JP6800372B2

JP6800372B2 - 持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物

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Description

本発明は、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の新規の持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。

生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）または黄体形成ホルモン放出ホルモンは、視床下部性神経ホルモンであって、神経内分泌ペプチド（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅｐｅｐｔｉｄｅ）の一種である。具体的には、ＧｎＲＨは、視床下部の神経血管の末端で合成されて脳下垂体前葉性性腺刺激細胞に作用し、生殖腺刺激ホルモンである黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）の合成及び放出を促進することができる。ＧｎＲＨにより合成及び放出が調節される黄体形成ホルモンや濾胞刺激ホルモンは、男性及び女性の性ホルモンを調節して生殖細胞を成熟させる役割をする。

ＧｎＲＨは、日常の濃度では生殖腺ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の分泌を促進したり排卵を促進したりする効果を奏する一方、高濃度臨床では反対に、拮抗的阻害効果が生じることが知られている。高濃度の投与を通じてホルモン−依存腫瘍である前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ）や乳癌（Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ）の治療に用いられ得、子宮内膜症（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ）、子宮線維腫（Ｕｔｅｒｉｎｅｆｉｂｒｏｉｄｓ）、真性性早熟症（Ｃｅｎｔｒａｌｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓｐｕｂｅｒｔｙ）、及び子宮腺筋腫（Ａｄｅｎｏｍｙｏｓｉｓ）などの治療に用いられ得る。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ誘導体が各種性ホルモン依存性疾患に用いられ得ることが広く知られている（ＫｕｍａｒＰ．及びＳｈａｒｍａＡ，ＪＨｕｍＲｅｐｒｏｄＳｃｉ，２０１４；７（３）：ｐｐ１７０−１７４）。

ＧｎＲＨを含む既存の治療剤としては、１ヶ月または３ヶ月ごとに注射すればよい既存の徐放型製品が存在し、これは生分解性多核性貯蔵型マイクロカプセル（ＰＬＧＡまたはＰＬＡ）にＧｎＲＨ作用剤を含めた形態である。具体的には、Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）ＤｅｐｏｔというＧｎＲＨ誘導体徐放化製品が市販されている。これはＧｎＲＨ誘導体であるリュープロレリン酢酸塩（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅａｃｅｔａｔｅ）を活性物質としてＰＬＧＡ[ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）]微粒球を徐放性成分として含む製品である。前記Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）Ｄｅｐｏｔは生分解性重合体を用いるため注射量も多く増え、筋肉及び皮下に大きい用量で投与する特徴を有している。これにより、注射部位に疼痛や組織損傷が伴われ１ヶ月経っても生分解性重合体が全て吸収されず、数ヶ月間塊り（ｌｕｍｐ）が残っており、時によって炎症まで起こる問題が生じる。

追加で、前記Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）Ｄｅｐｏｔなどの短所を補完するためにエリガード注（登録商標）などが追加で開発されたが、初期薬物放出現象を有するか、混合溶液上における薬物安定性が低いなど、依然としてさらに他の短所を有している。これにより、ＧｎＲＨの血中濃度を長期間高く維持する製剤または剤形に対する開発の要求は継続している。

既存の徐放型製品は、ＧｎＲＨホルモンを血中に徐々に放出する目的の製剤であって、有効物質を徐放型で放出させるための追加の徐放性物質を含む。これにより、総医薬投与量が大きくなることによる痛み、投与組織の残存感、薬物安定性が低くなる等の問題が生じる。特に、既存の製品（ＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅＡｃｅｔａｔｅ）を注射で投与された人のうち２３ないし３０％に至る患者が注射部位の痛みを訴えた（ＬｅｅＰＡｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ、ＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，２０１４）。

一方、米国登録特許第９，６９４，０５１号は、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）の一部ペプチドのアミノ末端のリシン（Ｌｙｓ）にアルキルモイエティが接合されて変形されるペプチド結合体が、血清半減期が増加することを開示している。アルキルモイエティをペプチドのアミノ末端に接合することを通じて血清半減期が増加することを示しているが、ＧｎＲＨと全く異なる機能と配列のペプチドに関するものであって、アルキルモイエティを結合するアミノ末端がリシンである差がある。

