JP6757008B2 - Bifidobacterium genus bacteria transformation method - Google Patents
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Description
本発明は、ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法に関する。 The present invention relates to a method for transforming a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium.
ビフィドバクテリウム属細菌は、グラム陽性の偏性嫌気性菌で、ヒトの腸内細菌叢における主要細菌であり、便秘や下痢の改善等の整腸作用、血清コレステロール上昇抑制作用、免疫賦活作用等、ヒトの健康に対して有益な作用を有することが知られている。このため、各種発酵飲食品や生菌製剤等の形態で多数の市販品が販売されている。 Bifidobacterium is a gram-positive obligate anaerobic bacterium, which is a major bacterium in the human intestinal flora, and has an intestinal regulating effect such as improvement of constipation and diarrhea, an inhibitory effect on serum cholesterol elevation, and an immunostimulatory effect. It is known that it has a beneficial effect on human health. For this reason, a large number of commercially available products are sold in the form of various fermented foods and drinks and live bacterial preparations.
しかしながら、ビフィドバクテリウム属細菌については、一般に形質転換が困難であることが知られており、当該細菌がヒトの健康に資する分子機構の解明は十分でなかった。ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換効率としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＰＲＬ２０１０において３．７×１０３ｃｆｕ／μｇＤＮＡであったとの報告があり（非特許文献１）、当該菌は形質転換効率が低い菌種に属すると考えられる。 However, it is generally known that transformation of Bifidobacterium spp. Is difficult, and the molecular mechanism by which the bacterium contributes to human health has not been sufficiently elucidated. Regarding the transformation efficiency of Bifidobacterium spp., For example, it has been reported that the transformation efficiency of Bifidobacterium Bifidum PRL2010 was 3.7 × 10 3 cfu / μg DNA (Non-Patent Document 1). It is considered to belong to a bacterial species with low conversion efficiency.
ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換効率が低い原因は、厚く複雑な細胞壁の存在、制限修飾系の存在、環境ストレス、特にエレクトロコンピテントセルの調製時及び形質転換操作中にさらされる酸素、に対する感受性等が挙げられる。そのため、ビフィドバクテリム属細菌の形質転換効率を向上することができるより簡便な手法が望まれている。 The low transformation efficiency of bifidobacteria is due to the presence of thick and complex cell walls, the presence of restrictive modification systems, environmental stress, especially oxygen exposed during the preparation and transformation of electrocompetent cells. Sensitivity and the like can be mentioned. Therefore, a simpler method capable of improving the transformation efficiency of Bacteria bifidobacteria is desired.
本発明の課題は、簡便で効率の良いビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a simple and efficient method for transforming a bacterium of the genus Bifidobacterium.
そこで本発明者らは、ビフィドバクテリウム属細菌の中でも特に形質転換効率の低いビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７（ＢＦ−１株）に注目し、形質転換について種々検討したところ、全く意外にも、通常形質転換には向かないとされるｐＨ８．０以上の緩衝液中でエレクトロポレーションを行うことで形質転換効率が向上することを見出し、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors paid attention to Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 (BF-1 strain), which has a particularly low transformation efficiency among the bacteria of the genus Bifidobacterium, and examined various transformations. However, they have found that the transformation efficiency is improved by performing electroporation in a buffer solution having a pH of 8.0 or higher, which is usually considered to be unsuitable for transformation, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕ｐＨ８．０以上の緩衝液中でエレクトロポレーションを行うことを特徴とする、ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法。
〔２〕ビフィドバクテリウム属細菌にＤＮＡ及びトランスポソームから選択される物質を導入するものである、〔１〕記載の方法。
〔３〕ＤＮＡ及びトランスポソームから選択される物質が宿主細菌由来のメチル化修飾酵素によってメチル化されたものである、〔２〕記載の方法。
〔４〕トランスポソームが冷凍保存したトランスポソームである、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕ｐＨ８．０以上の緩衝液が、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー及びＣＡＰＳバッファーから選ばれる緩衝液である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・インファンティスから選ばれる細菌である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法を用いるものである、ビフィドバクテリウム属細菌トランスポゾン挿入変異株ライブラリの作製方法。
That is, the present invention provides the following [1] to [7].
[1] A method for transforming a Bifidobacterium genus bacterium, which comprises performing electroporation in a buffer solution having a pH of 8.0 or higher.
[2] The method according to [1], wherein a substance selected from DNA and transposome is introduced into a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium.
[3] The method according to [2], wherein the substance selected from DNA and transposome is methylated by a methylation modifying enzyme derived from a host bacterium.
[4] The method according to [2] or [3], wherein the transposome is a frozen-preserved transposome.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the buffer solution having a pH of 8.0 or higher is a buffer solution selected from a HEPES buffer, a Tris-HCl buffer, and a CAPS buffer.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the bacterium belonging to the genus Bifidobacterium is a bacterium selected from Bifidobacterium bifidam and Bifidobacterium infantis.
[7] A method for producing a bifidobacteria bacterium transposon-inserted mutant library, which uses the method according to any one of [1] to [6].
本発明によれば、エレクトロコンピテントセルの洗浄及び／又は懸濁にｐＨ８．０以上の緩衝液を用い、当該緩衝液中でエレクトロポレーションを行うことにより、従来形質転換が困難あるいは形質転換効率が低いとされていたビフィドバクテリウム属細菌の形質転換を効率よく行うことができる。また、形質転換効率が向上することにより、トランスポゾン挿入変異株の取得が容易になり、ビフィドバクテリウム属細菌のトランスポゾン挿入変異株ライブラリの構築が可能となる。 According to the present invention, by using a buffer solution having a pH of 8.0 or higher for washing and / or suspending the electrocompetent cells and performing electroporation in the buffer solution, conventional transformation is difficult or transformation efficiency. Bifidobacterium spp., Which was considered to have a low value, can be efficiently transformed. Further, by improving the transformation efficiency, it becomes easy to obtain a transposon-inserted mutant strain, and it becomes possible to construct a transposon-inserted mutant strain library of Bifidobacterium spp.
本発明に用いられるビフィドバクテリウム属細菌の種類は特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（Ｂ． ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ． ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ． ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂ． ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂ． ｇｌｏｂｏｓｕｍ）等が挙げられる。中でも、ビフィドバクテリウム・ビフィダム及びビフィドバクテリウム・インファンティスが好ましく、ビフィドバクテリウム・ビフィダムがさらに好ましく、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６１３）が特に好ましい。 The type of Bifidobacterium bacteria used in the present invention is not particularly limited, for example, Bifidobacterium breve (Bifidobacterium breve), Bifidobacterium longum (B. longum), Bifidobacterium bifidum (B. bifidum), Bifidobacterium Animarisu (B. animalis), Bifidobacterium Zuisu (B. suis), Bifidobacterium infantis (B. infantis), Bifidobacterium address Santis (B. adolescentis), Bifidobacterium Katenuratamu (B. catenulatum), Bifidobacterium shoe Doka Tenu error Tam (B. pseudocatenulatum), Bifidobacterium lactis (B. lactis), Bifidobacterium -Globosum ( B. globosum ) and the like can be mentioned. Among them, Bifidobacterium bifidam and Bifidobacterium infantis are preferable, Bifidobacterium bifidam is more preferable, and Bifidobacterium bifidam YIT 10347 (FERM BP-10613) is particularly preferable.
本明細書において、「形質転換」とは、ビフィドバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡの改変またはビフィドバクテリウム属細菌へのＤＮＡ等の導入によりもたらされる改変をいい、染色体ＤＮＡの欠失、挿入、複製、変異、または自律複製プラスミドの導入による形質変化すべてを含む。導入されたＤＮＡは、染色体に組み込まれて維持、複製されてもよく、プラスミド等のように染色体とは独立して維持、複製されてもよい。 As used herein, the term "transformation" refers to a modification caused by modification of the chromosomal DNA of a Bifidobacterium bacterium or introduction of DNA or the like into a Bifidobacterium bacterium, and deletion or insertion of the chromosomal DNA. Includes all transformations due to replication, mutation, or introduction of an autonomous replication plasmid. The introduced DNA may be integrated into the chromosome and maintained / replicated, or may be maintained / replicated independently of the chromosome such as a plasmid or the like.
本発明のビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法は、ｐＨ８．０以上の緩衝液中でエレクトロポレーションを行うことを特徴とする。
エレクトロポレーションは、宿主細胞（エレクトロコンピテントセル）と導入物質を混合し、高電圧電気パルスを与え、瞬間的に細胞膜に小孔を開けて導入物質を細胞に取り込ませる方法である。エレクトロポレーションにより細胞に導入される物質としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、トランスポソーム、低分子物質等が挙げられるが、ＤＮＡ又はトランスポソームが好ましい。本明細書において、「宿主」とは、エレクトロポレーションにより形質転換体へと形質転換される細菌又は細胞をいい、エレクトロポレーション用に特に調製された宿主細胞をエレクトロコンピテントセルという。
The method for transforming a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium of the present invention is characterized by performing electroporation in a buffer solution having a pH of 8.0 or higher.
Electroporation is a method in which a host cell (electrocompetent cell) and an introduced substance are mixed, a high-voltage electric pulse is applied, and a small hole is instantaneously formed in the cell membrane to allow the introduced substance to be taken up by the cell. Examples of the substance introduced into the cell by electroporation include DNA, RNA, transposome, low molecular weight substance and the like, and DNA or transposome is preferable. As used herein, the term "host" refers to a bacterium or cell that is transformed into a transformant by electroporation, and a host cell specifically prepared for electroporation is referred to as an electrocompetent cell.
ここで、宿主細胞に導入されるＤＮＡは特に限定されず、環状でも直鎖状でもよく、天然から単離されたものであっても、合成されたものであっても、あるいは遺伝子工学的手法を用いて産生されたものであってもよい。該ＤＮＡは、ＰＣＲ増幅断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片のようなＤＮＡ断片であってもよい。あるいは、該ＤＮＡは、プラスミド等の染色体外で自律増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体に組み込まれるベクターであってもよい。このようなベクターとして、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌由来の複製領域を有するプラスミド、具体的には、ビフィドバクテリウム属細菌と大腸菌のシャトルベクターが挙げられる。該ＤＮＡには、ビフィドバクテリウム属細菌に導入しようとするＤＮＡを含んでいればよく、導入しようとするＤＮＡとしては、これに限定されるものではないが、プロモーター、遺伝子及びターミネーターからなる発現カセットが例示される。該ＤＮＡには、必要に応じて、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位等の制御配列や、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、選択マーカー、シグナル配列、リーダー配列等を含んでいてもよい。形質転換体の選抜を容易にする観点から、該ＤＮＡには選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子等といった薬剤耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの各種配列又は要素は、ＤＮＡの種類、宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。 Here, the DNA introduced into the host cell is not particularly limited, and may be circular or linear, whether it is isolated from nature, synthesized, or a genetic engineering method. It may be produced using. The DNA may be a DNA fragment such as a PCR amplified fragment or a restriction enzyme cleavage DNA fragment. Alternatively, the DNA may be a vector that can autonomously proliferate and replicate outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that integrates into the chromosome. Examples of such a vector include a plasmid having a replication region derived from a bacterium of the genus Bifidobacterium, specifically, a shuttle vector of a bacterium of the genus Bifidobacterium and Escherichia coli. The DNA may contain a DNA to be introduced into a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium, and the DNA to be introduced is not limited to this, but is an expression consisting of a promoter, a gene and a terminator. A cassette is illustrated. The DNA contains, if necessary, control sequences such as an operator, enhancer, and ribosome binding site, and various sequences known to those skilled in the art, such as restriction enzyme cleavage sites, selectable markers, signal sequences, leader sequences, and the like. You may be. From the viewpoint of facilitating selection of transformants, it is preferable that the DNA contains a selectable marker. Selective markers include, but are not limited to, drug resistance genes such as chloramphenicol resistance gene, ampicillin resistance gene, canamycin resistance gene, tetracycline resistance gene, spectinomycin resistance gene, streptomycin resistance gene and the like. Absent. These various sequences or elements can be appropriately selected and used by those skilled in the art according to the conditions such as the type of DNA, the host cell, and the culture medium.
