JP6880554B2 - Mold detection carrier, mold detection method, and mold detection kit - Google Patents
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Description
本発明は、耐熱性カビを検出するためのカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットに関する。 The present invention relates to a mold detection carrier for detecting heat-resistant mold, a mold detection method, and a mold detection kit.
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの検査では、一般的に、環境中からカビを採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
In recent years, in food manufacturing sites, clinical sites, agricultural sites, cultural property protection environments, etc., it has been possible to inspect the presence of microorganisms such as molds to confirm their safety and soundness and prevent their reproduction. It has become important.
In such a mold test, generally, the mold is collected from the environment, pre-cultured, and then cultured in the optimum medium for each bacterial species for about 20 days, and then the morphological characteristics are observed. Therefore, a morphological observation method (culture method) for identifying mold is performed (see Patent Document 1).
しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査、農業現場での植物病害診断など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。 However, this method has a problem that the inspection process becomes complicated because it is necessary to separate and culture each mold species. In addition, since it takes a long time to culture, there is a problem that it is not suitable for inspections that require quickness, such as indoor inspections in which humans live, food inspections, and plant disease diagnosis at agricultural sites. .. Furthermore, there is also a problem that labor may be wasted because identification cannot be performed unless spores representing morphological characteristics are formed.
また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取したカビを培養した後、培養されたカビからＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いる方法などが提案されている（特許文献２、３参照）。 Recently, an identification method using a gene has also been performed in the examination of mold. For example, after culturing a mold collected from the environment, DNA is extracted from the cultured mold, the target region is amplified by the PCR (polymerase chain reaction) method or the like, and the amplification product is analyzed in the environment. Molds have been identified. As a method for analyzing the amplification product, a method of analyzing the size of the amplification product by electrophoresis and a method of using a DNA chip on which a probe that complementarily binds to the amplification product is immobilized have been proposed (Patent Document 2). 3, 3).
ＤＮＡチップを用いる場合は、まず検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域に特異的に結合するプローブを作成して、ＤＮＡチップに固定化する。そして、環境もしくは製品や植物の検体中から採取したカビを培養して、カビのＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などによりカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅する。さらに、その増幅産物をＤＮＡチップに滴下して、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、増幅産物に含まれる標識の蛍光強度等を測定することでカビを検出する。
ところで、環境中の検出対象のカビには様々な種類があるため、１個のＤＮＡチップにより複数のカビを同時に検出できることが望ましい。そのためには、ＤＮＡチップ上に複数のカビから選択されたプローブを固定化する必要がある。
When using a DNA chip, first, a probe that specifically binds to a target region in the DNA of the mold to be detected is prepared and immobilized on the DNA chip. Then, the mold collected from the environment or the sample of the product or plant is cultured, the DNA of the mold is extracted, and the target region in the DNA of the mold is amplified by the PCR method or the like. Further, the amplification product is dropped onto a DNA chip, the amplification product is hybridized with a probe, and the fluorescence intensity of the label contained in the amplification product is measured to detect mold.
By the way, since there are various types of molds to be detected in the environment, it is desirable that a single DNA chip can detect a plurality of molds at the same time. For that purpose, it is necessary to immobilize a probe selected from a plurality of molds on the DNA chip.
一方、プローブにハイブリダイズさせる標的領域の増幅産物は、所定のプライマーセットを用いてＰＣＲ法などにより得られるが、カビの種類によっては、単一の標的領域のみでは偽陽性反応が生じやすいものがあるため、複数のプライマーセットにより、複数の標的領域を同時に増幅させることが望ましい場合がある。また、培養したカビを個別に増幅させるのではなく、複数種類のカビを同時に増幅し、これら複数種類のカビから選択されたプローブを固定化したＤＮＡチップによるカビの検出を行えば、検査の迅速性は向上する。
しかしながら、複数の標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プローブにもより高い精度で機能するものが求められる。また、同時に増幅させる検出対象のカビの数が増加すれば、プローブに要求される精度は一層高くなる。
On the other hand, the amplification product of the target region to hybridize to the probe can be obtained by the PCR method or the like using a predetermined primer set, but depending on the type of mold, a false positive reaction is likely to occur with only a single target region. Therefore, it may be desirable to simultaneously amplify multiple target regions with multiple primer sets. In addition, instead of amplifying the cultured molds individually, if multiple types of molds are simultaneously amplified and the molds are detected by a DNA chip on which a probe selected from these multiple types of molds is immobilized, the test can be expedited. Gender improves.
However, when performing multiplex PCR that simultaneously amplifies a plurality of target regions, a probe that functions with higher accuracy is required. Further, as the number of molds to be detected to be amplified at the same time increases, the accuracy required for the probe becomes higher.
本発明者らは、耐熱性カビである、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の１１種類を検出対象のカビとし、これらを検出可能なカビ検出用担体を作成するために鋭意研究を行った。
これら複数種類のカビのそれぞれのＤＮＡにおける特定の標的領域のうち、それぞれのカビにのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類のカビには結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上、各プローブによりこれら複数種類のカビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
The present inventors are heat-resistant molds, Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, Thermoascus crustaceus, Thermoascus.・ Aurorascus aurantiacus, Thermoascus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora crassa, Emericella nidulans, Talaromyces flavus Eleven types of flavus) and Talaromyces bacillisporus were used as detection target molds, and intensive studies were conducted to prepare a mold detection carrier capable of detecting these types.
Of the specific target regions in the DNA of each of these multiple types of molds, a probe is selected by selecting a base sequence that has a base sequence that specifically binds only to each mold and does not bind to other types of molds. In theory, it is possible to specifically detect these multiple types of molds with each probe.
しかし、実際にはこのようにして得られたプローブであっても有効に機能するとは限らない。このため、各プローブを作成するためには、実験によってプローブの効果を確認しつつ、試行錯誤を繰り返すことによって、有効に機能するプローブを見いだすことが必要であった。 However, in reality, even the probe obtained in this way does not always function effectively. Therefore, in order to prepare each probe, it was necessary to find a probe that functions effectively by repeating trial and error while confirming the effect of the probe by experiment.
ここで、ムーコル・ラセモサスとリクテイミア・コリムビフェラを検出するためのプローブが特許文献４に記載されている。また、モナスカス・ルバー、ニューロスポラ・クラッサのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献５に記載されており、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラスのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献６に記載されており、タラロマイセス・フラバス、タラロマイセス・バチリスポラスのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセット等が特許文献７に記載されている。
しかしながら、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの１１種類のカビを、それぞれ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを固定化したカビ検出用担体は知られていない。
Here,
However, Mucol Lasemosas, Liquitimia colimbifera, Monascus ruber, Thermoscus clusterseus, Thermoscus aurantiacas, Thermoscus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora Classa, Emerisera Nidurance, Talaromyces -There is no known mold detection carrier on which a probe capable of specifically detecting 11 types of molds of Flavas and Talaromyces bacilli sporas with high accuracy and specificity is immobilized.