このような背景のもとに、本発明者は、追加の物質や持続的放出のための製剤の構成などによる短所を有する徐放型製剤とは異なり、ＧｎＲＨホルモン成分自体の生体内半減期自体を増加させるための持続型製剤であるとともに生体利用率が増加した製剤を開発しようと努力した。具体的には、ＧｎＲＨ自体の生体内半減期を増加させたＧｎＲＨ誘導体にパルミチン酸を連結し、特定の塩の形態で製造して持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を製造した。製造した持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が優れた生体利用率を有しながら、生体半減期及び血中濃度維持効果を確認することを通じて本発明を完成した。

このように製造された本発明の持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物などは、各種性ホルモン−依存性疾患の予防及び治療や避妊に用いられ得る。

本発明は、前記のような既存の徐放型製剤の問題に鑑みて創出されたものであり、循環半減期が２〜４分程度に過ぎないＧｎＲＨホルモン成分自体の生体内半減期を増加させるための持続型製剤であるとともに生体利用率が増加した製剤を開発しようとした。これにより、本発明の目的は、投薬容易性と増加した効能を有する持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明者は、天然型の状態で循環半減期が２〜４分程度に過ぎない生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の生体利用率と生体内半減期を増加させ得る誘導体を製造しようと努力した結果、ＧｎＲＨ誘導体に結合したパルミチン酸；及び薬剤学的に許容可能な塩を含む、持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を開発し、この増加した効能と生体内半減期を有することを確認して本発明を完成した。

本発明で増加した効能とは、天然型ＧｎＲＨと同一の濃度でさらに優れた性ホルモン関連疾患治療の効果を奏することを意味し、例えば、天然型ＧｎＲＨと同一の濃度で投与された時にさらに優れた前立腺癌または乳癌の死滅効果などを有することを意味する。

一方、ＧｎＲＨは、一般の濃度では生殖腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の分泌を促進したり排卵を促進したりする効果を奏するものの、高濃度では反対に、拮抗的阻害効果を奏する。これにより、前記とは反対に、性ホルモンにより悪化する疾患の進行を阻害したり、さらに性ホルモンにより依存的な疾患の改善及び治療に効果を奏する。

以下では、本発明のＧｎＲＨ誘導体；前記ＧｎＲＨ誘導体に結合したパルミチン酸；及び薬剤学的に許容可能な塩を含む、持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物について詳細に説明する。

※持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体
本発明において用語「生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）」とは、視床下部の神経血管の末端で合成されて脳下垂体前葉性性腺刺激細胞に作用し、生殖腺刺激ホルモンである黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）の合成及び放出を促進する機能を有するホルモンである。ＧｎＲＨは、種別に異なる他の配列を有することができ、哺乳動物の天然型ＧｎＲＨは、下記配列番号１を有することができる。

[哺乳動物のＧｎＲＨ配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１）
本発明において用語「ＧｎＲＨ誘導体」は、ＧｎＲＨと構造的に類似するものの、体内で異なる方式で作用できる。ＧｎＲＨ誘導体、特に、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）に該当する誘導体の初期投与時には、ＧｎＲＨ誘導体がＧｎＲＨ受容体に結合しながら濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体ホルモン（ＬＨ）の体内合成と分泌を一定水準促進するようになる。しかし、ＧｎＲＨ誘導体の体内濃度が持続的に維持された場合には生殖腺刺激ホルモンが枯渇し、ＧｎＲＨ受容体が下向調節されて濾胞刺激ホルモン及び黄体ホルモンの合成と分泌がむしろ抑制される矛盾する効果を奏するようになる。このような効果を通じて、性ホルモン依存性疾患の予防または治療に用いられ得、避妊剤としても使用が可能である。

