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JP6851977B2 - マクロライド系免疫抑制剤の高分子誘導体 - Google Patents

マクロライド系免疫抑制剤の高分子誘導体 Download PDF

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Description

本発明はマクロライド系化合物の高分子誘導体、その製造方法及びその用途に関する。
本発明において使用されるマクロライド系化合物は、ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有し、かつペプチジル−プロリルイソメラーゼ及び／またはロタマーゼ酵素活性を阻害するという共通の活性を有する。マクロライド系化合物の例としては、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、アスコマイシンなどを含むトリシクロ化合物がある。
マクロライド系化合物または医薬として許容されるその塩は、優れた免疫抑制作用、抗菌活性、およびその他の薬理活性を有し、その為、臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、および感染症等の治療および予防に有用であることが、例えば、特許文献１等に記載されている。
タクロリムスは臓器移植後の拒絶反応抑制、骨髄移植後の移植片対宿主病、難治性の活動期潰瘍性大腸炎などの治療に汎用されている。しかしながら、タクロリムスは水に難溶（２．４〜３．６μＭ、室温）であり、経口投与時のバイオアベイラビリティーが低い。また、タクロリムスの治療域は狭く、体内動態の個体間・個体内変動が大きいため、血中濃度のコントロールが困難な薬物である。タクロリムスの体内動態変動因子として、水への低い溶解度や、消化管粘膜でのＰ−糖タンパク質や薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａの発現量及び遺伝子型の個体差などが知られている（非特許文献１、２）。
タクロリムスの主な副作用の一つに腎毒性および膵臓毒性がある。腎毒性は、腎細動脈の血管収縮作用により血流量および糸球体濾過量低下が起こり、さらに尿細管細胞への栄養補給が滞ることが原因である。膵臓毒性は主に膵β細胞のインシュリンｍＲＮＡ転写阻害に基づく膵β細胞からのインシュリン産生抑制による耐糖能異常発症である。これらの毒性は、タクロリムスの血漿中濃度に依存して発現する。
タクロリムスの中枢神経系の副作用として、ヒトでは可逆性後白質脳症症候群・高血圧性脳症等が報告されている（市販後調査を含め０．１〜０．５％未満）。また、ラットへのタクロリムスの静脈内投与が、軽度の呼吸促迫、自発運動低下、腹臥位、常同行動等を誘発することが認められている。（非特許文献３）
ポリマーと薬剤が結合することにより、薬剤の水溶性が向上したり、生体内における薬物動態が改善し、その結果として薬効の増強、副作用の軽減、薬効の持続性などの実用上優れた効果が得られることが知られている。ポリマーと薬剤の結合様式は、ポリマーと薬剤が共有結合する場合とポリマーと薬剤とが物理的に吸着する場合とがある。ポリマーと共有結合した薬剤は、体内において加水分解反応などによりポリマーから放出される。一方、ポリマーに物理的に吸着した薬剤は、加水分解反応のような化学反応に因らず、体内においてポリマーから薬剤が徐々に放出する。いずれもポリマーからの薬剤の放出に酵素は関与しないが、ポリマーと薬剤の結合様式の違いは、薬剤の放出機構に違いをもたらすと考えられる。
特許文献２及び特許文献３には、ポリエチレングリコール類及びポリアスパラギン酸からなる共重合体と薬剤から得られる高分子誘導体が記載されている。特許文献２及び特許文献３に記載の該高分子誘導体は、共重合体と薬剤が物理的に吸着している。該高分子誘導体の徐放性は共重合体から徐々に薬剤が解離することに起因し、患部に選択的に薬効を示すとともに副作用が少ない。
特許文献４には、タクロリムスをａｌｋｙｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ （ＭＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ）から成るポリマーに物理的に吸着させた化合物を得る方法が開示されている。しかしながら、血中濃度あるいはタクロリムスが患部へ特異的に移行することに関して記載はない。
非特許文献４には、ＰＥＧポリマーにタクロリムスを化学的に結合させて合成したＰＥＧ化タクロリムスについて報告がある。しかしながら、ＰＥＧ化タクロリムスはアジュバント関節炎マウス及びループス腎炎マウスなどの炎症疾患モデル動物に対し、タクロリムス以上の効果が得られていない。
非特許文献５には、Ｐｏｌｙ （ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） ｅｓｔｅｒｓ−Ｐｏｌｙ ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＥＧ−ＰＣＬ）ポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成されたミセルについての報告がある。ＰＥＧ−ＰＣＬタクロリムスミセルはＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎マウスに対し、タクロリムスと比較して体重減少の抑制、大腸の短縮化抑制及び大腸の出血や陰窩細胞の消失などの炎症改善効果が高いことが明らかにされている。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＣＬタクロリムスミセルが炎症改善効果を示すためには、１日１回１２日間連続で投与していることから、この化合物では血中濃度を長く維持することができないと考えられる。
非特許文献６及び７には、Ｐｏｌｙ ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ−ｂ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯ）から成るポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成したミセルについての報告がある。ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは、タクロリムスと比較して細胞内に徐々に取り込まれることが記載されている。また、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは５ｍｇ／ｋｇを６日間隔で３回尾静脈内投与することにより、坐骨神経損傷モデルラットの自発運動性を改善することが示されている。しかしながら、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルから遊離したタクロリムスは脳に高く集積することから、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは免疫抑制剤としての機能よりも、神経保護剤としての機能に特化していると考えられる。
非特許文献８には、ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）またはｐＨ感受性Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｐ−４１３５Ｆから成るポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成したナノパーティクルについての報告がある。該ナノパーティクルはコラーゲン誘発関節炎及びＤＳＳ誘発大腸炎マウスに対し、タクロリムスよりも高い炎症改善効果を示している。しかしながら、該ナノパーティクルが炎症改善効果を示すためには、１日１回１２日間連続で投与していることから、この化合物では血中濃度を長く維持することができないと考えられる。さらに、腎障害の指標であるＢＵＮ、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランスに対する改善作用も十分ではなかった。
現在までに、患部への高い集積性を示し、個人差なく血中濃度が一定に維持されることによって、タクロリムスに比べて有効性と安全性が顕著に向上し、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となる製剤は未だなく、その開発が求められている。
国際公開９３／００５０５９号 国際公開２００３／０００７７１号 国際公開２００４／０８２７１８号 国際公開２０１３／１５７６６４号
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９９、６７、ｐ．３３３−３３５ Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８、１５、ｐ．１６０９−１６１３ 藤沢薬品工業株式会社（現アステラス製薬株式会社）プログラフカプセル（０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ）プログラフ注射液（５ｍｇ）に関する資料 ５３頁 平成１３年６月部会審議 承認申請資料概要 Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１１、３４、１３０１−１３１０ Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３、９、ｐ．１４７−１５７ Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．２０００、７、ｐ．１３９−１４５ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９９、１４２１、ｐ．３２−３８ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００６、３１６、ｐ．１３８−１４３
本発明の目的は、薬剤を炎症部位に集積させ低投与量でより高い効果を有し、また目標血中トラフ濃度で維持させることにより長い投与間隔及び毒性を軽減する新規な免疫抑剤又は抗炎症剤を提供することにある。
本発明者はポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体が本発明の課題を解決することを見出した。
本発明は以下の［１］〜［１８］に関する。
［１］ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体。
［２］ポリアミノ酸誘導体がポリアスパラギン酸誘導体である前記［１］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［３］下記一般式（１）
Figure 0006851977
［式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基を示し、Ｒ４はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基を示し、Ｒ５はそれぞれ独立して、疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）からなる群から選択され、Ｘは結合又は結合基であり、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｄは１〜２００の整数を示し、且つｅ、ｆ及びｇは各々０または２００以下の正の整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇは３〜２００の整数を示し、ポリアミノ酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］で表される前記［１］又は［２］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［４］下記一般式（２）
Figure 0006851977
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ及びｔは一般式（１）と同一であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは各々０または２００以下の正の整数であり、ｋ＋ｌは１〜２００の整数であり、且つｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは３〜２００の整数であり、ポリアミノ酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］で表される前記［１］又は［２］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［５］Ｘが結合である前記［３］又は［４］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［６］Ｘが結合であり、Ｒ５が疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）である前記［５］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［７］Ｘの結合基がアスパラギン酸誘導体である前記［３］又は［４］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［８］Ｘの結合基がアスパラギン酸誘導体であり、Ｒ５が疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）である前記［７］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［９］Ｘの結合基が、下記一般式（３）又は一般式（４）