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの１１種類のカビを、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能なカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a heat-resistant mold, Mucol Lasemosas, Lictimia corimbifera, Monascus ruber, Thermoscus clusterseus, Thermoscus aurantiacas, Thermoscus. A mold detection carrier and mold that can detect 11 types of molds, Thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora Classa, Emerisera Nidurance, Talalomyces flavus, and Talalomyces bacillisporus, quickly, accurately and specifically. It is an object of the present invention to provide a method for detecting mold and a kit for detecting mold.
上記目的を達成するため、本発明のカビ検出用担体は、以下の（a）乃至（ｇ）に記載の塩基配列からなる第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体としてある。
（ａ）ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１、２及び４に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
（ｂ）リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
（ｃ）モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
（ｄ）サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
（ｅ）サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
（ｆ）サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、並びに、
（ｇ）ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群。
In order to achieve the above object, the mold detection carrier of the present invention is composed of two or more probe groups selected from the first to seventh probe groups consisting of the base sequences described in (a) to (g) below. It is a carrier for mold detection, which comprises immobilizing a probe and simultaneously detecting two or more molds to be detected.
(A) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 4 selected from the ITS region for detecting Mucor racemosus, and a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. First probe group consisting of at least one of
(B) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 selected from the ITS region for detecting Lichtheimia corymbifera, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A second probe group consisting of either,
(C) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 9 selected from the ITS region for detecting Monascus ruber, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A third probe group consisting of either,
(D) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 to 11 selected from the ITS region for detecting Thermoascus crustaceus, and a nucleotide sequence complementary to the probe. A fourth probe group consisting of at least one of the probes,
(E) A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 selected from the ITS region for detecting Thermoascus aurantiacus, and a probe consisting of a base sequence complementary to the probe. Fifth probe group consisting of at least one of
(F) At least a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 selected from the ITS region for detecting Thermoascus thermophilus, and a probe having a base sequence complementary to the probe. A sixth probe group consisting of either, and
(G) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 15 selected from the ITS region for detecting Nigrospora oryzae, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A seventh probe group consisting of either.
また、本発明のカビ検出用担体は、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ａ）乃至（ｇ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。 Further, the mold detection carrier of the present invention may be configured to immobilize the probes of the first to seventh probe groups and simultaneously detect the mold to be detected according to the above (a) to (g). preferable.
また、本発明のカビ検出用担体は、以下の（ｈ）乃至（ｋ）に記載の塩基配列からなる第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体としてある。
（ｈ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
（ｉ）エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
（ｊ）タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、並びに、
（ｋ）タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群。
In addition, the mold detection carrier of the present invention immobilizes probes of two or more probe groups selected from the eighth to eleventh probe groups consisting of the base sequences described in the following (h) to (k). , A carrier for detecting mold, which is characterized by simultaneously detecting two or more molds to be detected.
(H) From a probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 17 selected from the β-tubulin gene for detecting Neurospora crassa, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Eighth probe group consisting of at least one of the probes,
(I) From a probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 19 selected from the β-tubulin gene for detecting Emmericella nidulans, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Ninth probe group consisting of at least one of the probes,
(J) A probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces flavus, and a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A tenth probe group consisting of at least one, and
(K) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 22 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces bacillisporus, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Eleventh probe group consisting of at least one of the probes.
また、本発明のカビ検出用担体は、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ｈ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。
また、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブ、及び、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ａ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。
Further, the mold detection carrier of the present invention has a configuration in which the probes of the eighth to eleventh probe groups are immobilized and the mold to be detected according to the above (h) to (k) is simultaneously detected. Is preferable.
Further, the probes of the first to seventh probe groups and the probes of the eighth to eleventh probe groups are immobilized, and the mold to be detected according to the above (a) to (k) is simultaneously detected. It is preferable that the configuration is such that
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてＩＴＳ領域を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、及びニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。 Further, the mold detection method of the present invention is a mold detection method including a step of amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product, and the mold detection method includes ITS as the target region. Using the region, the reaction solution for PCR contains a primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a sample. Then, the sample was used as Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, Thermoascus crustaceus, Thermoascus orantiaceus. If at least one of the DNAs of aurantiacus, Thermoascus thermophilus, and Nigrospora oryzae is contained, the reaction solution for PCR is used and contained in the sample. The target region in DNA is amplified, and the obtained amplification product is subjected to the above-mentioned mold detection carrier , the above-mentioned first to the above, to which the probes of two or more probe groups selected from the above-mentioned first to seventh probe groups are immobilized. A complementary base is added dropwise to the mold detection carrier on which the probe of the seventh probe group is immobilized, or the mold detection carrier on which the probes of the first to eleventh probe groups are immobilized. There is a method of binding with a probe having a sequence.
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。 Further, the mold detection method of the present invention is a mold detection method including a step of amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product, and β as the target region. -A primer set for amplifying the β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 in a reaction solution for PCR using the tuberin gene. And a sample, and the sample contains at least one of Neurospora crassa, Emericella nidulans, Talaromyces flavus, and Talaromyces bacillisporus. When the above-mentioned DNA is contained, the target region in the DNA contained in the sample is amplified by using the reaction solution for PCR, and the obtained amplification product is used as the eighth to eleventh probe group. The mold detection carrier on which the probes of two or more probe groups selected from the above are immobilized, the mold detection carrier on which the probes of the eighth to eleventh probe groups are immobilized, or the first to the first to the above. This is a method in which the probe of the eleventh probe group is dropped onto the immobilized carrier for detecting mold and bound to a probe having a complementary base sequence.
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてＩＴＳ領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crusta
ceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
Further, the method for detecting mold of the present invention is a method for detecting mold including a step of amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product, and ITS is used as the target region. A primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 in a PCR reaction solution using a region and a β-tubulin gene. , And a primer set for amplifying the β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 and a sample. In addition, Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, Thermoascus crusta
ceus, Thermoascus aurantiacus, Thermoascus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora crassa, Emericella nidulans , Talaromyces flavus, and Talaromyces bacillisporus, if at least one of the DNAs is contained, the PCR reaction solution is used to target the target region in the DNA contained in the sample. The obtained amplification product is used as a probe of one or more probe groups selected from the first to seventh probe groups and one or more probes selected from the eighth to eleventh probe groups. group of probes immobilized fungal detection carrier, or, the first through eleventh probe group of the probe is added dropwise to immobilized the mold detection carrier, the probe having a complementary base sequence There is a way to combine with.
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。 Further, the mold detection kit of the present invention is a mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed. The carrier includes a primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28. The mold detection carrier on which the probes of two or more probe groups selected from the first to seventh probe groups are immobilized, and the mold detection on which the probes of the first to seventh probe groups are immobilized. The carrier or the carrier for detecting mold is configured in which the probes of the first to eleventh probe groups are immobilized.
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。 Further, the mold detection kit of the present invention is a mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed. The primer set includes a primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30. The carrier is the mold detection carrier on which the probes of two or more probe groups selected from the eighth to eleventh probe groups are immobilized, and the probes of the eighth to eleventh probe groups are immobilized. The above-mentioned carrier for detecting mold or the above-mentioned carrier for detecting mold is configured in which the probes of the first to eleventh probe groups are immobilized.