本発明の一様態において、ＧｎＲＨ誘導体は、ＧｎＲＨ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であり、これはリュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ナファレリン（Ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、ブセレリン（Ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、デスロレリン（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、メテレリン（Ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、ゴナドレリン（Ｇｏｎａｄｏｒｅｌｉｎ）及びこれらから変形された誘導体からなる群から選択され得る。

本発明の他の一様態において、ＧｎＲＨ誘導体は、既存に存在するＧｎＲＨ作用剤と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものである。

具体的には、本発明のＧｎＲＨ誘導体は、ＧｎＲＨ、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン、ブセレリン、ヒストレリン、デスロレリン、メテレリン、またはゴナドレリンと８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものであってもよく、さらに具体的には、ＧｎＲＨ（配列番号１）またはリュープロレリン（配列番号２）と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものであってもよい。

本発明の一様態において、ＧｎＲＨ誘導体は、リュープロレリンの最初のアミノ酸であるグルタミン酸を他のアミノ酸に置換した誘導体であり、さらに具体的には、グルタミンに置換した誘導体である。

本発明の一様態において、ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号２、３、または４のアミノ酸配列を含むものである。

特に、本発明のＧｎＲＨ誘導体は、従前から存在していたＧｎＲＨやＧｎＲＨ誘導体に追加の変形を付加したものを意味し得る。

具体的には、本発明のＧｎＲＨ誘導体は、当該ＧｎＲＨ誘導体に結合したパルミチン酸；及び薬剤学的に許容可能な塩を含む、持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体であってもよい。さらに具体的には、前記パルミチン酸は、ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に結合したものであってもよい。

本発明において用語「パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔａｔｅ）」とは、炭素数１６個のノルマル鎖飽和脂肪酸であって、１つのカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有する疎水性の性質を有する炭化水素鎖のカルボキシルである。

本発明の持続型ＧｎＲＨ誘導体は、パルミチン酸結合を通じて、i）腎臓再吸収及び脂肪貯蔵効率の促進；ii）血清タンパク質との結合増加による保護効果；iii）類似体シリーズの疎水性を増進させる特性を通じる腎臓排出（Ｒｅｎａｌｃｌｅａｒａｎｃｅ）の遅延；iv）脂質膜や生物学的膜への付着による放出期間増加及び薬効増加の効果を奏する。

パルミチン酸が付着されたデキサメタゾンパルミテートエマルジョンの抗−炎症効果は、同等量のデキサメタゾン単一成分に比べて５．６倍増加することが知られている（Ｐｅｎｇｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ，２０１０：３６（１２））。脂肪酸を付けて持続型製剤化されて商業化された製品であって、パリペリドンに脂肪酸を付加したインベガトリンザ（登録商標）（ＩＮＶＥＧＡＴＲＩＮＺＡ（登録商標））があり、上記デキサメタゾンに脂肪酸を付加したＬｉｐｏｔａｌｏｎ（登録商標）が存在する。

ホルモンや酵素などにパルミチン酸を結合させる場合、前記のような機作により体内半減期は増加することが知られているが、分子の疎水性増加により水溶解度が顕著に低くなり得、水溶性の環境で分子間で凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が起こったり、分子内でタンパク質の疎水性部位との疎水性結合などが起こったりし得る。従って、製剤安定性に問題が生じるか、生体利用率が落ち得、有効成分であるタンパク質の効能が低下し得る。

このような側面でパルミチン酸結合を通じて生体内半減期を増加させるものの、特定タンパク質の効能を低下させず、凝集を引き起こさない適切な製剤化戦略が必要である。

本発明において用語「薬剤学的に許容可能な塩」は、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の安定性、水溶解度の増加、生体利用率の増加などの目的のために用いられ得る薬剤学的に許容可能な塩を制限なく含む。

本発明の一様態において、薬剤学的に許容可能な塩は、無機酸、有機酸、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、及びアルカリ土類金属塩からなる群から選択され、他の一様態において、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、スルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、及びマグネシウム塩からなる群から選択される。