トランスポソームとは、トランスポゼースとトランスポゾンＤＮＡの複合体のことをいう。トランスポゼースは、トランスポゾンＤＮＡを転移する酵素であり、トランスポゾンＤＮＡを染色体にランダムに挿入する。トランスポゾンＤＮＡは、両末端にトランスポゼースの認識配列である逆向き反復配列を有するＤＮＡ断片で、反復配列の間には宿主細胞の染色体ＤＮＡに挿入しようとするＤＮＡを有する。該ＤＮＡとしては、上記の薬剤耐性遺伝子を用いることが、トランスポゾン挿入変異株の取得を容易にする点で好ましい。例えば、トランスポゼースとしては、Ｔｎ５トランスポゼースが挙げられ、当該トランスポゼースが認識する反復配列は、モザイクエンド（ＭＥ）とよばれる１９ｂｐの塩基配列である。 A transposome is a complex of transposase and transposon DNA. Transposes are enzymes that transfer transposon DNA and randomly insert transposon DNA into chromosomes. Transposon DNA is a DNA fragment having an inverted repeat sequence, which is a recognition sequence of transposase, at both ends, and has DNA to be inserted into the chromosomal DNA of the host cell between the repeat sequences. It is preferable to use the above-mentioned drug resistance gene as the DNA from the viewpoint of facilitating the acquisition of a transposon-inserted mutant strain. For example, examples of the transposase include Tn5 transposase, and the repetitive sequence recognized by the transposase is a 19 bp base sequence called a mosaic end (ME).
ビフィドバクテリウム属細菌には、外部から侵入したＤＮＡを選択的に切断分解するための制限修飾系が備わっており、当該制限修飾系を回避することが形質転換効率を上げる上で有効であることが知られている。よって、形質転換効率を改善するため、導入しようとするＤＮＡを一旦宿主細菌に導入し、あるいは公知の方法により調製した宿主細菌のメチル化修飾酵素を用いて、該ＤＮＡをメチル化し、得られたメチル化ＤＮＡを用いて宿主細菌を形質転換することで宿主細菌の制限修飾系を回避してもよい。 Bifidobacterium spp. Are equipped with a restriction modification system for selectively cleaving and degrading DNA that has invaded from the outside, and avoiding the restriction modification system is effective in increasing transformation efficiency. It is known. Therefore, in order to improve the transformation efficiency, the DNA to be introduced was once introduced into the host bacterium, or the DNA was methylated using a methylation-modifying enzyme of the host bacterium prepared by a known method. The restriction modification system of the host bacterium may be avoided by transforming the host bacterium with methylated DNA.
本発明に用いられる緩衝液は、宿主細菌細胞を洗浄及び／又は懸濁し、エレクトロコンピテントセルを調製する際に用いる緩衝液であり、ｐＨが８．０以上である限り、特に制限されない。ｐＨは２５℃におけるｐＨをいい、当該ｐＨの下限値は、８．０以上であることが好ましく、９．０以上であることがさらに好ましい。当該ｐＨの上限値は、１２．０以下であることが好ましく、１１．５以下であることがさらに好ましく、１１．０以下であることが特に好ましい。このような緩衝液としては、ＨＥＰＥＳバッファー、ＴＡＰＳＯバッファー、ＰＯＰＳＯバッファー、ＨＥＰＰＳＯバッファー、ＥＰＰＳバッファー、Ｔｒｉｃｉｎｅバッファー、Ｂｉｃｉｎｅバッファー、ＴＡＰＳバッファー、ＣＨＥＳバッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＣＡＰＳバッファー等が挙げられ、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー及びＣＡＰＳバッファーから選ばれる緩衝液が好ましい。
通常、ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換においては、ｐＨ５．０〜６．０程度の緩衝液が使用される。これに対し、本発明においては、意外にも、タンパク質の変性を生じ形質転換に悪影響を及ぼす可能性があることから通常使用しないｐＨ８．０以上の緩衝液を使用することにより、効率のよい形質転換が可能となる。緩衝液以外の形質転換条件については、ビフィドバクテリウム属細菌の種類に応じて適宜設定すればよい。
The buffer solution used in the present invention is a buffer solution used for washing and / or suspending host bacterial cells to prepare electrocompetent cells, and is not particularly limited as long as the pH is 8.0 or higher. The pH refers to the pH at 25 ° C., and the lower limit of the pH is preferably 8.0 or more, and more preferably 9.0 or more. The upper limit of the pH is preferably 12.0 or less, more preferably 11.5 or less, and particularly preferably 11.0 or less. Examples of such a buffer include HEEPS buffer, TAPSO buffer, POPSO buffer, HEPPSO buffer, EPPS buffer, Tricine buffer, Bicine buffer, TAPS buffer, CHES buffer, Tris-HCl buffer, CAPS buffer, and the like. A buffer solution selected from Tris-HCl buffer and CAPS buffer is preferred.
Usually, a buffer solution having a pH of about 5.0 to 6.0 is used for transformation of Bifidobacterium spp. On the other hand, in the present invention, surprisingly, protein denaturation may occur, which may adversely affect transformation. Therefore, by using a buffer solution having a pH of 8.0 or higher, which is not normally used, efficient transformation is performed. Conversion is possible. Transformation conditions other than the buffer solution may be appropriately set according to the type of Bifidobacterium spp.
本発明のビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法による形質転換体の取得は、具体的には、例えば、下記のようにして行うことができる。宿主細菌を適当な培地で前培養し、一部を新鮮な培地に接種して本培養し、適当な時期で細胞を採取する。氷冷した緩衝液で細胞を洗浄、懸濁し、エレクトロコンピテントセルを得る。氷上にて適当量のエレクトロコンピテントセルと導入物質を混合し、混合液を氷冷キュベットに移し、電気パルスを印加する。エレクトロポレーション後、すぐに細胞を適当な培地に移し回復培養を行い、形質転換体選抜用の薬剤を含む寒天培地に播種して選択培養し、導入遺伝子により薬剤耐性となった目的の形質転換体を選抜する。 Specifically, for example, the transformant can be obtained by the method for transforming a bacterium of the genus Bifidobacterium of the present invention as follows. The host bacterium is pre-cultured in an appropriate medium, a part of the host bacterium is inoculated into a fresh medium and main-cultured, and cells are collected at an appropriate time. The cells are washed and suspended in ice-cooled buffer to give electrocompetent cells. An appropriate amount of electrocompetent cells and the introduced substance are mixed on ice, the mixed solution is transferred to an ice-cooled cuvette, and an electric pulse is applied. Immediately after electroporation, the cells were transferred to an appropriate medium for recovery culture, seeded on an agar medium containing a drug for selecting a transformant, selectively cultured, and transformed into drug resistance by the introduced gene. Select the body.
ビフィドバクテリウム属細菌の培養には、エレクトロコンピテントセル調製のための前培養及び本培養、エレクトロポレーション後の回復培養、並びに形質転換体選抜のための選択培養が含まれる。培地としては、ビフィドバクテリウム属細菌を培養することができるものであれば特に限定されるものではなく、ＭＲＳ培地、ＭＩＬＳ培地（表１）、ＧＡＭ培地等が挙げられるが、形質転換効率の点から、好ましくは０．０５％ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ添加ＭＲＳ培地又は０．５％ ｇｌｕｃｏｓｅ添加ＧＡＭ培地である。さらに、本培養においては、培地は０．２Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅを含むことが好ましい。選択培養においては、培地は、適当な選択薬剤を含む寒天培地であることが好ましい。培養温度は、ビフィドバクテリウム属細菌が好適に増殖できる条件であれば特に限定されないが、例えば３４〜４０℃、好ましくは３７℃である。培養は、嫌気条件で静置培養を行うのが好ましい。前培養時間は約２４時間が好ましく、その後培養液の２〜５％（ｖ／ｖ）を接種しての本培養時間は、約４〜約７時間が好ましく、約４〜約５時間が好ましく、約４時間がさらに好ましい。本培養終了時点の菌体濃度は、ＯＤ６６０の値が約０．５〜約０．７であるのが好ましく、約０．７であるのがさらに好ましい。回復培養時間は３時間が好ましい。選択培養時間は、３〜７日間が好ましく、５〜６日間がさらに好ましい。
宿主細胞への導入に用いられるＤＮＡの長さは、ビフィドバクテリウム属細菌に導入可能であれば特に制限されないが、１０〜２０，０００ｂｐが好ましく、１００〜６，０００ｂｐがより好ましい。エレクトロポレーションに供する導入物質の量は、ＤＮＡ量として、１〜１，０００ｎｇが好ましく、１〜２００ｎｇがより好ましい。エレクトロポレーションに供するエレクトロコンピテントセルの濃度は、１サンプルあたりＯＤ６６０＝５０〜７５が形質転換効率の点から好ましい。エレクトロポレーションに供するサンプル量は、２０〜１００μｌが好ましく、２０〜５０μｌがさらに好ましい。エレクトロポレーションに用いるキュベットは、１ｍｍ幅のものが好ましい。エレクトロポレーションの電気パルスの条件としては、形質転換効率の点から、電圧は１０〜１７．５ｋＶ／ｃｍが好ましく、１０〜１２．５ｋＶ／ｃｍがさらに好ましく、１１．５ｋＶ／ｃｍが特に好ましく、抵抗値は１００〜４００Ωが好ましく、１００〜３００Ωがさらに好ましく、２００Ωが特に好ましく、コンデンサ容量は２５μＦが好ましい。
Cultures of Bifidobacterium spp. Include pre- and main cultures for preparing electrocompetent cells, recovery cultures after electroporation, and selective cultures for transformant selection. The medium is not particularly limited as long as it can cultivate Bifidobacterium spp. Examples thereof include MRS medium, MILS medium (Table 1), GAM medium and the like, but the transformation efficiency is high. From the point of view, preferably 0.05% cysteine HCl-added MRS medium or 0.5% glucos-added GAM medium. Furthermore, in the main culture, the medium preferably contains 0.2 M sucrose. In selective culture, the medium is preferably an agar medium containing a suitable selective agent. The culture temperature is not particularly limited as long as the conditions under which Bifidobacterium spp. Can grow favorably, but are, for example, 34 to 40 ° C., preferably 37 ° C. The culture is preferably static culture under anaerobic conditions. The pre-culture time is preferably about 24 hours, and the main culture time after inoculating 2 to 5% (v / v) of the culture solution is preferably about 4 to about 7 hours, preferably about 4 to about 5 hours. , About 4 hours are more preferred. The cell concentration at the end of the main culture preferably has an OD660 value of about 0.5 to about 0.7, and more preferably about 0.7. The recovery culture time is preferably 3 hours. The selective culture time is preferably 3 to 7 days, more preferably 5 to 6 days.
The length of the DNA used for introduction into the host cell is not particularly limited as long as it can be introduced into a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium, but is preferably 10 to 20,000 bp, more preferably 100 to 6,000 bp. The amount of the introduced substance to be subjected to electroporation is preferably 1 to 1,000 ng, more preferably 1 to 200 ng as the amount of DNA. The concentration of electrocompetent cells to be subjected to electroporation is preferably OD660 = 50 to 75 per sample from the viewpoint of transformation efficiency. The amount of sample to be subjected to electroporation is preferably 20 to 100 μl, more preferably 20 to 50 μl. The cuvette used for electroporation is preferably 1 mm wide. As the condition of the electric pulse of electroporation, the voltage is preferably 10 to 17.5 kV / cm, more preferably 10 to 12.5 kV / cm, and particularly preferably 11.5 kV / cm from the viewpoint of transformation efficiency. The resistance value is preferably 100 to 400 Ω, more preferably 100 to 300 Ω, particularly preferably 200 Ω, and the capacitor capacity is preferably 25 μF.