Figure 0006851977
［式中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基を示し、Ｒ１０はＮＨ２、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基を示し、ＣＹ−ＣＺはＣＨ−ＣＨ若しくはＣ＝Ｃ（二重結合）を示す。］である前記［３］又は［４］に記載のタクロリムスの高分子化合物。
［１０］Ｒ８、Ｒ９が共に水素原子であり、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨである前記［９］に記載のタクロリムスの高分子化合物。
［１１］疎水性置換基が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ６０）のジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基からなる群から選択される前記［３］乃至［１０］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１２］Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基であり、ｔが５０〜１５００の整数であり、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇが４〜１５０の整数である前記［３］、［５］乃至［１１］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１３］Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ４）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアシル基であり、ｔが１００〜１５００の整数であり、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇが８〜１２０の整数である前記［３］、［５］乃至［１１］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１４］Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基であり、ｔが５０〜１５００の整数であり、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑが４〜１５０の整数である前記［４］乃至［１１］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１５］Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ４）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアシル基であり、ｔが１００〜１５００の整数であり、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑが８〜１２０の整数である前記［４］乃至［１１］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１６］Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がトリメチレン基であり、Ｒ３がアセチル基である前記［３］乃至［１５］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１７］ポリエチレングリコールセグメント及びポリアスパラギン酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基を有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする前記［１］乃至［１６］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体の製造方法。
［１８］前記［１］乃至［１６］の何れかに記載のタクロリムスの高分子誘導体を有効成分とするマクロライド系免疫抑制剤。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基がエステル結合していることを特徴とする。この高分子誘導体は、その構造上、水中で親水性の高いポリエチレングリコールセグメントを外殻、疎水性の高い側鎖を内殻とした凝集体を形成すると考えられる。この高分子誘導体は生体内において安定であり、酵素非依存的にタクロリムスを徐放することができ、炎症部位への高い集積性を示し、低投与量で治療効果に優れている。また、酵素に依存しない生理活性物質の放出及び血中濃度の維持が可能であることによって、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となり、安全性が顕著に向上することが期待される。
酵素非存在下における薬剤放出の経時変化を示す。-●-は実施例１の化合物、-○-は実施例２、-■-は実施例３の化合物、-□-は実施例１６の化合物をそれぞれ表す。 酵素非存在下における薬剤放出の経時変化を示す。-●-は実施例４の化合物、-○-は実施例５の化合物、-■-は実施例６の化合物、-□-は実施例７の化合物、-▲-は実施例８の化合物をそれぞれ表す。 ラット血中におけるタクロリムス濃度の経時変化を示す。-●-は実施例１の化合物、-■-は実施例２の化合物、-△-は実施例３の化合物、-◇-は実施例４の化合物、-＊-はタクロリムスをそれぞれ表す。 ラット血中におけるタクロリムス濃度の経時変化を示す。-●-は実施例５の化合物、-■-は実施例６の化合物、-△-は実施例７の化合物、-◇-は実施例８の化合物、-＊-はタクロリムスをそれぞれ表す。 ラットの相対体重の経時変化を示す。-■-は実施例１の化合物を２０ｍｇ／ｋｇ、-◆-は実施例１の化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、-▲-は実施例１の化合物を４０ｍｇ／ｋｇ、-●-は実施例１の化合物を５０ｍｇ／ｋｇ、-○-は生理食塩水（Saline）を単回投与したときの体重変化をそれぞれ示す。 ラットの相対体重の経時変化を示す。-■-はタクロリムスを２０ｍｇ／ｋｇ、-◆-はタクロリムスを３０ｍｇ／ｋｇ、-○-はクレモホールとエタノールの混合液（Vehicle）を単回投与したときの体重変化をそれぞれ示す。 ラットの大脳皮質病理切片を各倍率で観察した図面代用写真である。左図は溶媒対照投与群の病理切片、右図はタクロリムス投与により死亡した個体の病理切片をそれぞれ示す。 マウスＤＳＳ大腸炎における、実施例９乃至１５の化合物の薬剤集積を示す図面代用写真である。 ラットコラーゲン関節炎の炎症スコアの経時変化を示す。-●-は実施例１の化合物、-○-はタクロリムスをそれぞれ表す。 ラットコラーゲン関節炎の炎症スコアの経時変化を示す。-▲-は実施例１の化合物、-■-は実施例４の化合物、-●-は未投与群をそれぞれ表す。 ラットコラーゲン関節炎の炎症スコアの経時変化を示す。-▲-は実施例１の化合物、-■-は実施例３の化合物、-●-は未投与群をそれぞれ表す。 ラットコラーゲン関節炎の炎症スコアの経時変化を示す。-▲-は実施例１の化合物、-■-は実施例２の化合物、-◆-は実施例５の化合物、-＊-は実施例６の化合物、-●-は未投与群をそれぞれ表す。 ラットコラーゲン関節炎の炎症スコアの経時変化を示す。-▲-は実施例１の化合物、-■-は実施例７の化合物、-◆-は実施例８の化合物、-●-は未投与群をそれぞれ表す。 ラットコラーゲン関節炎誘発における、合成例８の化合物の薬剤集積を示す図面代用写真である。左図は関節炎非誘発群、右図は関節炎誘発群をそれぞれ示す。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基がエステル結合していることを特徴とする。以下に、その詳細について説明する。
本発明におけるポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体には、グラフト型ポリマーやブロック型ポリマーが含まれ、好ましくはブロック型ポリマーが挙げられる。
ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の分子量は、通常５００〜５００、０００程度であり、好ましくは６００〜１００、０００程度であり、更に好ましくは８００〜８０、０００である。なお、本明細書中において分子量とは、ポリエチレングリコール標準品を基準とした、ＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量である。
ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の１分子あたりのカルボキシ基の数は、平均で、３〜２００個程度であり、４〜１５０個が好ましく、より好ましくは８〜１２０個である。カルボキシ基の数はアルカリによる中和滴定により求められる。
本発明におけるポリエチレングリコールセグメントには、両末端又は、片方の末端が修飾されたポリエチレングリコールも含まれ、両末端の修飾基は同一でも異なってもよい。末端の修飾基としては、置換基を有してもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基が挙げられる。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ジメトキシエチル基、ジエトキシエチル基等が挙げられる。好ましくは置換基を有してもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ジメトキシエチル基等が挙げられる。片方の末端が修飾されたポリエチレングリコールとしては、好ましくはアルコキシポリエチレングリコールであり、更に好ましくはメトキシポリエチレングリコールが挙げられる。
ポリエチレングリコールセグメントの平均分子量は通常３００〜５００，０００程度であり、好ましくは５００〜１００，０００程度、更に好ましくは１，０００〜５０，０００程度である。
本発明におけるポリアミノ酸誘導体はポリグルタミン酸誘導体、ポリアスパラギン酸誘導体、ポリリシン誘導体、ポリオルニチン誘導体、ポリチロシン誘導体、ポリセリン誘導体、ポリトレオニン誘導体が挙げられ、好ましくは反応性置換基としてカルボキシ基を有するポリアスパラギン酸誘導体またはポリグルタミン酸誘導体が挙げられる。これらの側鎖カルボキシ基を有するポリアミノ酸誘導体は、α−アミド結合型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのアミド結合型重合体であっても、β−アミド結合型重合体であっても、その混合物であってもよい。ポリアミノ酸誘導体としてはポリアスパラギン酸誘導体が好ましい。
タクロリムスは、下記式（Ｉ）で表される。タクロリムスのアルコール性水酸基は、複数あるが、アルコール性水酸基であれば置換位置は限定されない。
Figure 0006851977
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の構造例として、下記一般式（１）［式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、Ｒ２は結合基を示し、Ｒ３は水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基を示し、Ｒ４はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基を示し、Ｒ５はそれぞれ独立して、疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）からなる群から選択され、Ｘは結合又は結合基であり、ｔは５〜１１５００の整数を示し、ｄ、ｅ、ｆ若しくはｇは各々０または２００以下の正の整数を示し、且つｄは１〜２００の整数を示し、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇは３〜２００の整数を示す。］及び下記一般式（２）［式中、ｔ及びＲ１〜Ｒ７は一般式（１）と定義が同一であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは各々０または２００以下の正の整数を示し、且つｋ＋ｌは１〜２００の整数を示し、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは３〜２００の整数を示す。］で表される化合物が挙げられる。なお、各繰り返し単位の配列順は合成時に制御不可能であり、一般式（１）及び一般式（２）に記載のものに限られない。
Figure 0006851977
Figure 0006851977
