JP6890389B2

JP6890389B2 - 送液装置、及びそれを用いた細胞培養装置

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Publication number: JP6890389B2
Application number: JP2016166681A
Authority: JP
Inventors: 政晴木山; 広斌周; 鈴木　大介; 大介鈴木; 美登里加藤; 洸斉藤
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2021-06-18
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Description

本発明は細胞を培養する細胞培養装置及び方法に係り、特にその送液技術に関するものである。

自分の細胞もしくは他人の細胞を用いて疾病の治療を行う再生医療では、生体から採取した細胞を培養して細胞数を増やす、あるいはしかるべき形に組織を構築させて移植治療に用いられる。治療に用いる細胞の培養は、細胞プロセシングセンタ（ＣｅｌｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＣｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行わなければならない。ここでの課題は、細胞培養は技術者の手作業によって行われるため、労力とコストが非常にかかるという点と、手動で実施することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。

このような手作業の課題を解決する手段として、閉鎖系で細胞培養工程を自動化する装置が開発されてきた。培養容器の蓋を開閉する操作が不要な閉鎖系培養容器を用いることで、細胞培養工程の自動化と生物学的汚染リスクの低減が達成されるものである。自動培養装置では、分注器を機械化し手操作と同様の分取と移送の動作を連動して液体添加を行う方法があるが、装置全体を無菌環境に設置する必要から装置は大型化する。一方で、分注操作にポンプを使用した場合、液体ボトルから培養皿までの空間を使い捨てのチューブで接続し、ポンプによる定量と送液を同時に行う方法がある。この場合液体が送液されるチューブ内部を無菌状態に維持できればよく、自動化装置は小型化できる。自動培養装置において機械化分注器を使用したものには、以下の特許文献１に開示されており、ポンプ送液を使用したものには特許文献２に開示されている。

特開２００６−１４９２６８号公報特開２００７−２２２１２０号公報

特許文献２をはじめとして、一般には分注にポンプを使用した場合、送液元となる液体培地や、細胞または生体試料を懸濁した液体培地（以下細胞懸濁液とする）を保持したボトルはポンプの上流に配置し、ポンプの下流に培養皿などの容器を配置して、液体の流れを一方向とする方法が用いられてきた。このときポンプの内部を細胞懸濁液が通過すると、場合によっては、送液に伴う圧力変化によって通過後の細胞または生体試料に過度な負荷が生じる懸念があった。

本発明の目的は、このような課題を解決し、送液時に、液体に含まれる細胞や生体試料への応力負荷を低減する送液装置、それを用いた細胞培養装置及び方法を提供することにある。

上記の目的を達成するため、本発明においては、第１液体を保持する第１液体保持部と、第２液体を保持する第２液体保持部と、第１液体保持部と第２液体保持部との間に接続されるポンプと、第２液体保持部の下流に接続される受容器と、第１液体をポンプ経由で受容器に供給する第１供給管と、第２液体を受容器に供給する第２供給管とを備える構成の送液装置を提供する。

また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞培養装置であって、恒温槽と、恒温槽内に配置される培養容器と、培養容器への液体の送液と排液を行う送液装置と、恒温槽と送液装置を制御する制御部とを備え、送液装置は、第１液体を保持する第１液体保持部と、第２液体を保持する第２液体保持部と、第１液体保持部と第２液体保持部との間に接続されるポンプと、第１液体をポンプ経由で培養容器に供給する第１供給管と、第２液体を培養容器に供給する第２供給管を有する構成の細胞培養装置を提供する。

更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞培養方法であって、恒温槽内に配置される培養容器への液体の送液と排液を行う送液装置として、第１液体を保持する第１液体保持部と、第２液体を保持する第２液体保持部と、第１液体保持部と第２液体保持部との間に接続されるポンプと、第１液体をポンプ経由で培養容器に供給する第１供給管と、第２液体を培養容器に供給する第２供給管を有する構成の送液装置を用いて、細胞培養を行う細胞培養方法を提供する。

本発明によれば、送液時に、液体に含まれる細胞や生体試料への応力負荷を低減することができる。

実施例１の送液装置の一構成図である。実施例１の送液装置の制御タイムチャートの一例を示す図である。実施例１の送液装置の他の構成図である。実施例１の送液装置の制御タイムチャートの他の例を示す図である。実施例１の送液装置および細胞培養装置の一構成図である。実施例１の自動培養装置の制御フローの一例を示す図である。実施例１の自動培養装置の制御タイムチャート例を示す図である。実施例２の送液装置の一構成図である。実施例２の送液装置の制御と重量測定データ例を示す図である。実施例３の送液装置の一構成図である。実施例３の送液装置の制御フローチャート例を示す図である。実施例３の送液装置の他の構成図である。

以下、添付図面を参照して本発明の種々の実施例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。なお、本明細書において、液体を送る送液管、及び気体を送る送気管を総称して供給管と呼び、この供給管は送液管或いは送気管として機能する。

実施例１は、第１液体を保持する第１液体保持部と、第２液体を保持する第２液体保持部と、第１液体保持部と第２液体保持部との間に接続されるポンプと、第２液体保持部の下流に接続される受容器と、第１液体をポンプ経由で受容器に供給する第１供給管と、第２液体を受容器に供給する第２供給管とを備える構成の送液装置およびそれを用いた細胞培養装置の実施例である。以下、図１〜図７を参照しながら、実施例１に係る送液装置およびそれを用いた細胞培養装置を、送液装置、細胞培養容器と自動細胞培養装置の構成、細胞培養の操作の順に説明する。

＜送液装置＞
図１は、第１の実施例における送液装置の一構成を示す図である。送液装置１において、液体を保持する第１液体保持部である第１液体ボトル２は、そのふた（蓋）により内部を気密に保持できる。ふたに設けた気圧調整のための気圧調整管路３は、その開口端に設けられたメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタ４で外気に開放されている。ふたに設けられた供給管５は、第１液体ボトル２の内部に開口端を持ち、液体ボトル２内の液体に接して液体排出口となる。ポンプ６の一端は供給管５の他端に接続され、もう一端は供給管７に接続される。なお、ポンプ６がローラーポンプなどの場合、供給管５と供給管７は例えば一つのゴムチューブで構成され、その流路がポンプ６の流体駆動部に接続される。この供給管７の送液の送液先は、受容器８へ液体を供給する液体供給管２１である。供給管５と供給管７を総称して第１供給管と呼ぶ場合がある。

供給管５の第１液体ボトル２に保持された第１液体ボトル内の液体の液面より上方に分岐点９が設けられている。これにより、後で説明するように、第１気体導入弁１０を開放してガスを送気した際、分岐点９の位置から第１液体ボトル２間の供給管５にある液体を、液体の落差から生じる位置エネルギによって液体ボトル２にまで戻すためである。これは、供給管５の中に液体を保持したままでは、乾燥して詰まりが発生するため、それを防止するためである。

第１気体導入弁１０は、分岐点９とフィルタ１１に接続された管を開閉する。この第１気体導入弁１０に使用する弁機構は電磁弁が好適である。いわゆる電磁弁は電磁石の作用により開閉する部品にゴムチューブを挟み込んで取り付け、電磁弁のＯＮ／ＯＦＦによりゴムチューブを弾性変形させて管部を開放／閉止する機構である。以下、本明細書において、弁なるものは電磁弁を意味する。フィルタ１１はメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタであり外気に接している。

