JP6988016B1

JP6988016B1 - グランザイムｂ抑制剤

Info

Publication number: JP6988016B1
Application number: JP2021072466A
Authority: JP
Inventors: 紘子山嵜; 美怜山野; 真穂横田; 大嗣亀井; 良樹伊藤
Original assignee: Sato Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sato Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-01-05
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: JP2022166987A; CN114617907B; CN114617907A

Abstract

【課題】効果の高いグランザイムＢ抑制剤を提供する。【解決手段】ゲンノショウコエキスを有効成分として含有する。【選択図】なし

Description

本発明は、ゲンノショウコエキスを有効成分として含むグランザイムＢ抑制剤に関する。

グランザイムＢ阻害剤は、免疫誘導効果、自己免疫性・慢性の炎症性疾患への効果が示唆されている（特許文献１〜２）。また、皮膚への適用においては、火傷、創傷治癒の促進効果、皮膚老化に対する外観改善効果が示されている（特許文献３〜５）。
グランザイムＢ活性阻害剤として、既知の低分子ペプチド等が知られている（特許文献１〜３、非特許文献１〜２）。しかし、原料の入手が容易で安価な天然由来物質のグランザイムＢ活性抑制剤に関する報告はない。
また、グランザイムＢは、分化誘導性のサイトカインにより発現誘導され、アポトーシスに関与する（非特許文献３）。皮膚においては通常状態における発現量は低く、自己免疫性・慢性炎症性皮膚状態で発現量が増加すること、紫外線照射によっても発現誘導される（非特許文献４〜６）。しかしながら、グランザイムＢ発現を抑制する素材に関する報告は皆無である。

国際公開第２００３／０６５９８７号米国特許出願公開第２００３／０１４８５１１号明細書国際公開第２０１７／１３２７７１号特許第６１３４２６８号公報特許第５７４６８１３号公報

Bird et. al., Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 6387-6398 Kam et. al., Biochim. Biophys. Acta., 2000, 1477(1-2), 307-23 Tamang et. al., Cytokine, 2006 November, 36(3-4), 148-159 Turner et.al., J. Invest. Dermatol., 2021, Jan, 141(1), 36-47 Hiebert et.al., Exp. Gerontol., 2011 Jun, 46(6),489-99 Parkinson et.al., Aging Cell, 2015 Feb, 14(1), 67-77

グランザイムＢの発現上昇を抑え、かつグランザイムＢ活性阻害作用も有する素材は、グランザイムＢに起因する皮膚への増悪作用を効率よく抑制することが示唆される。
したがって、グランザイムＢ発現抑制作用及び活性阻害作用の両作用を有する天然由来物質は、より応用範囲が広いグランザイムＢ作用の抑制剤としての利用が期待される。