より具体的には、本発明のビフィドバクテリウム属細菌の形質転換方法による形質転換体の取得は、例えば、下記のようにして行うことができる。ビフィドバクテリウム属細菌を０．０５％ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ添加ＭＲＳ培地で約２４時間前培養し、培養液の２〜５％（ｖ／ｖ）を０．２Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅを含む新鮮な同培地に接種して本培養を約４時間行い、細胞を回収する。当該細胞を氷冷下ｐＨ８．０以上の緩衝液で洗浄、懸濁してエレクトロコンピテントセルを調製する。ＯＤ６６０＝５０程度のエレクトロコンピテントセルと１〜２００ｎｇのＤＮＡ等の導入物質を混合し、混合液に対し電圧１１．５ｋＶ／ｃｍ、抵抗値２００Ω、コンデンサ容量２５μＦの電気パルスを印加してエレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション後、すぐに細胞を０．０５％ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ添加ＭＲＳ培地に移し回復培養を３時間行い、形質転換体選抜用の薬剤を添加した０．０５％ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ＨＣｌ添加ＭＲＳ寒天培地に播種して選択培養を５〜６日間行い、導入遺伝子により薬剤耐性となった目的の形質転換体を選抜する。 More specifically, the transformant can be obtained by the method for transforming a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium of the present invention, for example, as follows. Bifidobacterium spp. Are pre-cultured in MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl for about 24 hours, and 2-5% (v / v) of the culture medium is inoculated into the same medium fresh containing 0.2 M susrose. The main culture is carried out for about 4 hours, and the cells are collected. The cells are washed with a buffer solution having a pH of 8.0 or higher under ice-cooling and suspended to prepare electrocompetent cells. An electrocompetent cell with an OD of about 660 = 50 and an introduced substance such as 1 to 200 ng of DNA are mixed, and an electric pulse having a voltage of 11.5 kV / cm, a resistance value of 200 Ω, and a capacitor capacity of 25 μF is applied to the mixed solution to electroporate. Perform the ration. Immediately after electroporation, the cells were transferred to MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl, subjected to recovery culture for 3 hours, and seeded on MRS agar medium supplemented with 0.05% cysteine HCl added with a drug for transformant selection. The selective culture is carried out for 5 to 6 days, and the target transformant that has become drug resistant by the introduced gene is selected.
本発明において、ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換効率は、選択薬剤を加えた寒天培地で培養したときのＤＮＡ１μｇあたりの生じたコロニー数（ｃｆｕ／μｇ）で評価する。 In the present invention, the transformation efficiency of Bifidobacterium spp. Is evaluated by the number of colonies generated per 1 μg of DNA (cfu / μg) when cultured on an agar medium containing a selective agent.
本発明の形質転換方法により、ビフィドバクテリウム属細菌において、目的遺伝子の発現の阻害又は抑制を効率良く行うことが可能となる。
目的遺伝子の発現を阻害するには、該遺伝子を破壊、欠損すればよく、この方法としては、全く別のＤＮＡ断片を遺伝子の内部に挿入する挿入失活法や段階的な相同組換えによって該遺伝子の一部又は全部を欠失する段階的二重交叉法が挙げられ、特に段階的二重交叉法が好ましい。
具体的には、目的遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体ＤＮＡから分離するか、あるいはＰＣＲ法によって増幅して分離し、例えばｐＹＳＳＥ３のような大腸菌では増殖するが対象とする細菌中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれらＤＮＡ断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドＤＮＡを、欠失を起こさせようとする細菌に本発明の形質転換方法を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、ＰＣＲ法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからＰＣＲ法等によって目的遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
The transformation method of the present invention makes it possible to efficiently inhibit or suppress the expression of a target gene in a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium.
In order to inhibit the expression of the target gene, the gene may be disrupted or deleted, and this method includes an insertion inactivation method in which a completely different DNA fragment is inserted inside the gene or a stepwise homologous recombination. A stepwise double crossover method in which a part or all of a gene is deleted can be mentioned, and a stepwise double crossover method is particularly preferable.
Specifically, when a part or all of the target gene is deleted, the regions on both sides of the deletion region are separated from the chromosomal DNA, or amplified and separated by the PCR method, for example, pYSSE3. The DNA fragments are cloned into a plasmid vector that grows in a large Escherichia coli but cannot be replicated in the target bacteria in the same orientation as the original orientation. Next, the obtained recombinant plasmid DNA is introduced into the bacterium to be deleted by using the transformation method of the present invention, and the desired deletion region is obtained from the resulting antibiotic-resistant clone by PCR or the like. Select a clone in which the plasmid is inserted onto the chromosome by recombination in a region homologous to the cloned region upstream or downstream of. By repeating subculture of the clones thus obtained in an antibiotic-free medium, the plasmids are detached from the chromosome by recombination between homologous regions in which they are present again, and disappear as the bacteria grow. Select clones that have lost antibiotic resistance. A clone lacking the target gene region can be separated from the clone thus obtained by the PCR method or the like.
目的遺伝子の発現を抑制するには、該遺伝子のｍＲＮＡの５’末端領域と相補的な短いＲＮＡを合成することによる、いわゆるＲＮＡ干渉による方法や、該遺伝子の発現を制御する領域又は制御遺伝子を破壊若しくは欠損等して改変する方法を用いることができ、特に該遺伝子の発現を制御する領域の改変が好ましい。
具体的には、目的遺伝子の転写を制御するプロモーターの塩基配列の一部を置換、欠失、付加又は挿入により改変することによって、該遺伝子のｍＲＮＡへの転写量を、改変していない野生型に比して少なくすることができる。
In order to suppress the expression of the target gene, a method by so-called RNA interference by synthesizing a short RNA complementary to the 5'end region of the mRNA of the gene, or a region or a regulatory gene that controls the expression of the gene is used. A method of modifying by disrupting or deleting can be used, and modification of the region controlling the expression of the gene is particularly preferable.
Specifically, by modifying a part of the base sequence of the promoter that controls transcription of the target gene by substitution, deletion, addition, or insertion, the transcription amount of the gene into mRNA is not modified in the wild type. Can be reduced compared to.
また、本発明の形質転換方法により、ビフィドバクテリウム属細菌において、目的遺伝子の発現の増強も効率良く行うことが可能となる。
目的遺伝子の発現を増強するには、本発明の形質転換方法により、該遺伝子を導入した組換えプラスミドを対象とする細菌に導入すること、該遺伝子を染色体の別の場所に部位特異的組換えによって組み込むことによって細菌内での該遺伝子のコピー数を増加させること、該遺伝子のプロモーター配列を改変し、ｍＲＮＡへの転写量を多くすることによって発現を増加させること等の方法が挙げられ、特に該遺伝子のコピー数を増加させる方法が好ましい。
目的遺伝子のコピー数を増加させる方法の具体例としては、１個の細菌細胞あたり複数個のコピー数を持つプラスミドに、目的遺伝子をその遺伝子の本来のプロモーター配列とリボソーム結合部位を含めてクローニングするか、別の遺伝子から分離した、あるいは化学合成によって作成したプロモーターとリボソーム結合部位の下流に該遺伝子のポリペプチドをコードする領域だけをつなげてクローニングした組換えプラスミドを作製し、細菌細胞内に本発明の形質転換方法によって導入することが挙げられる。これによって、細菌細胞内での該遺伝子のコピー数を上げることができる。
In addition, the transformation method of the present invention makes it possible to efficiently enhance the expression of a target gene in a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium.
In order to enhance the expression of the target gene, the recombinant plasmid into which the gene has been introduced is introduced into a target bacterium by the transformation method of the present invention, or the gene is site-specifically recombined at another location on the chromosome. There are methods such as increasing the number of copies of the gene in bacteria by incorporating the gene, modifying the promoter sequence of the gene, and increasing the expression by increasing the amount of transcription into mRNA. A method of increasing the number of copies of the gene is preferred.
As a specific example of the method for increasing the copy number of the target gene, the target gene is cloned into a plasmid having a plurality of copies per bacterial cell, including the original promoter sequence of the gene and the ribosome binding site. Alternatively, a recombinant plasmid isolated from another gene or cloned by connecting only the region encoding the polypeptide of the gene to the downstream of the ribosome binding site with the promoter prepared by chemical synthesis was prepared, and the plasmid was prepared into the bacterial cell. It may be introduced by the transformation method of the present invention. This makes it possible to increase the copy number of the gene in bacterial cells.
また、本発明の形質転換方法により、ビフィドバクテリウム属細菌のトランスポゾン挿入変異株ライブラリの構築も可能となる。トランスポゾン挿入変異株作製方法の具体例としては、両末端にトランスポゼースの認識配列である逆向き反復配列を有し、反復配列の間に薬剤耐性遺伝子といった選択マーカーなどの挿入変異株の検出を可能とするＤＮＡを含むトランスポゾンＤＮＡを作製し、該トランスポゾンＤＮＡとトランスポゼースにより複合体を形成し、該複合体を本発明の形質転換方法で宿主細菌細胞に導入し、トランスポゾンが宿主細菌細胞の染色体ＤＮＡに挿入された変異株を薬剤等により選抜することが挙げられる。トランスポソームが細菌細胞に導入されると、トランスポゼースの働きによりトランスポゾンが細菌染色体に挿入される。トランスポゾンが遺伝子に挿入されると、当該遺伝子の破壊株を作出することができる。トランスポゾンの挿入部位はランダムであるため、染色体上の無作為の遺伝子に変異を生じさせることが可能となり、トランスポゾン変異株ライブラリを構築することができる。該ライブラリを用いることで、細菌の有益な作用等の表現型を規定する遺伝子を同定できるなど、遺伝子及びタンパク質の発現、機能、構造等に関する解析を効率よく行うことが可能となる。 In addition, the transformation method of the present invention makes it possible to construct a transposon insertion mutant library of Bifidobacterium spp. As a specific example of the method for producing a transposon-inserted mutant strain, it has a reverse repeat sequence that is a recognition sequence of transposes at both ends, and it is possible to detect an inserted mutant strain such as a selection marker such as a drug resistance gene between the repeat sequences. A transposon DNA containing the DNA to be used is prepared, a complex is formed with the transposon DNA by transposase, the complex is introduced into a host bacterial cell by the transformation method of the present invention, and the transposon is inserted into the chromosomal DNA of the host bacterial cell. The selected mutant strain may be selected by a drug or the like. When a transposome is introduced into a bacterial cell, the transposon is inserted into the bacterial chromosome by the action of transposes. When a transposon is inserted into a gene, a disrupted strain of the gene can be created. Since the insertion site of the transposon is random, it is possible to mutate a random gene on the chromosome, and a transposon mutant strain library can be constructed. By using the library, it is possible to efficiently analyze the expression, function, structure, etc. of genes and proteins, such as identifying genes that define phenotypes such as beneficial actions of bacteria.
トランスポゾンＤＮＡは、例えば、予め逆向き反復配列を含む公知のベクターの反復配列間に所望の遺伝子をクローニングし、該ベクターを両端の反復配列のすぐ外側に認識配列のある制限酵素で切断して精製するか、該ベクターを鋳型にして両端の反復配列と間の遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、両端の反復配列のすぐ外側に認識配列のある制限酵素で切断して精製するか、又は該ベクターを鋳型にしてそれぞれ反復配列とその３’側の配列にアニールする塩基配列を有するプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行うことで得ることができる。あるいは、当該技術分野で公知の遺伝子工学的手法により得ることもできる。 Transposon DNA is purified by, for example, cloning a desired gene between the repeat sequences of a known vector containing a reverse repeat sequence in advance, and cutting the vector with a restriction enzyme having a recognition sequence just outside the repeat sequences at both ends. Alternatively, the vector can be used as a template to amplify a DNA fragment containing a gene between the repetitive sequences at both ends by PCR, and then cut with a restriction enzyme having a recognition sequence just outside the repetitive sequences at both ends for purification. Alternatively, it can be obtained by performing PCR amplification using the vector as a template and using a primer pair having a base sequence that anneals to the repetitive sequence and the sequence on the 3'side of the repetitive sequence. Alternatively, it can also be obtained by a genetic engineering method known in the art.