液体を保持する第２液体保持部である第２液体ボトル１２は、ふたにより内部を気密に保持される。ふたに設けた気体管路１３であり、気圧調整管路１３の開口端に設けられたメッシュサイズ０.２２μｍのフィルタ１４を介して、第２気体導入弁１５に接続される。気体管路１３は第２気体導入弁１５を経由して分岐１６に至る。第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５で、第２液体保持部である第２液体ボトル１２に気体を導入する気体導入弁を構成する。ポンプ６の一端から延びる供給管７の途中に分岐点１６が設けられており、分岐点１６から上述した気体管路１３が分岐される。気体管路１３は第２気体導入弁１５により開閉され、供給管７は分岐点１６と分岐点２０の間に挿入された第１供給弁１７により開閉される。

第２液体ボトル１２のふたに設けられた供給管１８は、第２液体ボトル１２の内部に開口端を持ち、液体に接して液体排出口となる。なお、この供給管１８を第２供給管と称する場合がある。供給管１８の途中には第２供給弁１９が接続され、第２供給弁１９により供給管１８を開閉する。供給管７と供給管１８の分岐点２０は、気密性の高いふたで閉鎖された受容器８への液体供給管２１に接続される。なお、受容器８には気圧調整用のフィルタ２２が設けられている。この液体供給管２１の開口部及び分岐点２０は第２液体ボトル１２内の液体の液面より上方に設けられている。これは液体を第２液体ボトル１２に戻して、詰まりを防止するためである。このような第２液体ボトル１２からの加圧型送液では、第２液体ボトル１２内の液面より上方に液体供給管２１の開口部及び分岐点２０を設置することにより、管内の液体が戻らず残留してしまうのを防止する。

以上のポンプ６と、第１気体導入弁１０と、第２気体導入弁１５と、第１供給弁１７と、第２供給弁１９の開閉、すなわち開放・閉止の動作は制御部であるコントローラ２３で制御される。コントローラ２３は、中央処理部（ＣＰＵ）のプログラム実行により実現できる。

送液装置１は次のように第１液体ボトル２内の液体の送液を行う。ポンプ６の流量をおよそＱとする。第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を閉じ、第１供給弁１７を開放したのち、ポンプ６を稼働させると、ポンプ６は供給管５内の気体を送気し、気体に連なった第１液体ボトル２内の液体が供給管５を通過して、送液が開始される。液体は分岐点９を通過し、所定の液量Ａが第１液体ボトル２より供給されたときポンプ６を停止する。停止するとポンプ６の内部構造により管は閉塞されており、液体は移動しない。

次いで、第１気体導入弁１０を開放すると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９の位置から第１液体ボトル２側の供給管５にある液体（戻り量Ｂ）は、その落差エネルギによって液体ボトル２にまで戻る。分岐点９よりポンプ６側の液体は、上述したポンプ６の内部構造により停止状態を維持している。このポンプ６側の液体が目的とする所定の送液量となる。次いでポンプ６を所定時間作動させると、フィルタ１１より順次気体導入がされるとともに供給管７より、液体供給管２１に向けて液体が移動する。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。

次いで、送液装置１は以下のように第２液体ボトル１２内の液体の送液を行う。第１供給弁１７を閉じ、第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を稼働させると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９を経由して、ポンプ６は第２液体ボトル１２内の液体に加圧が開始される。気相を介した圧力伝播により第２液体ボトル１２内の液体は供給管１８より第２供給弁１９を通過して、受容器８へ送液が開始される。液体は分岐点２０を通過し、所定の液量Ｃが第２液体ボトル１２より供給されたときポンプ６を停止するとともに、第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を閉止する。それぞれの弁の働きにより供給管１８は閉塞されており、液体は移動しない。このとき供給管１８における分岐点２０より上流となる管内には液体が満たされており、その管の長さと径から求まる管内体積に相当する液量をＤとする。

次いで、第１供給弁１７を開放し、ポンプ６を稼動すると、フィルタ１１より気体導入がされ、気体は分岐点１６と第１供給弁１７を経由して、分岐点２０の位置から容器側の下流の液体を受容器８に移動させる。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。

図２に本実施例の送液装置の制御タイムチャートの一例を示す。第１液体添加、すなわち第１液体の送液のときは「ＳＴＡＲＴ」で第１供給弁１７を開放したのち、ポンプ６を稼働させ送液が開始される。所定の液量Ａが第１液体ボトル２より供給されたとき、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次いで第1気体導入弁１０を開放する。ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後にポンプ６を停止後全ての弁を閉止する。

次いで、第２液体添加、すなわち第２液体の送液のときは、第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を稼働させると送液が開始される。所定の液量Ｃが第１液体ボトル２より供給されたとき、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次いで第２供給弁１９と第２気体導入弁１５を閉止したのち、第１供給弁１７を開放し、ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後にポンプ６を停止させる。その後第２気体導入弁１５を開放した後、全ての弁を閉止する。

所定の液量Ｃが第１液体ボトル２より供給され、ポンプ６の稼働を一旦停止した後における、各弁の開閉タイミングは精度よく送液するために重要である。最初に第２供給弁１９と第２気体導入弁１５を閉止し、液体と気体の流れを停止することは、第２液体ボトル１２内の高まった圧力をボトル２に保持しておき、液体の後端が受容器８に到達したのち、第２気体導入弁１５を開放することにより、ボトル内の気相圧力は第１供給弁１７を通じて、容器８側に伝播されて、管内の液体に掛かる圧力が常圧に維持されることとなる。

以上説明した本実施例の送液装置１を使用し、送液元となる液体において圧力変化の影響を小さくしたい液体を第２液体ボトル１２に保持し、送液元となる液体において圧力変化の影響が小さい液体を第１液体ボトル２に保持すれば、圧力変化の影響を小さくしたい液体はポンプ６を通過することの影響を小さくして目的の容器へ送液でき、一方で圧力変化の影響のない液体はポンプ６を通過して定量的に繰り返して目的の容器へ送液することができる。

その理由は、圧力変化の影響を小さくしたい液体はポンプ６の下流に配置された第２液体ボトル１２に保持されて、気相を介した圧力伝播により目的の容器８に送液することで、ポンプ６の内部を通過することの影響を小さくして目的の容器へ送液できるからである。また一方で圧力変化の影響のない液体はポンプ６の上流に配置された第１液体ボトル２に保持されてポンプ６を通過して送液されるから、ポンプ６の流量精度に準じた定量的制御によって繰り返して目的の容器へ送液することができるからである。

このとき、第２液体ボトル１２に細胞や生体試料の懸濁液が保持されていれば、ポンプを通過することなく細胞等の懸濁液を受容器に送液することができ、細胞または生体試料への負荷を低減できる。また、第１液体ボトル２に液体培地等が保持されていれば、液体培地は定量的に繰り返し送液することが可能である。ポンプ６はローラーポンプが好適であるがダイヤフラムポンプ、ギヤポンプなど他の方式のポンプでも適用できる。いわゆるしごきポンプ、チューブポンプともいうローラーポンプは、モータ回転軸に取り付けたローラーにゴムチューブを巻きつけて、モータ回転によってゴムチューブを弾性変形させて内部の気体や液体を送液する機構である。細胞培養装置では送液のチューブの滅菌性を確保する必要があり、使用時にチューブを交換可能であるローラーポンプは有用である。使用前に内部を滅菌可能であれば、どの様な送液ポンプも使用可能である。

また、ポンプの停止時には内部の液体が移動しない構成が必要であるが、液体が移動するポンプの使用時には、ポンプの前後いずれかに送液ボトル側への流れを制限する逆止弁を介して管路を構成すれば、本実施例の装置に適用できる。