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。 Further, the mold detection kit of the present invention is a mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed. The primer set includes a primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, and SEQ ID NO: 29. The carrier includes a primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown and a reverse primer consisting of the reverse primer shown in SEQ ID NO: 30, and the carrier is from the first to seventh probe groups. selected one or more probe group of probes and the eighth to eleventh probes immobilized fungal detection carrier for one or more probe group selected from probe groups, or, the first through tenth The probe of one probe group is an immobilized carrier for detecting mold.
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「プローブ群」は、プローブの集合を意味しており、複数のプローブからなる場合のみを意味するものではなく、一のプローブからなるものを含めてプローブ群と称している。 In the present specification and claims, the "probe group" means a set of probes, and does not mean only the case of a plurality of probes, but includes the one consisting of one probe. It is called a probe group.
本発明によれば、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、又はタラロマイセス・バチリスポラスを、精度高く特異的かつ多重で検出することが可能となる。 According to the present invention, the heat-resistant molds Mucol Lasemosas, Liquitemia corimbifera, Monascus ruber, Thermoscus clusterseus, Thermoscus aurantiacas, Thermoscus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora crassa, Emericella nidulans, Talaromyces flavus, or Talaromyces Bachirisuporasu, it is possible to detect with accuracy higher specific and multiplexing.
以下、本発明のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, a carrier for detecting mold, a method for detecting mold, and an embodiment of a kit for detecting mold of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments and examples described later.
［カビ検出用担体］
（検出対象カビ）
本実施形態のカビ検出用担体により検出する対象のカビは、耐熱性カビである、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の１１種類である。また、これらに、同じく耐熱性カビである、ペシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、ビソクラミス・ゾラニアエ（Byssochlamys zollerniae）を加えた１３種類とすることも好ましい。
[Mold detection carrier]
(Mold to be detected)
The molds to be detected by the mold detection carrier of the present embodiment are heat-resistant molds such as Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, and Thermoscus ruber. Clusterseus (Thermoascus crustaceus), Thermoascus aurantiacus, Thermoascus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora crassa, Emericella durance (Emericella nidulans), Talaromyces flavus, and Talaromyces bacillisporus. Further, it is also preferable to add 13 types of molds, which are also heat-resistant molds, Paecilomyces variotii and Byssochlamys zollerniae.
これらの耐熱性カビは、例えば子嚢胞子のような耐熱性の高い構造を形成し、７５℃で３０分間の加熱処理を行っても生残することができる。耐熱性カビは、低温殺菌では完全な殺滅が困難であることから、食品や環境中においてこれらのカビの存在の有無を確認可能にすることが望ましい。 These heat-resistant molds form highly heat-resistant structures such as ascospores and can survive heat treatment at 75 ° C. for 30 minutes. Since it is difficult to completely kill heat-resistant molds by pasteurization, it is desirable to be able to confirm the presence or absence of these molds in foods and the environment.
（プローブ）
本実施形態の対象カビを検出するためのプローブは、図１〜図２に示す配列番号１〜２２によりそれぞれ特定される塩基配列からなる核酸断片である。
(probe)
The probe for detecting the target mold of the present embodiment is a nucleic acid fragment consisting of the base sequences specified by SEQ ID NOs: 1 to 22 shown in FIGS. 1 to 2.
配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブは、ムーコル・ラセモサスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is a probe selected from the ITS region for detecting Mucol lasemosas.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 is a probe selected from the ITS region for detecting Liquitimia colimbifera.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 9 is a probe selected from the ITS region for detecting Monascus ruber.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 to 11 is a probe selected from the ITS region for detecting Thermoscus clusterseus.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 is a probe selected from the ITS region for detecting Thermoscus orrantiacus.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is a probe selected from the ITS region for detecting Thermoscus thermophilus.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 15 is a probe selected from the ITS region for detecting nigrospora oryzae.
配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブは、ニューロスポラ・クラッサを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 17 is a probe selected from the β-tubulin gene for detecting neurospora classa.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 19 is a probe selected from the β-tubulin gene for detecting emerisera nidurance.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 is a probe selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces flavus.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 22 is a probe selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces bacillispulus.
また、図２に示す配列番号２３に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２４〜２５に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。本実施形態のカビ検出用担体において、これらのプローブを固定化しても良い。 Further, the probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 shown in FIG. 2 is a probe selected from the ITS region for detecting Talaromyces bacillispirus, and the probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 24 to 25 is A probe selected from the β-tubulin gene for detecting pesilomyces variotti, and a probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 is selected from the β-tubulin gene for detecting Bisoclamis zolaniae. It is a probe. These probes may be immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment.
本実施形態のカビ検出用担体では、上記の通り、プローブとして、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子から選択されたものを用いている。
具体的には、図１に示すムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの７種類については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
また、図２に示すニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの４種類については、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
In the mold detection carrier of the present embodiment, as described above, a probe selected from the ITS region and / or the β-tubulin gene in the genomic DNA of the mold is used.
Specifically, the seven types shown in Fig. 1 are Mucol Lasemosas, Liquitimia corimbifera, Monascus ruber, Thermoscus clusterseus, Thermoscus aurantiacas, Thermoscus thermophilus, and Nigrospora oryzae. , The specificity of the probe selected from the ITS region is high, and false positive reactions are relatively unlikely to occur. Therefore, when a positive reaction is obtained with these probes, it can be determined that the mold is present. ..
In addition, for the four types shown in FIG. 2, Neurospora classa, Emerisera nidurance, Talaromyces flavus, and Talaromyces bacillisporus, the probe selected from the β-tubulin gene has high specificity and false positive reactions occur. Since it is relatively unlikely to occur, it can be determined that the mold is present when a positive reaction is obtained with these probes.
なお、図２に示すタラロマイセス・バチリスポラスについては、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２３に示す塩基配列からなるプローブも、当該カビの存否の判定に用いることができる。また、同図に示すペシロマイセス・バリオッティ、ビソクラミス・ゾラニアエの２種類についても、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。 Regarding the taralomyces bacillispulus shown in FIG. 2, a probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 selected from the ITS region can also be used for determining the presence or absence of the mold. In addition, regarding the two types of Paecilomyces bariotti and Bisoclamis zoraniae shown in the figure, if a positive reaction is obtained with a probe selected from the β-tubulin gene, it is determined that the mold is present. be able to.
（プローブの合成）
本実施形態のカビ検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも１８〜３０塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例でカビ検出用担体に固定化した配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーも１９〜２６塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
(Probe synthesis)
Each of the above probes immobilized on the carrier for detecting mold of the present embodiment has a length of about 18 to 30 bases and can be synthesized by a general DNA synthesizer. As the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 immobilized on the carrier for detecting mold in the examples described later, those synthesized by a DNA synthesizer were used. The primers consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 27 to 30 used for PCR in the examples described later also had a length of about 19 to 26 bases, and those synthesized by a DNA synthesizer were used.
また、本実施形態における配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜２６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜２６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブを用いることもできる。 Further, the probe consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 in the present embodiment is not limited to the sequence itself, and one or several bases are deleted, substituted or deleted in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26. An added probe can be used. It is also possible to use a probe capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26. Further, these probes and probes having a base sequence complementary to the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 can also be used.