一般式（１）及び一般式（２）のＲ１における炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基としては炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、好ましくは炭素数（Ｃ１〜Ｃ４）の直鎖又は分岐鎖のアルキル基であり、特に好ましくは炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）の直鎖又は分岐鎖のアルキル基である。炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖又は分岐鎖のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基があり、特にメチル基が好ましい。
一般式（１）及び一般式（２）のＲ２で表される結合基としては、特に限定されないが炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基が挙げられ、炭素数（Ｃ２〜Ｃ４）のアルキレン基が好ましく、例えば、エチレン基、トリメチレン基、ブチレン基等が挙げられ、特にトリメチレン基が好ましい。
一般式（１）及び一般式（２）のＲ３における炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基としては特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ピバロイル基等が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
一般式（１）及び一般式（２）のＲ４であるタクロリムスのアルコール性水酸基は、ポリマーのカルボン酸部分と脱水縮合剤によりエステル結合をするアルコール性水酸基であれば置換位置は特に限定されない。
一般式（１）及び一般式（２）のＲ５は疎水性置換基を取り得る。
該疎水性置換基としては、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ６０）のジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基が挙げられる。
特に好ましくは炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ４０）ジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基である。
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ基としては特に限定されないが、例えば、オクチルオキシ基、デシルオキシ基、ドデシルオキシ基、テトラデシルオキシ基、ヘキサデシルオキシ基、オクタデシルオキシ基等が挙げられる。
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルケニルオキシ基としては特に限定されないが、例えば、９−ヘキサデセニルオキシ基、ｃｉｓ−９−オクタデセニルオキシ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエニルオキシ基等が挙げられる。
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルキルアミノ基としては特に限定されないが、例えば、オクチルアミノ基、デシルアミノ基、ドデシルアミノ基、テトラデシルアミノ基、ヘキサデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基等が挙げられる。
前記炭素数（Ｃ２〜Ｃ４０）のジアルキルアミノ基としては特に限定されないが、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジシクロヘキシルアミノ基、ジオクチルアミノ基、ジノニルアミノ基等が挙げられる。
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルケニルアミノ基としては特に限定されないが、例えば、９−ヘキサデセニルアミノ基、ｃｉｓ−９−オクタデセニルアミノ基、ｃｉｓ、ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエニルアミノ基等が挙げられる。
前記アミノ酸誘導体残基としては、例えば、トリプトファン誘導体残基、フェニルアラニン誘導体残基、イソロイシン誘導体残基、ロイシン誘導体残基、バリン誘導体残基等が挙げられ、好ましくはトリプトファン誘導体残基、イソロイシン誘導体残基、フェニルアラニン誘導体残基である。
トリプトファン誘導体残基としては、例えば、下記式（５−１）〜（５−４）で示される、トリプトファニル−メチルエステル基、トリプトファニル−エチルエステル基、トリプトファニル−ベンジルエステル基、トリプトファニル−コレステロールエステル基等が挙げられる。
Figure 0006851977
イソロイシン誘導体残基としては、例えば、下記式（６−１）〜（６−４）で示される、イソロイシニル−メチルエステル基、イソロイシニル−エチルエステル基、イソロイシニル−ベンジルエステル基、イソロイシニル−コレステロールエステル基等が挙げられる。
Figure 0006851977
フェニルアラニン誘導体残基としては、例えば、下記式（７−１）〜（７−４）で示される、フェニルアラニニル−メチルエステル基、フェニルアラニニル−エチルエステル基、フェニルアラニニル−ベンジルエステル基、フェニルアラニニル−コレステロールエステル基等が挙げられる。
Figure 0006851977
該疎水性置換基としては蛍光基、例えば、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン基、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ残基、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４ Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ残基、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標） Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ残基、ＡＴＴＯ
５９４ ａｍｉｎｅ残基等も含まれる。
一般式（１）及び一般式（２）のＲ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）を取り得る。ここでＲ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。
炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキルとしては、例えば、シクロヘキシル基等が挙げられる。
三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基としては、例えば、エチル基、イソプロピル基、３−ジメチルアミノプロピル基等が挙げられる。
三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基の三級アミノ基はジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等である。
一般式（１）で表されるタクロリムスの高分子誘導体における全α−アスパラギン酸数の平均値はｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇで表され、３〜２００個程度であり、好ましくは６〜１５０個程度であり、特に好ましくは１０〜１２０個である。
全α−アスパラギン酸数（ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ）に対するタクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｄ）の割合は１〜１００％、好ましくは２〜９０％、更に好ましくは３〜６０％である。又、α−アスパラギン酸数（ｄ）として３〜２００個、好ましくは４〜１５０個程度、特に好ましくは８〜１２０個程度である。
Ｒ５の疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）中のＲ６、Ｒ７の好ましい組合せとしては、下表に示す化合物が挙げられる。
Figure 0006851977
一般式（２）で表されるタクロリムスの高分子誘導体における全アスパラギン酸数の平均値はｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑで表され、３〜２００個程度であり、好ましくは４〜１５０個程度であり、特に好ましくは８〜１２０個である。
一般式（２）で表されるタクロリムスの高分子誘導体における全アスパラギン酸数（ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）に対するタクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｋ＋ｌ）の割合は１〜１００％、好ましくは２〜９０％、更に好ましくは３〜６０％である。又、タクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｋ＋ｌ）は１〜２００個、好ましくは１〜１００個程度、特に好ましくは１〜９０個程度である。
全アスパラギン酸数（ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ）に対するα−アスパラギン酸（ｋ＋ｍ＋ｏ）の割合は１〜８０％であり、好ましくは１〜５０％である。この割合は、例えば、ポリアスパラギン酸の保護基の脱保護条件等を選ぶことにより適宜変えることができる。
一般式（１）及び一般式（２）のｔは平均値であり、５〜１１５００程度の整数であるが、好ましくは５０〜３０００程度の整数であり、特に好ましくは１００〜１５００程度の整数である。
前記一般式（１）及び一般式（２）におけるＸは、結合又は前記Ｒ４、Ｒ５と、ポリアミノ酸主鎖の側鎖カルボニル基との結合基である。該結合基としては、Ｒ４、Ｒ５の結合性官能基と、該ポリアミノ酸誘導体の側鎖カルボキシ基に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有する結合基であれば、特に限定されるものではない。
ＸのＲ４、Ｒ５側の末端結合性官能基としては、カルボキシ基、オキシカルボキシ基、アミノカルボキシ基が好ましい。Ｒ４、Ｒ５が分子中にアミノ基及び／又は水酸基を有することから、これらの結合性官能基は、該アミノ基及び／又は水酸基とアミド結合、エステル結合、ウレタン結合、カーボネート結合及びウレア結合する。
Ｘのもう一方の、前記側鎖カルボキシ基側の末端結合性官能基としては、アミノ基、水酸基又はチオール基が好ましい。これらの結合性官能基は、側鎖カルボキシ基とアミド結合、エステル結合、チオエステル結合できる。
すなわちＸは、一方の末端基がカルボキシ基、オキシカルボキシ基又はアミノカルボキシ基であり、もう一方の末端基がアミノ基、水酸基又はチオール基である置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基又はアルケニレン基であることが好ましい。
Ｘの具体例は下表に記載の物が挙げられるが、本発明の高分子誘導体の合成又は性能に影響を与えないものであればこれらに限られない。いずれのＸも、側鎖カルボキシ基とはアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する。
Figure 0006851977
前記Ｘのアルキレン基は、水素原子が適当な置換基により修飾されていても良い。該置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアルキルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアリール基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニルアミノ基等を挙げることができる。
Ｘとしては−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−Ｏ−が好ましい。特に好ましくは、Ｒ４、Ｒ５とアミド結合又はエステル結合することができるカルボキシ基を有すると共に、該側鎖カルボキシ基とアミド結合できるアミノ基を有する−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−である。
Ｘ中のｙとして好ましくは１乃至６であり、さらに好ましくは１、２、４、又は６である。
最も好ましいＸとしては−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−（ｙ＝１、２、４、又は６）である。
Ｘとして挙げた置換基を有していても良い−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−において、ｙが１の場合はアミノ酸骨格と同義である。したがって、Ｘとして、アミノ酸誘導体を用いても良い。