図２に示したフローチャート例では、説明の便宜上第１液体を先に送液し、次いで第２液体を後に送液する説明を行ったが、この前後は入れ替えることも可能である。

以上説明した本実施例の送液装置に関して、第２液体ボトル１２の液体を繰り返し送液する際において、1回目の液体の液面は第２液体ボトル１２内部にあるが、次の送液時の液面は供給管１８における分岐点２０の位置にある。その液量は前記したように供給管１８における分岐点２０より上流の管内体積に相当するＤ量であるが、１回目の送液の際には、その差分量を考慮した送液制御を行えばよい。また２回目以降の送液は、第２液体ボトル１２に保持された液量がある限り、常に液面の端部は分岐点２０に位置するので、複数回の送液を実施する上では、一定液量を送液するポンプの制御を行えばより精度の高い送液が可能である。

一方で、本実施例の送液装置によれば、別の送液方法により送液する液体を攪拌した後で送液することも可能である。図３における送液装置の構成は図１に示した実施例と同じ構成であり、第２液体ボトル１２に関連する構成部分を詳細に図示したものである。

同図において第２液体の送液のとき、第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を稼働させると、フィルタ１０より気体導入がされるとともに、分岐点１６と気体管路１３を経由して、ポンプ６は第２液体ボトル１２内の液体に加圧を開始する。任意の送液がなされたとき、供給管内に第２液体は液面２４a位置まで進行する。次いでポンプ６を通常とは逆の吸引条件で稼働させると、第２液体ボトル１２内を陰圧とし、供給管１８に保持された第２液体が、第２液体ボトル１２内の液体に戻り、その液体の流れによって、第２液体ボトル１２内の液体は攪拌される。

この加圧と吸引操作を繰り返し行うことによって、液体の攪拌はより高い効率で得ることができる。送液対象として液体組成が不均一な液体の場合に顕著であり、例えば細胞を培地に懸濁した細胞懸濁液では、手操作では細胞播種前に分注器のピストンを押し戻しすることで、液体に対流を起こさせ撹拌操作を行っており、本実施例の送液装置では受容器としての複数の培養容器に播種するとき、送液の前にポンプの駆動を加圧と吸引の運転を行うことで液体の撹拌を実現できる。

次いで送液の液体を攪拌し、かつ再現性が確保できる理由を以下の方法で説明する。上記の攪拌操作の後に、第２液体の送液を行う直前には、ポンプ６を加圧条件より少し多い吸引条件で稼働して停止すれば、供給管１８より受容器８に設けられたフィルタ２２より気体導入がされて、第２液体ボトル１２内の気体供給が行われる。このとき、気体の流れが停止する十分な時間を与えたとき、送液開始点となる液面２４ｂは第２液体ボトル１２の内部の供給管１８の開口端の位置となる。これ以降は、前述した送液手順、加圧と加圧より少し多い吸引条件手順を行い、次の送液前に上記攪拌および前記送液手順を繰り返し実施すれば、送液開始点は常に一定となる。送液制御はより簡単であり、かつ再現性よい送液が可能である。この効果は、送液対象を複数の培養容器に定量的に送液する場合に顕著であり、送液操作によって液体ボトルの保持液量が減量しても、送液開始となる液面が常に一定の位置に制御できるので、送液制御はポンプの流量と目的の液量と、目的の容器までの管の長さと径から見込まれる管体積に相当する空間を通過するような時間制御によって実現できる。

図４に実施例１における送液の再現性の確保しつつ液体を攪拌した後で送液する方法の制御フローチャートを示す。第１液体の送液のときは、図２で説明した通り、「ＳＴＡＲＴ」で第１供給弁１７を開放したのち、ポンプ６を稼働させ第１液体の送液が開始される。所定の液量Ａが第１液体ボトル２より供給されたとき、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次いで第1気体導入弁１０を開放する。ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後にポンプ６を停止後全ての弁を閉止する。

次いで、第２液体の送液のときは第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を稼働させる。図４に示すように、まずポンプ６を通常とは逆の吸引条件で稼働させ、第２液体ボトル１２内を陰圧とし、第２液体ボトル１２内の液体を攪拌する。その後は、ポンプ６を通常の条件で稼働させると送液が開始される。所定の液量Ｃが第２液体ボトル１２より供給されたとき、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。次いで供給弁１９と第２気体導入弁１５を閉止したのち、第１供給弁１７を開放し、ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後にポンプ６を停止後全ての弁を閉止する。ここで、図２と同様、一端第２気体導入弁１５を開放した後、全ての弁を閉止しても良い。

ただし、過度な撹拌は細胞等への負荷を生じさせる場合があるため、本実施例の構成においては、管内送液速度条件に加え、大径容器から小径管への速度変化量の目安は１００倍以下が望ましい。即ち液体ボトルの径Ｄ１と供給管の径Ｄ２の比は１０倍以下が推奨される。

液体ボトルの形状は円筒型が一般的であるが、通常その内径は開口径より底面径は小さく製作され、また底面部分は三角錐の形状であればより好適である。三角錐の形状、すなわちコーン形状とすることにより供給管が底部により近く配置されることは、液体ボトルから供給管への排出時の残存量を低減できる。

＜細胞培養容器と自動細胞培養装置の構成＞
図５は、実施例１の送液装置１を用いた自動細胞培養装置３１の一構成例を示す図である。本実施例の細胞培養装置は、恒温槽と、恒温槽内に配置される培養容器と、培養容器への液体の送液と排液を行う送液装置と、恒温槽と送液装置を制御する制御部とを備え、送液装置は、第１液体を保持する第１液体保持部と、第２液体を保持する第２液体保持部と、第１液体保持部と第２液体保持部との間に接続されるポンプと、第１液体をポンプ経由で培養容器に供給する第１供給管と、第２液体を培養容器に供給する第２供給管と、第２液体保持部に気体を導入する気体導入弁を有する構成の細胞培養装置、及びそれを用いた細胞培養方法の実施例である。

以下、受容器としての細胞培養容器への液体培地の供給または排出するよう制御する制御部を備えた自動細胞培養装置の実施例を説明する。恒温槽３２は、細胞培養に最適な培養温度で第１培養容器８０、第２培養容器などの細胞培養容器を保持する。冷蔵庫３３は、補充用ボトル６９など、冷温保持する必要があるものを保持する。

播種用培地を保持する第１液体保持部である第１培地ボトル３４は、ふたにより内部を気密に保持できる。第１培地ボトル３４には、ふたの一つに設けた気圧調整のための気圧調整管３５が設けられている。また、開口端に設けられたメッシュサイズ０．２２μｍのフィルタ３６が設置され、恒温槽３２の気相に開放している。ふたに設けられた第１供給管として機能する供給管３７の一端は、第１培地ボトル３４の内部に開口端を持ち、播種用培地に接して液体排出口となる。第１制御弁３８は供給管３７の流れを制御する。供給管３７は分岐点３９を介して、後述する共通管４２に接続される。分岐点３９は第１培地ボトル３４に保持される液体の液面より上方に設けられる。

交換用培地を保持する第２培地ボトル４３の構成は第１培地ボトルと同様である。供給管４４の一端は、第２培地ボトル４３の内部に開口端を持ち、交換用培地に接して液体排出口となる。第２制御弁４５は供給管４４の流れを制御する。供給管４４は分岐点４６を介して共通管４２に接続される。共通管４２の上流は第１気圧調整弁７６に接続され、第１気圧調整弁７６は後述するガス共通管４７に接続される。共通管４２の下流にはポンプ４１が接続され、また第１ガス導入弁４０にも接続される。

第１ガス導入弁４０には加湿ボトル４８における排出部と接続され、加湿ボトル４８の導入部は分岐されて、第２気圧調整弁４９を介してガス共通管４７に接続される。もうひとつの分岐はフィルタ５０を介して、圧力制御弁５１に接続され、その上流にはＣＯ_２とＯ_２含む混合ガスボンベ５２が接続される。ガスボンベ５２は細胞培養に最適化されたガス濃度で充填加圧されたＣＯ_２ガスのボンベであり、細胞培養中の液体培地のｐＨ値調整を行う目的であり、ＣＯ_２ガスで液体培地の表面よりガス交換を可能とする。加湿ボトル４８は滅菌水が保持されており、ＣＯ_２ガスを滅菌水にくぐらせて加湿されたガスを、培養容器に送気することで、液体培地の蒸発による液体培地成分の濃縮を防止することが可能である。これによりボンベ５２より導出したＣＯ_２ガスは加湿ボトル４８において最適湿度に加湿され待機される。