本発明の一様態において、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号３または４のアミノ酸配列を含み、前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にパルミチン酸が結合し、前記薬剤学的に許容可能な塩がナトリウム塩または酢酸塩である。

本発明の他の一様態において、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にパルミチン酸が結合し、前記薬剤学的に許容可能な塩が酢酸塩である。

本発明のさらに他の一様態において、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にパルミチン酸が結合し、前記薬剤学的に許容可能な塩がナトリウム塩である。

※パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含む薬剤学的組成物
本発明の薬剤学的組成物は、前記説明した本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含むものを制限なく含む。

本発明の一様態において、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的有効量の本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含み、追加で薬剤学的に許容される担体を含むものであってもよい。本明細書において用語「薬剤学的有効量」は、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物に含まれ得る薬剤学的に許容される担体は、製剤製造の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。

本発明の薬剤学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含み得る。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができる。特に、注射剤の投与経路としては、皮下注射、筋肉注射のうちいずれの投与形態も可能であり、投与形態は、目的とする体内濃度調節の効果などを考慮して選択され得る。

これにより、本発明の薬剤学的組成物は、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、カプセル剤、錠剤、液剤、懸濁剤、噴霧剤、吸入剤、点眼剤、粘着剤、貼付剤の中から選択された剤形であることが好ましく、注射剤がさらに好ましい。

本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により多様に処方され得る。本発明の薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人を基準に、０．００１−１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。前記薬剤学的組成物には、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が約０．００１−３０ｍｇ／ｍＬの範囲で含まれる。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法に応じて、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態に製造されたり、または多用量容器内に入れて製造され得る。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加で含み得る。

本発明の薬剤学的組成物は、性ホルモン−依存性疾患の予防または治療のために用いられ得、避妊のために用いられ得る。前記性ホルモン−依存性疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜症、子宮類線維腫、多嚢胞性卵巣症、真性性早熟症、多毛症、性腺刺激脳下垂体腺腫、睡眠時無呼吸症、過敏性大腸症候群、月経前症候群、良性前立腺肥大症及び不妊からなる群から選択され得るが、これに制限されない。

本発明の薬剤学的組成物は、追加で従前に用いていた生分解性重合体とともに用いる場合、顕著に優れた生体半減期を有することができる。これにより、本発明の薬剤学的組成物は、生分解性重合体を追加で含み得る。本発明において生分解性重合体は、薬物が身体を通じて腸管外に伝達されるように投与され得るようにしたり、本発明のＧｎＲＨ誘導体を含有した重合体が特定部位に局所的に作用できるように投与され得るようにする。本発明において生分解性重合体は、ＣｈａｓｉｎＭなど（「ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒｓａｓＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ」、ＮｅｗＹｏｒｋ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，１９９０）またはＤ．Ｗｅｓｃｍａｎなど（「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｔａｙｌｏｒ & Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９８）を参考にすることができるが、これに制限されない。

例えば、本発明において生分解性重合体は、ＰＬＡ（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、線状または分枝型ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ））、ＰＧＡ（ｐｏｌｙ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）、ヒドロゲルなどであってもよい。

本発明は、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはこれを含む薬剤学的組成物を人間を含む哺乳類に投与することによって、性ホルモンに関する症状及び疾患を予防したり治療する方法及び用途を追加で提供する。

本発明の新規の持続型パルミチン酸結合生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体の優れた生体利用率及び増加した血中半減期を通じて、性ホルモン−依存性疾患の治療において医薬の投薬頻度や投薬量の減少などに大きく寄与すると期待される。特に、既存の、注射部位の残存感と痛みの副作用を有していたＧｎＲＨ徐放型製剤の短所を克服できる。

