JP6800191B2 - 抗ｐｄ−１抗体並びにその治療及び診断のための使用 - Google Patents

Description

本発明は、抗ＰＤ−１抗体並びに該抗体の治療及び診断のための使用に関する。

プログラム死−１（ＰＤ−１、また、「ＣＤ２７９」とも呼ぶ）は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激／阻害性受容体ファミリーに関連する５５ＫＤ受容体タンパク質である。非特許文献１参照。ＰＤ−１をコードするｃＤＮＡ及び遺伝子をクローニングし、マウスおよびヒトにおいて特性を明らかにした。非特許文献２、非特許文献３参照。全長ＰＤ−１は、２８８個のアミノ酸残基（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００５００９）を含む。その細胞外ドメインは、アミノ酸残基１〜１６７で構成され、そして、細胞質Ｃ−末端テールは、二つの仮想の疫調節性モチーフ、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（非特許文献４参照）および、免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（非特許文献５参照）を有する。

今まで、二つの配列関連リガンド（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｉｇａｎｄ）、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は、ＰＤ−１と特異的に相互作用して、ＣＤ３およびＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化を阻害する細胞内シグナル伝達を誘導し（非特許文献６参照）、それにより、例えば、細胞増殖の減少、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの分泌、他の成長因子およびサイトカイン分泌といったＴ細胞活性を弱化させることが確認されていた。

ＰＤ−１の発現は、しばしば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞においてみられる。それは、ヒトの他の組織、例えば、筋肉、上皮、神経組織等においては希に発現される。また、ＰＤ−１の高水準発現は、多くの場合、免疫細胞の活性化と関連している。例えば、ヒトＴ細胞株、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）またはホルボールエステル（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート、またはＴＰＡ）によって活性化されたときに、ＰＤ−１の発現はウエスタンブロットにおいて上方制御されることが確認された。非特許文献７参照。同様の現象は、抗ＣＤ３抗体による刺激の際に、刺激されたマウスＴ−，及びＢ−リンパ球、及び、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞において観察された。非特許文献８及び非特許文献９参照。Ｔエフェクター細胞の刺激後のＰＤ−１発現の増加は、枯渇（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）及び免疫活性減少のほうに活性化Ｔエフェクター細胞を向け直す。したがって、ＰＤ−１媒介性阻害シグナルは、免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）に重要な役割をしている。非特許文献１０参照。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＰＤ−１発現増加及び腫瘍細胞におけるＰＤ−１リガンド発現増加は、肺（非特許文献１１参照）、肝臓（非特許文献１２及び非特許文献１３参照）、胃（非特許文献１４参照）、腎臓（非特許文献１５及び非特許文献１６参照）、乳房（非特許文献１７参照）、卵巣（非特許文献１８参照）、膵臓（非特許文献１９参照）、メラノサイト（非特許文献２０参照）、及び食道（非特許文献２１参照）などの異なるタイプの臓器及び組織に関与する様々な癌において報告されている。これらの癌におけるＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の発現増加は、より頻繁に患者の生存転帰の予後不良と関連している。異種移植片癌細胞の増殖を阻害するＰＤ−１遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニックマウスは、癌の根絶または寛容のための免疫系の調節におけるＰＤ−１シグナル伝達の重要性を明らかにした。非特許文献２２参照。

ＰＤ−１シグナル伝達の上方調節は、ヒトにおいて、免疫寛容、癌の増殖をもたらすだけでなく、ウイルス感染及びその拡大をももたらす。流行する肝臓感染症ウイルス、ＨＢＶ及びＨＣＶは、肝細胞においてＰＤ−１リガンドの過剰発現を誘導するとともにＴ−エフェクター細胞においてＰＤ−１信号伝達を活性化して、Ｔ細胞枯渇及びウイルス感染に対する寛容をもたらす。非特許文献２３及び非特許文献２４参照。同様に、ＨＩＶ感染症は、同様のメカニズムにより頻繁にヒトの免疫系を回避する。拮抗剤分子によるＰＤ−１シグナル伝達が、免疫細胞を寛容から戻し、がんや慢性ウイルス感染を根絶するよう再活性化し得る。非特許文献２５及び非特許文献２６参照。

Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５４：３０７−３１４ Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９２ ＥＭＢＯ Ｊ １１：３８８７−３３９５ Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４−７０６ ＩＴＩＭ； Ｖｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８：２８６−２９１ ＩＴＳＭ； Ｃｈｅｍｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３：９４５−９５４ Ｒｉｌｅｙ， ２００９ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２２９：１１４−１２５ Ｖｉｂｈａｒｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３２：２５−２８ Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５−７７２ Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１−１１８ Ｂｏｕｒ−Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２４１：１８０−２０５ Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：５０９４−５１００ Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １２８：８８７−８９６ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００９ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：９７１−９７９）５１００ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ １０８：１９−２４ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０１：１７１７４−１７１７９ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３：１７５７−１７６１ Ｇｈｅｂｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２００６ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ８：１９０−１９８ Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０４：３３６０−３３６５ Ｎｏｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３：２１５１−２１５７ Ｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ Ｃａｎｃｅｒ １１６：１７５７−１７６６ Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７−２９５３ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００９ Ｂｌｏｏｄ １１４：１５４５−１５５２ Ｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：４２１５−４２２５ Ｇｏｌｄｅｎ−Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０：３６３７−３６４１ Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５４：３０７−３１４ Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７ Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：８１３−８２４

本発明は、ＰＤ−１の免疫抑制（阻害）のための方法および組成物を提供する。一態様において、本発明は、ヒトＰＤ−１に結合する、配列番号１１−２２、３１−４２および５９−６３から選択される配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体抗原結合ドメインを提供する。
ＣＤＲは、（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）並びに（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）配列をそれぞれ含む重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）への組換えに適しており、ＰＤ−１特異的結合及び／又は機能性を保持する。

特定の実施形態では、ドメインは、以下を含む重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む：
ａ）ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１１、１７、３１、又は３７）、
ｂ）ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１２、１８、３２、又は３８）、
ｃ）ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１３、１９、３３、又は３９）、
ｄ）ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１４、２０、３４、又は４０）、
ｅ）ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１５、２１、３５、又は４１）、又は
ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１６、２２、３６、又は４２）。

特定の実施形態では、ドメインは、以下を含む重鎖可変領域（Ｖｈ）及び／又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む：
ａ）ｍｕ３１７： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１−１３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１４−１６）；
ｂ）ｍｕ３２６： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１７−１９）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２０−２２）；
ｃ）３１７−４Ｂ６： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３１−３３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３４−３６）；
ｄ）３２６−４Ａ３： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３７−３９）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号４０−４２）；
ｅ）３１７−１Ｈ： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１、５９、１３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１４−１６）；
ｆ）３１７−４Ｂ２： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１、６０、１３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６１、１５、１６）；
ｇ）３１７−４Ｂ５： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１、６０、１３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６１、１５、１６）；
ｈ）３１７−４Ｂ６： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１１、３２、１３）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号６１、１５、１６）；
ｉ）３２６−１： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１７、６２、１９）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２０−２２）；
ｊ）３２６−３Ｂ１： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１７、６２、１９）；
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２０−２２）；
ｋ）３２６−３Ｇ１： ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１７、６２、１９）；又は
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２０−２２）。

特定の実施形態では、ドメインは、以下を含む重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む：
（ａ） ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号３１）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１２、３２、５９又は６０）、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３３）、
ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１４、３４、又は６１）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号３５）、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３６）；又は
（ｂ） ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号３７）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１８、３８、又は６２）、及びＣＤＲ−Ｈ３（配列番号３９）、
ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号４０）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号４１）、及びＣＤＲ−Ｌ３（配列番号４２）。

特定の実施形態では、以下を含む重鎖可変領域（Ｖｈ）又は軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む：
ａ）ｍｕ３１７（配列番号４又は６）；
ｂ）ｍｕ３２６（配列番号８又は１０）；
ｃ）３１７−４Ｂ６（配列番号２４又は２６）；
ｄ）３２６−４Ａ３（配列番号２８又は３０）；
ｅ）３１７−４Ｂ２（配列番号４３又は４４）；
ｆ）３１７−４Ｂ５（配列番号４５又は４６）；
ｇ）３１７−１（配列番号４８又は５０）；
ｈ）３２６−３Ｂ１（配列番号５１又は５２）；
ｉ）３２６−３Ｇ１（配列番号５３又は５４）；
ｊ）３２６−１（配列番号５６又は５８）；
ｋ）３１７−３Ａ１（配列番号６４）；
ｌ）３１７−３Ｃ１（配列番号６５）；
ｍ）３１７−３Ｅ１（配列番号６６）；
ｎ）３１７−３Ｆ１（配列番号６７）；
ｏ）３１７−３Ｇ１（配列番号６８）；
ｐ）３１７−３Ｈ１（配列番号６９）；
ｑ）３１７−３Ｉ１（配列番号７０）；
ｒ）３１７−４Ｂ１（配列番号７１）；
ｓ）３１７−４Ｂ３（配列番号７２）；
ｔ）３１７−４Ｂ４（配列番号７３）；
ｕ）３１７−４Ａ２（配列番号７４）；
ｖ）３２６−３Ａ１（配列番号７５）；
ｗ）３２６−３Ｃ１（配列番号７６）；
ｘ）３２６−３Ｄ１（配列番号７７）；
ｙ）３２６−３Ｅ１（配列番号７８）；
ｚ）３２６−３Ｆ１（配列番号７９）；
ａａ）３２６−３Ｂ Ｎ５５Ｄ（配列番号８０）；
ａｂ）３２６−４Ａ１（配列番号８１）；又は
ａｃ）３２６−４Ａ２（配列番号８２）。

特定の実施形態では、ドメインは、以下を含む重鎖可変領域（Ｖｈ）及び軽鎖可変領域（Ｖｋ）を含む：
ａ）ｍｕ３１７（配列番号４及び６）；
ｂ）ｍｕ３２６（配列番号８及び１０）；
ｃ）３１７−４Ｂ６（配列番号２４及び２６）；
ｄ）３２６−４Ａ３（配列番号２８及び３０）；
ｅ）３１７−４Ｂ２（配列番号４３及び４４）；
ｆ）３１７−４Ｂ５（配列番号４５及び４６）；
ｇ）３１７−１（配列番号４８及び５０）；
ｈ）３２６−３Ｂ１（配列番号５１又は５２）；
ｉ）３２６−３Ｇ１（配列番号５３及び５４）；
ｊ）３２６−１（配列番号５６及び５８）；
ｋ）３１７−３Ａ１（配列番号６４及び２６）；
ｌ）３１７−３Ｃ１（配列番号６５及び２６）；
ｍ）３１７−３Ｅ１（配列番号６６及び２６）；
ｎ）３１７−３Ｆ１（配列番号６７及び２６）；
ｏ）３１７−３Ｇ１（配列番号６８及び２６）；
ｐ）３１７−３Ｈ１（配列番号６９及び２６）；
ｑ）３１７−３Ｉ１（配列番号７０及び２６）；
ｒ）３１７−４Ｂ１（配列番号７１及び２６）；
ｓ）３１７−４Ｂ３（配列番号７２及び２６）；
ｔ）３１７−４Ｂ４（配列番号７３及び２６）；
ｕ）３１７−４Ａ２（配列番号７４及び２６）；
ｖ）３２６−３Ａ１（配列番号７５及び３０）；
ｗ）３２６−３Ｃ１（配列番号７６及び３０）；
ｘ）３２６−３Ｄ１（配列番号７７及び３０）；
ｙ）３２６−３Ｅ１（配列番号７８及び３０）；
ｚ）３２６−３Ｆ１（配列番号７９及び３０）；
ａａ）３２６−３Ｂ Ｎ５５Ｄ（配列番号８０及び３０）；
ａｂ）３２６−４Ａ１（配列番号２８及び８１）；又は
ａｃ）３２６−４Ａ２（配列番号２８及び８２）。

特定の実施形態では、ドメインは、以下のＰＤ１残基に特異的に結合する：
（ａ）Ｋ４５及びＩ９３（文献［２００８ ＰＮＡＳ、１０５：１０４８３］に基づくアミノ酸番号付け；配列番号２におけるＫ５８およびＩ１０６に相当する）；又は
（ｂ）Ｉ９３、Ｌ９５及びＰ９７（文献［２００８ ＰＮＡＳ、１０５：１０４８３］に基づくアミノ酸番号付け；配列番号２におけるＩ１０６、Ｌ１０８およびＰ１１０に相当する）。

特定の実施形態では、ドメインは、ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞又はＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２細胞と共培養したＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞におけるＩＬ−２放出を誘導し、及び／又は、ＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ１細胞又はＨＥＫ２９３／ＰＤ−Ｌ２細胞と共培養したＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞におけるＩＬ−２分泌を阻害する。

また、本発明は、配列番号８３−８８、特に配列番号８７又は８８のいずれかを含む、抗体ＩｇＧ４重鎖エフェクター又は定常領域を提供する。

また、本発明は、対象ＰＤ−１結合ドメインを含む、抗体、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）_２を提供する。

また、本発明は、配列番号８３−８８、特に配列番号８７又は８８を含むＩｇＧ４重鎖エフェクター又は定常領域と、対象ＰＤ−１結合ドメインと、を含む抗体を提供する。

また、本発明は、対象ＰＤ−１結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、特にｃＤＮＡ配列を提供する。

また、本発明は、癌またはウイルス感染症の判定を受けた個体、または、ＰＤ−１拮抗作用を必要とする個体に対象ドメインを投与することを含む、対象ドメインを使用する方法を提供する。