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。 The stringent condition means a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, a DNA having high homology (homology of 90% or more, preferably 95% or more) with respect to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. Conditions for hybridizing with a DNA having a different base sequence can be mentioned. Usually, it refers to the case where hybridization occurs at a temperature of about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C. lower than the dissolution temperature (Tm) of the complete hybrid. For stringent conditions, see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), in particular, Section 11.45, "Conditions for Hybrid."
なお、図３に示す配列番号２７〜３０の塩基配列からなる各プライマー（配列番号２７及び２８のプライマーセット、配列番号２９及び３０のプライマーセットにおける各プライマー）についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号２７〜３０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号２７〜３０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対して特異的にアニーリングできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。 Similarly, each primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 27 to 30 shown in FIG. 3 (primer sets of SEQ ID NOs: 27 and 28 and each primer in the primer sets of SEQ ID NOs: 29 and 30) is also limited to the sequence itself. However, when one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NOs: 27 to 30, and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NOs: 27 to 30 is used. Those capable of amplifying the same region can also be used. Further, it is a primer composed of a nucleic acid fragment that can be specifically annealed to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NOs: 27 to 30, and is derived from the base sequence shown in SEQ ID NOs: 27 to 30. It is also possible to use a primer capable of amplifying the same region as when the primer is used.
（カビ検出用担体の作成）
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
(Creation of carrier for mold detection)
The carrier for detecting mold of the present embodiment can be produced by an existing general method using a probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26.
For example, when a paste-type DNA chip is prepared as a carrier for detecting mold of the present embodiment, the probe is immobilized on a glass substrate by a DNA spotter to form a spot corresponding to each probe. be able to. Further, when a synthetic DNA chip is produced, it can be produced by synthesizing a single-stranded oligo DNA having the above sequence on a glass substrate by photolithography technology. Further, the substrate is not limited to glass, and a plastic substrate, a silicon wafer, or the like can be used. Further, the shape of the substrate is not limited to a flat plate shape, and various three-dimensional shapes can be used, and a substrate having a functional group introduced so as to enable a chemical reaction can be used. ..
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。また、本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部を固定化したものとすることも、配列番号１〜２６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもできる。
さらに、本実施形態のカビ検出用担体は、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることができる。
The mold detection carrier of the present embodiment may have all or a part of the probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 immobilized therein. Further, the mold detection carrier of the present embodiment is assumed to have all or a part of the probe in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 immobilized therein. Also, all or part of the probe capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1-26 shall be immobilized. It is also possible to immobilize all or part of these probes or probes having a base sequence complementary to the probes having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26.
Further, in the mold detection carrier of the present embodiment, a probe for detecting mold in each group is immobilized on each group of probes selected from the ITS region and probes selected from the β-tubulin gene. Can be assumed to be.
［カビの検出方法］
本実施形態のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、上記のＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び／又は、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に検出対象のカビの少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、ＰＣＲ用反応液を使用して、試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を上述したカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させる方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば（１）カビの採取、（２）ＤＮＡの抽出、（３）標的領域の増幅、及び（４）増幅産物の確認を含むものとすることができる。
[Mold detection method]
The mold detection method of the present embodiment is a mold detection method including a step of amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product, and amplifies the target region. In the PCR reaction solution for this purpose, a primer set for amplifying the above-mentioned ITS region and / or a primer set for amplifying the β-tubulin gene and a sample are contained in the sample, and the mold to be detected is contained in the sample. When at least one of the DNAs of the above is contained, the reaction solution for PCR is used to amplify the target region in the DNA contained in the sample, and the obtained amplification product is added dropwise to the above-mentioned mold detection carrier. The method may be any method in which the amplification product is bound to a probe having a complementary base sequence, and is not limited to the specific embodiments and configurations of the examples. It can include 2) extraction of DNA, (3) amplification of the target region, and (4) confirmation of the amplification product.
（１）カビの採取
例えば空中浮遊カビを採取する場合、検査対象の環境中における室内又は屋外の空気を採取する。そして、採取した空気を専用培地に吹き付けて、空気中に含まれるカビの培養を行う。培地としては、所定の寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
次に、ストリップにおいて培養されたカビのコロニーを、コロニー毎に個別に採取し、又は二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。
例えば植物検体のカビを採取する場合、ハサミやカッターなどを用いて、検査対象の罹病組織片あるいは健全組織片を採取する。そして採取した植物組織片を次亜塩素酸やエタノールで表面殺菌後、専用培地に置床して、植物組織中に含まれるカビの培養を行う。培養条件としては、２０℃〜２５℃の範囲内で６５時間以上静置することが好ましい。
(1) Collection of mold For example, when collecting airborne mold, indoor or outdoor air in the environment to be inspected is collected. Then, the collected air is blown onto a special medium to culture the mold contained in the air. As the medium, it is preferable to use a predetermined agar medium or the like in a strip shape for an air sampler. As the culture conditions, it is preferable to leave the cells at 25 ° C. in a dark place for 65 hours or more.
Next, the mold colonies cultured on the strip are collected individually for each colony, or two or more colonies are collected together, and the colonies are frozen with liquid nitrogen or the like to freeze the mold cells contained in the colonies. Crush.
For example, when collecting mold from a plant sample, a diseased tissue piece or a healthy tissue piece to be inspected is collected using scissors or a cutter. Then, after surface sterilizing the collected plant tissue pieces with hypochlorous acid or ethanol, the collected plant tissue pieces are placed on a special medium to culture the mold contained in the plant tissue. As the culture conditions, it is preferable to leave the cells in the range of 20 ° C. to 25 ° C. for 65 hours or more.
（２）ＤＮＡの抽出
次に、このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
また土壌中から直接カビのＤＮＡを抽出することもできる。ＤＮＡの抽出は直接溶菌法（Direct Lysis Method）による方法や土壌ＤＮＡ抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
(2) Extraction of DNA Next, genomic DNA is extracted from the crushed mold cells thus obtained. Genomic DNA can be extracted by a general method such as a method by the CTAB method (Cetyl trimethyl ammonium bromide) or a method using a DNA extraction device.
It is also possible to extract mold DNA directly from the soil. DNA extraction can be performed by a general method such as a method by a direct lysis method or a method using a soil DNA extraction kit.
（３）標的領域の増幅
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態のカビの検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各種カビの標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
(3) Amplification of target region Next, the target region in the extracted genomic DNA is amplified. That is, it amplifies a DNA fragment containing a target region in genomic DNA. The method for amplifying the target region is not particularly limited, but the PCR method can be preferably used. In the PCR method, the target region is amplified by using a PCR reaction solution containing a primer set for amplifying the target region. As the PCR device, a general thermal cycler or the like can be used.
In the mold detection method of the present embodiment, for example, by performing PCR under the following reaction conditions, the target regions of various molds can be suitably amplified.