本発明者は、広範囲の植物エキスのうち、ゲンノショウコエキスがグランザイムＢ発現抑制作用及び活性阻害作用の両作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明者はさらに、複数の植物エキス添加によりグランザイムＢ活性阻害作用が増強することを示した。すなわち、本発明は下記の〔１〕〜〔２３〕に関するものである。
〔１〕ゲンノショウコエキスを有効成分として含有する、グランザイムＢ抑制剤。
〔２〕ゲンノショウコエキスを１〜１００μｇ／ｍＬ含有する、前記〔１〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔３〕ゲンノショウコエキスを１．８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、前記〔２〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔４〕ゲンノショウコエキスを１８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、前記〔３〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔５〕グランザイムＢ抑制作用を有する１種以上の植物エキスをさらに含有する、前記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔６〕前記植物エキス及び前記ゲンノショウコエキスを１：１〜１：４の質量比で含有する、前記〔５〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔７〕前記植物エキスが、ザクロ果皮エキス、イエローヒマラヤンラズベリー根エキス、ユーカリエキス、ワレモコウエキス、イロハモミジ葉エキス、シモツケソウエキス、ハマメリスエキス、バラエキス、アボガドエキス、テンチャエキス、メマツヨイグサ抽出液、ウーロン茶エキス、カシア樹皮エキス、ユキノシタエキス、メリッサエキス、トルメンチラエキス、ダマスクバラ花エキス、ヨモギエキス、ヒキオコシエキス、コンフリーエキス、オトギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、ブドウ葉エキス、シナノキエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、海藻エキス、シャクヤクエキス、ドクダミエキス、サンザシエキス、シソエキス、ラベンダーエキス、ノバラエキス、アセンヤクエキス、サガラメエキス、ボタンエキス、アスパラサスリネアリスエキス、カンゾウ抽出末及びクララエキスからなる群から選択される、前記〔５〕又は〔６〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔８〕前記植物エキスの少なくとも１種が、オトギリソウエキス及びテンチャエキスからなる群から選択される、前記〔７〕に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔９〕グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制である、前記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔１０〕グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢの活性阻害である、前記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔１１〕グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制及びグランザイムＢの活性阻害である、前記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
〔１２〕前記〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤のみからなる、化粧料組成物。
〔１３〕ゲンノショウコエキスを有効成分として含有する、コラーゲン分解抑制剤。
〔１４〕ゲンノショウコエキスを１〜１００μｇ／ｍＬ含有する、前記〔１３〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔１５〕ゲンノショウコエキスを１．８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、前記〔１４〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔１６〕ゲンノショウコエキスを１８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、前記〔１５〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔１７〕コラーゲン分解抑制作用を有する１種以上の植物エキスをさらに含有する、前記〔１３〕から〔１６〕のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔１８〕前記植物エキス及び前記ゲンノショウコエキスを１：１〜１：４の質量比で含有する、前記〔１７〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔１９〕前記植物エキスが、ザクロ果皮エキス、イエローヒマラヤンラズベリー根エキス、ユーカリエキス、ワレモコウエキス、イロハモミジ葉エキス、シモツケソウエキス、ハマメリスエキス、バラエキス、アボガドエキス、テンチャエキス、メマツヨイグサ抽出液、ウーロン茶エキス、カシア樹皮エキス、ユキノシタエキス、メリッサエキス、トルメンチラエキス、ダマスクバラ花エキス、ヨモギエキス、ヒキオコシエキス、コンフリーエキス、オトギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、ブドウ葉エキス、シナノキエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、海藻エキス、シャクヤクエキス、ドクダミエキス、サンザシエキス、シソエキス、ラベンダーエキス、ノバラエキス、アセンヤクエキス、サガラメエキス、ボタンエキス、アスパラサスリネアリスエキス、カンゾウ抽出末及びクララエキスからなる群から選択される、前記〔１７〕又は〔１８〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔２０〕前記植物エキスの少なくとも１種が、オトギリソウエキス及びテンチャエキスからなる群から選択される、前記〔１９〕に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔２１〕コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制である、前記〔１３〕から〔２０〕のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔２２〕コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢの活性阻害である、前記〔１３〕から〔２０〕のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
〔２３〕コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制及びグランザイムＢの活性阻害である、前記〔１３〕から〔２０〕のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。

後述の実施例で示されるように、本発明に従うゲンノショウコエキスはグランザイムＢ発現抑制作用及び活性阻害作用を有するので、グランザイムＢ抑制剤として有用である。

図１は、ゲンノショウコエキスのグランザイムＢ遺伝子の発現抑制作用を示す実験結果である。図２Ａは、ゲンノショウコエキスのグランザイムＢの活性阻害作用を示す実験結果である。図２Ｂは、ゲンノショウコエキスのグランザイムＢの活性阻害作用を示す実験結果である。図３は、グランザイムＢの活性阻害作用を有する植物エキスを示す。図４Ａは、オトギリソウエキスのグランザイムＢの活性阻害作用を示した図である。図４Ｂは、テンチャエキスのグランザイムＢの活性阻害作用を示した図である。図５Ａは、ゲンノショウコエキスとオトギリソウエキスの、グランザイムＢ抑制によるデコリン分解抑制の相乗効果を示した図である。図５Ｂは、ゲンノショウコエキスとオトギリソウエキスの、グランザイムＢ抑制によるデコリン分解抑制の相乗効果を示した図である。図６Ａは、ゲンノショウコエキスとテンチャエキスの、グランザイムＢ抑制によるデコリン分解抑制の相乗効果を示した図である。図６Ｂは、ゲンノショウコエキスとテンチャエキスの、グランザイムＢ抑制によるデコリン分解抑制の相乗効果を示した図である。

以下、本発明の実施の形態を具体的に説明する。なお、以下で例示する好ましい態様やより好ましい態様等は、「好ましい」や「より好ましい」等の表現にかかわらず適宜相互に組み合わせて使用することができる。また、数値範囲の記載は例示であって、各範囲の上限と下限並びに実施例の数値とを適宜組み合わせた範囲も好ましく使用することができる。さらに、「含有する」又は「含む」等の用語は、「本質的になる」や「のみからなる」と読み替えてもよい。

〔グランザイムＢ抑制剤〕
以下、本発明のグランザイムＢ抑制剤について詳細に説明する。
グランザイムＢは、細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞内の細胞質顆粒によって放出されるセリンプロテアーゼであり、様々な細胞外基質を分解し皮膚障害に関与する（Turner et.al., Matrix Biol. (2019) 75-76, 126-140）。なかでも、グランザイムＢがＩ型コラーゲンを保護するデコリンを分解することで、ＭＭＰ−１（matrix metalloproteinase-1）によるＩ型コラーゲン分解が促進されることが知られている（Parkinson et.al., Aging Cell. 2015 Feb; 14(1): 67-77）。グランザイムＢは、通常状態における発現量は低く、皮膚への紫外線照射などに起因して発現誘導される（Hernandez-Pigeon et. al., J Biol Chem. 2006 May 12; 281 (19): 13525-32）。

