（５）：３００８～３０１６（２０１５））。強い初期のＩＦＮ応答は、アルファウイルス複製を妨害し、したがって抗原の用量を次第に制限し得るので、これは役立つ（Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（８）：３７０６～３７１８（２００１）、Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ８１（２０）：１１２４６～１１２５５（２００７））。さらに、両方の疾患モデルにおける完全な防御、及び長期の抗原特異的Ｔ細胞応答（ワクチン接種後少なくとも１０日）が、炎症反応を増加させるのに一般に使用されるアジュバントの非存在下で得られた（Ｓｃｈｉｊｎｓら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ１０（４）：５３９～５５０（２０１１））。
ナノ粒子送達ビヒクルに対する全身的サイトカイン応答の欠如は、抗ベクター免疫を阻止する可能性もある（Ｕｌｍｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ３０（３０）：４４１４～４４１８（２０１２））。抗ベクター免疫は、免疫系が送達ビヒクルに応答し、送達ビヒクルを不活性化するときに生じ、例えば、ウイルス媒介性送達プラットホームにおいて認められた（Ｓｍａｌｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１（４）：２４１～２４５（２０１１）、Ｌｏｐｅｚ－Ｇｏｒｄｏ Ｅら、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ２５（４）：２８５～３００（２０１４））。この性質のため、最近のヒト治験中にｒＶＳＶベースの系で必要であることが示唆された同種追加免疫を不要にすることもできる（Ｆｕｃｈｓら、Ｏｐｅｎ Ｆｏｒｕｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ２（３）（２０１５））。これによって、種々の疾患に対して同じ送達技術を用いて患者に繰り返し投薬することが可能になり得る。
進化する病原体、突然の大流行及び個々の患者の要求に対してより適切に答えるために、医療現場近傍での迅速な製造に適した柔軟で安全で効率的なワクチンプラットホームが必要である。ここで開発されたプラットホームは、以下を可能にし得る合成システムを提供することによって、この要求に対処するものである：１）標的同定後の極めて迅速な製造、２）製造後に必要な精製を最小限にすること、３）混入アレルゲンの可能性が低いこと、４）レプリコンを含めて、複数の抗原産生ＲＮＡのカプセル化を可能にする、比較的大きいペイロードを可能にすること、５）好ましくない免疫応答を誘導し得る、内在性ｍＲＮＡ産生を減少させ得る、また、レプリコン自己増幅を減少させ得る、追加のアジュバントの使用を不要にすること（Ｇｕｐｔａら、Ｖａｃｃｉｎｅ１１（３）：２９３～３０６（１９９３）、Ｐｏｌｌａｒｄ Ｃら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２１（１）：２５１～２５９（２０１３）、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ７５（８）：３７０６～３７１８（２００１）、Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ８１（２０）：１１２４６～１１２５５（２００７））、６）適切な抗体産生及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導すること、最後に７）患者の服薬遵守を向上させ、医療従事者の負担を軽減する、単回投与で防御免疫を生じること。
実施例９ 修飾デンドリマーナノ粒子送達レプリコンＲＮＡは、非小細胞肺癌の発生に対して予防的に接種される
このワクチン接種様式を予防癌ワクチンの製造に使用できることを示すために、推定ＮＳＣＬＣ関連癌胎児性抗原Ｈｍｇａ２を用いたレプリコンを合成した。
材料及び方法
Ｈｍｇａ２をコードするレプリコンを用いてナノ粒子ワクチンを製造し、Ｈｍｇａ２をコードするＭＤＮＰでマウスを免疫した。免疫処置から２週間後、Ｈｍｇａ２＋又はＨｍｇａ２－ＫＰ腫瘍細胞を気管内注入によってマウス肺に同所移植した。Ｎ＝５。
結果
Ｋｒａｓの潜在発癌性対立遺伝子を活性化し、腫瘍抑制因子ｐ５３を欠失させる、Ｃｒｅリコンビナーゼのウイルス投与を利用した、Ｋｒａｓ癌遺伝子及びｐ５３癌抑制遺伝子の肺特異的変異を含む肺腺癌の確立されたモデル（肺癌の「ＫＰ」モデル）を用いて、非小細胞肺癌の進行を調べることができる（ＤｕＰａｇｅら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．；４（７）：１０６４～１０７２（２００９））。適用例の中でも、ＫＰモデルは、肺腫瘍細胞における分化マーカーの漸進的な消失を経時的に追跡し、それに続いて、その発現がＨｍｇａ２などの胚形成に通常関連するタンパク質の上方制御を追跡するのに使用される。（Ｗｉｎｓｌｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ、４７３（７３４５）、１０１～１０４（２０１１））。
移植されたマウス腫瘍由来の細胞系を利用する予備研究においては、レシピエントマウスの予防的ワクチン接種は、大きい及び中間サイズの腫瘍の発生を抑制し、小さい腫瘍の数も明らかに減少させた。Ｈｍｇａ２＋ＫＰ腫瘍細胞によって誘導される腫瘍は、腫瘍の数及びサイズがＨｍｇａ２－腫瘍（図１６Ｂ）よりも減少し（図１６Ａ）、抗原特異的効果を示した。重要なことには、この防御作用は、移植細胞における抗原発現に依存し、特異性を示した。

Claims (14)

  1. 治療薬、予防薬及び／又は診断薬とを対象に送達するための修飾デンドリマーナノ粒子であって、
    １種以上の第１～７世代アルキル化デンドリマー、
    １種以上の両親媒性ポリマー、及び
    相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、複製ＲＮＡ（ｒｅｐＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ガイド鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、発現ベクター及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上の核酸を含む治療薬、予防薬及び／又は診断薬、
