[go: up one dir, main page]

JP6814824B2 - アポトーシスを誘導するための組成物及び方法 - Google Patents

アポトーシスを誘導するための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6814824B2
JP6814824B2 JP2019002767A JP2019002767A JP6814824B2 JP 6814824 B2 JP6814824 B2 JP 6814824B2 JP 2019002767 A JP2019002767 A JP 2019002767A JP 2019002767 A JP2019002767 A JP 2019002767A JP 6814824 B2 JP6814824 B2 JP 6814824B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
complex
morpholinos
morpholino
seq
morf2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019002767A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019089779A (ja
Inventor
ジンドリッヒ ヘンリー コペチェック
ジンドリッヒ ヘンリー コペチェック
ジュアン ヤン
ジュアン ヤン
テ ウェイ チュ
テ ウェイ チュ
Original Assignee
ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション
ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション, ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション filed Critical ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション
Publication of JP2019089779A publication Critical patent/JP2019089779A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6814824B2 publication Critical patent/JP6814824B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７７６，９９９号の利益を主張する。
（連邦政府資金による研究開発の記載）
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＧＭ９５６０６下で政府の支援でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
（配列表の参照）
２０１４年３月１１に作成されたものであり、１３，５７６ｂである、「２１１０１＿０２８３Ｐｌ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして２０１４年３月１１日に提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って参照により本開示に組み込まれる。
薬物を含まない高分子治療プラットフォーム（Ｄｒｕｇ ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ）は、いくつかの疾患及び障害の処置に大きな可能性を有する。例えば、本明細書に記載のような、その後にアポトーシスを誘導するＣＤ２０の架橋は、Ｂ細胞悪性疾患、炎症性障害、及びＢ細胞の関与する自己免疫疾患を含む、いくつかの疾患及び障害を処置するために使用されることができる。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、高い死亡率を有する世界中で蔓延している癌である。２０１２年には、米国のみで、ＮＨＬの新規症例が７０，１３０件あり、ＮＨＬによる死亡例が１８，９４０件あった。約８５％のＮＨＬは、Ｂ細胞を起源とする悪性腫瘍であり、残りの悪性腫瘍はＴ細胞を起源とする。Ｂ細胞ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫を含む。これらの癌は、通常、緩慢性または侵攻性のいずれかに分類され、９５％超のＢ細胞リンパ腫が、細胞表面抗原ＣＤ２０を有する。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、主にリツキシマブ、は、一般的に使用されるＮＨＬ患者への免疫療法である。しかしながら、免疫療法の奏効率は低く（再発／難治性ＮＨＬについては＜５０％）、まれに致死副作用を生成し得る（例えば、進行性多巣性白質脳症）。多くの研究者が、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の臨床的非応答性及び有害効果は、Ｆｃ誘導性細胞事象に起因するとしてきた。
Ｂ細胞悪性疾患、炎症性障害、及びＢ細胞の関与する自己免疫疾患の処置において有効である組成物及び方法が依然として不足している。これらの必要性及び他の必要性を本発明によって満たす。
標的化部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）及びオリゴヌクレオチドを含む複合体を本明細書に開示する。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体であって、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり、Ｆａｂ’断片は、ＣＤ２０受容体に特異的であり、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり、Ｆａｂ’断片は、チオエーテル結合を介してモルフォリノにコンジュゲートされる、複合体を本明細書に開示する。
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を本明細書に開示する。
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体であって、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み、コポリマー担体は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオンモノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミドを含み、一本以上の側鎖は、一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得、一つ以上のオリゴヌクレオチドは、モルフォリノである、複合体を本明細書に開示する。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体、及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体を含むキットを本明細書に開示する。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体、コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体、及び第一の複合体及び第二の複合体を投与するための説明書を含むキットを本明細書に開示する。
アポトーシスを誘導する方法であって、細胞の集団を標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体と接触させること；及び細胞の集団をコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体と接触させることを含み、第一の複合体及び第二の複合体と細胞の接触が細胞のアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。
アポトーシスを誘導する方法であって、細胞の集団を、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体とコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む第二の複合体とを含む組成物と接触させることを含み、該組成物と細胞の接触が細胞のアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。
それを必要とする対象の処置方法であって、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体を含む第一の組成物を対象に投与すること；コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体を含む第二の組成物を対象に投与することを含み、第一の組成物及び第二の組成物の投与が、対象における細胞の標的集団のアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、標的化部分を得ること、オリゴヌクレオチドを修飾すること、及び標的化部分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることを含むプロセスを本明細書に開示する。
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、コポリマー担体を得ること、一つ以上のオリゴヌクレオチドを修飾すること、及びコポリマー担体を一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることを含むプロセスを本明細書に開示する。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体、及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体を、コポリマー担体から一つ以上のオリゴヌクレオチドまでを含む第二の複合体と接触させることを含むプロセスを本明細書に開示する。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を図示し、説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって誘導されるＣＤ２０架橋媒介性アポトーシスを使用したＢ細胞根絶のための薬物を含まない高分子治療プラットフォームの例示的な設計を概説する概略図を示す。 例示的な一対の相補的なモルフォリノ−ＭＯＲＦ１−ｍ（配列番号２５）及びＭＯＲＦ２−ｍ（配列番号２６）についての化学構造及び核酸塩基配列を示す。 図３Ａは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の合成及びＭＯＲＦ２の複数のコピーを用いたコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の合成を示す。 図３Ｂ−１は、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の合成及びＭＯＲＦ２の複数のコピーを用いたコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の合成を示す。 図３Ｂ−２は、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の合成及びＭＯＲＦ２の複数のコピーを用いたコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の合成を示す。 図４は、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって特徴づけられる、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体とコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを示す。 図５は、共焦点蛍光顕微鏡によって解析された、Ｒａｊｉ Ｂ細胞の表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の生体認識を示す。 図６Ａ〜図６Ｃは、三つの方法で解析された、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体を活用したＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシス誘導を示す。 図７は、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合アッセイによって解析された、ＲａｊｉＢ細胞の濃度依存性アポトーシス誘導を示す。 図８Ａ〜図８Ｂは、ＲａｊｉＢ細胞（ＣＤ２０+）及びＤＧ−７５細胞（ＣＤ２０-）におけるアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合アッセイ対照試験を示す。 図９は、アポトーシス誘導のための自己組織化ハイブリッドナノ複合体（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の概略図を示す。 図１０Ａは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の合成及び特徴付けを示す。 図１０Ｂは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の合成及び特徴付けを示す。 図１０Ｃは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の合成及び特徴付けを示す。 図１０Ｄは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の合成及び特徴付けを示す。 図１１Ａは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを示す。 図１１Ｂは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを示す。 図１１Ｃは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを示す。 図１２Ａは、細胞表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の生体認識を示す。 図１２Ｂは、細胞表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の生体認識を示す。 図１２Ｃは、細胞表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＰ−ＭＯＲＦ２複合体の生体認識を示す。 図１３Ａは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＲａｊｉ Ｂ細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。 図１３Ｂは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＲａｊｉ Ｂ細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。 図１３Ｃは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＲａｊｉ Ｂ細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。 図１４は、ＳＣＩＤマウスのリンパ腫に対する本開示の複合体及び／または組成物の治療有効性を示す。 図１５Ａは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＳＣＩＤマウス内のＲａｊｉ細胞の根絶を示す。 図１５Ｂは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＳＣＩＤマウス内のＲａｊｉ細胞の根絶を示す。 図１５Ｃは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＳＣＩＤマウス内のＲａｊｉ細胞の根絶を示す。 図１５Ｄは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＳＣＩＤマウス内のＲａｊｉ細胞の根絶を示す。 図１５Ｅは、本開示の複合体及び／または組成物を使用したＳＣＩＤマウス内のＲａｊｉ細胞の根絶を示す。 図１６Ａは、ＰＢＳ及びＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を用いた処置後のマウスの病理組織学的試験を示す。 図１６Ｂは、ＰＢＳ及びＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を用いた処置後のマウスの病理組織学的試験を示す。 図１６Ｃは、ＰＢＳ及びＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を用いた処置後のマウスの病理組織学的試験を示す。 図１７Ａは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の特徴付けを示す。 図１７Ｂは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の特徴付けを示す。 図１７Ｃは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の特徴付けを示す。 図１７Ｄは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の特徴付けを示す。 図１７Ｅは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体の特徴付けを示す。 図１８ＡはＰ−ＭＯＲＦ２複合体の特徴付けを示す。 図１８ＢはＰ−ＭＯＲＦ２複合体の特徴付けを示す。 図１８ＣはＰ−ＭＯＲＦ２複合体の特徴付けを示す。 図１８ＤはＰ−ＭＯＲＦ２複合体の特徴付けを示す。 図１８ＥはＰ−ＭＯＲＦ２複合体の特徴付けを示す。 図１９は、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２のハイブリダイゼーション時の淡色効果を示す。 図２０は、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２及び前駆体Ｆａｂ’−ＳＨ及びＰ−ＴＴの流体力学的有効径を示す。 図２１Ａは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ、コンジュゲート、及びその混合物のハイブリダイゼーションの解析を示す。 図２１Ｂは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ、コンジュゲート、及びその混合物のハイブリダイゼーションの解析を示す。 図２１Ｃは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ、コンジュゲート、及びその混合物のハイブリダイゼーションの解析を示す。 図２１Ｄは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ、コンジュゲート、及びその混合物のハイブリダイゼーションの解析を示す。 図２２Ａは、ＣＤスペクトル測定による、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１／Ｐ−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。 図２２Ｂは、ＣＤスペクトル測定による、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１／Ｐ−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。 図２３Ａは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。 図２３Ｂは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。 図２３Ｃは、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。 図２４Ａ〜図２４Ｂは、Ｒａｊｉ細胞及びＤＧ７５細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスの対照試験を示す。 図２５Ａは、異なるアッセイによって、および異なるインキュベーション時間で、解析されたＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスを示す。 図２５Ｂは、異なるアッセイによって、および異なるインキュベーション時間で、解析されたＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスを示す。 図２６Ａは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を注入され、異なる処置に曝されたマウスの造影Ｔ1強調矢状断像ＭＲＩを示す。 図２６Ｂは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を注入され、異なる処置に曝されたマウスの造影Ｔ1強調矢状断像ＭＲＩを示す。 図２６Ｃは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を注入され、異なる処置に曝されたマウスの造影Ｔ1強調矢状断像ＭＲＩを示す。 図２７Ａは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２７Ｂは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２７Ｃは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２７Ｄは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２７Ｅは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２７Ｆは、異なる処置を受けた、腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留ＲａｊｉＢ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 図２８は、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を注射され、異なる処置に曝されたマウスの体重を示す。 図２９は、ＳＣＩＤマウスにおける125Ｉ標識Ｆａｂ’−ＭＯＲＦコンジュゲートの血液活性時間プロファイルを示す。
本発明のさらなる利点は、以下の説明に部分的に記載され、一部は説明から明らかになり、または本発明の実践によって習得されることができる。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示であり、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されたい。
（発明の詳細な説明）
本発明は、本発明の以下の詳細な説明及びそこに含まれる実施例を参照することによってより容易に理解することができる。
本化合物、組成物、物品、システム、デバイス、及び／または方法を開示し説明する前に、別段の指示が無い限りそれらは特定の合成方法に限定されないこと、または別段の指示がない限り特定の試薬に限定されないこと、当然それ自体変化してよいことが理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的とするものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料を以下に記載する。
本明細書で言及する全ての刊行物は、刊行物が引用されて関連する方法及び／または材料を開示及び記載するために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日以前のその開示のためにのみ提供される。本明細書に記載のいずれも、本発明が先行発明によって、かかる刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
Ａ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形は、文脈で明確に別段の指示が無い限り、複数の言及を含む。
範囲は、本明細書で「約」一特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表されるとき、さらなる態様は一特定の値から及び／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって、値が概数として表されるとき、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるだろう。それぞれの範囲の終点は、他の終点に関連して、及び他の終点から独立して、その両方で重要であることがさらに理解されるだろう。本明細書には多くの値が開示されており、その値自身に加えて、各値も本明細書で「約」その値と開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。二つの特定の単位間の各単位も開示されるということも理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
組成物内の特定の要素または成分の重量部に対する本明細書及び請求項における言及は、重量部がそれについて表される、組成物または物品内の要素または成分及び任意の他の要素または成分間の重量の関係性を示す。ゆえに、２重量部の成分Ｘ及び５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、Ｘ及びＹは、２：５の重量比で存在し、化合物にさらなる成分が含有されているかいないかにかかわらず、かかる比率で存在する。
本明細書で用いるとき、用語「任意選択」または「任意選択的に」は、その後に記載される事象または出来事が起こり得るまたは起こり得ないことを意味し、その記載が前記事象または出来事が起こる場合及び起こらない場合を含むことを意味する。例えば、一態様では、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体は、任意選択的に検出可能標識を含み得る。一態様では、本開示の方法は、任意選択的に本開示の組成物及び／または複合体の投与を反復することを含み得る。
本明細書で用いるとき、用語「類似体」は、親化合物（例えば、本明細書に開示の化合物）の構造から由来する構造を有する化合物をさし、その構造は、本明細書に記載のそれと十分に類似し、その類似性に基づき、特許請求される化合物と同一または類似の活性及び有用性を呈する、または、前駆物質として特許請求される化合物と同一または類似の活性及び有用性を誘導すると当業者によって予期され得る。
本明細書で用いるとき、「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」または「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」は、特定の既知の配列に相同性を有するポリペプチドまたは核酸を指す。述べられたまたは既知の配列に対して、少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上の相同性パーセントを有する本明細書に開示の核酸及びポリペプチドの変異体を具体的に開示する。当業者は、どのようにして二つ以上のタンパク質または二つ以上の核酸の相同性を決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高水準であるように、二つ以上の配列を整列させた後に算出され得る。本開示の遺伝子及び本明細書のタンパク質の任意の変異体、変更形態、及び誘導体を規定するための一方法は、特定の既知の配列に対する相同性に関して変異体、変更形態、及び誘導体を規定することを通してなされることが理解される。
本明細書で用いるとき、「アプタマー」は、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子を指す。一般的には、アプタマーは、ステムループまたはＧカルテットなどの、定義された二次及び三次構造へと折りたたまれた１５〜５０塩基の長さの小核酸である。アプタマーは、小分子及び大分子を結合し得る。アプタマーは、標的分子からのＫｄが１０-12Ｍ未満で非常に堅固に結合し得る。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子を結合し得る。アプタマーは当該分野で周知であり、種々の異なる標的分子を結合するためのアプタマーの作成及び使用方法の代表的な例は、米国特許の次の非限定的なリストにおいて見出され得る：５，４７６，７６６号、５，５０３，９７８号、５，６３１，１４６号、５，７３１，４２４号、５，７８０，２２８号、５，７９２，６１３号、５，７９５，７２１号、５，８４６，７１３号、５，８５８，６６０号、５，８６１，２５４号、５，８６４，０２６号、５，８６９，６４１号、５，９５８，６９１号、６，００１，９８８号、６，０１１，０２０号、６，０１３，４４３号、６，０２０，１３０号、６，０２８，１８６号、６，０３０，７７６号、及び６，０５１，６９８号。
本明細書で用いるとき、「標的化部分」は、例えばＢ細胞などの、細胞または細胞の集団の表面上にある認識分子に特異的であり得る。本開示の組成物及び方法の一態様では、標的化部分は、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、完全長抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ’）2、シングルドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、ハイブリッド断片、ファージディスプレイ抗体、リボソームディスプレイ抗体、ペプチド、ペプチドリガンド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、糖類または多糖類、及びアプタマーを含むことができる。
本明細書で用いるとき、用語「対象」は、投与の標的、例えば動物を指す。用語「対象」は、飼育動物（例えば、ネコ、イヌ等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエ等）も含む。ゆえに、本明細書に開示の方法の対象は、哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類または両生類などの脊椎動物であり得る。あるいは、本明細書に開示の方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモット、又は齧歯類であり得る。本用語は、特定の年齢または性別を示さない。ゆえに、成人及び新生児対象、ならびに胎児、男女いずれも、が包含されると意図される。一態様では、対象はヒト患者であり得る。
患者は、例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞の関与する自己免疫疾患などの一つ以上の疾患または障害に罹患する対象を指す。一態様では、疾患及び障害は、限定されないが、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症を含む。一態様では、対象は、次の一つ以上を有し得る：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。一態様では、患者はＪＣウイルスを有する。一態様では、患者は、臓器移植を受けている。本開示の方法の一態様では、患者は、投与ステップの前に一つ以上の前述の疾患または障害の処置が必要であると診断されている。本開示の方法の一態様では、患者は、例えば、悪性Ｂ細胞などの悪性細胞のアポトーシスを誘導する必要があると診断されている。
本明細書で用いるとき、「非ホジキンリンパ腫」または「ＮＨＬ」は、リンパ組織の癌を指す。異質の病状として、ＮＨＬは、リンパ節及び全身系統の膨大を引き起こし得る。
本明細書で用いるとき、用語「処置」は、疾患、病態、または障害（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、及びＢ細胞の関与する自己免疫疾患など）を治療、改善、安定化、または予防することを意図した患者の医療管理を指す。この用語は、積極的処置、つまり、疾患、病態、または障害の改善に特異的に向けられた処置を含み、原因処置、つまり関連する疾患、病態、または障害の原因の除去に向けられた処置も含む。加えて、この用語は、緩和処置、つまり、疾患、病態、または障害の治療よりも症状の緩和のために設計された処置；予防的治療、つまり関連する疾患、病態、または障害の進展を最小化するまたは部分的または完全に阻害する処置；及び支持処置、つまり、関連する疾患、病態、または障害の改善に向けられた別の特定の治療法を補完するために採用される処置を含む。様々な態様では、本用語は、哺乳類（例えば、ヒト）を含む、対象の任意の処置を包含し、（ｉ）まだ疾患を有すると診断されていないが、素因があり得る対象における疾患の発症を予防すること；（ｉｉ）疾患を阻害すること、すなわちその進展を阻止すること；または（ｉｉｉ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退縮を引き起こすことを含む。
本明細書で用いるとき、用語「予防」または「予防する」は、特に事前の作用によって、何かが起こることを、排除する、回避する、除去する、未然に防ぐ、停止する、または妨げることを指す。低減する、阻害するまたは予防するが本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、他の二つの単語の使用も明確に開示されることが理解される。一態様では、悪性の細胞増殖を予防することが意図される。
本明細書で用いるとき、用語「診断される」は、当業者、例えば医師による身体検査を受けており、本明細書に開示の化合物、組成物、または方法によって診断または処置され得る病状を有すると見出されていることを意味する。例えば、「ＮＨＬと診断される」は、当業者、例えば医師による身体検査を受けており、悪性細胞の増殖を予防または阻害し得る及び／またはＢ細胞などの細胞の集団においてアポトーシスを誘導し得る化合物または組成物によって診断され得るまたは処置され得る病状を有すると見出されていることを意味する。さらなる例として、「アポトーシスを誘導する必要があると診断される」は、当業者、例えば医師による身体検査を受けており、細胞の集団のアポトーシスを誘導することが対象に利益をもたらすだろう、悪性細胞の増殖または他の疾患を特徴とする病状を有すると見出されていることを指す。かかる診断は、本明細書に記載のように、例えばＮＨＬ等の障害に関連し得る。
本明細書で用いるとき、「一つ以上のオリゴヌクレオチド」は「一つ以上のモルフォリノ」を指し得る。例えば、一態様では本開示のコポリマー担体は、一つ以上のグラフトされたオリゴヌクレオチドを含み得、または一つ以上のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、「一つ以上のオリゴヌクレオチド」または「一つ以上のモルフォリノ」は、１モルフォリノ、または２モルフォリノ、または３モルフォリノ、または４モルフォリノ、または５モルフォリノ、または６モルフォリノ、または７モルフォリノ、または８モルフォリノ、または９モルフォリノ、または１０モルフォリノを含み得る。例えば、一態様では、本開示のコポリマーは、１モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、３モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、一つ以上のグラフトされたＭＯＲＦ２モルフォリノを含み得る。例えば、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は１つのグラフトされたモルフォリノ、または３つのグラフトされたモルフォリノ、または１０のグラフトされたモルフォリノ、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。例えば、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１つのグラフトされたＭＯＲＦ２、または３つのグラフトされたＭＯＲＦ２、または１０のグラフトされたＭＯＲＦ２、または１０超のグラフトされたＭＯＲＦ２を含み得る。
本明細書で用いるとき、語句「障害のための処置が必要であると同定される」または類似の表現は、障害の処置への必要性に基づいた対象の選択を指す。例えば、対象は、当業者による先の診断に基づいて、障害（例えば、ＮＨＬまたは悪性の細胞増殖に関連する何か他の障害または細胞の集団のアポトーシスを必要とする障害）の処置の必要性を有すると同定され得、その後に障害のための処置に供された。同定は、一態様では、診断をなした人とは異なる人によってなされ得ることが企図される。さらなる態様では、診断を行った人によって投与が行われ得ることも企図される。
本明細書で用いるとき、用語「投与すること」及び「投与」は、本開示の組成物、複合体、または医薬製剤を対象に提供する任意の方法を指す。かかる方法は、当業者に周知であり、限定されないが、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、点眼、経耳投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、バッカル投与、及び、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射剤を含む非経口投与を含む。投与は、連続的または間欠性であり得る。種々の態様では、製剤は、治療的に投与され得る；つまり、存在する疾患または病状を処置するために投与され得る。さらに種々の態様では、製剤は予防的に投与され得る；つまり疾患または病状の予防のために投与され得る。一態様では、当業者は、アポトーシスを誘導するように、本開示の組成物または本開示の複合体についての投与の有効用量、有効計画、または有効経路を決定することができる。一態様では、当業者は、本開示の複合体または本開示の組成物の有効性を改善するように、投与ステップの態様を変更または修正することもできる。
本明細書で用いるとき、「一つ以上の投与ステップを変更する」は、一つ以上の本開示の組成物または本開示の複合体の投与を変えるまた修正することを含み得る。一態様では、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体を投与することは、例えば、投与経路を変える、または組成物の用量を変える、または投与のタイミングを変える、または投与の頻度を変える、またはそれらの組み合わせによって、変更され得る。一態様では、コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体の投与は、例えば、投与経路を変える、または組成物の用量を変える、または投与のタイミングを変える、または投与の頻度を変える、またはそれらの組み合わせによって、変更され得る。一態様では、一つ以上の投与ステップの変更は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体の投与を変更すること、及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体の投与を変更することを含み得る。
用語「接触する」は、本明細書で用いるとき、本開示の組成物、化合物、または複合体と目的の標的（例えば、細胞または細胞の集団、受容体、抗原、または他の生物学的実体など）を、本開示の組成物、化合物、または複合体が目的の標的（例えば、受容体、転写因子、細胞、細胞の集団、等）の活性に影響を及ぼし得る方法で、直接的（すなわち、標的自身と相互作用することによって）、または間接的（すなわち、標的の活性が依存する別の分子、余因子、因子、またはタンパク質と相互作用することによって）のいずれかで一緒にすることを指す。一態様では、本開示の組成物または複合体は、例えば、Ｂ細胞などの細胞または細胞の集団と接触し得る。
本明細書で用いるとき、用語「決定する」は、発現及び／または活性レベルまたは有病率及び／または発生率における活性または事象または数量または量または変化を測定するまたは確かめることを指し得る。例えば、決定は、アポトーシス誘導の数量または量を測定するまたは確かめることを指し得る。決定は、カスパーゼ活性または発現の数量または量を測定するまたは確かめることも指し得る。本明細書で用いる、発現及び／または活性レベルまたは有病率及び／または発生率における活性または事象または数量または量又は変化を決定するために使用される方法及び技術は、なんらかの定量化可能な値を測定または確かめるために当業者がとるであろうステップを指し得る。当該分野は、発現及び／または活性レベルまたは有病率及び／または発生率における活性または事象または数量または量または変化を測定する方法に精通している。
本明細書で用いるとき、用語「有効量」及び「有効な量」は、所望の結果を達成するまたは望ましくない病状に影響を与えるのに十分な量を指す。例えば、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するまたは望ましくない症状に影響を与えるのに十分であるが、通常、有害副作用を引き起こすには不十分である量を指す。例えば、一態様では、本開示の組成物または複合体の有効量は、所望の細胞または細胞の集団においてアポトーシスを誘導するのに有効な量である。任意の特定の患者のための特定の治療有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般健康状態、性別、及び食事；投与の時間；投与の経路；採用される特定の化合物の排出速度；処置の期間；採用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物を含む種々の因子及び医療分野で周知の同様の因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するために必要なものより低いレベルで本開示の組成物または複合体の投薬を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることは十分に当該分野の範囲内である。必要に応じて、有効一日用量は、投与の目的のために複数の用量に分割され得る。その結果、単回投与組成物は、一日用量を構成するためにかかる量またはその約数を含有し得る。用量は、任意の禁忌の事象において個別の医師によって調整され得る。用量は変動することができ、一日に一回以上の投薬を、一日または数日にわたって投与され得る。一態様では、製剤は「予防有効量」；つまり、疾患または病状の予防のために有効な量で投与され得る。
用語「薬学的に許容され得る」は、生物学的にまたは他に望ましくないことがない、すなわち、許容できないレベルの望ましくない生物学的影響を引き起こすまたは有害な様式での相互作用することがない、材料を説明する。本明細書で用いるとき、用語「薬学的に許容され得る担体」は、滅菌水性または非水性溶液、分散液、懸濁剤または乳剤、ならびに使用直前に滅菌注射用溶液または分散液へと再構成するための滅菌粉末を指す。好適な水性及び非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース及びその好適な混合物、植物油（オリーブオイルなど）及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤も含有し得る。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤を含むことによって確保され得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望ましくあり得る。注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤の包含によってもたらされ得る。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）などの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比及び採用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度は制御され得る。デポー注射製剤は、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を閉じ込めることによっても調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターに通して濾過することによって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。好適な不活性担体は、ラクトースなどの糖を含み得る。
ｉ）コポリマー
従来のコポリマーは、世界中の多くの研究室で、及びいくつかの臨床試験でも使用されている。（その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３７，８８３号を参照）。例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＨＰＭＡ）コポリマーは、（１）生体適合性であり、十分に確立された安全性プロフィールを有する；（２）水溶性であり、低分子量（遊離型、非結合）薬物と比較したとき良好な薬物動態を有する；及び（３）優れた化学的柔軟性（すなわち、異なる側鎖を含有するモノマーは、容易に合成され、その構造中に組み込まれ得る）を有する。しかしながら、ＨＰＭＡポリマーは分解性ではなく、ＨＰＭＡポリマーの分子量は、生体適合性を維持するために、腎閾値未満に保たれるべきである。これは、ＥＰＲ（血管透過性・滞留性亢進）効果を介して、固形腫瘍におけるＨＰＭＡポリマーの血管内半減期及び蓄積を制限する。
これらの制限を克服するために、骨格分解性ＨＰＭＡコポリマー担体が開発された。コポリマー担体は、酵素的に分解可能な配列（すなわち、カテプシンＢ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍａｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）等によって）を主鎖（すなわち、ポリマー骨格）内に、及び酵素的に分解可能な側鎖（すなわち、薬物放出のために）を含有し得る。（例えば、その全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／５８３，２７０を参照）。細胞のリソソームコンパートメントに到着する際、薬物は放出され、それに付随してポリマー担体は、腎閾値未満の分子に分解され、対象から除去され得る。ゆえに、分子量の増加したジブロックまたはマルチブロック生分解性コポリマーが生成され得る。これは、さらに、本明細書に開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の血液循環時間を向上させ得、それは、例えば、循環癌細胞（すなわち、悪性Ｂ細胞）を標的とする薬物を含まない高分子治療に好適である。さらには、米国特許第４，０６２，８３１号は、水溶性ポリマーの範囲を記載し、米国特許第５，０３７，８８３号は、種々のペプチド配列を記載し、その両方はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
ｉｉ）モルフォリノ
本明細書に開示の組成物及び方法は、化学的に修飾された骨格を有する生体適合性の、合成のオリゴヌクレオチド類似体を活用し得る。以下に示す概略図は、いくつかの類似体を一覧表示し、これらの類似体と天然ＤＮＡの特性を比較する。
これらの特性に基づき、本開示の組成物及び方法は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡとは互換性がない。むしろ、類似体は生体適合性及び非分解性でないといけないため、本開示の組成物及び方法は、ホスホロジアミデート（ｐｈｏｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ）モルフォリノオリゴヌクレオチド（モルフォリノまたはＭＯＲＦとしても知られる）を活用し得る。モルフォリノは、化学的に修飾された、非電荷骨格を有し、そのそれぞれが６員モルホリン環に連結された４つの核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）の１つを含有する、４つの異なるサブユニットから組み立てられる。サブユニットは、非イオン性ホスホロジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄａｔｅ）結合によって結合されてモルフォリノオリゴヌクレオチドを生成する。モルフォリノは、また、強い結合親和性（すなわち、低ｎＭからｐＭレベルまでのＫｄ）、高い配列特異性、及び十分に実証された安全性プロファイルを有する。さらには、モルフォリノの免疫原性は、高度に配列依存性であり、それゆえに、取り組まれ得る。モルフォリノの合成、構造及び結合特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号、５，２１７，８６６号、５，１４２，０４７号、５，０３４，５０６号、５，１６６，３１５号、５，５２１，０６３号、及び５，５０６，３３７号に詳述されており、そのそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
より長い長さを有する本開示のモルフォリノは、より高い特異性及びより強い結合親和性を提供する；しかしながら、かかるモルフォリノは、劣った水溶性も有する。当該分野では、１４ｂｐ〜１５ｂｐのモルフォリノが理想的な標的化効果を維持するために必要な最低限の長さであると考える。２５ｂｐのモルフォリノは、強い結合親和性及び良好な水溶性（約５〜３０ｍＮ）を確保し得る。例えば、本開示の組成物及び方法において２５ｂｐのモルフォリノを使用することで、ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２のハイブリダイゼーションへの立体障害の影響を避けることができる。より長い配列は、ハイブリダイゼーションに、より良好な「立体柔軟性」を提供し得る。従って、本開示の組成物及び方法では、モルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得る。一態様では、例えば、モルフォリノは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ｂｐの長さであり得る。
本開示のモルフォリノのＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇ含有量は、三つの因子：（１）Ｇ＋Ｃ含有量（Ｇ及びＣの数または割合）、（２）Ｇ含有量（Ｇの数または割合）、及び（３）Ｃ含有量（Ｃの数または割合）に基づいて決定され得る。
Ｇ＋Ｃ含有量について、本開示のモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧ＋Ｃ含有量を含み得る。この範囲は、最適な結合効率及び特異性を提供し得る。Ｇ含有量について、本開示のモルフォリノは、約３６％未満のＧ含有量を含み得る。このレベルのＧ含有量は、良好な水溶解度を提供し得る；しかしながら、４またはそれ以上のＧの反復は避けるべきである。Ｃ含有量について、本開示のモルフォリノは、７未満のＣ含有量を含み得る。このレベルのＣ含有量は、モルフォリノの腎臓蓄積を高める好ましくない効果を回避し得ることを保証し得る。さらには、一つ以上のモルフォリノとコポリマーのコンジュゲーションは、モルフォリノの薬物動態プロファイルを好ましく変更し得、腎臓蓄積を（モルフォリノとＦａｂ’断片のコンジュゲーションと比較して）低減させ得る。表１は、変動するＣ含有量のレベルを含むモルフォリノの腎臓蓄積を示す。２５Ｃを有するモルフォリノは、注射わずか３時間後に正常マウスの腎臓において最も高い蓄積割合を有した（Ｌｉｕら、２００４）。
表１．
本開示の組成物及び方法では、Ｆａｂ’断片にコンジュゲートされたモルフォリノは、より多くのＡ及びより少ないＣを含み得、一方でコポリマーにコンジュゲートされた一つ以上のモルフォリノは、より多くのＣ及びより少ないＡを含み得る。従って、一態様では、２５ｂｐのモルフォリノは、３Ｃ、６Ｇ、１２Ａ、４Ｔ（Ｇ＋Ｃ＝３６％、Ｇ＝２４％）を含み得る。相補的な２５ｂｐのモルフォリノは、６Ｃ、３Ｇ、４Ａ、１２Ｔ（Ｇ＋Ｃ＝３６％、Ｇ＝１２％）を含み得る。
各モルフォリノの核酸塩基組成を決定した後に、公的にアクセス可能な、オンライン配列「スクランブラ―」を、ヒトｍＲＮＡとの最小のオフターゲット結合を確保するために使用することができる。さらには、公的にアクセス可能な、オンライン配列解析ソフトウェアを、最小限の自己相補性を確保するために使用することができる。本明細書に開示の実験では、自己相補性を避けるために配列解析を行うとき、「自己二量体化のために必要な最小限の塩基対」及び「ヘアピンのために必要な最小限の塩基対」を、「２」及び「２」（１０ｂｐ及び１２ｂｐについて）；「３」及び「３」（１５ｂｐ、１８ｂｐ、２０ｂｐ、２３ｂｐ、及び２５ｂｐについて）；「４」及び「４」（２８ｂｐ、３０ｂｐ、３２ｂｐ、及び３５ｂｐについて）；及び「５」及び「４」（３８ｂｐ及び４０ｂｐについて）に設定した。表２は、本開示の組成物及び方法で使用するための例示的なモルフォリノの一覧を提供する。
表２−例示的なモルフォリノの一覧


