JP6805385B1 - 表皮内の保湿関連物質の発現増強剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を利用することによって、表皮内の保湿関連物質の発現を増強する。【解決手段】ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤である。前記保湿関連物質が、フィラグリン、プロフィラグリン、及び／又は、カスパーゼ１４である。前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。【選択図】図２ｂ
Description
本発明は、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤及び発現増強方法に関する。
リン脂質と界面活性剤とからなる閉鎖小胞体（ベシクル）が知られており、リポソームとも称される。特許文献１には、リン脂質に替えて、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（以下「ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物」と称する場合がある）を主体とする脂質を用い、水又は界面活性剤と混合することによって、自発的にベシクルを形成させる調製方法が開示されている。このようなベシクルは、それらの内部や表面にタンパク質や抗体などの目的物質を封入又は結合させて生体内の細胞に送達するドラッグデリバリーシステムに利用されている。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を脂質とするベシクルは、その表面が親水性のＰＥＧ鎖で覆われた形態を有しており、生体内への浸透性と血中での安定性が良好である。特許文献２には、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物からなるベシクルの表面に荷電要素を結合させて正帯電させることにより、表皮の角層への浸透性と貯留性を向上させることが記載されている。
ドラッグデリバリーシステムにおけるベシクルは、単に目的物質のキャリアとして認識されている。ベシクルは、最終的に生体内で個々の分子に分解するが、ベシクルを構成する分子自体の生体内での作用は、ほとんど知られていない。特許文献３及び特許文献４は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の生体内での幾つかの作用を開示している。それらによれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、体内でホスホリパーゼＡに結合してこれを阻害することによって抗炎症作用を発揮するとされている。しかしながら、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の生体内での作用は、未だ不明な点が多い。
本発明の目的は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物に関して新たに見出された特性を利用することであり、特に、表皮内の保湿関連物質の発現を増強することである。
上記の目的を達成するために本発明は、以下の構成を提供する。
本発明の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１〜２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１〜４６の範囲内である、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤である。
本発明の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１〜２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１〜４６の範囲内である、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤である。
本発明の別の態様は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用い、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１〜２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１〜４６の範囲内である、表皮内の保湿関連物質の発現増強方法である。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態又はベシクル状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記保湿関連物質が、フィラグリン、プロフィラグリン、又はカスパーゼ１４である。
好ましくは、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態又はベシクル状態で表皮内に浸透される。
好ましくは、前記保湿関連物質が、フィラグリン、プロフィラグリン、又はカスパーゼ１４である。
本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤が実現される。また、本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた、表皮内の保湿関連物質の発現増強方法が実現される。
以下、図面を参照しつつ、本発明の実施の形態を説明する。