トランスポゾンＤＮＡに含まれる薬剤耐性遺伝子のプロモーターは、発現効率の観点から、本来のプロモーターから高発現プロモーターに置換することが好ましい。該高発現プロモーターとしては、例えば、リボソームＲＮＡや伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＬＤＨ）のプロモーターが挙げられる。伸長因子のプロモーターの由来は特に制限されないが、ビフィドバクテリウム属細菌が好ましく、ビフィドバクテリウム・ビフィダム又はビフィドバクテリウム・ブレーベがさらに好ましく、ビフィドバクテリウム・ブレーベが特に好ましい。プロモーターの置換は、当該技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、置換しようとするプロモーターを有する細菌の染色体ＤＮＡから、当該プロモーターをコードするＤＮＡを分離あるいはＰＣＲ法によって増幅して分離し、これを、相同組換え法やライゲーション法により、薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドにおいて本来のプロモーターと置換することができる。高発現プロモーターを用いることにより、宿主細菌染色体上にランダムにトランスポゾンＤＮＡが挿入された変異株を効率よく取得することができる。 From the viewpoint of expression efficiency, the promoter of the drug resistance gene contained in the transposon DNA is preferably replaced with a highly expressed promoter from the original promoter. Examples of the highly expressed promoter include ribosomal RNA, elongation factor, and lactate dehydrogenase (LDH) promoters. The origin of the promoter of the elongation factor is not particularly limited, but Bifidobacterium spp. Are preferred, Bifidobacterium bifidum or Bifidobacterium brave is more preferred, and Bifidobacterium brave is particularly preferred. The promoter can be replaced by a method known in the art. For example, the DNA encoding the promoter is separated from the chromosomal DNA of the bacterium having the promoter to be replaced, amplified and separated by the PCR method, and the drug resistance gene is contained by the homologous recombination method or the ligation method. It can be replaced with the original promoter in the plasmid. By using a high expression promoter, a mutant strain in which transposon DNA is randomly inserted on the host bacterial chromosome can be efficiently obtained.
トランスポソームの作製は、当該技術分野で公知の方法により行うことができるが、それに適した市販のキットを用いて、キット添付のプロトコールに従って実施することもできる。当該キットしては、Ｅｚ−Ｔｎ５ＴＭ Ｃｕｓｔｏｍ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）等が挙げられる。
トランスポソームは、トランスポゾンＤＮＡとトランスポゼースを混合し、室温で３０分間インキュベートした後、宿主細菌細胞に導入される。通常は、トランスポソームを低温で一定期間保存してから導入すると形質転換効率が低下するが、後記実施例に示す通り、トランスポソームを冷凍保存、すなわち−３０℃で６日間又は３０日間保存後に細菌に導入したところ、意外にも、調製直後に導入した場合に比して形質転換効率が約３〜７倍向上した。よって、トランスポソームは、調製後、好ましくは−２０〜−３０℃で、さらに好ましくは−３０℃で、好ましくは１〜６０日間、さらに好ましくは１〜３０日間保存してから使用するのがよい。
The transposome can be prepared by a method known in the art, but it can also be carried out using a commercially available kit suitable for the transposome according to the protocol attached to the kit. Examples of the kit include Ez-Tn5 TM Custom Transposome Construction Kits (epicenter) and the like.
Transposomes are introduced into host bacterial cells after mixing transposon DNA and transposes and incubating at room temperature for 30 minutes. Normally, if the transposome is stored at a low temperature for a certain period of time and then introduced, the transformation efficiency decreases. However, as shown in Examples below, the transposome is stored frozen at -30 ° C for 6 or 30 days, and then bacteria are used. Surprisingly, the transformation efficiency was improved by about 3 to 7 times as compared with the case where it was introduced immediately after preparation. Therefore, after preparation, the transposome is preferably stored at -20 to -30 ° C, more preferably -30 ° C, preferably 1 to 60 days, still more preferably 1 to 30 days before use. ..
宿主細菌細胞にトランスポソームを導入後、選択培地に生育したコロニーを用い、コロニーＰＣＲ等の当該技術分野で公知の手法により、染色体へのトランスポゾンの挿入を確認することができる。また、インバースＰＣＲやシーケンス等の公知の手法により、染色体上のトランスポゾン挿入部位を確認することができる。 After introducing the transposome into the host bacterial cell, the colony grown in the selective medium can be used, and the insertion of the transposon into the chromosome can be confirmed by a method known in the art such as colony PCR. In addition, the transposon insertion site on the chromosome can be confirmed by a known method such as inverse PCR or sequencing.
ここで採用され得る各種操作、例えばＤＮＡの合成、同切断、削除、付加乃至結合を目的とする酵素処理、同単離、精製、選択など、組換えＤＮＡの作製などはいずれも常法に従うことができる（例えば「分子遺伝学実験法」、共立出版株式会社1993年発行；「PCRテクノロジー」、宝酒造株式会社1990年発行、Science, 224, 1431 (1984)；Biochem.Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80,5990 (1983); Moplecular Cloning, by T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982)など参照）。 Various operations that can be adopted here, such as DNA synthesis, cleavage, deletion, enzymatic treatment for the purpose of addition or binding, isolation, purification, selection, preparation of recombinant DNA, etc., all follow conventional methods. (For example, "Molecular Genetics Experimental Method", published by Kyoritsu Publishing Co., Ltd. in 1993; "PCR Technology", published by Takara Shuzo Co., Ltd. in 1990, Science, 224, 1431 (1984); Biochem.Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80,5990 (1983); Moplecular Cloning, by T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982), etc.).
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１ ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換１
（１）使用菌株、プラスミド、培地および培養条件
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７を宿主として使用した。形質転換用のプラスミドとして、pBDCNBb1F（クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む、ビフィズス菌と大腸菌のシャトルベクター、4657 bp）を使用した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の培養には、0.05% cysteine HCl添加MRS培地、MILS（1% lactose）培地又はMILS（1% glucose）培地を使用し、本培養においては0.2 M sucroseを添加した。培地中の溶存酸素をCO2ガスで置換し、37℃、嫌気条件下、静置で培養した。
Example 1 Transformation of Bifidobacterium spp. 1
(1) Strain, plasmid, medium and culture conditions used Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was used as a host. As a plasmid for transformation, pBDCNBb1F (bifidobacterium and Escherichia coli shuttle vector containing chloramphenicol resistance gene, 4657 bp) was used. Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was cultivated using 0.05% cysteine HCl-added MRS medium, MILS (1% lactose) medium or MILS (1% glucose) medium, and 0.2 M sucrose was added in the main culture. .. Dissolved oxygen in the medium was replaced with CO 2 gas, and the cells were cultured statically at 37 ° C. under anaerobic conditions.
（２）ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７におけるプラスミドの抽出
プラスミドの抽出は、以下の方法により行った。具体的には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７を0.05% cysteine HCl添加MRS培地100 mlを用いて一晩培養した。培養終了後、遠心分離（7000 rpm、0℃、5 min）によって菌体を回収した。25 mlの0.2 M glycine buffer（pH 10.0）を用いて菌体を洗浄し、遠心分離（7000 rpm、0℃、5 min）によって菌体を回収した。得られた菌体を18.95 mlの6.7% sucrose-50 mM Tris-HCl-1 mM EDTA（pH 8.0）に懸濁し、5 mlのLysozyme溶液（10 mg/ml lysozyme、0.05 mg/ml mutanolysin、25 mM Tris-HCl（pH 8.0））を加え、37℃で30分インキュベートした。500 mlの10 mg/ml RNaseAを添加し、室温で2分インキュベートした。2.41 mlの0.25 M EDTA-50 mM Tris-HCl（pH 8.0）を加え、続いて1.38 mlの10% Triton X-100溶液を加えた。更に、1.38 mlの3 N NaOHを加え室温で5分間、転倒混和した。2.48 mlの2 M Tris-HCl（pH 7.0）を加え室温で3分間、転倒混和した。3.59 mlの5 M NaClを加えた後、35 mlのphenol-chloroform-isoamyl alcohol（25:24:1）を加え完全に混合した後、遠心分離した（9500 rpm、0℃、5 min）。上層を回収し、再度35 mlのphenol-chloroform-isoamyl alcohol（25:24:1）を加え完全に混合し、遠心分離した（9500 rpm、0℃、5 min）。上層を回収し、35 mlのchloroform-isoamyl alcohol（24:1）を加え、遠心分離した（9500 rpm、0℃、5 min）。上層を回収し、35 mlのisopropanolを加え氷上で30分インキュベートした。遠心分離し（9500 rpm、0℃、5 min）、上清を除去した後、デシケーターで10分陰圧にし、沈殿を乾燥させた。沈殿を1 ml TEで溶解し、crudeなプラスミド溶液を調製した。プラスミド溶液は、必要に応じてアガロースゲルで電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて精製した。
(2) Extraction of plasmid in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 The plasmid was extracted by the following method. Specifically, Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was cultured overnight using 100 ml of MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (7000 rpm, 0 ° C., 5 min). The cells were washed with 25 ml of 0.2 M glycine buffer (pH 10.0) and collected by centrifugation (7000 rpm, 0 ° C., 5 min). The resulting cells were suspended in 18.95 ml of 6.7% sucrose-50 mM Tris-HCl-1 mM EDTA (pH 8.0) and 5 ml of Lysozyme solution (10 mg / ml lysozyme, 0.05 mg / ml mutanolysin, 25 mM). Tris-HCl (pH 8.0)) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. 500 ml of 10 mg / ml RNase A was added and incubated for 2 minutes at room temperature. 2.41 ml of 0.25 M EDTA-50 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added, followed by 1.38 ml of 10% Triton X-100 solution. Further, 1.38 ml of 3 N NaOH was added and mixed by inversion for 5 minutes at room temperature. 2.48 ml of 2 M Tris-HCl (pH 7.0) was added and mixed by inversion for 3 minutes at room temperature. After adding 3.59 ml of 5 M NaCl, 35 ml of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added, mixed thoroughly, and then centrifuged (9500 rpm, 0 ° C., 5 min). The upper layer was recovered, 35 ml of phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24: 1) was added again, mixed thoroughly, and centrifuged (9500 rpm, 0 ° C., 5 min). The upper layer was recovered, 35 ml of chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) was added, and the mixture was centrifuged (9500 rpm, 0 ° C., 5 min). The upper layer was collected, 35 ml of isopropanol was added, and the mixture was incubated on ice for 30 minutes. Centrifugation (9500 rpm, 0 ° C., 5 min) was performed to remove the supernatant, and the precipitate was dried under negative pressure in a desiccator for 10 minutes. The precipitate was dissolved in 1 ml TE to prepare a crude plasmid solution. The plasmid solution was electrophoresed on an agarose gel as needed and purified using the QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
（３）ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７におけるプラスミドの形質転換
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７におけるpBDCNBb1Fの形質転換は、次の方法（以下、従来法とも称す）により行った。具体的には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７を0.05% cysteine HCl添加MRS培地で24時間培養した培養液を0.2 M sucroseを添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に5%（v/v）接種し、OD660が0.5となるまで約3時間培養した。培養終了後氷上で冷却し、遠心分離（7000 rpm、0℃、10 min）により集菌した。氷冷した0.5 M sucrose、1 mM ammonium citrate buffer（pH 6.0）で3回菌体を洗浄した後、同バッファーでOD660が50となるように懸濁し、エレクトロコンピテントセルを調製した。39 mlのエレクトロコンピテントセルと1 mlのプラスミドDNA溶液（100 ng/ml）とを混合し、ジーンパルサーII（BIO-RAD）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は1 mm幅のキュベット（MBP）を用い11.5 kV/cm、200 Ω、25 mFとした。エレクトロポレーション後、4 mlの0.05% cysteine HCl添加MRS培地に懸濁し、気相をCO2ガスで置換し、37℃、3時間回復培養した。インキュベート後、適当量の培養液をクロラムフェニコール（8 mg/ml）を添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に塗抹し、37℃、5日間嫌気培養した。
(3) Transformation of plasmid in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 The transformation of pBDCNBb1F in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was carried out by the following method (hereinafter, also referred to as a conventional method). Specifically, the culture medium obtained by culturing Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 in MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl for 24 hours was added to 0.05% MRS medium supplemented with 0.2 M sucrose and 5% (v / v). Inoculated and cultured for about 3 hours until OD660 reached 0.5. After completion of the culture, the cells were cooled on ice and collected by centrifugation (7000 rpm, 0 ° C., 10 min). The cells were washed 3 times with ice-cooled 0.5 M sucrose and 1 mM ammonium citrate buffer (pH 6.0), and then suspended in the same buffer so that OD660 was 50 to prepare electrocompetent cells. 39 ml of electrocompetent cells and 1 ml of plasmid DNA solution (100 ng / ml) were mixed and electroporated with Genepulsar II (BIO-RAD). The electroporation conditions were 11.5 kV / cm, 200 Ω, and 25 mF using a 1 mm wide cuvette (MBP). After electroporation, the cells were suspended in 4 ml of MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl, the gas phase was replaced with CO 2 gas, and the cells were recultured at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, an appropriate amount of the culture solution was smeared on MRS medium containing 0.05% cysteine HCl added with chloramphenicol (8 mg / ml), and anaerobically cultured at 37 ° C. for 5 days.