一態様では、本開示のモルフォリノの対間でのハイブリダイゼーションは、塩基対合（すなわち、特定の水素結合パターン）によって達成され得る。ハイブリダイゼーションは、塩基スタッキング（すなわち、π相互作用）によって維持され得る。本開示のモルフォリノの対間でのハイブリダイゼーションは、コイルドコイルペプチドの形成より特異的であることに留意されたい。
一態様では、本開示の組成物及び方法で活用されるモルフォリノは、完全に相補的（１００％）であり得、または完全より少なく相補的であり得る。それゆえ、一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノの相補性の割合は、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５〜１００％相補的であり得る。一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノは、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的であり得る。一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノは、少なくとも９３％相補的であり得る。
一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノは、１５ｎＭ未満の平衡解離定数Ｋｄを有し得る。一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-7Ｍより小さい結合定数（Ｋｄ）を有し得る。一態様では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体のモルフォリノ及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-9Ｍより小さい結合定数（Ｋｄ）を有し得る。
Ｂ．組成物
ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体を本明細書に開示する。一態様では、本開示の複合体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は当業者に周知であり、限定されないが、ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０を含む。
本開示の複合体の一態様では、標的化部分は、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子について特異的であり得る。非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子の例は、当業者に周知である。一態様では、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、細胞または細胞の集団上にあり得る。一態様では、細胞または細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞であり得る。
本開示の複合体の一態様では、非内在化細胞表面分子は受容体であり得る。一態様では、緩徐内在化細胞表面分子は受容体であり得る。例えば、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、限定されないが、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含み得る。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体であり得る。一態様では、受容体は、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）であり得る。一態様では、受容体は、細胞表面死受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体４（ＤＲ４）であり得る。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体５（ＤＲ５）であり得る。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）であり得る。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）であり得る。一態様では、受容体は、アポトーシス受容体のＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）であり得る。
本開示の複合体の一態様では、標的化部分は、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり得る。一態様では、標的化部分は、多糖類であり得る。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドであり得る。一態様では、標的化部分は、アプタマーであり得る。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、ヒト化され得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、抗ＣＤ２０受容体抗体から由来し得る。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は当該分野で周知であり、限定されないが、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、及びＢＬＸ−３０１を含む。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５であり得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。本開示の複合体の一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
本開示の複合体の一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、本開示のモルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、本開示のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、モルフォリノは、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）修飾であり得る。
本開示の複合体の一態様では、モルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含む。例えば、モルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１１ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１３ｂｐの長さ、１４ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１６ｂｐの長さ、１７ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、１９ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２１ｂｐの長さ、２２ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２４ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２６ｂｐの長さ、２７ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、２９ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３１ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３３ｂｐの長さ、３４ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３６ｂｐの長さ、３７ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、３９ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。
一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、モルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得る。一態様では、モルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
本開示の複合体の一態様では、モルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、３シチジン、６グアノシン、１２アデノシン、及び４チミジンを含み得る。例えば、一態様では、３シチジン、６グアノシン、１２アデノシン、及び４チミジンを含むモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得る。一態様では、本開示の複合体のモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、モルフォリノは３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、モルフォリノは、７つ以下のＣを含み得る。
本開示の複合体の一態様では、標的化部分は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションの種類及びコンジュゲートの方法は、当該分野で周知である。一態様では、本開示の複合体の標的化部分は、オリゴヌクレオチドに、例えば、共有結合を介してコンジュゲートされ得る。一態様では、標的化部分は、オリゴヌクレオチドに、チオール基を介してコンジュゲートされ得る。チオール基は、当該分野で周知である。本開示の複合体の一態様では、標的化部分は、オリゴヌクレオチドに、チオエーテル結合、チオール−マレイミド結合、チオール−ビニルスルホン結合、チオール−ハロゲノ結合、チオール−ペンタフルオロフェニルエステル結合、チオール−エン結合、またはチオール−イン結合を介してコンジュゲートされ得る。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体であって、標的化部分はＦａｂ’断片であり、Ｆａｂ’断片はＣＤ２０受容体に特異的であり、オリゴヌクレオチドはモルフォリノであり、及びＦａｂ’断片は、チオエーテル結合を介してモルフォリノにコンジュゲートされる、複合体を本明細書に開示する。
ｉｉ）コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を本明細書に開示する。一態様では、本開示の複合体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は当該分野で周知であり、限定されないが、ローダミン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０を含む。
本開示の複合体の一態様では、コポリマー担体は、水溶性であり得る。本開示のコポリマーの一態様では、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、主鎖担体は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、一本以上の側鎖は酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、一本以上の側鎖は、官能基で終わり得る。官能基は、当該分野で周知であり、限定されないが、アミン反応性活性エステル、マレイミド、アジド、及びアルキンを含む。一態様では、官能基は、本開示のコポリマー複合体の一本以上の側鎖への一つ以上のオリゴヌクレオチドの結合を可能にし得る。一態様では、一本以上の側鎖は、本開示の官能基を介して一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。一態様では、主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。一態様では、主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ｐ−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−ＧＧ−ＯＮｐ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。本開示の複合体の一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
本開示の複合体の一態様では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。一態様では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、本開示の一つ以上のモルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどの、ゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、本開示の一つ以上のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、アミン誘導体化され得る。典型的には官能基として求核剤の添加を必然的に含み、アミン誘導体化及びチオール誘導体化を含む誘導体化は、当該分野で周知である。一態様では、本開示の一つ以上のモルフォリノは、アミンペンタフルオロフェニルエステル、アミンサクシニミドキシエステル、またはアミンカルボキシルの使用を通して生成され得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、チオール誘導体化され得る。一態様では、本開示の一つ以上のモルフォリノは、チオール−マレイミドの使用を通して生成され得る。
一態様では、本開示のコポリマーは、一つ以上のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、１モルフォリノ、または２モルフォリノ、または３モルフォリノ、または４モルフォリノ、または５モルフォリノ、または６モルフォリノ、または７モルフォリノ、または８モルフォリノ、または９モルフォリノ、または１０モルフォリノを含み得る。例えば、一態様では、本開示のコポリマーは、１モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、３モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、一つ以上のグラフトされたＭＯＲＦ２モルフォリノを含み得る。例えば、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１つのグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、３つのグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１０のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは、同一のオリゴヌクレオチドを含み得るか、異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、同一のモルフォリノを含み得るか、異なるモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノまたはグラフトされたモルフォリノは、同一の配列を有し得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノまたはグラフトされたモルフォリノは、異なる配列を有し得る。例えば、一態様では複数のモルフォリノが存在し得、ここで一つ以上のモルフォリノは、異なる配列を含み、または一つ以上のモルフォリノは同一の配列またはその組み合わせを含む。
本開示の複合体の一態様では、一つ以上のモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、７つ以下のＣを含み得る。
本開示の複合体の一態様では、一つ以上のモルフォリノは１０ｂｐ〜４０ｂｐを含む。例えば、モルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１１ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１３ｂｐの長さ、１４ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１６ｂｐの長さ、１７ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、１９ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２１ｂｐの長さ、２２ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２４ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２６ｂｐの長さ、２７ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、２９ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３１ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３３ｂｐの長さ、３４ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３６ｂｐの長さ、３７ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、３９ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。
［１０７］ 一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
一態様では、本開示の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、６シチジン、３グアノシン、４アデノシン、及び１２チミジンを含み得る。例えば、一態様では、６シチジン、３グアノシン、４アデノシン、及び１２チミジンを含む一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体であって、コポリマー担体が主鎖及び一本以上の側鎖を含み、コポリマー担体がＮ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み、一本以上の側鎖が一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得、一つ以上のオリゴヌクレオチドがモルフォリノである、複合体を本明細書に開示する。
ｉｉｉ）キット
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体とコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体を含むキットを本明細書に開示する。一態様では、本明細書に開示のキットは、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体とコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体を投与するための説明書を含み得る。
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体、コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体、及び第一の複合体及び第二の複合体を投与するための説明書を含むキットを本明細書に開示する。
一態様では、第一の複合体及び第二の複合体は同時に処方される。一態様では、第一の複合体及び第二の複合体は、同梱される。
本開示のキットの一態様では、標的化部分は、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子に特異的であり得る。非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子の例は、当該分野で周知である。一態様では、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、細胞または細胞の集団上にあり得る。一態様では、細胞または細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞であり得る。
本開示のキットの一態様では、非内在化細胞表面分子は受容体であり得る。一態様では、緩徐内在化細胞表面分子は受容体であり得る。例えば、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、限定されないが、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含む。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体であり得る。一態様では、受容体は、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）であり得る。一態様では、受容体は、細胞表面死受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体４（ＤＲ４）であり得る。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）であり得る。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）であり得る。一態様では、受容体は、アポトーシス受容体のＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）であり得る。
一態様では、本開示のキットの標的化部分は、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、多糖類であり得る。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドであり得る。一態様では、標的化部分は、アプタマーであり得る。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、ヒト化され得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、抗ＣＤ２０受容体抗体から由来し得る。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は当該分野で周知であり、限定されないが、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、及びＢＬＸ−３０１を含む。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５であり得る。
本開示のキットの一態様では、コポリマー担体は、水溶性であり得る。一態様では、本開示のコポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、官能基で終わり得る。官能基は、当該分野で周知であり、限定されないが、アミン反応性活性エステル、マレイミド、アジド、ジスルフィド、及びアルキンを含む。一態様では、官能基は、コポリマー複合体の一本以上の側鎖への一つ以上のオリゴヌクレオチドの結合を可能にし得る。一態様では、一本以上の側鎖は、一つ以上のオリゴヌクレオチドに、官能基を介してコンジュゲートされ得る。一態様では、本開示のコポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ｐ−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−ＧＧ−ＯＮｐ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、本開示のキットのオリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
本開示のキットの一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。一態様では、本開示のオリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、本開示のモルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、本開示のモルフォリノは、自己相補的でない。本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、相補的であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-7Ｍより小さいＫｄを有し得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-9Ｍより小さいＫｄを有し得る。
一態様では、本開示のキットのコポリマーは、一つ以上のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、１モルフォリノ、または２モルフォリノ、または３モルフォリノ、または４モルフォリノ、または５モルフォリノ、または６モルフォリノ、または７モルフォリノ、または８モルフォリノ、または９モルフォリノ、または１０モルフォリノを含み得る。例えば、一態様では、本開示のコポリマーは、１モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、３モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０モルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマーは、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、一つ以上のグラフトされたＭＯＲＦ２モルフォリノを含み得る。例えば、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１つのグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、３つのグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１０のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、本開示のコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、１０超のグラフトされたモルフォリノを含み得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノまたはグラフトされたモルフォリノは、同一の配列を有し得る。一態様では、一つ以上のモルフォリノは、異なる配列を有し得る。例えば、一態様では、複数のモルフォリノが存在し得、ここで一つ以上のモルフォリノは、異なる配列を含み、または一つ以上のモルフォリノは同一の配列またはその組み合わせを含む。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得る。例えば、一態様では、本開示のキット内のそれぞれのモルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、７つ以下のＣを含み得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは３８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは３８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３Ｃ、６Ｇ、１２Ａ、及び４Ｔを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは６Ｃ、３Ｇ、４Ａ、及び１２Ｔを含み得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。
本開示のキットの一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
ｉｖ）医薬組成物
一つ以上の本開示の複合体を含む本開示の組成物を含む医薬組成物を本明細書に開示する。例えば、一態様では、本開示の医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体及び（ｉｉ）薬学的に許容され得る担体を含む。一態様では、本開示の医薬組成物は、（ｉ）コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体及び（ｉｉ）薬学的に許容され得る担体を含む。一態様では、本開示の医薬組成物は、（ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体、（ｉｉ）コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体、及び（ｉｉｉ）薬学的に許容され得る担体を含む。
一態様では、本開示の医薬組成物は、Ｂ細胞悪性腫瘍、炎症性障害、またはＢ細胞の関与する自己免疫疾患の処置を必要とする対象に投与され得る。例えば、一態様では、本開示の医薬組成物は、ＮＨＬの処置を必要とする対象に投与され得る。一態様では、本開示の医薬組成物は、次の一つ以上の処置を必要とする対象に投与され得る：関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。一態様では、対象は、次の一つ以上を有し得る：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。一態様では、本開示の医薬組成物は、臓器移植後の処置を必要とする患者に投与され得る。一態様では、本開示の医薬組成物は、処置を必要とする対象に投与され得、ここで患者はＪＣウイルスを有する。
採用される医薬担体は、例えば、固体、液体、または気体であり得る。固体担体の例としては、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸が挙げられる。液体担体の例としては、糖シロップ、落花生油、オリーブオイル、及び水が挙げられる。気体担体の例としては、二酸化炭素及び窒素が挙げられる。
経口剤形用の組成物の調製において、任意の慣用の医薬媒体を採用することができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤などを用いて、懸濁液、エリキシル及び溶液などの経口液体製剤を形成することができる。一方で、デンプン、糖、微結晶セルロースなどの担体、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを用いて、粉末、カプセル及び錠剤などの経口固体製剤を形成することができる。錠剤及びカプセルは、それにより固体の医薬的担体が用いられる好ましい経口投薬単位である。任意選択的に、錠剤に、標準的な水性または非水性の技術によるコーティングを施してよい。本明細書に開示の組成物または複合体を含有する錠剤は、任意選択的に一つ以上の副成分または補助剤とともに、圧縮または成形することにより調製され得る。圧縮錠剤は、好適な機械にて、任意選択的に結合剤、潤滑剤、不活性な希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合した、粉末または顆粒などの流動性形態の本開示の組成物の複合体を圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、粉末化化合物の混合物を不活性な液体の希釈剤で湿らせ、適当な機械にて成形することにより作製することができる。
本開示の組成物は、本開示の化合物から調製され得ることが理解されたい。本開示の組成物は、本開示の使用法において採用され得ることも理解されたい。
Ｃ．方法
ｉ）アポトーシスを誘導する方法
アポトーシスを誘導する方法であって、細胞の集団を標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体と接触させること；細胞の集団をコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体と接触させることを含み、第一の複合体及び第二の複合体と細胞の接触が細胞のアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。一態様では、本開示の方法は、細胞の集団を標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体と接触させることを反復することを含み得る。一態様では、本開示の方法は、細胞の集団をコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体と接触させることを反復することを含み得る。一態様では、本開示の方法は、細胞の集団を標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体と接触させること及び細胞の集団をコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体と接触させることを含み得る。一態様では、当業者は、アポトーシスを誘導するように、本開示の組成物または本開示の複合体についての投与の有効用量、有効計画、または有効経路を決定することができる。
一態様では、アポトーシスを誘導する本開示の方法は、細胞のアポトーシスを確認することを含み得る。アポトーシスを確認する方法は、当該分野で周知であり、限定されないが、カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定を含む。一態様では、アポトーシスの確認は次の一つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の二つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の全てを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞は、悪性Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞の集団は、対象内にあり得る。一態様では、Ｂ細胞は、対象内にあり得る。一態様では、対象は、非ホジキンリンパ腫を有し得る。一態様では、対象は、臓器移植を受けたことがあり得る。一態様では、対象は、ＪＣウイルスを有し得る。一態様では、対象は、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症を有し得る。一態様では、対象は、次の一つ以上を有し得る：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、標的化部分は、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子について特異的であり得る。非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子の例は、当該分野で周知である。一態様では、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、細胞または細胞の集団上にあり得る。一態様では、細胞または細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、非内在化細胞表面分子は受容体であり得る。一態様では、緩徐内在化細胞表面分子は受容体であり得る。例えば、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、限定されないが、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含む。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体であり得る。一態様では、受容体は、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）であり得る。一態様では、受容体は、細胞表面死受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体４（ＤＲ４）であり得る。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）であり得る。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）であり得る。一態様では、受容体は、ＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子受容体（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）であり得る。
本開示の方法の一態様では、標的化部分は、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、多糖類であり得る。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドであり得る。一態様では、標的化部分は、アプタマーであり得る。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、ヒト化され得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、抗ＣＤ２０受容体抗体から由来し得る。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は、当該分野で周知であり、限定されないが、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、及びＢＬＸ−３０１を含む。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、コポリマー担体は、水溶性であり得る。一態様では、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、官能基で終わり得る。官能基は、当該分野で周知であり、限定されないが、アミン反応性活性エステル、マレイミド、アジド、ジスルフィド、及びアルキンを含む。一態様では、官能基は、本開示のコポリマー複合体の一本以上の側鎖への一つ以上のオリゴヌクレオチドの結合を可能にし得る。一態様では、一本以上の側鎖は、本開示の官能基を介して一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。一態様では、本開示のコポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。一態様では、本開示のコポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ｐ−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−ＧＧ−ＯＮｐ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、モルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、モルフォリノは自己相補的でない。本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、相補的であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-7Ｍより小さいＫｄを有し得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-9Ｍより小さいＫｄを有し得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得る。例えば、一態様では、本開示の方法におけるそれぞれのモルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、７つ以下のＣを含み得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３シチジン、６グアノシン、１２アデノシン、及び４チミジンを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、６シチジン、３グアノシン、４アデノシン、及び１２チミジンを含み得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得、ここで、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
ｉｉ）アポトーシスを誘導する方法
アポトーシスを誘導する方法であって、細胞の集団を、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体とコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む第二の複合体とを含む組成物と接触させることを含み、該組成物と細胞の接触がアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。本開示の方法は、細胞と該組成物の接触を反復することを含み得る。本開示の方法は、細胞のアポトーシスを確認することを含み得る。アポトーシスを確認する方法は、当該分野で周知であり、限定されないが、カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定を含む。一態様では、アポトーシスの確認は次の一つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の二つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の全てを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、当業者は、アポトーシスを誘導するように、本開示の組成物または本開示の複合体についての投与の有効用量、有効計画、または有効経路を決定することができる。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞は、悪性Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞の集団は、対象内にあり得る。一態様では、Ｂ細胞は、対象内にあり得る。一態様では、対象は、非ホジキンリンパ腫を有し得る。一態様では、対象は、臓器移植を受けたことがあり得る。一態様では、対象は、ＪＣウイルスを有し得る。一態様では、対象は、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症を有し得る。一態様では、対象は、次の一つ以上を有し得る：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、非内在化細胞表面分子は受容体であり得る。一態様では、緩徐内在化細胞表面分子は受容体であり得る。例えば、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、限定されないが、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含む。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体であり得る。一態様では、受容体は、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）であり得る。一態様では、受容体は、細胞表面死受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体４（ＤＲ４）であり得る。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）であり得る。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）であり得る。一態様では、受容体は、ＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子受容体（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、標的化部分は、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、多糖類であり得る。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドであり得る。一態様では、標的化部分は、アプタマーであり得る。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、ヒト化され得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、抗ＣＤ２０受容体抗体から由来し得る。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は、当該分野で周知であり、限定されないが、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、及びＢＬＸ−３０１を含む。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、コポリマー担体は、水溶性であり得る。一態様では、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、官能基で終わり得る。官能基は、当該分野で周知であり、限定されないが、アミン反応性活性エステル、マレイミド、アジド、及びアルキンを含む。一態様では、官能基は、本開示のコポリマー複合体の一本以上の側鎖への一つ以上のオリゴヌクレオチドの結合を可能にし得る。一態様では、一本以上の側鎖は、本開示の官能基を介して一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。一態様では、主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖（ｍａｉｎ ｃｈａｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｃａｒｒｉｅｒ）は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ｐ−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−ＧＧ−ＯＮｐ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、モルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、モルフォリノは自己相補的でない。本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは相補的であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-7Ｍより小さいＫｄを有し得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-9Ｍより小さいＫｄを有し得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得る。例えば、一態様では、本開示の方法におけるそれぞれのモルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、７つ以下のＣを含み得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３シチジン、６グアノシン、１２アデノシン、及び４チミジンを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、６シチジン、３グアノシン、４アデノシン、及び１２チミジンを含み得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得、ここで第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。