送液ポンプ４１においては第１接続５３と第２接続５４を有している。また第１接続５３と第２接続５４は、第２ガス導入弁５５に接続されている。第２ガス導入弁５５は、送液ポンプ４１のバイパスの役割を持つ。

送液ポンプ４１における第２接続５４は分岐点５６で分岐されて、供給管５７を開閉制御する第３ガス導入弁５８と、送気管５９を開閉制御する送気弁６０に接続される。細胞懸濁液は第２液体保持部である細胞ボトル６１に保持され、細胞ボトル６１のふたに接続されたフィルタ６２を介して送気管５９に接続され、もう一方は第２供給管として機能する供給管６３であり一端は、細胞ボトル６１の内部に開口端を持ち、細胞懸濁液に接して液体排出口となる。第３制御弁６４は供給管６３を開閉制御する。供給管５７は分岐点６５で供給管６３から分岐され、一方は分岐点６６で供給管６７を開閉制御する第４制御弁６８に接続される。

交換用培地に用いる補充用培地は補充用ボトル６９に保持される。補充用ボトル６９は、そのふたに接続されたフィルタ７０を介して気圧調整管７１に接続され、供給管６７の一端が、補充用ボトル６９の内部に開口端を持ち、補充用培地に接して液体排出口となる。即ち補充用ボトル６９の交換用培地は送液ポンプ４１の作用によって、第２培地ボトル４３に送液される配管の構成である。

共通管４２は、第３気圧調整弁７７と第1気圧調整弁７６を介して、補充用ボトル６９の気圧調整管７１、第２培地ボトル４３における気圧調整管７２と接続される。さらに共通管４２は、フィルタ７３を介して気体バッグ７４と、前記した第２気圧調整弁４９に接続される。この気体バッグ７４には逆止弁７５が設けられており、恒温機３２内の気相に通じており、第２気圧調整弁４９のみを開放して、ガスボンベ５２のガスを気体バッグ７４に保持できる。さらに気体バッグ７４の容量を超えたガス量は逆止弁７５より恒温機３２内の気相に放出されるので、気体バッグ７４の内部のガス圧は常に大気圧で維持されている。即ち、気体バッグ７４内に保持されたガスは共通管４２を介して、交換用培地ボトル４３内の気相と補充用ボトル６９の気相と接する構成である。さらに気圧調整弁７６と第１制御弁３８と第２制御弁４５を開放すれば、第２培地ボトル４３内の液相、および播種用培地ボトル３４の液相と接する構成である。

供給管５７は培養容器へ通じる多分岐部７８に接続され、第１培養容器８０における送液用の容器開閉弁８２と、第２培養容器８１用の容器開閉弁８３に接続される。第１培養容器８０と第２培養容器８１の両者は同じ構成であるので、以下第１培養容器８０を代表として構成を説明する。

第１培養容器８０は、外観が本体部８４とふた部８５からなる気密な容器であり、内観は本体部８４の内底部に細胞懸濁液８６を保持して培養可能な容器８７を保持できる。ふた部８５には３つの貫通するポートが設けられており、その一つは容器８７に液体を添加する送液ポート８８であり、前記した容器開閉弁８２に接続される。他の一つは、容器８７の底面近傍に接し液体を排出する排出ポート８９であり、最後の一つは、気圧調整ポート９０である。このうち送液ポート８８は、ガス導入時における送気ポートを兼ねており、このため送液ポート８８と気圧調整ポート９０の開口端は容器８７に液体が満たされても、接液しない高さに設けられている。気圧調整ポート９０は第４気圧調整弁９１に接続され、第２培養容器８１との多分岐部９２を経由して、トラップボトル９３に接続される。トラップボトル９３は冷蔵庫３３に設置されており、ここを通過する気相はフィルタ９４を介して冷蔵庫３３へと放出される。

第１培養容器８０または第２培養容器８１より、保持されている液体を排出する構成を説明する。排液ボトル９７には排液管９８が気密に接続されている。排液管９８は排出弁９９を介して排液ポンプ９６の吐出口に接続されている。排液ポンプ９６の吸引口には多分岐部１００によって分岐され、第１培養容器８０用の第１容器排出弁１０１と、第２培養容器８１用の第１容器排出弁１０２に接続される。第１容器排出弁１０１は第１培養容器８０における排出ポート８９に接続される。即ち排液ボトル９７は排液ポンプ９６の作用によって、第１培養容器８０または第２培養容器８１における容器８７より液体が排出される配管の構成である。上記に示した種々の電磁弁やポンプ９６、恒温槽３２、冷蔵庫３３等は制御部であるコントローラ１０３で制御される。

＜細胞培養の操作＞
図６は、図５に示した制御部であるコントローラ１０３で制御される細胞培養装置３１における細胞培養の全体的な操作のフローチャートを示す図である。「ＳＴＡＲＴ」についで、恒温槽３２に流路を設置したのち（Ｓ０１）、別途準備した細胞懸濁液を保持する細胞ボトル６１と、播種用培地を保持した培地ボトル３４、および交換用培地を保持した交換用培地ボトル６９を流路に接続する（Ｓ０２）。次いで自動制御により気体バッグ７４にガスを充填する（Ｓ０３）。第１培養容器８０および第２培養容器８１にガスを送気したのち、細胞ボトル６１より細胞懸濁液を送液する（Ｓ０４）。直ぐに播種用培地ボトル３４より播種用培地を培養容器に送液する（Ｓ０５）。図示しない揺動機構により各培養容器内の細胞懸濁液を攪拌した後、培養容器に加湿されたガスを送気して、細胞に対し恒温維持して静置する（Ｓ０６）。細胞培養の進行状態によって、液体培地の交換を開始するかの判定を行う（Ｓ０７）。液体培地の交換に当たっては、補充用培地ボトル６９より第２培地ボトル４３に所定量充填後（Ｓ０８）、培養容器における古い培地を排出したのち（Ｓ０９）、第２培地ボトル４３より新しい液体培地を送液する（Ｓ１０）。引き続き加湿ガスの送気と静置を行い（Ｓ１１）、細胞培養の進行状態によって、培養の継続判定を行い（Ｓ１２）、必要時に培地交換を再実行する。細胞培養の終了時には、自動培養を終了し、手作業で培養容器より培養した細胞の取り出しを行い（Ｓ１３）、細菌増殖の有無を確認するため排液バッグ９７を回収して（Ｓ１４）、使用済みの流路を恒温槽３２より取り外して終了（ＥＮＤ）する。

図７は、図５のコントローラ１０３で制御される、培養容器８０における送液・送気のタイムチャートの一例を示している。横軸は操作項目と時間軸を示し、縦方向には図５で明示した第１制御弁３８から容器排出弁１０２の１８台の電磁弁、および送液ポンプ４８と排液ポンプ９６のローラーポンプ等の動作タイミングを示している。初期状態では全ての電磁弁がＯＦＦであるので閉止であり、全てのポンプがＯＦＦであるので、送液停止の状態である。