本発明のグランザイムＢ抑制剤（以下、「抑制剤」と略記する）によるグランザイムＢ抑制の態様としては、グランザイムＢの活性阻害及びグランザイムＢ遺伝子の発現抑制が挙げられる。
グランザイムＢの活性阻害により、コラーゲンが保護される。例えば、理論に縛られないが、グランザイムＢの活性を阻害するとデコリンの分解が抑制され、結果としてＭＭＰ−１によるＩ型コラーゲン分解が抑制される。
グランザイムＢ遺伝子の発現抑制によっても、コラーゲンが保護される。理論に縛られないが、グランザイムＢの発現上昇を抑えることで、より効果的にグランザイムＢの活性を抑制可能である。
しかしながら、本発明の抑制剤によるグランザイムＢの活性阻害及びグランザイムＢ遺伝子の発現抑制、及びそれらによって得られるコラーゲン保護は、必ずしも上記したデコリン分解抑制に関わるものに限定されないことは明らかである。
グランザイムＢは、デコリンの他、様々な細胞外マトリックスを分解することが知られている（Russo et.al., Sci Rep., 2018 Jun 26. 8(1),9690、Turner et.al., Matrix Biol. 2019 Jan, 75-76, 126-140、Pardo et.al., Cell Death Differ., 2007 Oct, 14(10), 1768-79）。例えば、デコリン以外のグランザイムＢの基質として、collagen VII、collagen XVII、α6/β4 integrin、fibronectin、vitronectin、laminin、biglycan、plasminogen、VE-cadherin、ZO-1 及び von Willebrand factor が挙げられる。

＜ゲンノショウコエキス＞
本発明の抑制剤は、ゲンノショウコエキスを有効成分として含有する。
ゲンノショウコエキスは、ゲンノショウコ（ＧｅｒａｎｉｕｍｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉＳｉｅｂｏｌｄｅｔＺｕｃｃａｒｉｎｉ（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ））から抽出されるエキスである。ゲンノショウコは、フクロソウ科フクロソウ属の多年生植物であり、ミコシグサ、イシャイラズなどとも呼ばれ、整腸作用を有する生薬原料として用いられる。ゲンノショウコエキスは公知物質であり、市場で容易に入手可能であるか、又は調整可能である。ゲンノショウコエキスの調整には当技術分野で周知の方法を使用できるが、例えばゲンノショウコの地上部から、エタノール溶液又は１，３−ブチレングリコール溶液で抽出することで、医薬部外品原料規格２００６に記載のゲンノショウコエキスの規格を満たすものを得ることができる。

本発明の抑制剤は、ゲンノショウコエキスを、グランザイムＢ抑制剤の全体積に対して、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ含有する。本発明の抑制剤は、ゲンノショウコエキスを、グランザイムＢ抑制剤の全体積に対して、好ましくは１．８μｇ／ｍＬ以上含有し、さらに好ましくは５．５μｇ／ｍＬ以上含有し、特に好ましくは１８μｇ／ｍＬ以上含有する。含有量の上限は特に限定されないが、例えば８０μｇ／ｍＬ以下、９０μｇ／ｍＬ以下、９５μｇ／ｍＬ以下で含有する。ゲンノショウコエキスは特異なにおいを有するため、グランザイムＢ抑制剤としての効果を発揮しつつ、ゲンノショウコエキスのにおいを抑えることが可能な含有量としては、例えば１８〜５５μｇ／ｍＬが望ましい。

＜追加の植物エキス＞
本発明の抑制剤は、ゲンノショウコエキスに加え、有効成分としてグランザイムＢ抑制作用を有する１種以上の植物エキス（以下、「追加の植物エキス」と記載する）をさらに含有していてもよい。
グランザイムＢ抑制作用を有する追加の植物エキスとしては、限定されるものではないが、例えば実施例の〔蛍光基質を用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系〕に従い、グランザイムＢ阻害活性（IC₅₀値<３μｇ／ｍＬ）を示すものを選択することができる。