多様な濃度のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ誘導体と対照群の薬物を前立腺癌細胞株の一種であるＤＵ−１４５細胞株に処理した後、細胞の生存率を測定した。陰性対照群として１％のＤＭＳＯを用い、陽性対照群として０．１％のＳＤＳを用いた。ナトリウム塩と酢酸塩化されたＧｎＲＨ誘導体と対照群の薬物を前立腺癌細胞株の一種であるＤＵ−１４５細胞株に処理した後、細胞の生存率を測定した。陰性対照群として１％のＤＭＳＯを用い、陽性対照群として０．１％のＳＤＳを用いた。パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体に最初のアミノ酸と含まれた塩による溶解度を測定した結果である。パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群の薬物と本発明のＧｎＲＨ誘導体を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群の薬物であるＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅと本発明のＧｎＲＨ誘導体を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群の薬物であるＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅａｃｅｔａｔｅｄｅｐｏｔの１ヶ月の剤形と本発明のＧｎＲＨ誘導体を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。

以下、本発明を製造例及び実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記製造例及び実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記製造例及び実施例に限定されるものではない。

製造例１：生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体の製造方法
天然型哺乳動物のＧｎＲＨ配列は、下記の通りである。

[哺乳動物のＧｎＲＨ配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１）
上記哺乳動物のＧｎＲＨ配列において、６番目のＧｌｙをＤ−Ｌｅｕに置換し、１０番目のＧｌｙをｄｅｓ−Ｇｌｙ（デス−グリシン）に置換してエチルアミド基に切り替えたＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅ（登録商標）を本発明の誘導体及び誘導体パルミチン酸結合体のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いた。

[Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−[Ｄ−Ｌｅｕ^６]−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号２）
上記Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ配列において１番目のアミノ酸であるグルタミン酸を維持した誘導体とこれをグルタミンに置換した誘導体を以下のような製造方法を通じて作った。

（１）ＧｎＲＨ誘導体ペプチドの製造方法
誘導体ペプチドの合成は、一般のＦｍｏｃ／ｔＢｕ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法により合成され、アミノ酸のα−アミノ基が塩基に敏感なＦｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）基で保護されており、ｓｉｄｅ基は、酸に敏感なグループで保護される。固相ペプチド合成（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、次の段階を含んでＦｍｏｃの切断及びアミノ酸の結合の繰り返しを通じてペプチド鎖を順次付けていく。
１．レジンにＦｍｏｃアミノ酸をローディング（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ｔｒｉｔｙｌｒｅｓｉｎ）；
２．Ｆｍｏｃ−ＡＡ−レジン（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）上のＦｍｏｃ保護基を除去；
３．ＤＭＦ洗浄；
４．活性化された上でアミノ酸を結合（ＤＩＣ／ＨＯＢｔ使用）；
５．ＤＭＦ洗浄；
６．２〜５の段階を繰り返し順次アミノ酸を結合；
７．合成されたペプチドからレジンのみ除去（１．５％のＴＦＡ／ＤＣＭ）；
８．レジンのみ除去されたペプチドのアミノ末端にエチルアミン（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を結合（ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＨＯＡｔ使用）；及び
９．結合したペプチドで保護化されたｓｉｄｅの全体を切断（９２．５％のＴＦＡ／２．５％のＴＩＳ／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＨ_２Ｏ）。

前記製造したＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に、パルミチン酸基を結合した。誘導体のアミノ末端にパルミチン酸を付けるのは、一般アミノ酸を結合する法と同一であった。

（２）ＧｎＲＨ誘導体ペプチドの精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
上記ＴＦＡの切断後、ペプチドをＳｈｉｍａｄｚｕＨＰＬＣ１０ＡＶＰシステムでＣ１８カラムを用いてＨＰＬＣ条件（Ａバッファ０．０５％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ、Ｂバッファ０．０５％のＴＦＡ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、流量率１ｍＬ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍ）の条件下で精製した。下記のＧｎＲＨ誘導体Ｐ１及びＰ３は、１番目のアミノ酸がグルタミン酸であるものであり、Ｐ２及びＰ４は、１番目のアミノ酸がグルタミンであるものである。

