JP6782450B2 - 青系花色を有するキクの作出方法 - Google Patents

Description

本発明は、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させるための発現カセット、該発現カセットを含むベクター及び形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部（特に切り花）もしくはその加工品（特に切り花加工品）、組織又は細胞、ならびに青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法に関する。

キク、バラ、カーネーション、ユリ等は世界的に産業上重要な花きである。特にキクは世界の花き産業においてバラに次ぐ市場規模を有し、日本国内では切り花産出量の４割、産出額の３割を占める第１位の花きである。しかしながら、上記主要花きでは、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなどの問題により、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色を有する品種の作出は困難であった。全く新しい青系花色の創出は、花きの利用場面の拡大に伴う新たな需要を喚起し、生産や消費の拡大に繋がる。そこで、遺伝子工学的手法により青系花色をもつ花きが作出され、カーネーションとバラでは市販されるに至っている。ただ、これまでの青系花色を目指した花色改変では、紫色（RHSカラーチャート色相グループ：Purpleグループ）や青紫色（Purple-Violetグループ, Violetグループ）が限界であり、紫青色（Violet-Blueグループ）や青色（Blueグループ）の花色をもつ青色の花きは作出されていない。したがって、青色の花きは、リンドウ、デルフィニウムやブルースターなどに現在も限られており、真に青色の花色をもつ花きの作出を可能にするための青色発現制御技術の開発が依然として望まれている。

花の青色化を目指した花色改変において、導入される遺伝子としてはF3′5′Hが知られている（特許文献１）。F3′5′H単独または、内在性のF3′HやDFRの発現を抑制するコンストラクトと共に導入し，花弁のアントシアニンをデルフィニジン型にすることで青色方向に花色を改変できる（図１）。キクではCamF3′5′H（非特許文献１，特許文献２）を導入すると、色相角315°程度の紫色（RHSカラーチャート Violetグループ 83）または青紫色（Violetグループ 88）に改変されることが知られている（特許文献３，非特許文献２)。また、パンジーF3′5′H（特許文献１）の発現と内在性F3′Hの抑制で得られるキクでは、紫色（Purple-Violetグループ N82）や青紫色（Violetグループ 84）になることが知られている（特許文献４，非特許文献３)。さらに、A3′5′OMT（特許文献５）とCamF3′5′Hを共発現してマルビジン型アントシアニンを合成・蓄積させると、より青色側の色相角305°〜315°（青紫色）を示すキクが得られる（非特許文献４）。カーネーション（非特許文献５)、バラ(特許文献６，非特許文献６)、ユリ（特許文献７）、ダリア(非特許文献７）、コチョウラン（特許文献８，特許文献９）でも同様に紫色や青紫色の花を持つ形質転換体を作出できることが報告されている。

F3′5′H、A3′5′OMT等を用いた従来の青色化技術では、紫色や青紫色の花色を作出できるが、Violet-BlueグループやBlueグループで色相角230°〜290°を示す本当に青色の花色をもつ形質転換体は作出できない。また花の様々な青色発現機構が解明され（非特許文献８）、それらに関与する遺伝子として、分子内会合を引き起こす芳香族有機酸によるアントシアニンのポリアシル化（図２）（特許文献１０，特許文献１１，特許文献１２，特許文献１３，特許文献１４，非特許文献９)、分子間会合を引き起こすアントシアニンと補助色素（コピグメント）の合成（特許文献１５，特許文献１６，特許文献１７）、液胞内pHの調整（特許文献１８，特許文献１９）、液胞への金属イオンの輸送（特許文献２０，非特許文献１０）、金属錯体構成フラボンの合成（特許文献２１）等を担う遺伝子も報告されているが、これらを導入した花きの青色化の成功例はない。また、芳香族有機酸によるポリアシル化はアントシアニンの糖残基に起きるが、この糖残基の付与を担うチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）が報告されている（特許文献２２）。かかる遺伝子をデルフィニジン3-グルコシドを蓄積する藤色のロベリアに導入した結果、青色に花色が変化したことが報告されているが、花弁に蓄積しているアントシアニンの約７０％は、ロベリア内在性の3′−アシル基転移酵素（3′AT）および5′ATの働きにより、3′位,5′位のグルコシル基が芳香族アシル基により修飾されていた。このポリアシル化アントシアニンの蓄積がロベリアの青色への花色改変の要因であることから、CtA3′5′GT導入による青色花の作出には、Ct3′ATなどの芳香族アシル基転移酵素遺伝子を共発現させることの必要性が示されている（非特許文献１１）。事実、キクにCtA3′5′GTだけ導入したとしても、青色化は達成されないことが判明している（参考例１，２）。
青色発現機構を再現するためには複数の遺伝子を組み合わせて、その全ての遺伝子を機能させる必要があるが、導入する宿主で機能するとは限らないため、青色発現機構の解明やそれを担う遺伝子の報告例だけでは、真に青色の花を作出できるとは言えない。

国際公開第2004/020637号 国際公開第2013/157502号 国際公開第2010/122849号 国際公開第2009/062253号 国際公開第2003/062428号 国際公開第2005/017147号 国際公開第2012/036290号 特許第5285304号公報 国際公開第2008/136434号 特許第4853853号公報 特許第4982782号公報 国際公開第1996/025500号 国際公開第2006/046780号 国際公開第2011/016260号 国際公開第2008/156211号 国際公開第2008/156214号 国際公開第2008/156206号 国際公開第2001/14560号 特許第507282号公報 特許第4958247号公報 国際公開第2012/096307号 特許第4418865号公報

Biosci. Biotechnol. Biochem. (2003) 67:161 Plant Cell Physiol (2013) 54:1684 Plant Cell Physiol (2013) 54:1696 ICP2014:251 Phytochemistry (2003) 63:15 Plant Cell Physiol (2007) 48:1589 農耕と園藝(2012)10月号 p.42，農業技術体系追録第15号330の1の192 Nat Prod Rep (2009) 26:857 Plant Cell Physiol (2015) 56:28 Plos one (2012)7:e43189 日本植物細胞分子生物学会つくば大会・シンポジウム講演要旨集（2006）p.40