本発明は、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物）において新たに見出された特性を利用して創作されたものである。ここで新たに見出された特性は、ヒトの表皮内の保湿関連物質の発現を増強する作用である。
本発明は、ジアシルグリセロールポリエチレングリコール付加物（ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物）において新たに見出された特性を利用して創作されたものである。ここで新たに見出された特性は、ヒトの表皮内の保湿関連物質の発現を増強する作用である。
本発明に関する脂質分子であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の構造式を概略的に示す。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、３つの炭素を有するグリセロール骨格部（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）と、骨格部の３つの炭素のうち末端の１つの炭素に結合した直鎖型ポリエチレングリコールであるＰＥＧ鎖と、３つの炭素のうち他の２つの炭素にそれぞれ結合した同種の長鎖脂肪酸（ＣＯＯＲ）とから構成されている。ＰＥＧ鎖の部分が親水性であり、長鎖脂肪酸の部分が疎水性である。
以下の説明において特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を表すとき、長鎖脂肪酸の種類と、ＰＥＧ鎖のｎの数に基づいて、"［ジ］＋［長鎖脂肪酸名］＋［グリセロール］＋［ＰＥＧ−ｎ］"と称する。例えば、長鎖脂肪酸がミリスチン酸、ＰＥＧ鎖のｎが１２の場合は、"ジミリスチン酸ＰＥＧ−１２"である。また、特定のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をさらに略称で示す場合もある。
長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数は、１１〜２３の範囲内とすることができる。この範囲に含まれる長鎖脂肪酸は、例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、又はオレイン酸などである。ＰＥＧ鎖のｎの数は、１１〜４６の範囲内とすることができる。本発明に関係するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物として、以下のものを例示することができる。括弧内に、融点と略称を示す。
・ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ−１２（２５．０℃：ＧＤＭ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−１２（４０．０℃：ＧＤＳ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−２３（３９．８℃：ＧＤＳ２３）
・ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ−２３（３１．２℃：ＧＤＰ２３）
・ジオレイン酸グリセロールＰＥＧ−１２ （２５．０℃：ＧＤＯ１２）
・ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ−１２（２５．０℃：ＧＤＭ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−１２（４０．０℃：ＧＤＳ１２）
・ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−２３（３９．８℃：ＧＤＳ２３）
・ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ−２３（３１．２℃：ＧＤＰ２３）
・ジオレイン酸グリセロールＰＥＧ−１２ （２５．０℃：ＧＤＯ１２）
ヒトの表皮の皮膚バリア機能において、角層下部にあるフィラグリンは重要な役割を有するタンパクである。フィラグリンは、先ず、角層の下の顆粒層でプロフィラグリンとして産生される。プロフィラグリンは、複数の酵素により分解されフィラグリンとなる。フィラグリンは、さらにカスパーゼ１４などの別の複数の酵素により分解され、角層上部にある天然保湿因子（ＮＭＦ）となる。ＮＭＦは、角層において水分を保持し、ｐＨを維持するバッファー作用を有する。それによって、表皮細胞の正常な分化を促進し、病原性細菌の増殖を低減する。アトピー性皮膚炎の患者ではフィラグリンの発現が減少していると言われている。
本明細書では、表皮内における保湿に関連する物質であるプロフィラグリン、フィラグリン、及びＮＭＦ、並びにこれらに関係する酵素を総称して「保湿関連物質」とする。
発明者らは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮に適用することによって、表皮内の保湿関連物質であるフィラグリン、プロフィラグリン、及びカスパーゼ１４の発現が増強されることを見出した。これらの保湿関連物質の発現が増強されることは、これらによって最終的に産生されるＮＭＦも増強されることを示している。これは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のヒト表皮内における新たな作用であり、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の新たな特性である。この特性は、表皮に対して保湿効果をもたらすことができる。これは、単に表皮表面を乾燥から保護する保湿効果ではなく、表皮内の角層及びその下の顆粒層における作用によって得られる保湿効果である。