また、本発明は、（ａ）マウスＣＤ８αのＣ末端ドメイン（１１３−２２０）に融合された抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（配列番号８９）；又は（ｂ）ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメインに融合されたヒトＰＤ−１の細胞外及び膜貫通ドメイン（配列番号９０）を含む融合タンパク質を提供する。

また、本発明は、対象融合タンパク質を使用する方法であって、該融合タンパク質を発現する細胞株で抗ＰＤ−１抗体をアッセイ、スクリーニング、または、選択することを含む、方法を提供する。

ＰＤ−１／Ｆｃ（上）及びＰＤ−１／Ｈｉｓ（下）の概略図である。ＥＣＤ：細胞外ドメイン；Ｌ：リンカー；Ｈ：Ｈｉｓタグ；Ｆｃ：ヒトＩｇＧ４からのγ４Ｆｃ断片；Ｎ：Ｎ末端；Ｃ：Ｃ末端。 ＥＬＩＳＡにおけるヒトＰＤ−１に結合するマウスモノクローナル抗体の用量依存的反応曲線である。マウスモノクローナル抗体は、各図の左上隅に表示されている。モノクローナル抗体３１７及び５１７は重鎖及び軽鎖の可変領域において高い相同性を共有している。結合シグナル強度は直接的なＯＤ_４５０読み取り（値）によって表される。抗原、ＰＤ−１／Ｈｉｓを５０μｌの容積でウェルあたり７０μｇまで増加する濃度で被覆した。この方法は実施例１において説明する。 ＦＡＣＳ分析に基づく、生きている細胞上に発現されたヒトＰＤ−１に結合するマウスｍＡｂの用量依存的反応曲線である。マウス抗体コード及びＥＣ_５０を各パネル上に表示した。ＭＦＩは、平均蛍光強度を表す。ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞を、ＦＡＣＳのためにウェル当たり５×１０^４細胞で９６ウェルプレート中に懸濁した。実施例１に記載したように、細胞表面標的へのＰＤ−１モノクローナル抗体の結合及びＦＡＣＳ検出を行った。 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の機能的活性をアッセイするために使用される細胞共培養システムの概略図である。Ｔ細胞（ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋のいずれか）は、ＰＢＭＣにおけるＨｕＴ７８／ＰＤ−１または初代Ｔ細胞を表す。ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体；Ｎ：核；Ｃ：細胞質。 図ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と共培養したＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞におけるマウスモノクローナル抗体誘導性のＩＬ−２分泌の用量依存的反応曲線である。ベースライン：すべての試験濃度でｍＩｇＧによって誘導される平均ＩＬ−２放出。トップライン：プリズムソフトウェアによる回帰計算に基づいた最高のＩＬ−２放出。 図６（Ａ）は、細胞株ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１と共培養したＰＢＭＣ（ドナー１９）における抗ＰＤ−１モノクローナル抗体によって誘導されたＩＦＮ−γ分泌を示すヒストグラムである。図６（Ｂ）は、細胞株ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１と共培養したＰＢＭＣ（ドナー２０）における抗ＰＤ−１モノクローナル抗体によって誘導されたＩＦＮ−γ分泌を示すヒストグラムである。 図７（Ａ）及び図７（Ｂ）は、エフェクター細胞（ＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１）及び標的細胞（ＨｕＴ７８／ＰＤ−１）の共培養による抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の活性を示す。平均は、代表的な実験の２つのデータ点から算出した。モノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度に添加した。実施例９に記載したように実験を行った。 ＥＬＩＳＡ（上のパネル）及びウエスタンブロット（下のパネル）による抗ＰＤ−１モノクローナル抗体のマッピング及び結合エピトープである。ＷＴ又はＭｔ ＰＤ−１を含有する馴化培地を用いてＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによって結合活性を評価した。^**はモノクローナル抗体結合活性がＷＴ ＰＤ−１の２５−５０％に減少されたＡＡ残基を示す。^***はモノクローナル抗体結合活性がＷＴ ＰＤ−１の２５％未満に減少したＡＡ残基を示す。 図ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と共培養した別の健康なドナーからの初代ヒトＰＢＭＣにおけるヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体により誘導されたＩＦＮ−γ放出である。 ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、ｈｕ３１７（Ａ）及びｈｕ３２６（Ｂ）によって増強されたＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞の細胞毒性を示す。標的肺癌細胞、ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＤ−Ｌ１は、エフェクター細胞と（Ｔ対Ｅ）１対２の比率で共培養し、実施例１２に記載したようにアッセイした。 ３つの処置群、ビヒクル（ＰＢＳ）、ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｈｕ３１７−１／ＩｇＧ４ｍｔ２）における個々の腫瘍増殖（成長）曲線である。各曲線は、各パネルの右側に数字で示した腫瘍持ちマウスの腫瘍増殖経路を表す。（肝細胞癌株Ｈｅｐ３Ｂから確立された）Ｈｅｐ３Ｂ／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞を１日目に播種し、ＰＢＭＣを１５日目に移植し、３回分のｈｕ３１７−１／ＩｇＧ４ｍｔ２を１８、２８および３８日目にそれぞれ注入した。方法については、実施例１２に記載されている。

ＰＤ−１は、そのリガンド、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と結合すると、免疫細胞において抑制性シグナル伝達を開始する。癌の増殖やウイルス感染の場合に、ＰＤ−１シグナル伝達の活性化は、免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を促進して、癌又はウイルス感染細胞が免疫監視（ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）から逃れるようにし、癌転移又はウイルス負荷（ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）増加をももたらす。治療薬によるＰＤ−１媒介細胞内シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含む免疫細胞を活性化することで、癌細胞増殖またはウイルス感染を阻害する免疫細胞機能を増強させるとともに、免疫監視および免疫記憶機能を回復させて、これらのヒトの疾患を治療する。

本発明は、免疫細胞においてがリガンドによって誘導されるＰＤ−１媒介性細胞内シグナル伝達に拮抗する機能を有する抗体を提供する。マウス抗ＰＤ−１抗体は、フレームワーク領域内のヒト抗体と高度に類似するようにヒト化された。変異されたヒトＩｇＧ４変異体フォーマットに作製された完全な抗体は、エフェクター機能および物理化学的特性の面でユニークな特徴を有している。開示された抗ＰＤ−１抗体は、癌の治療、ウイルス感染の制御、及び、悪化した免疫寛容に機構的に関与する他のヒトの疾患における治療的使用に適している。

定義

文脈が他に示さない限り、用語「抗体」は最も広い意味で使われ、具体的に、抗体（全長モノクローナル抗体を含む）およびＰＤ−１を認識できる抗体断片を含む。抗体分子は、通常、単一特異性であるが、独自特異性（ｉｄｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）、異種特異性（ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）、または多特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）としても記載され得る。抗体分子は、抗原上の特定の抗原決定基またはエピトープに対する特異的結合部位によって結合する。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を含み、一般的にその抗原結合領域または可変領域である。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；線形抗体；単鎖抗体分子；および抗原断片から形成された多特異性抗体などがある。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、文献［Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ （１９７５）］；米国特許４，３７６，１１０；文献［Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ （１９８７−１９９９）］；文献［Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ （１９８８）］；及び文献［Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ （１９９３）］参照。本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラス、及びそれらの任意のサブクラスであってもよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで培養され得る。モノクローナル高力価の抗体は、個々のハイブリドーマからの細胞をマウス、例えば、プリスティーン・プライムド（ｐｒｉｓｔｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、所望のモノクローナル抗体を高濃度で含有する腹水を産生するｉｎ ｖｉｖｏ産生によって得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのモノクローナル抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、腹水から、または培養上清から精製することができる。

「単離（された）ポリヌクレオチド」とは、天然状態でそれに隣接する配列から分離されたポリヌクレオチドセグメントまたは断片、例えば、通常その断片に隣接する配列（例えば、天然のゲノム中の断片に隣接する配列）から取り除かれたＤＮＡ断片をいう。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ組み込まれたか、他の配列とは独立した分離分子（例えば、ｃＤＮＡ断片又はゲノム断片、又はＰＣＲ又は制限酵素消化によって産生されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。また、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。

「構造体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、１以上のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）連結された、即ち、作動可能に連結された、ポリヌクレオチド分子を含む、任意の供給源に由来する、ゲノムの組込または自己複製できる、直鎖状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド分子、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製性ポリヌクレオチド分子、またはファージ等任意の組換えポリヌクレオチド分子を意味する。組換え構造体は、典型的に、意図された宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含むであろう。異種および非異種（すなわち、内因性）プロモーターは、本発明の核酸の発現を指示するよう使用され得る。

「ベクター」とは、軽質転換、すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入のために使用することができる任意の組換えポリヌクレオチド構造体を意味する。ベクターの一種に、付加的なＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」がある。別のタイプのベクターとして、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、細菌性複製起点及びエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターを本願明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

本明細書で使用される「発現ベクター」とは、宿主細胞への形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）、トランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）、又は、形質導入された（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）ときに、目的の遺伝子を複製及び発現することができる核酸分子をいう。発現ベクターは、該ベクターを確実に維持し、必要に応じて、宿主内で増幅させるために複製起点と、１以上の表現型選択マーカーと、を含む。さらに、発現ベクターは、細胞内のポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含む。適切な発現ベクターは、例えば、市販されている種々のｐＵＣプラスミド又はｐＢＲ３２２に由来するプラスミドであってもよい。他の発現ベクターは、バクテリオファージ、ファージミド、またはコスミド発現ベクターに由来するものであってもよい。

本発明の更なる実施形態

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示されたマウスハイブリドーマクローンのスクリーニングから同定されたマウスモノクローナル抗体を提供する。

他の実施形態において、本発明は、以下のポリヌクレオチドおよびタンパク質配列の組成を提供する：

ａ）マウスモノクローナル抗体３１７の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列、配列番号３；

ｂ）マウスモノクローナル抗体３１７またはｍｕ３１７＿Ｖｈの重鎖可変領域のタンパク質配列（配列番号４）；

ｃ）マウスモノクローナル抗体３１７の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列、配列番号５；

ｄ）マウスモノクローナル抗体３１７またはｍｕ３１７＿Ｖｋの軽鎖可変領域のタンパク質配列（配列番号６）；

ｅ）マウスモノクローナル抗体３２６の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列、配列番号７；

ｆ）マウスモノクローナル抗体３２６またはｍｕ３２６＿Ｖｈの重鎖可変領域のタンパク質配列（配列番号８）；

ｇ）マウスモノクローナル抗体３２６の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列、配列番号９；

ｈ）マウスモノクローナル抗体３２６またはｍｕ３２６＿Ｖｋの軽鎖可変領域のタンパク質配列（配列番号１０）；

一態様において、本発明は、ｍｕ３１７及びｍ３２６のＣＤＲ配列を含む、標的抗原ＰＤ−１への結合を媒介する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む組成物を提供する。

ａ）ｍｕ３１７重鎖のＣＤＲ１（ｍｕ３１７Ｈ−ＣＤＲ１）はＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨのアミノ酸（配列番号１１）を含む。

ｂ）ｍｕ３１７Ｈ−ＣＤＲ２はＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳのアミノ酸配列（配列番号１２）を含む。

ｃ）ｍｕ３１７Ｈ−ＣＤＲ３はＡＲＡＹＧＮＹＷＹＩＤＶのアミノ酸配列（配列番号１３）を含む。

ｄ）ｍｕ３１７軽鎖のＣＤＲ１（ｍｕ３１７Ｌ−ＣＤＲ１）はＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡのアミノ酸配列（配列番号１４）を含む。

ｅ）ｍｕ３１７Ｌ−ＣＤＲ２はＹＡＦＨＲＦＴのアミノ酸配列（配列番号１５）を含む。

ｆ）ｍｕ３１７Ｌ−ＣＤＲ３はＨＱＡＹＳＳＰＹＴのアミノ酸配列（配列番号１６）を含む。

ｇ）ｍｕ３２６Ｈ−ＣＤＲ１はＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む。

ｈ）ｍｕ３２６Ｈ−ＣＤＲ２はＷＩＮＮＮＮＧＥＰＴＹＡＥＥＦＫＧのアミノ酸配列（配列番号１８）を含む。

ｉ）ｍｕ３２６Ｈ−ＣＤＲ３はＡＲＤＶＭＤＹのアミノ酸配列（配列番号１９）を含む。

ｊ）ｍｕ３２６Ｌ−ＣＤＲ１はＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＹＳＦＭＨのアミノ酸配列（配列番号２０）を含む。

ｋ）ｍｕ３２６Ｌ−ＣＤＲ２はＲＡＳＮＬＥＳのアミノ酸配列（配列番号２１）を含む。

ｌ）ｍｕ３２６Ｌ−ＣＤＲ３はＱＱＳＫＥＹＰＴのアミノ酸配列（配列番号２２）を含む。

別の実施形態において、本発明は、以下を含めた、マウスのモノクローナル抗体ｍｕ３１７及びｍｕ３２６から生成されたヒト化モノクローナル抗体の配列を含む組成物を提供する：