アポトーシスを誘導する本開示の方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
ｉｉｉ）処置の方法
それを必要とする対象の処置方法であって、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体を含む第一の組成物を対象に投与すること；及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む第二の複合体を含む第二の組成物を対象に投与することを含み、第一の組成物及び第二の組成物の投与が、対象における細胞の標的集団のアポトーシスを誘導する方法を本明細書に開示する。一態様では、投与は、静脈内投与を含む。一態様では、本開示の方法は、第一の組成物の投与を反復することを含み得る。一態様では、本開示の方法は、第二の組成物の投与を反復することを含み得る。一態様では、本開示の方法は、第一の組成物の投与を反復すること及び第二の組成物の投与を反復することを含み得る。一態様では、本開示の方法は、細胞の標的集団のアポトーシスを確認することを含み得る。一態様では、当業者は、本開示の組成物または本開示の複合体について、それを必要とする対象を処置するための投与の有効用量、有効計画、または有効経路を決定し得る。
アポトーシスを確認する方法は、当該分野で周知であり、限定されないが、カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定を含む。一態様では、アポトーシスの確認は次の一つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の二つを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。一態様では、アポトーシスの確認は次の全てを含み得る：カスパーゼ３活性の測定、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム結合の測定、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識の測定。
本開示の処置方法の一態様では、細胞の集団は、Ｂ細胞であり得る。一態様では、Ｂ細胞は、正常Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞は悪性Ｂ細胞であり得る。一態様では、細胞の集団は、対象内にあり得る。一態様では、Ｂ細胞は、対象内にあり得る。一態様では、対象は、非ホジキンリンパ腫を有し得る。一態様では、対象は、臓器移植を受けたことがあり得る。一態様では、対象は、ＪＣウイルスを有し得る。一態様では、対象は、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症を有し得る。一態様では、対象は、次の一つ以上を有し得る：非ホジキンリンパ腫、臓器移植、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少性紫斑病、エヴァンス症候群、血管炎、水疱性皮膚症、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病、またはグレーブス病眼症。
本開示の処置方法の一態様では、非内在化細胞表面分子は受容体であり得る。一態様では、緩徐内在化細胞表面分子は受容体であり得る。例えば、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子は、限定されないが、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体を含む。腫瘍壊死因子（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞死受容体５（ＤＲ５）、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）を含む。一態様では、受容体は、ＣＤ２０受容体であり得る。一態様では、受容体は、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型（ＰＴＰＲＣ）であり得る。一態様では、受容体は、細胞表面死受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体４（ＤＲ４）であり得る。一態様では、受容体は、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）受容体であり得る。一態様では、受容体は、細胞死受容体５（ＤＲ５）である。一態様では、受容体は、ＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）であり得る。一態様では、受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）であり得る。一態様では、受容体は、ＴＮＦ様弱性アポトーシス誘導因子受容体（ＴＷＥＡＫまたはＴＮＦＳＦ１２）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、標的化部分は、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、多糖類であり得る。一態様では、標的化部分は、ペプチドリガンドであり得る。一態様では、標的化部分は、アプタマーであり得る。一態様では、標的化部分は、一本鎖可変部であり得る。一態様では、標的化部分は、Ｆａｂ’断片であり得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、ヒト化され得る。一態様では、Ｆａｂ’断片は、抗ＣＤ２０受容体抗体から由来し得る。抗ＣＤ２０受容体抗体の例は、当該分野で周知であり、及び限定されないが、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、及びＢＬＸ−３０１を含む。一態様では、抗ＣＤ２０受容体抗体は、１Ｆ５であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、コポリマー担体は、水溶性であり得る。一態様では、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、コポリマー担体の主鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、酵素的に分解可能な配列を含み得る。一態様では、コポリマー担体の一本以上の側鎖は、官能基で終わり得る。官能基は、当該分野で周知であり、限定されないが、アミン反応性活性エステル、マレイミド、アジド、及びアルキンを含む。一態様では、官能基は、本開示のコポリマー複合体の一本以上の側鎖への一つ以上のオリゴヌクレオチドの結合を可能にし得る。一態様では、一本以上の側鎖は、本開示の官能基を介して一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。一態様では、本開示のコポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。一態様では、本開示のコポリマー担体の主鎖は、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ｐ−ニトロフェニルエステル（ＭＡ−ＧＧ−ＯＮｐ）モノマーと共重合したＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含み得る。
オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である。本開示の処置方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性及び非分解性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、水溶性及び電荷中性であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、次の一つ以上であり得る：生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性。例えば、一態様では、オリゴヌクレオチドは、生体適合性、非分解性、水溶性、及び電荷中性である。
本開示の処置方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸であり得る。本開示の方法の一態様では、オリゴヌクレオチドは、モルフォリノであり得る。一態様では、モルフォリノは、例えば、ヒトゲノムなどのゲノムの任意のｍＲＮＡ標的に結合しない。一態様では、モルフォリノは自己相補的でない。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは相補的であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは自己相補的でない。一態様では、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、自己相補的でない。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-7Ｍより小さいＫｄを有し得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノ及び第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０-9Ｍより小さいＫｄを有し得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含み得る。例えば、一態様では、本開示の方法におけるそれぞれのモルフォリノは、１０ｂｐの長さ、１２ｂｐの長さ、１５ｂｐの長さ、１８ｂｐの長さ、２０ｂｐの長さ、２３ｂｐの長さ、２５ｂｐの長さ、２８ｂｐの長さ、３０ｂｐの長さ、３２ｂｐの長さ、３５ｂｐの長さ、３８ｂｐの長さ、または４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、約３５％から約６５％のＧＣ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、３６％未満のＧ含有量を含み得る。一態様では、それぞれのモルフォリノは、７つ以下のＣ核酸塩基を含み得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、４０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＴＡＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’（配列番号１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣ３’（配列番号２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、ＧＡＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡ３’（配列番号３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＣ３’（配列番号４）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴ３’（配列番号５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＧＣＧＴＴＴＡＣ３’（配列番号６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＴＣＡＣＧＡＧＴＡＡＴＡ３’（配列番号７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号８）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧ３’（配列番号１０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＣＡ３’（配列番号１１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＴＴＣ３’（配列番号１２）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴ３’（配列番号１４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号１５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ３’（配列番号１６）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、３０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＧＧＡＴＡＡＡＣＴ３’（配列番号１７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣ３’（配列番号１８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＡ３’（配列番号１９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＣ３’（配列番号２０）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＣ３’（配列番号２２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＧＡＡＣＡＣＧＡＡＡＧＡＧＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＡＡＴ３’（配列番号２３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＴＴＡＴＴＧＣＧＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＡＣ３’（配列番号２４）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＡＴＴ３’（配列番号２７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＡＴＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴ３’（配列番号２８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、３シチジン、６グアノシン、１２アデノシン、及び４チミジンを含み得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、６シチジン、３グアノシン、４アデノシン、及び１２チミジンを含み得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２３ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＧＧＧＡＴＡＴＡＴ３’（配列番号２９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＡＣＴＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号３０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡ３’（配列番号３１）であり得、ここで、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣ３’（配列番号３２）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、２０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＡ３’（配列番号３３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＴＣＴＴＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号３４）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴ３’（配列番号３５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（配列番号３６）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１８ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴ３’（配列番号３７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＣ３’（配列番号３８）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＧＴＣＡＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＧＧＴＡ３’（配列番号３９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣ３’（配列番号４０）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１５ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴ３’（配列番号４１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡ３’（配列番号４２）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＴＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号４３）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＣＴＴＣＣＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡ３’（配列番号４４）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１２ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴ３’（配列番号４５）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＧ３’（配列番号４６）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＣＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡＴ３’（配列番号４７）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＡＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧ３’（配列番号４８）であり得る。
本開示の処置方法の一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、１０ｂｐの長さであり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＡＧＧＴＡＣＡ３’（配列番号４９）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴ３’（配列番号５０）であり得る。一態様では、第一の複合体のモルフォリノは、５’ＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡ３’（配列番号５１）であり得、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノは、５’ＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号５２）であり得る。
Ｄ．合成
ｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体の合成
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、標的化部分を得ること、オリゴヌクレオチドを修飾すること、及び標的化部分とオリゴヌクレオチドとをコンジュゲートすることを含むプロセスを本明細書に開示する。一態様では、標的化部分は、チオエーテル結合を介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。一態様では、オリゴヌクレオチドはＳＭＣＣ修飾であり得る。一態様では、オリゴヌクレオチドは、３’−マレイミド基を含有し得る。一態様では、複合体を合成する本開示のプロセスは、検出可能標識を導入することを含み得る。複合体を合成する本開示のプロセスの一態様では、標的化部分は、本開示の標的化部分であり得る。例えば、標的化部分は、ＣＤ２０に特異的なＦａｂ’断片であり得る。複合体を合成する本開示のプロセスの一態様では、オリゴヌクレオチドは、本開示のオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含むモルフォリノであり得る。
ｉｉ）コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体の合成
コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、コポリマー担体を得ること、一つ以上のオリゴヌクレオチドを修飾すること、及びコポリマー担体を一つ以上のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることを含むプロセスを本明細書に開示する。一態様では、コポリマー担体は、一本の主鎖及び一本以上の側鎖を含み得る。一態様では、ＲＡＦＴ重合を、本開示の主鎖を生成するために使用することができる。一態様では、複合体を合成する本開示のプロセスは、検出可能標識を導入することを含み得る。複合体を合成する本開示のプロセスの一態様では、コポリマー担体は、本開示のコポリマー担体であり得る。例えば、本開示のコポリマー担体は、ＭＡ−ＧＧ−ＴＴモノマーと共重合したＨＰＭＡコポリマーを含み得る。複合体を合成する本開示のプロセスの一態様では、一つ以上のオリゴヌクレオチドは、一つ以上の本開示のオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、一つ以上の本開示のオリゴヌクレオチドは、それぞれ１０ｂｐ〜４０ｂｐを含むモルフォリノであり得る。
ｉｉｉ）標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体、及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を含む組成物の合成
標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む複合体、及びコポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む複合体を合成するプロセスであって、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む第一の複合体を、コポリマー担体から一つ以上のオリゴヌクレオチドまでを含む第二の複合体と接触させることを含むプロセスを本明細書に開示する。一態様では、第一の複合体のオリゴヌクレオチドは、第二の複合体の一つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。一態様では、本開示のプロセスは、第一の複合体を生成することを含み得る。一態様では、本開示のプロセスは、第二の複合体を生成することを含み得る。一態様では、本開示のプロセスは、第一の複合体を生成すること及び第二の複合体を生成することを含み得る。一態様では、第一の複合体は、標的化部分及びオリゴヌクレオチドを含む任意の本開示の複合体であり得る。一態様では、第二の複合体は、コポリマー担体及び一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む任意の本開示の複合体であり得る。例えば、本開示のプロセスの一態様では、標的化部分は、ＣＤ２０に特異的なＦａｂ’断片であり得、コポリマー担体は、ＭＡ−ＧＧ−ＴＴモノマーと共重合したＨＰＭＡコポリマーを含み得、それぞれのオリゴヌクレオチドは、１０ｂｐ〜４０ｂｐを含むモルフォリノであり得、ここで第一の複合体のモルフォリノは、第二の複合体の一つ以上のモルフォリノに相補的である。
各本開示の方法は、さらに、追加のステップ、操作及び／または成分を含み得ることが企図される。任意の一つ以上のステップ、操作及び／または成分は、任意選択的に省略され得ることも企図される。本開示の方法は本開示の化合物を提供するために使用され得ることが理解されたい。本開示の方法の生成物は、本開示の使用法において採用され得ることも理解されたい。
Ｅ．実施例
以下の実施例は、当業者に、どのようにして本明細書にて特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス及び／または方法が作成及び評価されるかについての、完全な開示および説明を提供するように述べられ、純粋に本発明の例示として意図され、発明者が彼らの発明だとみなすものの範囲を限定することを意図しない。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示され同様または類似の結果を得る特定の実施形態において多くの変更がなされ得ることを理解するべきである。数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。
ｉ）ＩＮ ＶＩＴＲＯ評価
ａ．モルフォリノの設計
２５ｂｐの一対の相補的モルフォリノ（ＭＯＲＦ１−ｍ＝５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）及びＭＯＲＦ２−ｍ＝５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６））を設計した。モルフォリノを、コンジュゲーションのために使用される３’第一級アミンで修飾した（図２、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ、（オレゴン州フィロマス））。それぞれ２５ｂｐを有する二つのモルフォリノ間のハイブリダイゼーションのＫｄが典型的にＰＭレベルであるため、２５ｂｐのオリゴヌクレオチドを選択することによって、後続の実験のための強い結合親和性が確保された。それぞれのこれらの二つのモルフォリノの配列組成は、最適な結合効率及び特異性を達成するように設計された。ここで、各モルフォリノのＧＣ含有量は約３５〜６５％であった。良好な水溶解度を確保するために、総Ｇ含有量は３６％未満であった。急速な腎クリアランスを妨害することによって望ましい薬物動態を確保するために、Ｃ核酸塩基の総数は７未満であった。各モルフォリノの塩基組成を決定した後に、公的にアクセス可能な、オンライン配列「スクランブラ―」を、ヒト及びマウスｍＲＮＡとの最小のオフターゲット結合を確保するために使用した（ｗｗｗ．ｓｉｍａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／ｓｃｒａｍｂｌｅｄ．ｐｈｐのウェブページ）。さらに、公的にアクセス可能な、オンライン配列解析ソフトウェアを最小の自己相補性を確保するために使用した。（ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌのウェブページ）。
ｂ．ＦＡＢ’−ＭＯＲＦ１複合体の合成
マウスの抗ＣＤ２０ＩｇＧ抗体（１Ｆ５）を、バイオリアクター（ＣｅｌｌＭａｘ）内でハイブリドーマクローン１Ｆ５から調製し、プロテインＧカラムで精製した。抗体をペプシンで消化してＦ（ａｂ’）2断片を得て、さらにトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって還元して、Ｆａｂ’断片を得た。Ｆａｂ’断片を、次いで、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）修飾されたモルフォリノ（すなわち、３’−マレイミド基を有するモルフォリノ）にコンジュゲートした。ここで、モルフォリノは、チオール反応性３’マレイミド基を有する配列番号２５によって表され、コンジュゲーションはチオエーテル結合を介して生じた。最終生成物はＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体であった（図３Ａ）。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体を、イメージング目的のためにローダミンを用いて標識した。
ｃ．コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の合成
アミン反応性チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）基を有する側鎖を含有するＨＰＭＡコポリマーを、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって合成した。ＲＡＦＴ重合は、当該分野で周知である（図３Ｂ）。Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン−ＴＴ（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）モノマーを使用して、グリシン−グリシンスペーサーを介してＴＴを導入した。任意選択である、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）を含有する少量のコモノマーを、イメージング目的のために添加した。ＲＡＦＴ重合を使用して、狭い分子量分布を有するポリマー骨格を、再現性よく合成した。側鎖のＴＴ基とアミン誘導体化ＭＯＲＦ２（配列番号２６）との反応は、安定アミド結合を介してＭＯＲＦ２の複数のコピーでグラフトされたＨＰＭＡコポリマーを生成した。結果得られた生成物は、コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体であった。異なる原子価（すなわち、コポリマー鎖でグラフトされたモルフォリノ数）を有するコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体を合成して、これらの複合体の生物学的効果の比較を可能にした。コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体を、イメージング目的のためにＦＩＴＣを用いて標識した（図３Ｂ）。
ｄ．複合体のＩＮ ＶＩＴＲＯ評価
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションを、次の三つの方法により決定した：（１）可視・紫外分光法（ハイブリダイゼーションが吸光度２６０ｎｍで淡色効果を引き起こす）、（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ハイブリダイゼーションがゲル遅延を引き起こす）、及び（３）動的光散乱法（ハイブリダイゼーションが流体力学的有効直径の変化を引き起こす）。細胞レベルでは、ヒトバーキットＢ細胞非ホジキンリンパ腫Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ベセスダ）を使用して、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の生体認識を試験した。Ｒａｊｉ細胞の細胞表面での複合体の認識及び結合を、共焦点蛍光顕微鏡によって決定した。アポトーシス誘導を三つの異なる尺度を使用して解析した：（１）カスパーゼ３活性（すなわち、アポトーシス性遺伝子発現）、（２）アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合（すなわち、初期アポトーシス事象としての膜反転（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｌｉｐｐｉｎｇ））、及び（３）ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（すなわち、後期アポトーシス事象としてのゲノムＤＮＡ断片化）。これらの試験全体を通して、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体と高度架橋された１Ｆ５ｍＡｂを、臨床的に関連する陽性対照として使用した。加えて、ＣＤ２０発現が低いまたは無いヒトＮＨＬ ＤＧ−７５Ｂ細胞を陰性対照細胞系統として使用した。
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のハイブリダイゼーション、ならびにかかるハイブリダイゼーションがアポトーシス誘導に及ぼす直接効果を評価するために、一連の対照実験を行った。具体的には、次の実験を行った：（１）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体を用いた単一成分処置、（２）コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体を用いた単一成分処置、（３）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体プラス遊離型コポリマー（ｆｒｅｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を用いた二成分処置、（４）コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体プラス遊離型Ｆａｂ’断片（ｆｒｅｅ Ｆａｂ’ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を用いた二成分処置、及び（５）過剰な、（ｉ）遊離型及び非コンジュゲートＭＯＲＦ１及び（ｉｉ）遊離型及び非コンジュゲートＭＯＲＦ２で処置された「ブロッキング」対照（例えば、遊離型ＭＯＲＦ１及び遊離型ＭＯＲＦ２は、複合体の結合と競合した）。
ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、可視・紫外分光法、及びＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析によって確証されるように、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体は、合成に成功した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーションは、（１）可視・紫外分光法（ハイブリダイゼーションが淡色効果を２６０ｎｍで引き起こす）、（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ハイブリダイゼーションがゲル遅延を引き起こす）、及び（３）動的光散乱法（ＤＬＳ）を介して確証された（図４）。Ｆａｂ−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体間のハイブリダイゼーションの結合速度論が速いこと（〜１０分）は、二つの複合体の混合時の、粒子の流体力学的有効径の著しい及び急速な増加によって実証された（ＤＬＳによって特徴づけられる）。これらの実験では、各ＭＯＲＦ複合体ならびに二つのＭＯＲＦ複合体の混合物（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２のモル比は１：１である）の流体力学的粒径を解析した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の急速なハイブリダイゼーション（〜１０分）は、混合後１０分、３０分、６０分で測定された類似の粒子サイズによって反映された。測定を三重化した。ハイブリダイゼーションは、コイルドコイルペプチド形成のハイブリダイゼーション（〜６０分）と比較して非常に早かった。（抗ＣＤ２０Ｆａｂ’−ＣＣＥペプチドとＨＰＭＡコポリマーＣＣＫペプチドの自己組織化を示す、Ｗｕら、２０１０を参照）。
ｅ．実験結果
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、高い死亡率を有する世界中で蔓延している癌である。約８５％のＮＨＬはＢ細胞を起源とし、Ｂ細胞リンパ腫の９５％超は細胞表現抗原ＣＤ２０を有する。それゆえ、Ｒａｊｉ Ｂ細胞（すなわち、高ＣＤ２０発現を伴う細胞）の細胞表面での二つのＭＯＲＦ複合体の生体認識を、共焦点蛍光顕微鏡によって評価した（図５）。図５では、次の略語を適用する：Ｔｒａｎｓ−透過光下で得られた細胞画像；Ｒ−赤色チャネル；Ｇ−緑色チャネル；Ｏ−Ｒ及びＧのオーバーレイ。Ｂ細胞をＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体（ローダミンを用いて標識）に曝露することにより、（赤色チャネルによって示されるように）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体を用いたＢ細胞の表面の「装飾」を、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体がＣＤ２０に結合すること介してもたらした。コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体（ＦＩＴＣを用いて標識）に曝露された細胞は、観察可能ないずれの蛍光シグナルも示さず、それは生体認識対がないことによるものだと予想された。しかしながら、両方の複合体（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体）を使用したとき、両方の処置プロトコル（すなわち、両方の複合体の同時曝露を伴う（「予混合」）処置または各複合体への連続曝露を伴う処置）は、Ｂ細胞表面での両方の複合体の共局在をもたらし、それゆえＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のハイブリダイゼーションをもたらす（黄色蛍光で示す）。このハイブリダイゼーションは、Ｂ細胞の表面上の蛍光シグナルのオーバーレイによって示される。
同時または予混合処置プロトコルは、細胞表面でより強い蛍光シグナルを生成するように見え、それはより高い結合親和性を有する予混合複合体の多価の結果である。対照実験では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びＦＩＴＣを用いて標識した遊離ポリマーの予混合（すなわち、コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体無し）は、Ｂ細胞表面で赤色シグナルのみもたらした。同様に、対照実験では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及び過剰の遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１の予混合は、Ｂ細胞表面で赤色シグナルのみもたらした。これらの結果は、ＭＯＲＦ１複合体とＭＯＲＦ２複合体のハイブリダイゼーションが優れた生体認識を与えることを確かにした。
二つのＭＯＲＦ複合体間のハイブリダイゼーションの効率は、他の分子（例えば、コイルドコイルペプチド）のそれよりも大いに良好であると証明された。例えば、１：１のモル比（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２）を適用した。本明細書に記載の組成物及び方法によって提供された優れたハイブリダイゼーション効率及び生体認識とは対照的に、コイルドコイルペプチドは、観察可能な生体認識を達成するために２５倍過剰の第二ペプチドを要した。これらの実験は、コイルドコイルペプチドが有したものよりも、コポリマー鎖へのモルフォリノのより良好なアクセシビリティがあったことを実証した。（図４のＤＬＳ結果によって実証されるように）より速い結合速度論と相まってモルフォリノの改善されたアクセシビリティは、モルフォリノを含む本開示の組成物が、アポトーシス誘導及びｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性に関して有利であることを示す。
モルフォリノを含む本開示の複合体を用いた処置に従ったＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスの誘導を、三つの異なる方法によって確認した：（Ａ）カスパーゼ３の活性化、（Ｂ）アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合、及び（Ｃ）ＴＵＮＥＬアッセイ。（図６Ａ〜図６Ｃ）。両方の複合体（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体）を用いた処置は、連続的に投与または予混合物としての投与のいずれでも、検出可能な細胞アポトーシスを誘導した。対照群（すなわち、両方の単一処置群（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体単独またはコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体単独）におけるアポトーシス誘導のレベルは、未処置細胞のそれと統計学的に差異はなかった。ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２のモル比が１：１０であるとき、アポトーシス誘導のレベルは、ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２のモル比を１：１として使用した群から区別できなかった。これらのデータは、細胞表面上のＭＯＲＦ１結合部位の飽和の可能性を示す。これらのデータはまた、コポリマー鎖へのモルフォリノの優れたアクセシビリティを確認した。図６Ａ〜図６Ｃに示す実験について、０．５μＭの二つの異なるモルフォリノ複合体または１Ｆ５ ｍＡｂを使用して、２×１０5個の細胞／０．４ｍＬ（カスパーゼ３（図６Ａ）及びアネキシンＶ／ＰＩアッセイ（図６Ｂ）について）または１０6個の細胞／０．５ｍＬ（ＴＵＮＥＬアッセイ（図６Ｃ）について）を処置した。全ての実験は三回実施された。
表３は、本開示のモルフォリノ複合体及びコイルドコイルペプチド間のアポトーシス誘導の対照比較を示す。これらの実験では、ヒトＮＨＬ Ｒａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシス指数（％）を、同一の細胞数及び濃度下（４００μＬの培養培地中に２×１０5個の細胞）で評価した。二つの成分のモル比は両方とも１：１（ＣＣＥ：ＣＣＫまたはＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２）である。ポリマー骨格の分子量も非常に類似する（〜１００ｋＤａ）。これらのデータは、モルフォリノをベースとする組成物及び方法（より低い濃度またはより低い原子価のポリマーコンジュゲートで試験された）が、コイルドコイルペプチド系と比較して、より高いレベルのアポトーシスを誘導したことを示す。このデータは、両方の処置プロトコル（すなわち、複合体が連続的に投与されたまたは複合体が予混合組成物として投与された）において観察された。
表３−アポトーシス誘導の比較
表３では、アポトーシス指数（％）をアネキシンＶ／ＰＩ結合アッセイによって評価し、フローサイトメトリーによって定量化した。二つの系統を最大のアポトーシスに対応する時間間隔（すなわち、コイルドコイルペプチド（ＣＣＥ−ＣＣＫ）については１２時間、及びＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションについては４８時間）で比較した。Ｆａｂ’（ＣＣＥまたはＭＯＲＦ１当量）のモル濃度及びポリマーコンジュゲート（ＣＣＫの数またはＭＯＲＦ２の数／鎖）の結合価を記載した。
図７に示すように、複合体の濃度増加（図６の０．５μＭから１μＭ、２μＭ、及び５μＭまで）は、高レベルのアポトーシスの誘導をもたらした（図７）。用量依存的なアポトーシス誘導のレベルは、両方の処置プロトコル（すなわち、二つの複合体が予混合組成物として投与されたかまたは二つの複合体が連続的に投与された）、ならびに陽性対照（１Ｆ５ ｍＡｂ＋ヤギ抗マウス二次抗体）において観察された。濃度が２μＭから５μＭに増加したとき、陽性対照細胞のアポトーシス指数は飽和し始めた。しかしながら、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体のハイブリダイゼーションを活用する処置プロトコルでは飽和は観察されなかった。図７では、１μＭ、２μＭ、または５μＭの濃度のモルフォリノ複合体または１Ｆ５ ｍＡｂを使用して、０．４ｍＬ培地中の２×１０5個の細胞を処置した。インキュベーション時間は４８時間であり、フローサイトメトリーを介して解析を生じた。
図８Ａ〜図８Ｂは、いくつかの対照実験の結果を示す。（ｉ）遊離コポリマーとの予混合Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体（すなわち、ＭＯＲＦ２を欠く）または（ｉｉ）遊離Ｆａｂ’断片との予混合コポリマー−ＭＯＲＦ２複合体（すなわち、ＭＯＲＦ１を欠く）のいずれかを活用した処置プロトコルは、未処置細胞のアポトーシス指数と比較して、両方とも類似したアポトーシス指数をもたらした。連続的に処置された「ブロッキング」対照群（すなわち、ハイブリダイゼーションのための結合部位と競合するために過剰遊離ＭＯＲＦ１または過剰遊離ＭＯＲＦ２と予混合された複合体）も観察可能なアポトーシス誘導を生成しなかった。これらの結果は、ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２のハイブリダイゼーションがアポトーシス誘導に必要とされることを証明した。最後に、陰性対照として（図８Ｂ）、細胞表面ＣＤ２０発現を欠く、ＮＨＬ Ｂ細胞系統ＤＧ−７５を使用し、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて解析した。ＤＧ−７５細胞曝露がもたらしたアポトーシス誘導は非常に低かった、またはアポトーシスを誘導しなかった。この結果は、本開示のモルフォリノをベースとしたアプローチのｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性は、ＣＤ２０架橋によって媒介されたことを実証した。図８Ａ〜図８Ｂでは、Ｐ−ｄｅＭＦ２は、遊離ＭＯＲＦ１と予混合（２０倍過剰、室温で１時間）されたコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体を指し、Ｆａｂ’−ｄｅＭＦ１は、遊離ＭＯＲＦ２と予混合（２０倍過剰、室温で１時間）されたＦａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体を指す。
ｉｉ）ｉｎ ｖｉｖｏ評価
ａ．ｉｎ ｖｉｖｏ実験Ｎｏ．１
進行ＮＨＬの動物モデルを提供するために、雌ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７）マウスは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を静脈内移植され得る。このモデルは、様々な臓器、特に脊髄および骨髄における悪性（ＮＨＬ）Ｂ細胞の播種、浸潤及び増殖を表す。被検体は、後肢麻痺を発症し死亡する。ゆえに、被検体が本開示の組成物または本開示の複合体を用いた処置を受けた後から後肢麻痺の発症するまでに経過する時間の量が決定され得る。ここで、処置後から麻痺の発症前までに経過する時間の量は、治療有効性の指標として使用され得る。
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１複合体及びコポリマー−ＭＯＲＦ２複合体の免疫原性は、免疫応答性（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）マウスにおいて評価され得る。酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）は、コンジュゲートの静脈注射の際のマウスの血液中の初期サイトカイン放出（例えば、ＩＦＮα、ＴＮＦα）を検出することができ、免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの血液及び脾臓中の長期抗体産生を検出することができる。
ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏ実験Ｎｏ．２
合成及び生物学的ビルディング・ブロックからなるハイブリッドナノマテリアルは、ナノ医療のための高い可能性を有する。標的細胞の表面受容体を架橋しアポトーシスを誘導する免疫エフェクター細胞のメカニズムを模倣する治療プラットフォームを設計した。このプラットフォームを、表面抗原ＣＤ２０を高度に発現するＢ細胞リンパ腫に対して試験した。二つのナノコンジュゲートを合成した：（１）一本鎖モルフォリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲＦ１）に共有結合した抗ＣＤ２０Ｆａｂ’断片、及び（２）相補的オリゴヌクレオチドＭＯＲＦ２の複数のコピーでグラフトされたＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のリニアポリマー。二つのコンジュゲートは、ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションを介して、ＣＤ２０+悪性Ｂ細胞の表面で自己組織化し、それはＣＤ２０抗原を架橋し、アポトーシスを開始した。ヒト非ホジキンリンパ腫のマウスモデルにて試験したとき、二つのコンジュゲートは、連続的に投与されても予混合物として投与されても、癌細胞を根絶して、長期生存者を生成した。本明細書に記載の実験は、本開示の方法および本開示の組成物及び複合体が小分子細胞毒性化合物を含有せず、免疫独立性であったことを実証する。
分子の生体認識は、生命の基本的な特色である−多くの生物学的プロセスは、高分子間の複雑かつ特異的な相互作用、例えば、抗体−抗原結合及びＤＮＡ塩基対合によって支配されている。天然のこれらの忠実度の高い認識モチーフは、薬物送達（Ｄｏｕｇｌａｓら、２０１２；Ｍｕｌｖｅｙら、２０１３；Ｌｕら、１９９９）、生体組織工学（Ｇｕｎｇｏｒｍｕｓら、２０１０；Ｈｏｌｍｅｓら、２０００）、バイオ検知（Ｙｕａｎら、２００８；Ｅｈｒｉｃｋら、２００５；Ｌｉｕら、２００６）、等における適用のための自己組織化ナノマテリアルを設計するために採用され得る。研究の新たな方向は、かかる正確に定義された「スマート」マテリアルを、細胞の活性を刺激するまたは制御するために使用するものである（Ｗｕら、２０１０；Ｃｈｏら、２０１２；Ｋｏｐｅｃｅｋら、２０１２）。本明細書に記載のように、いずれの従来の薬物も含まない、マテリアル単独での使用は治療効果を提供した。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、高い死亡率を有する世界中で蔓延している癌である（Ｓｉｅｇｅｌら、２０１３）。従来の化学療法及び放射線療法は、重大な有害反応、特に、感染のリスクの増大や輸血の必要性につながる血球減少症を伴う。大半のＮＨＬがＢ細胞を起源とするため、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する免疫療法が一般的な処置となってきた（Ｃｈｅｓｏｎら、２００８）。しかしながら、特に再発状態において、免疫療法に応答しない多くの患者が存在する。例えば、最も一般的に使用されるＣＤ２０ｍＡｂであるリツキシマブが再発／難治性ＮＨＬに対して有する全奏効率は５０％未満である（Ｍｏｌｉｎａら、２００８）。これは、結合ｍＡｂを高度に架橋する免疫エフェクター細胞の不活性に大いに帰する（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２；Ｓｍｉｔｈら、２００３）。さらには、ｍＡｂ処置は、稀ではあるが、進行性多巣性白質脳症（Ａｌｌｉｓｏｎ ２０１０）及び肺損傷（Ｌａｎｄｓ ２０１０；Ｋａｍｅｉら、２０１０）などの致死副作用を引き起こし、これはＦｃ媒介性エフェクター細胞事象（例えば、補体活性化）に起因する（ｖａｎｄｅｒ Ｋｏｌｋら、２００１）。
自己組織化ハイブリッドナノコンジュゲートからなる生体模倣材料プラットフォーム（図９）をＢ細胞リンパ腫に対する治療システムとして設計した（図１）。それは、抗ＣＤ２０Ｆａｂ’抗体断片、一対の相補的ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２）、及びＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）のリニアポリマー（Ｐ）を含む。本明細書に記載の実験は、（１）悪性ＣＤ２０+Ｂ細胞を抗ＣＤ２０Ｆａｂ’及びＭＯＲＦ１（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１）のコンジュゲートに曝露することで、細胞表面がＭＯＲＦ１で装飾され、（２）ＭＯＲＦ２の複数のコピーでグラフトされたＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ＭＯＲＦ２）を用いた、装飾されたＢ細胞のさらなる処置が、ＣＤ２０架橋を随伴する細胞表面でのＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションをもたらし、それがアポトーシスを引き起こしたこと実証する（図１）。具体的には、図１は、相補的モルフォリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２）の細胞外ハイブリダイゼーションによって媒介されるＣＤ２０抗原の架橋によるＢ細胞のアポトーシス誘導を示す。具体的には、図９は、治療プラットフォームの一般的設計概念を示す。生体認識を介して自己組織化する二つのナノコンジュゲートは、標的化前用量及び架橋用量として連続的に投与され得る、または予混合されて多価構築物を形成して単回用量として使用され得る。
ＣＤ２０結合抗体が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）発現免疫エフェクター細胞（例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞）によって高架橋されるとき、ＣＤ２０のクラスター形成が脂肪ラフト内で生じ、アポトーシスを誘導する（Ｄｅａｎｓら、２００２）。本開示のシステムの各成分（例えば、Ｆａｂ’、モルフォリノオリゴ、ＨＰＭＡポリマー）は、個別に使用されるとき、いずれの薬理学的有効性も有さない。アポトーシス誘導は直接的（すなわち、免疫機能から独立）であり、特異的（すなわち、ＣＤ２０を標的とする）である；それによって、現在使用されている免疫療法、化学療法、及び放射線療法の副作用及び問題を回避した。
本開示のシステムは、相補配列を有する一対のモルフォリノ（ＭＯＲＦ）オリゴヌクレオチドに基づく。ＭＯＲＦオリゴは、ワトソン・クリック型塩基対合（ハイブリダイゼーション）によって二重らせんを形成し、及び物理的架橋剤としての役割を果たす。ＭＯＲＦオリゴは、ＤＮＡまたはＲＮＡより強い結合親和性を結果もたらす電荷中性ホスホロジアミデート骨格を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ １９９５）。ＭＯＲＦオリゴは、生体適合性及びヌクレアーゼ耐性であり；これは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性及び安全性を保証する（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７）。これらの利点のために、ＭＯＲＦオリゴは、治療の送達を強化するための高分子バインダーとして十分に使用されている（Ｍｕｌｖｅｙら、２０１３；Ｌｉｕら、２００４；Ｍａｎｇ’ｅｒａら、２００１）。本明細書に記載のＨＰＭＡコポリマーは、水溶性であり長く血流を循環する。本開示のコポリマーは、安全性プロファイルを十分に確立しており、治療担体として広く使用されている（Ｋｏｐｅｃｅｋら、２０１０）。水溶液では、線状ＨＰＭＡコポリマーは、ランダムコイルコンフォメーションを有し、側鎖にグラフトされた標的化部分を効果的に提示することができる（Ｕｌｂｒｉｃｈら、２０１０）。
本明細書に記載の実験では、本提案の抗リンパ腫組成物及び複合体（すなわち、ナノ医療）の開発及び前臨床評価が試みられた。二つのナノコンジュゲート（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２）の生体認識を特徴付けた。悪性Ｂ細胞系統の効果的なアポトーシス誘導を達成するように治療システムを最適化した。優れた抗癌有効性（残存腫瘍なく１００％生存）がヒトＮＨＬのマウスモデルにおいて実証された。
ハイブリダイゼーションを媒介する薬物を含まない高分子治療プラットフォームの概念を検証するため、ＣＤ２０を薬理学的標的として選択した。ＣＤ２０は、大半のＮＨＬ悪性Ｂ細胞ならびに正常Ｂ細胞上に発現する非内在化受容体である（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら、１９８０）。しかしながら、ＣＤ２０は、形質細胞（エフェクターＢ細胞）及び幹細胞上には発現しない。その結果、患者の体液性免疫は重度に影響を受けず、正常数のＢ細胞が処置後に回復され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８４；Ｋｉｍｂｙら、２００５）3。ここで、抗ＣＤ２０Ｆａｂ’断片を治療システムにおいて採用し、それはＮＨＬを疾患モデルとして使用して本開示のシステムの第一例を実証した。
（１）ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２の設計
使用したＭＯＲＦオリゴは、２５ｂｐであり、約８．５ｋＤａであった（図１０Ａ、図１０Ｃ、及び図２）。それらの３’末端をコンジュゲーションのために使用された第一級アミンで修飾した。Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ含有量を、最適な結合効率及び特異性を達成し（ＧＣ＝３５〜６５％）、水溶解度を維持し（Ｇ＜３６％（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７））、好ましい薬物動態を提供（急速な腎臓吸収を回避するためにＣの数＜７（Ｌｉｕら、２００４））するように選択した。塩基組成を決定した後、配列スクランブリングソフトウェアによってヒト及びマウスのｍＲＮＡとのオフターゲット結合を最小にするように生成し、さらに自己相補性を防ぐように最適化した。
（２）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の合成及び特徴付け
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートを調製するため（図１０Ａ）、マウス抗ヒトＣＤ２０ ＩｇＧ２ａ ｍＡｂ（１Ｆ５）からのＦａｂ’断片（Ｐｒｅｓｓら、１９８７）を、チオエーテル結合を介してＭＯＲＦ１の３’末端に係留した。図１０Ａでは、*は、ＳＭＣＣまたはスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートヘテロ二官能性リンカーを示す。コンジュゲートを、イメージング試験のために任意選択的にローダミン（ＲＨＯ）を用いて標識した。ＨＰＬＣ（図１０Ｂ、緩衝液Ａ（Ｈ2０＋０．１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ）及び緩衝液Ｂ（アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ）のグラジエントで溶出されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ）を活用した）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図１７Ａ、ＰＢＳで溶出されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ ＨＲ１６／６０カラムを使用）によって確認されるようにＦａｂ’−ＭＯＲＦ１は合成に成功した；カップリング反応は、飛行時間型質量分析（図１７Ｂ）及び可視・紫外分光法（図１７Ｃ〜図１７Ｅ）によって特徴付けられるように１：１化学量論に従った。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１の分子量（ＭＷ）は、約５７．５ｋＤａであった。図１７では、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１のプロファイルは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによる精製のプロセスを実証し、第一のピーク（５３ｍＬで溶出）はコンジュゲート（精製中に収集された）を表し；第二のピーク（７０ｍＬで溶出）は非コンジュゲートＭＯＲＦ１（除去された）を示した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１は、Ｆａｂ’−ＳＨ（５６ｍＬ）と比較して、より早い溶出体積によって特徴付けられた。図１７Ｂでは、主要画分は分子量が約５７．５ｋＤａであることを示し（Ｆａｂ’：〜４８．８ｋＤａ、ＭＯＲＦ１：〜８．６ｋＤａ）；ほんのわずかな非コンジュゲートＦａｂ’が観察された。精製されたＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（図１７Ｃ）、非コンジュゲートＭＯＲＦ１（図１７Ｄ）、及びＦａｂ’断片（図１７Ｅ）の可視・紫外吸収スペクトルも示す。全ての成分の濃度は２．５μＭであった。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートは、２６０ｎｍ（ＭＯＲＦ１によって寄与される）及び２８０ｎｍ（Ｆａｂ’によって寄与される）での吸光度の組み合わせによって特徴付けられた。
多価Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートを調製するため（図１０Ｃ）、（アミン反応性）チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）基で終わるグリシル−グリシン（ＧＧ；スペーサー）側鎖を含有するＨＰＭＡコポリマーを合成した。図１０Ｃでは、ＭＡ−ＧＧ−ＴＴは、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシンチアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）を示す。これらのポリマー前駆体（Ｐ−ＴＴ）を、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合によって合成した。重合可能フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）誘導体を、イメージング試験のために任意選択的に添加した。ＲＡＦＴ重合を使用して、狭い分子量分布（多分散性指数≦１．１５、ＳＥＣによって決定される）を有するポリマー骨格は、再現性よく合成された。さらには、アミン誘導体化ＭＯＲＦ２オリゴ（ＭＯＲＦ２−ＮＨ2）を、ＨＰＭＡコポリマーの側鎖への安定アミド結合を介してグラフトし、多価Ｐ−ＭＯＲＦ２を生成した。該コンジュゲートを精製し、ＳＥＣによって特徴付けた（図１０Ｄ）。図１０Ｄは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ１０／３０カラム（酢酸緩衝液＋３０％アセトニトリルｖ／ｖ）を使用した代表的なＰ−ＴＴ及びＰ−ＭＯＲＦ２（結合価＝３）のＳＥＣ解析を示す。変動する骨格分子量及び結合価（すなわち、ポリマー鎖当たりのＭＯＲＦ２の数）を有する三つの異なるＰ−ＭＯＲＦ２を合成した（図１８Ａ〜図１８Ｅ）。これらのコンジュゲートの骨格数平均分子量（Ｍｎ）は、７０から１３６ｋＤａの範囲であった。三つのＰ−ＭＯＲＦ２製剤の結合価は、それぞれ、２、３、及び１０であった。
図１８は、ＳＥＣで精製されたＰ−ＭＯＲＦ２コンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬ（図１８Ａ））、非コンジュゲートＭＯＲＦ２（２．５μＭ（図１８Ｂ））、及びＨＰＭＡポリマー（Ｐ）（１ｍｇ／ｍＬ（図１８Ｃ））の可視・紫外吸収スペクトルを示す。多価Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートを、２６０ｎｍ（ＭＯＲＦ２によって寄与される）でのＵＶ吸光度によって特徴付けた。図１８Ｄは、合成され、本明細書に記載の実験において使用された、異なるＰ−ＭＯＲＦ２コンジュゲート及びそのポリマー前駆体（Ｐ−ＴＴ）の物理化学的特性を要約する表を提供する。数平均分子量（Ｍｎ）及び多分散性（Ｐｄ）をＳＥＣによって決定した。ポリマー鎖あたりのチアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）基の数（ＴＴ／Ｐ）を３０５ｎｍでのＵＶ吸光度で決定した；鎖当たりのＦＩＴＣの数（ＦＩＴＣ／Ｐ）を４９５ｎｍでの吸光度で決定した；鎖あたりのＭＯＲＦ２オリゴの数（ＭＯＲＦ２／Ｐ）を２６０ｎｍでのＵＶ吸光度で決定した。図１８Ｅは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣによる、Ｐ−ＭＯＲＦ２＃３及びそのＰ−ＴＴポリマー前駆体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）解析を示す；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ１０／３０カラム（酢酸緩衝液ｐＨ６．５＋３０％アセトニトリルｖ／ｖ）。このカラムの保有限度は約７ｍＬである。
（３）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２のＩｎ Ｖｉｔｒｏハイブリダイゼーション
ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２生体認識を介する二つのコンジュゲートのハイブリダイゼーションを、まず紫外・可視分光法によって評価した。二つのコンジュゲートを異なる比率で混合し、２６０ｎｍ（塩基によって寄与される）での光学濃度を測定した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を混合する際、「淡色効果」が観察された（図１１Ａ）；ＯＤ２６０ｎｍは、１：１（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２）のモル比が使用されたときに、最小に達した。かかる低減は、芳香族環の共鳴を制限する相補的塩基間の水素結合に起因した。同じ方法を使用して、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２のハイブリダイゼーション、及び同一の淡色性が観察された（図１９）。図１９では、２６０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）は、二つのＭＯＲＦ（ＰＢＳ中、ｐＨ＝７．４）が（異なるパーセンテージで）混合されたときに低減した。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。これらの結果は、ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの機能がＦａｂ’またはポリマーへのコンジュゲーション後に保存されたことを示した。
さらには、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の結合を動的光散乱法（ＤＬＳ）によって特徴付けた（図１１Ｂ、図２０）。図１１Ｂに示すように、二つのコンジュゲート混合時（等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２で）の、流体力学的サイズの有意な及び急速な増加が明らかになった。安定した直径（〜４０ｎｍ）を早く達成することは、コンジュゲートのＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの速い結合速度論（＜１０分）を反映した。この特性は、薬物を含まない高分子治療の設計に好ましい。図１１Ｂでは、Ｐ−ＭＯＲＦ２の結合価は３であった。別段の指示がない限り、混合物をＰ−ＭＯＲＦ２と比較することによって統計を実施した（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５、ｎ．ｓ．＝有意差なし）。図２０では、全ての成分は、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中に溶解され、直径１０２±３ｎｍ（標準１００ｎｍ）のＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）ポリスチレンサイズ標準に則して測定された。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。
円偏光二色性（ＣＤ）分光法を、生理的条件（ＰＢＳ ｐＨ＝７．４）のＦａｂ’−ＭＯＲＦ１／Ｐ−ＭＯＲＦ２複合体の融解温度（Ｔｍ）を決定するために使用した（図１１Ｃ）。まず、Ａ形二重らせんを示している明白な光学サイン（２６０ｎｍで最大、２１０ｎｍで最小）（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００）が、二つのコンジュゲートの混合時に得られた；類似のＣＤプロファイルが、非コンジュゲートＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２が混合されたときに観察された（図２１Ａ〜図２ＩＤ）。
例えば、図２１は、ハイブリダイゼーションの解析のための、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ、コンジュゲート、及びその混合物のＣＤスペクトルを示す（ｓｏｗ）。全ての成分はＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に５０μＭのＭＯＲＦ当量濃度で溶解された。ｙ軸はモル楕円率（θ）を表す。図２１Ａは、遊離ＭＯＲＦ１、ＭＯＲＦ２、及び両方の等モル混合物を示す。混合されたとき、光学サイン（２６０ｎｍで最大、２１０ｎｍで最小）は、Ａ形二重らせんが得られたことを示す。図２１Ｂは、Ｐ−ＭＯＲＦ２（結合価＝３）と遊離ＭＯＲＦ２の比較を示す。同一のスペクトルが観察された。図２１Ｃは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートと遊離Ｆａｂ’断片及び遊離ＭＯＲＦ１の比較を示す。コンジュゲートは、Ｆａｂ’及びＭＯＲＦ１の組み合わさった光学サインを有するように見える。図２１Ｄは、Ｐ−ＭＯＲＦ２と、遊離ＭＯＲＦ１またはＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２）のいずれかを混合することは、ＣＤスペクトルを一本鎖ＭＯＲＦ２のそれからＡ形二本鎖オリゴを示すそれへとシフトさせたことを示す。かかるスペクトルのシフトは、ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの機能がＦａｂ’またはポリマーへのコンジュゲーションの後に保存されたことを示した。
次に、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の混合物を解析するために熱融解試験を実施した。データは、前述のＣＤサインが９５℃ではもはや存在しないことを示した；２６０ｎｍでの正の帯は、２７５ｎｍ付近を中心とするピークを生成した有意な深色シフトを受けた（図２２Ａ〜図２２Ｂ、図２３Ａ〜図２３Ｃ）。図１１Ｃに示す熱融解曲線は、２６０ｎｍでのシグナルが、温度が上昇するにつれてＳ字パターンに低減することを実証した。非線形回帰の結果は、約５７℃から６２℃のＴｍ値を示した。Ｔｍは、体温より十分に高く、結合のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を示す。図１１Ｃでは、融解温度（Ｔｍ）は、非線形回帰（グラフパッドプリズム５ソフトウェア）を使用してロジスティック関数にデータをフィットさせることから得られた。全ての実験は、生理学的条件（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で実施された。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。
図２２Ａ〜図２２Ｂは、ＣＤスペクトル測定による、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１／Ｐ−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。図２２Ａは、異なる温度でのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（５μＭ ＭＯＲＦ１当量）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（５μＭ ＭＯＲＦ２当量；結合価＝３）の混合物のＣＤスペクトルを示す。温度が２５℃から６０℃及び９５℃に上昇したとき、２６０ｎｍでの正の帯は、２７５ｎｍ付近を中心とするピークを生成した深色シフトを受けた。２６０ｎｍでのモル楕円率（θ）を、以下の熱融解試験において使用した。図２２Ｂは、ハイブリダイズされたＦａｂ’−ＭＯＲＦ１／Ｐ−ＭＯＲＦ２のＣＤ熱融解曲線を示す。温度が上昇するにつれ、２６０ｎｍでのθのＳ字低減が観察された。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。これらのデータをロジスティック関数にフィットさせてＴｍを得た；非線形回帰の結果は、Ｔｍ＝６０〜６２℃を示した。ここに示す順方向走査（温度の上昇）解析は、逆方向走査（温度の低減−図１１Ｃを参照）と類似の結果をもたらした。
図２３は、ＣＤスペクトル測定による、遊離型、非コンジュゲートＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）の解析を示す。例えば、図２３Ａは、異なる温度でのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＭＯＲＦ１（５μＭ）及びＭＯＲＦ２（５μＭ）の混合物のＣＤスペクトルを示す。温度が２５℃から６０℃及び９５℃まで上昇したとき、２６０ｎｍでの正の帯は、２７５ｎｍ付近を中心とするピークを生成した深色シフトを起こした。２６０ｎｍでのモル楕円率（θ）を、以下の熱融解試験において使用した。図２３Ｂは、温度が上昇するにつれてそのデータが収集された、ハイブリダイズされたＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２の順方向ＣＤ熱融解曲線を示す。図２３Ｃは、温度が低減するにつれてそのデータが収集された、ハイブリダイズされたＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２の逆方向ＣＤ熱融解曲線を示す。２６０ｎｍでθのＳ字変化を実証するプロファイルは、順方向走査及び逆方向走査の両方で同じであった。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。ロジスティック関数を使用した非線形回帰の結果は、Ｔｍ＝５７〜６１℃を示した。
（４）Ｂ細胞表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の生体認識
ヒトＢ細胞リンパ腫Ｒａｊｉ細胞系統（ＣＤ２０+）（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏら、１９８０；Ｓｈａｎら、１９９８）を、細胞表面でのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２（結合価＝２）の生体認識を試験するために使用した。この試験を、共焦点蛍光顕微鏡によって実施した。まず、Ｒａｊｉ細胞をローダミンで標識されたＦａｂ’−ＭＯＲＦ１に曝露することで、ＣＤ２０へのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１結合により、細胞表面赤色シグナル（ＲＨＯ）装飾がもたらされた；ＦＩＴＣで標識されたＰ−ＭＯＲＦ２のみに曝露された細胞は、いずれの蛍光シグナルも示さなかった（図１２Ａ、０．４μＭでのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１または０．４μＭでのＰ−ＭＯＲＦ２、ＭＯＲＦ２当量）。次に、Ｒａｊｉ細胞が両方の蛍光で標識されたコンジュゲート（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１＋Ｐ−ＭＯＲＦ２）に連続的に（１時間空けて）または予混合物として（すなわち、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．４μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２（０．４μＭ）の混合物、ＭＯＲＦ２当量）のいずれかで曝露されたとき、赤色及び緑色（ＦＩＴＣ）シグナルが、Ｂ細胞の表面でうまく共局在化した（図１２Ｂ）。この観察は、細胞表面での好結果のＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションを示した。図１２Ｃは、二つの対照群から得られた顕微画像を示す：（１）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（ローダミン）及びＦＩＴＣ色素を有するがＭＯＲＦ２を有さないＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ＦＩＴＣ、過剰量）の予混合物に曝露された細胞；（２）連続的にＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）（ローダミン）に、その後過剰の非コンジュゲートＭＯＲＦ１を有するＰ−ＭＯＲＦ２（ＦＩＴＣ）の混合物（これが二本鎖ＭＯＲＦでグラフトされたＨＰＭＡコポリマー；Ｐ−ｄｓＭＯＲＦを生成する）に細胞を曝露することにより達成された「プレブロッキング」対照。両方の対照処置は、生体認識対が存在しないために、赤色シグナルのみを細胞表面でもたらした（図１２Ｃ）。これらの対照の結果は、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の細胞表面生体認識が、確かにＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションを媒介したことを確証させた。
（５）ヒトＮＨＬ Ｂ細胞のアポトーシスの誘導
ヒトＢ細胞系統（Ｒａｊｉ及びＤＧ７５）のアポトーシス誘導を、三つの方法によって評価した：カスパーゼ３の活性化アッセイ、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合アッセイ、及びターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）アッセイ。これらの実験では、ヤギ抗マウス二次抗体（２°Ａｂ）と高架橋された抗ＣＤ２０ １Ｆ５ ｍＡｂを、ＦｃＲ＋免疫エフェクター細胞の機能を模倣する陽性対照として使用した（Ｓｈａｎら、１９９８）。この対照は、抗ＣＤ２０ｍＡｂの治療有効性を部分的に反映した。結果は、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の共処置が、連続的または予混合物としてのいずれかで、効果的にＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスを誘導したことを示した（図１３）。対照的に、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１またはＰ−ＭＯＲＦ２のいずれかを用いた単一成分処置は、アポトーシスの開始に失敗した。一連の対照実験（図２４）は、ＣＤ２０抗原の架橋を随伴するＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションがアポトーシス誘導の要因であるという仮説を検証した。Ｒａｊｉ細胞を（１）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びポリマー前駆体Ｐ−ＴＴの混合物；（２）Ｆａｂ’及びＰ−ＭＯＲＦ２の混合物；（３）そのＭＯＲＦ１またはＭＯＲＦ２結合部位が、過剰な非コンジュゲート相補的ＭＯＲＦによって処置の前にブロックされた「プレブロックされた」コンジュゲートに曝露した。ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションが存在しないために、これらの処置のどれもアポトーシスを誘導しなかった（図２４Ａ）。さらには、ＣＤ２０を発現しない（または最小限に発現する）陰性対照Ｂ細胞系統（ＤＧ７５）のアポトーシスを評価した（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、１９７７）。二つのナノコンジュゲートを用いた共処置後のアポトーシスのレベルは非常に低く、未処置細胞のそれに類似していた（図２４Ｂ）。この結果は、ＣＤ２０結合がアポトーシス誘導に必要な事象であることを示した。
例えば、図２４は、アネキシンＶ／ＰＩ結合アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスの対照試験を示す。図２４Ａは、Ｒａｊｉ Ｂ細胞（高レベルのＣＤ２０発現）のアポトーシス誘導を示す。インキュベーション時間は、４８時間であった。図２４Ｂは、ＤＧ７５Ｂ細胞（最小のＣＤ２０発現または発現なし）のアポトーシス誘導を示す。インキュベーション時間は示した通りであった。以下の表示を図２４Ａ及び図２４Ｂに適用する：未処置：培養培地内の細胞；ｍＡｂ＋２°Ａｂ：１Ｆ５ ｍＡｂ（０．５μＭ）、その後（１時間後）ヤギ抗マウス二次抗体（０．２５μＭ）；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１：０．５μＭの単一成分；Ｐ−ＭＯＲＦ２：０．５μＭのＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３の単一成分（ＭＯＲＦ２当量）；連続：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）、その後（１時間後）Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）；予混合：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）の予混合物；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１＋Ｐ−ＴＴ：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びポリマー前駆体Ｐ−ＴＴ Ｎｏ．２（１ｍｇ／ｍＬ）の予混合物；Ｆａｂ’−ＳＨ＋Ｐ−ＭＯＲＦ２：遊離Ｆａｂ’（０．５μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）の予混合物；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１＋Ｐ−ｄｓＭＯＲＦ：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びそのＭＯＲＦ２結合部位が過剰な遊離ＭＯＲＦ１によって（処置１時間前に）ブロックされた「プレブロックされた」Ｐ−ＭＯＲＦ２（〜１ｍｇ／ｍＬ）の連続処置（１時間間隔）；Ｆａｂ’−ｄｓＭＯＲＦ＋Ｐ−ＭＯＲＦ２：そのＭＯＲＦ１結合部位が過剰な遊離ＭＯＲＦ２によって（処置１時間前に）ブロックされた「プレブロックされた」Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）の連続処置（１時間間隔）。アポトーシス細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。
（６）アポトーシス誘導の最適化
本開示の治療システムを最適化するために、コンジュゲートの濃度、二つのコンジュゲート間の比率、Ｐ−ＭＯＲＦ２の結合価、及び曝露時間を含む、いくつかの因子及びＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスに及ぼすその影響を検査した。ポリマー鎖当たり約３オリゴを含有するＰ−ＭＯＲＦ２（Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３）をまず使用した。アネキシンＶ／ＰＩ染色アッセイの結果は、１μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及び等モルのＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）が、約４０％のアポトーシス細胞（未処置と比較して４倍超）を誘導したことを示した（図１３Ａ）。図１３Ａでは、以下を適用する：未処置：培養培地内の未処置細胞；ｍＡｂ＋２°Ａｂ：１Ｆ５ ｍＡｂ（１μＭ）、その後（１時間後）ヤギ抗マウス二次抗体（０．５μＭ）；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１：１μＭの単一成分；Ｐ−ＭＯＲＦ２：１μＭのＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３の単一成分（ＭＯＲＦ２当量）；連続：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（１μＭ）、その後（１時間後）Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（１μＭ）；予混合：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（１μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（１μＭ）の予混合物。別段の指示が無い限り、各群を未処置と比較することによって統計を実施した（***ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし）。
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（及び対応するＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３）の異なる濃度を除いて、全ての条件を同一に維持したとき、濃度依存的アポトーシス誘導が観察された（図１３Ｂ）。図１３Ｂでは、以下を適用する：**ｐ＜０．００５、ｎ．ｓ．＝有意差なし。データは、コンジュゲートの濃度の増加（０．５μＭから２μＭ及び５μＭ（Ｆａｂ’当量））がより高いレベルのアポトーシスをもたらしたことを示した。連続及び予混合処置レジメンの両方、ならびに陽性対照（ｍＡｂ＋２°Ａｂ）において用量依存的傾向が観察された。試験された最高濃度（５μＭ）では、薬物を含まない高分子治療（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１＋Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３）によるアポトーシス誘導は、未処置対象と比較して７倍に達した。さらには、ｍＡｂ＋２°Ａｂによって誘導されたアポトーシス細胞のパーセンテージは、１Ｆ５ ｍＡｂの濃度が２μＭから５μＭに増加したときに飽和したように見えた。しかしながら、かかる飽和は、本開示の組成物及び複合体を受けている処置群では観察されなかった。この差異は、二つの結合部位しか有さないｍＡｂとは対照的に、Ｐ−ＭＯＲＦ２が標的との多量体相互作用を有することによると思われる。
さらには、Ｐ−ＭＯＲＦ２の結合価及びＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２間の比率が、Ｒａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシス誘導に及ぼす影響を検査した。鎖あたり１０オリゴを含有する「高結合価」Ｐ−ＭＯＲＦ２（Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０）を、Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（鎖当たり３オリゴ）と比較した。結果は、全ての処置条件が同じであるとき（０．５μＭ Ｆａｂ’、ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１または１：１０）、Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０コンジュゲートがＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３と比較して、約２倍高いレベルのアポトーシスを誘導したことを示した（図１３Ｃ）。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の連続処置は、陽性対照（ｍＡｂ及び２°Ａｂの連続処置；すなわち、１Ｆ５ ｍＡｂ（０．５μＭ）、その後にヤギ抗マウス二次抗体（０．２５μＭ））より有効にアポトーシスを誘導した。ここで観察されたより高いレベルのアポトーシス誘導は、Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の多価に起因し、それは、Ｂ細胞へのより高い結合活性ならびにより有効なＣＤ２０クラスター形成をもたらした（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９、２０１２；Ｃｈｕら、２０１２）。Ｒａｊｉ細胞が同一濃度のＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）に曝露され、一方で１０倍過剰のＰ−ＭＯＲＦ２（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１０）が使用されたとき、等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２を用いた処置と比較してアポトーシスレベルは有意に増強されなかった（図１３Ｃ）。別段の指示が無い限り、各「高結合価」群と対応する「低結合価」群を比較することによって、統計を実施した（**ｐ＜０．００５、ｎ．ｓ．：有意差なし）。全てのデータを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１で装飾された細胞の表面上のＭＯＲＦ１結合部位は飽和し、それはハイブリダイゼーションのためのポリマー鎖へのＭＯＲＦの良好なアクセシビリティを示した（ポリマー鎖による最小立体障害効果）。アポトーシス誘導の同一の傾向が異なる曝露時間で、及び異なるアポトーシスアッセイから観察された（図２５Ａ〜図２５Ｂ）。
図２５は、異なるアッセイによって解析された、異なるインキュベーション時間でのＲａｊｉ Ｂ細胞のアポトーシスを示す。図２５Ａは、カスパーゼ３活性化アッセイを示す。図２５Ｂは、ＴＵＮＥＬアッセイを示す。インキュベーション時間は示した通りであった。以下の表示を両方の図に適用する−未処置：培養培地内の細胞；ｍＡｂ＋２°Ａｂ：１Ｆ５ ｍＡｂ（０．５μＭ）、その後（１時間後）ヤギ抗マウス二次抗体（０．２５μＭ）；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１：０．５μＭの単一成分；Ｐ−ＭＯＲＦ２：５μＭのＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３の単一成分（ＭＯＲＦ２当量）；連続（１：１）：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）、その後（１時間後）Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）；連続（１：１０）：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）、その後（１時間後）Ｐ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（５μＭ ＭＯＲＦ２当量）；予混合（１：１）：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（０．５μＭ ＭＯＲＦ２当量）の予混合物；予混合（１：１０）：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（０．５μＭ）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ３（５μＭ ＭＯＲＦ２当量）の予混合物。アポトーシス細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって定量化した。データを、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２（１：１）の処置によりもたらされたＲａｊｉ細胞のアポトーシスレベルは、１０倍過剰のＰ−ＭＯＲＦ２（１：１０）を使用したそれを類似した。これは、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１で装飾された細胞の表面上のＭＯＲＦ１結合部位の飽和を示した。
（７）ヒトＮＨＬのマウスモデルにおける前臨床評価
ハイブリダイゼーションを媒介する薬物を含まない高分子治療のｉｎ ｖｉｖｏ治療有効性を、全身播種性のＲａｊｉ Ｂ細胞を有するＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７）マウスにおいて評価した。この動物モデルは１００％に近い腫瘍生着率（Ｇｈｅｔｉｅら、１９９０）を有し、及び処置後の後肢麻痺のない生存期間は、抗癌有効性を正確に反映する（Ｇｈｅｔｉｅら、１９９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、２０３）。４００万個のＲａｊｉ Ｂ細胞を、尾静脈を介して０日目に注射した；後肢麻痺の発生率またはマウスの生存時間を１２５日目までモニターした。コンジュゲート、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０を、マウスの尾静脈を介して、連続的にまたは予混合物としてのいずれかで注射した。異なる群に分けられたマウス（ｎ＝６〜７）は、本開示の組成物及び複合体を含む単回用量または３用量の処置のいずれかを受け、それは腫瘍注射の２４時間後に開始した。１日目に単回用量処置；１、３、５日目に３用量処置。動物生存曲線を図１４に示す。ＰＢＳ（ｎ＝８）で処置された陰性対照マウスは、癌細胞の注射後１７〜３５日目に後肢麻痺を発症した；生存期間中央値は２４日間であった。この観察は文献と一致した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、２００３；Ｗｕら、２０１２）。連続処置の単回投与（連続×１；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）は実質的に動物生存時間を延長させた（生存期間中央値：８１日間）。単回予混合用量（予混合×１；ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：１）は、連続処置と類似の有効性を有し、７８日の生存期間中央値をもたらした。同一用量のＦａｂ’−ＭＯＲＦ１（５７．５μｇ／２０ｇ）が与えられるが、その後に５倍過剰のＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０（ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：５）が与えられるとき、有効性は、等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２処置より有意に改善された。かかる処置の単回投与（連続（１：５）×１）は、６７％生存率（４／６長期生存者；１２５日間）を生成した。ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏデータ（図１３Ｃ）間の矛盾は、過剰なＰ−ＭＯＲＦ２が使用されたとき、結合飽和を阻害するコンジュゲートの血液希釈によって説明され得る。要約すると、図１４では、以下を適用する：ＰＢＳ：ＰＢＳ（ｎ＝８）を注射されたマウス；連続×１：Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の連続処置、単回用量（ｎ＝７）；予混合×１；Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の予混合物、単回用量（ｎ＝７）；連続（１：５）×１；連続処置、ＭＯＲＦ１：ＭＯＲＦ２＝１：５、単回用量（ｎ＝６）；連続×３；３用量の連続処置（ｎ＝７）；予混合×３；３用量の予混合物（ｎ＝７）；１Ｆ５ ｍＡｂ×３；３用量の１Ｆ５ ｍＡｂ（ｎ＝７）。マウスの麻痺無し生存時間を、カプラン・マイヤープロットにて表す。各群における長期生存者の数を示した（もしあれば）。ログランク検定で統計を実施した（*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．＝有意差なし）。