アミノ酸誘導体を結合基とする場合、アミノ酸のＮ末アミノ基が前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、Ｃ末カルボキシ基が該Ｒ４、Ｒ５のアミノ基又は水酸基とアミド結合又はエステル結合する態様の結合基として用いられる。
結合基として用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。
Ｘとしてのアミノ酸誘導体はアスパラギン酸誘導体が好ましい。該アスパラギン酸誘導体としては、α−カルボキシ基が前記Ｒ４、Ｒ５の結合基として機能し、β−カルボキシ基がアミド体であるアスパラギン酸誘導体結合基である。または、β−カルボキシ基が前記Ｒ４、Ｒ５の結合基として機能し、α−カルボキシ基がアミド体であるアスパラギン酸誘導体であっても良い。該Ｒ４、Ｒ５の結合基ではない、もう一方のカルボキシ基がアミド体である場合は、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜２０）のアルキルアミド、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミド、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルアミド又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸残基等が挙げられる。
該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜２０）のアルキルアミドとしては、例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピルアミド、ｔ−ブチルアミド、シクロヘキシルアミド、ドデシルアミド、オクタデシルアミド等が挙げられる。
該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミドとしては、例えば、フェニルアミド、４−メトキシフェニルアミド、４−ジメチルアミノフェニルアミド、４−ヒドロキシフェニルアミド等が挙げられる。該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルアミドとしては、例えば、ベンジルアミド、２−フェニルエチルアミド、４−フェニルブチルアミド、８−フェニルオクチルアミド等が挙げられる。該アスパラギン酸誘導体のカルボキシ基が保護されたアミノ酸アミドとしては、例えば、グリシニル−メチルエステル、アラニル−メチルエステル、ロイシニル−メチルエステル、イソロイシニル−メチルエステル、バリニル−メチルエステル、フェニルアラニル−メチルエステル、アラニル−エチルエステル、ロイシニル−エチルエステル、イソロイシニル−エチルエステル、アラニル−ブチルエステル、ロイシニル−ブチルエステル等が挙げられる。
前記Ｘは、下記一般式（３）又は一般式（４）で示されるアスパラギン酸誘導体結合基又はマレイン酸誘導体結合基もとり得る。
Figure 0006851977
ここで、一般式（３）及び一般式（４）中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアミノ基を示し、Ｒ１０はＮＨ２、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基、及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基を示し、ＣＸ−ＣＹはＣＨ−ＣＨ若しくはＺ配置のＣ＝Ｃ（二重結合）である。
Ｒ８、Ｒ９における、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基である。
直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。
分岐鎖状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。
環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
Ｒ１０において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基とは、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基としては、例えば、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基としては、例えば、アニリノ基、４−メトキシアニリノ基、４−ジメチルアミノアニリノ基、４−ヒドロキシアニリノ基等が挙げられる。
また、前記Ｒ１０は、カルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基であっても良い。カルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基としては、例えば、下記式（８）で表されるグリシニル−メチルエステル基、下記式（９−１）〜（９−３）で表されるアラニニル−メチルエステル基、アラニニル−エチルエステル基、アラニニル−ブチルエステル基、下記式（１０−１）〜（１０−３）で表されるロイシニル−メチルエステル基、ロイシニル−エチルエステル基、ロイシニル−ブチルエステル基、下記式（１１）で表されるバリニル−メチルエステル基、下記式（１２）で表されるフェニルアラニニル−メチルエステル基、等が挙げられる。
Figure 0006851977
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基と、タクロリムスのアルコール性水酸基とを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることにより得られ、本製造方法も本発明に含まれる。すなわち、ポリエチレングリコール構造部分−ポリアスパラギン酸のブロック共重合体と、必要に応じて反応させる基以外の官能基を保護したタクロリムスとを、両者が溶解する有機溶媒中、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性溶媒中、０〜１８０℃、好ましくは５〜５０℃でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）等の脱水縮合剤を用いた反応に付す製造方法である。又、縮合反応の際にＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。縮合反応後、必要に応じて脱保護を行い、通常の分離精製等の操作によりタクロリムスの高分子誘導体が製造される。
又、Ｒ５が−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）基であるタクロリムスの高分子誘導体は、上記のカルボジイミド類を縮合剤として用いても得られる。
Ｒ５に炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ６０）のジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基（カルボキシ基が保護されたアミノ酸を含む）等を導入する方法としては、ポリマーのカルボキシ基を上記の方法にて活性化してから添加したい量の対応するアルコール、対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を塩基性条件下で反応させる方法、対応するアルコール、対応するアミンやカルボキシ基が保護されたアミノ酸等を活性化させてからポリマーに反応させる方法等も可能である。ポリマーを精製した後に同様の反応でポリマー中の未反応のカルボン酸基を再活性化させることができ、ここにタクロリムスのアルコール性水酸基を縮合させてもよい。或いは異なるアルコール、アミン等を繰り返し反応させて、Ｒ５の種々の置換基の混成体を合成し、次いでタクロリムスのアルコール性水酸基を縮合させてもよい。又、タクロリムスを縮合させた後に炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ６０）のジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基等を導入してもよい。
ただし、本発明のタクロリムスの高分子誘導体の製造法は上記の方法に限定されるわけではない。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、生体内に投与後、タクロリムスを徐々に遊離する性質を有し、該タクロリムスを有効成分とする医薬としての用途を有する。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の医薬品としての用途は、該タクロリムスにより治療効果を奏する疾病であれば特に限定されるものではない。例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、臓器移植及び骨髄移植における拒絶反応の抑制等の治療に用いられる医薬に適する。特に好ましくは、自己免疫疾患あるいは炎症性疾患の治療用医薬である。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎等を挙げることができ、炎症性疾患としては、間質性肺炎等が挙げられる。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体を含む医薬は、医薬品として通常容認される他の添加剤を有していても良い。該添加剤としては、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等が挙げられる。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体を含む医薬は、治療用の医薬品製剤として調製されても良い。該製剤としては、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、臓器の灌流液に混合、患部臓器への局所投与等いずれの投与方法でも可能であるが、好ましくは非経口的投与であり、注射による静脈内投与、動脈内投与又は患部臓器への局所投与がより好ましく、通常、例えば、水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモホール等及びそれらの混合液）並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等が使用される。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の投与量は、患者の性別、年齢、生理的状態、病態等により当然変更され得るが、非経口的に、通常、成人１日当たり、活性成分として０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍ２を投与する。注射による投与は、静脈、動脈、患部（炎症部）等に行われる。
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は患部に集積し、低投与量でタクロリムス単剤より高い効果を有する。また、酵素に依存しない生理活性物質の放出及び血中濃度の維持が可能であることから、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となり、長い投与間隔及び安全性が顕著に向上する。このため、本発明のタクロリムスの高分子誘導体は臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、および感染症等の治療および予防に有用な免疫抑制剤又は抗炎症剤である。
以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。また、本発明の化合物は必要に応じて製剤化を行った後に使用した。
合成例１ ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数２０．９）の合成（化合物１）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１００．０ｇ）をＤＭＳＯ（１９００ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、５５．３ｇ、２７当量）を加え、３２．５℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（４０００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１６０００ｍＬ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１４２．７ｇ）を得た。得られた固形物（１４０．０ｇ）をＤＭＦ（１４００ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（４．４ｍＬ）を加えて３５℃にて３時間撹拌した。反応液を、エタノール（１４００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１２６００ｍＬ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１３３．７ｇ）を得た。得られた固形物（５０．０ｇ）をＤＭＦ（５００ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（５．０ｇ）を加えて、３５℃にて２４時間加水素分解を行った。反応液に活性炭（１０．０ｇ）を加えて１時間撹拌した後、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液を、酢酸エチル（１１００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（６０００ｍＬ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（４１．１ｇ）を得た。固形物を５％食塩水（２５００ｍＬ）に溶解し、２規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１１．０に調製後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１（３７．５ｇ）を得た。０．１規定の水酸化カリウムを用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は約２０．９であった。
