JP6736566B2 - 生物学的機器校正のための方法及びシステム - Google Patents

Description

一般に、操作者が意図された目的のために生物学的分析システムをより迅速に且つ効率的に使用することができるように、生物学的分析システムの設置及び設定を単純化する必要性がますます高まっている。

実験機器の設置及び校正は、時間がかかり且つ高価なプロセスとなり得る。多くの場合において、これらのプロセスを実行するために機器供給業者の技術者が現場にいる必要がある。このコストは、一般に、ユーザに渡される。いくつかの場合において、経験豊富なユーザは、多段階手順を使用して適切に製造された機器を成功裏に校正することができる。そのような校正中において、物理的標準及びウェルプレートが手動手順と組み合わせて使用され することができる。手動校正処理及びデータ検査は、誤りが発生しやすく、臨時又は主観的措置に依存することがある。最終的なシステム検証ステップは、準最適な校正を許容することに対する回復力を提供することができるが、自動化は、そのような活動中に改善された客観性及び一貫性を提供する。

１つの例示的な実施形態において、機器を校正するための方法が提供される。機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む。本方法は、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することを含む。本方法は、さらに、蛍光色素の生スペクトルを蛍光色素の純スペクトル校正データと比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することを含む。本方法は、さらに、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することを含む。本方法は、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行することを含む。

他の例示的な実施形態において、機器を校正するためのプロセッサ実行可能命令によって符号化されたコンピュータ可読記憶媒体が提供される。機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む。本命令は、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行するための命令を含む。本命令は、蛍光色素の生スペクトルを蛍光色素の純スペクトル校正データと比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行するための命令を含む。本命令は、さらに、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行するための命令を含む。本命令は、さらに、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を含む。

他の例示的な実施形態において、機器を校正するためのシステムが提供される。機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む。本システムは、プロセッサ実行可能命令によって符号化されたプロセッサ及びメモリを備える。本命令は、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行し、蛍光色素の生スペクトルを蛍光色素の純スペクトル校正データと比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行するための命令を含む。本命令は、さらに、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行することとを含む。