ａ）ヒト化モノクローナル抗体ｈｕ３１７−４Ｂ６は、以下によってコードされる配列番号２４としての重鎖可変領域（Ｖｈ）のタンパク質配列を含む：

ｂ）ｈｕ３１７−４Ｂ６＿ＶｈのｃＤＮＡ（配列番号２３）；

ｃ）ヒト化モノクローナル抗体ｈｕ３１７−４Ｂ６は、以下によってコードされる配列番号２６としての軽鎖可変領域（Ｖｋ）のタンパク質配列を含む：

ｄ）ｈｕ３１７−４Ｂ６のｃＤＮＡ（配列番号２５）；

ｅ）ヒト化ｍＡｂｈｕ３２６−４Ａ３は、以下によってコードされる配列番号２８としてのＶｈのタンパク質配列を含む：

ｆ）ｈｕ３２６−４Ａ３−ＶｈのｃＤＮＡ（配列番号２７）；

ｇ）ヒト化モノクローナル抗体ｈｕ３２６−４Ａ３は、以下によってコードされる配列番号３０としてのＶｋのタンパク質配列を含む：

ｈ）ｈｕ３２６−４Ａ３＿ＶｋのｃＤＮＡ（配列番号２９）；

ｉ）ｈｕ３１７−４Ｂ２＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号４３）およびｈｕ３１７−４Ｂ２＿Ｖｋのタンパク質（配列番号４４）；

ｊ）ｈｕ３１７−４Ｂ５＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号４５）およびｈｕ３１７−４Ｂ５＿Ｖｋのタンパク質配列（配列番号４６）；

ｋ）ｈｕ３１７−１＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号４８）およびｈｕ３１７−１＿ＶｈをコードするｃＤＮＡ（配列番号４７）；

ｌ）ｈｕ３１７−１＿Ｖｋのタンパク質配列（配列番号５０）およびｈｕ３１７−１＿ＶｋをコードするｃＤＮＡ（配列番号４９）；

ｍ）ｈｕ３２６−３Ｂ１＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号５１）およびｈｕ３２６−３Ｂ１＿Ｖｋのタンパク質配列（配列番号５２）；

ｎ）ｈｕ３２６−３Ｇ１＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号５３）およびｈｕ３２６−３Ｇ１＿Ｖｋのタンパク質配列（配列番号５４）；

ｏ）ｈｕ３２６−１＿Ｖｈのタンパク質配列（配列番号５６）およびｈｕ３２６−１＿ＶｈをコードするｃＤＮＡ（配列番号５５）；

ｐ）ｈｕ３２６−１＿Ｖｋのタンパク質配列（配列番号５８）およびｈｕ３２６−１＿ＶｋをコードするｃＤＮＡ（配列番号５７）；

ｑ）ｍｕ３１７から産生される他のヒト化モノクローナル抗体のタンパク質配列（配列番号６３−７４）；

ｒ）ｍｕ３２６から産生される他のヒト化モノクローナル抗体のタンパク質配列（配列番号７５−８２）。

一側面において、本発明は、ヒト化モノクローナル抗体のＣＤＲ配列を含む組成物を提供する。ＣＤＲは、ｈｕ３１７又はｈｕ３２６等の同じ系列のヒト化モノクローナル抗体間で共有され得る（表１５〜１８参照）。非冗長のＣＤＲは以下の通りである：

ａ）重鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７及びｍｕ３１７を通して共有されるＨ−ＣＤＲ１配列、ＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨ（配列番号３１）；

ｂ）重鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７及びｍｕ３１７を通して共有されるＨ−ＣＤＲ３配列、ＡＲＡＹＧＮＹＷＹＩＤＶ（配列番号３３）；

ｃ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７−４Ｂ２、ｈｕ３１７−４Ｂ５、及びｈｕ３１７−４Ｂ６を通して共有されるＬ−ＣＤＲ１配列、ＫＳＳＥＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号３４）；

ｄ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７及びｍｕ３１７を通して共有されるＬ−ＣＤＲ２配列、ＹＡＦＨＲＦＴ（配列番号３５）；

ｅ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７及びｍｕ３１７を通して共有されるＬ−ＣＤＲ３配列、ＨＱＡＹＳＳＰＹＴ（配列番号３６）；

ｆ）ｈｕ３１７−４Ｂ６＿ＶｈにおけるＨ−ＣＤＲ２配列、ＶＩＹＡＤＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号３２）；

ｇ）ｈｕ３１７−４Ｂ２＿Ｖｈ及びｈｕ３１７−４Ｂ５＿ＶｈにおけるＨ−ＣＤＲ２配列、ＶＩＹＡＧＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号６０）；

ｈ）ｈｕ３１７−１＿ＶｈにおけるＨ−ＣＤＲ２配列、ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５９）；

ｈｕ３１７−１＿ＶｋにおけるＬ−ＣＤＲ１配列、ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡ（配列番号１１）；

ｊ）重鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３２６及びｍｕ３２６を通して共有されるＨ−ＣＤＲ１配列、ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号３７）；

ｋ）重鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３２６及びｍｕ３２６を通して共有されるＨ−ＣＤＲ３配列、ＡＲＤＶＭＤＹ（配列番号３９）；

ｌ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３２６及びｍｕ３２６を通して共有されるＬ−ＣＤＲ１配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＹＳＦＭＨ（配列番号４０）；

ｍ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３２６及びｍｕ３２６を通して共有されるＬ−ＣＤＲ２配列、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号４１）；

ｎ）軽鎖におけるヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３２６及びｍｕ３２６を通して共有されるＬ−ＣＤＲ３配列、ＱＱＳＫＥＹＰＴ（配列番号４２）。

ｏ）ｈｕ３２６＿４Ａ３＿ＶｈにおけるＨ−ＣＤＲ２配列、ＷＩＮＮＮＮＡＥＰＴＹＡＱＤＦＲＧ（配列番号３８）；

ｐ）ｈｕ３２６＿１及び他のｈｕ３１７モノクローナル抗体のＶｈにおけるＨ−ＣＤＲ２配列、ＷＩＮＮＮＮＧＥＰＴＹＡＱＧＦＲＧ（配列番号６２）。

別の側面において、本発明は、抗原上のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の特定の結合エピトープ、およびその機能的使用を提供する。リガンド結合に必要なＰＤ−１における６つの重要なアミノ酸（ＡＡ）残基を個別に変異させ、変異体および野生型ＰＤ−１タンパク質を用いて、結合エピトープを評価した。変異によってその抗体結合が有意に損なわれた残基を、重要な結合エピトープとして認識する。モノクローナル抗体、ｈｕ３１７−４Ｂ５及びｈｕ３１７−４Ｂ６の重要な結合エピトープはＫ４５およびＩ９３であり（２００８ ＰＮＡＳ， １０５：１０４８３に基づくアミノ酸番号付け；配列番号２におけるＫ５８及びＩ１０６に相当する（等価物））；モノクローナル抗体ｈｕ３２６−３Ｂ１及びｈｕ３１７−４Ａ３の有意な結合エピトープはＩ９３、Ｌ９５及びＰ９７である（２００８ ＰＮＡＳ， １０５：１０４８３に基づくアミノ酸番号付け； 配列番号２におけるＩ１０６， Ｌ１０８及びＰ１１０の等価物）。

さらなる別の側面において、本発明は、好ましいエフェクター機能および物理化学的性質を示した、ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を含め、対象の抗体の可変領域に連結され得る組換えヒトＩｇＧ４変異体の定常領域配列を含む組成物を提供する。その配列は以下の通りである：

ＩｇＧ４ｍｔ１０の定常領域配列（配列番号８８）；
ａ）ＩｇＧ４ｍｔ１の参照配列（配列番号８３）；
ｂ）ＩｇＧ４ｍｔ２の参照配列（配列番号８４）；
ｃ）ＩｇＧ４ｍｔ６の参照配列（配列番号８５）；
ｄ）ＩｇＧ４ｍｔ８の参照配列（配列番号８６）；
ｅ）ＩｇＧ４ｍｔ９の参照配列（配列番号８７）。

別の実施形態において、本発明は、ＯＳ８（Ｔ細胞活性化分子）とＰＤ−１リガンドを共発現する、安定な細胞株、ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２又はＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１を産生する組換え融合タンパク質ＯＳ８を発現するプラスミドを用いて、抗ＰＤ−１抗体機能を分析する方法を提供する。この細胞株を用いて、共培養によってＴ−細胞及びＰＢＭＣを結合して、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の機能を評価した（実施例３および実施例４参照）。あるいは、組換え融合タンパク質、Ｐ３Ｚを発現する別のプラスミドを用いて安定な細胞株、ＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚを作製した。ここで、Ｐ３Ｚは、分子センサーおよびシグナル伝達メディエーターとして機能する。ＰＤ−１リガンドがＰ３Ｚに結合したとき、それは細胞内シグナルを送ってＨｕＴ７８細胞におけるＩＬ−２の放出を活性化する。このシステムを用いて、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の阻害効果を評価してもよい（実施例３参照）。

一態様において、本発明は、以下のように組換え融合タンパク質のアミノ酸配列を含む組成物を提供する。
ａ）ＯＳ８のタンパク質配列（配列番号８９）；
ｂ）Ｐ３Ｚのタンパク質配列（配列番号９０）

別の側面において、本発明は、本明細書に記載された組換え融合タンパク質を発現する安定な細胞株を生成する方法、および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の機能的活性を定量的にアッセイするためにシステムを使用する方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、発現のために異種転写調節配列に作動可能に連結されていてもよく、ベクター、細胞等に組み込まれていてもよい。

別の実施形態において、本発明は、ＰＤ−１媒介性シグナル伝達を抑制する機能、及び、癌細胞などの標的細胞に対するサイトカイン分泌および細胞毒性を含む免疫応答のカスケードを引き起こす免疫細胞を活性化する機能を有する、ｈｕ３１７−４Ｂ６、ｈｕ３１７−４Ｂ５、ｈｕ３１７−４Ｂ２等、及びｈｕ３２６−４Ａ３、ｈｕ３２６−３Ｂ１、ｈｕ３２６−３Ｇ１等を含む、マウス抗ＰＤ−１抗体及びヒト化バージョン抗ＰＤ−１抗体、並びに、該抗体のそのような機能的使用を提供する。

一態様において、本発明は、癌細胞およびウイルス感染のクリアランスのために免疫応答シグナルを増幅し、免疫系を動員し、免疫エフェクター細胞として作用する機能を有する、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞およびＰＢＭＣを含む、ＰＤ−１を発現するいくつかのタイプの免疫細胞を活性化するヒト化抗ＰＤ−１抗体、及び、該抗体のそのような機能的使用を提供する。

別の側面において、ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、疾患の進行、特に、癌及びウイルス感染症をもたらす、ＰＤ−１媒介細胞内シグナル伝達による免疫細胞の抑制に関与するヒトの疾患を治療するための治療薬として使用される。

本発明の組成物は、癌、神経変性疾患、及び、感染性疾患、特に、ウイルス感染性疾患、及びヒトＰＤ−１の不適切または有害な発現が該状態の病因又は病態の要素である他の疾患の治療に有用である。したがって、本発明は、抗ＰＤ−１タンパク質で、それを必要とする対象（被験体）における癌を治療し、または、腫瘍の進行を阻害する方法を提供する。本発明はさらに、対象において癌を治療しまたは腫瘍の進行を阻害するための医薬の製造における対象のポリヌクレオチドの使用を提供する。

本発明は、列挙された特定の実施形態の全ての組み合わせを含む。更なる実施形態及び本発明の適用可能な全範囲は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の精神および範囲内における種々の変更および修正が当業者に明らかであるために、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、発明の詳細な説明および具体例はあくまで例示として設けられたことを理解すべきである。引用文献を含めて本明細書に言及された文献、特許、特許出願すべては、ここに全ての目的のためにその全体が参考として援用される。

実施例１ 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の作製

抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のハイブリドーマ融合技術（マイナーな変更あり）に基づいて作製した。文献［Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ １９７６ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５１１−５１９］、文献［ｄｅ Ｓｔ Ｇｒｏｔｈ ａｎｄ Ｓｈｅｉｄｅｇｇｅｒ １９８０， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１−２１］、及び文献［Ｍｅｃｈｅｔｎｅｒ ２００７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７８：１−１３）参照。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイで高い結合活性を有するモノクローナル抗体を、さらなる特徴付けのために選択した。

免疫化および結合アッセイのためのＰＤ−１組換えタンパク質

全長ヒトＰＤ−１ｃＤＮＡを含む発現プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社（カタログ番号ＳＣ１１７０１１、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００５０１８．１、北京、中国）より入手した。ＰＤ−１のアミノ酸（ＡＡ）１〜１６８からなる細胞外ドメイン（配列番号１、配列番号２）をＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ４重鎖のγＦｃドメイン又はＨｉｓ_６タグのいずれかに融合されたＣ末端を有するｐｃＤＮＡ３．１系発現ベクター（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）にてサブクローニングして、２つの組換え融合タンパク質発現プラスミド、ＰＤ−１−ＥＣ／ＨｉｓおよびＰＤ−１−ＥＣ／ＦＣ（ＰＤ−１／ＨｉｓおよびＰＤ−１／Ｆｃと略称する）を得た。免疫原／抗原タンパク質を概略的に図１に示す。組換え融合タンパク質の産生のために、ＰＤ−１／ＨｉｓおよびＰＤ−１／Ｆｃプラスミドを、１〜３リットルの培地（インビトロジェン社社）中で一時的に２９３−Ｆ細胞にトランスフェクトし、回転式シェーカ―を備えたＣＯ_２インキュベーター中で５〜７日間培養した。組換えタンパク質を含有する上清を収集し、１５０００ｇで３０分間遠心分離して除去した。ＰＤ−１／Ｈｉｓを、Ｎｉ−セファロース・ファスト・フロー（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社、上海、中国）を用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィーに続くＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社、上海、中国）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＰＤ−１／Ｆｃは、プロテインＧ・セファロース・ファスト・フロー・カラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いて精製した。ＰＤ−１／ＨｉｓおよびＰＤ−１／Ｆｃタンパク質の両方をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、小アリコートで−８０℃の冷凍庫に保存した。