優れた治療有効性が、３連続投与用量（連続×３；ｎ＝７）または３予混合投与用量（予混合×３；ｎ＝７）を受けたマウスの群で観察された。全てのマウスは実験のエンドポイント（１２５日目）まで生存した。３等価用量の１Ｆ５ ｍＡｂ（静脈内）を受けた陽性対照群（ｎ＝７）は、８６％生存率を有した。３用量処置群（すなわち、本開示の組成物及び複合体を受けている）に対する差異は統計的に有意ではないが、本開示の組成物及び複合体の抗癌活性は、ｍＡｂと違い、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの免疫エフェクターメカニズム（Ｏｋｒｏｊら、２０１３）から独立している。これらのデータは、本開示の直接アポトーシス誘導システムが、主にＡＤＣＣ及びＣＤＣに関連する副作用（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｌｋら、２００１；Ｏｋｒｏｊら、２０１３）の懸念を同時に減少させる一方で、免疫療法として有効であり得ることを示した。
（８）ｉｎ ｖｉｖｏ抗リンパ腫有効性の解析
４×１０6個のＲａｊｉ Ｂ細胞を０日目に静脈内注射されたマウスを、異なる処置に曝露した−ＰＢＳ：ＰＢＳを注射されたマウス；連続×３；１、３、５日目に、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の連続処置；予混合×３；１、３、５日目に、３用量のＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０の予混合物。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を用いた処置後のＳＣＩＤマウスにおけるＲａｊｉ細胞の根絶は、ＭＲＩ、フローサイトメトリー、及び組織学によって確証された。癌細胞の注射後４〜５週間での、ガドリニウムベースの造影剤を用いるＭＲＩは、ＰＢＳで処置された対照マウスが腰髄に腫瘍を発症し（図１５Ａ）、一方で３用量の本開示の組成物及び複合体が腫瘍発症を防止した（図１５Ｂ〜図１５Ｃ）ことを示した。図１５Ａ〜図１５Ｃは、マウスの腰椎に焦点を当てた造影（Ｔ1）強調矢状断像ＭＲＩを示す。腫瘍小結節（赤矢印）を示す異質な見た目及び不規則な形状の腫瘤が対照マウスの脊髄にて観察された（ＰＢＳ、ｎ＝４、図１５Ａ）が、処置マウス（連続×３及び予混合×３、ｎ＝４）では観察されなかった。連続×３（図１５Ｂ）または予混合×３（図１５Ｃ）で処置された生存マウスは、１６週目に再度撮像された；疾患の再発は観察されなかった（図２６Ａ〜図２６Ｃ）。
図２６は、Ｒａｊｉ Ｂ細胞を注入され、異なる処置に曝露されたマウスの造影Ｔ1強調矢状断像ＭＲＩを示す。図２６Ａは、ＰＢＳで処置された対照マウスが、腫瘍を腰髄に発症したことを示し、それは腫瘍小結節（矢印）を示す異質な見かけ及び不規則な形状の腫瘤によって特徴付けられる。ＭＲシグナル強度（任意単位）の範囲を示す灰色のスケールバーを示す。図２６Ｂは、腰椎に焦点を当てた、本開示の組成物及び複合体（連続×３）で処置されたマウスのＭＲ画像を示し、図２６Ｃは、腰椎に焦点を当てた、本開示の組成物及び複合体（予混合×３）で処置されたマウスのＭＲ画像を示す。撮像は、癌細胞の注射後１０５日目に実施された；走査されたマウスのいずれにおいても腫瘍は見出されなかった（ｎ＝４）。
マウスを屠殺した後、フローサイトメトリーを実施して、大腿骨髄における残留Ｒａｊｉ細胞（ヒトＣＤ１０+ＣＤ１９+）を解析した（図１５Ｄ）。二つの蛍光標識抗体、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１０及びＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１９を、フローサイトメトリー解析のために使用した（Ｗｕら、２０１２；Ｃｈｅｎら、２０１０）。結果は、麻痺した動物（ＰＢＳ処置）が相当量のＲａｊｉ細胞を骨髄（大腿から得た）内に有し、一方で治療群（連続×３及び予混合×３）における長期生存者は腫瘍が無かった（図１５Ｅ）ことを示した。フローサイトメトリーは、また、麻痺したマウス（ＰＢＳ処置）の脊髄内のＲａｊｉ細胞があり、長期生存者（図２７Ａ〜図２７Ｆ）ではないことも確認した。これはＭＲＩデータと一致した。さらには、図１５Ｅは、フローサイトメトリーによって解析された、対象マウス（ＰＢＳ、ｎ＝６）及び本開示の組成物及び複合体で処置されたマウス（連続×３及び予混合×３、群当たりｎ＝７）の骨髄におけるＲａｊｉ細胞％（ヒトＣＤ１０+ＣＤ１９+）の定量的比較を示す（図１５Ｄ）。各データ点は個別のマウスを表す；平均％を示す。ペアのないサンプルのスチューデントのＴ検定によって統計を実施した（*ｐ＜０．０５）。
図２７は、異なる処置を受けた腫瘍を有するマウスの異なる臓器／組織内の残留Ｒａｊｉ Ｂ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。図２７は、ＰＢＳ（図２７Ａ）、３連続処置（図２７Ｂ）、３予混合処置（図２７Ｃ）で処置されたマウスの鼠径リンパ節及び腸間膜リンパ節（ＬＮ）から単離された細胞を示す。図２７は、ＰＢＳ（図２７Ｄ）、３連続処置（図２７Ｅ）、及び３予混合処置（図２７Ｆ）で処置されたマウスの脊髄（ＳＣ）から単離された細胞も示す。これらの細胞をＰＥマウス抗ヒトＣＤ１０及びＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した；右上四分儀（ＣＤ１０+ＣＤ１９+）はＲａｊｉ細胞を表す。ＰＢＳで処置された、麻痺のあるマウス（ＰＢＳ）は、ＬＮ（ｎ＝６）及びＳＣ（ｎ＝３）の両方でＲａｊｉ細胞を有するが、一方で治療群（連続×３、予混合×３；図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２７Ｅ、及び図２７Ｆ）における長期生存者は腫瘍がなかったことを示した（群当たりｎ＝６）。
さらには、組織学的検査は、ＰＢＳ処置マウスの肝臓、肺及び脳におけるリンパ腫播種を開示した（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。対照的に、長期生存者では腫瘍は見られなかった。いずれの組織においても処置によって引き起こされる毒性は検出されなかった；処置マウスの組織学及び安定した体重増加によって証拠づけられる（図２８）。図２８は、尾静脈を介してＲａｊｉ Ｂ細胞を注射され、異なる処置に曝露されたマウスの体重を示す。単回用量投与は１日目であった；３用量は１、３、５日目に投与された。体重を平均−ＳＤとして表す。全てのマウスの最初の平均化された体重の８０％を示す黒い点線を示す。これらの結果は、本開示の組成物及び複合体がリンパ腫細胞の増殖／播種をｉｎ ｖｉｖｏで急性毒性なしに阻害することに成功したことを示した。図１６Ａでは、Ｒａｊｉ細胞を注射され、ＰＢＳで処置された対照マウスは、肝臓（２マウス（腫瘍を見出された）／４マウス（検査した））、肺（３／４）、及び脳（１／４）に転移性腫瘍を発症し、これは単形リンパ腫細胞の侵襲（アスタリスク）及び正常組織構造の破壊によって実証された。図１６Ｂでは、３用量の、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の連続処置（連続×３）では、結果としてリンパ腫侵襲の証拠がなかった（０／３、全ての臓器について）。図１６Ｃでは、３用量の予混合処置（予混合×３）は、リンパ腫播種を予防した（０／３、全ての臓器について）。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された組織検体は、盲検獣医病理学者（ｂｌｉｎｄｅｄ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔ）によって検査された。評価されたいずれの臓器においても処置の毒性は示されなかった。
（９）関連材料及び方法
（ａ）ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２
二つの相補的な３’アミン誘導体化２５ｍｅｒホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマーは、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ（オレゴン州フィロマス）からであった。ＭＯＲＦ１：５’−ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ−リンカー−アミン−３’（ＭＷ＝８６３０．５Ｄａ）；ＭＯＲＦ２：５’−ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ−リンカー−アミン−３’（ＭＷ＝８４３８．５Ｄａ）。リンカーの構造を図２に示す。塩基配列の設計のために、配列スクランブリングソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｒｎａｗｉｚａｒｄ．ｃｏｍ／ｓｃｒａｍｂｌｅｄ．ｐｈｐ）及び配列解析ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ）を使用した。
（ｂ）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１の調製
１Ｆ５ ｍＡｂを、マウスのハイブリドーマ細胞サブクローン１Ｆ５（ＡＴＣＣ、メリーランド州ベセスダ）からＣｅｌｌＭａｘ（登録商標）バイオリアクター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ランチョ・ドミンゲス）内で調製した。抗体を培養培地から回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で精製した。ｍＡｂからのＦａｂ’の調製は、Ｆｏｗｅｒｓら、２００１に明記のプロトコルに従った。簡潔には、ｍＡｂをクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中でＦ（ａｂ’）2へと１０％（ｗ／ｗ）ペプシン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用いて消化した。コンジュゲーションの直前に、Ｆ（ａｂ’）2を１０ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）によってＦａｂ’へと還元した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートを調製するため、３’第一級アミンを含有するＭＯＲＦ１オリゴをスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）と反応させて、末端（チオール反応性）マレイミド基を導入した。これによって３’−マレイミドを有するＭＯＲＦ１（ＭＯＲＦ１−ｍａｌ）を生成した。ＭＯＲＦ１−ｍａｌを次いでＦａｂ’（末端チオール基を含有する）にチオエーテル結合を介してコンジュゲートさせて、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１を得た。コンジュゲートを、ＳＥＣを用いて精製して遊離型、非コンジュゲートＦａｂ’及びＭＯＲＦ１を除去した。
具体的には、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートを調製するために、次のステップを実施した：まず、２００ｎｍｏｌのＭＯＲＦ１−ＮＨ2（３’第一級アミンを含有する）（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、オレゴン州フィロマス）を、１７０μＬのＤＭＳＯ中で０．６７ｍｇ（２μｍｏｌ）のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｓｏｌｔｅｃ Ｖｅｎｔｕｒｅｓ、マサチューセッツ州ビバリー）と反応させて、ＭＯＲＦ１−ｍａｌ（３’マレイミドを含有する）を生成した。反応は室温で２４時間行われた。生成物を１．５ｍＬのアセトンに沈殿させることで単離し、脱イオン化水アセトンに２回溶解沈殿することすることによって精製して、真空下で乾燥させた。次に、２００ｎｍｏｌのＭＯＲＦ１−ｍａｌを２００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ６．５）内に溶解し、次いで該溶液を２ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ６．５）中で２００ｎｍｏｌ（〜１０ｍｇ）の新たに還元されたＦａｂ’−ＳＨと混合した。反応は４℃で２４時間行われた。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してＦａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートを精製し、遊離型、非コンジュゲートＦａｂ’及びＭＯＲＦ１を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００ ＨＲ１６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用した。任意選択的に、イメージング試験のために、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１を５〜１０モル過剰のローダミンＲｅｄ（商標）−Ｘスクシンイミジルエステル（Ｒ６０１０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で標識した。生成物をＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートのＦａｂ’当量濃度を決定するため、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用した。得られた値を、紫外・可視分光法（２７８，０００Ｍ-1ｃｍ-1のモル吸光係数を使用）から得られたＭＯＲＦ１当量濃度と比較した。かかる比較によって、カップリング反応の１：１化学量論が確証された。
（ｃ）Ｐ−ＭＯＲＦ２の調製
ポリマー前駆体（Ｐ−ＴＴ及びＰ−ＴＴ−ＦＩＴＣ）、いわゆる、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシンチアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）、及び任意選択的に、Ｎ−メタクリロイルアミノプロピルフルオレセインチオウレア（ＭＡ−ＦＩＴＣ）のコポリマーを、ＲＡＦＴ共重合によって合成した。２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４；Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンド）を開始剤として使用し、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾアト（ＣＰＤＢ）を連鎖移動剤として使用した。ＣＰＤＢ（Ｐａｎら、２０１１）及びモノマーＨＰＭＡ（Ｋｏｐｅｃｅｋら、１９７３）、ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ（Ｓｕｂｒら、２００６）、及びＭＡ−ＦＩＴＣ（Ｏｍｅｌｙａｎｅｋｏら、１９９８）を合成した。
多価Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートを二つのステップで調製した。まず、ポリマー前駆体（Ｐ−ＴＴ）、いわゆる、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシングリシルチアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）、及び任意選択的に（イメージング試験のためのみ）、Ｎ−メタクリロイルアミノプロピルフルオレセインチオウレア（ＭＡ−ＦＩＴＣ）のコポリマーをＲＡＦＴ共重合によって合成した。次に、Ｐ−ＴＴをＭＯＲＦ２−ＮＨ2と反応させて多価Ｐ−ＭＯＲＦ２を生成した。
Ｐ−ＴＴの合成に関して、ＲＡＦＴ共重合では、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート（ＣＰＤＢ）を連鎖移動剤として使用し、及び２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（ＶＡ−０４４）を開始剤として使用した。反応は、０．３％（ｖ／ｖ）酢酸（ＭｅＯＨ／Ｈ＋）を含有するメタノール中で実行された。一般的な手順は次の通りである：ＨＰＭＡ（２７２ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）及びＭＡ−ＧＧ−ＴＴ（３０．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をシュレンクライン（Ｓｃｈｌｅｎｋ−ｌｉｎｅ）に付いているアンプル内へと添加した。３回の真空窒素循環で酸素を除去した後、１ｍＬの脱気ＭｅＯＨ／Ｈ＋を添加してモノマーを溶解した。その後、ＣＰＤＢ溶液（５０μＬ ＭｅＯＨ／Ｈ＋中に０．４３ｍｇ）及びＶＡ−０４４溶液（５０μＬ ＭｅＯＨ／Ｈ＋中に０．２５ｍｇ）を、シリンジを介して添加した。アンプルを密封する前に該混合物を窒素で１５分間泡立てた；共重合を４０℃で３６時間行った。該コポリマーを、アセトンへの沈殿によって単離し、メタノール−アセトンに２回溶解沈殿することによって精製し、真空下で乾燥させた。Ｐ−ＴＴの収率は、１６０ｍｇ（５３％）であった。Ｐ−ＴＴの数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（多分散性、Ｐｄ）をＳＥＣによって、ｍｉｎｉＤＡＷＮ及びＯｐｔｉｌａｂＲＥＸ検出器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用して決定した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）及び３０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を移動相として、使用した。末端（活性）ジチオベンゾアト基を除去するために、Ｐ−ＴＴコポリマーを、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、バージニア州リッチモンド）と反応させた。簡潔には、Ｐ−ＴＴ（３９ｍｇ、Ｍｎ＝９２ｋＤａ、〜０．４２ｍｍｏｌ）及びＶ−６５（２０倍過剰、２．１ｍｇ、〜８．４７ｍｍｏｌ）をアンプル内に添加した。３回の真空窒素循環で酸素を除去した後、０．４ｍＬのＭｅＯＨ／Ｈ＋を添加した。該溶液を窒素で１５分間泡立て、密閉し、５０℃で３時間反応させた。末端修飾コポリマーを、アセトンへの２回沈殿によって精製し、次いで真空下で乾燥させた（収率３４ｍｇ、または８６％）。コポリマー内のＴＴ基の含有量を、３０５ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定した（モル吸光係数＝１０，９００Ｍ−１ｃｍ−１；メタノール中）（Ｓｕｂｒら、２００６）。ＦＩＴＣの含有量を、４９５ｎｍでの吸光度によって決定した（モル吸光係数＝８２，０００Ｍ−１ｃｍ−１；ホウ酸緩衝液ｐＨ９．２＋１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＦ中）（Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏら、１９９８）。
Ｐ−ＭＯＲＦ２を生成するためのＰ−ＴＴへのＭＯＲＦ２−ＮＨ2の付着に関して、上述のＰ−ＴＴをＭＯＲＦ２−ＮＨ2と反応させて、多価Ｐ−ＭＯＲＦ２を生成した。例えば、次のステップを実施した：１０ｍｇのＰ−ＴＴ（９２ｋＤａ；３．８３μＭｏｌのＴＴ基を含有する）を６．４６ｍｇ（７６６ｎｍｏｌ）のＭＯＲＦ２−ＮＨ2と、４００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合した。アンプル内の該溶液混合物を室温で２４時間撹拌した；次いで１μＬの１−アミノ−２−プロパノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を添加し、さらに１５分間撹拌して、ポリマー鎖上の未反応ＴＴ基をアミノライズ（ａｍｉｎｏｌｙｚｅ）した。反応後、該溶液を０．２２μＭフィルターを通してろ過し、該コンジュゲートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出されたＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を有するＡＫＴＡ ＦＰＬＣを使用してＳＥＣによって精製した。Ｐ−ＭＯＲＦ２を、非コンジュゲートＭＯＲＦ２（あれば）の除去後、２６５ｎｍでのＵＶ吸光度によって特徴付けた。ＭＯＲＦ２の含有量を定量化し、結合価（ポリマー鎖あたりのＭＯＲＦ２の数）を決定するために、紫外・可視解析の前に、分取りしたＰ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートを凍結乾燥し、０．１Ｎ ＨＣｌに溶解した。２５２，０００（Ｍ-1ｃｍ-1）のモル吸光係数をＭＯＲＦ２の定量化のために使用した。Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートの結合価を、結果得られたＭＯＲＦ２含有量及びポリマー骨格のＭｎ（以前にＳＥＣによって決定された）に基づいて算出した。
（ｄ）Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２の特徴付け
ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２オリゴの定量化、ならびにコンジュゲート内のＭＯＲＦの含有量の決定のために紫外・可視分光法を使用した。ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２のモル吸光係数（２６５ｎｍで、０．１Ｎ ＨＣｌ中）は、それぞれ、２７８，０００及び２５２，０００（Ｍ-1ｃｍ-1）であった。Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートの結合価を、ＭＯＲＦ２の消衰係数及びポリマー骨格のＭｎを使用して決定した。Ｐ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートのＭＯＲＦ２当量濃度を、紫外・可視分光法を使用して定量化した。Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートのＦａｂ’当量濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）によって定量化した。
ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの際の淡色効果の解析をＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ４００Ｂｉｏ紫外可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して実施した。ＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２（またはＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２）をまず１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）にそれぞれ２．５μＭ（ＭＯＲＦ当量）の濃度で溶解し、次に、異なる比率で混合した。全ての溶液混合物におけるＭＯＲＦオリゴ（ＭＯＲＦ１＋ＭＯＲＦ２）の最終濃度は、一定に保たれた（２．５μＭ）。例えば、７５％のＭＯＲＦ１（または２５％ＭＯＲＦ２）を含有する混合物は、０．７５ｍＬの２．５μＭ ＭＯＲＦ１溶液と０．２５ｍＬの２．５μＭ ＭＯＲＦ２溶液を混合することによってなされた。試料を、１ｃｍのクォーツ製のキュベット内に配置した。２６０ｎｍ（塩基によって寄与される）での光学濃度（ＯＤ）を記録した。全ての測定を三重で行った。
コンジュゲート、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２、及びその前駆体、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＰ−ＴＴの流体力学的有効直径を、ＤＬＳ（動的光散乱法）によって、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ製ＢＩ−２００ＳＭゴニオメーター及びＨｅ−Ｎｅレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えたＢＩ−９０００ＡＴデジタルコリレーターを使用して室温でＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で解析した。散乱角は９０°であった。直径１０２±３ｎｍ（標準１００ｎｍ）のＮａｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）ポリスチレンサイズ標準（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を並べて（ｉｎ ｌｉｎｅ）測定した。約１ｍｇ／ｍＬの濃度でのコンジュゲート及び前駆体を、測定の前に０．２２μＭフィルターを通してろ過した。全ての試料は、０．２未満の多分散性を示し、平均粒子直径を記録した。さらには、ＤＬＳを使用してＦａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２が結合する際の粒子サイズの変化を特徴付けた。解析を、二つのコンジュゲートを（等モルのＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２濃度で）混合した後、異なる時間（１０分後、３０分後、６０分後）で解析を行った。全ての試料は、ハイブリダイズされたコンジュゲートを示す主要集団粒子（多分散性＜０．２）、ならびに非結合Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２を示す小数集団粒子を含有した。主要集団の平均有効直径を記録した。全ての測定を三重で行った。
熱電性温度制御システムを有するＡｖｉｖ ６２ＤＳ ＣＤ分光計（Ａｖｉｖ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ニュージャージー州レイクウッド）を使用した。定期的な測定（熱融解解析を除く）を、各試料が１ｎｍ／ステップ（帯域幅＝１ｎｍ、各ステップ＝２秒）で２００から３４０ｎｍまで走査される２５℃で実行した。試料を１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で５０μＭ ＭＯＲＦ当量濃度（５０μＭ Ｆａｂ’当量でのＦａｂ’−ＳＨ）で調整した。測定の前に、試料を０．２２μＭフィルターを通してろ過し、０．１ｃｍ光路長のクォーツ製のキュベット内に配置した。得られたスペクトルをバックグラウンド（ＰＢＳ ｐＨ＝７．４）から差し引いた；三つの連続走査からのデータを平均化した。熱融解試験については、２６０ｎｍでのＣＤシグナルを記録した（ｎ＝３）。
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２（またはＭＯＲＦ１及びＭＯＲＦ２）を等モル比（５μＭ／５μＭ ＭＯＲＦ１／ＭＯＲＦ２）でＰＢＳ ｐＨ＝７．４中で１時間室温で混合した。該溶液混合物を、測定の前に、ろ過し、１ｃｍ光路長のクォーツ製のキュベット内に配置した。各試料は、まず２℃／ステップで、２５℃から９５℃へ温度が上昇する順方向走査を受けた。各ステップについて、各試料を２分間平衡化し、その後３０秒間のデータ点平均化を行った。その後、−１０℃／ステップで９５℃から２５℃に温度低減する逆方向走査を実施した。各ステップについて、試料を５分間平衡化し、３０秒間のデータ点平均化を行った。
測定された楕円率（θobs）を、次の式を使用してモル楕円率（θ）に変換した：θ＝θｏｂｓ／（ｌ×ｃ）、式中、ｌはキュベットの光学的距離であり、ｃはＭＯＲＦ当量モル濃度である。ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションの融解温度（Ｔｍ）を解析するため、θ（２６０ｎｍで）を温度（Ｔ）に対してプロットし、データを、次の４パラメータロジスティック関数を使用して非線形回帰（グラフパッドプリズム５ソフトウェア）によって熱融解曲線にフィットさせた：
θ＝θｍｉｎ＋（θｍａｘ−θｍｉｎ）／［１＋（Ｔ／Ｔｍ）＾Ｈ］
式中、θminは曲線における最小モル楕円率（２６０ｎｍで）であり、θmaxは曲線における最大モル楕円率（２６０ｎｍで）であり、Ｈは、Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅである。
（ｅ）共焦点蛍光顕微鏡
ヒトバーキットＢ細胞非ホジキンリンパ腫Ｒａｊｉ細胞系統（ＡＴＣＣ、メリーランド州ベセスダ）を、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）において、５％のＣＯ2（ｖ／ｖ）を有する３７℃の加湿雰囲気下で培養した。全ての実験は、対数増殖期の細胞を使用して行われた。連続処置については、ウェルあたり１０6の密度の細胞を０．４ｍＬのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１−ＲＨＯ（０．４μＭ Ｆａｂ’当量）と培養培地にて３７℃で一時間インキュベートした；次いで、０．４ｍＬのＰ−ＭＯＲＦ２−ＦＩＴＣ（０．４μＭ ＭＯＲＦ２当量）とのさらに１時間にわたるインキュベーションの前に、細胞を２回ＰＢＳで洗浄した。予混合処置については、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１−ＲＨＯ及びＰ−ＭＯＲＦ２−ＦＩＴＣを最初に培養培地内で等モル濃度（０．４μＭ）で１時間混合した；次いで、同一密度の細胞を０．４ｍＬの予混合溶液と１時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し（コンジュゲートを含有する培地を捨てるため）、次いで、オリンパス製レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００）を使用して、イメージングするために、１４ｍｍのマイクロウェルを有する滅菌された３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州アッシュランド）上に配置した。対照試験については、全ての対応する成分の濃度を一貫して維持した；過剰量のＰ−ＦＩＴＣ及びＰ−ｄｓＭＯＲＦを使用した。解析の前に、ＦＩＴＣ標識１Ｆ５ ｍＡｂ、ローダミン標識Ｆ（ａｂ’）2、及びＰＢＳとインキュベートされた細胞を、チャネル設定を調整する及びＣＤ２０結合を確認するために使用した。
（ｆ）ＩＮ ＶＩＴＲＯアポトーシスの評価
ヒトＮＨＬ Ｂ細胞のアポトーシスを三つの方法によって評価した：カスパーゼ３アッセイ、アネキシンＶ／ＰＩアッセイ、及びＴＵＮＥＬアッセイ。これらのアッセイは異なる側面からアポトーシスを評価した−カスパーゼ３活性化のレベルは、アポトーシス性タンパク質発現を表した；アネキシンＶ／ＰＩ結合は、初期アポトーシス事象としての細胞膜反転を特徴付けた；ＴＵＮＥＬアッセイは、後期アポトーシス事象としてのゲノムＤＮＡ断片化を解析した。アポトーシス活性（アポトーシス細胞％）の定量化をフローサイトメトリーによって実施した。
Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１及びＰ−ＭＯＲＦ２との共処置によるヒトバーキットＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）Ｒａｊｉ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス誘導を三つのアッセイによって評価した：カスパーゼ３活性化アッセイ、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）結合アッセイ、及びＴＵＮＥＬ（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識法）アッセイ。全ての実験において、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）二次抗体（２°Ａｂ）（ＫＰＬ、メリーランド州ゲイザースバーグ）と高架橋した１Ｆ５ ｍＡｂを、陽性対照として使用した（モル比 １Ｆ５：ＧＡＭ＝２：１）。未処置細胞（培養培地内）を陰性対照として使用した。
カスパーゼ３活性を評価するために、Ｐｈｉ−ＰｈｉＬｕｘキット（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ、メリーランド州ゲイザースバーグ）を使用した。連続処置について、２×１０5個のＲａｊｉ細胞を０．５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を含有する０．４ｍＬの新鮮な増殖培地に懸濁した。該細胞を、５％のＣＯ2を有する３７℃の加湿雰囲気中で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、その後、０．５μＭまたは５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２を含有する０．４ｍＬの培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を６時間または２４時間インキュベートした。予混合処置については、まず、０．５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を０．５μＭまたは５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２と培養培地にて室温で１時間混合し、次いで２×１０5個のＲａｊｉ細胞を０．４ｍＬの予混合溶液に懸濁した。該細胞懸濁液を６時間または２４時間インキュベートした。陽性対照については、細胞をまず０．４ｍＬの０．５μＭの１Ｆ５ ｍＡｂと培養培地にて１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡを用いて２回洗浄し、その後０．２５μＭのＧＡＭを含有する０．４ｍＬの新鮮な増殖培地に再懸濁した。該細胞を、３７℃でさらに６時間または２４時間インキュベートした。処置の後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、製造業者のプロトコルに従ってカスパーゼ３活性について解析した。全ての実験を三重で行った。
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ染色を製造業者（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マサチューセッツ州ボストン）によって提供されるＲＡＰＩＤ（商標）プロトコルに従って行った。連続処置については、２×１０5個のＲａｊｉまたはＤＧ７５（ＣＤ２０陰性；対照）細胞を０．５、１、２または５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を含有する０．４ｍＬの新鮮な増殖培地に懸濁した。該細胞を５％のＣＯ2を有する３７℃の加湿雰囲気中で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、その後０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２を含有する０．４ｍＬの培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を２４時間または４８時間インキュベートした。予混合処置については、まず、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２と、培養培地にて室温で１時間混合し、次いで２×１０5個のＲａｊｉまたはＤＧ７５細胞を０．４ｍＬの予混合溶液に懸濁した。該細胞懸濁液を２４時間または４８時間インキュベートした。陽性対照については、細胞をまず０．４ｍＬの０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または５μＭの１Ｆ５ ｍＡｂと培養培地にて１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡを用いて２回洗浄し、その後０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、または２．５μＭのＧＡＭを含有する０．４ｍＬの新鮮な増殖培地に再懸濁した。該細胞を３７℃でさらに２４時間または４８時間インキュベートした。染色の前に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。全ての実験を三重で実行した。
ＴＵＮＥＬアッセイについて、Ａｐｏ Ｄｉｒｅｃｔ ＴＵＮＥＬキット（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。連続処置については、１０6個のＲａｊｉ細胞を、０．５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を含有する０．５ｍＬの新鮮な増殖培地に懸濁した。該細胞を５％のＣＯ2を有する３７℃の加湿雰囲気中で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、その後、０．５μＭまたは５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２を含有する０．５ｍＬの培地に再懸濁した。該細胞懸濁液を２４時間または４８時間インキュベートした。予混合処置については、まず、０．５μＭのＦａｂ’−ＭＯＲＦ１を０．５μＭまたは５μＭ（ＭＯＲＦ２当量）のＰ−ＭＯＲＦ２と培養培地にて室温で１時間混合し、次いで１０6個のＲａｊｉ細胞を０．５ｍＬの予混合溶液に懸濁した。該細胞懸濁液を２４時間または４８時間インキュベートした。陽性対照については、細胞をまず０．５ｍＬの０．５μＭの１Ｆ５ ｍＡｂと培養培地にて１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋１％ＢＳＡを用いて２回洗浄し、その後０．２５μＭのＧＡＭを含有する０．５ｍＬの新鮮な増殖培地に再懸濁した。該細胞を３７℃でさらに２４時間または４８時間インキュベートした。処置後、該細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１時間固定した。次いで、該細胞を７０％のエタノール中で４℃で一晩透過処理をした。解析の前に、ニック末端標識を製造業者のプロトコルに従って実行した。全ての実験を三重で実行した。
（ｇ）ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌有効性の決定
約７週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）に尾静脈を介して２００μＬ食塩水中の４×１０6個のＲａｊｉ細胞を静脈注射した（０日目）。この動物モデルは、後肢麻痺及びその後の動物の死亡につながる、脊髄を含む様々な臓器におけるリンパ腫細胞の播種、浸潤、及び増殖を表す（Ｇｈｅｔｉｅら、１９９０、１９９２；Ｇｒｉｆｆｉｒｔｈｓら、２００３）。後肢麻痺の発症を実験のエンドポイントとした；加えて、体重損失が＞２０％となったときマウスを屠殺した。麻痺／病気のサインがない動物は１２５日目まで維持され、長期生存者と考えられた。コンジュゲート、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（５７．５μｇ／２０ｇ；１ｎｍｏｌのＭＯＲＦ１）及びＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０（２２μｇ／２０ｇ；１ｎｍｏｌのＭＯＲＦ２）、を１００μＬのＰＢＳに溶解し、尾静脈を介して連続的に（１時間間隔）または予混合物（処置の１時間前に混合）としてのいずれかで注射した。接種マウスを７群に分けた：（１）陰性対照（２００μＬのＰＢＳを注射）、（２）連続処置の単回投与（連続×１）、（３）予混合処置の単回投与（予混合×１）、（４）３回投与された連続処置（連続×３）（５）３回投与された予混合処置（予混合×３）（６）連続処置の単回投与だが、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１に対して５倍過剰なＰ−ＭＯＲＦ２／ｖ１０（１１０μｇ／２０ｇ；５ｎｍｏｌのＭＯＲＦ２）を用いる（連続（１：５）×１）、及び（７）３用量（７５μｇ／２０ｇ；用量あたり１ｎｍｏｌのＦａｂ’当量）の１Ｆ５ ｍＡｂを尾静脈を介して注射された陽性対照。単回用量群については、コンジュゲートを１日目に投与した（癌細胞投与の２４時間後）；複数用量群については、コンジュゲート（またはｍＡｂ）を１、３、５日目に与えた。疾患進行をモニターするため、マウス（群あたり２〜４匹）をＴ1強調ＭＲＩによって４、５、及び１６週目に走査した。ガドベン酸メグルミン（ＭｕｌｔｉＨａｎｃｅ（登録商標）；Ｂｒａｃｃｏ ＳｐＡ、イタリア、ミラノ）を０．３ｍｍｏｌ／ｋｇで撮像の２０分前に（静脈内）注射した。造影前画像を比較に使用した。
ハイブリダイゼーションを媒介する薬物を含まない高分子治療、いわゆる、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１とＰ−ＭＯＲＦ２を用いた共処置の治療有効性を、ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７）マウスが静脈内にヒトＲａｊｉ Ｂ細胞を移植された、進行性ＮＨＬの動物モデルにおいて評価した。全ての処置レジメンは本項に記載される。動物の処置後モニタリングを、１日に２回行った。マウスの体重を一日おきに記録した。綿密に評価されたマウスの主要な態様は、後肢麻痺、食餌／水消費量、異常な行動／活動のバイタルサイン（例えば、特定の領域を舐める、噛む、引っ掻く、及び発声する）、及び容姿（例えば、身繕いに失敗する、ボサボサの外見、異常な休息／猫背姿勢、起毛）を含む。次のシナリオ（どれでも最初に現れたもの）に従って動物を屠殺した：（１）（後肢）麻痺の発症、及び（２）最初（癌細胞の注射の１日前）の２０％を超える体重損失。前述のサインをいずれも伴わない動物は（癌細胞の注射後）１２５日目まで維持され、さらなる解析のために屠殺された。
ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＩの取得のために、マウスを精密気化器からの酸素中で１％〜２．５％のイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州アボットパーク）を用いて麻酔した。マウスをコイル中心で腹臥位に配置した。３０ｃｍ幅の円筒穴及び１２ｃｍの傾斜磁場インサートを有する７テスラのＢｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｅｃ ＭＲＩスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用した。造影前画像をまず取得し、次いでマウスにガドリニウムをベースとした造影剤、ガドベン酸メグルミン（Ｍｕｌｔｉｈａｎｃｅ（登録商標）；Ｂｒａｃｃｏ Ｉｍａｇｉｎｇ、イタリア、ミラノ）を、尾静脈を介して０．３ｍｍｏｌ／ｋｇ（１００μＬ、生理食塩水中）で注射した。注射の２０分後、造影後画像を取得した。走査の間、マウスの体温は、温風循環システム（ＳＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州ストーニー・ブルック）を使用して３７℃に維持された。呼吸を継続的にモニターした。ＰａｒａＶｉｓｉｏｎ（登録商標）５．１ソフトウェア環境下で走査を実行した。取得パラメータは次の通りであった：呼吸アーチファクトを抑制するためにレトロスペクティブゲーティングを用いたＴ1強調ＦＬＡＳＨシーケンス、エコー時間（ＴＥ）２．９ミリ秒、繰り返し時間（ＴＲ）４３．２ミリ秒、フリップアングル５０°、厚さ０．５ｍｍでの６枚の矢状面切片、マトリクス２５６×２５６、視野（ＦＯＶ）３ｃｍ×３ｃｍ、５０反復。走査の後、画像を解析し、オフラインワークステーション（ＯｓｉｒｉＸ）上で処理した。
（ｈ）残留Ｒａｊｉ細胞のフローサイトメトリー解析
マウスを屠殺した後、次の臓器／組織を残留Ｒａｊｉ細胞についてフローサイトメトリーによって解析した：骨髄（大腿）、腸間膜リンパ節及び鼠径リンパ節、脊髄、及び脾臓。二つの蛍光標識された抗体、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウス抗ヒトＣＤ１０（ＩｇＧ１、κイソタイプ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識マウス抗ヒトＣＤ１９（ＩｇＧ１、κイソタイプ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を使用してＲａｊｉ Ｂ細胞を染色した（Ｃｈｅｎら、２０１０）。単細胞懸濁液を次の手順を使用して臓器／組織から調製した。骨髄については、新鮮な大腿部を１ｍＬのＰＢＳでパージして細胞懸濁液を得た。細胞を５ｍＬの赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファーに再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、遠心分離してデブリを除去し、その後４００μＬの冷たい洗浄バッファーに再懸濁して、４つのチューブに等しく分けた：（１）非染色対照、（２）ＣＤ１０単独染色、（３）ＣＤ１９単独染色、及び（４）ＣＤ１０／ＣＤ１９二重染色細胞。染色については、２０μＬの各抗体を、約１０6個の細胞を含有する１００μＬの細胞懸濁液に添加した。細胞を３０分間４℃で暗所でインキュベートし、解析の前に１．５ｍＬの洗浄バッファーで洗浄した。リンパ節、脊髄及び脾臓については、機械的な方法を使用した。１ｍＬのＰＢＳを含有するシャーレ内のピンセットの助けを借りて組織を優しく脱凝集した。懸濁液を、７０μｍのＦａｌｃｏｎ（商標）ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させて大きな凝集塊及びデブリを除去し、次いで細胞を遠心分離して５ｍＬのＲＢＣ溶解バッファーに再懸濁した。残りの手順は上述と同じである。フローサイトメトリー解析については、１〜１．５×１０5個の細胞のデータを記録した。
（ｉ）病理学及び病理組織学的検査
マウスを屠殺した直後、次の臓器／組織を病理学的評価のために回収した：脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、脊髄及びリンパ節。これらの臓器／組織を１０％ホルマリン中で一晩室温で固定し、それから移動させて７０％エタノール中で保存した。病理組織学的検査を盲検獣医病理学者によってＡＲＵＰ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ユタ州ソルトレイクシティ）で行った。切片を４μｍの厚さで切断し、ガラススライド上に乗せ、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
（ｊ）統計解析
この試験における全ての実験は少なくとも３回実施された。定量化したデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。統計解析は、２群間を比較するためのスチューデントのＴ検定、または、三つまたはそれを超える群を比較するための一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって実施された（ｐ値＜０．０５は、統計学的に有意な差を示す）。動物の生存解析を、グラフパッドプリズム５ソフトウェアを使用してログランク検定を用いて実施した。
ｉｉｉ）実験の利点