他の例示的な実施形態において、機器を校正するためのシステムが提供される。機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む。本システムは、画像内の反応部位位置を判定するように構成されたＲＯＩ校正部を含む。本システムは、蛍光色素の生スペクトルを蛍光色素の純スペクトル校正データと比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように構成された純色素校正部を含む。本システムは、さらに、フィルタ正規化係数を判定するように構成された機器正規化校正部を含む。機器は、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するように構成されたリボヌクレアーゼＰ検証部を含む。本システムは、さらに、校正結果を表示するように構成されたディスプレイエンジンを含む。
例えば、本願は以下の項目を提供する。
（項目１）
機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む前記機器を校正するための方法であって、
画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、
蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、
フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、
前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行すること
を備える、方法。
（項目２）
前記ＲＯＩ校正が、
各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、
各ＲＯＩの中心位置を推定することと、
各ＲＯＩのサイズを推定することと、
前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定することと、
グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、
前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、前記グローバル・グリッディング・モデルの適用が前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、
欠落したＲＯＩを回復することと、
前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整が前記光学系の信号対雑音比を向上させること
を備える、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＲＯＩ校正が、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記純色素校正が、
複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、前記サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、
前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、
各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、
色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成すること
を備える、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、前記機器正規化校正が、
前記励起フィルタ及び前記発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、
データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用すること
を備える、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記フィルタ正規化係数が、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記リボヌクレアーゼＰ検証が、
複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、前記検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、
前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、
前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ _ｔ ）の第１のセット及び前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ _ｔ 値の第２のセットを判定することと、
前記第１及び第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ _ｔ 値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算すること
を備える、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記リボヌクレアーゼＰ検証が前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記リボヌクレアーゼＰ検証が、さらに、
表示画面上で前記機器の検証又は失敗の指示を表示することを備える、項目８に記載の方法。
（項目１１）
さらに、
多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、
プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためのプレート検出を実行することと、
背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、
蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行すること
を備える、項目１に記載の方法。
（項目１２）
機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む前記機器を校正するためのシステムであって、
プロセッサと、
プロセッサ実行可能命令によって符号化されたメモリと
を備え、前記命令が、
画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、
蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、
フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、
前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を含む、システム。
（項目１３）
前記ＲＯＩ校正のための命令が、
各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、
各ＲＯＩの中心位置を推定することと、
各ＲＯＩのサイズを推定することと、
前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定することと、
グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、
前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、前記グローバル・グリッディング・モデルの適用が前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、
欠落したＲＯＩを回復することと、
前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整が前記光学系の信号対雑音比を向上させるための命令を備える、項目１２に記載のシステム。
（項目１４）
前記ＲＯＩ校正が、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する、項目１２に記載のシステム。
（項目１５）
前記純色素校正のための命令が、
複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、前記サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、
前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、
各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、
色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令を備える、項目１２に記載のシステム。
（項目１６）
前記サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、項目１５に記載のシステム。
（項目１７）
前記光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、前記機器正規化校正が、
前記励起フィルタ及び前記発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、
データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することを備える、項目１２に記載のシステム。
（項目１８）
前記フィルタ正規化係数が、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする、項目１２に記載のシステム。
（項目１９）
前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、
複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、前記検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、
前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、
前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ _ｔ ）の第１のセット及び前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ _ｔ 値の第２のセットを判定することと、
前記第１及び第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ _ｔ 値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令を備える、項目１２に記載のシステム。
（項目２０）
前記リボヌクレアーゼＰ検証が前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、項目１２に記載のシステム。
（項目２１）
前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、さらに、
表示画面上で前記機器の検証又は失敗の指示を表示するための命令を備える、項目１９に記載のシステム。
（項目２２）
さらに、
多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、
プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためにプレート検出を実行することと、
背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、
蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令を備える、項目１２に記載のシステム。
（項目２３）
機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む前記機器を校正するためのプロセッサ実行可能命令によって符号化されたコンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令が、
画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、
蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、
フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、
前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を備える、コンピュータ可読記憶媒体。
（項目２４）
前記ＲＯＩ校正のための命令が、
各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、
各ＲＯＩの中心位置を推定することと、
各ＲＯＩのサイズを推定することと、
前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定することと、
グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、
前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、前記グローバル・グリッディング・モデルの適用が前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、
欠落したＲＯＩを回復することと、
前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整が前記光学系の信号対雑音比を向上させるための命令を備える、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目２５）
前記ＲＯＩ校正が、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目２６）
前記純色素校正のための命令が、
複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、前記サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、
前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、
各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、
色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令を備える、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目２７）
前記サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、項目２６に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目２８）
前記光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、前記機器正規化校正のための命令が、
前記励起フィルタ及び前記発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、
データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用するための命令を備える、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目２９）
前記フィルタ正規化係数が、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目３０）
前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、
複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、前記検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、
前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、
前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ _ｔ ）の第１のセット及び前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ _ｔ 値の第２のセットを判定することと、
前記第１及び第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ _ｔ 値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令を備える、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目３１）
前記リボヌクレアーゼＰ検証が前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目３２）
前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、さらに、
表示画面上で前記機器の検証又は失敗の指示を表示するための命令を備える、項目３０に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目３３）
さらに、
多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、
プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためにプレート検出を実行することと、
背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、
蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令を備える、項目２３に記載のコンピュータ可読記憶媒体。
（項目３４）
機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む前記機器を校正するためのシステムであって、
画像内の反応部位位置を判定するように構成された関心領域（ＲＯＩ）校正部と、
蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように構成された純色素校正部と、
フィルタ正規化係数を判定するように構成された機器正規化校正部と、
前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するように構成されたリボヌクレアーゼＰ検証部と、
校正結果を表示するように構成された表示エンジンと
を備える、システム。
（項目３５）
前記ＲＯＩ校正部が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定し、
各ＲＯＩの中心位置を推定し、
各ＲＯＩのサイズを推定し、
前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定し、
グローバル・グリッティング・モデルを導出し、
前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用し、前記グローバル・グリッディング・モデルの適用が前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させ、
欠落したＲＯＩを回復し、
前記ＲＯＩの半径を調整し、前記調整が前記光学系の信号対雑音比を向上させるように構成されている、項目３４に記載のシステム。
（項目３６）
前記ＲＯＩ校正部が、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する、項目３４に記載のシステム。
（項目３７）
前記純色素校正部が、
複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像し、前記サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占め、
前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定し、
各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化し、
色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するように構成されている、項目３４に記載のシステム。
（項目３８）
前記校正部が、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回前記サンプルホルダを撮像するように構成されている、項目３７に記載のシステム。
（項目３９）
前記光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、前記機器正規化校正部が、
前記励起フィルタ及び前記発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、
データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用するように構成されている、項目３４に記載のシステム。
（項目４０）
前記フィルタ正規化係数が、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする、項目３４に記載のシステム。
（項目４１）
前記リボヌクレアーゼＰ検証部が、
複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信し、前記検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含み、
前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定し、
前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ _ｔ ）の第１のセット及び前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ _ｔ 値の第２のセットを判定し、
前記第１及び第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するように構成されている、項目３４に記載のシステム。
（項目４２）
前記リボヌクレアーゼＰ検証部が、さらに、表示画面上で前記機器の検証又は失敗の指示を表示するように構成されている、項目４１に記載のシステム。
（項目４３）
さらに、
多成分データのリアルタイムスペクトル校正を実行するように構成された自動色素補正部と、
プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するように構成されたプレート検出部と、
背景変化を補償するように構成された自動背景校正部と、
蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用するように構成された機器正規化部と
を備える、項目３４に記載のシステム。

