JP6838743B2 - 非ペプチド性ｇａｐｄｈ凝集阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、非ペプチドであるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）の凝集阻害剤に関する。

認知障害を主徴とするアルツハイマー病は早急に対策を要する疾患である。アルツハイマー病などのアミロイドーシスとGAPDHの凝集には関連があり、GAPDHの凝集を阻害すればアミロイドβの凝集や沈着が防止されることが指摘されている。このような状況下において、本願発明者らは、特定のアミノ酸配列を有する１０〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチドがGAPDHの凝集を阻害することを見いだし、特許出願を行っている（特許文献１）。

しかしながら、ペプチドは消化管で分解されるだけでなく体内における代謝も早く、静脈投与によっても脳内への移行が少ないとされる。また、ペプチドの合成や精製も困難であるという問題点があるので、ペプチドに類似した非ペプチド化合物（ペプチドミミック）が望まれる。

特開２０１３−２４１４０２号公報

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、特許文献１に開示されたペプチドについて更に研究を進めたところ、さらに短いアミノ酸残基からなるペプチドがGAPDHの凝集を抑制することを突き止めた。そしてこのペプチドから種々の化合物をモデリングしたところ、GAPDHの凝集を選択的に阻害する化合物が見いだされた。つまり、本発明の課題は、GAPDH凝集阻害剤として使用し得る新たな非ペプチド化合物を提供することにある。

本発明に係る化合物は次の化学式１（化１）で示される化合物又はそれらのポリサルファー化誘導体であって、GAPDH凝集阻害剤として使用される。但し、式中の、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は炭素原子数が１以上１０以下の脂肪族炭化水素基である。また、本発明に係る化合物はそれらの薬理学的に許容される塩でもあり得る。

本発明は非ペプチド化合物である新しいGAPDH凝集阻害剤を提供する。

図１は化合物TN-101の合成経路を示す図である。 図２はアミロイドβ40誘発性PC12細胞死におけるGAI-17ぺプチドの保護効果を示す図である。図中「＊＊」はコントロールとの間で有意差（有意水準１％）があったことを、「＃＃」「††」は対象群間で有意差（有意水準１％）があったことを示す。 図３は脳卒中モデルにおけるGAPDH凝集と脳梗塞の関係を示す図である。（ａ）は脳内GAPDH凝集体の形成を示すウエスタンブロッティングの画像を、（ｂ）は脳内GAPDH凝集体の形成と脳梗塞体積の関係を示す図である。 図４はGAI-17ペプチドの脳保護効果を示す図である。（ａ）は脳梗塞体積の変化を示す図、（ｂ）は神経症状の改善を示す図である。 図５はGAPDHと化合物TN-101が結合した状態のファーマコフォアモデルを示す図である。 図６は化合物TN-101の１次スクリーニングの結果を示す図である。 図７は化合物TN-101の２次スクリーニングの結果を示す図である。 図８は化合物TN-101のGAPDH凝集阻害活性（ＩＣ₅₀）の測定結果を示すグラフである。図中「＊＊」はGAI-17ペプチドとの間で有意差（有意水準１％）があったことを示す。

本発明に係る化合物は次の化学式１（化１）で示される化合物又はそれらの化合物のポリサルファー化誘導体である。なお、化学式中、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は炭素原子数が１以上１０以下の脂肪族炭化水素基である。ハロゲン原子は、フッ素原子であり、塩素原子であり、臭素原子であり、ヨウ素原子であり得る。脂肪族炭化水素基は、飽和又は不飽和の炭化水素基でもあり、直鎖状又は分岐状の炭化水素基でもあり得る。脂肪族炭化水素基は、例えば、メチル基であり、エチル基であり、ｎ−プロピル基であり、イソプロピル基であり、ｎ−ブチル基であり、イソブチル基であり、sec-ブチル基であり、tert-ブチル基であり得る。本発明において、ポリサルファー化誘導体とは、化学式２（化２：但し式中ｎは１以上の整数）又は化学式５（化５：但し式中ｎは１以上の整数）に示されるように、化学式１で示される化合物のイオウ原子にさらに１個又は２個以上のイオウ原子（ポリサルファー）が付加された化合物、及び化学式３（化３：但し式中ｎは１以上の整数）又は化学式６（化６：但し式中ｎは１以上の整数）に示されるように２分子の化学式１で示される化合物が、１個又は２個以上のイオウ原子（ポリサルファー）を介在させて結合した誘導体を意味する。また、本発明に係る化合物は、薬理学的に許容される塩でもあり得る。当該塩は、例えば塩酸塩であり、硫酸塩であり、マレイン酸塩であり、オレイン酸塩、フマル酸塩であり得る。なお、化学式５又は化学式６に示された化合物はそれぞれ化学式２又は化学式３において、Ｒ _１ ，Ｒ _２ ，Ｒ _３ のそれぞれが水素原子である化合物である。