本発明は、このジアシルグリセロールＰＥＧ付加物において新たに見出された特性を利用して、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤を提供する。また、本発明は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた、表皮内の保湿関連物質の発現増強方法を提供する。
本発明では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮に適用する場合、一種のみで用いてもよく、又は複数種を組み合わせて用いてもよい。
本発明によれば、表皮内に到達したジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、それが無い場合に比べて表皮内の保湿関連物質の産生量を増加させることができる。その結果、表皮内のみでなく表皮表面の保湿状態も良好となる。したがって、本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分とする、表皮の保湿剤を提供することができ、特に、化粧品や医薬品として提供することができる。さらに、本発明によれば、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として用いた表皮の保湿方法を提供することができ、特に、アトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患の治療剤又は治療方法としても有効であると期待される。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含む化粧品や医薬品は、例えば、水溶液、乳液、ゲル、クリーム等の多様な形態で提供することができる。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をヒトの表皮内に到達させる１つの方法では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を水又は所定の溶媒に溶解させた溶液状態で表皮内に到達させることができる。例えば、リン酸緩衝食塩水PBS(-)を溶媒とする所定の濃度のジアシルグリセロールＰＥＧ付加物溶液を調製し、皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。塗布された溶液は、最上層の角層内に浸透し、さらに角層の下の顆粒層へと浸透する。そして、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、浸透した表皮内の各層において当該層に元々存在する保湿関連物質の発現を増強する。
ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を表皮内に到達させる別の方法では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物をベシクル状態で表皮内に到達させることができる。そのようなベシクルは、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の二重層、又は、二重層が複数重なった多重層からなる閉じた球殻として形成されており、親水性のＰＥＧ鎖が最外層の表面に配置されている。ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のベシクルを調製し、それを皮膚表面に塗布することで表皮内に浸透させることができる。表皮内に到達した後にベシクルが分解し、個々の分子に分離することで、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体の作用を発揮することができる。
従来のドラッグデリバリーシステムでは、ベシクルの材料であるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、目的物質の単なるキャリアと考えられてきたが、本発明では、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体を有効成分として利用する。したがって、本発明では、通常のドラッグデリバリーシステムにおいてベシクルに組み込まれる目的物質は、基本的に不要である。本発明では、水とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物のみを混合して形成したベシクルを表皮内に浸透させることによって、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物自体が、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤として機能することができる。
幾つかのジアシルグリセロールＰＥＧ付加物は、所定の温度で水と混合することにより、自発的にベシクルを形成する（特許文献１、２参照）。例えば、２質量％のＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２を９８質量％の脱イオン水に室温で混合し撹拌することにより、ＧＤＭ１２又はＧＤＯ１２のベシクルの懸濁液が得られる。別の例として、２質量％のＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３を４５〜５５℃で溶解させてから、４５〜５５℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＳ１２又はＧＤＳ２３のベシクルの懸濁液が得られる。さらに別の例として、２質量％のＧＤＰ２３を３７℃で溶解させてから、３７℃の９８質量％の脱イオン水に混合し撹拌することにより、ＧＤＰ２３のベシクルの懸濁液が得られる。室温よりも高い温度で得られた懸濁液を室温に冷却しても、ベシクルは安定している。