図１は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる生物学的機器の校正ワークフローを示している。 図２は、本教示の実施形態が実装可能なＰＣＲ機器２００を示すブロック図である。 図３は、本願明細書に記載された実施形態にかかる撮像のために使用可能な例示的な光学系３００を示している。 図４は、本願明細書に記載された様々な実施形態を実装するための例示的なコンピューティングシステムを示している。 図５は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる例示的な分散型ネットワークシステムを示している。 図６は、ｑＰＣＲ器具の校正において使用される一連のステップを示している。 図７は、９６ウェルサンプル容器の関心領域を示している。 図８は、９６ウェル校正プレートの各ウェルを占めるＦＡＭ色素を有する校正プレートの画像である。 図９は、本開示の実施形態にかかる例示的なワークフローを示している。 図１０は、本開示の実施形態にかかる例示的なワークフローを示している。 図１１Ａは、本開示の実施形態にかかる格子状構成を有する校正プレートを示している。 図１１Ｂは、図１１Ａにおけるプレート１１００によって示されるのと同じ構成のＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ及びＳＹＢＲ色素を有する４色素格子状９６ウェル校正プレートの画像である。 図１２Ａは、本教示の様々な実施形態において使用される色素混合物を示している。 図１２Ｂは、本教示の様々な実施形態の純色素及び主チャンネルフィルタの組み合わせを示している。 図１３は、本教示の様々な実施形態にかかる正規化前の色素混合物の％偏差を示している。 図１４は、本教示の様々な実施形態にかかる正規化後の色素混合物の％偏差を示している。 図１５は、本教示の様々な実施形態にかかる正規化後の色素混合物の％偏差の詳細図を示している。 図１６は、本教示の様々な実施形態にかかる正規化プロセスを示すフローチャートである。 図１７は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を検証するための例示的な方法を示している。 図１８は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を検証するための他の例示的な方法を示している。 本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる増幅データからの複数の蛍光閾値の判定を示している。 本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を検証するためのシステムを示している。 本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を校正するためのシステムを示している。

本願明細書に記載された様々な実施形態に関連する方法の例示的なシステムは、米国意匠特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０００ ＤＥＳ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０１１ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２３ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２５ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２８ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２９ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０３２ ＰＲＯ）、及び米国仮特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０３３ ＰＲＯ）に記載されているものを含み、これらは、全て２０１５年２月６日に出願されており、それらの全体が参照することによって本願明細書に組み込まれる。

本発明のより完全な理解を提供するために、以下の詳細な説明は、特定の構成、パラメータ、例などの多数の特定の詳細を記載する。しかしながら、そのような詳細な説明は、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施形態のより良好な説明を提供することを意図するものであることが認識されるべきである。

生物学的分析機器の校正の進歩は、有利には、操作者の誤りの低減、操作者の入力の低減、及び、適切且つ効率的な設置のために、生物学的分析機器及びその様々な要素を校正するために必要な時間の短縮を可能とする。