本発明が解決しようとする課題は、青系花色を有する形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供することである。

本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させると、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角：230°〜290°）を有する形質転換キク植物が得られることを発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
[１] 以下の（１−ａ）〜（１−ｅ）：
（１−ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（１−ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
以下の（２−ａ）〜（２−ｅ）：
（２−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（２−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
[２] 前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター及び第１のターミネーター、ならびに前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び第２のターミネーターをさらに含む、[１]に記載の発現カセット。
[３] 前記第１のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第１のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、[２]に記載の発現カセット。
[４] 前記第２のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、[２]又は[３]に記載の発現カセット。
[５] [１]〜[４]のいずれかに記載の発現カセットを含むベクター。
[６] [１]〜[４]のいずれかに記載の発現カセットを含む形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[７] 花弁においてチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）が共発現している、[６]に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[８] デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及び／またはデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）を含有する、[６]又は[７]に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[９] [６]〜[８]に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
[１０] 青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法であって、
宿主に以下の（１−ａ）〜（１−ｅ）：
（１−ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（１−ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び／又は
以下の（２−ａ）〜（２−ｅ）：
（２−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（２−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法。
[１１] [１]〜[４]のいずれかに記載の発現カセット又は[５]に記載のベクターで宿主を形質転換することによって行われる、［１０］に記載の方法。
[１２] 前記青系花色が、RHSカラーチャートでBlueグループ又はViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL^*a^*b^*表色系の色相角で230°〜290°を示す、[１１]に記載の方法。
[１３] [１０]〜[１２]のいずれかに記載の方法によって作成された形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[１４] [１３]に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。

本発明により得られた青色花形質をもつキク形質転換体の花弁アントシアニンを分析した結果、新たに合成された主要アントシアニンは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5），微量アントシアニンは、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5），デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド，デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド，シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドであり、分子内会合により青色発現をする芳香族有機酸でポリアシル化されたアントシアニンなどは検出されなかった。すなわち、本発明により、アントシアニン3′位及び5′位を水酸化及び配糖化するだけで、キクに青色の花色形質を付与することができる。本発明は、青色発現に必要とされてきた芳香族アシル基によるポリアシル化を必要としない従来の理論や技術とは全く異なる青色発現制御技術に基づく。

F3′5′H導入によりキク花弁で合成されるデルフィニジン配糖体を示す。 分子内会合を引き起こす芳香族有機酸によるアントシアニンのポリアシル化（チョウマメのテルナチン生合成の例）を示す。 青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンのHPLC-MS分析結果を示す。 青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンの化学構造とLC-MS/MS分析結果を示す。 CamF3′5′H及びCtA3′5′GTを導入したキク花色の青色化を示す写真、及び青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンのHPLC分析結果である。 CtA3′5′GTを導入したキク花色を示す写真である。

本発明は、以下の（１−ａ）〜（１−ｅ）：
（１−ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（１−ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
以下の（２−ａ）〜（２−ｅ）：
（２−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（２−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット、に関する。

本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、本発明の発現カセットにおいて、第１のポリヌクレオチドは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵又はその類似体をコードし、そして、第２のポリヌクレオチドは、カンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素又はその類似体をコードする。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。

アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素は、アントシアニンの3′位及び5′位水酸基に糖を逐次的に転移する反応を触媒する酵素であり、チョウマメの青色花弁から見出されている。チョウマメの花弁は、アントシアニンの水酸基のうち3′位及び5′位がともに配糖化され、さらに芳香族アシル基による修飾を受けたポリアシル化デルフィニジンが蓄積することにより、青色に発色していると考えられている。また、フラボノイド3′,5′-水酸化酵素は、フラボノイドの3′位及び5′位を水酸化する酵素であり、カンパニュラの青色花弁などから見出されている。F3′5′Hが発現した花弁では、デルフィニジン型アントシアニンが多く蓄積し、これにより藤色、紫色、青紫色や青色に発色することが可能になっていると考えられている。しかしながら、キク植物は、アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素をコードする遺伝子およびフラボノイド3′,5′-水酸化酵素をコードする遺伝子をともに有していない。また、キクは六倍体という高次倍数性を有し、かつゲノムサイズも大きいことから、形質転換効率が低いのに加えて、導入遺伝子のサイレンシング（不活化）が起こることもあり、これらの遺伝子を導入して、安定に発現する遺伝子組換えキクを得ることは容易ではない。さらに、CtA3′5′GT又はCamF3′5′Hのいずれかを導入したとしても、花弁の青色化は生じず、これまでに青系花色を有する形質転換キク植物は知られていない。

本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。

ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。

上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。

本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。

また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（バージョン9.5 Oxford Molecular Ltd.,Oxford,England）のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。本発明において、各アミノ酸配列間の「同一性」の程度は、例えば、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上である。

生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするポリヌクレオチドは生来の塩基配列を有するポリヌクレオチドを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいポリヌクレオチド断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したポリヌクレオチド断片を得る。その後、この変異を導入したポリヌクレオチド断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするポリヌクレオチドを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたポリヌクレオチド断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。

また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドが所望の活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物である所望の活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いても、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のアントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。同様に、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いても、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。

本明細書中、「発現カセット」は、ポリヌクレオチドにプロモーターとターミネーターが任意に連結したポリヌクレオチド断片を意味する。本発明の発現カセットは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵又はその類似体をコードする第１のポリヌクレオチド、及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素又はその類似体をコードする第２のポリヌクレオチドに、それぞれ、作動可能に連結された第１のプロモーター及び／又は第１のターミネーター、ならびに、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び／又は第２のターミネーターをさらに含むことができる。