別の例として、水に替えて、種々の物質の水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を混合撹拌することによって形成したベシクルを用いる場合も、本発明の範囲に含まれる。その場合、水溶液に含まれる物質には、別の機能をもたせることもできる。
さらに別の例として、水又は水溶液とジアシルグリセロールＰＥＧ付加物とを混合撹拌することによって形成したベシクルの表面を、例えばカチオン性界面活性剤などの荷電要素で修飾して用いる場合も、本発明の範囲に含まれる。特許文献２には、正帯電したベシクルが、特に表皮への浸透性と貯留性に優れていることが記載されている。
以下、表皮に対するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の適用と、表皮内の保湿関連物質との関係を試験データにより示す。
（１）フィラグリンの産生促進に関する試験１
ヒト表皮モデルを用いて試料を作製した後、抗フィラグリン抗体を用いた免疫染色法と、ヘマトキシリン−エオジン（Hematoxylin Eosin）染色法の２つの染色法を適用することによって、フィラグリンの産生を観察した。
ヒト表皮モデルを用いて試料を作製した後、抗フィラグリン抗体を用いた免疫染色法と、ヘマトキシリン−エオジン（Hematoxylin Eosin）染色法の２つの染色法を適用することによって、フィラグリンの産生を観察した。
（１−１）試験方法
・表皮モデルの処理
以下のように、ヒト三次元培養表皮モデル（以下「表皮モデル」と称する）（LabCyte EPI-MODEL24 6D：（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）の処理を行い、試料を調製した。
先ず、表皮モデルを寒天培地中で室温にて２４時間インキュベートした。その後、表皮モデルを培地（アッセイ培地：（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）にて３７℃で４８時間培養した。
続いて、培地交換を行い、表皮モデルの角層表面に、以下の試料１〜４をそれぞれ３０μＬ塗布して、１８時間培養を継続した。試料１のコントローはPBS(-)のみを含む。試料２〜４は、リン酸緩衝食塩水PBS(-)を溶媒とする濃度の異なるＧＤＭ１２の溶液である。
試料１：ＧＤＭ１２のコントロール（N.C.）
試料２：ＧＤＭ１２の１％溶液
試料３：ＧＤＭ１２の２％溶液
試料４：ＧＤＭ１２の３．５％溶液
・表皮モデルの処理
以下のように、ヒト三次元培養表皮モデル（以下「表皮モデル」と称する）（LabCyte EPI-MODEL24 6D：（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）の処理を行い、試料を調製した。
先ず、表皮モデルを寒天培地中で室温にて２４時間インキュベートした。その後、表皮モデルを培地（アッセイ培地：（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製）にて３７℃で４８時間培養した。
続いて、培地交換を行い、表皮モデルの角層表面に、以下の試料１〜４をそれぞれ３０μＬ塗布して、１８時間培養を継続した。試料１のコントローはPBS(-)のみを含む。試料２〜４は、リン酸緩衝食塩水PBS(-)を溶媒とする濃度の異なるＧＤＭ１２の溶液である。
試料１：ＧＤＭ１２のコントロール（N.C.）
試料２：ＧＤＭ１２の１％溶液
試料３：ＧＤＭ１２の２％溶液
試料４：ＧＤＭ１２の３．５％溶液
その後、表皮モデルの角層表面の試料を滅菌済み綿棒で吸い上げることで余分な試料を取り除いた後、角層表面には新たに試料を塗布せずに表皮モデルの培養を継続し、各試料を適用してから６日後に表皮モデルを回収した。
・表皮モデルの凍結切片の作製とフィラグリン免疫染色法
回収した表皮モデルを凍結組織包埋剤（O.C.T.コンパウンド：サクラファインテックジャパン（株）製）に包埋し、凍結切片を作製した。その後、冷アセトン中で固定後、ウシ血清アルブミンBSAを１％含有するPBS(-)に浸漬し、室温にて１時間ブロッキングした。
その後、その切片に対して抗フィラグリン抗体（Genetex社製）を３７℃にて一晩反応させ、さらに、抗マウスIgG Alexa Fluor(登録商標) 488抗体（Cellsignaling technologyies社製）を３７℃にて２時間反応させた。さらに、Hoechst(登録商標) 33342（Invitrogen社製）を室温にて５分間反応させることにより、核染色を行った。そして、蛍光顕微鏡を用いて緑色及び青色の蛍光を観察した。緑色の蛍光はフィラグリンの存在を示す。青色の蛍光は、表皮モデルの細胞に異常がないことを確認するためのものである。
回収した表皮モデルを凍結組織包埋剤（O.C.T.コンパウンド：サクラファインテックジャパン（株）製）に包埋し、凍結切片を作製した。その後、冷アセトン中で固定後、ウシ血清アルブミンBSAを１％含有するPBS(-)に浸漬し、室温にて１時間ブロッキングした。