そのため、本教示の様々な実施形態によれば、合格／不合格状態を提供し且つ障害が特定されたときにフィードバックをトラブルシューティングする自動校正及び検証システムに専門知識を取り入れることができる。機器が校正プロセスに失敗すると、修理技術者が呼び出される。本教示は、設置及び校正手順に必要とされるコスト及び時間を最小限に抑えることができる。

本願明細書に記載された方法及びシステムは、生物学的分析システムなどの様々な種類のシステム、機器及び機械に実装されることができることが認識されるべきである。例えば、複数のサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う機器、システム又は機械において、様々な実施形態が実装されることができる。多数のサンプルが処理される定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に一般に適用可能であるが、本願明細書に記載された様々な実施形態にしたがって任意の適切なＰＣＲ法が使用可能であることが認識されるべきである。適切なＰＣＲ法は、これらに限定されるものではないが、例えば、ディジタルＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、入れ子ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ゲノムウォーキング及びブリッジＰＣＲを含む。さらにまた、本願明細書において使用される場合、増幅は、サーマルサイクラー、等温増幅、熱対流、赤外線媒介熱サイクリング、又はヘリカーゼ依存性増幅を使用することを含むことができる。
全体的な校正ワークフロー

生物学的機器は、大抵の場合、実験のための正確で信頼できるデータを生成するようにあてにされる。生物学的機器の定期的な校正及びメンテナンスは、機器の適切且つ最適な動作を保証し、ユーザの生産性を最大化し、潜在的な問題が現れる前に対処することによって高価な修理を最小化し、結果の品質を向上させることができる。

本教示の様々な実施形態によれば、本願明細書に記載された校正方法は、別個に又は任意の組み合わせでともに実行されることができる。さらに、本願明細書に記載された校正方法は、初期校正のための製造後又は初期設置及び使用後の任意の時点に行うことができる。本願明細書に記載された校正方法は、例えば、毎週、毎月、半年毎、毎年、又は必要に応じて行うことができる。

本教示に記載された様々な実施形態によれば、各読み取りにおける蛍光信号の位置及び強度、各蛍光信号に関連する色素、及び信号の有意性を判定するために、関心領域（ＲＯＩ）校正、背景校正、均一性校正、純色素校正、機器正規化などの校正方法が使用される。さらに、様々な実施形態によれば、検出及び色素読み取りをさらに改良して誤差を判定するために、自動色素補正、自動背景校正、及びプレート検出が行われる。適切な性能の機器検証はまた、リボヌクレアーゼＰ検証を使用してシステムによって自動的に行われてもよい。

図１は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器上で実行可能な例示的な校正ワークフロー１００を示している。校正ワークフロー１００は、例であり、本願明細書に記載された校正方法は、別個に、又はサブセットとして任意の組み合わせ及び順番に行われてもよいことが認識されるべきである。

ステップ１０２において、ＲＯＩ校正が実行される。一般に、ＲＯＩ校正は、検出器の視野内のウェルの位置を定義する情報を生成する。本教示は、ユーザ相互作用の最小化又は排除によってＲＯＩ校正を自動化することができる。様々な実施形態は、ヒストグラム分析及びバイナリ検索パターンを使用してフィルタあたりの最適な露光時間を判定する方法及びシステムを提供することによってプロセスを自動化することができる。ＲＯＩ校正は、本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、以前の方法よりも正確に且つより少ない誤差で画像内のウェルを特定する。様々な実施形態にかかるＲＯＩ校正方法及びシステムが以下にさらに記載される。

ステップ１０４において、背景校正が実行される。大抵の場合、検出器は、検出可能な信号を放射するサンプルが存在しない場合であっても、ある量の信号を読み取る。サンプル信号のより正確な測定値を得るために、背景信号がサンプル信号読み取り値から減算されることができるため、この背景信号の構成が重要であり得る。背景校正は、各フィルタ／ウェルの組み合わせについての機器背景信号を判定するために水プレートを使用して行うことができる。このステップは、ユーザ相互作用を最小化又は排除するように自動化されてもよい。正しいプレートが背景校正のために使用されているかどうかをテストする自動化が提供されることができる。例えば、ステップ１０４は、信号レベルをみることができ、ＲＯＩ校正に使用される強い信号を放射するテストプレートなどの不正確なテストプレートを使用する可能性を排除することができる。信号レベルが予想される背景レベルをはるかに超えている場合、ユーザは、適切なテストプレートを挿入するように警告されることができる。また、この段階は、信号レベルの幅広い発散を検査することによってテストプレート中の１つ以上のウェルの汚染をテストすることができ、検出された場合、汚れた又は汚染されたウェルの可能な存在を示す警告を発することができる。汚染されたウェルは、サンプル信号レベルから減算される不適切な背景信号レベルをもたらす可能性がある。