追加の植物エキスの例としては、ザクロ果皮エキス、イエローヒマラヤンラズベリー根エキス、ユーカリエキス、ワレモコウエキス、イロハモミジ葉エキス、シモツケソウエキス、ハマメリスエキス、バラエキス、アボガドエキス、テンチャエキス、メマツヨイグサ抽出液、ウーロン茶エキス、カシア樹皮エキス、ユキノシタエキス、メリッサエキス、トルメンチラエキス、ダマスクバラ花エキス、ヨモギエキス、ヒキオコシエキス、コンフリーエキス、オトギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、ブドウ葉エキス、シナノキエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、海藻エキス、シャクヤクエキス、ドクダミエキス、サンザシエキス、シソエキス、ラベンダーエキス、ノバラエキス、アセンヤクエキス、サガラメエキス、ボタンエキス、アスパラサスリネアリスエキス、カンゾウ抽出末及びクララエキスからなる群から選択されるものが挙げられる。これらのエキスは、単独又は組み合わせのいずれであっても、追加の植物エキスとして用いることができる。

追加の植物エキスは、単独でもグランザイムＢの抑制作用を有するが、ゲンノショウコエキスと組み合わせると相乗的なグランザイムＢ抑制作用を発揮するものが好ましい。ゲンノショウコエキスとの相乗効果を発揮する追加の植物エキスとしては、オトギリソウセキス及び／又はテンチャエキスが挙げられる。

＜オトギリソウエキス＞
オトギリソウエキスは、セイヨウオトギリソウ（ＨｙｐｅｒｉｃｕｍｐｅｒｆｏｒａｔｕｍＬｉｎｎｅ）又はオトギリソウ（ＨｙｐｅｒｉｃｕｍｅｒｅｃｔｕｍＴｈｕｎｂｅｒｇ（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ））から抽出されるエキスである。セイヨウオトギリソウ及びオトギリソウは、オトギリソウ科オトギリソウ属の多年生植物である。オトギリソウエキスは公知物質であり、市場で容易に入手可能であるか、又は調製可能である。オトギリソウエキスの調整には当技術分野で周知の方法を使用できるが、例えばセイヨウオトギリソウ又はオトギリソウの地上部から、水、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジエチレングリコール、又はこれらの混液により抽出することで、医薬部外品原料規格２００６に記載のオトギリソウエキスの規格を満たすものを得ることができる。

＜テンチャエキス＞
テンチャエキスは、テンヨウケンコウシ（ＲｕｂｕｓｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓＳｈｕｇａｎＬｅｅ．（Ｒｏｓａｃｅａｅ））から抽出されるエキスである。テンヨウケンコウシは、バラ科キイチゴ属の耐寒性落葉低木である。テンチャエキスは公知物質であり、市場で容易に入手可能であるか、又は調製可能である。テンチャエキスの調整には当技術分野で周知の方法を使用できるが、例えばテンヨウケンコウシの葉を熱湯に浸漬した後、葉を乾燥し、さらに加熱したものを熱湯にて抽出することで医薬部外品原料規格２００６に記載のテンチャエキスの規格を満たすものを得ることができる。また、抽出溶媒としては１，３−ブチレングリコールを用いることもできる。

オトギリソウエキス及びテンチャエキスのほか、追加の植物エキスの各々は公知物質であり、市場で容易に入手可能であるか、又は当技術分野で周知の方法を使用して調製可能である。

本発明の抑制剤に配合される追加の植物エキスの量は特に限定されないが、例えば追加の植物エキスとゲンノショウコエキスの質量比を１：１〜１：４で配合した場合に、特に高い効率でグランザイムＢを抑制することができる。追加の植物エキスとゲンノショウコエキスの質量比は、例えば１：１．５であり、好ましくは１：２であり、さらに好ましくは１：３であり、特に好ましくは１：４である。
オトギリソウエキスが追加の植物エキスとして配合される場合、オトギリソウエキスとゲンノショウコエキスの質量比は、好ましくは１：１〜１：４であり、当該濃度比で高い相乗効果が得られる。
テンチャエキスが追加の植物エキスとして配合される場合、テンチャエキスとゲンノショウコエキスの質量比は、好ましくは１：１〜１：４であり、当該濃度比で高い相乗効果が得られる。

本発明の抑制剤は、追加の植物エキスを、抑制剤の全体積に対して例えば１〜１００μｇ／ｍＬ含有する。
追加の植物エキスとしてオトギリソウエキスを含有する場合、オトギリソウエキスを、抑制剤の全体積に対して、好ましくは１．５μｇ／ｍＬ以上含有し、さらに好ましくは４．６μｇ／ｍＬ以上含有し、特に好ましくは１５μｇ／ｍＬ以上含有する。含有量の上限は特に限定されないが、例えば８０μｇ／ｍＬ以下、９０μｇ／ｍＬ以下、９５μｇ／ｍＬ以下で含有する。当該濃度範囲で配合されると、抑制剤のより高いグランザイムＢ活性阻害作用が発揮される。
追加の植物エキスとしてテンチャエキスを含有する場合、テンチャエキスを、抑制剤の全体積に対して、好ましくは３．１μｇ／ｍＬ以上含有し、さらに好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上含有し、特に好ましくは３１μｇ／ｍＬ以上含有する。含有量の上限は特に限定されないが、例えば８０μｇ／ｍＬ以下、９０μｇ／ｍＬ以下、９５μｇ／ｍＬ以下で含有する。当該濃度範囲で配合されると、抑制剤のより高いグランザイムＢ活性阻害作用が発揮される。