化学式１で示される化合物は、一般的な合成方法により容易に合成され得る。その合成方法は例えば、図１に示される。もっとも、図１に示された反応条件や試薬、溶媒は例示であり、適宜当業者により好ましい条件や試薬や溶媒が選択され得る。そして、そのポリサルファー化誘導体は、公知の方法、例えば、Idaらの論文（Ida T, Sawa et al., Reactive cysteine persulfides and S-polythiolation regulate oxidative stress and redox signaling, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2014, 111巻21号, 7606-7611頁）に記載された方法によって製造し得る。

本発明に係る化合物はGAPDH凝集阻害作用を発揮し、種々の脳神経変性疾患又はその症状の予防、治療又は改善に使用され得る。脳神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病であり、ハンチントン病であり、パーキンソン病であり、脳梗塞であり得る。当該化合物は、GAPDHの活性中心にあるCys-152周辺に形成される結合ポケットに、化合物のＳＨ基が入り、GAPDHのCys-152とＳ-Ｓ結合を生じて、GAPDHのオリゴマー化（凝集）を阻止する。したがって、医薬品としての使用に際しては、置換基であるＲ_１，Ｒ_２，Ｒ_３の選択に際してはファーマコアフォアモデルが参考にされ、炭素原子数が１０よりも大きい場合もあり得る。GAPDHの凝集は、脳神経変性疾患に関与する種々のタンパク質、例えばアルツハイマー病におけるアミロイドβである、の凝集や沈着を防止し得る。また、脳血流障害時には、脳梗塞に先だってGAPDH凝集体が形成されることから、脳梗塞の発生や進行を阻止し得る。

当該化合物は医薬品として使用される場合、典型的には医薬組成物として使用される。医薬組成物は、脳室内への直接投与の他、経皮投与、静脈内投与、筋肉内投与、経直腸投与など種々の方法により投与され得る。医薬組成物は、各投与経路に応じた剤型に調製され得る。その剤型は特に限定されず、例えば散剤であり、顆粒剤であり、錠剤であり、カプセル剤であり、内服用液剤であり、注射剤であり、スプレー剤であり、軟膏であり、硬膏剤であり得る。

本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る化合物と製剤化に必要な担体及びその他の補助剤を含み得る。製剤化に必要な担体は、例えば、デンプンや乳糖、白糖などの賦形剤であり、液剤のための精製水であり、注射剤のための注射用精製水であり、外用剤に使用されるワセリンやラノリンなどの軟膏用基剤であり得る。その他の補助剤は、例えば、トラガントガムやゼラチンのような結合剤、ステアリン酸マグネシウムやタルクのような滑沢剤、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースのような崩壊剤、メチルセルロースやヒドロキシプロピルセルロースなどのコーティング剤、ｐＨ調整剤、安定剤、乳化剤などであり得る。

化合物の投与量は、投与される化合物の種類、疾患の種類や患者の状態、投与経路、患者の年齢や体重等によって適宜決定され得る。医薬組成物中の配合量は、必要とされる投与量となるように、剤型に応じて適宜調製され得る。その配合量は、概ね組成物中０.０００１％〜５０％程度であるが、この範囲に限られるものではない。

以下、下記の実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されることのないのはいうまでもない。

〔ペプチドのダウンサイジング〕
ペプチドミミックの作製に際し、リード化合物となるペプチドの探索を行った。表１に示すようにアミノ酸配列を有するGAI-1（配列番号１）から、そのＮ末端及びＣ末端にあるアミノ酸を数個欠損させた各種のペプチドを合成した。合成した各ペプチドについて、下記の１次スクリーニング、２次スクリーニング、３次スクリーニングを行い、ＳＣＴのアミノ酸配列からなるペプチド（GAI-17）を選択した。また、選択したGAI-17のペプチドについて、GAPDH凝集阻害活性におけるＩＣ₅₀値を求めた。これらの結果を表１に示す。

（１次スクリーニング）
１次スクリーニングとして、潜在能力(Potency)を示すGAPDH凝集阻害活性を測定した。特許文献１に記載の方法に準じ、５μM精製ヒトGAPDHをBuffer G2に溶解した溶液にペプチドを５０μＭとなるように添加した後、３７℃４８時間でインキュベートし、溶液の濁度（４０５nmにおける吸光度）からGAPDHの凝集阻害率を測定した。