ステップ１０６において、均一性校正が実行される。いくつかの場合において、プレートの幾何学的形状（反り、厚さ）の変化は、各ウェルにおいて等しい量の蛍光色素が存在するにもかかわらず、プレートにわたって強度の読み取り値を変化させる可能性がある。均一性校正は、プレート変動による強度変動が補正されることができるように複数色素プレートを使用して機器を校正することができる。ステップ１０６は、自動化されてユーザの相互作用を低減又は排除することができる。この自動化の一部は、誤った校正プレートの使用の検出並びに校正プレート内の空の又は汚染されたウェルに対する検出及び調整を含むことができる。

ステップ１０８において、純色素校正が実行される。ｑＰＣＲ機器において使用される蛍光色素の校正は、機器によって収集された全蛍光における各色素の個々の寄与を特徴付けて区別するように、機器ソフトウェアが色素標準から収集された校正データを使用するのを可能とする。本教示の様々な実施形態によれば、サンプルが広がった後、機器ソフトウェアは、読み取り値毎に生スペクトル信号の形式でデータを受信する。ソフトウェアは、純スペクトル校正データと各色素によって寄与される生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素のそれぞれの寄与を判定する。分析後にユーザが実験を保存すると、機器ソフトウェアは、その実験について収集された蛍光データ並びにウェル毎の各蛍光色素の寄与とともに純スペクトルを記憶する。本方法は以下にさらに記載される。純色素校正を使用すると、本教示の様々な実施形態によれば、より少ない純校正プレートが使用可能であり、ユーザコストを節約し、校正における誤差源を排除することができる。

ステップ１１０において、機器正規化校正が実行される。一般に直面する１つの困難は、研究者が複数の機器において行われた実験結果を容易に比較できないことである。例えば、光源、光学素子及び蛍光検出器などの要素のパラメータの物理的変動は、同一の生物学的サンプルである可能性があるものに関する分析結果の変動をもたらす可能性がある。したがって、要素の変動を最小限に抑えるのを支援する方法及び装置が引き続き必要とされている。

ｑＰＣＲにおいて、増幅曲線は、大抵の場合、同じ溶液中の受動基準色素にレポーター色素の信号を正規化することによって判定される。この正規化は、ラベル付けされた正規化蛍光値又は「Ｒｎ」として報告されることができる。受動基準正規化は、全体信号レベルが液量又は全体的な照度によって影響を受けた場合であっても一定のＲｎ値を可能とする。しかしながら、受動基準正規化は、照明のスペクトルにおける機器間差異からなど、レポーター色素と基準色素との間の信号比が変化する場合、適切には機能することができない。本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、機器正規化校正は、追加の費用を必要とするＲｎ値を調整するための「正規化係数」を得るために、色素混合物から蛍光を読み取ることを含む。

ステップ１１２において、リボヌクレアーゼＰ検証が実行される。検証テストを実行すると、機器が適切に機能しているかどうかを確認するように検査する。例えば、リボヌクレアーゼＰ検証は、機器が２つの異なる量のサンプルを正確に区別できるかどうかを判定する。以前は、リボヌクレアーゼＰ検証は、機器を検証するために統計的計算を行うユーザにより、標準曲線を使用して手動で行われた。本教示に記載された様々な実施形態によれば、リボヌクレアーゼＰ検証は、標準曲線を使用することなくシステムによって自動的に実行されることができる。リボヌクレアーゼＰ検証の様々な実施形態が以下にさらに記載される。