合成例２ ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数４０）の合成（化合物２）
合成例１記載の方法に準じ、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコールに対してγ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物を５１．２５当量用いることにより、表記化合物２を得た。０．１規定の水酸化カリウムを用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は約４０．８であった。
合成例３ アスパラギン酸−１−グリシニルメチルエステル−４−ベンジルエステル塩酸塩の合成（化合物３）
Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）アスパラギン酸−４−ベンジルエステル（１２．０１ｇ）と、Ｌ−グリシンメチルエステル塩酸塩（４．６５ｇ）をＤＭＦ（１８０ｍＬ）に溶解後、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（１０．６６ｇ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）（６．８２ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（６．３ｍＬ）を加え、２．５時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルにて抽出し、５％クエン酸水溶液，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮にて酢酸エチルを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥して白色粉末（１３．７９ｇ）を得た。この白色粉末（１２．４１ｇ）を４規定の塩酸−ジオキサン溶液（１５０ｍＬ）に溶解後、室温で４．５時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え再度減圧濃縮し、真空乾燥して化合物３（１０．５８ｇ）を得た。
合成例４ ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体とアスパラギン酸−１−グリシンメチルエステルのアミド結合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数２０．９）の合成（化合物４）
化合物１（１．４ｇ）をＮＭＰ（２５ｍＬ）に溶解し、２５℃にて化合物３（１．０ｇ），ジイソプロピルエチルアミン（７２５μＬ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３４２ｍｇ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）（９３７μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をエタノール（４０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１６０ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１．８７ｇ）を得た。得られた固形物（１．７ｇ）をＮＭＰ（３６ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（１８０ｍｇ）を加えて、室温下で一夜加水素分解を行った。反応液に活性炭（３９０ｍｇ）を加えて１時間撹拌した後、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液を、エタノール（７０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（６３０ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し化合物４（１．２４ｇ）を得た。
合成例５ ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体とアスパラギン酸−１−グリシンメチルエステルのアミド結合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数４０．８）の合成（化合物５）
化合物２（１．５ｇ）をＮＭＰ（２７ｍＬ）に溶解し、２５℃にて化合物３（１．８ｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（９７８μＬ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（６７１ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（１．１２ｍＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をエタノール（７５ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（３００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（２．３ｇ）を得た。得られた固形物（２．３ｇ）をＮＭＰ（３５ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（４００ｍｇ）を加えて、室温下で一夜加水素分解を行った。反応液に活性炭（８００ｍｇ）を加えて１時間撹拌した後、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液を、ジイソプロピルエーテル（５００ｍＬ）に滴下し、攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し化合物５（２．２６ｇ）を得た。
合成例６ ポリエチレングリコール−α，β−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数２３．８）の合成（化合物６）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、７５ｇ）をＤＭＳＯ（１．４３Ｌ）に溶解後、γ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、４５ｇ、２９当量）を加え、３２．０℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（３Ｌ）及びジイソプロピルエーテル（１２Ｌ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１０６ｇ）を得た。得られた固形物（１０５ｇ）をＤＭＦ（１．０５Ｌ）に溶解し、無水酢酸（３．３ｍＬ）を加えて３５℃にて３時間撹拌した。反応液を、エタノール（１．０５Ｌ）及びジイソプロピルエーテル（９．４５Ｌ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１０３ｇ）を得た。得られた固形物（１００ｇ）をＭｅＣＮ（２Ｌ）に溶解後、０．２規定の水酸化ナトリウム（２Ｌ）を加えて、２３℃にて３時間加水分解を行った。反応液に２規定の塩酸を加えて中和した後、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去し、濃縮液を得た。酢酸エチル（２Ｌ）を用い濃縮液を３回洗浄した。水層を減圧濃縮後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１１．０に調製し、食塩（１００ｇ）を添加後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮した後、凍結乾燥し、化合物６（７５．４ｇ）を得た。０．１規定の水酸化カリウムを用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は２３．８であった。
合成例７ ポリエチレングリコール−α，β−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体とアスパラギン酸−１−グリシンメチルエステルのアミド結合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数２３．８）の合成（化合物７）
化合物６（１．２４ｇ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、２５℃にて化合物３（９９２ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（５３６μＬ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（３０．６ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（６１６μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をエタノール（４０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１６０ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１．８８ｇ）を得た。得られた固形物（１．７５ｇ）をＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（１７５ｍｇ）を加えて、室温下で一夜加水素分解を行った。反応液に活性炭（３８４ｍｇ）を加えて２時間撹拌した後、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液をエタノール（４５ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（４０５ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し化合物７（１．４４ｇ）を得た。
実施例１ 一般式（２）においてＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８、ｋ＋ｌの平均値が５．３である高分子誘導体（化合物８）
化合物６（８３２ｍｇ）、タクロリムス（５４０ｍｇ）をＤＭＦ（８．９ｍＬ）に溶解し，１５℃にてＤＭＡＰ（１６．４ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（４７４μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２７０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（２８ｍＬ）に溶解後、精製水（２８ｍＬ）及びイオン交換樹脂（１４ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物８（９８０ｍｇ）を得た。化合物８のタクロリムス含量は２０．８％と計算された。
実施例２ 一般式（２）においてＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がトリプトファニル−コレステロールエステル基（式（５−４））及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８である高分子誘導体（化合物９）
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−トリプトファン（３．５４ｇ）、コレステロール（３．０ｇ）をジクロロメタン（３８．８ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＰ（９４８．０ｍｇ）、ＥＤＣＩ（７９３．３ｍｇ）を加えて一夜撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジクロロメタン抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮にてジクロロメタンを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥して白色粉末（３．１３ｇ）を得た。この白色粉末（３．１３ｇ）を４規定の塩酸−ジオキサン溶液（２３．２５ｍＬ）に溶解後、室温で３時間撹拌した。反応液にアセトンを加え固体を析出させた後、沈殿物を濾取し、真空乾燥により白色粉末（２．６９ｇ）を得た．