細胞培養容器８０内の容器８７に細胞播種を行うとき（図６のＳ０４）は、細胞播種の動作に従う。初期状態から第１気圧調整弁７６と送気弁６０と第３制御弁６４を開放し、さらに容器開閉弁８２と第４気圧調整弁９１をＯＮ（開放）すると、気体バッグ７４から送液ポンプ４１を通じて、さらに細胞ボトル６１と培養容器８０が通じ、さらにトラップボトル９３が通じる。次いで送液ポンプ４１を所定時間ＯＮすると、細胞ボトル６１から細胞懸濁液の送液が開始され、送液開始点は容器８０に到達する。目的の液量が分岐点６５に到達したとき、送液ポンプ４１の送液を停止する。

次いで、第３制御弁６４を閉止し、送気弁６０を閉止し、次いで第３ガス導入弁５８を開放して、送液ポンプ４１の送液を開始すると、容器開閉弁８２を通じて培養容器８０の第１ポート８８より、細胞液懸濁液が送液される。このとき第３ポート９０はトラップボトル９３を通じ外気に通じているので、細胞培養容器８０の内部の圧力は常圧に調整される。細胞懸濁液の後端が培養容器８０に到達すれば、所定量の注入が為されており、送液ポンプ４１を停止する。

次いで送気弁６０を開放して閉止することにより細胞ボトル６１の内圧を開放した後、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。細胞ボトル６１の内圧を常圧に戻す方法としては、タイムチャートでは図示しないが、目的の液量が分岐点６５に到達し、送液ポンプ４１の送液を停止したとき、第３制御弁６４を閉止し、第２ガス導入弁５５を開放する方法により、ガスバッグ内のガスを導入することも有効である。

細胞培養容器８０、８１のように受容器が複数ある時は、予め細胞ボトル６１には複数の細胞培養容器に分配できる量の細胞懸濁液を保持し、上記の操作において容器開閉弁８２を閉止して、図５における容器開閉弁８３を開放し、第４気圧調整弁９１を適宜開放して、上記動作を行えば細胞培養容器８１に細胞液懸濁液が同量送液することができる。

細胞培養容器８０内の容器８７に播種用培地の送液を行うとき（図６のＳ０５）は、播種用培地送液の動作に従う。初期状態から第１制御弁３８と第３ガス導入弁５８を開放し、さらに容器開閉弁８２と第４気圧調整弁９１をＯＮ（開放）すると、播種用培地ボトル３４から送液ポンプ４１を通じて、培養容器８０が通じ、さらにトラップボトル９３が通じる。次いで送液ポンプ４１を所定時間ＯＮすると、播種用培地ボトル３４から播種用培地の送液が開始され、送液開始点は容器８０に到達する。

目的の液量が分岐点３９に到達したとき、送液ポンプ４１の送液を停止する。次いで、次いで第１気圧調整弁７６および第１制御弁を開放すれば、供給管３７内の播種用培地は分岐点３９で分割され、播種用培地ボトル３４側の液体は落差でボトル内に戻る。次いで、送液ポンプ４１の送液を開始すると、容器開閉弁８２を通じて培養容器８０の第１ポート８８より、播種用培地が送液される。このとき第３ポート９０はトラップボトル９３を通じ外気に通じているので、細胞培養容器８０の内部の圧力は常圧に調整される。播種用培地の後端が培養容器８０に到達すれば、所定量の注入が為されており、送液ポンプ４１を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め播種用培地ボトル３４には複数の細胞培養容器に分配できる量の播種用培地を保持し、上記の操作において容器開閉弁８２を閉止して、図５における容器開閉弁８３を開放し、第４気圧調整弁９１を適宜開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器８１に播種用培地が同量送液することができる。

次に培養容器８０の内部に加湿されたＣＯ_２ガスで満たすとき（図６のＳ０６）は、培養容器に加湿ガス送気の操作に従う。初期状態から第１ガス導入弁４０と第２ガス導入弁５５を開放し、さらに容器開閉弁８２と第４気圧調整弁９１をＯＮ（開放）すると、加湿ボトル４８から培養容器８０が通じ、さらにトラップボトル９３が通じる。次いで圧力制御弁５１を所定圧に調整しつつ開放し、第１ガス導入弁４０を所定時間ＯＮすると、ボンベ５２より加湿ボトル４８を通じて、培養容器８１に最適に加湿されたＣＯ_２ガスが到達する。培養容器８１は密閉されているが、第３ポート９０から外気に通じるフィルタ９４までが開放されているので、培養容器の内部の圧力は外気圧と調整された圧となる。所定量のＣＯ_２ガスの注入が為された後、まず第１ガス導入弁４０を閉止し、次いで第２ガス導入弁５５を閉止し、培養容器内の圧力が大気圧と同等となった時、容器開閉弁８２、第４気圧調整弁９１を閉止する。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において容器開閉弁８３、第４気圧調整弁９１を開放して、上記動作を行えば、培養容器８１にＣＯ_２ガスが充填される。

次に、細胞培養容器より液体培地の交換を行うことを判断したとき（図６のＳ０７）は、図７の動作タイムチャートにおける、補充用培地の充填（図６のＳ０８）の操作に従う。

初期状態から第３気圧調整弁７７と第２制御弁４５と第３ガス導入弁５８と、第４制御弁６８を開放する。その結果送液ポンプ４１を介して、第２培地ボトル４３から補充用培地ボトル６９が通じる。次いで送液ポンプ４１を通常とは逆の方向で送液する。送液に先端が第２培地ボトル４３に到達し、目的の送液量となったとき、ポンプ４１の送液を停止する。次いで、第１気圧調整弁７６を開放すれば、供給管４４における分岐点４６で液体は分割され、今回の送液方向である第２培地ボトル４３側の供給管４４内の液体は、落差によって第２培地ボトル４３に送液される。即ち目的の送液量は第２培地ボトル４３に送液されている液量と供給管４４における分岐点４６に保持された液量となる。

次いで、送液ポンプ４１を通常の送液方向に送液すると、後端を分岐点６６に位置とした液体が移動開始され、元の補充用培地ボトル６９に液体が到達する。このとき第２培地ボトル４３の気相と、気圧調整管７１を通じて補充用培地ボトル６９の気相が通じているので、第２培地ボトル４３と補充用培地ボトル６９の内部の圧力は常圧に調整される。開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め第２培地ボトル４３には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持するように、ポンプの送液量を調整する。また、細胞培養における培地の交換回数が複数予定されているときは、細胞培養容器が複数あるときに必要な液体培地量に培地の交換回数を掛け合わせた液体培地を送液できる量の液体培地を補充用培地ボトル６９に保持しておけば、複数の細胞培養容器に、複数回の培地の交換が継続的に可能である。

培養容器８０内の容器８７より培地排出を行うとき（図６のＳ０９）は、図７の動作タイムチャートにおける容器から培地排出動作に従う。初期状態から第１気圧調整弁７６と第２ガス導入弁５５、第３ガス導入弁５８、容器開閉弁８２を開放し、容器排出弁１０１と排出弁９９をＯＮ（開放）すると、気体バッグ７４から第１気圧調整弁７６を通じて、第２培養容器８１の第１ポート８８までの管路が通じる。また排液ボトル９７から排出ポンプ９６を介して排出ポート８９までの流路が通じる。次いで排出ポンプ９６を容器８７に保持された液体量を排出するための排出時間を与えて所定時間ＯＮすると、容器から液体培地を吸引し送液が開始され、排液ボトル９７に到達する。このとき第１ポート８８は気体バッグに通じているので、細胞培養容器５５の内部の圧力は常圧に調整され、かつ気体バッグのガスが導入される。所定量の排出が為された後、排出ポンプ９６を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、上記の操作において容器開閉弁８２を閉止して、図５における容器開閉弁８３を開放し、容器排出弁１０１を閉止して、容器排出弁１０２を開放して、上記動作を行えば、培養容器８１における容器より液体培地を排液することが可能となる。