図２１は、本願明細書に記載の様々な実施形態にかかる機器の校正のためのシステム２１００を示している。システム２１００は、ＲＯＩ校正部２１０２と、純色素校正部２１０４と、機器正規化校正部２１０８と、リボヌクレアーゼＰ検証部２１１０と、ディスプレイエンジン／ＧＵＩ２１０６とを含む。ＲＯＩ校正部２１０２は、画像内の反応部位位置を判定するように構成される。純色素校正部２１０４は、蛍光色素の生スペクトルを蛍光色素の純スペクトル校正データと比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように構成される。機器正規化校正部２１０８は、フィルタ正規化係数を判定するように構成される。リボヌクレアーゼＰ検証部２１１０は、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するように構成される。ディスプレイエンジン２１０６は、校正結果を表示するように構成される。

本教示は、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）機器を参照して記載される。特に、本教示の実施形態は、ウェルプレートの光学撮像を用いるＲＴ−ＰＣＲ機器について行われる。そのような機器は、分析目的のために複数のサンプル又はスポットからの信号を同時に測定することができ、大抵の場合、これらに限定されるものではないが、ＲＯＩ（関心領域）の特定、背景信号の判定、多成分分析のための均一性及び純色素スペクトル校正を含む校正を必要とする。校正はまた、予想される結果を有する既知のサンプルプレートを使用したＲＴ−ＰＣＲ検証反応を含むことができる。当業者は、本教示がＲＴ−ＰＣＲ機器に関する例によって記載されているが、それらの原理は、結果の正確性及び／又は最適性を保証するために校正及び検証を必要とすることがある他の形式の実験機器に幅広く適用可能であることを理解するであろう。

ＰＣＲ機器
上述したように、これに限定されるものではないが、様々な実施形態にしたって利用されることができる機器は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）機器である。図２は、本教示の実施形態が実装可能なＰＣＲ機器２００を示すブロック図である。ＰＣＲ機器２００は、基材（図示しない）に含まれる複数のサンプル２１２上に配置された加熱カバー２１０を含むことができる。様々な実施形態において、基材は、サンプル領域と加熱カバー２１０との間にカバーを有する複数のサンプル領域を有するガラス又はプラスチックスライドとすることができる。基材のいくつかの例は、限定されるものではないが、標準的なマイクロタイター９６ウェル、３８４ウェルプレート、若しくはマイクロカードなどのマルチウェルプレート、又はガラス若しくはプラスチックスライドなどの略平面支持部を含むことができる。基材の様々な実施形態における反応部位は、基材の表面上に形成された規則的又は不規則な配列でパターン化された、窪み、刻み目、隆起及びそれらの組み合わせを含むことができる。ＰＣＲ機器の様々な実施形態は、サンプル部２１４、加熱及び冷却用素子２１６、熱交換器２１８、制御システム２２０、及びユーザインターフェース２２２を含む。本教示にかかる熱ブロックアセンブリの様々な実施形態は、図２のＰＣＲ装置２００の要素２１４−２１８を備える。

リアルタイムＰＣＲ機器２００は、光学系２２４を有する。図２において、光学系２２４は、電磁エネルギを放射する照明源（図示しない）と、基材内のサンプル２１２から電磁エネルギを受け取る光学センサ、検出器、又は撮像装置（図示しない）と、各ＤＮＡサンプルから撮像装置へと電磁エネルギを誘導するために使用される光学素子とを有することができる。図２におけるＰＣＲ機器２００及び図２におけるリアルタイムＰＣＲ機器２００の実施形態について、制御システム２２０は、検出システム、加熱カバー、及び熱ブロックアセンブリの機能を制御するために使用されることができる。制御システム２２０は、図２におけるＰＣＲ機器２００及び図２におけるリアルタイムＰＣＲ機器２００のユーザインターフェース２２２を介してエンドユーザにアクセス可能とすることができる。また、図２に示されるようなコンピュータシステム２００は、図２におけるＰＣＲ機器２００の機能の制御並びにユーザインターフェース機能を提供するように機能することができる。さらに、図４のコンピュータシステム４００は、データ処理、表示及び報告準備機能を提供することができる。そのような機器制御機能の全ては、ＰＣＲ機器にとってローカルに特化することができ、又は、図４のコンピュータシステム４００は、後により詳細に説明されるように、制御、分析、及び報告機能の一部又は全ての遠隔制御を提供することができる。
撮像用光学系