(A) 95 ° C. 10 minutes, (b) 95 ° C. (DNA denaturation step) 30 seconds, (c) 56 ° C. (annealing step) 30 seconds, (d) 72 ° C. (DNA synthesis step) 60 seconds ((b) ~ (D) for 40 cycles), (e) 72 ° C. for 10 minutes
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）など）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。 As the reaction solution for PCR, for example, it is preferable to use a reaction solution having the following composition. That is, nucleic acid synthesis substrate (dNTP mixture (dCTP, dATP, dTTP, dGTP), etc.), primer set, nucleic acid synthase (Nova Taq HotStart DNA polymerase, etc.), fluorescent labeling reagent (Cy5-dCTP, etc.), genomic DNA of sample, buffer. A solution and a PCR reaction solution containing water as the remaining component can be preferably used. As the buffer solution, for example, Ampdirect (registered trademark) (manufactured by Shimadzu Corporation) can be used.
本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅が行われる。
このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図３に示す配列番号２７及び２８の塩基配列からなるもの（配列番号２７：フォワードプライマー、配列番号２８：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
また、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、同図に示す配列番号２９及び３０の塩基配列からなるもの（配列番号２９：フォワードプライマー、配列番号３０：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
In this embodiment, the DNA fragment is amplified by targeting the ITS region and / or the β-tubulin gene in the genomic DNA of the mold as a target region.
At this time, as a primer set for amplifying the ITS region, it is preferable to use one consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 27 and 28 shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 27: forward primer, SEQ ID NO: 28: reverse primer). ..
As a primer set for amplifying the β-tubulin gene, a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 29 and 30 shown in the figure (SEQ ID NO: 29: forward primer, SEQ ID NO: 30: reverse primer) should be used. Is preferable.
（４）増幅産物の確認
次に、増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下し、このカビ検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているカビを特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（登録商標）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比（Signal to Noise ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
(4) Confirmation of Amplification Product Next, the amplification product is dropped onto the mold detection carrier of the present embodiment, and the label of the amplification product hybridized to the probe immobilized on the mold detection carrier is detected. Check for the presence of amplification products. This makes it possible to identify the mold existing in the environment to be inspected.
The label can be detected by using a general label detection device such as a fluorescence scanning device, for example, by measuring the fluorescence intensity of the amplified product using BIOSHOT (registered trademark) of Toyo Kohan Co., Ltd. be able to. The measurement result is preferably obtained as an S / N ratio (Signal to Noise ratio) value. This is because it is possible to accurately determine whether the measurement result is positive or negative based on the S / N ratio value, and generally, when the S / N ratio value is 3 or more, it is determined to be positive. Can be done. The S / N ratio value described in the present specification is calculated by (median fluorescence intensity value-background value) ÷ background value. The label is not limited to fluorescence, and other labels may be used.
［カビ検出用キット］
本実施形態のカビ検出用キットには、カビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定されたカビ検出用担体とが含まれる。本実施形態のカビ検出用キットは、プライマーセットを用いて増幅された増幅産物をカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
プライマーセット及びカビ検出用担体は、上述したＩＴＳ領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれ以下の構成とすることができる。
[Mold detection kit]
The mold detection kit of the present embodiment includes a primer set for amplifying a nucleic acid fragment containing a target region in mold DNA and a mold detection carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed. included. The mold detection kit of the present embodiment detects mold by dropping an amplification product amplified using a primer set onto a mold detection carrier and binding the amplification product to a probe having a complementary base sequence. Used for
The primer set and the carrier for detecting mold can have the following configurations for each group of probes selected from the above-mentioned ITS region and probes selected from the β-tubulin gene.
ＩＴＳ領域から選択されたプローブのグループ：
検出対象のカビが、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
Group of probes selected from the ITS area:
Primer if the mold to be detected is at least one of Mucol Lasemosas, Liquitimia colimbifera, Monascus ruber, Thermoscus clusterseus, Thermoscus aurantiacas, Thermoscus thermophilus, Nigrospora oryzae. As the set, it is preferable to use a primer set including a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 for amplifying the ITS region.
また、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、並びに、
ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
Specifically, the carrier for detecting mold preferably has the following configuration.
A first probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 selected from the ITS region for detecting Mucor racemosus.
A second probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 selected from the ITS region for detecting Lichtheimia corymbifera,
A third probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 9 selected from the ITS region for detecting Monascus ruber,
A fourth probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 to 11 selected from the ITS region for detecting Thermoascus crustaceus.
A fifth probe group consisting of probes consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 selected from the ITS region for detecting Thermoascus aurantiacus,
A sixth probe group consisting of probes consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 selected from the ITS region for detecting Thermoascus thermophilus, and
Mold detection in which the probe of the seventh probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 15 selected from the ITS region for detecting Nigrospora oryzae is immobilized. For carrier.
β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ：
検出対象のカビが、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、β-チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
Group of probes selected from the β-tubulin gene:
When the mold to be detected is at least one of Neurospora Classa, Emerisera Nidurance, Talaromyces flavus, and Talaromyces bacilisporus, the primer set is SEQ ID NO: 29 for amplifying the β-tubulin gene. It is preferable to use a primer set including a forward primer consisting of the base sequence shown and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.
また、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。
ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
Specifically, the carrier for detecting mold preferably has the following configuration.
Eighth probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 17 selected from the β-tubulin gene for detecting Neurospora crassa,
A ninth probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 19 selected from the β-tubulin gene for detecting Emmericella nidulans,
A tenth probe group consisting of a probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces flavus, and a group of tenth probes.
Fix the probe of the eleventh probe group consisting of at least one of the probes consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 22 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces bacillisporus. A carrier for detecting mold.
また、本実施形態のカビ検出用キットとして、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、並びに、β-チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いると共に、上記全ての群のプローブを固定化したカビ検出用担体を用いることも好ましい。 Further, as the mold detection kit of the present embodiment, a primer set including a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 for amplifying the ITS region, and a primer set. A primer set including a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 for amplifying the β-tubulin gene is used, and the probes of all the above groups are fixed. It is also preferable to use a modified carrier for detecting mold.
本実施形態のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットによれば、上記１１種類の耐熱性カビを特異的に識別できるプローブを用いることにより、これらのカビを適切に検出することができる。このため、本実施形態により、カビの存否を確認するための環境検査等において、これらのカビを迅速かつ精度高く検出することが可能となる。 According to the mold detection carrier, the mold detection method, and the mold detection kit of the present embodiment, these molds are appropriately detected by using a probe capable of specifically identifying the above 11 types of heat-resistant molds. be able to. Therefore, according to the present embodiment, it is possible to detect these molds quickly and with high accuracy in an environmental inspection or the like for confirming the presence or absence of molds.
以下、本発明の実施形態に係るカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの実施例の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。 Hereinafter, a test conducted for confirming the effects of the mold detection carrier, the mold detection method, and the examples of the mold detection kit according to the embodiment of the present invention will be specifically described.
［試験１］
カビ検出用担体としては、ジーンシリコン（登録商標）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１〜２に示される配列番号１〜２６のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
[Test 1]
As the mold detection carrier, Gene Silicon (registered trademark) (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used, and the probes of SEQ ID NOs: 1 to 26 shown in FIGS. Each probe used was synthesized by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd. In addition, each probe was immobilized on a substrate by a microarray.