（４）形質転換条件の検討
（４−１）
上記（３）に記載した形質転換条件を用い、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出したcrudeなプラスミドを用いた場合と大腸菌より抽出したプラスミドを用いた場合の形質転換効率を比較した。
（４−２）
上記（３）に記載した形質転換条件から、下記の条件を変更し形質転換効率に及ぼす影響を調べた。プラスミドはビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７から抽出したcrudeな状態のものを電気泳動のバンドの濃度から見積って約100 ng/mlに調製して使用した。各条件の形質転換効率は、（３）に記載した従来法の条件の形質転換効率を100としたときの相対値として示した。
（ｉ）培地
前培養、本培養、および回復培養の培地を0.05% cysteine HCl添加MRS培地、MILS（1% lactose）培地またはMILS（1% glucose）培地に変更した場合の形質転換効率を測定した。なお、本培養培地には0.2 M sucroseを添加した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、0.05% cysteine HCl添加MRS培地を用いた場合を100としたときの相対値として示した。
（ｉｉ）本培養時間
本培養時間を2、3、4、5時間とした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、本培養を3時間とした場合を100としたときの相対値として示した。
（ｉｉｉ）エレクトロコンピテントセル濃度
エレクトロコンピテントセル濃度をOD660=25、50、75とした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、OD660=50とした場合を100としたときの相対値として示した。
（ｉｖ）エレクトロポレーション条件
（ｉｖ−ｉ）電圧
エレクトロポレーションを行う際の電圧を10、11.5、12.5、15、17.5 kV/cmとした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、電圧を11.5 kV/cmとした場合を100としたときの相対値として示した。
（ｉｖ−ｉｉ）抵抗
エレクトロポレーションを行う際の抵抗値を100、200、300、400 Ωとした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、抵抗値を200 Ωとした場合を100としたときの相対値として示した。
（ｖ）回復培養時間
エレクトロポレーション後の回復培養時間を1、2、3時間とした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、回復培養時間を3時間とした場合を100としたときの相対値として示した。
（ｖｉ）バッファーの種類とpH
エレクトロコンピテントセルの洗浄、懸濁バッファーをそれぞれ0.5 M sucroseを添加した、1 mM ammonium citrate（pH 4.0（2）、5.0（2）、6.0（7）、7.0（4））、1 mM HEPES（pH 7.2（1）、7.5（1）、8.0（2））、1 mM Tris-HCl（pH 8.0（2）、9.0（2））又は1 mM CAPS（pH 10.0（2）、11.0（2））とした場合の形質転換効率を測定した。形質転換効率は、それぞれ括弧内に示した回数測定して平均値を求め、1 mM ammonium citrate pH 6.0を用いた場合を100としたときの相対値として示した。
(4) Examination of transformation conditions (4-1)
Using the transformation conditions described in (3) above, the transformation efficiency was compared between the case of using the crude plasmid extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 and the case of using the plasmid extracted from Escherichia coli.
(4-2)
From the transformation conditions described in (3) above, the following conditions were changed to investigate the effect on transformation efficiency. The plasmid was extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 in a crude state, estimated from the concentration of the electrophoresis band, and prepared to about 100 ng / ml and used. The transformation efficiency of each condition is shown as a relative value when the transformation efficiency of the conventional method described in (3) is 100.
(I) Medium The transformation efficiency was measured when the pre-culture, main culture, and recovery culture mediums were changed to 0.05% cysteine HCl-added MRS medium, MILS (1% lactose) medium, or MILS (1% glucose) medium. .. In addition, 0.2 M sucrose was added to the main culture medium. The transformation efficiency was measured twice each to obtain an average value, and was shown as a relative value when 100 was used when using MRS medium containing 0.05% cysteine HCl.
(Ii) Main culture time The transformation efficiency was measured when the main culture time was 2, 3, 4, and 5 hours. The transformation efficiency was measured twice each to obtain an average value, and was shown as a relative value when the main culture was set to 3 hours and set to 100.
(Iii) Electro-competent cell concentration The transformation efficiency was measured when the electro-competent cell concentration was OD660 = 25, 50, 75. The transformation efficiency was measured twice for each, and the average value was calculated, and the value was shown as a relative value when OD660 = 50 was set to 100.
(Iv) Electroporation conditions (iv-i) Voltage The transformation efficiency was measured when the voltage at the time of electroporation was 10, 11.5, 12.5, 15, 17.5 kV / cm. The transformation efficiency was measured twice each to obtain an average value, and was shown as a relative value when the voltage was 11.5 kV / cm and 100.
(Iv-iii) Resistance The transformation efficiency was measured when the resistance values for electroporation were 100, 200, 300, and 400 Ω. The transformation efficiency was measured twice each to obtain an average value, and was shown as a relative value when the resistance value was 200 Ω and 100.
(V) Recovery culture time The transformation efficiency was measured when the recovery culture time after electroporation was 1, 2 or 3 hours. The transformation efficiency was measured twice each to obtain an average value, and was shown as a relative value when the recovery culture time was 3 hours and 100.
(Vi) Buffer type and pH
Washing of electrocompetent cells, suspension buffer added 0.5 M sucrose, 1 mM ammonium citrate (pH 4.0 (2), 5.0 (2), 6.0 (7), 7.0 (4)), 1 mM HEPES ( pH 7.2 (1), 7.5 (1), 8.0 (2)), 1 mM Tris-HCl (pH 8.0 (2), 9.0 (2)) or 1 mM CAPS (pH 10.0 (2), 11.0 (2)) The transformation efficiency was measured. The transformation efficiency was measured the number of times shown in parentheses to obtain the average value, and was shown as a relative value when 100 was used when 1 mM ammonium citrate pH 6.0 was used.
（５）結果
（５−１）制限修飾系の回避
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７から抽出したcrudeなプラスミドを用いて、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の形質転換を行ったところ、形質転換効率は1.1×104 CFU/mg DNA（下記の条件検討を含めた18回の平均）となり、大腸菌から抽出したプラスミドの形質転換効率の1×101 CFU/mg DNA程度から大幅に向上した。この結果から、形質転換用のプラスミドを形質転換に用いる宿主細菌で調製して制限修飾系を回避することが、ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換効率の向上に有効であることが示唆された。
（５−２）形質転換条件の検討
（ｉ）培地
形質転換効率に及ぼす培地の影響を検討した結果、MILS（1% lactose）培地、MILS（1% glucose）培地は0.05% cysteine HCl添加MRS培地の10%程度の形質転換効率であり、0.05% cysteine HCl添加MRS培地が最も高い形質転換効率を示した（図１）。
（ｉｉ）本培養時間
形質転換効率は、本培養時間4時間（OD660=0.7）で最も高値を示し、それより短時間でも長時間でも低下した。本培養時間4時間において、従来法の3時間よりも4.6倍形質転換効率が向上した（図２）。
（ｉｉｉ）エレクトロコンピテントセル濃度
形質転換効率は、エレクトロコンピテントセル濃度が高い方が良好である傾向が見られ、OD660=50、75においてはほぼ同程度であった（図３）。
（ｉｖ）エレクトロポレーション条件
（ｉｖ−ｉ）電圧
形質転換効率は、電圧が高くなるにつれて低下する傾向が見られ、10、11.5、12.5 kV/cmにおいてほぼ同程度の高値を示した（図４）。
（ｉｖ−ｉｉ）抵抗
エレクトロポレーションを行う際の抵抗値において200 Ωで最も形質転換効率が高値であった。それ以上でもそれ以下でも効率が低下する傾向が認められた（図５）。
（ｖ）回復培養時間
エレクトロポレーション後の回復培養時間は長いほど形質転換効率が上昇する傾向が認められた。調べた条件の中では3時間において最も高い形質転換効率を示した（図６）。
（ｖｉ）バッファーの種類とpH
バッファーのpHが高くなるに連れて形質転換効率が上昇する傾向が認められたが、pH 8.0程度でピークに達しそれ以上ではほぼ一定の値となった。調べた中ではpH 9.0が最も良く、従来法のpH6.0の17倍形質転換効率が向上した（図７）。
形質転換条件を検討した結果、本培養時間を３時間から４時間に延長すること、バッファーのpHを8.0以上とすることで、形質転換効率の向上が見られた。特に、バッファーのpHについては、通常pHが高いバッファーはタンパク質の変性を起こし形質転換に悪影響を及ぼすため使用しないことから考えると、予想外の結果である。
(5) Results (5-1) Avoidance of restriction modification system When transformation of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was performed using a crude plasmid extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347, transformation was performed. The efficiency was 1.1 × 10 4 CFU / mg DNA (average of 18 times including the following condition examination), which was significantly improved from the transformation efficiency of 1 × 10 1 CFU / mg DNA of the plasmid extracted from Escherichia coli. From this result, it was suggested that preparing a plasmid for transformation with the host bacterium used for transformation and avoiding the restriction modification system is effective in improving the transformation efficiency of Bifidobacterium spp. ..
(5-2) Examination of transformation conditions (i) Medium As a result of examination of the effect of the medium on the transformation efficiency, MILS (1% lactose) medium and MILS (1% glucose) medium are 0.05% cysteine HCl-added MRS medium. The transformation efficiency was about 10%, and the MRS medium containing 0.05% cysteine HCl showed the highest transformation efficiency (Fig. 1).
(Ii) Main culture time The transformation efficiency showed the highest value at the main culture time of 4 hours (OD660 = 0.7), and decreased for a shorter time or a longer time. In the main culture time of 4 hours, the transformation efficiency was improved 4.6 times as compared with the conventional method of 3 hours (Fig. 2).
(Iii) Electro-competent cell concentration The transformation efficiency tended to be better when the electro-competent cell concentration was higher, and was almost the same at OD660 = 50 and 75 (Fig. 3).
(Iv) Electroporation conditions (iv-i) Voltage transformation efficiency tended to decrease as the voltage increased, showing approximately the same high values at 10, 11.5, and 12.5 kV / cm (Fig. 4). ).
(Iv-ii) resistance The transformation efficiency was the highest at 200 Ω in the resistance value when electroporation was performed. There was a tendency for efficiency to decrease above or below (Fig. 5).
(V) Recovery culture time The longer the recovery culture time after electroporation, the higher the transformation efficiency tended to be. Among the examined conditions, the highest transformation efficiency was shown at 3 hours (Fig. 6).
(Vi) Buffer type and pH
The transformation efficiency tended to increase as the pH of the buffer increased, but it peaked at around pH 8.0 and remained almost constant above that. Among the investigations, pH 9.0 was the best, and the transformation efficiency was improved 17 times that of the conventional pH 6.0 (Fig. 7).
As a result of examining the transformation conditions, it was found that the transformation efficiency was improved by extending the main culture time from 3 hours to 4 hours and setting the pH of the buffer to 8.0 or more. In particular, regarding the pH of the buffer, it is an unexpected result considering that a buffer having a high pH is not usually used because it causes denaturation of proteins and adversely affects transformation.