ヒトＰＤ−Ｌ１をコードするｃＤＮＡは、公表された配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１４１４３）に基づいてＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（南京、中国）によって化学的に合成した。ＰＤ−Ｌ２発現プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社（カタログ番号ＳＣ１０８８７３，ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２５２３９．２、北京、中国）から購入した。両方のｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロマイシン（カタログ番号Ｖ８７０−２０、インビトロジェン社）およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ（カタログ番号Ｖ８１０−２０、インビトロジェン社）にてそれぞれクローニングした。

安定な発現細胞株

ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する安定な細胞株は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミドのＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州、米国）およびＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）へそれぞれトランスフェクションした後、１ｍｌ当たり２００μｇのハイグロマイシン（カタログ番号１０６８７−０１０、インビトロジェン社）又は１ｍｇのＧ４１８（シグマ社）を含有する培地で選択することで、確立した。単一クローンは、従来の方法、培地‐ウェル表面から単一のコロニーのピックアップ又は限界希釈のいずれかによって単離した。すべてのコロニーを、抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び、ＰＤ−Ｌ２抗体（カタログ番号１２−９９６９、１７−５９８３、１２−５８８８、イーバイオサイエンス、サンディエゴ、米国）を用いたウエスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析によりそれぞれスクリーニングし、トップ発現クローンを、ハイブリドーマモノクローナル抗体をスクリーニングするＦＡＣＳ結合アッセイのために選択し、機能分析に使用した。

免疫化、ハイブリドーマ融合およびクローニング

８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＦＫ ＢＩＯＣＳＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤ、北京、中国）に、５μｇのＰＤ−１／Ｆｃを含有する含むアジュバント１００μｌ（カタログ番号ＫＸ０２１００４１、ＫａｎｇＢｉＱｕａｎ、北京、中国）を皮下免疫した。免役化は、上記免疫原を３週間おきに２回注射することで行った。第２ラウンドの免役化後２週間の時点でマウス血清をＦＡＣＳ（以下の項）によってＰＤ−１結合を評価した。血清中高力価の抗ＰＤ−１抗体を有するマウスを選択し、アジュバントの不在下で５０μｇのＰＤ−１／Ｆｃを腹腔内に追加免疫した。その三日後に、標準的な技術（文献［Ｇｅｆｔｅｒ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９７７ Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ， ３：２３１−２３６］参照）を用いて、脾細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株、ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ）と融合した。

ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによる抗体のＰＤ−１結合活性の評価

文献［Ｆｌａｎａｇａｎ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３７８：３３−５２］に記載された酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（一部変更あり）によって、ハイブリドーマクローンの上清を最初にスクリーニングした。簡単に言えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０μｌ中のＰＤ−１／ＨｉｓまたはＰＤ−１／Ｆｃタンパク質５０〜２００ｎｇを９６ウェルプレート（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ＪｉｎＣａｎＨｕａ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ、深セン、中国）にウェル単位でコーティングした。ＨＲＰ連結抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号７０７６Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国及び中国上海）及び化学発光試薬（カタログ番号ＰＡ１０７−０１、ＴＩＡＮＧＥＮ、中国）を用いて、ＥＬＩＳＡシグナルを検出及び現像して、波長４５０ｎｍでプレートリーダー（ＰＨＲＥＡｓｔａｒ ＦＳ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ、ドイツ）にて読み出した。ＥＬＩＳＡ陽性の抗体産生クローンを、従来の方法を用いる蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によってさらに確認した。前述したＰＤ−１安定発現細胞株、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１（１０^５細胞／ウェル）を、Ｖ底９６ウェルプレート（カタログ番号３８９７、コーニング社、米国及び中国上海）で抗ＰＤ−１ハイブリドーマからの上清で染色した。ヒトＦｃ受容体を遮断するために、細胞をヒトＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）（カタログ番号Ｈ１１２９６、ライフホルダー社、米国及び中国上海）でプレインキュベートした。ＰＤ−１抗体は、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号４０５３１２、バイオレジェンド社、サンディエゴ、米国）で検出し、細胞蛍光をフローサイトメータ（Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ、Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国及び中国上海）を用いてモニターした。

ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイの両方で陽性のシグナルを示したハイブリドーマ細胞の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を機能分析に供して、ヒト免疫細胞系アッセイ（本明細書中）で良好な機能的活性を有する抗体を同定した。陽性の機能的活性を有する抗体をさらにサブクローニングし、特徴付けした。

無血清または低血清培地へのサブクローニングおよび適応

ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳおよび機能分析を介した一次スクリーニングからの陽性ハイブリドーマクローンを従来の限界希釈法によってサブクローニングした。各々の陽性クローンを、９６ウェルプレートにプレートし、ＣＯ_２インキュベーター内で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、カタログ番号ＳＨ３００８４．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、北京、中国）を有するＲＰＭＩ１６４０培地（カタログ番号ＳＨ３０８０９．０１Ｂ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社、上海、中国）中で培養した。各限界希釈プレートからの３つのサブクローンを選択し、ＦＡＣＳおよび機能分析によって特徴付けした。機能分析を介して選択されたサブクローンをモノクローナル抗体と定義した。トップサブクローンは、１−３％のＦＢＳを有するＣＤＭ４モノクローナル抗体培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）での増殖に適していた。

モノクローナル抗体の発現及び精製

マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞または組換え抗体プラスミドでトランスフェクトされた２９３−Ｆ細胞（カタログ番号Ｒ７９００７、インビトロジェン社）のいずれかを、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内でそれぞれＣＤＭ４モノクローナル抗体培地（カタログ番号ＳＨ３０８０１．０２、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（カタログ番号１２３３８０１８、インビトロジェン社）にて５〜７日間培養した。全ての細胞および細胞破片を除去する１００００ｇでの３０分間の遠心分離によって馴化培地を収集し、精製前に０．２２μｍ膜を通して濾過した。製造業者のガイドに従ってマウスのまたは組換え抗体をプロテインＡカラム（カタログ番号１７１２７９０１、ＧＥライフサイエンス社）に適用し、それに結合させ、ＰＢＳで洗浄し、２０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ３．５）中で溶出させた。溶出した物質は、１ＭトリスｐＨ８．０で中和され、通常９０％超の純度の抗体を含有した。プロテインＡ親和性精製された抗体は、ＰＢＳに対して透析するか、または、ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いてさらに精製して凝集物を除去した。２８０ｎｍで吸光度を測定することにより、または、標準として定義された濃度のウシＩｇＧ（カタログ番号２３２１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いるブラッドフォードアッセイ（カタログ番号１８５６２１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）により、タンパク質濃度を測定した。精製された抗体を−８０℃の冷凍庫の中にアリコートで保存した。

実施例２ 抗ＰＤ−１抗体間の結合活性の比較

我々は、数千のハイブリドーマクローンをスクリーニングして、高い特異性と強度をもってヒトＰＤ−１に結合するいくつかのトップモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。ＥＬＩＳＡアッセイ（図２）に示すように、３つのトップ抗体がかかる結合強度及び特異性を引き出した。ＦＡＣＳ解析の結果から、選択されたモノクローナル抗体が細胞表面上に発現された天然（ｎａｔｉｖｅ）ＰＤ−１タンパク質に結合することが分かった。マウスモノクローナル抗体３１７（ｍｕ３１７）、ｍｕ３２６及びｍｕ１５０は、濃度依存的な結合活性を示し、それらの結合ＥＣ_５０（５０％活性における有効濃度）はコントロールｍｕ５５よりも有意に低かった（図３）。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりモノクローナル抗体の結合親和性を評価する。

ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにおける高い結合活性と共に、細胞系アッセイ（本明細書中）における強力な機能的活性を有するモノクローナル抗体を、リアルタイム結合反応における結合速度定数について調べた。マウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を、プロテインＡフローカラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）に続くＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いる排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーによってハイブリドーマ上清から精製した。精製した抗ＰＤ−１抗体は、ＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃の冷凍庫の中にアリコートで保存した。

ＰＤ−１モノクローナル抗体の結合親和性を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)Ｔ−２００装置（ＧＥライフサイエンス社）を用いてＨＢＳ−Ｎ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ＧＥヘルスケア社）の中でＳＰＲ測定を実施した。抗マウスＦｃ ＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社）は、標準的な第一級アミンカップリングプロトコルを使用して作成した。０．３μｇ／ｍｌのＰＤ−１モノクローナル抗体を１０μｌ／分で１分間抗マウスＦｃ表面上に捕捉した。３．３ｎＭから１２０ｎＭまでの連続希釈液中ＰＤ−１／Ｆｃを３０μｌ／分で３分間抗体結合表面上に注入してから解離相が１０分間続く。会合速度（Ｋ_ａ又はｋ_ｏｎ）および解離速度（Ｋ_ｄ又はｋ_ｏｆｆ）を１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥライフサイエンス社）を用いて計算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出した。

表１に示すように、ｍｕ３２６及びｍｕ５１７の両方、ｍｕ３１７に関連する同族系列ファミリー員は、ｍｕ１３４よりも有意に良好な、それぞれ０．３２４ｎＭおよび０．２８９ｎＭに相当するサブナノモルのＫ_Ｄを持っている。ｋ_ｏｎ速度は表１に示す３つのモノクローナル抗体間で類似していたが、Ｋ_ｏｆｆ速度は有意に異なり、ｍｕ１３４においてより速い解離速度が観察された。

ＳＰＲによる抗ＰＤ−１ＦＡｂの親和性測定

抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をＰＣＲによってＦＡｂバージョンに変換して、それぞれ重鎖および軽鎖の可変領域をヒトＩｇＧ２−ＣＨ１のＮ末端およびκ鎖の定常領域と融合させ、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。両方の発現ベクターは、全体抗体の一過性発現に類似する一過性トランスフェクションプロトコルを使用して、２９３−Ｆ細胞中で共発現させた。簡単に言えば、Ｆａｂカッパ鎖をＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１系発現ベクター（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）でサブクローニングした。別のプラスミドでは、ＰＣＲを重ねることで、ヒトＩｇＧ２からのＣＨ１コード配列と共に重鎖可変領域（ＶＨ）Ｃ末端ｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ８タグと融合し、その後、発現ベクター中でサブクローニングした。Ｃ２３２ＳおよびＣ２３３Ｓ（文献［ＫＡｂａｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ， ＫＡｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５^ｔｈ ｅｄ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＮＩＨ １９９１］参照）突然変異をＩｇＧ２重鎖に導入して、ＩｇＧ２−Ａ構造においてジスルフィド結合交換を防止し、ヒトＩｇＧ２を安定化した。文献［Ｌｉｇｈｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １９（４）： ７５３−７６２］参照。両方の構造体は、ＦＡｂ成熟配列の上流にシグナルペプチドを含有していた。ＦＡｂの分泌発現は、２９３−Ｆ細胞への上記２つのプラスミドの共トランスファクションによって得られ、トランスファクションから６−７日後細胞培養上清を回収した。Ｈｉｓ８タグ付きのＦａｂは、ニッケル‐セファロース・ファスト・フロー・カラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）に続くＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、細胞培養上清から精製された。精製されたＦａｂは、ＰＢＳ中に０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃の冷凍庫にアリコートで保存した。

抗ＰＤ−１Ｆａｂの親和性測定のために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ−２００機器（ＧＥライフサイエンス社）を用いてＳＰＲアッセイを行った。簡単に言えば、ヒトＰＤ−１／ＨｉｓまたはカニクイザルＰＤ−１／Ｈｉｓを活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥライフサイエンス社）に結合して、約１００〜２００応答単位（ＲＵ）を得てから、１Ｍエタノールアミンで未反応基をブロックした。０．１２ｎＭから９０ｎＭまで増加する濃度のＦａｂサンプルを、３０μＬ／分でＳＰＲランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）に注入し、ヒトＰＤ−１／ＨｉｓまたはサルＰＤ−１／Ｈｉｓ上の結合反応は、ブランク・フロー・セル（ｂｌａｎｋ ｆｌｏｗ−ｃｅｌｌ）からＲＵを差し引くことで算出した。会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥライフサイエンス社）を用いて算出した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出した。

ＳＰＲによって測定された抗ＰＤ−１Ｆａｂの結合親和性を表１８に示す。各抗ＰＤ−１ＦａｂはヒトＰＤ−１に高親和性（Ｋ_ｄ ＝ ０．１５−１ ｎＭ）で結合した。すべてのＦａｂは、３２６−３Ｇ１除き、カニクイザルＰＤ−１への親和性よりもわずかに低いがそれに匹敵する親和性（Ｋ_ｄ５倍以内）で結合した。