検出対象のカビとしては、独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）及び独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から入手した菌株を使用した。具体的には、以下の１３種類のカビにつき、１３種類の菌株を使用した。 The molds to be detected were obtained from the Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center, and the NITE Biological Resource Center, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation. The strain was used. Specifically, 13 types of strains were used for the following 13 types of mold.
（１）ムーコル・ラセモサス NBRC4555
（２）リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
（３）モナスカス・ルバー NBRC4483
（４）サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
（５）サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（７）ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
（８）ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
（９）エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
（１０）タラロマイセス・フラバス NBRC7232
（１１）タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
（１２）ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
(1) Mucol Racemosus NBRC4555
(2) Rictemia Kolim Bifera NBRC4009
(3) Monascus Luber NBRC4483
(4) Thermo Asuka Clusterseus NBRC9129
(5) Thermo Asuka Aurantiakas NBRC6766
(6) Thermo Asuka Thermophilus NBRC9643
(7) Nigrospora Orize NBRC32860
(8) Neurospora Classa NBRC6067
(9) Emerisera Nidurance NBRC4340
(10) Talaromyces flavus NBRC7232
(11) Talaromyces Bachirisporus NBRC31150
(12) Paecilomyces Variotti NBRC100534
(13) Bisoclamis Zoraniae JCM12808
これらのカビを上記菌株毎に培養した。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
さらに、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域又はβ-チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
These molds were cultivated for each of the above strains. Culturing was carried out using PDA medium or M40Y medium in a dark place at 25 ° C. for 7 days.
Further, the cultured mold colonies were collected, individually placed in a vial containing φ0.5 mm zirconia beads, immersed in liquid nitrogen to freeze the sample, and then the mold cells were crushed using a shaking device.
Next, the genomic DNA of the mold was extracted by a DNA extraction device, and the ITS region or β-tubulin gene of each mold was amplified for each strain by the PCR method.
ＰＣＲ用反応液には、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとβ-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットの両方を含有させて、これらの標的領域の増幅反応を行った。
ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとしては、図３に示す配列番号２７の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとしては、同図に示す配列番号２９の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。
The PCR reaction solution contained both the ITS region amplification primer set and the β-tubulin gene amplification primer set, and the amplification reaction of these target regions was carried out.
As the primer set for ITS region amplification, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 shown in FIG. 3 were used. As the β-tubulin gene amplification primer set, a forward primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30 shown in the figure were used. As these primers, those synthesized by Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd. were used.
なお、図１に示すカビについては、ＩＴＳ領域から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができるため、ＰＣＲ用反応液にＩＴＳ領域増幅用プライマーセットを含有させ、β-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを含有させることなく、標的領域の増幅反応を行うようにすることもできる。同様に、図２に示すカビについては、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができるため、ＰＣＲ用反応液にβ-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを含有させ、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットを含有させることなく、標的領域の増幅反応を行うようにすることもできる。 Regarding the mold shown in FIG. 1, when a positive reaction is obtained with the probe selected from the ITS region, it can be determined that the mold is present, so that the ITS region is amplified in the reaction solution for PCR. It is also possible to include the primer set for β-tubulin gene amplification and to carry out the amplification reaction of the target region without containing the primer set for amplifying the β-tubulin gene. Similarly, with respect to the mold shown in FIG. 2, when a positive reaction is obtained with a probe selected from the β-tubulin gene, it can be determined that the mold is present, and thus a reaction solution for PCR. Can also contain a primer set for amplifying the β-tubulin gene, and the amplification reaction of the target region can be carried out without containing the primer set for amplifying the ITS region.
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、１３種類の菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer（配列番号２７）(2.5μM) 1.0μl
６．ITS1-Rv primer（配列番号２８）(2.5μM) 1.0μl
７．BtF primer（配列番号２９）(10μM) 1.0μl
８．BtR primer（配列番号３０）(10μM) 1.0μl
９．Template DNA 1.0μl
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
Ampdirect (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as the reaction solution for PCR, and 20 μl of the following composition was prepared for each of the 13 types of strains.
1. 1. Ampdirect (G / Crich) 4.0 μl
2. Ampdirect (addition-4) 4.0 μl
3. 3. dNTPmix 1.0 μl
4. Cy-5dCTP 0.2 μl
5. ITS1-Fw primer (SEQ ID NO: 27) (2.5 μM) 1.0 μl
6. ITS1-Rv primer (SEQ ID NO: 28) (2.5 μM) 1.0 μl
7. BtF primer (SEQ ID NO: 29) (10 μM) 1.0 μl
8. BtR primer (SEQ ID NO: 30) (10 μM) 1.0 μl
9. Template DNA 1.0 μl
10. NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2 μl
11. Water (water until the whole is 20.0 μl)
上記ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using the above PCR reaction solution, DNA was amplified by a nucleic acid amplification device (TaKaRa PCR Thermal Cycler Disk (registered trademark) manufactured by Gradient Takara Bio Inc.) under the following conditions.
(A) 95 ° C. 10 minutes (b) 95 ° C. 30 seconds (c) 56 ° C. 30 seconds (d) 72 ° C. 60 seconds (40 cycles of (b) to (d))
(E) 72 ° C for 10 minutes
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を算出した。その結果を図４〜図５に示す。
Next, a buffer solution (3 × SSC citric acid-physiological saline + 0.3% SDS) is mixed with the PCR amplification product, heated at 94 ° C. for 5 minutes, and added dropwise to the mold detection carrier (DNA chip). did. The mold detection carrier was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and the PCR product that did not hybridize was washed away from the DNA chip using the above buffer solution.
Then, using a label detection device (BIOSHOT, manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.), the fluorescence intensity (fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) in each probe immobilized on the mold detection carrier was measured, and each was measured. The S / N ratio value in the probe was calculated. The results are shown in FIGS. 4 to 5.
これらの図に示すように、配列番号１〜２６に示される塩基配列をそれぞれ有するプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性と判断できる。したがって、これらのプローブは、ぞれぞれの対象カビを検出するために、有効に機能していることがわかる。 As shown in these figures, the S / N ratio values of the probes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 26 are all 3 or more, and can be judged to be positive. Therefore, it can be seen that these probes are effectively functioning to detect each target mold.
［試験２］
検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
[Test 2]
A test for confirming whether the probe immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment functions effectively when multiplex PCR is performed to simultaneously amplify the target region in the DNA of a plurality of molds to be detected. went.
カビ検出用担体は、試験１と同じものを使用した。また、検出対象のカビも試験１と同じく１３種類のカビについて、１３種類の菌株を使用した。
本試験では、図６に示すように、これらのカビをランダムに５種類ずつ組み合わせ、以下の５つのグループの混合ＤＮＡ試料を作成した。したがって、一部のカビは、複数の試料に重複して含まれている。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
The same carrier for mold detection as in
In this test, as shown in FIG. 6, five types of these molds were randomly combined to prepare a mixed DNA sample of the following five groups. Therefore, some molds are duplicated in a plurality of samples. Culturing was carried out using PDA medium or M40Y medium in a dark place at 25 ° C. for 7 days.