（６）最適化条件
上記（５）の結果をもとに最適化したビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の形質転換の条件を以下に示す。なお、複数の条件において従来法とほぼ同程度に良好であった場合は、従来法の条件を採用した。
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７を0.05% cysteine HCl添加MRS培地で24時間培養した培養液を0.2 M sucroseを添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に5%（v/v）接種し、OD660が0.7となるまで約4時間培養する。培養終了後氷上で冷却し、遠心分離により集菌する。氷冷した0.5 M sucrose、1 mM Tris-HCl buffer（pH 9.0）で3回菌体を洗浄した後、同バッファーでOD660が50となるように懸濁し、エレクトロコンピテントセルを調製する。39 mlのエレクトロコンピテントセルと1 mlのDNA溶液（好ましくは制限修飾系を回避したDNA約100 ng/ml）とを混合し、エレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーションの条件は1 mm幅のキュベットを用い11.5 kV/cm、200 Ω、25 mFとする。エレクトロポレーション後、4 mlの0.05% cysteine HCl添加MRS培地に懸濁し、気相をCO2ガスで置換し、37℃、3時間回復培養する。インキュベート後、適当量の培養液を、選択薬剤を添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に塗抹し、37℃、5日間嫌気培養する。
(6) Optimization conditions The conditions for transformation of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 optimized based on the result of (5) above are shown below. If the conditions were as good as those of the conventional method under multiple conditions, the conditions of the conventional method were adopted.
Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was cultured in MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl for 24 hours, and the culture medium was inoculated with 5% (v / v) of MRS medium supplemented with 0.2 M sucrose to obtain OD660. Incubate for about 4 hours until 0.7. After culturing, cool on ice and collect bacteria by centrifugation. After washing the cells 3 times with ice-cooled 0.5 M sucrose and 1 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), suspend the cells in the same buffer so that OD660 becomes 50 to prepare electrocompetent cells. Electroporation is performed by mixing 39 ml of electrocompetent cells with 1 ml of DNA solution (preferably about 100 ng / ml of DNA that bypasses the restriction modification system). The conditions for electroporation are 11.5 kV / cm, 200 Ω, and 25 mF using a 1 mm wide cuvette. After electroporation, suspend in 4 ml of MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl, replace the gas phase with CO 2 gas, and perform recovery culture at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, an appropriate amount of the culture solution is smeared on 0.05% cysteine HCl-added MRS medium supplemented with the selected drug, and anaerobically cultured at 37 ° C. for 5 days.
（７）最適化条件の形質転換効率
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出、精製したプラスミドを用いて、最適化した条件と従来法の条件で形質転換効率を比較した。形質転換効率の値は平均値±標準偏差（SD）で表した。有意差検定にはStudent’s t検定を使用した。その結果、従来法の形質転換効率が2.7×105CFU/mg DNAであったのに対し、最適化した条件では2.6×106CFU/mg DNAと有意に9.6倍高かった（図８）。
(7) Transformation efficiency under optimized conditions Using a plasmid extracted and purified from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347, the transformation efficiency was compared between the optimized conditions and the conventional conditions. The value of transformation efficiency was expressed as mean ± standard deviation (SD). The Student's t-test was used for the significance test. As a result, the transformation efficiency of the conventional method was 2.7 × 10 5 CFU / mg DNA, whereas under the optimized conditions, it was 2.6 × 10 6 CFU / mg DNA, which was significantly 9.6 times higher (Fig. 8).
実施例２ ビフィドバクテリウム属細菌の形質転換２
（１）使用菌株、プラスミド、培地および培養条件
ビフィドバクテリウム・ロンガム サブスピーシーズ インファンティス ＹＩＴ ４０１８Ｔを宿主として使用した。形質転換用のプラスミドとして、pBDSNBb1F（スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む、ビフィズス菌と大腸菌のシャトルベクター）を使用した。ＹＩＴ ４０１８Ｔ株の培養には、0.5% glucose添加GAM培地を使用した。培地中の溶存酸素をCO2ガスで置換し、37℃、嫌気条件下、静置で培養した。
Example 2 Transformation of Bifidobacterium spp. 2
(1) Strain used, plasmid, medium and culture conditions Bifidobacterium longum subspecies Infantis YIT 4018 T was used as a host. As a plasmid for transformation, pBDSNBb1F (a shuttle vector of bifidobacteria and Escherichia coli containing a spectinomycin resistance gene) was used. GAM medium supplemented with 0.5% glucose was used for culturing the YIT 4018 T strain. Dissolved oxygen in the medium was replaced with CO 2 gas, and the cells were cultured statically at 37 ° C. under anaerobic conditions.
（２）バッファーの種類とpHが形質転換効率に与える影響の検討
ＹＩＴ ４０１８Ｔ株におけるpBDSNBb1Fの形質転換において、エレクトロコンピテントセルの洗浄、懸濁バッファーの種類とpHが形質転換効率に与える影響を調べた。バッファーとしては、10% glycerol、1mM citrate（pH 5.0、6.0）、1mM HEPES（pH 7.5）、1mM Tris-HCl（pH 9.0）又は1mM CAPS（pH 11.0）を用い、形質転換は次の方法により行った。具体的には、ＹＩＴ ４０１８Ｔ株を0.5% glucose添加GAM培地で24時間培養した培養液を同培地100 mlに2%（v/v）接種し、OD660が0.5となるまで約7時間培養した。培養終了後氷上で冷却し、遠心分離（7000 rpm、0℃、10 min）により集菌した。氷冷したバッファーで3回菌体を洗浄した後、同バッファーでOD660が50となるように懸濁し、エレクトロコンピテントセルを調製した。39 mlのエレクトロコンピテントセルと1 mlのpBDSNBb1FプラスミドDNA溶液（100 ng/ml）とを混合し、ジーンパルサーII（BIO-RAD）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は1 mm幅のキュベット（MBP）を用い11.5 kV/cm、200 Ω、25 mFとした。エレクトロポレーション後、4 ml の0.5% glucose添加GAM培地に懸濁し、気相をCO2ガスで置換し、37℃、3時間回復培養した。インキュベート後、適当量の培養液をスペクチノマイシン （128 mg/ml） を添加した0.5% glucose添加GAM培地に塗抹し、37℃、5-6日間嫌気培養した。各バッファーを使用したときの形質転換効率（CFU/mg DNA）は、それぞれ2回ずつ測定して平均値を求め、従来用いられるpH 6.0のバッファーを使用したときの形質転換効率を100としたときの相対値として示した。
(2) Examination of the effect of buffer type and pH on transformation efficiency In the transformation of pBDSNBb1F in YIT 4018 T strain, washing of electrocompetent cells and the effect of suspension buffer type and pH on transformation efficiency Examined. As a buffer, use 10% glycerol, 1 mM citrate (pH 5.0, 6.0), 1 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM Tris-HCl (pH 9.0) or 1 mM CAPS (pH 11.0), and transform by the following method. It was. Specifically, the culture medium obtained by culturing the YIT 4018 T strain in a GAM medium containing 0.5% glucose for 24 hours was inoculated into 100 ml of the same medium at 2% (v / v) and cultured for about 7 hours until the OD660 became 0.5. .. After completion of the culture, the cells were cooled on ice and collected by centrifugation (7000 rpm, 0 ° C., 10 min). After washing the cells three times with ice-cooled buffer, the cells were suspended in the same buffer so that OD660 was 50, and an electrocompetent cell was prepared. 39 ml of electrocompetent cells and 1 ml of pBDSNBb1F plasmid DNA solution (100 ng / ml) were mixed and electroporated with Genepulsar II (BIO-RAD). The electroporation conditions were 11.5 kV / cm, 200 Ω, and 25 mF using a 1 mm wide cuvette (MBP). After electroporation, the cells were suspended in 4 ml of 0.5% glucose-added GAM medium, the gas phase was replaced with CO 2 gas, and the cells were recultured at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, an appropriate amount of culture medium was smeared on GAM medium containing 0.5% glucose added with spectinomycin (128 mg / ml), and anaerobically cultured at 37 ° C. for 5-6 days. The transformation efficiency (CFU / mg DNA) when each buffer was used was measured twice each to obtain the average value, and when the transformation efficiency when using the conventionally used pH 6.0 buffer was 100. It is shown as a relative value of.
（３）結果
形質転換効率は、pHが高くなるに連れて上昇する傾向が認められた（図９）。この結果から、ＹＩＴ ４０１８Ｔ株を用いた場合であっても、pH 8.0以上のバッファーを用いることで形質転換効率が向上することが示された。
(3) Results The transformation efficiency tended to increase as the pH increased (Fig. 9). From this result, it was shown that even when the YIT 4018 T strain was used, the transformation efficiency was improved by using a buffer having a pH of 8.0 or higher.
比較例 ラクトバチルス属細菌の形質転換
ラクトバチルス・カゼイ ＡＴＣＣ ２７１３９を宿主として使用し、形質転換用のプラスミドとして、pUCYIT356-1-Not2（大腸菌と乳酸桿菌のシャトルベクター、100 ng）を使用した。ＡＴＣＣ ２７１３９株におけるpUCYIT356-1-Not2の形質転換において、エレクトロコンピテントセルの洗浄、懸濁バッファーのpHが形質転換効率に与える影響を調べた。バッファーとしては、1mM HEPES（pH 7.0、7.5、8.0）を用い、形質転換は次の方法により行った。具体的には、ＡＴＣＣ ２７１３９株をILS培地で24時間培養した培養液を同培地20 mlに2.5%（v/v）接種し、2時間培養した。培養終了後氷上で冷却し、遠心分離（7500 rpm、4℃、10 min）により集菌した。氷冷したバッファーで3回菌体を洗浄した後、1/400 量の同液に懸濁した菌体懸濁液をエレクトロコンピテントセル（5.0 × 1010 CFU/ml）とした。40 mlのエレクトロコンピテントセルと1 mlのpUCYIT356-1-Not2プラスミドDNA溶液（100 ng/ml）とを混合し、ジーンパルサーX cell（BIO-RAD）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は2 mm幅のキュベット（MBP）を用い8.75 kV/cm、400 Ω、25 mFとした。エレクトロポレーション後、1 ml の0.5M Sucrose添加GAM培地に懸濁し、37℃、1.5時間回復培養した。インキュベート後、適当量の培養液をエリスロマイシン（25 mg/ml）を添加した0.5M Sucrose添加GAM培地に塗抹し、37℃、2日間嫌気培養した。各バッファーを使用したときの形質転換効率（CFU/mg DNA）は、それぞれ3回ずつ測定して平均値を求め、最適化条件であるpH 7.0のバッファーを使用したときの形質転換効率を100としたときの相対値として示した。
その結果、形質転換効率は、pH 7.0のバッファーを用いた場合に比してpH 7.5のバッファーを用いた場合に上昇する傾向が認められたが、pH 8.0のバッファーを用いた場合には有意に減少した（図１０）。よって、ラクトバチルス属細菌の形質転換では、バッファーのpHを8.0以上に高めても形質転換効率は向上しないことが示唆された。
Comparative Example Lactobacillus bacterium Transformation Lactobacillus casei ATCC 27139 was used as a host, and pUCYIT356-1-Not2 (shuttle vector of Escherichia coli and lactic acid bacillus, 100 ng) was used as a plasmid for transformation. In the transformation of pUCYIT356-1-Not2 in the ATCC 27139 strain, the effect of washing the electrocompetent cells and the pH of the suspension buffer on the transformation efficiency was investigated. As a buffer, 1 mM HEPES (pH 7.0, 7.5, 8.0) was used, and transformation was carried out by the following method. Specifically, a culture solution obtained by culturing the ATCC 27139 strain in ILS medium for 24 hours was inoculated into 20 ml of the medium in 2.5% (v / v) and cultured for 2 hours. After completion of the culture, the cells were cooled on ice and collected by centrifugation (7500 rpm, 4 ° C, 10 min). After washing the cells three times with an ice-cooled buffer, the cell suspension suspended in 1/400 volume of the same solution was used as an electrocompetent cell (5.0 × 10 10 CFU / ml). 40 ml of electrocompetent cells and 1 ml of pUCYIT356-1-Not2 plasmid DNA solution (100 ng / ml) were mixed and electroporated using Genepulsar X cell (BIO-RAD). The electroporation conditions were 8.75 kV / cm, 400 Ω, and 25 mF using a 2 mm wide cuvette (MBP). After electroporation, the cells were suspended in 1 ml of 0.5 M Sucrose-added GAM medium and recultured at 37 ° C. for 1.5 hours. After incubation, an appropriate amount of the culture solution was smeared on 0.5M Sucrose-added GAM medium supplemented with erythromycin (25 mg / ml), and anaerobically cultured at 37 ° C. for 2 days. The transformation efficiency (CFU / mg DNA) when each buffer was used was measured 3 times each to obtain the average value, and the transformation efficiency when using the buffer of pH 7.0, which is the optimization condition, was set to 100. It is shown as a relative value when
As a result, the transformation efficiency tended to increase when the pH 7.5 buffer was used as compared with the case where the pH 7.0 buffer was used, but it was significantly higher when the pH 8.0 buffer was used. It decreased (Fig. 10). Therefore, it was suggested that in the transformation of Lactobacillus bacteria, the transformation efficiency does not improve even if the pH of the buffer is increased to 8.0 or higher.