この白色粉末（６０．６ｍｇ）、化合物６（３０８ｍｇ）、タクロリムス（２００．０ｍｇ）をＮＭＰ（３．３ｍＬ）に溶解し、２５℃にてジイソプロピルエチルアミン（２５．４μＬ）、ＤＭＡＰ（３０．４ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（１５３μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１００ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１０．４ｍＬ）に溶解後、精製水（１０．４ｍＬ）及びイオン交換樹脂（５．２ｍＬ）を加え、２．５時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物９（４２０ｍｇ）を得た。化合物９のタクロリムス含量は１９．３％と計算された。
実施例３ 一般式（２）においてＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが一般式（３）であり、Ｒ８及びＲ９が水素原子、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨ、Ｒ１０がグリシニル−メチルエステル基、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８である高分子誘導体（化合物１０）
化合物７（３３９ｍｇ）、タクロリムス（１５０ｍｇ）、ＤＭＡＰ（２２．３ｍｇ）をＮＭＰ（２．４ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＩＰＣＩ（１２９μＬ）を加えて１夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（７５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解後、精製水（１０ｍＬ）及びイオン交換樹脂（５ｍＬ）を加え、１時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１０（３４９ｍｇ）を得た。化合物１０のタクロリムス含量は２２．５％と計算された。
実施例４ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．９である高分子誘導体（化合物１１）
化合物１（５８８ｍｇ）、タクロリムス（３０７ｍｇ）をＤＭＦ（８．５ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（９．１ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２６０μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２５５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（２４ｍＬ）に溶解後、精製水（２４ｍＬ）及びイオン交換樹脂（１２ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１１（６２３ｍｇ）を得た。化合物１１のタクロリムス含量は１１．２％と計算された。
実施例５ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．９である高分子誘導体（化合物１２）
化合物１（５１６ｍｇ）、タクロリムス（３００ｍｇ）、オクタデシルアミン（４０ｍｇ）をＮＭＰ（５ｍＬ）に溶解し、３０℃にてＤＭＡＰ（４６ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２３０μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１５５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１７ｍＬ）に溶解後、精製水（１７ｍＬ）及びイオン交換樹脂（８．７ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１２（６２０ｍｇ）を得た。化合物１２のタクロリムス含量は１４．１％と計算された。
実施例６ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が４０．８である高分子誘導体（化合物１３）
化合物２（３３７ｍｇ）、タクロリムス（３３０ｍｇ）、オクタデシルアミン（４４ｍｇ）をＮＭＰ（５．５ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（５０ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２５３μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１６５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１７ｍＬ）に溶解後、精製水（１７ｍＬ）及びイオン交換樹脂（８．７ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１３（５０７ｍｇ）を得た。化合物１３のタクロリムス含量は２３．６％と計算された。
実施例７ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが一般式（３）であり、Ｒ８及びＲ９が水素原子、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨ、Ｒ１０がグリシニル−メチルエステル基、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．９である高分子誘導体（化合物１４）
化合物４（８４９ｍｇ）、タクロリムス（５１５ｍｇ）、オクタデシルアミン（４７．４ｍｇ）、ＤＭＡＰ（５２．１ｍｇ）をＮＭＰ（６ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＩＰＣＩ（６５７μＬ）を加えて２夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（８８６ｍｇ）を得た。得られた固形物をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解後、精製水（３０ｍＬ）及びイオン交換樹脂（１８ｍＬ）を加え、１時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮し、凍結乾燥することによって、化合物１４（０．８７ｇ）を得た。化合物１４のタクロリムス含量は１５．７％と計算された。
実施例８ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが一般式（３）であり、Ｒ８及びＲ９が水素原子、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨ、Ｒ１０がグリシニル−メチルエステル基、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が４０．８である高分子誘導体（化合物１５）
化合物５（３５７ｍｇ）、タクロリムス（３３０ｍｇ）、オクタデシルアミン（２９．５ｍｇ）、ＤＭＡＰ（３３．４ｍｇ）をＮＭＰ（４ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＩＰＣＩ（１６８μＬ）を加えて２夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１２０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１１ｍＬ）に溶解後、精製水（１１ｍＬ）及びイオン交換樹脂（５．５ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１５（４２４ｍｇ）を得た。化合物１５のタクロリムス含量は１７．４％と計算された。
実施例９ 一般式（２）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５が２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８である高分子誘導体（化合物１６）
化合物６（５２４．７ｍｇ）、タクロリムス（３４０．７ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（８ｍｇ）をＤＭＦ（５．７ｍＬ）に溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（１０．４ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（３０１．８μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１７０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解後、精製水（１０ｍＬ）及びイオン交換樹脂（１６ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１６（６２７ｍｇ）を得た。化合物１６のタクロリムス含量は２４．８％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は１．２％と計算された。
実施例１０ 一般式（２）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がトリプトファニル−コレステロールエステル基（式（５−４））、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８である高分子誘導体（化合物１７）
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−トリプトファン（３．５４ｇ）、コレステロール（３．０ｇ）をジクロロメタン（３８．８ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＰ（９４８．０ｍｇ）、ＥＤＣＩ（７９３．３ｍｇ）を加えて一夜撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジクロロメタン抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮にてジクロロメタンを除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行い、真空乾燥して白色粉末（３．１３ｇ）を得た。この白色粉末（３．１３ｇ）を４規定の塩酸−ジオキサン溶液（２３．２５ｍＬ）に溶解後、室温で３時間撹拌した。反応液にアセトンを加え固体を析出させた後、沈殿物を濾取し、真空乾燥により白色粉末（２．６９ｇ）を得た。
この白色粉末（３２．３ｍｇ）、化合物６（１６３．８ｍｇ）、タクロリムス（１０６．４ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（１．５ｍｇ）をＮＭＰ（１．８ｍＬ）に溶解し、３０℃にてジイソプロピルエチルアミン（１３．５μＬ）、ＤＭＡＰ（１６．２ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（８１．６μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（５０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（６ｍＬ）に溶解後、精製水（６ｍＬ）及びイオン交換樹脂（３ｍＬ）を加え、４時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１７を得た。化合物１７のタクロリムス含量は１５．３％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．５９％と計算された。
実施例１１ 一般式（２）においてＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５が２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが一般式（３）であり、Ｒ８及びＲ９が水素原子、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨ、Ｒ１０がグリシニル−メチルエステル基、ｔの平均値が２７２、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑの平均値が２３．８である高分子誘導体（化合物１８）