図３は、本願明細書に記載された実施形態にかかる撮像のために使用されることができる例示的な光学系３００を示している。光学系３００は、例示的な光学系であることが認識されるべきであり、当業者は、関心対象の画像を撮像するために他の光学系が使用可能であることを認識するであろう。様々な実施形態によれば、関心対象は、例えば、本願明細書に記載されるような校正プレートなどのサンプルホルダとすることができる。カメラ３０４に含まれる光学センサ３０２は、例えば、関心対象３１０を撮像することができる。光学センサ３０２は、ＣＣＤセンサとすることができ、カメラ３０４は、ＣＣＤカメラとすることができる。さらに、光学センサは、カメラレンズ３０６を含む。

関心対象に応じて、様々な実施形態にかかる関心対象３１０を撮像するために発光フィルタ３０８が選択されることができる。他の実施形態において、発光フィルタ３０８は、関心対象３０１から放射される蛍光発光を撮像するように変更されることができる。

光学系３００は、関心対象３１０を撮像するために反射光源３１２を使用することができる。光源３１２からの光は、ビームスプリッタ３２０によって関心対象３１０に反射される前に、非球面３１４、焦点合わせ部／分岐部３１６、及び励起フィルタ３１８を介してフィルタリングされることができる。光学系３００はまた、対物レンズ３２２も含むことができる。関心対象に応じて、励起フィルタ３１８は、様々な実施形態にかかる関心対象３１０を撮像するために選択又は変更されることができる。

本教示の様々な実施形態の以下の説明は、例示及び説明のために提示されたものである。それは、網羅的ではなく、開示された正確な形態に本教示を限定するものではない。変更及び変形は、上記教示に照らして可能であり又は本教示の実施から得ることができる。さらに、記載された実装形態は、ソフトウェアを含むが、本教示は、ハードウェア及びソフトウェアの組み合わせとして又はハードウェア単独で実装されてもよい。本教示は、オブジェクト指向及び非オブジェクト指向プログラミングシステムの双方によって実装されることができる。
コンピューティングシステム

図４は、様々な実施形態にかかる処理機能を実行するために使用されることができるコンピュータシステム４００を示すブロック図である。実験を行うための機器は、例示的なコンピューティングシステム４００に接続されることができる。コンピューティングシステム４００は、プロセッサ４０４などの１つ以上のプロセッサを含むことができる。プロセッサ４０４は、例えば、マイクロプロセッサ、コントローラ又は他の制御ロジックなどの汎用又は特殊用途処理エンジンを使用して実装されることができる。この例において、プロセッサ４０４は、バス４０２又は他の通信媒体に接続される。

さらに、図４のコンピューティングシステム４００は、ラックマウントコンピュータ、メインフレーム、スーパーコンピュータ、サーバ、クライアント、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、ハンドヘルドコンピューティングデバイス（例えば、ＰＤＡ、携帯電話、スマートフォン、パームトップなど）、クラスタグリッド、ネットブック、組み込みシステム、又は所定のアプリケーション若しくは環境にとって望ましい若しくは適切であり得る任意の他の種類の専用又は汎用コンピューティングデバイスなどの任意数の形態で具現化されることができることが理解されるべきである。さらに、コンピューティングシステム４００は、クライアント／サーバ環境及び１つ以上のデータベースサーバ、又はＬＩＳ／ＬＩＭＳインフラストラクチャとの統合を含む従来のネットワークシステムを含むことができる。ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含み、且つ、無線及び／又は有線要素を含む多くの従来のネットワークシステムが当該技術分野において知られている。さらに、クライアント／サーバ環境、データベースサーバ、及びネットワークは、当該技術分野において十分に文書化されている。本願明細書において記載される様々な実施形態によれば、コンピューティングシステム４００は、分散型ネットワーク内の１つ以上のサーバに接続するように構成されてもよい。コンピューティングシステム４００は、分散型ネットワークから情報又は更新を受信することができる。コンピューティングシステム４００はまた、分散型ネットワークに接続された他のクライアントによってアクセスされることができる分散型ネットワーク内に記憶される情報を送信してもよい。

コンピューティングシステム４００は、情報を通信するためのバス４０２又は他の通信機構と、情報を処理するためにバス４０２に結合されたプロセッサ４０４とを含むことができる。