培養容器８０内の容器８７に液体培地の添加を行うとき（図６のＳ１０）は、容器への培地添加の動作に従う。第２制御弁４５と第３ガス導入弁５８をＯＮ（開放）し、さらに容器開閉弁８２と第４気圧調整弁９１をＯＮすると、第２培地ボトル４３から送液ポンプ４１を通じて、培養容器８０が通じ、さらにトラップボトル９３が通じる。次いで送液ポンプ４１を所定時間ＯＮすると、第２培地ボトル４３から交換用培地の送液が開始され、送液開始点は容器８０に到達する。

目的の液量が分岐点３９に到達したとき、送液ポンプ４１の送液を停止する。次いで、次いで第１気圧調整弁７６を開放すれば、供給管４４内の交換用培地は分岐点４６で分割され、第２培地ボトル４３側の液体は落差でボトル内に戻る。次いで、送液ポンプ４１の送液を開始すると、容器開閉弁８２を通じて培養容器８０の第１ポート８８より、交換用培地が送液される。このとき第３ポート９０はトラップボトル９３を通じ外気に通じているので、細胞培養容器８０の内部の圧力は常圧に調整される。交換用培地の後端が培養容器８０に到達すれば、所定量の注入が為されており、送液ポンプ４１を停止し、開放されている各弁をＯＦＦとして閉止して送液を終了する。

細胞培養容器が複数ある時は、予め第２培地ボトル４３には複数の細胞培養容器に分配できる量の液体培地を保持し、上記の操作において容器開閉弁８２を閉止して、図５における容器開閉弁８３を開放し、第４気圧調整弁９１を適宜開放して、上記動作を行えば、細胞培養容器８１に交換用培地を同量送液することができる。

引き続き、培養容器８０の内部に加湿されたＣＯ_２ガスで満たすとき（図６のＳ１１）は、先に説明した加湿ガス送気の項に従えばよい。

以上のように図５に示した細胞培養装置の実施例においては、図６に示した動作シーケンスと図７に示した詳細なタイムチャートに準じた運用によって、培養容器８０が恒温器３２によって最適な培養温度に保持されること、送液装置によって細胞懸濁液を培養容器に送液できること、ついで送気機構により液体培地は適度なＣＯ_２ガス環境と湿度条件に維持されること、細胞は容器８７の内底面に接着して増殖するので、培養に伴い成分変化した液体培地を吸引排出して細胞と液体培地を分離できること、交換用培地を適量恒温槽３２内に保持された第２培地ボトル４３に充填でき予熱保持ができること、次いで、交換用培地を培養容器に順次添加して、培地交換ができることにより、細胞の自動培養が可能であるといえる。

本実施例に係る送液装置によれば、送液元となる液体において圧力変化の影響を小さくしたい液体を第２の液体ボトルに保持し、送液元となる液体において圧力変化の影響が小さい液体を第１の液体ボトルに保持すれば、圧力変化の影響を小さくしたい液体はポンプを通過することの影響を小さくして目的の容器へ送液でき、一方で圧力変化の影響のない液体はポンプを通過して定量的に繰り返して目的容器へ送液することができる。

以上、実施例１に記載の送液装置および細胞培養装置によれば第１の課題である、送液に伴う圧力変化によって細胞または生体試料が損傷する問題を解消でき、さらに細胞の自動培養が可能であるといえる。その理由は、圧力変化の影響を小さくしたい液体はポンプの下流に配置された第２の液体ボトルに保持されて、気相を介した圧力伝播により目的の容器に送液することで、目的の容器へ送液できるからである。また一方で圧力変化の影響のない液体はポンプの上流に配置された第１の液体ボトルに保持されてポンプを通過して送液されるから、ポンプの流量精度に準じた定量的制御によって繰り返して目的の容器へ送液することができるからである。このとき、第２の液体ボトルに細胞懸濁液が保持されていれば、送液に伴う圧力変化による細胞または生体試料が損傷する懸念を低減できる。第２の液体ボトルに液体培地等が保持されていれば液体培地は、定量的に繰り返し送液することが可能である。

さらに本実施例の送液装置およびそれを利用した細胞培養装置によれば次の効果を有している。図６に示したフローチャートでは、細胞懸濁液を先に送液し、次いで播種用培地を後に送液している。このとき先に細胞懸濁液が送液されたあと、培養容器まで通じる液体供給管の管内には細胞懸濁液が少量の液滴となって残留する可能性がある。その後に播種用培地等を送液するとき液体供給管を通過するので、細胞懸濁液を含む少量の液滴と交じり合って目的の容器に到達することができる。所謂共洗いの効果によって、管内に細胞が残留する影響を低減できる効果がある。

実施例２は、実施例１で説明した送液装置の構成に加え以下の方法によって送液量を確認することが可能な送液装置の実施例である。すなわち、本実施例の送液装置は、実施例１の構成に加え、第１液体保持部の第１液体と、第２液体保持部の第２液体の重量をそれぞれ検知する重量センサを備え、制御部は、重量センサの出力に従いポンプを制御する構成の送液装置の実施例である。

図８は、第２の実施例における送液装置１１０の構成を示す図であり、実施例１と基本的な構成は同じであるが、送液量を確認する方法として、液体ボトルの重量変化値を検出する構成が付加されている。即ち実施例１に対し、第１液体ボトル２、気圧調整管路３、フィルタ４、供給管５、ポンプ６、供給管７、受容器８、分岐点９、第１気体導入弁１０、フィルタ１１、第２液体ボトル１２、気体管路１３、フィルタ１４、第２気体導入弁１５、分岐点１６、第１供給弁１７、供給管１８、第２供給弁１９、分岐点２０、液体供給管２１、フィルタ２２、制御部を構成するコントローラ２３は図１の構成と同じである。

本実施例においても、分岐点９は、供給管５の第１液体ボトル２に保持された第１液体ボトル内の液体の液面より上方に設ける。これにより、第１気体導入弁１０を開放してガスを送気した際、分岐点９の位置から第１液体ボトル２間の供給管５にある液体を、液体の落差から生じる位置エネルギによって液体ボトル２にまで戻すことができ、詰まりを防止できる。更に、以下に説明する送液前後の液体ボトル重量を計測する際、液体ボトル２にまで液体を戻し、管内残留が０であることが望ましい。

本実施例の構成においては、液体を保持した第１液体ボトル２と気圧調整管路３とフィルタ４の一組の重量を測定する第１重量センサ１１１と、供給管５を固定する固定治具１１２を備える。供給管５に柔軟性が高いゴムチューブなどの管材を使用すれば、分岐点９より下流に接続された構成品が第１液体ボトル２の重量測定を損なうことなく好適である。更に、本実施例の構成においては、液体を保持した第２液体ボトル１２と気体管路１３とフィルタ１４および供給管１８の一組の重量を測定する第２重量センサ１１３と、気体管路１３を固定する固定治具１１４、供給管１８を固定する固定治具１１５を備える、固定治具１１４、１１５は共に、固定治具１１２と同様の目的で付加される。

本実施例の送液装置１１０は以下のように送液と送液量の確認を行う。図９に本実施例の制御の順番を横軸に記載し、縦軸はそれに相応して重量センサより得られる重量測定値を示すものである。重量測定の例として第２液体ボトル１２内の液体の送液方法と重量センサ１１３の計測値の変化について説明する。送液前の第２重量センサ１１３の重量計測値を計測しここではゼロとする。第１供給弁１７を閉じ、第１気体導入弁１０と第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を稼働させると、フィルタ１１より気体導入がされるとともに、分岐点９を経由してポンプ６は第２液体ボトル１２内の液体に加圧を開始する。第２液体ボトル１２内の液体は供給管１８より第２供給弁１９を通過して、容器８へ送液が開始され、それと共に重量は減量する。