その後、その切片に対して抗フィラグリン抗体（Genetex社製）を３７℃にて一晩反応させ、さらに、抗マウスIgG Alexa Fluor(登録商標) 488抗体（Cellsignaling technologyies社製）を３７℃にて２時間反応させた。さらに、Hoechst(登録商標) 33342（Invitrogen社製）を室温にて５分間反応させることにより、核染色を行った。そして、蛍光顕微鏡を用いて緑色及び青色の蛍光を観察した。緑色の蛍光はフィラグリンの存在を示す。青色の蛍光は、表皮モデルの細胞に異常がないことを確認するためのものである。
・表皮モデルの凍結切片の作製とヘマトキシリン−エオジン染色法
回収した表皮モデルを凍結組織包埋剤（O.C.T.コンパウンド：サクラファインテックジャパン（株）製）に包埋し、凍結切片を作製した。その後、その切片をPBS(-)で水和した後、ヘマトキシリン液に浸漬して、染色し、流水で洗浄した後、エオジン液に浸漬した。さらに、その切片を７０％エタノールにて洗浄し、９５％エタノールにて脱水した後、封入した。その後、観察を行った。ヘマトキシリン−エオジン染色法は、表皮モデルの細胞に異常がないことを確認するために行った。
回収した表皮モデルを凍結組織包埋剤（O.C.T.コンパウンド：サクラファインテックジャパン（株）製）に包埋し、凍結切片を作製した。その後、その切片をPBS(-)で水和した後、ヘマトキシリン液に浸漬して、染色し、流水で洗浄した後、エオジン液に浸漬した。さらに、その切片を７０％エタノールにて洗浄し、９５％エタノールにて脱水した後、封入した。その後、観察を行った。ヘマトキシリン−エオジン染色法は、表皮モデルの細胞に異常がないことを確認するために行った。
（１−２）試験結果
図１に、４試料についてのフィラグリン免疫染色法（上段）及びヘマトキシリン−エオジン染色法（下段）の試験結果をそれぞれ示す。
図１に、４試料についてのフィラグリン免疫染色法（上段）及びヘマトキシリン−エオジン染色法（下段）の試験結果をそれぞれ示す。
上段の蛍光顕微鏡画像における緑色の蛍光（上部の白色部分）は、ＧＤＭ１２溶液を塗布された表皮モデルの角層におけるフィラグリンの産生量がN.C.の表皮モデルのそれに比べて多いことを示している。また、ＧＤＭ１２溶液の濃度が高くなるほどフィラグリンの産生量が多くなっている。これにより、ＧＤＭ１２による表皮内のフィラグリンの発現増強作用が確認された。
上段の蛍光顕微鏡画像における最下層における青色の蛍光（中央部の白色部分）、及び、下段のヘマトキシリン−エオジン染色法の画像は、表皮モデルの細胞に異常がないことを示している。
（２）フィラグリンの産生促進に関する試験２
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、ドット−ブロッティング法を用いてフィラグリンの産生を観察すると共に、フィラグリンの定量を行った。
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、ドット−ブロッティング法を用いてフィラグリンの産生を観察すると共に、フィラグリンの定量を行った。
（２−１）試験方法
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を１．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養後、培地交換を行い、以下の試料５〜１０の培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料５、８のコントロールは、培地のみである。試料６、７、９、１０は、培地に添加するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料５ ：コントロール（N.C.）
試料６ ：ＧＤＭ１２（０．０００５％）
試料７ ：ＧＤＭ１２（０．００１０％）
試料８ ：コントロール（N.C.）
試料９ ：ＧＤＳ２３（０．００２５％）
試料１０：ＧＤＳ２３（０．００５０％）
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を１．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４時間培養後、培地交換を行い、以下の試料５〜１０の培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料５、８のコントロールは、培地のみである。試料６、７、９、１０は、培地に添加するジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料５ ：コントロール（N.C.）
試料６ ：ＧＤＭ１２（０．０００５％）
試料７ ：ＧＤＭ１２（０．００１０％）
試料８ ：コントロール（N.C.）
試料９ ：ＧＤＳ２３（０．００２５％）
試料１０：ＧＤＳ２３（０．００５０％）
その後、表皮細胞を３７℃、５％二酸化炭素下で７２時間それぞれ培養した。続いて、表皮細胞をPBS (-) にて洗浄した後、０．５％Triton X-100 (２mM PMSF含有)を加え、超音波処理を行って細胞を破砕した。
・ドット−ブロッティング法
細胞破砕液をニトロセルロース膜に一定量ブロッティングし、一晩乾燥させた。乾燥後の転写膜を１％BSAのPBS溶液に浸漬し、室温にて１時間ブロッキングを行った。その後、PBS (-)にて洗浄し、抗ヒトフィラグリン抗体 (Anti-Filaggrin：ARGENE社製)を１：４０００の希釈濃度で転写膜上に添加した。室温で１時間反応させた後、PBS溶液にて洗浄した。
細胞破砕液をニトロセルロース膜に一定量ブロッティングし、一晩乾燥させた。乾燥後の転写膜を１％BSAのPBS溶液に浸漬し、室温にて１時間ブロッキングを行った。その後、PBS (-)にて洗浄し、抗ヒトフィラグリン抗体 (Anti-Filaggrin：ARGENE社製)を１：４０００の希釈濃度で転写膜上に添加した。室温で１時間反応させた後、PBS溶液にて洗浄した。