＜任意成分＞
本発明の抑制剤には、ゲンノショウコエキス及び追加の植物エキスに加え、本発明の効果を損なわない範囲で、１種以上の成分を任意に配合できる。また、任意成分は、後述する化粧料組成物に適用可能な成分であってもよい。任意成分としては、以下に示すものが挙げられる。

〔基剤成分〕
水（例えば、精製水）、低級アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール）、油脂、界面活性剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、増粘剤、色素等

〔その他〕
乳化剤、香料、防腐剤等

〔保湿成分〕
トコフェロール、ヒアルロン酸Ｎａ、ミツバアケビ茎エキス、加水分解エラスチン、加水分解コラーゲン、アカヤジオウ根エキス、アセチルヒアルロン酸Ｎａ、アルニカ花エキス、アロエベラ葉エキス、オウゴンエキス、オーキッドエキス、オタネニンジン根エキス、カミツレ花エキス、キュウリ果実エキス、クズ根エキス、クロレラエキス、セイヨウキズタ葉／茎エキス、セイヨウシロヤナギ樹皮エキス、セイヨウニワトコ花エキス、ゼニアオイエキス、センブリエキス、ダイズエキス、トウキンセンカ花エキス、トリスヘキシルデカン酸ピリドキシン、パリエタリアエキス、パルミチン酸レチノール、フユボダイジュ花エキス、マクロプチリウムアトロプルプレウム花／葉／茎エキス、ヤグルマギク花エキス、ローマカミツレ花エキス、ローヤルゼリーエキス、加水分解ハトムギ種子、オウレン根茎エキス、カワラヨモギ花エキス、キハダ樹皮エキス、クチナシ果実エキス、グリチルリチン酸２Ｋ、ゲンチアナ根茎／根エキス、センキュウ根茎エキス、トウキ根エキス、ドクダミエキス、ナツメ果実エキス、ハトムギ種子エキス、ベタイン、ホホバエステル、加水分解ヒアルロン酸、水添レチノール、水溶性プロテオグリカン

＜剤型＞
本発明の抑制剤の剤型は、特に限定されない。例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、ゲル、及びエアゾール等が挙げられる。本発明の抑制剤は、上記した任意成分を適宜組み合わせて配合することにより、所望の剤型とすることができる。

＜製造方法＞
本発明の抑制剤は、当技術分野で通常用いられる製法に従い製造することができる。製法としては、例えばスキンケア製品（皮膚用化粧料）の一般的な製法を挙げることができるが、これに限定されない。例えば、有効成分を基材成分へ添加し、混合することで製造できる。

＜使用方法＞
本発明の抑制剤は、塗布などにより対象に適用することができる。本発明の抑制剤の適用対象は、概して哺乳類であり、特にヒトが想定される。

〔コラーゲン分解抑制剤〕
ゲンノショウコエキスは、上述したようにグランザイムＢ活性阻害作用及びグランザイムＢ遺伝子発現抑制作用により、コラーゲン分解を抑制する。したがって、本発明のグランザイムＢ抑制剤は、コラーゲン分解抑制剤としても把握できる。
本発明のコラーゲン分解抑制剤によるコラーゲン分解抑制の態様としては、グランザイムＢの活性阻害及びグランザイムＢ遺伝子の発現抑制が挙げられる。
本発明のコラーゲン分解抑制剤の有効成分、任意成分、剤型、製造方法、及び使用方法は、グランザイムＢ抑制剤について述べた説明が適用される。

〔化粧料組成物〕
本発明の化粧料組成物は、グランザイムＢ抑制剤のみからなる。本発明の化粧料組成物の使用形態は、特に限定されない。例えば、化粧水、クリーム、乳液、エッセンス、ゼリー、ジェル、軟膏、ファンデーション、及びパック等が挙げられる。
本発明の化粧料組成物は、コラーゲンの維持を必要とする対象の皮膚に、塗布などにより適用することができる。本発明のグランザイムＢ抑制剤の適用対象は、概して哺乳類であり、特にヒトが想定される。
本発明の化粧料組成物の有効成分、任意成分、剤型、及び製造方法は、グランザイムＢ抑制剤について述べた説明が適用される。