（２次スクリーニング）
２次スクリーニングとして、Ａ．細胞毒性(Cytotoxicity）を示すペプチドの存在下におけるPC12細胞の生存率、Ｂ．副作用(Side effect)を示すGAPDH酵素活性に及ぼす影響、Ｃ．特異性(Specificity)を示すアミロイド形成に及ぼす影響をそれぞれ調べた。
Ａ．細胞毒性
８０％コンフルエントに培養したPC12細胞を、５０μMのペプチドの存在下で３７℃７２時間培養し、常法に従って細胞の生存率(Cell viability)を測定した。
Ｂ．副作用
特許文献１に記載の方法に準じ、０.０１μMの精製ヒトGAPDHに対して10μMのペプチドをそれぞれ添加して、GAPDHの酵素活性を測定した。
Ｃ．特異性
特許文献１に記載の方法に準じ、２５μMのアミロイドβ23-35を含む溶液を３７℃で１時間インキュベートし、その溶液の蛍光強度からアミロイド凝集形成を評価した。

（３次スクリーニング）
３次スクリーニングとして、有効性(Effectiveness)を示す細胞保護効果を調べた。特許文献１に記載の方法に準じ、Ａβ1-40誘発PC12細胞死に対する細胞保護効果を調べた。

次に、GAI-17について、アミロイド形成を促進するGAPDH-Seeds（GAPDHによるアミロイド様線維）の存在下におけるアミロイドβ誘発性細胞死に対する保護効果、及び脳保護効果について下記方法により調べた。
（GAPDH-Seeds存在下におけるアミロイドβ誘発性細胞死に対する保護効果）
GAPDH-Seeds（１％）及びGAI-17（５０μM）の存在下で、特許文献１の記載の方法に準じてＡβ1-40誘発PC12細胞死に対する細胞保護効果を調べた。その結果を図２に示す。
（脳保護効果）
脳保護効果として、脳卒中モデル（MCAO)における脳梗塞体積の変化及び神経症状の改善を調べた。脳卒中モデルマウスに対して、ペプチドを60nmol／マウスで脳室内投与し、２４時間後の脳梗塞体積の減少及び神経症状の改善を測定した。脳卒中モデルマウスは、Andrabiらの方法（Andrabi et atl.，Nat Med.，2011，Jun；17(6)：692-9）に従って作製された。マウスを３０分間の虚血状態に保った後還流を再開した。虚血開始３６時間経過後に脳梗塞体積を測定した。また、Andrabiらの方法（同上）に従って、マウスの神経症状についてのニューロロジカルスコアを求め、神経症状の改善度を求めた。

9-フルオレニルメトキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン（Fmoc-Cys(Trt)-OH）3gと(R)-(-)-1-アミノ-2-プロパノール0.58gを、HOAt 0.8gと水溶性カルボジイミド塩酸（Water Soluble Carbodiimide・HCl）1.28gを含む35mlのジメチルホルムアミド中、室温で１時間反応させ、3.5gの化合物１を得た。次に1gの化合物１を20%のピペリジンを含む35mlのジクロロメタンに溶解し、室温で３０分反応させた。その後、反応物をNHシリカゲルカラムに吸着させ、溶離液（酢酸エチル・クロロホルムの等容量混合液：メタノール＝9:1）で溶出させて、0.69gの化合物２を得た。0.69gの化合物２と4.29gの2-(3-ブロモプロポキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩2.34mLを脱水したアセトニトリル40ml中で反応させ、1.94gの化合物３を得た。1.94gの化合物３を、トリフルオロ酢酸/トリイソプロピルシラン/水/ドデカンチオールの混合液10ml中、室温で３０分間反応させ、0.41gの粗製化合物Ｃ（粗TN-101）を得た。この粗製化合物Ｃ82mgをODSカラムに吸着させた後、溶離液（0.1％のトリフルオロ酢酸を含む1%アセトニトリル水溶液）で溶出させ、34mgの精製化合物Ｃ（TN-101）のトリフルオロ酢酸塩を得た。エレクトロスプレーイオン化質量分析及びＮＭＲにより、この化合物は、分子量が237.1である化合物（塩フリー）であることが確認された。

（化合物TN-101の合成）
次にGAI-17のペプチドをリード化合物としてデザイニングを行い、化学式１中、Ｒ_１，Ｒ_２，Ｒ_３のそれぞれが水素原子である化合物（TN-101）を図１に示すフローに従って合成した。