実施例３ ヒトＴ細胞における抗ＰＤ−１抗体の機能的活性

安定な細胞株の作製

レトロウイルスパッケージング細胞株ＰＴ６７、ヒトＴ細胞系ＨｕＴ７８及びＨＥＫ２９３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から入手した。ＰＤ−１を発現するＨｕＴ７８サブラインＨｕＴ７８／ＰＤ−１は、前述したプロトコル（文献［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５ Ｂｌｏｏｄ １０６： １５４４−１５５１］参照）に従って、ＰＤ−１遺伝子を含むｐＦＢ−ｎｅｏベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈ社、サンタクララ、カリフォルニア州）を用いて、レトロウイルス形質導入によって作製した。Ｔ細胞エンゲ―ジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、膜アンカーキメラ抗体（ＯＳ８）は、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、ＯＫＴ３（文献［Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． １９９７， ＰＥＤＳ １０：４４５−４５３］参照）の一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を、ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び、細胞質ドメインを含むマウスのＣＤ８α（ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のＣ末端ドメイン（１１３−２２０）に融合することによって構築した。そうすることによって、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖがＴ細胞活性化剤として細胞表面に固定される（ａｎｃｈｏｒ）。ヒトＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＯＳ８ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングした。ＯＳ８とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２ ｃＤＮＡの両方を共発現する安定な細胞株ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１、Ｈｅｐ３Ｂ／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１およびＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２は、対プラスミドでＨＥＫ２９３及びＨｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ）を共トランスファクトさせてから、１０〜１４日間ハイグロマイシンまたはＧ４１８選択することで作製した。その後、細胞株は、前述のように限界希釈によってクローニングした（文献［Ｆｕｌｌｅｒ ＳＡ， ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． Ｃｈａｐｔｅｒ １１：Ｕｎｉｔ１１．８．， ２００１］参照）。Ｐ３Ｚと命名されたキメラＰＤ−１受容体は、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメイン（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿９３２１７０．１）にヒトＰＤ−１の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを融合することによって構築した。Ｐ３ＺをコードするｃＤＮＡ配列をＰＦＢ−ｎｅｏにクローニングし、レトロウイルス形質導入を介してＨｕＴ７８細胞に送達して、ＨＵＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞を作製した。

ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞におけるＩＬ−２の放出によるＰＤ−１抗体の機能の決定

抗ＰＤ−１抗体が、ＰＤ−Ｌ１誘導性（ＰＤ−Ｌ１により誘導された）ＰＤ−１シグナル伝達の相互作用をブロックすることができるかどうかを決定するために、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞（９６ウェルプレート中ウェル当たり１．５×１０^４細胞）と共に１５分間プレインキュベートした後、３７℃でウェルあたり２００μｌのＲＰＭＩ１６４０増殖培地を供給した平底プレートでＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１またはＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２細胞（ウェルあたり４×１０^４）と共培養した。１６−１８時間後、共培養物の上清を回収した。ＩＬ−２は、ヒトＩＬ−２ Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ ＥＬＩＳＡキッ（カタログ番号８８−７０２５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。このアッセイでは、抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−１シグナル伝達をブロックした結果、ＴＣＲシグナル伝達及びＩＬ−２産生が増強された（図４）。

図５及び表２に示すように、マウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ｍｕ３１７及びｍｕ３２６は、ｍｕ３０よりも有意に高い機能的活性を誘導して、ＩＬ−２分泌増加を導くＰＤ−Ｌ１誘導性ＰＤ−１シグナル伝達を阻害した。両方は、より高いＩＬ−２分泌（トップライン、表２）、それぞれ６７５および６３４ｐｇ／ｍｌを有するとともに、ｍｕ３０抗体よりも低いＥＣ_５０（５０％水準のＩＬ−２分泌誘導におけるモノクローナル抗体の有効濃度）を有していた。

抗ＰＤ−１モノクローナル抗体のＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞への結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、ＰＤ−Ｌ１誘導性Ｔ細胞活性化をブロックするだけでなく、ＰＤ−Ｌ２誘導性ＩＬ−２放出をもブロックした。表３は、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６が、ＩＬ−２分泌のパラメータ（ＥＣ_５０）で示されたＴ細胞活性においてｍｕ４７６よりも高い効力を有していることを示す。

ＨＵＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞におけるＩＬ−２の放出の逆シグナル伝達によるＰＤ−１抗体の機能の決定

キメラ受容体Ｐ３Ｚにおいて、ＰＤ−１シグナル伝達ドメインをＣＤ３ζの細胞質ドメインと交換した。したがって、Ｐ３Ｚは、元のＰＤ−１受容体としての阻害というより、ＰＤ−Ｌ１との結合時に活性化を仲介する。このアッセイにおいて、ＨｕＴ７８／Ｐ３Ｚ細胞（３×１０^４／ウエル）は、ハイブリドーマ上清またはＰＤ−１抗体と共に１分間プレインキュベートした後、３７℃の９６ウェル平底プレートでＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１またはＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２細胞（ウェルあたり４×１０^４）（ウェルあたり総容積２００μｌ）と共培養した。１６−１８時間後、共培養物の上清を回収し、前述したようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。

マウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の機能的活性は、前述した逆シグナル伝達アッセイにおけるＴ細胞活性化の直接的な読み出しによってさらに確認した。上記結果と一致して、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６は、我々がスクリーンしたモノクローナル抗体の間で最高の機能的活性を有していた。表４及び表５に示すように、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６は、ＩＣ_５０及び最大阻害の両方の点で、低活性モノクローナル抗体の一つ、ｍｕ３７よりもはるかに強力であった。

実施例４ ＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞と共培養した初代ヒトＰＢＭＣにおける抗ＰＤ−１抗体によるＩＦＮ−γ分泌の活性化

ＰＤ−１に対して選択されたトップｍＡｂがまた初代ヒト免疫細胞に対して機能的効果を発揮するかどうか確認するために、我々は、主にＴ細胞（５０−７０％）、Ｂ細胞及びＮＫ細胞（１５−３０％）、並びに単球（２−１０％）で構成された新たに単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、抗体の機能をアッセイした。製造業者の説明書に従って、ヒトＰＢＭＣをフィコールリンパ球分離培地（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；シグマアルドリッチ、ミゾーリ州）を用いた密度勾配遠心によって健康なドナーから単離した。すべてのヒト血液採取はＢｅｉｇｅｎｅの内部手順に従った。その後、アッセイの前に３日間、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（４０ｎｇ／ｍｌ）ＯＫＴ３（カタログ番号１６−００３７、イーバイオサイエンス社、カリフォルニア州）でＰＢＭＣを刺激した。ＦＡＣＳ分析（実施例１）は、活性化したＰＢＭＣ（主にＴ細胞）におけるＰＤ−１発現が、個々のドナーに依存して可変的に増加したことを示した（表６）。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合後、ＰＤ−１リガンド陽性腫瘍細胞に対する前活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞の応答を決定するために、９６ウェル平底プレート中でＰＢＭＣ（１×１０^４）をＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１またはＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ２細胞（３×１０^４）のいずれかと１５−１８時間共培養した。無細胞上清を、Ｔ細胞活性化及び他の免役細胞活性化の最も顕著な指標である、Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキットを用いるＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−γレベルについてアッセイした。文献［Ｔｈａｋｕｒ Ａ． ｅｔ ａｌ． ２０１２ Ｖａｃｃｉｎｅ， ３０：４９０７−４９２０］参照。

図６は、予備活性化ＰＢＭＣおよびＨＥＫ２９３／ＯＳ８／ＰＤ−Ｌ１細胞の共培養（物）にモノクローナル抗体ｍｕ３１７及びｍｕ３２６が存在することで用量依存的にＩＦＮ−γ蓄積が増加することを実証した。コントロールマウスのＩｇＧ処理によるＩＦＮ−γのベースレベルはドナー間で変化するが、ｍｕ３１７またはｍｕ３２６で処理されたＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γ分泌の増加は、０．１〜１０μｇ／ｍｌ範囲の抗体治療において統計的に有意である。ｍＩｇＧで処理されたＰＢＭＣの相応するレベルと比較すると、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６によって誘導された０．１〜１０μｇ／ｍｌ濃度レベルのＩＦＮ−γ分泌は、ドナー１９からのＰＢＭＣにおいて２．５〜３．２倍増加し、ドナー２０のＰＭＢＣにおいて１．４〜２．３倍増加した。

実施例５ 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体によるヒトＮＫ細胞の活性化

ＮＫ細胞における機能分析用の安定な細胞株

初代ヒトＮＫ細胞は、ＩＬ−２治療に応答してＰＤ−１タンパク質を発現し、ＰＤ−１媒介信号伝達によって増強されるＮＫ細胞の細胞毒性を阻害することが以前に報告されていた。文献［２０１０ Ｂｌｏｏｄ， １１６： ２２８６］参照。ＮＫ細胞における抗ＰＤ−１モノクローナル抗体によって発揮される機能的効果の定量的分析のために、ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）および肺癌細胞株ＳＫ−Ｍｅｓ−１（ＡＴＣＣ）を、前述したプロトコルに基づくレトロウイルス形質導入によって、ヒトＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１を安定的に発現するよう操作した。文献［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｂｌｏｏｄ １０６： １５４４−１５５１］、文献［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ６６： ５９２７］参照。二つの安定な細胞株をＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１およびＳＫ−Ｍｅｓ−１／ＰＤ−Ｌ１と命名した。

抗ＰＤ−１ＡｂがＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞におけるＩＦＮ−γ産生および分泌を促進する

ＮＫ細胞に対する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の機能的活性は、ウェルあたり合計６×１０^４個の細胞を有する９６ウェル平底プレートにおいて肺癌細胞株ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＤ−Ｌ１と１対２の比率で共培養したＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞におけるＩＦＮ−γ産生および分泌の定量的測定によってアッセイした。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、共培養を開始する１５分前にＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１に添加し、その後、該細胞をＣＯ_２インキュベーター中で一晩共培養した。実施例４に記載したように、無細胞上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γレベルについてアッセイした。

全ての抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、抗体治療濃度の低いベースラインから抗体治療濃度の高いトップラインまでＩＦＮ−γ産生を有意に増加させた。２つのトップ抗体、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６は、比較抗体５Ｃよりも低いＥＣ_５０を有しており、それは、ＮＫ細胞に対して強力な活性化効果を持っていることを示す（表７）。

抗ＰＤ−１抗体がＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞によって媒介される癌細胞死滅を増強する

ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞に対するＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞の細胞毒性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ）（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出アッセイによって決定した。簡単に言えば、ＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１の細胞（１０^５）を０．００４−１０μｇ／ｍｌの範囲内の最終濃度で抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とともにプレインキュベートし、９６ウェルＶ底プレート中でエフェクター対腫瘍細胞の比率（Ｅ：Ｔ）５：１でＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞（２×１０^４）を免役細胞培養物に添加した後、５時間共培養した。完全な腫瘍細胞の溶解を最大細胞死滅とし、各サンプルのＬＤＨ放出アッセイの読み出しを最大細胞死滅の割合（％）として算出した。全てのサンプルの細胞死滅（％）は、共通の基準としてベースラインの１０％を使用してプレートを通じて（ｃｒｏｓｓ）標準化した。

前述のように設定した特定の細胞毒性アッセイにおいて、選択された抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、高濃度のモノクローナル抗体入力（値）において１９％〜２０．２％の範囲の最終腫瘍細胞死滅（＝トップライン−ベースライン）をもたらした。ｍｕ３１７及びｍｕ３２６はｍｕ３３６よりも低いＥＣ_５０を有していたが、それは、ＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞媒介性腫瘍細胞死滅をもたらすことを示す（表８）。

実施例６ ＰＤ−１モノクローナル抗体のクローニング及び配列分析

特定のモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマクローンを、１００ｍｍ‐組織培養皿中で３〜１０×１０^６個（細胞）の密度まで培養し、その細胞をスイングバケットローター中で１５００ｒｐｍでの遠心分離を介して収集した。全細胞ＲＮＡを、超純ＲＮＡキット（ウルトラファインＲＮＡキット）（カタログ番号ＣＷ０５８１、ＣＷＢＩＯＴＥＣＨ社、北京、中国）を用いて製造業者のプロトコルに従い単離した。ＲＮＡを二重脱イオン水中に再懸濁し、ナノドロップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、上海、中国）によって濃度を測定した。

モノクローナル抗体ｃＤＮＡクローニング用のＰＣＲプライマーは、以前報告された配列（文献［Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ． ２００１ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７：４６１−４６９］参照）に基づいてインビトロジェン社（北京、中国）によって合成された。第一鎖ｃＤＮＡを逆転写酵素（カタログ番号ＡＨ３０１−０２、Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、北京、中国）を用いて合成した。ＰＣＲ試薬キット（カタログ番号Ａｐ２２１−１２、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、北京、中国）を用いて、製造業者のプロトコルに従い特定モノクローナル抗体ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物は、サービスプロバイダ（ＧｅｎｅＷｉｚ社、北京、中国）によって直接的に配列決定するか、又は、ｐＣＲベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングしてから配列決定した（ＧｅｎｅＷｉｚ社）。

マウスモノクローナル抗体のタンパク質配列を、配列相同性アラインメントにより分析した。モノクローナル抗体を配列相同性およびエピトープマッピングの結果（実施例１３）に基づいて分類した。配列主釈及びインタネット系配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ＧＯＶ／ｉｇｂｌａｓｔ／）により、Ｋａｂａｔ（文献［Ｗｕ， Ｔ．Ｔ． ａｎｄ Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， １９７０ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １３２： ２１１−２５０］参照）及びＩＭＧＴシステム（文献［Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．−Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２７， ２０９−２１２］参照）に基づいて相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。表９に示すように、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６のＣＤＲは、配列の長さおよび同一性において非常に異なる。