化合物７（１９７ｍｇ）、タクロリムス（８５．２ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（２ｍｇ）、ＤＭＡＰ（１２．９ｍｇ）をＮＭＰ（１．４ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＩＰＣＩ（７５μＬ）を加えて１夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（４０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（６ｍＬ）に溶解後、精製水（６ｍＬ）及びイオン交換樹脂（３ｍＬ）を加え、１時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１８（１３２ｍｇ）を得た。化合物１７のタクロリムス含量は１９．８％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．７４％と計算された。
実施例１２ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５が２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．３である高分子誘導体（化合物１９）
化合物１（２２４ｍｇ）、タクロリムス（１１７ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（１．５ｍｇ）をＤＭＦ（３．６ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（３．５ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（１０１μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１０８ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１２ｍＬ）に溶解後、精製水（１２ｍＬ）及びイオン交換樹脂（６ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１９（２４６ｍｇ）を得た。化合物１９のタクロリムス含量は９．３％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．５１％と計算された。
実施例１３ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．９である高分子誘導体（化合物２０）
化合物１（１５７ｍｇ）、タクロリムス（９１ｍｇ）、オクタデシルアミン（１２ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（１．５ｍｇ）をＮＭＰ（１．５ｍＬ）に溶解し、３０℃にてＤＭＡＰ（１４ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（７０μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（４５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（５．２ｍＬ）に溶解後、精製水（５．２ｍＬ）及びイオン交換樹脂（２．６ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物２０（１９２ｍｇ）を得た。化合物２０のタクロリムス含量は１３．２％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．７０％と計算された。
実施例１４ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘが結合、ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が４０．８である高分子誘導体（化合物２１）
化合物２（９９ｍｇ）、タクロリムス（９７ｍｇ）、オクタデシルアミン（１３ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（１．５ｍｇ）をＮＭＰ（１．６ｍＬ）に溶解し，２５℃にてＤＭＡＰ（１５ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（７４μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（４８ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解後、精製水（５ｍＬ）及びイオン交換樹脂（２．５ｍＬ）を加え、３時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物２１（１４１ｍｇ）を得た。化合物２１のタクロリムス含量は２４．８％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．８９％と計算された。
実施例１５ 一般式（１）でＲ１がメチル基、Ｒ２がトリメチレン、Ｒ３がアセチル基、Ｒ４がタクロリムス、Ｒ５がオクタデシルアミノ基、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基及びイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｘの結合基として一般式（３）の構造を有し、Ｒ８、Ｒ９が水素原子、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨ、Ｒ１０がグリシニル−メチルエステル基，ｔの平均値が２７２、ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇの平均値が２０．９である高分子誘導体（化合物２２）
化合物４（３０２ｍｇ）、タクロリムス（１８１ｍｇ）、オクタデシルアミン（１６．８ｍｇ）、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（藤本分子化学社製）（１．９６ｍｇ）、ＤＭＡＰ（１８．４ｍｇ）をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＩＰＣＩ（９３．４μＬ）を加えて２夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（６４ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（３１６ｍｇ）を得た。得られた固形物をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解後、精製水（１０ｍＬ）及びイオン交換樹脂（６ｍＬ）を加え、０．５時間撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物２２（２８２ｍｇ）を得た。化合物２２のタクロリムス含量は１７．６％、２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は０．４６％と計算された。
実施例１６ ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃとタクロリムスの高分子誘導体（化合物２３）
特許第４７４５６６４号に記載された方法にて製造したＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃ（ＰＥＧ：平均分子量１２０００；ポリグルタミン酸：平均重合数２２）（０．２８ｇ）にＤＭＦ（３ｍＬ）とタクロリムス（８５ｍｇ）を加え、３５℃にて溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（５．１ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（０．１５ｍＬ）を加えて、一夜撹拌した。２１．５時間後、ＤＩＰＣＩ（０．０７４ｍＬ）を加え、反応温度を２５℃に上げ、３時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（３０ｍＬ）に１０分かけて滴下し、室温にて２時間撹拌した。析出物を濾取してジイソプロピルエーテルで洗浄後、得られた析出物をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解後、精製水（１０ｍＬ）とイオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、５ｍＬ）を加えた。３時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾去し、凍結乾燥を行い、下記式（１３）で表される化合物２４（０．３６ｇ）を得た。タクロリムス含量は２１％と計算された。
Figure 0006851977
（式中、Ｒ１５がタクロリムス残基、Ｒ１６がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、ｔの平均値が２７２、ｒ＋ｓ＋ｕ＋ｖの平均値が２２、ｒの平均値が５．５）
合成例８ ２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンで標識した高分子誘導体（化合物２４）
特許第４７４５６６４号に記載された方法にて製造したＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃ（ＰＥＧ：平均分子量１２０００；ポリグルタミン酸：平均重合数２２）（２．０３ｇ）にＤＭＦ（５０ｍＬ）を加え、３５℃にて溶解し、２５℃にて２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン（５９ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（５３ｍｇ）を加えて、一夜撹拌した。２２時間後、ＤＭＴ−ＭＭ（２６ｍｇ）を加え、さらに１．５時間撹拌した．反応液をジイソプロピルエーテル（４８０ｍＬ）とエタノール（１２０ｍＬ）の混合溶液に１５分かけて滴下し、室温にて４時間撹拌した。析出物を濾取してジイソプロピルエーテルとエタノールの混合溶液（１００ｍＬ）で洗浄後、得られた析出物を乾燥し、下記式（１４）で表される高分子誘導体（１．８９ｇ）を得た。
Figure 0006851977
（式中、ｔの平均値は２７２、ｒ＋ｓ＋ｕ＋ｖの平均値が２２、ｒの平均値が１、ｓとｕの平均値が０、ｖの平均値が２１であり、Ｒ１２は２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基）
得られた高分子誘導体（０．５０ｇ）、４−フェニルブチルアミン（６０μＬ）、及びＤＭＡＰ（８４ｍｇ）にＤＭＦ（１０ｍＬ）を加え、３５℃にて溶解し、室温にてＤＩＰＣＩ（２１１μＬ）を加えて、一夜撹拌した。２３．５時間後、ＤＩＰＣＩ（１０６μＬ）を加え、さらに２時間撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）とエタノール（５０ｍＬ）の混合溶液に滴下し、室温にて４時間撹拌した。析出物を濾取してジイソプロピルエーテルとエタノールの混合溶液（５０ｍＬ）で洗浄後、得られた析出物をアセトニトリル（１５ｍＬ）に溶解後、精製水（５ｍＬ）とイオン交換樹脂（ダウケミカル製ダウエックス５０（Ｈ＋）、１０ｍＬ）を加えた。３時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾去し、凍結乾燥を行い、下記式（１５）で表される化合物２４（０．５０ｇ）を得た。化合物２４の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は２％と計算された。
Figure 0006851977
（式中、ｔの平均値は２７２、ｒ＋ｓ＋ｕ＋ｖの平均値が２２、ｒの平均値はｌ、ｓの平均値は１０であり、Ｒ１２は２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン残基、Ｒ１３は４−フェニルブチルアミノ基、Ｒ１４はイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基）
本発明における２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オン含量は、以下のＨＰＬＣ条件により測定した反応溶液中の２−（２−アミノエトキシ）−９−（ジエチルアミノ）−５Ｈ−ベンゾ［ａ］フェノキサジン−５−オンの消費率から算出した。
ＨＰＬＣの分析条件カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、４．６φ×１５０ｍｍカラム温度：４０℃溶離液 Ａ液：０．１％リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリルグラジェント：Ｂ液％（時間、分）、１０（０）、１０（０．０１）、５０（１２．０）、５０（１５．０）、１０（１５．０１）、ｓｔｏｐ（２０．０）流速：１．０ｍＬ／分検出器（検出波長）：ＵＶ（２５４ｎｍ）
本発明における化合物のタクロリムス含量は、以下のＨＰＬＣ条件により測定した反応溶液中のタクロリムスの消費率から算出した。
ＨＰＬＣの分析条件
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＸＲ−ＯＤＳＩＩＩ、２．０φ×２００ｍｍ
カラム温度：４０℃