その後、免疫組織化学染色試薬（ヒストファインシンプルステインMAX-PO(M)：(株)ニチレイバイオサイエンス製)を１：１００の希釈濃度で転写膜上に添加し、室温で１時間反応させた。PBS(-)にて洗浄後、化学発光ウェスタンブロッティング基質（Lumi-Light Western Blotting Substrate：Roche社製)を転写膜上に添加し、１分後に撮影装置（ライトキャプチャー：ATTO(株)製)を用いて化学発光パターンのスポット画像を撮影した。
・フィラグリンの定量方法
ドット−ブロッティング法で得られたスポット画像の各スポットの輝度を 解析装置（CS Analyzer Version 2.0：ATTO(株)製)を用いて定量した。
ドット−ブロッティング法で得られたスポット画像の各スポットの輝度を 解析装置（CS Analyzer Version 2.0：ATTO(株)製)を用いて定量した。
（２−２）試験結果
図２ａは、ＧＤＭ１２に関する試料５、６、７の各スポット画像を示し、図２ｂは、図２ａに基づいて定量された各試料のフィラグリンの産生量を示す。グラフの縦軸は、コントロールN.C.を１００％とした相対量を表す（以下の各図に示すグラフにおいても同じ）。
図２ａは、ＧＤＭ１２に関する試料５、６、７の各スポット画像を示し、図２ｂは、図２ａに基づいて定量された各試料のフィラグリンの産生量を示す。グラフの縦軸は、コントロールN.C.を１００％とした相対量を表す（以下の各図に示すグラフにおいても同じ）。
図２ａによれば、ＧＤＭ１２を適用された表皮細胞におけるフィラグリンの産生量がN.C.の表皮細胞におけるものに比べて多いことを示している。図２ｂの定量されたグラフでは、試料５（N.C.）に比べて試料６、７では２００％又はそれ以上のフィラグリンの産生が確認された。これにより、ＧＤＭ１２による表皮細胞におけるフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図３ａは、ＧＤＳ２３に関する試料８、９、１０の各スポット画像を示し、図３ｂは、図３ａに基づいて定量された各試料のフィラグリンの産生量を示す。
図３ａによれば、ＧＤＳ２３を適用された表皮細胞におけるフィラグリンの産生量がN.C.の表皮細胞におけるものに比べて多いことを示している。図３ｂの定量されたグラフでは、試料８（N.C.）に比べて試料９、１０では約２００％のフィラグリンの産生が確認された。これにより、ＧＤＳ２３による表皮細胞におけるフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図１〜図３ｂに示した表皮角層又は表皮細胞におけるフィラグリンの発現増強は、フィラグリンの分解生成物であるＮＭＦも発現増強され得ることを示している。
（３）プロフィラグリンｍＲＮＡの増幅試験
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、細胞のＲＮＡを抽出し、プロフィラグリンのｍＲＮＡを定量した。
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、細胞のＲＮＡを抽出し、プロフィラグリンのｍＲＮＡを定量した。
（３−１）試験方法
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を２．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４ 時間培養後、培地交換を行い、以下の試料１１〜１８を添加した培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料１１、１４、１７のコントロールは、培地のみである。試料１２、１３、１５、１６、１８は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料１１：コントロール（N.C.）
試料１２：ＧＤＳ１２（０．１００％）
試料１３：ＧＤＳ１２（０．０５０％）
試料１４：コントロール（N.C.）
試料１５：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料１６：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料１７：コントロール（N.C.）
試料１８：ＧＤＳ２３（０．００２％）
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を２．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４ 時間培養後、培地交換を行い、以下の試料１１〜１８を添加した培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料１１、１４、１７のコントロールは、培地のみである。試料１２、１３、１５、１６、１８は、ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料１１：コントロール（N.C.）
試料１２：ＧＤＳ１２（０．１００％）
試料１３：ＧＤＳ１２（０．０５０％）
試料１４：コントロール（N.C.）
試料１５：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料１６：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料１７：コントロール（N.C.）