実施例７ マウスモノクローナル抗体のヒト化

抗体３Ｄ構造のシミュレーション

ＣＤＲループ構造をサポートするために重要である可能性のあるフレームワーク残基を同定するために、ｍｕ３１７及びｍｕ３２６の可変ドメインについて三次元構造をシミュレートした。潜在的に重要なフレームワーク残基は、抗体ヒト化の第一ラウンドにおいて元のマウス残基として維持された。抗体について以前に確立された構造モデリング法（文献［Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００ ２０：２６７−２７９］参照）を採用して、抗体の既知の標準構造（文献［Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ． １９９７ ＪｏｕＲＮＡｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２７３：９２７−９４８］参照）に基づいて抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の３Ｄ構造をシミュレートした。簡単に言えば、既知の高解像度構造（解像度２．５オングストローム未満）と最も相同な抗体配列を同定するために、マウス抗体の各可変ドメイン（Ｖｋ及びＶｈ）の配列をＰＤＢデータベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ｂａｎｋ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）でブラストした。ｍｕ３１７及びｍｕ３２６モデリング用に選択された鋳型（表１０に示す）は、モデル化される標的抗体のＬ‐ＣＤＲ１、Ｌ‐ＣＤＲ２、Ｌ‐ＣＤＲ３、Ｈ‐ＣＤＲ１、およびＨ‐ＣＤＲ２において同類の標準的なループ構造を有していた。ＶｋおよびＶｈの鋳型が異なる免疫グロブリンに由来する場合、スイスモデルプログラム（文献［Ｋｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７， Ｄ３８７−Ｄ３９２］参照）による構造相同性モデリング用鋳型として使用されるＶｋ−Ｖｈ界面残基（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）のハイブリッド構造を形成するよう主鎖原子の最小二乗当てはめ（ｌｅａｓｔ−ｓｑｕｒｅ ｆｉｔ）によってそれらは一緒にパックされる。主鎖構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を保持しながら、特定の側鎖構造を調整した。親構造とモデル化構造が同一の残基を有する部位において側鎖構造は保持されていた。残基が異なる部位では、鋳型構造、回転異性体ライブラリーおよびパッキングの考慮事項に基づいて側鎖構造をモデル化された。相同性モデリング後、ＰＬＯＰプログラム（文献［Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２００２ ＪｏｕＲＮＡｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６：１１６７３−１１６８０］参照）を用いて、全原子エネルギー（ａｌｌ−ａｔｏｍ ｅｎｅｒｇｙ）を最小限に抑えるとともに、ＶｈとＶｈの界面を最適化するように相同性モデルを純化（改良）した。このステップは、特に、異なる抗体からの構造のセグメントを結合した領域において、立体化学を改良するために行われる。

ヒト化の程度を高め、および／または抗体の安定性を高めるよう抗体工学の更なる段階を案内するために、ＣＤＲ移植３１７−１及び３２６−１の構造をシミュレートした。選択された構造鋳型をまた表１０に示す。構造シミュレーションは、Ｈ−ＣＤＲ３の可能性のある構造が、同様のサイズ及びトルソ領域のＨ−ＣＤＲ３を含有する、３１７−１についてはＰＤＢ鋳型１ＡＹ１、及び３２６−１についてはＰＤＢ鋳型３ＣＸＤからそれぞれ取った点を除いて、上記手順と同様に行われた。移植されたＨ−ＣＤＲ３残基についてのエネルギー最小化は、ＰＬＯＰを用いて行われた。

ヒト化

抗ＰＤ−１モノクローナル抗体のヒト化のために、我々はＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）及びＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）においてヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースをブラストすることでｍｕ３１７及びｍｕ３２６可変領域のｃＤＮＡ配列に相同のヒト生殖系列ＩｇＧ遺伝子を調べた。ＰＤ−１モノクローナル抗体と高い相同性を有するヒトＩＧＶＨ及びＩＧＶγはヒト化のための鋳型として選択された。

ヒト化は、原則的にＣＤＲ移植により行われた。ヒト化の第１ラウンドでは、可変領域のフレームワーク配列におけるアミノ酸残基のマウスからヒトへの変異は、シミュレートされた３Ｄ構造によって案内され、その結果、マウスの全体的な抗体は保持され、ＣＤＲループ構造のみが前述したヒト配列に変異された。ヒト化モノクローナル抗体の初期バージョンは、ヒトＩｇＧ２定常領域（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０１８５９）に融合したヒト化可変重鎖（Ｖｈ）を有する重鎖及びヒトＩｇκＣ‐領域（ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０１８３４）に融合したヒト化可変軽鎖κ（Ｖκ）を有する軽鎖を含むｈｕ３１７−１（配列番号４７−５０）及びｈｕ３２６−１（配列番号５５−５８）であった。同様に、我々は、ヒトＩｇＧ２定常領域に融合したマウスのＶＨ及びヒトＩｇκＣ‐領域に融合したマウスのＶκから構成されたｍｕ３１７及びｍｕ３２６からのキメラ抗体を作製した。完全な（ｆｕｌｌ）キメラ抗体をそれぞれ、ｃｈ３１７及びｃｈ３２６と命名した。実施例１に記載したように、すべての組換えモノクローナル抗体を発現させ、精製した。

ＦＡＣＳおよび機能分析によって、モノクローナル抗体ｈｕ３１７−１がほぼｍｕ３１７及びｃｈ３１７と同じ結合活性および機能的活性を保持していることを実証した。ｍｕ３１７対ｃｈ３１７及びｈｕ３１７−１間のＦＡＣＳ分析におけるＥＣ_５０の差は、ＦＡＣＳで二つの異なる検出抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧおよびヤギ抗ヒトＩｇＧを使用したという事実によって解釈され得る。二つの機能分析では、３１７の３つの全てのバージョンがより同等に処理され、互いに近接な結果が得られた（表１１）。

ｍｕ３２６のヒト化の最初のラウンドの結果として、モノクローナル抗体ｈｕ３２６−１は、親のｃｈ３２６及びｍｕ３２６に類似した機能的特徴を保持しているが、ＦＡＣＳ結合アッセイ及びＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞系ＩＬ−２放出アッセイにおける機能的活性は、ｃｈ３２６よりわずかに弱いかもしれない（表１２）。

ヒト化の第一ラウンドに基づいて、我々はさらに抗体機能への影響を評価するために、ｈｕ３１７−１＿Ｖｈ及び＿Ｖκのフレームワーク（ＦＲ）内のマウスの他のアミノ酸（ＡＡ）残基をそれぞれ変異させた。表１３に示すように、Ｖｈにおける７つの個々の変異（体）及びｈｕ３１７−１のＶκにおける一変異（体）すべては同様の機能的活性を有する。変異（体）のうち、わずかにより弱い阻害機能を有するｈｕ３１７−２＿Ｋ７１ＶといったいくつかのＶｈの変異（体）においてごくわずかな変化が観察された。しかし、すべてのマウスのアミノ酸残基をヒトに変異させると（ｈｕ３１７−３Ａ）、ＦＡＣＳおよびＩＬ−２放出アッセイにおいてその機能は他の変異（体）よりも明らかに弱かった。

以上で説明した初期の試験では、ｈｕ３２６−１は、一部のマウスのＡＡ残基を残したことを除けば、ＦＲにおいて有意なヒト化レベルに達した。しかし、それはｍｕ３２６より弱い機能を有する。したがって、我々はマウスの残基に戻るか、または、ヒト残基へといったいずれかのさらなる個別変異（体）を作製し、モノクローナル抗体３２６機能への個々のＡＡの寄与を調べた。表１４は、ｈｕ３２６−１＿Ｖｈ鋳型（配列番号５６、配列番号５７）に基づいて作製したすべての単一ＡＡ変異（体）、及び、それらの機能分析の結果を示した。変異の大半は、元のｍｕ３２６モノクローナル抗体と同程度で、ｈｕ３２６−１よりも良好な機能的活性を示した。２つの変異（体）（Ｅ４６ＫおよびＦ９５Ｙ）はＥＣ_５０又はＩＣ_５０において潜在力がやや劣る結果となったが、それは、抗体構造および機能におけるそれらの残基の役割を示す。

ヒトにおいて治療薬として使用することができるモノクローナル抗体３１７及び３２６のために最高の可能性のあるＶｈ及びＶκ配列組成を調べるために、我々は、ＦＲにおけるヒト化レベル、機能的活性、物理化学的特性、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞毒性（ＤＣＤ）などの抗体特徴を考慮して、様々な変異の組み合わせ（ＣＤＲ配列内の一部の変異を含む）を作った。ほとんどの変異は、認定基準を通過していないとみなされた。操作プロセスを経て、潜在的な治療的有用性について６つのヒト化組換えモノクローナル抗体を選択した：ｈｕ３１７−４Ｂ２（配列番号４３−４４）、ｈｕ３１７−４Ｂ５（配列番号４５−４６）、ｈｕ３１７−４Ｂ６（配列番号：２３−２６）、ｈｕ３２６−３Ｂ１（配列番号５１−５２）、ｈｕ３２６−３Ｇ１（配列番号５３−５４）とｈｕ３２６−４Ａ３（配列番号２７−３０）。モノクローナル抗体のＣＤＲを元のマウス抗体のＣＤＲと比較したものを表１５、１６に示す。

６つのモノクローナル抗体のうち、ｈｕ３１７−４Ｂ２、ｈｕ３１７−４Ｂ５、及びｈｕ３１７−４Ｂ６は、配列において互いに密接に関連し、それらの機能的活動や強度において非常に類似している。一方、ｈｕ３２６−３Ｂ１、ｈｕ３２６−３Ｇ１、及びｈｕ３２６−４Ａ３は配列および機能において互いに非常に接近している（表１７−１８）。これらの２つのグループそれぞれに属したモノクローナル抗体は、いくつかの小さな違いはあるものの、（実施例１０及び１１に記載されている）物理化学的性質および結合エピトープ等、配列および機能以外の他の多くの特徴をも共有していた。

ＳＰＲによるヒト化抗ＰＤ−１Ｆａｂの親和性決定

抗ＰＤ−１モノクローナル抗体をＰＣＲによってＦａｂバージョンに転換して、重鎖及び軽鎖の可変領域をヒトＩｇＧ２−ＣＨ１のＮ末端及びκ鎖の定常領域にそれぞれ融合させ、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。完全な抗体の一過性トランスフェクションプロトコルを使用して２９３−Ｆ細胞で両方の発現ベクターを発現させた。簡単にいえば、Ｆａｂカッパ鎖をＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１系発現ベクター（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）にサブクローニングした。別のプラスミドで、ＰＣＲを重ねることにより、ヒトＩｇＧ２からのＣＨ１コード配列とともに重鎖可変領域（ＶＨ）をＣ末端ｃ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ８タグと融合し、その後、発現ベクターにサブクローニングした。Ｃ２３２ＳおよびＣ２３３Ｓ（文献［ＫＡｂａｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ， ＫＡｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５^ｔｈ ｅｄ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＮＩＨ １９９１］参照）変異をＩｇＧ２重鎖に導入して、ＩｇＧ２−Ａ構造においてジスルフィド結合交換を防止し、ヒトＩｇＧ２を安定化した（文献［Ｌｉｇｈｔｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １９（４）： ７５３−７６２］参照）。両方の構造物は、Ｆａｂ成熟配列の上流にシグナルペプチドを含有していた。Ｆａｂの分泌発現は、上記２つのプラスミドの２９３−Ｆ細胞への共トランスフェクションによって得られ、トランスファクション後６−７日が経過した時点で細胞培養上清を回収した。Ｈｉｓ８タグ付きのＦａｂは、細胞培養上清からＮｉ−セファロースファストフローカラム（カタログ番号１７５３１８０１、ＧＥライフサイエンス社）及びＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー（カタログ番号１７１０６９０１、ＧＥライフサイエンス社）を順次行うことで精製した。精製したＦａｂを、ＰＢＳ中に０．５〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃の冷凍庫にアリコートで保存した。

抗ＰＤ−１Ｆａｂの親和性測定のために、ＳＰＲアッセイはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ−２００機器（ＧＥライフサイエンス社）で行った。簡単に言えば、ヒトＰＤ−１／ＨｉｓまたはカニクイザルＰＤ−１／Ｈｉｓを活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥライフサイエンス社）に結合して、約１００〜２００応答単位（ＲＵ）を得てから、１Ｍのエタノールアミンで未反応基をブロックした。０．１２ｎＭから９０ｎＭまで増加する濃度のＦａｂサンプルを、３０μＬ／分でＳＰＲランニング緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）に注入し、ヒトＰＤ−１／Ｈｉｓ又はサルＰＤ−１／Ｈｉｓ上の結合反応は、ブランク・フロー・セル（ｂｌａｎｋ ｆｌｏｗ−ｃｅｌｌ）からＲＵを差し引くことで算出した。会合速度（ｋ_ｏｎ）と解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡ評価ソフトウェア、ＧＥライフサイエンス社）を用いて算出した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出した。

ＳＰＲによって測定された抗ＰＤ−１のＦａｂの結合親和性を表１８に示す。各抗ＰＤ−１ＦａｂはヒトＰＤ−１に高親和性（Ｋ_ｄ＝０．１５−１ｎＭ）で結合した。すべてのＦａｂは、３２６−３Ｇ１を除き、カニクイザルＰＤ−１への親和性よりもわずかに低いがそれに匹敵する親和性（Ｋ_ｄ５倍以内）で結合した。

実施例８ 変異ヒトＩｇＧ４定常領域を有する組換え抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の作製及び発現