ハイブリダイゼーションを媒介する細胞表面抗原架橋及びアポトーシス誘導を含むシステムを本明細書に開示する。細胞事象（アポトーシス）は、正確に標的された治療の設計に適した分子レベルから規定される特定の生体認識（すなわち、塩基対合）によって引き起こされる。本開示の二つのステップ（連続）処置は、事前標的の機会を提供する（Ｇｏｏｄｗｉｎら、２００１；Ｇｕｎら、２０１１；Ｚｈｏｕら、２００９）。これは、予混合処置及び他の単一成分抗ＣＤ２０構築物、例えばリツキシマブポリマー（Ｚｈａｎｇら、２００５）及び多価抗ＣＤ２０Ｆａｂ’官能化ポリマー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００９、２０１２；Ｃｈｕら、２０１２）と比べて有利である。例えば、架橋用量（Ｐ−ＭＯＲＦ２）の投与のタイミングは、事前標的用量（Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１）の生体分布に基づいて、個別の患者において最大の腫瘍対組織の蓄積を達成し、より有効な処置を可能にするために最適化され得る。このアプローチは、また、オフターゲット結合に関する有害反応の可能性を制限し、それゆえ固形腫瘍ならびに播種性疾患の処置に有益である。血液系の癌については、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１の薬物動態及び病気細胞に対するＦａｂ’−ＭＯＲＦ１の結合速度論は、Ｐ−ＭＯＲＦ２投与の最良のタイミングを決定するためにさらに研究され得る。
例えば、連続処置においてＦａｂ’−ＭＯＲＦ１後のＰ−ＭＯＲＦ２コンジュゲートの最適な投与スケジュールを探索するために、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートの薬物動態を調査した。マウスの125Ｉ標識Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１コンジュゲートの血液（放射）活性時間プロファイルを図２９に示し、ここで閉環は平均放射能を表し、血液のグラムあたりの注射された用量のパーセンテージとして表される（ＩＤ／ｇ％）。データを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した（ｎ＝５）。結果は、連続処置において最大の事前標的有効性を達成するためには、Ｐ−ＭＯＲＦ２は、（ほとんどのコンジュゲートが血液から排除されるとき）、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１の静脈注射後５時間以内で投与され得ることを示す。このとき、ハイブリダイゼーションを妨害するだろう最低限の遊離Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１（Ｂ細胞に非結合）がある。このデータは、本提案の組成物及び方法の治療有効性がさらに最適化され得ることを示す。
本明細書に記載の動物実験は、同等用量での、Ｆａｂ’−ＭＯＲＦ１＋Ｐ−ＭＯＲＦ２（１：１）の単一処置は、Ｆａｂ’−ＣＣＥ＋Ｐ−ＣＣＫ（１：２５）の単一処置よりも、リンパ腫播種の予防に有意に有効であったことを示す（連続処置：ＭＯＲＦについて８１日間の生存期間中央値、対、ＣＣについて５０日間の生存期間中央値；予混合処置：ＭＯＲＦについて７８日間の生存期間中央値、対、ＣＣについて５５日間の生存期間中央値）。これらのデータは、コイルドコイル形成ペプチドと比較してＭＯＲＦオリゴのＨＰＭＡポリマー鎖へのより優れた結合及びアクセシビリティを示す。加えて、ＭＯＲＦ１−ＭＯＲＦ２ハイブリダイゼーションについて、速い結合速度論が観察された（ＤＬＳによって特徴付けられたとき、〜１０分；図１１Ｂ）。逆に、ＣＣＥ−ＣＣＫコイルドコイル形成は、より長い時間（〜６０分）を要した（Ｗｕら、２０１０）。ＣＣ対ＭＯＲＦの比較は、本開示の組成物、複合体、及び方法が、薬物を含まない高分子治療の設計について有利であることを示す。
本明細書に開示の組成物、複合体、及び方法は、少なくとも二つの重要な利点を有する：（１）多価による、より優れたＢ細胞の標的化、及び（２）免疫機能に関連する副作用の低減の可能性。ペプチドを使用した以前の設計（すなわち、生体認識部分としてアンチパラレルなコイルドコイルヘテロ二量体を形成するペンタヘプタド（ｐｅｎｔａｈｅｐｔａｄ）ペプチドの対を使用する抗ＣＤ２０の薬物を含まない高分子治療システム（Ｗｕら、２０１０；Ｗｕら、２０１２）と比較するとき、本明細書に開示のＭＯＲＦオリゴはより速い結合速度論を実証し、それゆえより優れたアポトーシス誘導及びｉｎ ｖｉｖｏ抗リンパ腫をもたらす。本開示のＭＯＲＦオリゴの他の利点は、（１）ｉｎ ｖｉｖｏ安定性（すなわち、ヌクレアーゼ耐性）を保証する化学的に修飾された骨格、（２）十分に定義された結合特異性（すなわち、オフターゲット影響の可能性を予防する）、（３）電荷中性の性質（すなわち、強い結合親和性をもたらす）、（４）十分に確立された安全性プロファイル（すなわち、コイルドコイルペプチドの免疫原性の懸念に対処する）、及び（５）良好な水溶性及び好ましい薬物動態。
様々な修正及び変形が本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明においてなされ得ることは当業者に明らかであろう。本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の明細書および実行の考察から当業者には明らかであろう。本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示され、明細書および実施例は単なる例示として考えられることが意図される。本明細書に開示及び特許請求される全ての組成物及び／または方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作成及び実行されることができる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕アポトーシスを誘導する方法であって、
（ｉ）細胞の集団を標的化部分及びモルフォリノを含む第一の複合体と接触させる工程、及び
（ｉｉ）細胞の集団をコポリマー担体及び一つ以上のモルフォリノを含む第二の複合体と接触させる工程を含み、
前記第一の複合体及び前記第二の複合体と前記細胞との前記接触が、前記細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とする、方法。
〔２〕ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）を反復する工程をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕（ｉｉｉ）前記細胞のアポトーシスを確認する工程をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記細胞が、Ｂ細胞である、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記細胞が、対象内にある、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕前記対象が、非ホジキンリンパ腫を有する、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記標的化部分が、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子に特異的である、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子が、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原受容体、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する受容体である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記標的化部分が、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部である、前記〔７〕に記載の方法。
〔１０〕前記標的化部分が、Ｆａｂ’断片である、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記Ｆａｂ’断片が、抗ＣＤ２０受容体抗体に由来する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記抗ＣＤ２０受容体抗体が、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、またはＢＬＸ−３０１である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記第一の複合体のモルフォリノ及び前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、相補的である、前記〔１〕に記載の方法。
〔１４〕前記第一の複合体のモルフォリノが、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり、前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）である、前記〔１〕に記載の方法。
〔１５〕アポトーシスを誘導する方法であって、
細胞の集団を、標的化部分及びモルフォリノを含む第一の複合体と、コポリマー担体及び一つ以上のモルフォリノを含む複合体を含む第二の複合体とを含む組成物と接触させる工程を含み、前記細胞の前記組成物との前記接触が、前記細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とする、方法。
〔１６〕前記組成物と前記細胞の前記接触を反復する工程をさらに含む、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕前記細胞が、Ｂ細胞である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１８〕前記細胞が、対象内にある、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１９〕前記対象が、非ホジキンリンパ腫を有する、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕前記標的化部分が、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子に特異的である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２１〕前記非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子が、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原受容体、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する受容体である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記標的化部分が、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２３〕前記標的化部分が、Ｆａｂ’断片である、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記Ｆａｂ’断片が、抗ＣＤ２０受容体抗体に由来する、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕前記抗ＣＤ２０受容体抗体が、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、またはＢＬＸ−３０１である、前記〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕前記第一の複合体のモルフォリノ及び前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、相補的である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２７〕前記第一の複合体のモルフォリノが、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり、前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）である、前記〔１５〕に記載の方法。
〔２８〕（ｉ）標的化部分及びモルフォリノを含む第一の複合体と、（ｉｉ）コポリマー担体及び一つ以上のモルフォリノを含む第二の複合体とを備えることを特徴とするキット。
〔２９〕（ｉｉｉ）前記（ｉ）の複合体及び前記（ｉｉ）の複合体を投与するための説明書をさらに備える、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３０〕前記第一の複合体及び前記第二の複合体が、同時に処方される、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３１〕前記標的化部分が、非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子に特異的である、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３２〕前記非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子が、細胞上にある、前記〔３１〕に記載のキット。
〔３３〕前記細胞が、Ｂ細胞である、前記〔３２〕に記載のキット。
〔３４〕前記非内在化細胞表面分子または緩徐内在化細胞表面分子が、ＣＤ２０受容体、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｃ型、細胞表面死受容体、前立腺幹細胞抗原受容体、または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する受容体である、前記〔３１〕に記載のキット。
〔３５〕前記標的化部分が、多糖類、ペプチドリガンド、アプタマー、Ｆａｂ’断片、または一本鎖可変部である、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３６〕前記Ｆａｂ’断片が、抗ＣＤ２０受容体抗体に由来する、前記〔３５〕に記載のキット。
〔３７〕前記抗ＣＤ２０受容体抗体が、１Ｆ５、リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ＢＣＤ−０２０、ＩＢＩ−３０１、ウブリツキシマブ、またはＢＬＸ−３０１である、前記〔３６〕に記載のキット。
〔３８〕前記第一の複合体のモルフォリノ及び前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、相補的である、前記〔２８〕に記載のキット。
〔３９〕前記第一の複合体のモルフォリノが、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり、前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）である、前記〔２８〕に記載のキット。
Ｆ．参考文献
Ａｌｌｉｓｏｎ Ｍ．（２０１０） ＰＭＬ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｌｏｏｍ ｆｏｒ Ｒｉｔｕｘａｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１０５− １０６．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ： Ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ ６３：１４２４− １４３３．
Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｒｏｍ ａ “Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｌｉｋｅ” Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ （Ｌｉｎｅ Ｄ．Ｇ．−７５）．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９：２７−３３．
Ｃａｎｇ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｎｏｖｅｌ ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．５：６４．
Ｃａｒｔｒｏｎ Ｇ， ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｆｃｇ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩａ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ ９９：７５４−７５８．
Ｃｈｅｎ Ｘ， ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ− ＭＯＲＦ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９（８）： １５１８−１５２５．
Ｃｈｅｎ ＷＣ， ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃａｎ Ｌｉｇａｎｄｓ ｏｆ ＣＤ２２．Ｂｌｏｏｄ， １１５：４７７８−４７８６．
Ｃｈｅｓｏｎ ＢＤ， ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ− Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９：６１３−６２６．
Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ａ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １１：１０３８−１０４３．
Ｃｈｕ ＴＷ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−Ｆａｂ’ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３（２９）：７１７４−７１８１．
Ｃｈｕ ＴＷ， ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄ Ｎａｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｖｉａ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＡＣＳ Ｎａｎｏ．（１）：７１９−７３０．
Ｄｅａｎｓ ＪＰ， ｅｔ ａｌ．（２００２） ＣＤ２０−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｌｉｐｉｄ Ｒａｆｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １０７：１７６−１８２．
Ｄｏｕｇｌａｓ ＳＭ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ａ Ｌｏｇｉｃ−Ｇａｔｅｄ Ｎａｎｏｒｏｂｏｔ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｙｌｏａｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５：８３１−８３４．
Ｄｕ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｂ’ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ＣＤ２０．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４６：２４１９−２４２３．
Ｅｈｒｉｃｋ ＪＤ， ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ Ｔａｉｌｏｒｓ Ｓｔｉｍｕｌｉ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．４：２９８−３０２．
Ｆｏｗｅｒｓ ＫＤ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ’ ｆｒｏｍ Ｍｕｒｉｎｅ ＩｇＧ２ａ ｆｏｒ Ｔｈｉｏｌ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．９：２８１−２９４．
Ｇｈｅｔｉｅ ＭＡ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｍｏｎｏｍｅｒｓ ｏｆ ｒｉｔｕｘａｎ （ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＣＤ２０） ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ ９７：１３９２−１３９８．
Ｇｈｅｔｉｅ ＭＡ， ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｏｒ Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒ （Ｄａｕｄｉ） ｉｎ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：４８１−４８５．
Ｇｈｅｔｉｅ ＭＡ， ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｔｈｅ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ２２ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｉｎ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｄａｕｄｉ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｉｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ Ｅｉｔｈｅｒ ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ １９ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｒ ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ １９ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｂｌｏｏｄ ８０：２３１５−２３２０．
Ｇｏｏｄｗｉｎ ＤＡ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．１９：４３５−４５０．
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＧＬ， ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｃｕｒｅ ｏｆ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ａｎ Ａｎｔｉ−ＣＤ７４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：６５６７−６５７１．
Ｇｕ Ｚ， ｅｔ ａｌ．（２００５） Ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｇ８ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ ａ Ｆｃ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：９４９５−９５００．
Ｇｕｎｇｏｒｍｕｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｂｉ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１：７２６６−７２７４．
Ｇｕｎｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ａ Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．７：７４２−７４８．
Ｈｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ： ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｐｒｏｏｆ ｏｆ ａ ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｊ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４５（６）： １０８７− １０９５．
Ｈｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｔｏ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：９８３−９８８．
Ｈｅｒｔｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＤ２０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＧＡ１０１ （Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ） Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１２：２０３１−２０４２．
Ｈｏｌｍｅｓ ＴＣ， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｙｎａｐｓｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：６７２８−６７３３．
Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇａｌｅｃｔｉｎ−１−ｎａｎｏｇｏｌｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ．Ｅｕｒ．Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｊ．２３：１７０−１８１．
Ｉｎｏｕｅ Ｓ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｐｏｌｙｍａｌｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｂｏｔｈ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７１（４）：１４５４−１４６４．
Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＮ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−Ｆａｂ’ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １３：７２７−７３５．
Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＮ， ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−Ｆａｂ’ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ２０．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０：１２９−１３７．
Ｊｏｈｎｓｏｎ ＷＣ．（２０００） ＣＤ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｉｎ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｂｅｒｏｖａ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．； Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｅｄ．２：７０３−７１８．
Ｋａｈｎ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．（１９７８） Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ Ｔｈａｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｒ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｓ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：４２０９−４２１３．
Ｋａｍｅｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｓｅｖｅｒｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２５：１１９３．
Ｋｉｍｂｙ Ｅ．（２００５） Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ （ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３１：４５６−４７３．
Ｋｏｐｅｃｅｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１０） ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ： ｏｒｉｇｉｎｓ， ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ， ｐｒｅｓｅｎｔ， ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６２：１２２−１４９．
Ｋｏｐｅｃｅｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｓｍａｒｔ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．５１（３０）：７３９６−４１７．
Ｋｏｐｅｃｅｋ Ｊ．（２０１３） Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： Ｏｒｉｇｉｎｓ， ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏ ｄａｔｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５：４９−５９．
Ｋｏｐｅｃｅｋ， Ｊ， ｅｔ ａｌ．（１９７３） Ｐｏｌｙ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］ −１．Ｒａｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．９：７−１４．
Ｌａｎｄｓ ＬＣ．（２０１０） Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｃｏｎｃｅｒｎｓ：Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２５：１００１−１００３．
Ｌｉｕ Ｇ， ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｔｕｍｏｒｅｄ Ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ Ｏｌｉｇｏｍｅｒ Ｓｈｏｗｉｎｇ Ｌｏｗ Ｋｉｄｎｅｙ Ｕｐｔａｋｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ３１：４１７−４２４．
Ｌｉｕ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００６） Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ “Ｄｉｐｓｔｉｃｋ” Ｔｅｓｔ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｔａｍｅｒ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５：７９５５− ７９５９．
Ｌｕ ＺＲ，ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ Ｆａｂ’ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１１０１−１１０４．
Ｌｕｏ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ Ｐｏｌｙ［Ｎ−（２− ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］ ｖｉａ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ−Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｈａｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ； ４４（８）：２４８１−２４８８．
Ｍａｎｇ’ｅｒａ ＫＯ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｉｎｉｔｉａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｆ 99mＴｃ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ ｆｏｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１６８２−１６８９．
Ｍｏｌｉｎａ Ａ．（２００８） Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ： ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｎｏｎ− Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５９：２３７−２５０．
Ｍｏｌｉｎａ Ａ．（２００８） Ａ Ｄｅｃａｄｅ ｏｆ Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ： Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５９：２３７−２５０．
Ｍｕｌｖｅｙ ＪＪ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｕｍｏｕｒｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７６３−７７１．
Ｎｇｕｙｅｎ ＪＴ， ｅｔ ａｌ．（２００１） ＣＤ４５ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ： Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｅ ２ Ｏ−Ｇｌｙｃａｎｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５６９７−５７０７．
Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ．（１９９５） ＤＮＡ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ Ｂａｃｋｂｏｎｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：１６７−１８３．
Ｏｋｒｏｊ Ｍ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＣＤ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３９：６３２−６３９．
Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ Ｖ， ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ ＨＰＭＡ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆａｔｅ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：２５−３７．
Ｐａｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ Ｎ−（２− ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｖｉａ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｉｏｌ−ｅｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１２（１）：２４７− ５２．
Ｐａｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ， Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＨＰＭＡ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２）： １５５−６０．
Ｐｏｐｏｖ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ： ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｌｏｎｄ．） ６：１５７５−１５９１．
Ｐｒｅｓｓ ＯＷ， ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １Ｆ５ （Ａｎｔｉ−ＣＤ２０） Ｓｅｒｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｂｌｏｏｄ ６９：５８４−５９１．
Ｓｈａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．（１９９８） Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２０ ｗｉｔｈ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ ９１：１６４４−１６５２．
Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＣＤ７ ａｎｄ ＣＤ２８ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５７７−５８２．
Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０１３．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．６３：１１−３０．
Ｓｍｉｔｈ ＭＲ．（２００３） Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ （ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ）： ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：７３５９−７３６８．
Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ Ｐ， ｅｔ ａｌ．（１９８０） ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１６７８−１６８５．
Ｓｔｅｎｚｅｌ ＭＨ．（２０１３） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｉｏｌｓ： Ｏｌｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｔｏ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｎａｔｕｒｅ’ｓ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ．ＡＣＳ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２（１）： １４−１８．
Ｓｕｂｒ Ｖ， ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｎ−（２− Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−２−ｔｈｉｏｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅａｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．６６：１５２５−１５３８．
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ＪＥ， ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ： ｄｅｓｉｇｎ， ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７−１９５．
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ＪＥ．（２００７） Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ， ｓｉＲＮＡ， ａｎｄ Ｓ−ＤＮＡ ｃｏｍｐａｒｅｄ： ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．７（７）：６５１−６０．
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ＪＥ．（２００６） Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ ａｎｄ ＰＮＡｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ， Ｐａｒｔ １：８９− １１３．
Ｕｌｂｒｉｃｈ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ＨＰＭＡ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ａｓ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６２：１５０−１６６．
Ｖａｌｌａｔ ＬＤ， ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｔｅｍｐｏｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｂ−Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ： Ａｌｔｅｒｅｄ Ｂａｌａｎｃｅ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ ａｎｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｂ Ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １０９：３９８９−３９９７．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｌｋ ＬＥ， ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｌａｙｓ ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：８０７−８１１．
Ｗｕ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ−ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５７：１２６−１３１．
Ｗｕ Ｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｄｒｕｇ−ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４９：１４５１−１４５５．
Ｙａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍ Ｎ−（２− ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｒａｆｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．７（４）： １１８７−１１９５．
Ｙａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２０１１） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｃｌｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＲＡＦＴ−Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＨｅｔｅｒｏｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃＰｏｌｙＨＰＭＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｒｅａｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｐｏｌｙｍ．７１（３）：２９４−３０２．
Ｙａｚｉｃｉ Ｙ．（２０１１） Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ： Ｗｈｅｎ ｓｈｏｕｌｄ ｗｅ ｕｓｅ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｔｏ ｔｒｅａｔ ＲＡ？ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．７：３７９−３８０．
Ｙｕａｎ Ｗ， ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｓｍａｒｔ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｋｉｎａｓｅ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｍｏｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０：１５７６０− １５７６１．
Ｚｈａｎｇ Ｎ， ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍａｙ ｃａｕｓｅ ｈｙｐｅｒ−ｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：５９７１−５９８０．
Ｚｈａｎｇ Ｒ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ ＨＰＭＡ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．１６６（ｌ）：６６−７４．
Ｚｈｏｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ-ｃａｎｃｅｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．２１（１）： １−２６．
Ｚｈｏｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３８６：５２１−５２５．