パルミチン酸は、水で０．０４ｍｇ／ｍＬと難溶性であり、融点が６０℃であるため室温で固相を示している。従って、パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の場合、水溶液に対する溶解度が低いと予測されることによって、塩化（Ｓａｌｔｉｎｇ）を追加で進めた。これにより、ナトリウム塩と酢酸塩の２種類の塩化を行い、下記Ｐ１〜Ｐ４のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体塩を製造した。

前記製造したＧｎＲＨ誘導体及びパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体塩を用いて、以後の実験を進めた。

実施例１：パルミチン酸結合による前立腺癌細胞株死滅の効果の変化如何
ＧｎＲＨ誘導体は、乳癌、前立腺癌、子宮内膜症、真性性早熟症などの疾患治療の目的で臨床に適用される。従って、前立腺癌細胞株の一種であるＤＵ−１４５細胞株をＴ７５フラスコ内で適正量のＲＰＩＭ１６４０培養液（１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、１％のｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓを含む）で培養し、３７℃、５％のＣＯ_２、９５％の空気の条件の無菌細胞インキュベータを用いる。細胞株死滅試験は、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（ＣＣＫ−８、ＤＯＪＩＮＤＯ社の製品）を用いて進めた。ＤＵ−１５４細胞株をＴ７５フラスコでトリプシン処理して分離した後、１×１０^４の密度で９６ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に移して１時間程度付着化（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の時間を持った。

以後、多様な濃度のＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ誘導体と対照群の薬物を細胞株に処理した。具体的には、細胞死滅に対する陰性対照群として１％のＤＭＳＯを用い、陽性対照群として０．１％のＳＤＳを用いた。４８時間培養した上で、既存の培養液をなくした後、１００μＬの新たな培養液と１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各細胞株に処理した。４８時間培養した上で、既存の培養液をなくした後、１００μＬの新たな培養液と１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各細胞株に処理した４時間後、４５０nmで吸光度を測定し、細胞生存率程度を確認した。測定した結果は、下表３、図１及び図２の通りである。

前記Ｐ２及びＰ３誘導体は、約１０％の前立腺癌死滅率を示すＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅやＧｎＲＨに比べて約７倍〜７．５倍の前立腺癌死滅の効果を奏することを確認できる。これを通じて、１番目のアミノ酸の置換と塩化の組み合わせにより、前立腺癌死滅に関する予想できなかった優れた効果を確認した。

類似のＧｎＲＨ誘導体であるにもかかわらず、最初のアミノ酸と塩化の種類により、前立腺癌死滅の効果が顕著に異なった。

実施例２：パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の塩化の種類による溶解度の差
ＧｎＲＨ溶解度は、実験的な状況で水に対して１ｍｇ／ｍＬの程度であり、実際には約０．０５８８ｍｇ／ｍＬと予測される。それに対し、酢酸塩は、ＧｎＲＨの水に対する溶解度を１０ｍｇ／ｍＬとして約１０倍以上上昇させるものと知られている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００６４４）。

これは、塩のイオン化とともに溶媒のｐＨを下げて溶解度を増加させるものと見られる。市販中のＧｎＲＨ及びＧｎＲＨ誘導体の溶解度を高くするためにカルボキシ末端（Ｃ末端）に多様な結合を試み、その内容を下表４としてまとめた。

製品化されたＧｎＲＨ誘導体塩の水溶解度は、下表５の通りである。

追加で、前記４種類のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の溶解度試験を進めた。まず、室温上で粉末形態のペプチドを微細秤で重さを測定し、有機溶媒である１００％のＤＭＳＯに最終２０ｍＭの濃度で溶解試験を進めた結果、４種類のペプチドのいずれも非常に速く完全に溶解することを裸眼で確認した。これをＳｔｏｃｋ溶液とし、ＰＢＳ緩衝液または細胞培養液に多様な濃度で希釈させて、その溶解度を確認した。

ＰＢＳ緩衝液等に前記ペプチドｓｔｏｃｋ溶液を希釈させる場合、再度白く濁って内部に凝集現象が生じることが見られ、その程度は、４種類のＧｎＲＨ誘導体で全て異なった。凝集現象の程度を把握するために、遠心分離して凝集物を沈めて確認した結果、前立腺癌細胞株死滅の効果に優れていたＰ２及びＰ３誘導体で溶解度が非常に高いことが分かった（図３）。