溶離液 Ａ液：０．１％リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリルＡ液／Ｂ液＝８０／２０
流速：０．５ｍＬ／分
検出器（検出波長）：ＵＶ（２５４ｎｍ）
試験例１ リン酸緩衝生理食塩水中の薬剤放出性試験
実施例１〜８及び実施例１６の化合物をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、３７℃にて定温放置した。放出されたタクロリムス量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、使用した化合物中の全タクロリムス量に対する放出されたタクロリムス量の割合を求めた。実施例１乃至３及び実施例１６の結果を図１に、実施例４乃至８の結果を図２に示す。
この結果、本発明の化合物は酵素非存在下、薬剤を徐放することが示された。
試験例２ ラット血中濃度推移
８週齢雌性ＳＤラット（日本チャールズ・リバー株式会社）にタクロリムスまたは実施例１乃至８の化合物５ｍｇ／ｋｇを各群２匹ずつ単回尾静脈内投与した。投与後５分、１、６、２４、７２及び１６８時間後（タクロリムスは７２時間まで）にイソフルラン麻酔下で頸静脈を露出し、継時的に０．３mLずつ採血し、採取血液中のタクロリムス濃度を測定した。実施例１乃至４及びタクロリムスの結果を図３に、実施例５乃至８及びタクロリムスの結果を図４に示す。また、各化合物の血中濃度パラメータを表３に示す。ただし実施例１乃至８の結果はミセルから切り出されたタクロリムスの濃度及びパラメータである。
Figure 0006851977
この結果、実施例１乃至８はタクロリムスに比べ血中濃度半減期及びＭＲＴｉｎｆ．の延長を示し、タクロリムス単剤と比較して血中での滞留性が向上していることが明らかである。
試験例３ ラット単回毒性試験
雌性ＤＡラット(日本エスエルシー株式会社)にタクロリムスまたは実施例１を表４及び表５に示す投与量でそれぞれ単回尾静脈投与し、継時的に一般症状観察を行った。実施例１投与時の相対体重を図５、タクロリムス投与時の相対体重を図６に示す。
Figure 0006851977
Figure 0006851977
タクロリムス投与群では２０ｍｇ／ｋｇ以上で投与直後に腹臥位、鎮静、自発運動の低下が認められた。投与後２日目には自発運動低下、腹臥位、流涎、痙攣、よろめき歩行、不正呼吸が認められ、各群１／２例が死亡した。死亡したラットの大脳皮質には図７に示すように、神経細胞の空胞化が認められた。一方、実施例１の化合物を投与したラットは、最高用量である５０ｍｇ／ｋｇ投与群においても死亡例は見られなかった。
試験例３の結果より、タクロリムスの致死量は２０ｍｇ／ｋｇより低く、実施例１の化合物の致死量は５０ｍｇ／ｋｇより高いと言える。タクロリムス投与群は中枢神経障害によって死亡した可能性があった。一方、実施例１の化合物は、タクロリムスを高分子誘導体化することにより、タクロリムスよりもＣｍａｘが低くなったため、薬剤の脳への移行性が抑制され、タクロリムスよりも高投与量まで投与可能になったと考えられた。
試験例４ マウスＤＳＳ大腸炎における炎症部位への蛍光標識高分子誘導体の集積
２％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）溶液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールズ・リバー株式会社）に自由飲水させることで潰瘍性大腸炎を誘発させた。２％ＤＳＳ溶液を飲水後４日目に実施例９乃至１５の化合物の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｋｇ）を各郡３匹ずつ尾静脈内に投与した。対照薬としてナイルレッドを無水エタノール及びクレモホールに溶解後、生理食塩水で希釈し尾静脈内に投与した。投与後２４時間後に大腸の凍結病理切片を作成し、蛍光を観察した。結果を図８に示す。
試験例４の結果より、対照薬であるナイルレッドと比較して実施例９乃至１５は大腸の炎症部位に多く集積していることが明らかである．
試験例５ ラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果（１）
ウシ関節軟骨由来タイプＩＩコラーゲン（免疫グレード：コラーゲン技術研修会有限会社）０．３ｍｇを９週齢雌性ＤＡラット（日本エスエルシー株式会社）の背部に皮内投与することにより、コラーゲン関節炎を誘発した。タイプＩＩコラーゲン感作日及び感作後７日、１４日、２１日目に実施例１の化合物の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｋｇ）を各群３匹ずつ尾静脈内に投与した。対照薬としてタクロリムス水和物を無水エタノール及びクレモホールに溶解後、生理食塩水で希釈し尾静脈内に投与した。関節炎の判定は、目視によるスコア化により行った。結果を図９に示す。
試験例６ ラットコラーゲン誘導関節炎に対する抗炎症効果（２）
実施例１乃至８の化合物の生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｋｇ）を各群５匹ずつ尾静脈内に投与した。対照としては未投与群を設定した。他は試験例５と同様にして抗炎症効果を検討した。実施例１及び４の化合物の結果を図１０に、実施例１及び３の化合物の結果を図１１に、実施例１、２、５及び６の化合物の結果を図１２実施例１、２、７及び８の化合物の結果を図１３にそれぞれ示す。
以上の結果より、本発明の化合物は、長時間に渡り薬剤を徐放し、タクロリムスの血中滞留性を向上させることが確かめられた。また、炎症部位に高い集積性を示し、低投与量及び長い投与間隔でより高い関節炎抑制効果を有する。また、最高血中濃度を低用量で維持させることにより毒性を軽減することが示された。
試験例７ ラットコラーゲン関節炎における炎症部位への蛍光標識高分子誘導体の集積
ウシ関節軟骨由来タイプＩＩコラーゲン０．３ｍｇを１０週齢雌性ＤＡラット（日本エスエルシー株式会社）に皮内投与することにより、コラーゲン関節炎を誘発した。コラーゲン関節炎誘発群及び非誘発群に対して合成例８の化合物を尾静脈内投与し、投与後２４時間後に後肢足根関節の凍結病理切片を作製し、蛍光を観察した。結果を図１４に示す。
この結果、合成例８の化合物は、関節炎非誘発群と比較して関節炎誘発群の足根関節により高濃度で集積することが明らかとなった。また、関節炎誘発群において合成例８の化合物は周囲の水腫部位、炎症細胞浸潤部位等、急性炎症が認められる部位での集積が確認された。

Claims (14)

  1. ポリエチレングリコールセグメント及びポリアミノ酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体であって、前記タクロリムスの高分子誘導体が、
    下記一般式（２）
    Figure 0006851977
     ［式中、
    Ｒ １ は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、
    Ｒ ２ は結合基を示し、
    Ｒ ３ は水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基を示し、
    Ｒ ４ はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基を示し、
    Ｒ ５ はそれぞれ独立して、疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ ６ ）ＣＯＮＨ（Ｒ ７ ）（Ｒ ６ 、Ｒ ７ は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）からなる群から選択され、
    Ｘは結合又は結合基であり、
    ｔは５〜１１５００の整数を示し、
    ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ及びｑは各々０または２００以下の正の整数を示し、
    ｋ＋ｌは１〜２００の整数を示し、
    ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑは３〜２００の整数を示し、
    ただし、ｍ＋ｎは０ではなく、
    ポリアミノ酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］
    で表されるタクロリムスの高分子誘導体。
  2. ｌが０であり、ｎが０であり、及びｐが０である、請求項１に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  3. Ｘが結合である請求項１又は請求項２に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  4. Ｒ５が疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）である請求項３に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  5. Ｘの結合基がアスパラギン酸誘導体である請求項１又は請求項２に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  6. Ｒ５が疎水性置換基及び−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよく炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。）である請求項５に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  7. Ｘの結合基が、下記一般式（３）又は一般式（４）
    Figure 0006851977
     ［式中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子または炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基を示し、Ｒ１０はＮＨ２、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基を示し、ＣＹ−ＣＺはＣＨ−ＣＨ若しくはＣ＝Ｃ（二重結合）を示す。］である請求項１又は請求項２に記載のタクロリムスの高分子化合物。
  8. Ｒ８、Ｒ９が共に水素原子であり、ＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨである請求項７に記載のタクロリムスの高分子化合物。
  9. 疎水性置換基が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルオキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ２〜Ｃ６０）のジアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルケニルアミノ基、およびアミノ酸誘導体残基からなる群から選択される請求項１乃至８の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  10. Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基であり、ｔが５０〜１５００の整数であり、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑが４〜１５０の整数である請求項１乃至９の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  11. Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数（Ｃ２〜Ｃ４）のアルキレン基であり、Ｒ３が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアシル基であり、ｔが１００〜１５００の整数であり、ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑが８〜１２０の整数である請求項１乃至９の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  12. Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がトリメチレン基であり、Ｒ３がアセチル基である請求項１乃至１１の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
  13. ポリエチレングリコールセグメント及びポリアスパラギン酸誘導体からなる共重合体の側鎖のカルボキシ基にタクロリムスのアルコール性水酸基を有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合させることを特徴とする請求項１乃至請求項１２の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体の製造方法。
  14. 請求項１乃至１２の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体を有効成分とするマクロライド系免疫抑制剤。
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