本発明の発現カセットに用いられるプロモーター及びターミネーターは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させることができる限り特に制限されないが、前記第１のプロモーターは、好ましくはキクF3Hプロモーター、特にはキクF3H1k及びキクF3H500であり、前記第１のターミネーターは、好ましくはアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターであり、前記第２のプロモーターは、好ましくはキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターは、好ましくはアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである。

本発明は、前記発現カセットを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換されたキク植物にも関する。

さらに、本発明は、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記第１のポリヌクレオチド、及び／又はフラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする前記第２のポリヌクレオチドを外因性ポリヌクレオチドとして宿主に導入することによって得られる形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞に関する。ポリヌクレオチドの導入は、宿主を本発明の発現カセット又はベクターで形質転換することによって達成できる。あるいは、宿主において、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）又はカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）のいずれかが発現している場合には、前記第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドのうち、一方を宿主に導入するだけでよい。

現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させるために、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。

本明細書中、用語「キク植物（単に「キク」ともいう）」とは、キク科（Asteraceae）のキク属（Chrysanthemum）の植物を意味する。キク属（Chrysanthemum）には、一般に野菊と呼ばれる、ノジギク（C. japonense）、チョウセンノギク（C. zawadskii var. latilobum）、ハイシマカンギク（C. indicum var. procumbens）、イワギク（C. zawadskii）、イソギク（C. pacificum）などがある。そして一般にイエギクや栽培ギクとも呼ばれ、野生種間の交雑などによりスプレイ菊、大菊、小菊などの多様に品種改良された、キク（Chrysanthemum morifolium；旧種小名：Dendranthema grandiflora，Chrysanthemum grandiflorum））がある。本発明において宿主に用いられるキク植物の種類については特に制限されず、スプレイ菊、輪菊，ポットマムなど仕立て用途の違いで選抜・育種された様々なキクの品種・系統や、アネモネ咲き、デコラ咲き、ポンポン咲き，デージー咲き（一重咲き）など花形の違いを有する多様なキクの品種・系統を用いることができる。以下の実施例においても、宿主としてセイショール（S39）,大平, T27，セイアラベラ（T34），T37, カンデラティエラ，T10, T24, T44, T57 といった多様な品種・系統（色相角の平均値：55°程度〜0°（360°）〜337°程度；RHSカラーチャート：49C-DのRedグループ〜Red-Purpleグループ〜75B-Cの Purpleグループ）においても、RHSカラーチャート第５版（英国王立園芸協会）でBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、又は色彩色差計や色彩分光計などで測定して得られるCIEL^*a^*b^*表色系の色相角で230°〜290°の青系花色を示すことが実証されている。

宿主に用いたRedグループ、Red-Purpleグループ及びPurpleグループの花色を示すキク植物の主要アントシアニンは、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドである。カンパニュラなどのF3′5′H遺伝子を導入し機能させることで得られる形質転換キクの主要アントシアニンは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドであり、微量のデルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドも含まれる。シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドの可視吸収極大波長は518nmであるのに対し、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドでは527nmである。この長波長側へのシフトによってデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドを主要に含む形質転換キクは紫色や青紫色を示す。一方、カンパニュラF3′5′H遺伝子とともにチョウマメA3′5′GT遺伝子をキク花弁で発現させることにより作出された青いキクは、主要色素としてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）を含み、微量色素としてテルナチンC5の脱マロニル体であるデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド、そしてシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドを含むことが判明した。青いキクの主要アントシアニンであるデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）は、可視吸収極大波長が512nmであり、もとの赤やピンク色の主要アントシアニンであるシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドよりも短波長側にシフトしていた。これは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）はもとの色素よりも赤いにもかかわらず、キクの花弁を青色にしていることを意味する。したがって、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）とキクの内在性のコピグメント物質などが相互作用することなどにより、花弁は青色発現していると考えられるが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）のようなアントシアニンB環の3′位及び5′位水酸基がともに配糖化された赤色アントシアニンが青色発現をする例はこれまで報告されておらず、本発明は、青色発現に必要とされてきた芳香族アシル基によるポリアシル化を必要としない従来の理論や技術とは全く異なる青色発現制御技術に基づくものである。

さらに、本発明は、上記で得られた形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001)に依った。増幅したPCR産物やクローニングにより得られたプラスミドはDNA配列にエラーがないことを塩基配列を確認することにより決定した。

［実施例１：キク品種「大平」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
鋳型にpBluescript SK- gF3H9(菅野ら（2001）園学雑70（別2）193）を用い、HANS-F3Hpro1k-Fd（5′-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号５）とSNM-F3Hpro-Rv（5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号６）をプライマーに用いたPCRにより、5′側にHindIII, AscI, NotI, SwaI制限酵素サイト、3′側にSpeI, NheI制限酵素サイトを付加したCmF3Hプロモーター1kを含むDNA断片を増幅し、pGEM-T easy (Progemga）にTAクローニングした後、HindIIIとSpeIで消化してDNA断片を得た。
pBI221を鋳型に、SSS-NOSter-Fd（5′-GAGCTCACTAGTGTCGACGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3′；下線部はNOSターミネーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号７）とESP-NOSter-Rv（5′-CGAATTCAGGCCTGTTTAAACGATCTAGTAACATAGATGACAC-3′；下線部はNOSターミネーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号８）をプライマーに用いたPCRにより、5′側にSacI, EcoICRI(Ecl136II), SpeI, SalI制限酵素サイト、3′側にPmeI, SrfI, EcoRI制限酵素サイトを付加したアグロバクテリウムnosターミネーターを含むDNA断片を増幅し、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングした後、SacIとEcoRIで消化し、アグロバクテリウムnosターミネーターを含むDNA断片を得た。
制限酵素サイトを付加したCmF3Hプロモーター1kのDNA断片及びNOSターミネーターのDNA断片それぞれを、pBI221のCaMV 35Sプロモーターを含むHindIII-XbaI領域、NOSターミネーターを含むSacI-EcoRI領域に入れ替えた後、HindIIIとEcoRIで消化して得られるHANS-CmF3Hp1k:GUS:NOSt-PSEカセットと、pSPORT2（Invitrogen）をHindIIIとEcoRIで消化して得られるプラスミド断片を連結して、バイナリーベクターに連続的に遺伝子発現カセットを結合させるためのエントリーベクターであるpMCE5を得た。