9-フルオレニルメトキシカルボニル-S-トリチル-L-システイン（Fmoc-Cys(Trt)-OH）3gと(R)-(-)-1-アミノ-2-プロパノール0.58gを、酢酸0.8gと水溶性カルボジイミド塩酸（Water Soluble Carbodiimide・HCl）1.28gを含む35mlのジメチルホルムアミド中、室温で１時間反応させ、3.5gの化合物１を得た。次に1gの化合物１を20%のピペリジンを含む35mlのジクロロメタンに溶解し、室温で３０分反応させた。その後、反応物をNHシリカゲルカラムに吸着させ、溶離液（酢酸エチル・クロロホルムの等容量混合液：メタノール＝9:1）で溶出させて、0.69gの化合物２を得た。0.69gの化合物２と4.29gの2-(3-ブロモプロポキシ)テトラヒドロ-2H-ピランを、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩2.34mLを脱水したアセトニトリル40ml中で反応させ、1.94gの化合物３を得た。1.94gの化合物３を、トリフルオロ酢酸/トリイソプロピルシラン/水/ドデカンチオールの混合液10ml中、室温で３０分間反応させ、0.41gの粗製化合物Ｃ（粗TN-101）を得た。この粗製化合物Ｃ82mgをODSカラムに吸着させた後、溶離液（0.1％のトリフルオロ酢酸を含む1%アセトニトリル水溶液）で溶出させ、34mgの精製化合物Ｃ（TN-101）のトリフルオロ酢酸塩を得た。エレクトロスプレーイオン化質量分析及びＮＭＲにより、この化合物は、分子量が237.1である化合物（塩フリー）であることが確認された。

この化合物は、図５に示すように、TN-101は、GAPDHの凝集活性中心であるCys-152周辺に形成される疎水性結合ポケットに入り込み、TN-101のＳＨ基がアクセスすることで、GAPDHのCys-152のチオール基を保護し、GAPDHのオリゴマー化が阻止されることがシミュレートされた。

（TN-101の有効性）
化合物TN-101について、実施例１と同様の方法により１次スクリーニング及び２次スクリーニングを行った。その結果、１次スクリーニングにおいてTN-101はリード化合物（GAI-17ペプチド）よりも優れた凝集阻害活性を示し（図６）、２次スクリーニングにおいてもリード化合物と同等若しくはそれよりも少ない細胞毒性並びにGAPDH酵素活性の非阻害性を示した（図７）。また、GAPDH凝集阻害活性におけるＩＣ₅₀値（０.９０±０.１１μM）もリード化合物に比べて有意に小さく（図８）、TN-101は好適なGAPDH凝集阻害剤といえる。

前記Idaらの論文に記載の方法に準じて化合物１のポリサルファー化誘導体を合成した。TN-101（20ｍＭ）水溶液と20ｍＭ硫化水素ナトリウム（NaHS）を、20μＭトリス塩酸塩緩衝液（pH7.4）に溶解した20ｍＭヨード（I₂）溶液存在下で混和し、室温で15分間反応させた。反応液を、逆相液体クロマトグラフィーでし、TNS-(S)n-STN（化学式６）を分取した。なお、この段階では、ｎ＝０の単純二量体（TNS-STN）も生成され、ｎが０を含む任意の整数である混合物が得られる。分取した混合物をさらに、逆相液体クロマトグラフィーでし、TNS-S-STN（化学式４）を得た。

本発明に係る化合物はアルツハイマー病などのアミロイド凝集を伴う脳アミロイドーシスや脳虚血に伴う脳神経変性疾患の治療剤や予防剤に使用され得る。

Claims (5)

1. 化学式１（但し、式中のＲ_１，Ｒ_２，Ｒ_３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は炭素原子数が１以上１０以下の脂肪族炭化水素基である。）、化学式２（但し、式中のＲ_１，Ｒ_２，Ｒ_３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は炭素原子数が１以上１０以下の脂肪族炭化水素基であり、ｎは１以上の整数である。）、化学式３（但し、式中のＲ_１，Ｒ_２，Ｒ_３はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又は炭素原子数が１以上１０以下の脂肪族炭化水素基であり、ｎは１以上の整数である。）の何れかで示される化合物、並びにそれらの薬理学的に許容される塩。
   
   
   
2. 請求項1に記載の化合物から選ばれる１以上の化合物を有効成分とするGAPDH凝集阻害剤。
3. 請求項１に記載の化合物から選ばれる１以上の化合物を含有する医薬組成物。
4. 脳神経変性疾患又はその症状を予防、治療又は改善するための、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記脳神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳梗塞の何れかである、請求項４に記載の医薬組成物。