〔医薬組成物〕
本発明のグランザイムＢ抑制剤は、医薬用途にも利用可能である。対象となる疾患には創傷、火傷、自己免疫性皮膚炎、慢性創傷、ケロイド、肥厚性瘢痕、円板状エリテマトーデス、円形脱毛症、強皮症、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症などが挙げられ、本発明のグランザイムＢ抑制剤からなる医薬組成物を、塗布などにより対象に投与することで当該疾患の症状を改善することができる。医薬組成物の適用対象は概して哺乳類であり、特にヒトが想定される。
医薬組成物の有効成分、任意成分、剤型、及び製造方法は、グランザイムＢ抑制剤について述べた説明が適用される。

次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

〔植物エキスの調整〕
下記のように、各植物エキスを調整した。
ゲンノショウコエキスを、医薬部外品原料規格２００６に記載される方法により調製し、以下の実験に用いた。なお、抽出にはゲンノショウコの地上部（花、葉、及び茎）を用い、抽出溶媒としては１，３−ブチレングリコール溶液を使用した。
オトギリソウエキスを、医薬部外品原料規格２００６に記載される方法により調製し、以下の実験に用いた。なお、抽出にはセイヨウオトギリソウの地上部（花、葉、及び茎）を用い、抽出溶媒としては１，３−ブチレングリコール溶液を使用した。
テンチャエキスを、医薬部外品原料規格２００６に記載される方法により調製し、以下の実験に用いた。なお、抽出にはテンチャの葉を用い、抽出溶媒としては熱湯を使用した。

〔ヒト表皮角化細胞を使用したアッセイ系〕
下記の手順に従い、ヒト表皮角化細胞を培養し、ヒト表皮単層モデルを作成した。
ヒト表皮角化細胞を、37℃、5% CO₂ インキュベーター内、75 cm²フラスコ中で、10% FBS, 1% PS mix含有D-MEM (High Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red（富士フイルム和光純薬社製）、以下D-MEM培地を用いて70〜90%コンフルエントまで培養した。Accutase Solution（Sigma-Aldrich社製）を用いて細胞を剥離し、24 well clear plate（Corning社製）に1.5 x 104 cells/cm²となるように細胞を播種した。D-MEM培地を用いて37℃、5% CO₂インキュベーター内で３日間培養した細胞をヒト表皮単層モデルとし、アッセイに使用した。

〔グランザイムＢ遺伝子の発現抑制効果の評価系〕
通常状態の皮膚ではグランザイムＢ遺伝子の発現量は低く、紫外線（UV-B）照射によって発現誘導されることが知られている。そこで、UV-B 照射したヒト表皮単層モデルにゲンノショウコエキスを添加し、UV-B 照射によるグランザイムＢ遺伝子発現誘導の抑制効果を評価した。
ヒト表皮単層モデルにUV-B（波長：302 nm, 積算照射量：10 mJ/cm²）照射後、D-MEM中に溶解させたゲンノショウコエキスを添加し、16時間培養後の試験細胞から遺伝子を抽出し、Real-time PCR法にてmRNA量を測定した。グランザイムＢ遺伝子発現量は、GAPDHを内標準物質としたΔΔCt法を用いて算出した。
ゲンノショウコエキスによるグランザイムＢ遺伝子の発現抑制効果は、UV-B非照射群を対照とした% of control値を算出し、UV-B 照射したゲンノショウコエキス非処置群と処置群を有意差検定（Dunnett's Multiple Comparison Test）にて比較することで評価した。

〔ゲンノショウコエキスによるグランザイムＢ遺伝子発現抑制効果〕
ゲンノショウコエキスによるグランザイムＢ遺伝子発現抑制効果を、図１に示す。
図１に示されるように、ゲンノショウコエキスがUV-B 刺激誘導性のグランザイムＢ遺伝子発現上昇を抑制した。

〔デコリンを用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系〕
グランザイムＢは、様々な細胞外基質を分解し皮膚障害に関与する。なかでも、グランザイムＢがデコリンを分解することで、MMP-1によるＩ型コラーゲン分解が促進されることが知られている。そこで、デコリンに植物エキス及びグランザイムＢを添加し、植物エキスによるグランザイムＢ活性阻害効果を評価した。
グランザイムＢリコンビナント（終濃度 100 ng/μL、R&D systems社製）、カテプシンＣリコンビナント（終濃度 10 ng/μL、R&D systems社製）、CHAPS（終濃度0.01%）、DTT（終濃度5 mM）、NaCl（終濃度50 mM）、MES（終濃度50 mM, pH 5.5）を混合し、37℃で16時間反応させ、グランザイムＢを活性化した。デコリンリコンビナント（終濃度 10 ng/μL、Abcam社製）、植物エキス、活性化したグランザイムＢ（終濃度 2.5 ng/μL）及びTris-HCl（終濃度 50 mM, pH 7.5)を混合し、37℃、20〜22時間反応させた。反応後の溶液をSDS-PAGEにてタンパク分離した後、銀染色試薬（コスモバイオ社製）でタンパク質を検出し、デコリン分解物断片のタンパク量を定量化した。
グランザイムＢ活性阻害効果は、植物エキス非処置群を対照とした% of control値を算出し、植物エキス非処置群と処置群を有意差検定（Dunnett's Multiple Comparison Test）にて比較することで評価した。