バイナリーベクターに連続的に遺伝子発現カセットを連結させるためのエントリーベクターpMCE5のプロモーター5′側の制限酵素サイトをHindIII, FseI, AscI, StuI, SwaIに改変するとともに、ターミネーターをアグロバクテリウムnosターミネーターからアラビドプシスheat shock proteins (HSP) 18.2ターミネーター（AtHSPter，Plant Cell Physiol. 51(2): 328-332 (2010)；配列番号３７）に入れ替えたpMCE5-2を作製した。AtHSPterの5′側にはEcoICRI，SacI, SpeI, SalI制限酵素サイトを3′側にはSrfI, SmaI, PmeI, EcoRI, KpnIを付与した。
pBluescript SK- gF3H9を鋳型に、hFAStSw-proCmF3H-Fd（5′-AAGCTTGGCCGGCCTAGGCGCGCCAGGCCTATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域のDNAにアニールする配列である；配列番号９）とSNM-F3Hpro-Rv（5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域のDNAにアニールする配列である；配列番号６）をプライマーに用いたPCRにより増幅したDNA断片をpCR-BluntII-TOPO（Life Technologies）にクローニングし、pCR-FASS-CmF3Hpro1k を得た。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化して得られるFASS-CmF3Hpro1kのDNA断片と、pMCE5をHindIIIとSpeIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結して、pMCE5-FASSを得た。
pCR-HSPを鋳型に、SSS-terHSP-Fd（5′-GAGCTCACTAGTGTCGACATATGAAGATGAAGATGAAAT-3′；下線部はAtHSPterとアニールするDNA配列である；配列番号１０）とKESP-terHSP-Rv (5′-GGTACCGGTCCGGAATTCGTTTAAACGCCCGGGCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC-3′；下線部はAtHSPterとアニールするDNA配列である；配列番号１１）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片をpCR-BluntII-TOPO（Life Technologies）にクローニングし、pCR-SSS-AtHSPter-PSEKを得た。このプラスミドをKpnIとSacIで消化して得たAtHSPterのDNA断片をpMCE5-FASSをSacIとKpnIで消化したベクターDNA断片と連結し、pMCE5-2を得た。

pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′Hを得た。このプラスミドをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットのDNA断片と、参考例２で得たpB249をAscIとSwaIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結することで、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Hood, E.E. et al. (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2, 208-218，Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、46系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、26系統（57%）で青色方向への花色の変化が認められた。色彩分光計による測定は最低３花弁を測定し、その平均値を算出した。色相角（Hue°）はarctan (b*/a*)、彩度（C*値）は(a² + b²)^1/2で算出した。そのうちの22系統（全体の48%）で、色相角290°以下の青色を示し、また22系統（全体の48%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。このCamF3′5′HをキクF3HプロモーターとアラビドプシスHSPターミネーターで発現させるとともに、チョウマメA3′5′GTをキクF3Hプロモーターで発現させるpB423が、最も単純な遺伝子導入コンストラクトであり、48%という高い割合で青いキクを得られた。また、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２−１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。

青色形質を付与されたキク品種「大平」に含まれるアントシアニンを液体クロマトグラフ・質量スペクトル（ACQUITY UPLC・タンデム四重極MS ACQUITY TQD，日本ウォーターズ）により分析した。溶媒Aに1%ギ酸含有蒸留水、溶媒Bに1%ギ酸含有アセトニトリルを用いた。溶媒の流速を0.1ml/分とし、0-5分間に溶媒Bを0から5%にし、5-20分間に5%から35%にし、その後20-25分間35%を維持するグラジエント溶出を行った。カラムにはガードカラムVanGuard（日本ウォーターズ）を連結した、ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm（2.1 i.d. × 100mm；日本ウォーターズ）を用い、カラム温度35℃で分析した。フォトダイオードアレイで得られたスペクトルデータを530nmで解析した結果、保持時間約9分（ピーク１）、10.5分（ピーク２）、12.7分（ピーク３）にアントシアニンのピークが認められた（図３）。それぞれの質量（[M+H]⁺）は、最も主要なピーク２がm/z 875、ピーク１がm/z 789、ピーク３がm/z 697であった。また、各ピークの吸収スペクトル測定、チョウマメより調整した標品との比較、LC-MS/MS分析（図４）などの結果より、ピーク１はデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、ピーク２はデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、ピーク３はシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドであり、導入したカンパニュラF3′5′HとチョウマメA3′5′GTの発現により目的とするアントシアニンの構造に改変された。また、主要色素であるデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）とデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積によりキクは青色を発現した。
デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドなど新たに合成されたアントシアニンの蓄積は、薄層クロマトグラフィー（TLC）によっても検出された。TLC Cellulose Glass Plate (10 X 20 cm, Millipore)の下から1.5cmの位置に10%酢酸花弁抽出液をスッポトし、風乾後、展開溶媒BAW（ブタノール：酢酸：水＝4:1:2（v/v/v））を入れた展開槽中で、原点から7cmの位置まで展開した。展開後、プレートを乾燥させ、蛍光灯下およびUV光（CSN-15AC，コスモバイオ，254/360nm）下で検出した。各アントシアニンのRf値は以下の通りであった。デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）：0.15、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）：0.11、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド：0.30
花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１に示す。