実施例３ ビフィドバクテリウム属細菌のトランスポゾン挿入変異株の作製
（１）使用菌株、培地、および培養条件
ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７、大腸菌ＪＭ１０９を使用した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の培養には0.05% cysteine HCl添加MRS培地、大腸菌の培養にはLB培地を用いた。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７のエレクトロコンピテントセル作製のための本培養には0.2 M sucroseを添加した。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７は、培地の溶存酸素を炭酸ガスで置換し、37℃、嫌気条件下で静置培養した。大腸菌は、37℃、好気条件下で振とう培養した。
Example 3 Preparation of transposon-inserted mutant strain of Bifidobacterium spp. (1) Strain used, medium, and culture conditions Bifidobacterium bifidum YIT 10347 and Escherichia coli JM109 were used. MRS medium containing 0.05% cysteine HCl was used for culturing Bifidobacterium Bifidum YIT 10347, and LB medium was used for culturing Escherichia coli. 0.2 M sucrose was added to the main culture for the preparation of electrocompetent cells of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347. Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was cultured statically at 37 ° C. under anaerobic conditions by substituting dissolved oxygen in the medium with carbon dioxide gas. Escherichia coli was cultured with shaking at 37 ° C. under aerobic conditions.
（２）トランスポゾンDNA作製用プラスミド（pMOD-pBDcat及びpBDMcat）の構築
pBDCNBb1Fからスタフィロコッカス・アウレウス ｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）をプライマー（InFusion-FW2およびInFusion-RV2、表２）を用いてPCRにて増幅した。この断片をEZ-Tn5TM pMODTM-2<MCS> Transposon Construction Vector（epicentre）のトランスポゼースの認識配列19-bp Mosaic Ends（ME）の間にあるEcoR I-Hind III切断部位に挿入し、pMOD-pBDcatを作製した。次に、このpMOD-pBDcatからプライマー（InFusion-FWおよびInFusion-RV、表２）を用いて、CAT遺伝子を両端に存在するME配列とともにPCRにて増幅し、このDNA断片をビフィドバクテリウム・ブレーベ ＡＴＣＣ １５６９８株由来のプラスミドpNBb1と大腸菌由来のプラスミドpUC19の両方の複製領域を持つプラスミドpBDSNBb1FのSal I-Hind III部位に挿入し、pBDMcatを作製した。なお、DNA断片の増幅にはPrimeSTAR Max DNA polymerase（Takara Bio Inc.）、DNA断片の連結にはIn-Fusion HD Cloning Kit（Takara Bio Inc.）、コンピテントセルは大腸菌ＪＭ１０９（Takara Bio Inc.）をそれぞれ用いた。pMOD-pBDcatおよびpBDMcatの挿入領域の塩基配列は、それぞれPCR-FwまたはPCR-Rv（表２）、pBD-seq-FW、PCR-Fw、またはM13 Reverse（表２）のプライマーを用いてシーケンスを行い確認した。形質転換したコロニー等はLB培地を用いて培養を行い、抗生物質はアンピシリンが終濃度100 mg/ml、クロラムフェニコールが10 mg/mlとなるよう培地に添加した。プラスミド作製スキームを図１１に示す。
(2) Construction of plasmids for transposon DNA production (pMOD-pBDcat and pBDMcat)
The chloramphenicol resistance gene (CAT) derived from Staphylococcus aureus pC194 from pBDCNBb1F was amplified by PCR using primers (InFusion-FW2 and InFusion-RV2, Table 2). This fragment was inserted into the EcoR I-Hind III cleavage site between the transposal recognition sequences 19-bp Mosaic Ends (ME) of the EZ-Tn5 TM pMOD TM -2 <MCS> Transposon Construction Vector (epicentre) and pMOD- A pBDcat was prepared. Next, using primers (InFusion-FW and InFusion-RV, Table 2) from this pMOD-pBDcat, the CAT gene was amplified by PCR together with the ME sequences present at both ends, and this DNA fragment was amplified by Bifidobacterium. A pBDMcat was prepared by inserting into the Sal I-Hind III site of the plasmid pBDSNBb1F having replication regions of both the plasmid pNBb1 derived from the Brave ATCC 15698 strain and the plasmid pUC19 derived from Escherichia coli. PrimeSTAR Max DNA polymerase (Takara Bio Inc.) for amplification of DNA fragments, In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) for ligation of DNA fragments, and Escherichia coli JM109 (Takara Bio Inc.) for competent cells. Were used respectively. The nucleotide sequences of the insertion regions of pMOD-pBDcat and pBDMcat are sequenced using primers of PCR-Fw or PCR-Rv (Table 2), pBD-seq-FW, PCR-Fw, or M13 Reverse (Table 2), respectively. I did and confirmed. Transformed colonies and the like were cultured in LB medium, and antibiotics were added to the medium so that ampicillin had a final concentration of 100 mg / ml and chloramphenicol had a final concentration of 10 mg / ml. The plasmid preparation scheme is shown in FIG.
（３）プロモーターを置換したトランスポゾンDNA作製用プラスミド（pBDMcat4及びpBDMcat5）の構築
CAT遺伝子のプロモーターを高発現プロモーターに改変した。具体的には、プロモーター改変プラスミドの鋳型として、上記（２）で得たpBDMcatを用いた。プロモーターの鋳型として、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ＹＩＴ １２２７２およびビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７のelongation factorには、それぞれの菌の染色体DNAを用いた。インサート及びベクターDNAの増幅用PCRに用いたプライマーは表２にまとめた。当該プライマーにてpBDMcatを増幅したところ、アガロースゲル電気泳動にてバンドが２本認められたため、目的の大きさのバンドを切り出した。増幅したインサート断片をベクターDNA断片と連結し、pBDMcat4及びpBDMcat5を得た。DNA断片の増幅にはPrimeSTAR Max DNA polymeraseを用いた。DNA断片の連結にはIn-Fusion HD Cloning Kit、コンピテントセルは大腸菌ＪＭ１０９をそれぞれ用いた。構築したプラスミドの挿入領域の塩基配列は、PCR-FwまたはM13 Reverse（表２）のプライマーを用いてシーケンスを行い確認した。形質転換したコロニー等は、LB培地を用いて培養を行い、抗生物質はクロラムフェニコールが10 mg/mlとなるように培地に添加した。CAT遺伝子のプロモーターの置換スキームを図１２に示す。
(3) Construction of plasmids for producing transposon DNA (pBDMcat4 and pBDMcat5) in which promoters are substituted
The promoter of the CAT gene was modified to a highly expressed promoter. Specifically, the pBDMcat obtained in (2) above was used as a template for the promoter-modified plasmid. As a promoter template, the chromosomal DNA of each bacterium was used as the elongation factor of Bifidobacterium breve YIT 12272 and Bifidobacterium Bifidum YIT 10347. The primers used for PCR for amplification of inserts and vector DNA are summarized in Table 2. When pBDMcat was amplified with the primer, two bands were found by agarose gel electrophoresis, so a band of the desired size was cut out. The amplified insert fragment was ligated with the vector DNA fragment to obtain pBDMcat4 and pBDMcat5. PrimeSTAR Max DNA polymerase was used to amplify the DNA fragment. In-Fusion HD Cloning Kit was used for ligation of DNA fragments, and Escherichia coli JM109 was used as competent cells. The nucleotide sequence of the insertion region of the constructed plasmid was confirmed by sequencing using PCR-Fw or M13 Reverse (Table 2) primers. Transformed colonies and the like were cultured in LB medium, and antibiotics were added to the medium so that chloramphenicol was 10 mg / ml. The replacement scheme of the promoter of the CAT gene is shown in FIG.
（３）ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７におけるプラスミドの抽出
プラスミドの抽出は、実施例１（２）に記載の方法で行った。
(3) Extraction of plasmid in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 The plasmid was extracted by the method described in Example 1 (2).
（４）トランスポゾンDNAフラグメントの調製
トランスポゾンDNAフラグメントは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出したプラスミドをそれぞれ制限酵素切断後、電気泳動を行い、ゲルから切り出して調製した。具体的には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出したpBDMcat4はPvu IIを用いて、pBDMcat5はPshA Iを用いて切断し、電気泳動後目的のサイズのバンドをゲルより切り出した。DNA断片のゲルからの切り出しはQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を使用した。
(4) Preparation of Transposon DNA Fragment The transposon DNA fragment was prepared by cleaving each plasmid extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 with a restriction enzyme, performing electrophoresis, and cutting out from a gel. Specifically, pBDMcat4 extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was cleaved using Pvu II, and pBDMcat5 was cleaved using PshAI, and a band of the desired size was excised from the gel after electrophoresis. The QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) was used to cut out DNA fragments from gel.
（５）トランスポソームの作製
トランスポゾンDNA溶液と等量の100% glycerol溶液と2倍量のEZ-Tn5 transposaseを混合し、室温で30分インキュベートさせてトランスポソームを形成させた。ビフィドバクテリウム・ブレーベ elongation factorのプロモーターを含むトランスポソームサンプルは-30℃で6日間又は30日間保存したものも使用した。
(5) Preparation of transposome A transposon DNA solution, an equal amount of 100% glycerol solution and a double amount of EZ-Tn5 transposase were mixed and incubated at room temperature for 30 minutes to form a transposome. Transposome samples containing the promoter of Bifidobacterium breve elongation factor were also stored at -30 ° C for 6 or 30 days.
（６）ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７における形質転換
トランスポソームを用いた形質転換は、実施例１で最適化した方法で行った。具体的には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７を0.05% cysteine HCl添加MRS培地で24時間培養した培養液を0.2 M sucroseを添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に5%（v/v）接種し、OD660が0.7となるまで約4時間培養した。培養終了後氷上で冷却し、遠心分離（7000 rpm、0℃、10 min）により集菌した。氷冷した0.5 M sucrose、1 mM Tris-HCl buffer（pH 9.0）で3回菌体を洗浄した後、同バッファーでOD660が50となるように懸濁し、エレクトロコンピテントセルを調製した。39 mlのエレクトロコンピテントセルと1 mlのトランスポソーム溶液（DNA濃度53-75 ng/ml）とを混合し、ジーンパルサーII（BIO-RAD）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は1 mm幅のキュベット（MBP）を用い11.5 kV/cm、200 Ω、25 mFとした。エレクトロポレーション後、4 ml の0.05% cysteine HCl添加MRS培地に懸濁し、37℃、3時間回復培養した。インキュベート後、遠心分離（7000 rpm、20℃、5 min）により余分な上澄みを捨て、残った少量の培養液で懸濁した全量を、クロラムフェニコール（8 mg/ml）を添加した0.05% cysteine HCl添加MRS培地に塗抹し、37℃、5日間嫌気培養した。
(6) Transformation in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 Transformation using a transposome was carried out by the method optimized in Example 1. Specifically, the culture medium obtained by culturing Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 in MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl for 24 hours was added to 0.05% MRS medium supplemented with 0.2 M sucrose and 5% (v / v). Inoculated and cultured for about 4 hours until OD660 reached 0.7. After completion of the culture, the cells were cooled on ice and collected by centrifugation (7000 rpm, 0 ° C., 10 min). The cells were washed 3 times with ice-cooled 0.5 M sucrose and 1 mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), and then suspended in the same buffer so that OD660 was 50 to prepare electrocompetent cells. 39 ml of electrocompetent cells and 1 ml of transposome solution (DNA concentration 53-75 ng / ml) were mixed and electroporated with Genepulsar II (BIO-RAD). The electroporation conditions were 11.5 kV / cm, 200 Ω, and 25 mF using a 1 mm wide cuvette (MBP). After electroporation, the cells were suspended in 4 ml of MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl and recultured at 37 ° C. for 3 hours. After incubation, the excess supernatant was discarded by centrifugation (7000 rpm, 20 ° C, 5 min), and the total amount suspended in the remaining small amount of culture medium was added with chloramphenicol (8 mg / ml) at 0.05%. The cells were smeared on MRS medium supplemented with cysteine HCl and anaerobically cultured at 37 ° C. for 5 days.