ＰＤ−１は、主に活性化Ｔ細胞において発現されるので、天然のＩｇＧのＦｃ部分に連結されたＰＤ−１ブロッキング抗体は、ＡＤＣＣ及びＤＣＤなどのＦｃ媒介エフェクター機能をＩｇＧサブクラスに応じて異なる程度に誘導し、その結果、活性化Ｔ細胞を除去すると期待されている。文献［Ｎａｔｓｕｍｅ Ａ， ｅｔ ａｌ， ２００９ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ． ３： ７−１６］参照。ヒト抗体サブクラスＩｇＧ４は、少量のＡＤＣＣを有し、ほとんどＣＤＣエフェクター機能を有しないことが、これまでに多く報告されていた。文献［Ｍｏｏｒｅ ＧＬ， ｅｔ ａｌ． ２０１０ ｍＡｂｓ， ２：１８１−１８９］参照。一方、自然のＩｇＧ４は、酸性緩衝液または上昇する温度下等のストレス条件において安定性が劣ることが知られていた。文献［Ａｎｇａｌ， Ｓ． １９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３０：１０５−１０８］；文献［Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ， Ｗ． ｅｔ ａｌ， １９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７：９２６６−９２７３］；文献［Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １０５：９−１９］参照。ＰＤ−１^＋細胞を死滅から免れさせるとともに抗ＰＤ−１抗体の物理化学的特性を改善するために、変異の組み合わせによって操作したＩｇＧ４にヒト化モノクローナル抗体を結合し、減少されたまたはヌル（ｎｕｌｌ）ＦｃγＲ結合またはＣ１ｑ結合活性を持たせ、それにより、ＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を弱化させるか、又は、除去した。生物学的薬剤としての抗体の物理化学的特性を考慮すると、ＩｇＧ４のあまり望ましくない固有の特性の一つは、溶液中で２つの重鎖が動的に分離して半抗体（ｈａｌｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を形成することである。これによって、「Ｆａｂ腕交換（Ｆａｂ ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」と呼ばれるプロセスを介してｉｎ ｖｉｖｏで二重特異性抗体が生じる。文献［Ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ２００７ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１７−１５５４−１５７］参照。位置２２８（ＥＵ番号付けシステム）におけるセリンのプロリンへの突然変異は、ＩｇＧ４の重鎖分離を抑制しているようであった。文献［Ａｎｇａｌ， Ｓ． １９９３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ３０：１０５−１０８］；及び文献［Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １０５：９−１９］参照。ヒンジ及びγＦｃ領域中のいくつかのアミノ酸残基は、Ｆｃγ受容体との抗体相互作用に影響を及ぼすことが報告されている。文献［Ｃｈａｐｐｅｌ ＳＭ， ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：９０３６−９０４０］；文献［Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ， ９：１１５−１１９］；文献［Ａｒｍｏｕｒ， Ｋ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２９：２６１３−２６２４］；文献［Ｃｌｙｎｅｓ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６：４４３−４４６］；及び文献［Ａｒｎｏｌｄ Ｊ．Ｎ．， ２００７ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２５：２１−５０］参照。さらに、ヒト集団において稀に現れるいくつかのＩｇＧ４のアイソフォームは、異なる物理化学的性質を誘発し得る。文献［Ｂｒｕｓｃｏ， Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ， ２５：３４９−５５］；及び文献［Ａａｌｂｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ． ２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １０５：９−１９］参照。以前に報告されたすべての突然変異及びアイソフォームを特定の抗体として一括して扱うことが、理想的な抗体分子が前述したような治療薬の特徴すべてを共有することを保証するものではない。それは、抗体のエフェクター機能及び物理化学的特性への可変領域の影響並びに組み合わせられた変異の矛盾する効果に基づく。文献［Ｉｇａｗａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２０１０ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔ， ２３：３８５−３９２］；及び文献［Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｔｅｓｓｉｅｒ Ｐ．Ｍ．， ２０１２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ３：２６３−２８６］参照。

最小限のＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび不安定性を有する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を産生するために、我々は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ及びγＦｃ領域に多数の突然変異の組み合わせを導入して、ＩｇＧ４ｍｔ１及びＩｇＧ４ｍｔ１２を生じさせた。変異されたいくつかのＩｇＧ４変異体は、我々の分析結果にて示した通り、あまり望ましくないことが明らかであった。表１９には、いくつかの関連のＩｇＧ４変異体及び変異配列をまとめた。これらの抗体の評価が本明細書に記載されている。

実施例９ ＩｇＧｍｔ１０はＦｃγＲ結合を有しなく、最も低いＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能を有する

抗体が細胞表面標的タンパク質に結合し、エフェクター細胞上に発現されたＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に連結されると、ＡＴＣＣが開始される。ヒトＩｇＧ１はＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもＦｃｇγＲ、特に、ＦｃγＲ−Ｉ及びＦｃγＲ−ＩＩＩＡに対する高い結合親和性を有しているが、それはＡＤＣＣを活性化するＩｇＧ１の強度に関係することが十分に裏付けられていた。ＡＤＣＣに似ているＣＤＣは、抗体が細胞表面標的及びＣ１ｑタンパク質に交差結合したときに活性化され、補体複合体形成及び砲撃細胞溶解といったカスケード反応が続く。ＡＤＣＣおよびＣＤＣのプロキシとして、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに結合する抗体のアッセイは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの基本的な指標として機能し得る。したがって、我々はすべての主要なＦｃγＲへのモノクローナル抗体結合を体系的に評価した。

ＦｃγＲ結合

ＦｃγＲへの種々のＩｇＧ４変異体の結合をフローサイトメトリーによって決定した。簡単に言えば、ヒトＦｃγＲを発現する一連のＨＥＫ２９３トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を確立した。これらのトランスフェクタントはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、またはＦｃγＲＩＩＩＡを発現した。マルチサブユニットＦｃγＲ（すなわち、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）をＦｃＲγと共発現させた。多型変異体（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）（すなわち、ＦｃγＲＩＩＡ Ｈ１３１及びＲ１３１、ＦｃγＲＩＩＩＡ Ｆ１５８及びＶ１５８）も含まれていた。二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）’２−アレクサフルオロ４８８、ジャクソン・イムノリサーチ、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＦｃγＲ^＋ ＨＥＫ２９３細胞に対する変異されたＩｇＧ４の変異体（表９）を有する抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の結合を検出した。予想通り、ＩｇＧ１フォーマットの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｈｕ３１７−１／ＩｇＧ１及びｈｕ３１７−４Ｂ６／ＩｇＧ１）はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１およびＲ１３１対立遺伝子）、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８とＦ１５８の対立遺伝子）を含むすべてのＦｃγＲに強く結合する（表２０）。興味深いことに、２つの異なるバージョンのヒト化モノクローナル抗体、ｈｕ３１７−１及びｈｕ３１７−４Ｂ６（Ｖｈ及びＶκの両方において異なる）を同じＩｇＧ４変異体フォーマット（例えば、ＩｇＧ４ｍｔ１またはＩｇＧ４ｍｔ６フォーマットのいずれか）に作製したときに、それらの結合強度（ＭＦＩ）は、２倍〜１００倍近くまでの範囲で異なる（例えば、４５５．２／１１５．７＝３．９倍；１３．６／１．０＝１３．６倍；４３４．６／４．９＝８８．７倍など、表２０参照）。これは、抗体の可変領域は、ＦｃＲへの結合に有意な影響を及ぼすので、ＡＤＣＣなどエフェクター機能に影響を及ぼすという他の研究者による以前の知見と一致している。文献［Ｉｇａｗａ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２０１０ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｅｌｅｃｔ， ２３：３８５−３９２］；及び文献［Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｔｅｓｓｉｅｒ Ｐ．Ｍ．， ２０１２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ３：２６３−２８６］参照。

表２０に示すように、ｈｕ３１７−４Ｂ６及びｈｕ３２６−４Ａ３がＩｇＧ４ｍｔ１０フォーマットで作製されたときに、それらは、表に示したＰＤ−１モノクローナル抗体及びＩｇＧ変異体フォーマット及び我々がこの研究でテストした数多くの他のヒト化モノクローナル抗体及びＩｇＧフォーマットの中でＦｃγＲへの結合活性が最も低い。ここで、ＩｇＧ４ｍｔ１０フォーマットのｈｕ３１７−４Ｂ６及びｈｕ３２６−４Ａ３の独自性は、やや遠い配列相同性を有する、例えば、前述したｈｕ３１７−１のような同じ系列のヒト化モノクローナル抗体にまで拡張できない。

ＡＤＣＣ

古典的なＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩＡのまたはＣＤ１６に結合する抗体によってＮＫ細胞の活性化に関与する。ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体がＡＤＣＣを誘導するかどうかを確認するために、ＣＤ１６（Ｖ１５８対立遺伝子）及びＦｃＲγ遺伝子を含有する発現プラスミドを共形質導入することでＮＫ９２ＭＩ細胞から生成されたＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞をエフェクター細胞として使用し、そして、ＰＤ−１を発現するＴ細胞系、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１を標的細胞として使用した。ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞（４×１０^４）を９６ウェルＶ底プレートで同数のＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞と共培養した。細胞毒性は、前の項で説明したＬＤＨ放出アッセイによって測定した。結果から、ｈｕ３１７−４Ｂ２／ＩｇＧ４ｍｔ６、ｈｕ３１７−４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ６、ｈｕ３１７−４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ１０及びｈｕ３２６−４Ａ３／ＩｇＧ４ｍｔ１０すべてが陽性対照群と比較してベースレベルのＡＤＣＣを有していることが確認された（図７）。これらの４つのモノクローナル抗体の間におけるＡＤＣＣのわずかな違いは、実験誤差に起因する可能性がある（図７中のエラーバー参照）。

ＣＤＣ

ヒトＩｇＧ４抗体は、一般的に古典的経路を介してはいかなるＣＤＣをも誘導しない。ＩｇＧ４ｍｔ１０フォーマットの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体がＣＤＣを誘導するかどうかは、ＰＤ−１を発現するＴ細胞系、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１及び健康なドナーからの新鮮なヒト血清を用いて評価した。ＣＤＣによる細胞溶解をＣＥＬＬＴＩＴＥＲ Ｇｌｏアッセイキット（プロメガ社、北京、中国）によって測定した。簡単にいえば、ＨｕＴ７８／ＰＤ−１細胞（２×１０^４個）を無血清ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社）中で抗ＰＤ−１Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で１５分間インキュベートした後、９６ウェル平底プレート中で総容量１２０μｌの正常ヒト血清（ＮＨＳ）を最終濃度１５〜５０％まで添加した。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を溶解し、ＡＴＰ濃度についてアッセイした。ＩｇＧ４ｍｔ１０におけるヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体がＣＤＣを介してＰＤ−１^＋を死滅させることができるかどうかをテストするために、抗ＰＤ−１と共培養の前に、健康なドナーから単離したＰＢＭＣを抗ＣＤ３ Ａｂ ＯＫＴ３（４０ｎｇ／ｍｌ）で３日間予め活性化させた。ＡＴＰの量は、培養物中に存在する細胞の数に正比例する。蛍光は、９６ウェル蛍光光度計（ＰＨＥＲＡ Ｓｔａｒ ＦＳ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて読み取った。結果は、生存細胞の数に比例する相対的蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。％ＣＤＣ活性は以下の通り算出した：％ＣＤＣ活性＝［（ＲＦＵテスト−ＲＦＵバックグラウンド）／（総細胞溶解時のＲＦＵ−ＲＦＵバックグラウンド）］×１００。一般的に、我々は、活性化ＰＢＭＣに結合するＩｇＧ４ｍｔ１０フォーマットの抗ＰＤ−１によって媒介されたいかなるＡＤＣＣをも検出することができなかった。ＰＤ−１を高度に発現する細胞株、高い血清及び抗体濃度を用いるような過敏の実験条件下で、我々はいくつかの場面で非常に低レベルのＣＤＣを検出し、異なるバージョンおよび抗ＰＤ−１モノクローナル抗体間にそれほどの差異はない。それは、ＩｇＧ４変異体フォーマットの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体がＩｇＧ４の一般的な形態としての低ＣＤＣ活性またはＣＤＣ活性なしという特徴を保持したことを示す。

実施例１０ ＩｇＧ４ｍｔ１０フォーマットのヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ストレス条件下で増強された安定性を有する

高温・酸性条件での抗ＰＤ−１抗体の安定性

安定性研究に使用される抗ＰＤ−１抗体はすべて、前の項において説明したように、プロテインＡカラムの後サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製された。精製後、精製した抗体サンプルの凝集体の含量を分析用サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）にてモニターした。それは、０％〜０．５％の範囲内であった。

ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析のために、抗体サンプルをイソクラティック溶出条件下で（溶出緩衝液００．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（７．８×３００ｍｍ、カタログ番号０８５４１、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、上海、中国）、及び、それに続くＵＶ−２１５ｎｍでの検出によって分析した。各実験では、抗体サンプル１０μｌをカラムに充填し、１ｍＬ／分の流速で溶出した。二量体またはより大きな凝集体種の抗体を、モノマー種から分離し、二量体および凝集体の割合をＵＶトレースから統合されたピーク面積に基づいて決定した。

加速貯蔵安定性研究においては、高温条件での抗体の安定性を試験するために、抗ＰＤ−１抗体（ＰＢＳ中１０〜４０ｍｇ／ｍＬ）を４０〜５０℃のインキュベーターの中で４〜７日間維持した。その後、抗体サンプルは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにて、熱による二量体及び凝集体の形成について分析した。分析された各々の抗ＰＤ−１では、２％未満が高分子量種（二量体及び凝集体）となったが、それは、抗ＰＤ−１抗体が高温条件下で良好な安定性を有することを示す。