［実施例２：キク品種「セイアラベラ」（系統番号T34）へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク品種「セイアラベラ」（（有）イノチオ精興園；系統番号T34）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、34系統（72%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの27系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた。これらの系統では花色がRHSカラーチャートのBlueグループまたはViolet-Blueグループの色へと改変された。「大平」と同様に「セイアラベラ」でも72%という高い割合で青いキクを得られた。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２に示す。

［実施例３：キク系統「T37」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で小輪ポンポン咲きのキク系統「T37」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、97系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、58系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの9系統を用いて、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。それらの花色はViolet-Blueグループへと改変された。「大平」「セイアラベラ」と同様に「T37」でも60%という高い割合で青いキクを得られた。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表３に示す。

［実施例４：キク品種「大平」へのpB425の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
キクF3′H抑制カセット、CtAGS、CtA3′5′GT、DFR発現カセットなど複数の遺伝子抑制／発現カセットを連結するための、カンパニュラF3′5′H発現バイナリーベクターpB315（pBCam2）を作製した。pBI121-FASS-CmF3H1kをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pB315（pBI121-FASS-CmF3Hpro1k:NtADH-5′UTR-カンパニュラF3′5′H:NOSter；pBCam2）を得た。

参考例１で得たpBSII-ADH-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GTを得た。pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られる CmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットと、pB315をFseIとSwaIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結することで、pB425（pBCam2+CtA3′5′GT）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB425を導入したアグロバクテリウム（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、42系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、23系統（55%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの11系統（全体の26%）で、色相角290°以下の青色を示した。また12系統（全体の29%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。このように、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子とカンパニュラ由来F3′5′H遺伝子の２つの遺伝子を発現することで青いキクを作出することができる。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表４に示す。

［実施例５：キク品種「大平」へのpB433の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
ダッチアイリス（Iris hollandica）花被片由来のDFR遺伝子（Plant Cell Physiol 48 (2007) 1589，AB332098）を含むプラスミドpSPB909を鋳型に、IrisDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGATGAGCCCCGTTGTC-3′，下線部はIhDFRとアニールする配列；配列番号１２）とIrisDFR_NdeI Rv（5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；配列番号１３）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とIrisDFR_ORF_ADH_Rv（5′-GGGGCTCATCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１５）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とIrisDFR_NdeI Rv（5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；配列番号１３）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがダッチアイリスDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を増幅し、pCR-bluntII-TOPOにクローニングして、pCR-ADHNF-IhDFR-5′を得た。このプラスミドをSalIとEcoRVで消化して得られるDNA断片とpSPB909をSalIとEcoRVで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結することで、pUC El2-35Sp:ADHNF-IrisDFR:D8tを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、NheIで消化したDNA断片と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-IhDFRを得た。pMCE5-2-ADHNF-IhDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB433（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+IhDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB433を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、55系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、青色方向への花色の変化が認められた39系統（71%）のうちの31系統（全体の56%）で、色相角290°以下の青色を示した。また33系統（全体の60%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２−１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表５に示す。

［実施例６：キク品種「大平」へのpB434の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びデルフィニウムDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
デルフィニウム（Delphinium ×belladonna‘Volkerfrieden'）のがく片由来のDFR遺伝子を含むプラスミドpDbDFR4-8（GenBank accession no. AB221083）を鋳型に、DbDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGACTGTAGAAACTGTTTGTG-3′；下線部はDbDFRとアニールする配列である；配列番号１６）とDbDFR_NcoI_Rv（5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；配列番号１７）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とDbDFR_ORF_ADH_Rv（5′-TTCTACAGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１８）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とDbDFR_NcoI_Rv（5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１７）をプライマーに、DNAポリメラーゼにPrimeStar（タカラバイオ）を用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがデルフィニウムDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。この平滑末端の増幅産物にdAを付加する反応を行った後、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングして、pCR-ADHNF-DbDFR-5′を得た。このプラスミドをSmaIとNcoIで消化して得られる断片と、pDbDFR4-8をSmaIとNcoIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結し、pBS-ADHNF-DbDFRを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、SpeIで消化したDNA断片と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-DbDFRを得た。pMCE5-2 ADHNF-DbDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB434（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+DbDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB434を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、12系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、8系統（67%）で青色方向への花色の変化が認められ、8系統（全体の67%）が色相角290°以下の青色を示した。また7系統（全体の58%）が、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２−１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表６に示す。

［実施例７：キク品種「大平」へのpB435の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
チョウマメ（Clitoria ternatea ‘Double Blue'）の花弁由来のDFR遺伝子を含むプラスミドpBSCtDFR20（GenBank accession no. AB185901）を鋳型に、CtDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGATTCAGCAGCTGAAGTG-3′；下線部はCtDFRとアニールする配列である；配列番号１９）とCtDFR_SphI_Rv（5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；配列番号２０）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtDFR_ORF_ADH_Rv（5′-TGCTGAATCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２１）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtDFR_SphI_Rv（5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；配列番号２０）をプライマーに、DNAポリメラーゼにPrimeStar（タカラバイオ）を用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがチョウマメDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。この平滑末端の増幅産物にdAを付加する反応を行った後、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングして、pCR-ADHNF-CtDFR-5′を得た。このプラスミドをXbaIとSphIで消化して得られる断片と、pBSCtDFR20をXbaIとSphIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結し、pBS-ADHNF-CtDFRを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化したDNA断片(090616-2)と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-CtDFRを得た。pMCE5-2 ADHNF-CtDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB435（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+CtDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB435を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、34系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、28系統（82%）で青色方向への花色の変化が認められた。23系統（全体の68%）が色相角290°以下の青色を示し、また22系統（全体の65%）RHSカラーチャートでの測色でBlueグループまたはViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表７に示す。