試料１８：ＧＤＳ２３（０．００２％）
その後、表皮細胞を３７℃、５％二酸化炭素下で３時間培養した。続いて、細胞からＲＮＡを抽出した。
・プロフィラグリンｍＲＮＡ発現解析方法
抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析によりプロフィラグリンのｍＲＮＡを定量した。内部標準としてはシクロフィリン（Cyclophilin）を用いた。解析はプロフィラグリンの発現量を同一サンプルにおける内部標準であるシクロフィリンの発現量の値で補正を行った後、さらにコントロールN.C.の補正値を１００％としたときの各試料の補正値を算出した。
抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析によりプロフィラグリンのｍＲＮＡを定量した。内部標準としてはシクロフィリン（Cyclophilin）を用いた。解析はプロフィラグリンの発現量を同一サンプルにおける内部標準であるシクロフィリンの発現量の値で補正を行った後、さらにコントロールN.C.の補正値を１００％としたときの各試料の補正値を算出した。
（３−２）試験結果
図４ａは、ＧＤＳ１２に関する試料１１、１２、１３のプロフィラグリンｍＲＮＡの発現を示す。図４ａによれば、試料１２、１３のＧＤＳ１２を適用された表皮細胞におけるプロフィラグリンのｍＲＮＡの発現が、試料１１のN.C.の表皮細胞におけるものに比べて約１５０％に増大していることを示している。加えて、試料１２と１３では、ＧＤＳ１２の濃度が高い方がより増大している。これにより、ＧＤＳ１２による表皮細胞におけるプロフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図４ａは、ＧＤＳ１２に関する試料１１、１２、１３のプロフィラグリンｍＲＮＡの発現を示す。図４ａによれば、試料１２、１３のＧＤＳ１２を適用された表皮細胞におけるプロフィラグリンのｍＲＮＡの発現が、試料１１のN.C.の表皮細胞におけるものに比べて約１５０％に増大していることを示している。加えて、試料１２と１３では、ＧＤＳ１２の濃度が高い方がより増大している。これにより、ＧＤＳ１２による表皮細胞におけるプロフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図４ｂは、ＧＤＭ１２に関する試料１４、１５、１６のプロフィラグリンｍＲＮＡの発現を示す。図４ｂによれば、試料１５、１６のＧＤＭ１２を適用された表皮細胞におけるプロフィラグリンのｍＲＮＡの発現が、試料１４のN.C.の表皮細胞におけるものに比べて増大していることを示している。試料１５の低濃度のＧＤＭ１２の場合、若干の増大であるが、試料１６の高濃度のＧＤＭ１２の場合、約１５０％に増大している。これにより、ＧＤＭ１２による表皮細胞におけるプロフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図４ｃは、ＧＤＳ２３に関する試料１７、１８のプロフィラグリンｍＲＮＡの発現を示す。図４ｃによれば、試料１８のＧＤＳ２３を適用された表皮細胞におけるプロフィラグリンのｍＲＮＡの発現が、試料１７のN.C.の表皮細胞におけるものに比べて約１２０％増大していることを示している。これにより、ＧＤＳ２３による表皮細胞におけるプロフィラグリンの発現増強作用が確認された。
図４ａ〜図４ｃに示す表皮細胞におけるプロフィラグリンの発現増強は、プロフィラグリンの分解生成物であるフィラグリン、さらにその分解生成物であるＮＭＦも発現増強され得ることを示している。
（４）カスパーゼ１４の増幅
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、細胞のＲＮＡを抽出し、カスパーゼ１４のｍＲＮＡを定量した。
ヒト表皮細胞を用いて試料を作製した後、細胞のＲＮＡを抽出し、カスパーゼ１４のｍＲＮＡを定量した。
（４−１）試験方法
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を２．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４ 時間培養後、培地交換を行い、以下の試料１９〜２６を添加した培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料１９、２４のコントロールは、培地のみである。試料２０、２１、２２、２３、２５は、培地に含まれるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料１９：コントロール（N.C.）
試料２０：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料２１：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料２２：ＧＤＭ１２（０．０２０％）
試料２３：ＧＤＭ１２（０．１００％）
試料２４：コントロール（N.C.）
試料２５：ＧＤＳ２３（０．０００４％）
・表皮細胞の処理
正常ヒト表皮細胞（以下「表皮細胞」と称する）（クラボウ製）を２．０×１０４cells / wellの細胞密度にて増殖培地（KG2培地：クラボウ製)を用いて９６穴培養プレートに播種した。３７℃、５％二酸化炭素下で２４ 時間培養後、培地交換を行い、以下の試料１９〜２６を添加した培地（ウシ脳下垂体抽出物未含有KB2培地：クラボウ製)に交換した。試料１９、２４のコントロールは、培地のみである。試料２０、２１、２２、２３、２５は、培地に含まれるジアシルグリセロールＰＥＧ付加物の種類及び／又は濃度（培地に対する質量％）がそれぞれ異なる。