    を含み、前記ナノ粒子がコレステロールを含む場合、コレステロールは両親媒性ポリマーの一部としてのみ存在する、修飾デンドリマーナノ粒子。
  2. 前記１種以上のアルキル化デンドリマーが、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ポリプロピレンイミン）、ジアミノブタンアミンポリプロピレンイミンテトラミン及びポリ（アミドアミン）からなる群から選択され、
    任意選択的に、前記１種以上のアルキル化デンドリマーが、第１世代デンドリマー、第２世代デンドリマー及び第３世代デンドリマーからなる群から選択され、及び
    前記１種以上のアルキル化デンドリマーが、１～３０個の炭素（両端を含む）、好ましくは６～１６個の炭素（両端を含む）のサイズのエポキシド末端アルキル鎖を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
  3. 前記１種以上の両親媒性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド及びそれらのブロックコポリマーからなる群から選択される親水性成分を含み、
    好ましくは、前記１種以上の両親媒性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、好ましくは分子量１２０Ｄａ～２５，０００Ｄａ（両端を含む）、最も好ましくは２，０００Ｄａのポリエチレングリコールを含み、
    好ましくは、前記１種以上の両親媒性ポリマーが１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含み、及び
    前記１種以上の両親媒性ポリマーが、脂質及びリン脂質からなる群から選択される疎水性成分を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  4. 前記１種以上のアルキル化デンドリマーと前記両親媒性ポリマーの前記親水性成分の質量比が２０：１～５：１（両端を含む）、好ましくは１１．５：１である、請求項３に記載のナノ粒子。
  5. さらにタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子及びそれらの組合せからなる群から選択される治療薬、予防薬及び／又は診断薬を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  6. 前記１種以上の核酸が、１０～２０，０００塩基長（両端を含む）の、好ましくは、９，０００～１５，０００塩基長（両端を含む）の１個以上のリボ核酸配列を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
  7. 前記１種以上の核酸が、修飾アルファウイルスレプリコンＲＮＡを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  8. 前記１種以上の核酸が、感染病原体、若しくは寄生生物、又は癌などの異常増殖障害由来の１種以上の抗原を独立にコードし、
    好ましくは、前記感染病原体がウイルス及び細菌からなる群から選択される、請求項１１から７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  9. 前記１種以上の核酸が、１個以上の複製ＲＮＡ及び１個以上のメッセンジャーＲＮＡを含み、前記メッセンジャーＲＮＡが前記複製ＲＮＡの５’及び３’非翻訳領域を含むように修飾される、請求項１から８のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  10. 前記ナノ粒子のサイズが３０ｎｍ～４５０ｎｍ（両端を含む）、好ましくは６０ｎｍ～２５０ｎｍ（両端を含む）である、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  11. 前記１種以上のアルキル化デンドリマーと前記１種以上の核酸の質量比が１０：１～５：１（両端を含む）、好ましくは５：１である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  12. １種以上の治療薬、予防薬及び／又は診断薬を対象に送達することに使用するための請求項１～１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
  13. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むワクチンであって、
    前記１種以上の核酸が、抗原又はタンパク質抗原をコードするものであり、又は
    前記ナノ粒子が、さらに抗原を含むものであり、
    前記ナノ粒子が、対象の抗原提示細胞における抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効な量であり、
    好ましくは、１種以上の免疫調節剤を更に含み、
    前記免疫調節剤が、合成受容体リガンド、タンパク質、サイトカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子及びそれらの組合せからなる群から選択される、
    ワクチン。
  14. 前記タンパク質抗原が、腫瘍抗原、微生物抗原、アレルゲン及びそれらの組合せからなる群から選択され、
    前記腫瘍抗原が、癌遺伝子発現産物、選択的にスプライスされたタンパク質、変異遺伝子産物、過剰発現遺伝子産物、異常発現遺伝子産物、腫瘍ウイルスによって産生される抗原、癌胎児性抗原、改変細胞表面糖脂質を含むタンパク質、及びそれらの組合せからなる群から選択され、
    好ましくは、前記癌胎児性抗原がＨｍｇａ２タンパク質であり
    前記微生物抗原が、細菌、ウイルス、真菌、原生動物及びそれらの組合せからなる群から選択され、
    前記ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス及びそれらの組合せからなる群から選択されるウイルスに由来する、又は、前記原生動物抗原がトキソプラズマ ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）に由来する、請求項１３に記載のワクチン。
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