［実施例８：キク品種「セイショール」（（有）精興園より提供を受けた品種を供試；系統番号S39）へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
キク‘アリエッタ’舌状花弁由来cDNAを鋳型に、CmF3′H_full_ORF_F（5′-ATGAACATTTTACCTTTCGTATTTTATG-3′；配列番号２２）とCmF3′H_full_ORF_R（5′-TTAAATACTTTCATATACGTGGG-3′；配列番号２３）をプライマーに、DNAポリメラーゼにLA Taqを用いたPCRで増幅したキクF3′H ORFをpCR2.1にTAクローニングし、pCR2.1-CmF3′H-ORF1を得た。このプラスミドを鋳型に、CmF3′H_3′-Fd for dsRNA（5′-CACCCCGAACTCATTCGTCATCCAC-3′；配列番号２４）とCmF3′H_3′-Rv for dsRNA（5′-TCAATCCATACGCTTCTTCCATG-3′；配列番号２５）をプライマーに用いたPCRにより増幅したRNAiのトリガーとなるDNA断片（配列番号３８）をpENTR-D/TOPO（Invitrogn）に連結して、pENTR-CmF3′H-Cを得た。pENTR-CmF3′H-CとpANDA35K（http://bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/pANDA_top.htm）をLR反応し、pANDA- CmF3′H-C IRを得た。このプラスミドをXbaIとEcoICRIで消化して得られる約2.5kbのDNA断片とpBI121-FASS-CmF3H1kをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB319（pBF3′H-Ci）を得た。
pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′Hを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB319のバイナリーベクター断片を連結し、pB332（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H）を得た。

pB332（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H）をFseIとSwaIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られる CmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結してpB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を得た。

pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク系で大輪デコラ咲きのキク品種「セイショール」（（有）精興園より提供を受けた品種；系統番号S39）を形質転換し、10系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、6系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認され、3系統（全体の30%）で、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認でき、花色はBlueグループまたはViolet-Blueグループへと改変された（図５）。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表８に示す。

［実施例９：キク系統「T27」へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で小輪ポンポン咲きのキク系統「T27」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、10系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、６系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの４系統（全体の40%）で、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた（図５）。これらの系統では花色がViolet-Blueグループへと改変された。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表９に示す。

［実施例１０：キク品種「セイアラベラ」（系統番号T34）へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク品種「セイアラベラ」（（有）イノチオ精興園；系統番号T34）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、3系統(100%)で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの2系統（全体の67%）で、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド 3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン 3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた（図５）。これらの系統の花色はViolet-Blueグループへと改変された。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２−１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１０に示す。

［実施例１１：キク系統「T57」へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク系統「T57］（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、1系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、青色方向への花色の変化が確認され、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド 3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン 3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた。この系統の花色はViolet-Blueグループへと改変されており、測色値を以下の表１１に示す。

［実施例１２：キク品種「大平」へのpB436の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例５で得たpMCE5-2 ADHNF-IhDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB436（pBCam2+CtA3′5′GT+IhDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB436を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、57系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、32系統（56%）で青色方向への花色の変化が認められた。16系統（全体の28%）で、色相角290°以下の青色を示し、また14系統（全体の25%）でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１２に示す。

［実施例１３：キク品種「大平」へのpB437の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びデルフィニウムDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例６で得たpMCE5-2 ADHNF-DbDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB437（pBCam2+CtA3′5′GT+DbDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB437を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、38系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、21系統（55%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの9系統（全体の24%）で、色相角290°以下の青色を示し、また8系統（全体の21%）でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１３に示す。

［実施例１４：キク品種「大平」へのpB438の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びチョウマメDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例７で得たpMCE5-2 ADHNF-CtDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB438（pBCam2+CtA3′5′GT+CtDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB438を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、55系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、34系統（62%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの13系統（全体の24%）で、色相角290°以下の青色を示した。また18系統（全体の33%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１４に示す。

［実施例１５：キク品種「大平」へのpB426の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でデルフィニウムDFR遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例６で得たpMCE5-2 ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pBCam2+DbDFRを得た。このバイナリーベクターをFseIとSwaIで消化して得られるDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られるCmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結し、pB426（pBCam2+DbDFR+CtA3′5′GT）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB426を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、28系統（60%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの9系統（全体の19%）で、色相角290°以下の青色を示し、また10系統（全体の21%）でRHSカラーチャートでの測色ではViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１５に示す。

［実施例１６：キク品種「大平」へのpB427の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメDFR遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例７で得たpMCE5-2 ADHNF-CtDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pBCam2+CtDFRを得た。このバイナリーベクターをFseIとSwaIで消化して得られるDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られるCmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結し、pB427（pBCam2+CtDFR+CtA3′5′GT）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB427を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、24系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、15系統（63%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの4系統（全体の17%）で、色相角290°以下の青色を示し、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１６に示す。

［実施例１７：キク品種「大平」へのpB419の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメAGS遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
pBSII-ADH-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB420（pBCam2+CtAGS；参考例４）のバイナリーベクター断片を連結し、pB419（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB419を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、20系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、12系統(60%)で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの5系統(全体の25%)で、色相角290°以下の青色を示した。また、3系統(全体の15%)でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１７に示す。

［実施例１８：キク品種「大平」へのpB432の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメAGS遺伝子、チョウマメA3′5′GT遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
pMCE5-2- ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB419（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT）のバイナリーベクター断片を連結し、pB432（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT+IhDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB432を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、23系統（49%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの12系統（全体の26%）で、色相角290°以下の青色を示した。また13系統（全体の28%）でRHSカラーチャートのBlueグループまたはViolet-Blueグループの色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１８に示す。

［実施例１９：キク品種「セイショール」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で大輪デコラ咲きのキク品種「セイショール」（（有）イノチオ精興園）を形質転換し、2系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（50%）で色相角290°以下でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１９に示す。

［実施例２０：キク品種「カンデラティエラ」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でデコラ咲きのキク品種「カンデラティエラ」（（有）イノチオ精興園）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（33%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２０に示す。

［実施例２１：キク系統「T10」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、紅色系でデコラ咲きのキク系統「T10」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（33%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２１に示す。