〔ゲンノショウコエキスによるグランザイムＢ活性阻害効果〕
上記デコリンを用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系において、植物エキスとしてゲンノショウコエキスを処置し、グランザイムＢ活性阻害を評価した。評価結果を図２に示す。
図２に示されるように、ゲンノショウコエキスがグランザイムＢの活性を阻害することで、デコリンの分解を抑制した。

〔蛍光基質を用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系〕
蛍光基質としてN-Acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-7-amido-4-methylcoumarin（Ac-IEPD-AMC, Sigma-Aldrich）を使用して、図３に示す植物エキスのほか、数多くの植物エキスに関してグランザイムＢ活性阻害効果を評価した。
グランザイムＢリコンビナントは、デコリンを用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系と同じ手順で活性化した。Ac-IEPD-AMC（終濃度50μM）、植物エキス、活性化したグランザイムB（終濃度 0.3 ng/μL）、CHAPS（終濃度0.01%）及びHEPES（終濃度50 mM, pH 7.5)を、384 well black plate（Corning社製）に添加し、30℃、60分間反応させた。溶液添加直後（R1）と反応後（R2）に蛍光強度（ex/em = 380/460 nm）を測定した。
グランザイムＢ活性は、下記計算式を用いて算出した。
% of control (%) = 植物エキス処置群の蛍光値 (R2-R1) / 植物エキス非処置群の蛍光値 (R2-R1) x 100
グランザイムB活性阻害効果は、% of control 値から50% 阻害濃度（IC₅₀値）を算出することで評価した。

〔各種植物エキスによるグランザイムＢ活性阻害効果〕
上記蛍光基質を用いたグランザイムＢ活性阻害効果の評価系において、グランザイムＢ阻害活性（IC₅₀値<３μｇ／ｍＬ）を示した植物エキスを、図３に示す。
図３に示すように、ゲンノショウコエキス以外の複数の植物エキスが、グランザイムＢの活性を阻害した。

〔オトギリソウエキス及びテンチャエキスによるグランザイムＢ活性阻害効果〕
上記デコリンを用いたグランザイムＢの活性阻害効果の評価系において、オトギリソウエキス及びテンチャエキスを植物エキスとしてそれぞれ処置し、グランザイムＢ活性阻害を評価した。評価結果を図４に示す。
図４に示されるように、オトギリソウエキス及びテンチャエキスもまた、ゲンノショウコエキスと同様に、グランザイムＢの活性を阻害することでデコリンの分解を抑制した。

〔グランザイムＢ阻害によるデコリン分解抑制の相乗効果の評価系〕
試験は、デコリンを用いたグランザイムＢの活性阻害効果の評価系と同じ手順で実施した。
グランザイムＢ阻害によるデコリン分解抑制効果は、植物エキス非処置群を対照とした% of control値を算出し、各群を有意差検定（Tukey's Multiple Comparison Test）にて比較することで評価した。
相乗効果は、デコリン分解抑制率（100 - % of control 値 (%)）を算出し、植物エキス同時処置したデコリン分解抑制率の実測値から、植物エキス単独処置した各々のデコリン分解抑制率を足し合わせた理論値の比率を算出し評価した。
例：
相乗効果 = 植物エキスAとBを同時処置した際のデコリン分解抑制率（実測値）
／［植物エキスAを単独処置した際のデコリン分解抑制率 + 植物エキスBを単独処置した際のデコリン分解抑制率］（理論値）

〔ゲンノショウコエキスとオトギリソウエキスのデコリン分解抑制における相乗効果〕
ゲンノショウコエキスとオトギリソウエキスによる、デコリン分解抑制の相乗効果の評価結果を図５に示す。
図５に示すように、オトギリソウエキスとゲンノショウコエキスの同時処置は、単独のデコリン分解抑制効果を足した理論値と比較して、デコリン分解抑制効果を増強させた。また、オトギリソウエキスとゲンノショウコエキスの添加量の比が１：４のときに、より高い相乗効果が得られた。