（試料１）
（１）ムーコル・ラセモサス NBRC4555
（４）サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（９）エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
（１１）タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
(Sample 1)
(1) Mucol Racemosus NBRC4555
(4) Thermo Asuka Clusterseus NBRC9129
(6) Thermo Asuka Thermophilus NBRC9643
(9) Emerisera Nidurance NBRC4340
(11) Talaromyces Bachirisporus NBRC31150
（試料２）
（２）リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
（５）サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
（８）ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
（１０）タラロマイセス・フラバス NBRC7232
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
(Sample 2)
(2) Rictemia Kolim Bifera NBRC4009
(5) Thermo Asuka Aurantiakas NBRC6766
(8) Neurospora Classa NBRC6067
(10) Talaromyces flavus NBRC7232
(13) Bisoclamis Zoraniae JCM12808
（試料３）
（３）モナスカス・ルバー NBRC4483
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（７）ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
（１２）ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
(Sample 3)
(3) Monascus Luber NBRC4483
(6) Thermo Asuka Thermophilus NBRC9643
(7) Nigrospora Orize NBRC32860
(12) Paecilomyces Variotti NBRC100534
(13) Bisoclamis Zoraniae JCM12808
そして、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸してコロニーを凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置により各カビのゲノムＤＮＡを抽出したものを、上記試料１〜３に示す通りに混合した。そして、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーセットは、試験１におけるものと同一であり、ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号２７及び２８に示される塩基配列からなるプライマーを使用し、β-チューブリン遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号２９及び３０に示される塩基配列からなるプライマーを使用した。
Then, the cultured mold colonies were collected, placed in a vial containing φ0.5 mm zirconia beads, immersed in liquid nitrogen to freeze the colonies, and then the mold cells were crushed using a shaking device.
Next, the genomic DNA of each mold was extracted by a DNA extraction device and mixed as shown in
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、試料毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer(2.5μM) 1.0μl
６．ITS1-Rv primer(2.5μM) 1.0μl
７．BtF primer(10μM) 1.0μl
８．BtR primer(10μM) 1.0μl
９．Template DNA（1.0μl／菌株） 1.0μl×菌株数
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
Ampdirect (manufactured by Shimadzu Corporation) was used as the reaction solution for PCR, and 20 μl of the following composition was prepared for each sample.
1. 1. Ampdirect (G / Crich) 4.0 μl
2. Ampdirect (addition-4) 4.0 μl
3. 3. dNTPmix 1.0 μl
4. Cy-5dCTP 0.2 μl
5. ITS1-Fw primer (2.5 μM) 1.0 μl
6. ITS1-Rv primer (2.5 μM) 1.0 μl
7. BtF primer (10 μM) 1.0 μl
8. BtR primer (10 μM) 1.0 μl
9. Template DNA (1.0 μl / strain) 1.0 μl × number of
11. Water (water until the whole is 20.0 μl)
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、試験１と同様に、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分
Using each of the above PCR reaction solutions, DNA was amplified by a nucleic acid amplification device (TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient, manufactured by Takara Bio Inc.) under the following conditions in the same manner as in
(A) 95 ° C. 10 minutes (b) 95 ° C. 30 seconds (c) 56 ° C. 30 seconds (d) 72 ° C. 60 seconds (40 cycles of (b) to (d))
(E) 72 ° C for 10 minutes
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図７に示す。
Next, a buffer solution (3 × SSC citric acid-physiological saline + 0.3% SDS) was mixed with the PCR amplification product, heated at 94 ° C. for 5 minutes, and added dropwise to a mold detection carrier (DNA chip). .. The mold detection carrier was allowed to stand at 45 ° C. for 1 hour, and the PCR product that did not hybridize was washed away from the DNA chip using the above buffer solution.
Then, using a label detection device (BIOSHOT, manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.), the fluorescence intensity (fluorescence intensity of the amplification product bound to the probe) in each probe immobilized on the mold detection carrier was measured, and each probe was measured. The S / N ratio value in. The result is shown in FIG.
試料１に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号１〜４，１０，１１，１３，１８，１９，２１〜２３に示す塩基配列からなるプローブである。
配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブは、ムーコル・ラセモサスを検出するためのプローブである。このうち、配列番号１，２，４については、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。配列番号３については、５種類のカビを含むマルチプレックスＰＣＲを行った試験２では陽性反応は示さなかったが、１種類のカビのみを個別に増幅した試験１においては、陽性反応を示している。
配列番号１０，１１に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１８，１９に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２１〜２３に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料１に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
As shown in FIG. 6, the probe for detecting the mold contained in the
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 is a probe for detecting Mucol lasemosas. Of these, for SEQ ID NOs: 1, 2 and 4, the S / N ratio values are all 3 or more, indicating a positive reaction. Regarding SEQ ID NO: 3, a positive reaction was not shown in
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 and 11 is a probe for detecting Thermoscus clusterseus. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is a probe for detecting Thermoscus thermophilus. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 and 19 is a probe for detecting emerisera nidurance. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 23 is a probe for detecting Talaromyces bacillispulus. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
In addition, no positive reaction was observed for probes other than these. That is, no false positive reaction occurred for the probes other than these, and it was shown that the molds other than the mold to be detected were not erroneously detected according to each probe for detecting the mold contained in the
試料２に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号５〜７，１２，１６，１７，２０，２６に示す塩基配列からなるプローブである。
配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１６，１７に示す塩基配列からなるプローブは、ニューロスポラ・クラッサを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料２に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
As shown in FIG. 6, the probe for detecting the mold contained in the
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 is a probe for detecting Liquitimia colimbifera. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 is a probe for detecting Thermoscus orrantiacus. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 17 is a probe for detecting neurospora classa. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 is a probe for detecting Talaromyces flavus. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 is a probe for detecting Bisoclamis zolaniae. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
In addition, no positive reaction was observed for probes other than these. That is, no false positive reaction occurred for the probes other than these, and it was shown that the molds other than the mold to be detected were not erroneously detected according to each probe for detecting the mold contained in the
試料３に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号８，９，１３，１４，１５，２４，２５，２６に示す塩基配列からなるプローブである。
配列番号８，９に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１４，１５に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２４，２５に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料３に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
As shown in FIG. 6, the probe for detecting the mold contained in the
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 is a probe for detecting Monascus ruber. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 is a probe for detecting Thermoscus thermophilus. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 is a probe for detecting nigrospora oryzae. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 24 and 25 is a probe for detecting Paecilomyces variotti. All of these have S / N ratio values of 3 or more, indicating a positive reaction.
The probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 is a probe for detecting Bisoclamis zolaniae. Regarding this, the S / N ratio value is 3 or more, indicating a positive reaction.
In addition, no positive reaction was observed for probes other than these. That is, no false positive reaction occurred for the probes other than these, and it was shown that the molds other than the mold to be detected were not erroneously detected according to each probe for detecting the mold contained in the
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブは、検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合でも、ほぼ有効に機能することが明らかとなった。また、これらのプローブは、特異性が高く、偽陽性反応が見られないことも明らかとなった。 As described above, the probe immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment can function almost effectively even when multiplex PCR is performed to simultaneously amplify the target region in the DNA of a plurality of molds to be detected. It became clear. It was also revealed that these probes are highly specific and do not show false positive reactions.