［実施例２２：キク系統「T24」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で大輪咲きの厚物キク系統「T24」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、4系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（25%）で色相角290°以下でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２２に示す。

［実施例２３：キク系統「T27」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でポンポン咲きのキク系統「T27」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、21系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、11系統（52%）で色相角290°以下を示し、17系統（81%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２３に示す。

［実施例２４：キク系統「T44」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でポンポン咲きのキク系統「T44」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、12系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、4系統（33%）で色相角290°以下を示し、3系統（25%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２４に示す。

［実施例２５：キク系統「T57」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でデコラ咲きのキク系統「T57」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、2系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、2系統(100%）で色相角290°以下を示し、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２５に示す。

［参考例１：キク系統「94-765」へのpB248の導入（キクF3Hプロモーター500及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
チョウマメA3′5′GT遺伝子を含む、特許第4418865号に記載のpBSCtBGT1DB24プラスミドを鋳型に、ADH-3′5′GT-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGAAAACAATAAGCATGTC-3′；下線部はCt3′5′GTコード領域とアニールする配列である；配列番号２６）とHind-Ct3′5′GT-Rv（5′-AAGCTTGCGTTTTTAGCATCATTC-3′；配列番号２７）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCt3′5′GT-ADH-Rv（5′-ATTGTTTTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２８）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-FdとHind-Ct3′5′GT-Rvをプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがチョウマメA3′5′GT遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとHindIIIで消化して得られる約600bpのDNA断片を、pBlueScript II SK (+)をXbaIとHindIIIで消化して得られるベクターのDNA断片と連結して、pBSII-ADH-5′-CtBGT1-HindIIIを得た。このプラスミドをHindIIIとXhoIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pBSCtBGT1DB24をHindIIIとXhoIで消化して得られるDNA断片を連結し、pBSII-ADH-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドを鋳型に、NheI-ADH-Fd2(5′-GCTAGCGTCTATTTAACTCAGTATTCAGAAAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２９)とCt3′5′GT-SacI-Rv(5′-GAGCTCTTAGCTAGAGGAAATCATTTCCAC-3′；下線部はCt3′5′GTコード領域とアニールする配列である；配列番号３０)をプライマーに用いてPCRにより増幅した平滑末端のDNA産物を、pCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen）にクローニングしてpCR ADHNF-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドをNheIとEcoICRIで消化して得られる約1450bpのADHNF-CtA3′5′GT DNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp500-X（特許第5697040号）をXbaIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結して、pB248（pBI121 CmF3Hp500:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB248を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、23系統の形質転換体を得た。そのうち、15系統の舌状花弁に含まれるアントシアニン色素を高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2（粒径5μm, 4.6×250mm, ジーエルサイエンス）を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、5%酢酸、6.25%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配20分間の後、1.5%リン酸および20%酢酸を含む25%アセトニトリルで5分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100 シリーズ ダイオードアレイ検出器（ジーエルサイエンス）を用い、250nmから600nmの波長領域を検出した。分析の結果、12系統で、宿主花弁の主要アントシアニンであるシアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素、シアニジン3-(6-マロニル）グルコシド-3′-グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシド-3′-グルコシド（それぞれのHPLC分析の溶出時間（tR）：9.4分及び7.2分）をもつことが確認された。しかし、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれの形質転換系統もRHSカラーチャートのRed-Purpleグループの花色を示した（表２６）。キクF3Hプロモーター500（長さ約500b）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった(図６）。

［参考例２：キク系統「94-765」へのpB249の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
pBI121 HANS-CmF3Hp1k-S（特許第5697040号）をSpeIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片と、pCR ADHNF-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られる、ADHNF-チョウマメA3′5′GTのDNA断片を連結してpB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB249を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、25系統の形質転換体を得た。そのうち、18系統で舌状花弁に含まれるアントシアニン色素を参考例１の方法で分析した結果、17系統で、シアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素をもつことが確認された。また、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれもRed-Purpleグループの花色を示した（表２７）。F3Hプロモーター1k（長さ約1kb）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった（図６）。

［参考例３：キク系統「94-765」へのpB250の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子、チョウマメ由来AGS遺伝子、及びチョウマメ由来A3′AT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
チョウマメ1-O-アシルグルコース合成酵素（CtAGS，UDP-グルコース：ヒドロキシ桂皮酸1-O-グルコシル基転移酵素，図２）をコードするCtAGS遺伝子を含む、特許第4418865号に記載のpBSII-CtGT11-4-14を鋳型に、ADH-CtHCAGT-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3′；下線部はCtAGS遺伝子コード領域とアニールする配列である；配列番号３１)とStuI-CtHCAGT-Rv（5′- AGGCCTCATGTTCACAAACTTC-3′；配列番号３２）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtHCAGT-ADH-Rv（5′-TTCAGACCCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号３３）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号１４）とStuI-CtHCAGT-Rv（配列番号３２）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがCtAGS遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片を、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングした後に、XbaIとStuIで消化して得られる約850bpのDNA断片と、pBSII-CtGT11-4-14をXbaIとStuIで消化して得られるベクター断片を連結し、pBSII-ADH-CtAGSを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクター断片を連結して、pMCE5-ADH-AGSを得た。このプラスミドをAscIとPmeIで消化して得られる、遺伝子発現カセットAscI-CmF3Hp1k:NtADH-5′UTR:CtAGS:nost-PmeIのDNA断片と、pB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）をSwaIとAscIで消化して得られるバイナリーベクターDNA断片pMCE5-ADH-CtAGSを連結し、pBI121-CtBGT+AGSを得た。