試料１９：コントロール（N.C.）
試料２０：ＧＤＭ１２（０．００１％）
試料２１：ＧＤＭ１２（０．００４％）
試料２２：ＧＤＭ１２（０．０２０％）
試料２３：ＧＤＭ１２（０．１００％）
試料２４：コントロール（N.C.）
試料２５：ＧＤＳ２３（０．０００４％）
その後、表皮細胞を３７℃、５％二酸化炭素下で３時間培養した。続いて、細胞からＲＮＡを抽出した。
・カスパーゼ１４ｍＲＮＡ発現解析
抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析によりカスパーゼ１４のｍＲＮＡを定量した。内部標準としてはシクロフィリン（Cyclophilin）を用いた。解析はカスパーゼ１４の発現量を同一サンプルにおける内部標準であるシクロフィリンの発現量の値で補正を行った後、さらにコントロールの補正値を１００％としたときの各試料の補正値を算出した。
抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成し、定量リアルタイムＰＣＲ発現解析によりカスパーゼ１４のｍＲＮＡを定量した。内部標準としてはシクロフィリン（Cyclophilin）を用いた。解析はカスパーゼ１４の発現量を同一サンプルにおける内部標準であるシクロフィリンの発現量の値で補正を行った後、さらにコントロールの補正値を１００％としたときの各試料の補正値を算出した。
（４−２）試験結果
図５ａは、ＧＤＭ１２に関する試料１９、２０、２１、２２、２３のカスパーゼ１４ｍＲＮＡの発現を示す。図５ａによれば、試料２０、２１、２２、２３のＧＤＭ１２を適用された表皮細胞におけるカスパーゼ１４のｍＲＮＡの発現が、試料１９のN.C.の表皮細胞におけるものに比べてそれぞれ増大していることを示している。加えて、ＧＤＭ１２の濃度が高い方がより増大しており、試料２２では約２００％、試料２３では約４００％に増大している。これにより、ＧＤＭ１２による表皮細胞におけるカスパーゼ１４の発現増強作用が確認された。
図５ａは、ＧＤＭ１２に関する試料１９、２０、２１、２２、２３のカスパーゼ１４ｍＲＮＡの発現を示す。図５ａによれば、試料２０、２１、２２、２３のＧＤＭ１２を適用された表皮細胞におけるカスパーゼ１４のｍＲＮＡの発現が、試料１９のN.C.の表皮細胞におけるものに比べてそれぞれ増大していることを示している。加えて、ＧＤＭ１２の濃度が高い方がより増大しており、試料２２では約２００％、試料２３では約４００％に増大している。これにより、ＧＤＭ１２による表皮細胞におけるカスパーゼ１４の発現増強作用が確認された。
図５ｂは、ＧＤＳ２３に関する試料２４、２５のカスパーゼ１４ｍＲＮＡの発現を示す。図５ｂによれば、試料２５のＧＤＳ２３を適用された表皮細胞におけるカスパーゼ１４のｍＲＮＡの発現が、試料２４のN.C.の表皮細胞におけるものに比べて約１５０％に増大していることを示している。これにより、ＧＤＳ２３による表皮細胞におけるカスパーゼ１４の発現増強作用が確認された。
図５ａ、図５ｂに示す表皮細胞におけるカスパーゼ１４の発現増強は、フィラグリンをＮＭＦに分解する酵素の１つが増加することを示しているので、結果的にＮＭＦも発現増強され得ることを示している。
以上、実施例を参照して本発明を説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、これらから自明の変形例も本発明に含まれる。
Claims (7)
- ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物を有効成分として含み、前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、以下の構造式を有し、長鎖脂肪酸におけるＲの炭素数が１１〜２３の範囲内であり、ポリエチレングリコール鎖におけるｎが１１〜４６の範囲内である、表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ジミリスチン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＭ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＳ１２）、ジステアリン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＳ２３）、ジパルミチン酸グリセロールＰＥＧ−２３（ＧＤＰ２３）、及びジオレイン酸グリセロールＰＥＧ−１２（ＧＤＯ１２）からなる群から選択される、請求項１に記載の表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、溶液状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記ジアシルグリセロールＰＥＧ付加物が、ベシクル状態で表皮内に浸透する、請求項１又は２に記載の表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記保湿関連物質がフィラグリンである、請求項１〜４のいずれかに記載の表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記保湿関連物質がプロフィラグリンである、請求項１〜４のいずれかに記載の表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
- 前記保湿関連物質がカスパーゼ１４である、請求項１〜４のいずれかに記載の表皮内の保湿関連物質の発現増強剤。
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