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ固定化しても良い。また、本実施形態の検出対象カビ以外のカビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共に本実施形態のカビ検出用担体に固定化されていても良く、適宜変更することが可能である。
また、本発明における対象カビに関連するアナモルフ型・テレオモルフ型・異名を持つカビも当然検出可能であり、検出対象カビ名は最新の系統分類研究に準ずるものとする。
It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, the probe to be immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment is not limited to one spot for each type, and each probe may be immobilized for a plurality of spots. Further, other probes for detecting mold other than the mold to be detected of the present embodiment may be immobilized on the mold detection carrier of the present embodiment together with the probe of the present embodiment, and may be appropriately changed. It is possible.
In addition, the anamorph type, the teleomorph type, and the mold having a synonym related to the target mold in the present invention can be naturally detected, and the detection target mold name shall be based on the latest phylogenetic nomenclature research.
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスを特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention relates to heat-resistant molds Mucol Lasemosas, Liquitemia kolimbifera, Monascus ruber, Thermoascus clusterseus in environmental inspections, food inspections, epidemiological environmental inspections, clinical trials, livestock hygiene, plant disease diagnosis, etc. , Thermoscus aurantiacas, Thermoscus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora classa, Emericella nidurance, Talalomyces flavus, and Talalomyces bacillisporus, suitable for specific and multiple detection. It is possible to do.
Claims (11)
（ａ）ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１、２及び４に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
（ｂ）リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
（ｃ）モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
（ｄ）サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
（ｅ）サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
（ｆ）サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、並びに、
（ｇ）ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群。 The probes of two or more probe groups selected from the first to seventh probe groups consisting of the base sequences described in the following (a) to (g) are immobilized, and two or more molds to be detected are detected at the same time. A carrier for detecting mold.
(A) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 4 selected from the ITS region for detecting Mucor racemosus, and a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. First probe group consisting of at least one of
(B) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 7 selected from the ITS region for detecting Lichtheimia corymbifera, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A second probe group consisting of either,
(C) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 to 9 selected from the ITS region for detecting Monascus ruber, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A third probe group consisting of either,
(D) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 10 to 11 selected from the ITS region for detecting Thermoascus crustaceus, and a nucleotide sequence complementary to the probe. A fourth probe group consisting of at least one of the probes,
(E) A probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 selected from the ITS region for detecting Thermoascus aurantiacus, and a probe consisting of a base sequence complementary to the probe. Fifth probe group consisting of at least one of
(F) At least a probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 selected from the ITS region for detecting Thermoascus thermophilus, and a probe having a base sequence complementary to the probe. A sixth probe group consisting of either, and
(G) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 14 to 15 selected from the ITS region for detecting Nigrospora oryzae, and at least a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A seventh probe group consisting of either.
（ｈ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
（ｉ）エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
（ｊ）タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、並びに、
（ｋ）タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群。 The probes of two or more probe groups selected from the eighth to eleventh probe groups consisting of the base sequences described in the following (h) to (k) are immobilized, and two or more molds to be detected are detected at the same time. A carrier for detecting mold, which is characterized by being used.
(H) From a probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 16 to 17 selected from the β-tubulin gene for detecting Neurospora crassa, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Eighth probe group consisting of at least one of the probes,
(I) From a probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 19 selected from the β-tubulin gene for detecting Emmericella nidulans, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Ninth probe group consisting of at least one of the probes,
(J) A probe consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces flavus, and a probe consisting of a nucleotide sequence complementary to the probe. A tenth probe group consisting of at least one, and
(K) A probe consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 21 to 22 selected from the β-tubulin gene for detecting Talaromyces bacillisporus, and a nucleotide sequence complementary to the probe. Eleventh probe group consisting of at least one of the probes.
前記標的領域としてＩＴＳ領域を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、及びニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 A method for detecting mold, which comprises a step of amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product.
Using the ITS region as the target region,
The PCR reaction solution contains a primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a sample.
In the sample, Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, Thermoascus crustaceus, Thermoascus aurant , Thermoascus thermophilus, and Nigrospora oryzae, if at least one of the DNAs is contained.
The PCR reaction solution was used to amplify the target region in the DNA contained in the sample.
A method for detecting mold, which comprises dropping the obtained amplification product onto the carrier for detecting mold according to claim 1, 2 or 5, and binding the obtained amplification product to a probe having a complementary base sequence.
前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 A method for detecting mold, which comprises a step of amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product.
Using the β-tubulin gene as the target region,
The PCR reaction solution contains a primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30, and a sample. ,
When the sample contains at least one of the DNAs of Neurospora crassa, Emericella nidulans, Talaromyces flavus, and Talaromyces bacillisporus. ,
The PCR reaction solution was used to amplify the target region in the DNA contained in the sample.
A method for detecting mold, which comprises dropping the obtained amplification product onto the carrier for detecting mold according to claim 3, 4 or 5, and binding the obtained amplification product to a probe having a complementary base sequence.
前記標的領域としてＩＴＳ領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。 A method for detecting mold, which comprises a step of amplifying a target region in the DNA of the mold to be detected by PCR and confirming the presence or absence of an amplification product.
Using the ITS region and the β-tubulin gene as the target region,
A primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a base sequence shown in SEQ ID NO: 29 in a PCR reaction solution. A primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of a forward primer and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 and a sample are contained.
The samples include Mucor racemosus, Lichtheimia corymbifera, Monascus ruber, Thermoascus crustaceus, Thermoascus aurant. , Thermoascus thermophilus, Nigrospora oryzae, Neurospora crassa, Emericella nidulans, Taralomyces flavus, and Taralomyces flavus. If at least one of the DNAs of Talaromyces bacillisporus) is contained
The PCR reaction solution was used to amplify the target region in the DNA contained in the sample.
The resulting amplification products are selected from claims 1 Symbol placement first to seventh eighth to eleventh probe group selected one or more probe group of probes and claim 3, wherein the probe group of one or more probe groups of probes immobilized fungal detection carrier was, or was dropped on mold detection carrier according to claim 5, characterized in that for coupling a probe having a base sequence complementary How to detect mold.
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。 A mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed.
The primer set
A primer set for amplifying an ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 is included.
A mold detection kit, wherein the carrier is the mold detection carrier according to claim 1, 2 or 5.
前記プライマーセットが、
配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。 A mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed.
The primer set
It contains a primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30.
A mold detection kit, wherein the carrier is the mold detection carrier according to claim 3, 4 or 5.
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。 A mold detection kit containing a primer set for amplifying a target region in the DNA of a mold to be detected and a carrier on which a probe for confirming the presence or absence of an amplification product is fixed.
The primer set
A primer set for amplifying the ITS region consisting of a forward primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 and a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28, and a forward primer and sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29. It contains a primer set for amplifying a β-tubulin gene consisting of a reverse primer consisting of the nucleotide sequence shown in No. 30.
Wherein said carrier, one or more selected from claims 1 Symbol placement first to seventh eighth to eleventh probe group selected one or more probe group of probes and claim 3, wherein the probe group of mold detection carrier probe groups of the probe is immobilized, or a kit for mold detection, which is a fungus detection carrier according to claim 5, wherein.
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