3′AT活性および5′AT活性（図２）をもつと考えられるチョウマメA3′AT遺伝子を含む特許第4418865号に記載のCtSCPL1 cDNAクローンの１つであるpBSII-CtAT1-19を鋳型に、ADH-CtAT1-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGCAGCCTTCAGTTCAAC-3′；下線部はCtAT1にアニールする領域である；配列番号３４）とPst-CtAT1-Rv(5′-CTGCAGCATCTGTTCTAGCATAA-3′；配列番号３５) をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtAT1-ADH-Rv（5′-GAAGGCTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号３６）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号１４）とPst-CtAT1-Rv（配列番号３５）をプライマーに用いたPCRにより、NtADH-5′UTR 94bpがCtAT遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を増幅した。このDNA断片をXbaIとPstIで消化し、pBSII-CtAT1-19をSpeIとPstIで消化して得られるDNA断片と連結してpBSII-ADHNF-CtAT1-19を得た。このプラスミドをNotIとXhoIで消化して得られる約1.6kbのDNA断片と、EcoRIで消化した後にセルフライゲーションして環状化させたpCR2.1をNotIとXhoIで消化して得られるプラスミド断片を連結して、pCR-ADHNF-CtAT1-19を得た。また、pBSII-ADHNF-CtAT1-19をEcoICRIとSalIで消化して得られる約1.6kbのDNA断片と、SmaIとSalIで消化したpMCE5プラスミドのDNA断片を連結して、pMCE5-ADH-CtAT1を得た。

pBI121-CtBGT+AGSをSwaIとAscIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpMCE5-ADH-CtAT1をAscIとPmeIで消化して得られる、発現カセット（AscI-CmF3Hp1k:NtADH-5′UTR:Ct3′AT:nost-PmeI）のDNA断片を連結し、キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーターの制御によりチョウマメA3′5′GT、チョウマメAGS及びチョウマメ3′ATを共発現させるためのバイナリーベクターpB250を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB250を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、11系統の形質転換体を得た。そのうち、9系統で舌状花弁にもとのアントシアニン色素、シアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素をもつことが参考例１と同じ分析方法で確認されたが、チョウマメ由来AGS、及びチョウマメ由来A3′ATの遺伝子産物の働きにより、芳香族アシル基による修飾を受けたシアニジン配糖体を花弁に蓄積した系統は得られなかった。また、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれもRed-Purpleグループの花色を示した（表２８）。キクF3HプロモーターでチョウマメのA3′5′GT遺伝子、アシルグルコース合成酵素遺伝子、及びA3′AT遺伝子を発現させる方法では青いキクは得られなかった（図６）。

［参考例４：キク品種「大平」へのpB420の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子とチョウマメ由来AGS遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
参考例３で得たpBSII-ADH-CtAGSをXhoIで消化した後に平滑末端処理をし、その後XbaIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtAGSを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315（pBCam2）のバイナリーベクター断片を連結し、pB420（pBCam2+CtAGS）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB420を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、40系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、17系統で青色方向への花色の変化が認められた。しかし、最も青みの強い系統でも色相角317度で、RHSカラーチャートのPurple-Vioretグループの花色を示し、F3′5′H遺伝子のみ発現させた場合と同程度であった（表２９）。F3′5′H遺伝子にチョウマメ由来のアシルグルコース合成酵素遺伝子（CtAGS）を共発現させる導入遺伝子コンストラクトでは、色相角230°〜290°かつ／又はViolet-Blueグループ／Blueグループの花色を示す青いキクは得られなかった。

［参考例５：キク品種「大平」へのpB430の導入（キクF3Hプロモーター1kおよびアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子、チョウマメ由来AGS遺伝子，及びダッチアイリス由来DFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
pMCE5-2- ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB420（pBCam2+CtAGS）のバイナリーベクター断片を連結し、pB430（pBCam2+CtAGS+IhDFR）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB430を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、54系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、33系統（63％）で青色方向への花色の変化が認められた。しかし、最も青みの強い系統の色相角は315度で、RHSCCでの測色でもVioletグループまたはPurple-Vioretグループの系統しか得られず、F3′5′H遺伝子のみ発現させた場合と花色の変化は変わらなかった（表３０）。F3′5′H遺伝子にチョウマメ由来のアシルグルコース合成酵素遺伝子（CtAGS）及びダッチアイリス由来DFR遺伝子を共発現させる導入遺伝子コンストラクトでは、色相角230°〜290°かつ／又はViolet-Blueグループ／Blueグループの花色を示す青いキクは得られなかった。

［参考例６：キク品種「大平」へのpB249の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
参考例２に従って、pB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。

［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
pB249を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」を形質転換し、26系統の形質転換体を得た。もとの「大平」と大きく花色の変化した系統は得られず、やや花色の変化が認められた系統でもPurpleグループ75の花色を示した（表３１）。参考例２の「94-765」の場合と同じく、F3Hプロモーター1k（長さ約1kb）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった。

Claims (14)

1. 以下の（１−ａ）〜（１−ｅ）：
   （１−ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
   （１−ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （１−ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （１−ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
   （１−ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
   以下の（２−ａ）〜（２−ｅ）：
   （２−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
   （２−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （２−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （２−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
   （２−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット（ただし、アントシアニンの３′位及び／又は５′位のグルコシル基に芳香族アシル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むものを除く）。
2. 前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター及び第１のターミネーター、ならびに前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び第２のターミネーターをさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
3. 前記第１のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第１のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、請求項２に記載の発現カセット。
4. 前記第２のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、請求項２又は３に記載の発現カセット。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセットを含む形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
7. 花弁においてチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）が共発現している、請求項６に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
8. デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及び／またはデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）を含有する、請求項６又は７に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
9. 請求項６〜８のいずれか１項に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
10. 青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法であって、
    宿主に以下の（１−ａ）〜（１−ｅ）：
    （１−ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （１−ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （１−ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （１−ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    （１−ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び／又は
    以下の（２−ａ）〜（２−ｅ）：
    （２−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    （２−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （２−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    （２−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    （２−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法。
11. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現カセット又は請求項５に記載のベクターで宿主を形質転換することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記青系花色が、RHSカラーチャートでBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL^*a^*b^*表色系の色相角で230°〜290°を示す、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法によって作成された形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
14. 請求項１３に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。