〔ゲンノショウコエキスとテンチャエキスのデコリン分解抑制における相乗効果〕
ゲンノショウコエキスとテンチャエキスによる、デコリン分解抑制の相乗効果の評価結果を図６に示す。
図６に示すように、テンチャエキスとゲンノショウコエキスの同時処置は、単独のデコリン分解抑制効果を足した理論値と比較して、デコリン分解抑制効果を増強させた。また、テンチャエキスとゲンノショウコエキスの添加量の比が１：４のときに、より高い相乗効果が得られた。

本発明は化粧料組成物、医薬組成物等に利用可能である。

Claims

ゲンノショウコエキスを有効成分として含有する、グランザイムＢ抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１〜１００μｇ／ｍＬ含有する、請求項１に記載のグランザイムＢ抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１．８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、請求項２に記載のグランザイムＢ抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、請求項３に記載のグランザイムＢ抑制剤。
グランザイムＢ抑制作用を有する１種以上の植物エキスをさらに含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
前記植物エキス及び前記ゲンノショウコエキスを１：１〜１：４の質量比で含有する、請求項５に記載のグランザイムＢ抑制剤。
前記植物エキスが、ザクロ果皮エキス、イエローヒマラヤンラズベリー根エキス、ユーカリエキス、ワレモコウエキス、イロハモミジ葉エキス、シモツケソウエキス、ハマメリスエキス、バラエキス、アボガドエキス、テンチャエキス、メマツヨイグサ抽出液、ウーロン茶エキス、カシア樹皮エキス、ユキノシタエキス、メリッサエキス、トルメンチラエキス、ダマスクバラ花エキス、ヨモギエキス、ヒキオコシエキス、コンフリーエキス、オトギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、ブドウ葉エキス、シナノキエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、海藻エキス、シャクヤクエキス、ドクダミエキス、サンザシエキス、シソエキス、ラベンダーエキス、ノバラエキス、アセンヤクエキス、サガラメエキス、ボタンエキス、アスパラサスリネアリスエキス、カンゾウ抽出末及びクララエキスからなる群から選択される、請求項５又は６に記載のグランザイムＢ抑制剤。
前記植物エキスの少なくとも１種が、オトギリソウエキス及びテンチャエキスからなる群から選択される、請求項７に記載のグランザイムＢ抑制剤。
グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制である、請求項１から８のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢの活性阻害である、請求項１から８のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
グランザイムＢ抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制及びグランザイムＢの活性阻害である、請求項１から８のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤。
請求項１から１１のいずれか一項に記載のグランザイムＢ抑制剤のみからなる、化粧料組成物。
ゲンノショウコエキス及びオトギリソウエキスを有効成分として含有する、コラーゲン分解抑制剤。
前記オトギリソウエキス及び前記ゲンノショウコエキスを１：１〜１：４の質量比で含有する、請求項１３に記載のコラーゲン分解抑制剤。
ゲンノショウコエキス及びテンチャエキスを有効成分として含有する、コラーゲン分解抑制剤。
前記テンチャエキス及び前記ゲンノショウコエキスを１：１〜１：４の質量比で含有する、請求項１５に記載のコラーゲン分解抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１〜１００μｇ／ｍＬ含有する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１．８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、請求項１７に記載のコラーゲン分解抑制剤。
ゲンノショウコエキスを１８〜５５μｇ／ｍＬ含有する、請求項１８に記載のコラーゲン分解抑制剤。
コラーゲン分解抑制作用を有する１種以上の植物エキスをさらに含有する、請求項１３から１９のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
前記植物エキスが、ザクロ果皮エキス、イエローヒマラヤンラズベリー根エキス、ユーカリエキス、ワレモコウエキス、イロハモミジ葉エキス、シモツケソウエキス、ハマメリスエキス、バラエキス、アボガドエキス、メマツヨイグサ抽出液、ウーロン茶エキス、カシア樹皮エキス、ユキノシタエキス、メリッサエキス、トルメンチラエキス、ダマスクバラ花エキス、ヨモギエキス、ヒキオコシエキス、コンフリーエキス、セイヨウハッカエキス、ブドウ葉エキス、シナノキエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、海藻エキス、シャクヤクエキス、ドクダミエキス、サンザシエキス、シソエキス、ラベンダーエキス、ノバラエキス、アセンヤクエキス、サガラメエキス、ボタンエキス、アスパラサスリネアリスエキス、カンゾウ抽出末及びクララエキスからなる群から選択される、請求項２０に記載のコラーゲン分解抑制剤。
コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢの活性阻害である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。
コラーゲン分解抑制が、グランザイムＢ遺伝子の発現抑制及びグランザイムＢの活性阻害である、請求項１３から２１のいずれか一項に記載のコラーゲン分解抑制剤。