Claims (5)

  1. ＣＤ２０陽性ヒト細胞においてアポトーシスを誘導するための、コポリマー担体及び一つ以上のモルフォリノを含む第二の複合体と組み合わせて使用される組成物であって、
    標的化部分及びモルフォリノを含む第一の複合体を含み、
    前記標的化部分が、抗ＣＤ２０抗体又は抗ＣＤ２０Ｆａｂ’断片であり、
    前記第一の複合体が、ＣＤ２０陽性細胞を含むヒト細胞の集団に接触するものであり、前記第二の複合体が、前記ヒト細胞の集団に接触するものであり、
    前記第一の複合体のモルフォリノが、５’ＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＡ３’（配列番号２５）であり、前記第二の複合体の一つ以上のモルフォリノが、５’ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＣ３’（配列番号２６）であり、
    前記第一の複合体及び前記第二の複合体と前記ヒト細胞との前記接触が、前記ＣＤ２０陽性ヒト細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とする、組成物。
  2. 前記第一の複合体及び前記第二の複合体と前記ヒト細胞との前記接触が、さらに反復されるものである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ヒト細胞が、Ｂ細胞である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ヒト細胞が、非ホジキンリンパ腫を有する対象内にある、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記第一の複合体及び前記第二の複合体が、単一の組成物に製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
JP2019002767A 2013-03-12 2019-01-10 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法 Active JP6814824B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361776999P 2013-03-12 2013-03-12
US61/776,999 2013-03-12