酸性条件下での抗体の安定性は、下流製造プロセス（文献［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ａｂｓ ２：４８０−４９９］参照）において重要な課題となっている。プロテインＡからの抗体の溶出及びウイルスの不活性化は、通常、低ｐＨ（２．５〜４）条件での抗体のインキュベーションを必要とする。しかし、このような酸性条件は、潜在的に、抗体の変性および凝集を引き起こす可能性がある。ヒトＩｇＧ４は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のよりも安定性が劣ることが知られている。文献［２００２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：９］参照。したがって、我々は様々なＩｇＧ４の突然変異フォーマットで作製したヒト化モノクローナル抗体をアッセイした。簡単に言えば、低ＰＨ条件での抗体の安定性を、ｐＨ３．６，３．３、３．０、または、２．７で５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する低ｐＨ緩衝液と１：１容積で混合した各抗体サンプル（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ）によって調べた。室温で１時間インキュベートした後、低ｐＨ条件の抗体サンプルを１：５希釈によってＳＥＣ−ＨＰＬＣ溶出緩衝液（０．２Ｍのリン酸ナトリウム含有、ｐＨ７．２）中へ中和した。上述したようにＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を行って、低ｐＨ条件によって誘導された二量体及び凝集体の割合（％）を定量化した。ＩｇＧ１形式の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体３１７−４Ｂ６は、ｐＨ値が２．７と低い得る場合でも、バイオプロセッシング関連酸性条件下で最も安定であった。いくつかのＩｇＧ４変異体として作られた抗ＰＤ−１モノクローナル抗体のうち、酸によって誘導された凝集体がＩｇＧ１フォーマットの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、３１７−４Ｂ６および３２６−４Ａ３に匹敵する水準まで有意に減少されたことから、ｈｕ３１７−４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ１０及びｈｕ３２６−４Ａ３／ＩｇＧ４ｍｔ１０が酸緩衝液条件下で最も安定であった（表２１）。

実施例１１ 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の結合エピトープのマッピング

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２の複合体の結晶構造に関する以前の報告は、リガンド結合に必要なＰＤ−１上の重要なアミノ酸（ＡＡ）の理解に光を当てた。文献［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００４ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２０：３３７−３４７］；文献［Ｌｉｎ Ｄ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＰＮＡＳ １０５：３０１１−３０１６］；及び文献［Ｌａｚａｒ−Ｍｏｌｎａｒ Ｅ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＰＮＡＳ， １０５：１０４８３−１０４８８］参照。実際に、このような６個のＡＡアミノ酸残基を、ＰＤ−Ｌ１結合に必要な点突然変異分析により受容体上で同定した。上記６個のＡＡ残基のうち５個はＰＤ−ＬＳ結合にも必要であった。文献［Ｌｉｎ Ｄ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＰＮＡＳ １０５：３０１１−３０１６］参照。構造誘導型変異分析からの情報に基づいて、我々は、機能的モノクローナル抗体がＰＤ−１媒介性のシグナル伝達を遮断する最も効果的な方法は、６個の重要なＡＡ残基に結合することで、リガンド結合に必要な結合エピトープを占有することでＰＤ−１リガンドと競争することであるという仮説を立てた。仮説を研究し、機能的ＰＤ−１抗体による作用メカニズムを理解するために、我々は、６つの重要なＡＡ（すなわち、Ｋ４５Ａ、Ｉ９３Ａ、Ｌ９５Ａ、Ｐ９７Ａ、Ｉ１０１Ａ、及びＥ１０３Ａ）それぞれを個別にＡｌａに置き換えることにより、ＰＤ−１の６個の変異体を作製した。文献［Ｌｉｎ Ｄ．Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２００８ ＰＮＡＳ １０５：３０１１−３０１６に基づくＡＡ残基番号付け］参照。変異体ＰＤ−１／ＦｃおよびＰＤ−１／Ｈｉｓ（図１）は、ＰＣＲにより導かれた突然変異誘発またはファストミュタジェネシスシステム（カタログ番号ＦＭ１１１、Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、北京、中国）を使用するローリングサークル突然変異誘発のための鋳型として使用した。全ての変異体は、我々のｐｃＤＮＡ系発現ベクター中でサブクローニングされ、配列決定により確認された。突然変異ＰＤ−１及び野生型ＰＤ−１タンパク質は、（実施例１に記載された）一過性トランスフェクションによって発現され、４−６日間の培養後に用意された。馴化培地（ＣＭ）をウエスタンブロットによって分析して、質と量の面でＰＤ−１タンパク質の発現を検証した。上清（ＣＭ）は、細胞破片をクリアした後、エピトープマッピングのためのＥＬＩＳＡ分析又はウエスタンブロットにおいて直接使用した。

ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の結合エピトープを調べるために、野生型（ＷＴ）および突然変異体（Ｍｔ）ＰＤ−１を用いるＥＬＩＳＡアッセイを行って、ｈｕ３１７−４Ｂ５、ｈｕ３１７−４Ｂ６、ｈｕ３２６−３Ｂ１及びｈｕ３２６−４Ａ３の結合活性を評価した。抗体結合特徴の独自性を確認する比較のために、２つの基準抗体（それぞれＵＳ８００８４４９Ｂ２及びＵＳ８１６８７５７Ｂ２からの基準Ａｂ−１および基準Ａｂ−２）をこの研究に含ませた。同じＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＷＴまたはＭｔＰＤ−１を含有する同容積のＣＭをすべてのモノクローナル抗体について９６−ウェルに被覆した。すべてのＥＬＩＳＡの結果を、標準としてＷＴ ＰＤ−１結合シグナルの平均ＥＬＩＳＡ測定値を用いて正規化した。特定のＭｔ ＰＤ−１に対するＥＬＩＳＡ結合シグナルを、特定のＭｔ ＰＤ−１に対する最も高い抗体結合読み出し（１００％として設定する）に対してさらに標準化した。データ解析の便宜のために、特定の突然変異体のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合シグナルがＷＴ ＰＤ−１に対して５０％未満に落ちたときに、アミノ酸残基は重要な結合エピトープとなると定義される。それは、その突然変異が抗体結合を有意に排除するからである。同様に、特定の突然変異体のモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ結合シグナルが２５％未満に落ちたときに、それは非常に重要であると定義される。図８に示すように。ＰＤ−１に重要なアミノ酸残基のうち２つ、Ｋ４５およびＩ９３は、モノクローナル抗体ｈｕ３１７−４Ｂ５及びｈｕ３１７−４Ｂ６結合のための重要または非常に重要なエピトープであり、３つのＡＡ残基、Ｉ９３、Ｌ９５及びＰ９７は、ｈｕ３２６−３Ｂ１及びｈｕ３２６−４Ａ３ための重要または非常に重要なエピトープである。一方で、２つの基準抗体は、独自の結合エピトープを有するが、Ｐ９７は基準Ａｂ−１に重要であるが、Ｌ９５及びＰ９７は、基準Ａｂ−２に重要である。

興味深いことに、ＰＤ−１タンパク質はウエスタンブロットで変性されたとき、重要な結合エピトープ（Ｋ４５及びＩ９３）は互いに近接していないものの（非線形）、依然としてＷＴ ＰＤ−１に結合することができた。これは、ＰＤ−１タンパク質は、ウエスタンブロットプロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて変性した後ある程度再生されるようになったことを示す。これによって、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体がそれを認識し、かつ、結合することができる。この観察結果を利用して、我々は、上記ＥＬＩＳＡ研究に使用されたすべての６つの抗体についてウエスタンブロット分析を行った。ウエスタンブロットからの全体的な結果はＥＬＩＳＡ結果をよく裏付けた。つまり、重要又は非常に重要なエピトープを変異させると、ＥＬＩＳＡにおいて低い結合シグナルが得られたが、他の変異体ＰＤ−１への結合と比較して、最も弱いウエスタンブロットバンドを示した（図８）。ＥＬＩＳＡとウエスタンブロットとの間に一部わずかな違い（例えば、基準Ａｂ−２によるＩ９３Ａ及びＥ１０３Ａ上のＥＬＩＳＡ結合シグナルはウエスタンブロットにおけるそれらよりも比較的強かった）もあった。これは、これらのＡＡ残基が、変異されたときにストレス条件下においても（すなわち、変性又は天然の構造を失うこと）結合に影響を与えたことから、結合に寄与し得ることを示すかもしれない。表２２にまとめたように、本発明において、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、他の抗ＰＤ−１抗体とは異なる識別可能な結合エピトープを有している。

実施例１２ 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、異種移植マウスモデルにおいて初代ヒトＰＢＭＣを活性化し、腫瘍増殖を阻害する

ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体はヒトＰＢＭＣを活性化する

ヒト化プロセス全体を通して、様々な段階におけるヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び、免疫細胞系サイトカイン放出アッセイによって評価したように同様の機能的活性を保持した。ヒト化モノクローナル抗体の最終版の機能を確認するために、我々は、初代ヒトＰＢＭＣを使用してｈｕ３１７−４Ｂ５、ｈｕ３１７−４Ｂ６、ｈｕ３２６−３Ｂ１及びｈｕ３２６−４Ａ３の活性化機能をアッセイした。結果は、これらのモノクローナル抗体がヒト化を通じて、活性化の程度は個々の遺伝的バックグラウンドの違いに起因して４つのドナー間で異なるが、初代ＰＢＭＣを活性化する元のマウスのモノクローナル抗体機能を維持したことを実証した。

ヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、癌細胞に対するＮＫ細胞系細胞毒性を増強する

元のマウスモノクローナル抗体からのヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、ｈｕ３１７−４Ｂ５、ｈｕ３１７−４Ｂ６、ｈｕ３２６−３Ｂ１及びｈｕ３２６−３Ｇ１は、標的肺癌細胞、ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＤ−Ｌ１に対するＮＫ９２ＭＩ／ＰＤ−１細胞媒介性細胞毒性を用量依存的に増強する（図１０、表２３）。原理的には、ヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＤ−１シグナル伝達によって媒介される免疫細胞寛容を破壊して、ＮＫ細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球等の免疫細胞による癌死滅活性を増強するよう機能する可能性が明らかになった。

ヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、マウス異種移植片癌モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰＢＭＣを活性化し、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍増殖を阻害する

全ての実験証拠は、上記抗ＰＤ−１モノクローナル抗体が、ヒト癌細胞を異種移植した免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを移植し、モノクローナル抗体処理を行ってｉｎ ｖｉｖｏでの癌細胞増殖を阻害するマウス癌モデルにおいて作用し得ることを示した。次の通り実験を設計した。７〜８週齢のＳＣＩＤ−雄マウス（バイタル・リバー・ラボラトリーズ、中国）を５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｓｅｙ，ＵＳＡ）中で３×１０^６のＨｅｐ３Ｂ／ＯＳ８−ＰＤ−Ｌ１細胞を右脇腹に皮下接種した。腫瘍接種後１５日経過した時点で、大きさ１００−２５０ｍｍ^３の腫瘍を有するマウスを無作為化し、３つの処置群に分けた。２人の健康なドナーからプールされたＰＢＭＣ（５×１０^５）１００μｌを腫瘍内に注入した。ＰＢＭＣを移植してから３日後、抗ＰＤ−１抗体（Ｈｕ３１７−ＩｇＧ４ｍｔ２）およびヒトＩｇＧを皮下経由でそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与した。抗体処置は、１０日に１回で総３回繰り返した。ＰＢＳを陰性対照群として並行群に注射した。７日目から週２回キャリパーで腫瘍を測定した。腫瘍体積は、以下の式を用いて算出した：［Ｄ×（ｄ^２）］／２（Ｄは腫瘍の大きな直径を表し、ｄは小さな直径を表す）。すべての動物研究は、Ｂｅｉｇｅｎｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従って行った。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究では、対照群における腫瘍の６０％が自動回帰したが、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験の残りは、依然として、かなり参考になり、それを図１１に示した。対照群（ビヒクル処置群又はヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）処置群）それぞれは出発点のベースラインよりも４０％の腫瘍（５匹のマウスのうち２匹）成長（増殖）がみられた。ＰＢＳ処置群の２つの腫瘍はより大きく成長した（２０００ｍｍ^３超、プロトコルによって腫瘍サイズ制限を超えた１匹の腫瘍マウスは早めに終了させた）。ｈｕＩｇＧ処置群の２つの腫瘍は、ＰＢＳ処置群のサイズよりは小さいものの、平均ベースライン１６４ｍｍ^３を有意に超える、８００〜１３７０ｍｍ^３にまで成長した。一方で、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｈｕ３１７−１／ＩｇＧ４ｍｔ２）処置群では、腫瘍が完全に回帰したか、ベースラインのサイズに近くなっていた（一つの腫瘍＝２００ｍｍ^３、これはＰＢＭＣ移植から２週間の時点でベースラインの５０％まで回帰した後、ゆっくりと元の状態に戻った）。この結果は、前述した抗ＰＤ−１抗体がマウスのｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおける腫瘍細胞増殖を阻害するヒト免疫細胞を活性化することを示すが、これは、前述したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験結果に一致するものである。

Claims (2)

1. ヒトＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体であって、
   ＰＤ−１結合ドメインと、ＩｇＧ４重鎖エフェクター又は定常領域が配列番号８５若しくは８８を含むＩｇＧ４Ｆｃ領域とを含む、抗体。
2. 癌若しくはウイルス感染症を有するとの判定を受けた患者における、癌又はウイルス感染症の治療に使用するための請求項１に記載の抗体。