目標値重量Ｅに到達すると同時に、ポンプ６を停止するとともに、第２供給弁１９を閉じ次いで第２気体導入弁１５を閉止する。供給管１８は閉塞されており、液体は移動しない。次いで、第１供給弁１７を開放し、ポンプ６を稼動すると、フィルタ１１より気体導入がなされ、気体は分岐点１６と第１供給弁１７を経由して、分岐点２０の位置から容器側の下流の液体は移動を開始し、この容器８側の液体が目的送液量となる。液体の先端は受容器８に到達し液体の添加が開始され、液体の後端が受容器８に到達すれば、ポンプ６を停止する。次いで、第２気体導入弁１５と第２供給弁１９を開放すれば、供給管１８内の液体は落差で第２液体ボトル１２内に戻り、その時の重量センサ１１３の重量計測値を計測して送液を終了する。

目標値重量Ｅは目的の液体の送液量に対しその液量と密度から求められる重量換算値に加えて、分岐点２０から液体ボトル２内の液体の液面に相応する供給管１８の体積を液体で満たしたときの密度から求められる重量Ｆを足し合わせた重量である。即ち、容器８に送液された送液量はＥ−Ｆで求まる重量計測値より検知できる。繰り返して送液するときは、上記の操作を実行することにより、順次減量する重量を送液重量として扱うことができる。

本実施例の送液装置によれば、細胞播種時における細胞懸濁液の送液量の確認に利用できる。一般に細胞培養の工程では、作業者の熟練度と作業実施記録によって、こうした分注工程の実行を保証している。本実施例を用いれば、送液元となる細胞ボトルの重量の変化量を、目的重量分減量したことを記録することで１回の分注の作業記録とし、細胞培養工程の確実な実行結果を保証することができる。またポンプは長時間使用していると、チューブ形状の変形と回復が鈍って、ポンプ流量が変化する場合があるが、そのような変化においても、結果として送液される液体の重量変化量によって送液制御されるので、より再現性の高い送液方法といえる。加えてすべてのポンプを作動させた時間記録、ポンプへの印加電圧記録、液面センサの作動時間記録など、自動装置から得られる動作情報を整理すれば、送液および排出の実行結果を信頼性高く保証できる。

さらに本実施例の送液装置を実施例１に示した細胞培養装置に適用すれば、送液に伴う圧力変化によって細胞または生体試料等に与える負荷を低減でき、さらに送液量を精度よく制御しつつ送液でき、さらに細胞の自動培養を可能とすることができる。

実施例３は、実施例１で説明した送液装置の構成に加え以下の方法によって微量な送液量を再現性よく送液することが可能な送液装置の実施例である。すなわち、第１の液体を保持する第１の液体ボトルと、第１液体の導通する供給管と、気体導入弁と、気体導入弁と該液体ボトルと、圧力変化の影響を小さくしたい液体を保持する第２の液体ボトルと、第２液体の導通する供給管、とポンプと目的の容器を備え、該第２の液体ボトルの下流に容器を接続し、該ポンプを自身の方向に吸引したあと、該目的容器に送液することを特徴とする送液装置、さらに、本送液装置を備えた細胞培養装置の実施例である。

図１０は、実施例３における送液装置１２０の一構成を示す図であり、送液元となる液体において圧力変化の影響を小さくしたい液体を供給管内に必要量滞留させたのち、定量的に繰り返して目的容器へ送液する構成を示す。即ち実施例１に対し、第１液体ボトル２、気圧調整管路３、フィルタ４、供給管５、ポンプ６、供給管７、受容器８、分岐点９、第１気体導入弁１０、フィルタ１１、第２液体ボトル１２、フィルタ１４、供給管１８、第２供給弁１９、分岐点２０、液体供給管２１、フィルタ２２、コントローラ２３は同じで構成である。更に、１２１は供給管７と分岐点２０で供給管１８に接合された滞留管１２１、さらに滞留管１２１に接続される液体供給管２１を制御する第１供給弁１２２を備えている。滞留管１２１は既知の長さと管径であり、他の管である供給管７、供給管１８、液体供給管２１と同じ径であってもよく、ここでは説明のため図の表記を変えて示している。

本実施例の送液装置１２０は次のように送液と送液量の確認を行う。図１１に本実施例の制御フローチャートの一例を示す。第２液体添加、すなわち、第２液体の送液のときは第１気体導入弁１０と第２供給弁１９を開放したのち、ポンプ６を目的の送液方向とは逆の吸引方向で稼働させると、第２液体の送液が開始される。所定の液量Ｃが第２液体ボトル１２より供給管１８を経由して滞留管１２１に供給されたとき、ポンプ６の稼働を速やかに停止させる。

次いで第２供給弁１９を閉止したのち、第１供給弁１２２を開放する。ポンプ６を液体の後端が受容器８に到達するまでの時間より大きい時間を設定し稼働させ、任意時間後にポンプ６を停止後全ての弁を閉止する。第１液体添加、すなわち、第１液体を送液するときは、第１供給弁１２２を開放したのち、ポンプ６を目的の送液方向で稼働させると、第１ボトル２に保持された、第１液体の送液が開始される。

本実施例の送液装置によれば、細胞播種時における細胞懸濁液への圧力変化を小さくすることができ、さらに装置構成も簡素化できる。実施例１における送液装置１に比較して、滞留管を用いて圧力変化の影響を小さくしたい細胞懸濁液などの液体と圧力変化の影響がない液体培地などの液体の供給管を共有化することで、その供給管を制御する制御弁を少なくできる効果がある。

本実施例における送液装置はさらに、機構制御を簡単化しつつ、課題を解決できる。図１２は、図１０に示した送液装置１２０において、基本的構成は同じであるが、第２供給弁１９と第１供給弁１２２に代え、図示する方向に従って逆止弁１３１、１３２を設けた変形構成例を示す図である。より詳細には、逆止弁１３１、１３２により、供給管１８の送液の方向は常に送液ポンプ６に対して、吸引方向であり、加圧方向は流れが生じない。一方で液体供給管２１の送液の方向は常に送液ポンプ６に対して、加圧方向であり、吸引方向には流れが生じない。この構成において、送液ポンプ６は目的の受容器８と逆方向に吸引運転を実施すれば、第２ボトルより液体が所定量吸引され、滞留管１２１に保持されたのち、送液ポンプ６を目的の容器８方向に加圧運転を実施すれば、滞留管１２１に保持された液体は、目的の容器８へ送液が可能となる。

本構成のように制御すべき装置構成が少ないことは、コスト低減や小型化等の効果を得ることができる。また、煩雑さを軽減し、信頼性を高めることができる。また、滞留管１２１は、目的の送液量に応じて適宜変更するものであり、目的とする送液量が多いときは、管径を大きくして過剰な長さの管長とすることは避けるべきである。一方で、目的とする送液量が微量で、精度が要求される場合には管径を小さくして、滞留管１２１の管内の表面積を小さくすることも有用である。

以上説明した本発明に係る送液装置及びそれを利用した細胞培養装置によれば、送液元となる液体において圧力変化の影響を小さくしたい液体を第２の液体ボトルに保持し、送液元となる液体において圧力変化の影響が小さい液体を第１の液体ボトルに保持すれば、圧力変化の影響を小さくしたい液体はポンプを通過することの影響を小さくして目的の容器へ送液でき、一方で圧力変化の影響のない液体はポンプを通過して定量的に繰り返して目的容器へ送液することができる。

なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

更に、上述した各構成、機能、制御部であるコントローラ等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成する例を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。すなわち、処理部の全部または一部の機能は、プログラムに代え、例えば、ＡＳＩＣ（ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＣｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（ＦｉｅｌｄＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅＧａｔｅＡｒｒａｙ）などの集積回路などにより実現してもよい。