（７）コロニーPCR
形質転換後生育したコロニーを50 mlのTEに懸濁し、94℃、3 min加熱した。この熱処理液1 mlをテンプレートとしトランスポゾンDNAを標的としたPCRを行った。プライマーはProbe-FwおよびCm-Rv（表２）を使用し、Takara Ex Taq（Takara Bio Inc.）を用いて増幅した。
(7) Colony PCR
The colonies grown after transformation were suspended in 50 ml TE and heated at 94 ° C for 3 min. PCR targeting transposon DNA was performed using 1 ml of this heat treatment solution as a template. As primers, Probe-Fw and Cm-Rv (Table 2) were used, and amplification was performed using Takara Ex Taq (Takara Bio Inc.).
（８）染色体DNAの抽出
トランスポゾン挿入変異株の染色体DNAの抽出は以下の方法により行った。具体的には、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）を使用し、培養液1 mlからゲノムDNAを抽出した。0.05% cysteine HCl添加MRS培地で一晩培養した培養液を13000 rpm、2 分遠心し菌体を回収した。溶菌反応時にMutanolysin（1 mg/ml）を10 ml追加した。溶菌終了後RNase（100 mg/ml）を4 ml添加し、室温で2分インキュベートし、RNAを分解した。その他は添付のプロトコールに従って抽出操作を行った。
(8) Extraction of chromosomal DNA The chromosomal DNA of the transposon-inserted mutant strain was extracted by the following method. Specifically, genomic DNA was extracted from 1 ml of culture medium using the DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). The culture broth cultured overnight in MRS medium supplemented with 0.05% cysteine HCl was centrifuged at 13000 rpm for 2 minutes to collect the cells. During the lysis reaction, 10 ml of Mutanolysin (1 mg / ml) was added. After completion of lysis, 4 ml of RNase (100 mg / ml) was added and incubated at room temperature for 2 minutes to decompose RNA. For others, the extraction operation was performed according to the attached protocol.
（９）インバースPCR
染色体DNA 1 mgをトランスポゾン内に消化部位を持たない、Hae II、BamH I、Sal Iを用いて消化し、消化断片をフェノール クロロホルム イソアミルアルコール溶液で抽出し、エタノール沈殿で精製した。DNA断片をLigation high（TOYOBO）を用い、16℃、30分反応し自己環状化させた。このDNAを鋳型とし、プライマー（Sq-Fw、Sq-Rv、表２）を用いてPCRによりトランスポゾン挿入部位の周辺領域を増幅した。
(9) Inverse PCR
1 mg of chromosomal DNA was digested with Hae II, BamHI, and Sal I, which have no digestion site in the transposon, and the digested fragments were extracted with phenol chloroform isoamyl alcohol solution and purified by ethanol precipitation. The DNA fragment was self-circulated by reacting with Ligation high (TOYOBO) at 16 ° C. for 30 minutes. Using this DNA as a template, the peripheral region of the transposon insertion site was amplified by PCR using primers (Sq-Fw, Sq-Rv, Table 2).
（１０）遺伝子配列の決定
インバースPCRで増幅した断片をHigh Pure PCR Product Purification Kit（Roche）を用いて精製した。精製したPCR産物は、BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）、3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて塩基配列を決定した。プライマーはSq-FwおよびSq-Rv（表２）を用いた。
(10) Determination of gene sequence Fragments amplified by inverse PCR were purified using the High Pure PCR Product Purification Kit (Roche). The purified PCR product was sequenced using the BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sq-Fw and Sq-Rv (Table 2) were used as primers.
（１１）結果
（１１−１）プラスミドの構築
トランスポゾンDNA作製用のプラスミドを構築したところ（図１１、図１２）、プラスミド作製の過程において、プラスミドによって大腸菌のコロニーの大きさに違いが見られた。pMOD-pBDcatは、10 mg/mlクロラムフェニコール添加培地でコロニー形成が小さかったが、pBDMcatは、同培地で通常の大きさのコロニーを形成した。pBDMcatの系列のプラスミドでは、pBDMcat4は種々の大きさのコロニー、pBDMcat5は通常の大きさのコロニーを形成した。以上より、プラスミドやプロモーターの違いにより、CAT遺伝子の発現量が異なることが推察された。
（１１−２）トランスポゾン挿入変異株の取得
CAT遺伝子のプロモーター領域をビフィドバクテリウム・ブレーベおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７のelongation factorのプロモーター領域に置換したトランスポゾンDNAにおいては、それぞれ平均132個、9.3個のトランスポゾン挿入変異株が得られ（表３）、一部調べたコロニーでは、ランダムにトランスポゾンが挿入していた。
ビフィドバクテリウム・ブレーベのelongation factorのプロモーター領域に置換したトランスポゾンDNAを用いて作製したトランスポソームを-30℃で6日間又は30日間保存した後エレクトロポレーションをしたところ、それぞれ430個、1021個のトランスポゾン挿入変異株が得られ、用時調製したサンプルと比較して3〜7倍以上のトランスポゾン挿入変異株が得られた（表４）。
(11) Results (11-1) Construction of plasmid When a plasmid for transposon DNA preparation was constructed (Figs. 11 and 12), differences in the size of E. coli colonies were observed depending on the plasmid in the process of plasmid preparation. .. pMOD-pBDcat formed small colonies in the medium supplemented with 10 mg / ml chloramphenicol, whereas pBDMcat formed colonies of normal size in the same medium. In the pBDMcat series of plasmids, pBDMcat4 formed colonies of various sizes and pBDMcat5 formed colonies of normal size. From the above, it was inferred that the expression level of the CAT gene differs depending on the plasmid and promoter.
(11-2) Acquisition of transposon insertion mutant strain
In the transposon DNA in which the promoter region of the CAT gene was replaced with the promoter region of the elongation factor of Bifidobacterium breve and Bifidobacterium bifidam YIT 10347, an average of 132 and 9.3 transposon insertion mutants were obtained, respectively. (Table 3) Transposons were randomly inserted in some of the examined colonies.
Transposomes prepared using transposon DNA substituted for the promoter region of the elongation factor of Bifidobacterium breve were stored at -30 ° C for 6 or 30 days and then electroporated. As a result, 430 and 1021 were electroporated, respectively. The transposon-inserted mutant strain of No. 1 was obtained, and the transposon-inserted mutant strain was obtained 3 to 7 times or more as compared with the sample prepared at the time of use (Table 4).
以上より、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７においてトランスポゾン挿入変異株の効率的な取得が可能となった。トランスポゾン挿入変異株ライブラリの作製には、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の遺伝子数約1600の2〜3倍の変異株が必要であるが、今回1回のエレクトロポレーションで430〜1021個のトランスポゾン挿入変異株が得られたことから、複数回エレクトロポレーションを行って変異株を増やすことで、トランスポゾン挿入変異株ライブラリを構築できることが示唆された。 From the above, it has become possible to efficiently obtain a transposon insertion mutant strain in Bifidobacterium Bifidum YIT 10347. To prepare a transposon-inserted mutant library, two to three times as many mutants as the number of genes of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347, which is about 1600, are required. Since the transposon-inserted mutant strain was obtained, it was suggested that the transposon-inserted mutant strain library could be constructed by increasing the number of mutant strains by performing electroporation multiple times.
実施例４ ビフィドバクテリウム属細菌のトランスポゾン挿入変異株ライブラリの構築
実施例３記載のビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出したプラスミドpBDMcat4（CAT遺伝子のプロモーターがビフィドバクテリウム・ブレーベ由来のelongation factor）から調製したトランスポゾンDNAを用い、実施例３（５）と同様にしてトランスポソームを作製し、-30℃で30日間保存した。当該トランスポソーム（DNA濃度70 ng/ml)を用い、実施例３（６）と同様にビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の形質転換を複数回行い、計2685株のトランスポゾン挿入変異株を得て、変異株ライブラリを構築した。
得られた変異株のうち100株について、シーケンスによりトランスポゾン挿入部位を確認した。100株のうち、培養ができない1株及び挿入部位が重複した11株を除いた88株を解析し、挿入部位をビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７染色体上にマッピングしたところ（図１３）、トランスポゾンは染色体上に偏りなく挿入されていた。88株の内、トランスポゾンが遺伝子に挿入されていたのが75株、そのうち同一遺伝子に挿入されていたのが5株あったので、70株で異なる遺伝子にトランスポゾンが挿入されていた。よって、2685株のライブラリでは、約1150の遺伝子の変異株が得られることになる。ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７の遺伝子数は1613であり、遺伝子の大部分をカバーした実用的なレベルのライブラリが構築できたと考えられる。
次に、トランスポゾン挿入変異株8株（ＧＳＢ１、ＧＳＢ２、ＧＳＢ５７７、ＧＳＢ５７８、ＧＳＢ１５３７、ＧＳＢ１５３８、ＧＳＢ１８２５、ＧＳＢ１８２６）の初代培養株及び5回継代培養株より、染色体DNAを抽出してSal Iで切断し、トランスポゾン特異的な配列を標的とするプライマーセット（Probe-Fw: TTCTCGGGTGTTCTCGCATAT、Probe-Rv: GTTGGCTAGTGCGTAGTCGTT）を用いてpBDMcat4より増幅した断片をプローブとしてサザン解析を行った（図１４）。ネガティブコントロールには、トランスポゾンを挿入していないビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７より抽出した染色体DNAをSal Iで切断したDNA断片（WT）を、ポジティブコントロールには、プローブDNA断片を用いた。その結果、株によって異なる位置にバンドが1本検出され、当該バンドの位置は継代培養の回数に関わらず同じであった。よって、トランスポゾンは染色体上に1箇所挿入されており、継代培養しても、転移や脱落することなく安定して保持されていることが明らかとなった。
Example 4 Construction of transposon-inserted mutant library of Bifidobacterium genus Bacteria The plasmid pBDMcat4 (CAT gene promoter is derived from Bifidobacterium breve) extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 described in Example 3 Using the transposon DNA prepared from factor), a transposome was prepared in the same manner as in Example 3 (5), and stored at -30 ° C for 30 days. Using the transposome (DNA concentration 70 ng / ml), transformation of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 was performed multiple times in the same manner as in Example 3 (6) to obtain a total of 2685 transposon-inserted mutant strains. , Constructed a mutant strain library.
The transposon insertion site was confirmed by sequencing for 100 of the obtained mutant strains. Of the 100 strains, 88 strains excluding 1 strain that could not be cultured and 11 strains with overlapping insertion sites were analyzed, and the insertion site was mapped on the bifidobacteria bifidam YIT 10347 chromosome (Fig. 13). Was evenly inserted on the chromosome. Of the 88 strains, 75 had transposons inserted into the gene, and 5 of them had the same gene inserted, so 70 strains had transposons inserted into different genes. Therefore, in the library of 2685 strains, mutant strains of about 1150 genes can be obtained. The number of genes of Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 is 1613, and it is considered that a practical level library covering most of the genes could be constructed.
Next, chromosomal DNA was extracted from the primary culture strain and the 5-passage culture strain of eight transposon-inserted mutant strains (GSB1, GSB2, GSB577, GSB578, GSB1537, GSB1538, GSB1825, GSB1826) and cleaved with Sal I. Southern analysis was performed using a fragment amplified from pBDMcat4 using a primer set (Probe-Fw: TTCTCGGGTGTTCTCGCATAT, Probe-Rv: GTTGGCTAGTGCGTAGTCGTT) targeting a transposon-specific sequence (Fig. 14). A DNA fragment (WT) obtained by cutting chromosomal DNA extracted from Bifidobacterium Bifidum YIT 10347 without a transposon inserted with Sal I was used for the negative control, and a probe DNA fragment was used for the positive control. As a result, one band was detected at a different position depending on the strain, and the position of the band was the same regardless of the number of subcultures. Therefore, it was clarified that the transposon was inserted at one place on the chromosome and was stably retained without metastasis or shedding even after subculture.
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