両誘導体はそれぞれ、カルボキシ末端にナトリウム塩と酢酸塩が付いている形態で製作されたところ、これは本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の場合、ペプチドの最初のアミノ酸及び塩の種類により複合的に溶解度が影響を受けることが確認できた。

実施例３：生体半減期増加率の測定
本発明者は、前記製造したパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、動物実験（９週齢の雌ＳＤラット）を進めた。具体的には、Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ（ｎ＝６）、Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅａｃｅｔａｔｅｄｅｐｏｔの１ヶ月の剤形（３．７５ｍｇ／ｍｏｎｔｈ；ｎ＝７）、及びＧｎＲＨ誘導体Ｐ２（ｎ＝６）またはＰ４（ｎ＝６）を各群別ラットに１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した。ラットへの投与前、投与後の０．５時間、１時間、２時間、６時間、１日、３日、７日、１０日、１４日、２１日、及び２８日目にラットの尾静脈から採血し、ＬＣ／ＭＳＭＳを用いて血中Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ及びＧｎＲＨ誘導体の濃度を測定した。特定時点に濃度が約４ｎｇ／ｍＬに達した場合、その次の時点に測定を進めなかった。

前記実験結果を纏めると下記の通りである。

前記測定結果は、図４〜図６でグラフで示した。上記測定結果に基づき、半減期（ｔ_１／２）、クリアランス率（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、最大濃度到達時間（Ｔ_ｍａｘ）、投与後の最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）及び薬物に対する全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を計算して薬物動力学的分析をした結果は、下記の通りである。

前記結果を通じて、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体がＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅより顕著に優れた生体半減期、クリアランス率、分布容積、全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を有することを確認した。さらに、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が生分解性重合体を含む既存のＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅの１ヶ月の剤形に類似の水準の半減期、クリアランス率、及び全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を有し、特に、優れた分布容積と、最大濃度到達時間が遅延され、最大濃度が減少することを確認した。これを通じて本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が生体内で適切な濃度に長い期間維持されることを確認した。

前記確認した本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体の優れた性質を考慮すると、徐放性のために生分解性重合体を用いていた既存の製品に比べてボリュームが顕著に減り、痛みなどの短所を克服することができ、生分解性重合体が生体内に長い期間残存する副作用などを排除することができる。これは特に小児に用いる場合に有利な特徴である。一方、本発明のパルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を既存の製品に用いていた生分解性重合体とともに用いるようになると、既存のＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅのような薬物を用いた時より半減期が顕著に増加し、ｉｍｐｌａｎｔのような侵襲的（手術的）方法で用いる薬程に半減期が増加する効果を奏することができる（数ヶ月から１年）。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の通常の技術者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施され得ることを理解できる。これと関連し、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、また、その等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

持続型パルミチン酸結合生殖腺ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体であって、
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む前記ＧｎＲＨ誘導体のナトリウム塩、
ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む前記ＧｎＲＨ誘導体の酢酸塩、及び、
ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む前記ＧｎＲＨ誘導体の酢酸塩、からなる群から選択され、
前記ＧｎＲＨ誘導体の前記パルミチン酸のカルボキシ基はペプチド結合を介して前記ＧｎＲＨ誘導体のペプチド部分のアミノ末端に結合する、持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体。
前記持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体。
前記持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の持続型パルミチン酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含む、性ホルモン−依存性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物であって、前記性ホルモン−依存性疾患は、前立腺癌、乳癌、子宮内膜症及び真性性早熟症からなる群から選択されたものである、薬剤学的組成物。
前記薬剤学的組成物が、ＰＬＡ（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）、線状または分枝型ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ））、ＰＧＡ（ｐｏｌｙ−ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）及びヒドロゲルからなる群から選択される生分解性重合体をさらに含むものである、請求項４に記載の薬剤学的組成物。