１、１１０、１２０、１３０送液装置
２第１液体ボトル
３気圧調整管路
４、１１、１４、２２、３６、５０、６２、７０、７３、９４フィルタ
５、７、１８、３７、４４、５７、６３、６７供給管
６ポンプ
８受容器
９、１６、２０、３９、４６、５６、６５、６６分岐点
１０第１気体導入弁
１２第２液体ボトル
１３気体管路
１５第２気体導入弁
１７、１２２第１供給弁
１９第２供給弁
２１液体供給管
２３、１０３コントローラ
３１自動細胞培養装置
３２恒温槽
３３冷蔵庫
３４第１培地ボトル
３５、７１、７２気圧調整管
３８第１制御弁
４２共通管
４３第２培地ボトル
４５第２制御弁
７６第１気圧調整弁
４７ガス共通管
４０第１ガス導入弁
４８加湿ボトル
４９第２気圧調整弁
５１圧力制御弁
５２混合ガスボンベ
５３第１接続
５４第２接続
５５第２ガス導入弁
５８第３ガス導入弁
５９送気管
６０送気弁
６１細胞ボトル
６４第３制御弁
６８第４制御弁
６９補充用ボトル
７４気体バッグ
７５、１３１、１３２逆止弁
７８、９２、１００多分岐部
８０第１培養容器
８２、８３容器開閉弁
８１第２培養容器
８４本体部
８５ふた部
８６細胞懸濁液
８７容器
８８送液ポート
８９排出ポート
９０気圧調整ポート
９１第４気圧調整弁
９２、１００多分岐部
９３トラップボトル
９６排液ポンプ
９７排液ボトル
９８排液管
９９排出弁
１０１第１容器排出弁
１０２第１容器排出弁
１１１第１重量センサ
１１２、１１４、１１５固定治具
１１３第２重量センサ
１２１滞留管

Claims

第１液体を保持する第１液体保持部と、
細胞を含む第２液体を保持する第２液体保持部と、
前記第１液体保持部と前記第２液体保持部との間に接続されるポンプと、
前記第２液体保持部の下流に接続される受容器と、
前記受容器に液体を供給する液体供給管と、
前記第１液体を前記ポンプ経由で前記液体供給管に供給する第１供給管と、
前記第２液体保持部からの加圧送液で前記第２液体を前記液体供給管に供給する第２供給管と、
前記第２液体保持部に気体を導入するための、前記第１液体保持部と前記ポンプの間の前記第１供給管に接続される第１気体導入弁と、前記ポンプと前記受容器の間の前記第１供給管と前記第２液体保持部の間に接続される第２気体導入弁からなる気体導入弁と、
前記ポンプと前記受容器の間の前記第１供給管を開閉する第１供給弁と、
前記第２液体保持部と前記受容器の間の前記第２供給管を開閉する第２供給弁と、
前記ポンプと、前記第１供給弁と、前記第２供給弁と、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁を制御する制御部を、を備え、
前記制御部は、前記第１供給弁を閉じ、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁と、前記第２供給弁とを開放して前記ポンプを動作させることにより、前記第２液体保持部内の前記第２液体に加圧を行い、任意の送液がなされたとき前記ポンプを逆の吸引条件で稼働させることにより前記第２液体を撹拌させる、
ことを特徴とする送液装置。
請求項１記載の送液装置であって、
前記制御部は、前記第１供給弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記第１液体保持部から前記第１供給管を介して前記第１液体を前記液体供給管に送液し、
前記第１気体導入弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記液体供給管の所定量の前記第１液体を前記受容器に送液する
ことを特徴とする送液装置。
請求項１記載の送液装置であって、
前記制御部は、前記第２供給弁と、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記第２液体保持部から前記第２供給管を介して前記第２液体を前記液体供給管に送液し、
前記第２供給弁と前記第２気体導入弁を閉止した後、前記第１供給弁を開放して、前記ポンプを動作させることにより、前記液体供給管の所定量の前記第２液体を前記受容器に送液する
ことを特徴とする送液装置。
請求項３記載の送液装置であって、
前記第１供給管と前記第２供給管を分岐する分岐点と、前記液体供給管の開口部は、前記第２液体保持部の前記第２液体の液面より上方に設置される
ことを特徴とする送液装置。
請求項３記載の送液装置であって、
前記制御部は、前記第２供給弁と、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁を開放して前記ポンプを正逆動作させることにより、前記第２液体保持部の前記第２液体を撹拌する
ことを特徴とする送液装置。
請求項１記載の送液装置であって、
前記第１液体保持部と前記第２液体保持部はそれぞれ液体ボトルで構成され、前記液体ボトルの径と、前記液体ボトルから前記第１液体と前記第２液体を排出する前記第１供給管と前記第２供給管の径の比は１０倍以下である
ことを特徴とする送液装置。
請求項１記載の送液装置であって、
前記第１液体保持部と前記第２液体保持部はそれぞれ液体ボトルで構成され、前記液体ボトルの底面部分は三角錐の形状を有する
ことを特徴とする送液装置。
請求項１記載の送液装置であって、
前記第１液体保持部の前記第１液体と、前記第２液体保持部の前記第２液体の重量をそれぞれ検知する重量センサを備え、
前記制御部は、前記重量センサの出力に従い前記ポンプを制御する
ことを特徴とする送液装置。
細胞培養装置であって、
恒温槽と、前記恒温槽内に配置される培養容器と、前記培養容器への液体の送液と排液を行う送液装置と、前記恒温槽と前記送液装置を制御する制御部とを備え、
前記送液装置は、
第１液体を保持する第１液体保持部と、細胞を含む第２液体を保持する第２液体保持部と、前記第１液体保持部と前記第２液体保持部との間に接続されるポンプと、前記培養容器に液体を供給する液体供給管と、前記第１液体を前記ポンプ経由で前記液体供給管に供給する第１供給管と、前記第２液体保持部からの加圧送液で前記第２液体を前記液体供給管に供給する第２供給管を有し、
前記制御部は前記ポンプを加圧送液とは逆の吸引条件で稼働させることにより前記第２液体を撹拌させる、
こと特徴とする細胞培養装置。
請求項９記載の細胞培養装置であって、
前記第２液体保持部に気体を導入する気体導入弁を有し、
前記気体導入弁は、前記第１液体保持部と前記ポンプの間の前記第１供給管に接続される第１気体導入弁と、前記ポンプと前記培養容器の間の前記第１供給管と前記第２液体保持部の間に接続される第２気体導入弁からなる、
ことを特徴とする細胞培養装置。
請求項１０記載の細胞培養装置であって、
前記ポンプと前記培養容器の間の前記第１供給管を開閉する第１供給弁と、
前記第２液体保持部と前記培養容器の間の前記第２供給管を開閉する第２供給弁と、を備え、
前記制御部は、前記ポンプと、前記第１供給弁と、前記第２供給弁と、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁を制御する
ことを特徴とする細胞培養装置。
請求項１１記載の細胞培養装置であって、
前記制御部は、
前記第１供給弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記第１液体保持部から前記第１供給管を介して前記第１液体を前記液体供給管に送液し、前記第１気体導入弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記液体供給管の所定量の前記第１液体を前記培養容器に送液し、
前記第２供給弁と、前記第１気体導入弁と、前記第２気体導入弁を開放して前記ポンプを動作させることにより、前記第２液体保持部から前記第２供給管を介して前記第２液体を前記液体供給管に送液し、前記第２供給弁と前記第２気体導入弁を閉止した後、前記第１供給弁を開放して、前記ポンプを動作させることにより、前記液体供給管の所定量の前記第２液体を前記培養容器に送液する
ことを特徴とする細胞培養装置。