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016501342A Division JP6524059B2 (ja) 2013-03-12 2014-03-11 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020211211A Division JP7177131B2 (ja) 2013-03-12 2020-12-21 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019089779A JP2019089779A (ja) 2019-06-13
JP6814824B2 true JP6814824B2 (ja) 2021-01-20

Family

ID=51659008

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016501342A Active JP6524059B2 (ja) 2013-03-12 2014-03-11 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法
JP2019002767A Active JP6814824B2 (ja) 2013-03-12 2019-01-10 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法
JP2020211211A Active JP7177131B2 (ja) 2013-03-12 2020-12-21 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016501342A Active JP6524059B2 (ja) 2013-03-12 2014-03-11 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020211211A Active JP7177131B2 (ja) 2013-03-12 2020-12-21 アポトーシスを誘導するための組成物及び方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US10251906B2 (ja)
EP (2) EP2968504B1 (ja)
JP (3) JP6524059B2 (ja)
KR (1) KR102384693B1 (ja)
CN (1) CN105163755A (ja)
AU (2) AU2014248886B2 (ja)
CA (1) CA2904970C (ja)
ES (1) ES2784182T3 (ja)
WO (1) WO2014164913A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2904970C (en) 2013-03-12 2022-07-05 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for inducing apoptosis
WO2017190020A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 The Scripps Research Institute Oligonucleotide conjugates and uses thereof
US10925973B2 (en) 2016-06-15 2021-02-23 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for using albumin-based nanomedicines
EP3525808A4 (en) 2016-10-14 2020-06-24 University of Utah Research Foundation ANTIBODY-POLYMER-DRUG CONJUGATES

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CS173846B1 (ja) 1974-04-23 1977-03-31
GB8500209D0 (en) 1985-01-04 1985-02-13 Ceskoslovenska Akademie Ved Synthetic polymeric drugs
US5521063A (en) 1985-03-15 1996-05-28 Antivirals Inc. Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use
EP0216860B1 (en) 1985-03-15 1992-10-28 SUMMERTON, James Stereoregular polynucleotide-binding polymers
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5217866A (en) 1985-03-15 1993-06-08 Anti-Gene Development Group Polynucleotide assay reagent and method
US6001988A (en) 1990-06-11 1999-12-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
US5795721A (en) 1990-06-11 1998-08-18 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of ICP4
US6030776A (en) 1990-06-11 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5503978A (en) 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5846713A (en) 1990-06-11 1998-12-08 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors
US5780228A (en) 1990-06-11 1998-07-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5869641A (en) 1990-06-11 1999-02-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of CD4
US5731424A (en) 1990-06-11 1998-03-24 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity TGFβ nucleic acid ligands and inhibitors
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US6028186A (en) 1991-06-10 2000-02-22 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of cytokines
US5631146A (en) 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
WO1996041010A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit dna polymerases
US5792613A (en) 1996-06-12 1998-08-11 The Curators Of The University Of Missouri Method for obtaining RNA aptamers based on shape selection
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
DE60213771T2 (de) * 2001-03-30 2007-08-16 The University of Massachusetts, Worcester Morpholinobildgebung und therapie
US7534427B2 (en) * 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
RS55723B1 (sr) * 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
EP2031073A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-04 TC LAND Expression Diagnostic of immune graft tolerance using TMTC3 gene expression levels
US9388491B2 (en) 2012-07-23 2016-07-12 Novellus Systems, Inc. Method for deposition of conformal films with catalysis assisted low temperature CVD
WO2014087119A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Artemis Intelligent Power Limited Vehicle
CA2904970C (en) 2013-03-12 2022-07-05 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for inducing apoptosis
JP2019002767A (ja) 2017-06-14 2019-01-10 株式会社フェローテックホールディングス 電流センサ

Also Published As

Publication number Publication date
CA2904970A1 (en) 2014-10-09
AU2014248886B2 (en) 2019-06-27
AU2014248886A1 (en) 2015-10-29
US20160015732A1 (en) 2016-01-21
JP6524059B2 (ja) 2019-06-05
KR102384693B1 (ko) 2022-04-07
JP7177131B2 (ja) 2022-11-22
ES2784182T3 (es) 2020-09-22
AU2019236709B2 (en) 2021-10-28
CN105163755A (zh) 2015-12-16
CA2904970C (en) 2022-07-05
KR20150138233A (ko) 2015-12-09
JP2021073179A (ja) 2021-05-13
EP2968504A4 (en) 2017-01-18
EP3760222A1 (en) 2021-01-06
US20190167709A1 (en) 2019-06-06
EP2968504A1 (en) 2016-01-20
JP2019089779A (ja) 2019-06-13
AU2019236709A1 (en) 2019-10-17
EP2968504B1 (en) 2019-12-18
JP2016518323A (ja) 2016-06-23
WO2014164913A1 (en) 2014-10-09
US10251906B2 (en) 2019-04-09
US11213540B2 (en) 2022-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chu et al. Cell surface self-assembly of hybrid nanoconjugates via oligonucleotide hybridization induces apoptosis
JP7177131B2 (ja) アポトーシスを誘導するための組成物及び方法
Wu et al. Coiled-coil based drug-free macromolecular therapeutics: in vivo efficacy
Chu et al. Anti-CD20 multivalent HPMA copolymer-Fab′ conjugates for the direct induction of apoptosis
TW202039573A (zh) 抗轉鐵蛋白受體抗體及其用途
JP7069135B2 (ja) アルブミンベースのナノ医薬品を使用するための組成物及び方法
EP3315139B1 (en) A delivery system for targeted delivery of a therapeutically active payload
EP1708752B1 (en) Polymer-bound antibody cancer therapeutic agent
Zhang et al. Multimodality imaging of coiled‐coil mediated self‐assembly in a “drug‐free” therapeutic system
JP2019535232A (ja) 抗ｐｓｍａ抗体、その使用及びそのコンジュゲート
LU92353A1 (en) Antibody-mediated delivery of RNAI
US20230065416A1 (en) Clathrin-chimetic antibody receptor constructs for immune cell activation therapy in vivo
Chu Drug-free macromolecular therapeutics for treatment of B-cell malignancies
TW202506190A (zh) 利用抗ｍｕｃ１抗體－藥物結合物投予的藥劑低敏感性癌之治療方法
WO2024182454A1 (en) Bone-directed therapeutics for the treatment of cancer
JP2018052930A (ja) 新規アルキル化剤

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190207

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190207

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20191209

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200309

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200508

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20201022

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20201124

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20201221

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6814824

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250