コンピューティングシステム４００はまた、プロセッサ４０４によって実行される命令を記憶するためにバス４０２に結合されたランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的メモリとすることができるメモリ４０６を含む。メモリ４０６はまた、プロセッサ４０４によって実行される命令の実行中に一時的変数又は他の中間情報を記憶するために使用されることができる。コンピューティングシステム４００は、さらに、静的情報及びプロセッサ４０４の命令を記憶するためにバス４０２に結合された読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）４０８又は他の静的記憶装置を含む。

コンピューティングシステム４００はまた、情報及び命令を記憶するためにバス４０２に提供されて結合された磁気ディスク、光ディスク、又はソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）などの記憶装置４１０を含むことができる。記憶装置４１０は、メディアドライブ及びリムーバブルストレージインターフェースを含むことができる。メディアドライブは、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、ＣＤ又はＤＶＤドライブ（Ｒ又はＲＷ）、フラッシュドライブ、又は他のリムーバブル若しくは固定メディアドライブなどの固定又はリムーバブル記憶媒体をサポートするためにドライブ又は他の機構を含むことができる。これらの例が示すように、記憶媒体は、特定のコンピュータソフトウェア、命令、又はデータを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含むことができる。

代替実施形態において、記憶装置４１０は、コンピュータプログラム又は他の命令又はデータがコンピューティングシステム４００にロードされるのを可能とする他の同様の手段を含むことができる。そのような手段は、例えば、プログラムカートリッジ及びカートリッジインターフェース、リムーバブルメモリ（例えば、フラッシュメモリ又は他のリムーバブルメモリモジュール）及びメモリスロットなどのリムーバブルストレージユニット及びインターフェース、並びにソフトウェア及びデータが記憶装置４１０からコンピューティングシステム４００に転送されるのを可能とする他のリムーバブルストレージユニット及びインターフェースを含むことができる。

コンピューティングシステム４００はまた、通信インターフェース４１８を含むことができる。通信インターフェース４１８は、ソフトウェア及びデータがコンピューティングシステム４００と外部装置との間において転送されるために使用されることができる。通信インターフェース４１８の例は、モデム、ネットワークインターフェース（イーサネット（登録商標）又は他のＮＩＣカードなど）、通信ポート（例えば、ＵＳＢポート、ＲＳ−２３２Ｃシリアルポートなど）、ＰＣＭＣＩＡスロット及びカード、ブルートゥース（登録商標）などを含むことができ、通信インターフェース４１８を介して転送されるソフトウェア及びデータは、通信インターフェース４１８によって受信されることができる電子、電磁、光又は他の信号とすることができる信号の形態である。これらの信号は、無線媒体、有線又はケーブル、光ファイバ又は他の通信媒体などのチャンネルを介して通信インターフェース４１８によって転送されて受信されることができる。チャンネルのいくつかの例は、電話回線、携帯電話リンク、ＲＦリンク、ネットワークインターフェース、ローカル又はワイドエリアネットワーク、及び他の通信チャンネルを含む。

コンピューティングシステム４００は、コンピュータユーザに情報を表示するための陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのディスプレイ４１２にバス４０２を介して結合されることができる。英数字及び他のキーを含む入力装置４１４は、例えば、プロセッサ４０４に情報及びコマンド選択を通信するためにバス４０２に結合されている。入力装置はまた、タッチスクリーン入力機能によって構成されたＬＣＤディスプレイなどのディスプレイであってもよいです。他の種類のユーザ入力装置は、方向情報及びコマンド選択をプロセッサ４０４に通信し且つディスプレイ４１２上のカーソルの動きを制御するためのマウス、トラックボール又はカーソル方向キーなどのカーソル制御部４１６である。この入力装置は、典型的には、そのデバイスが平面内の位置を指定するのを可能とする第１の軸（例えば、ｘ）及び第２の軸（例えば、ｙ）の２軸の自由度を有する。コンピューティングシステム４００は、データ処理を提供し、そのようなデータの信頼のレベルを提供する。本教示の実施形態の所定の実装と一致して、データ処理及び信頼値は、メモリ４０６に含まれる１つの以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するプロセッサ４０４に応答してコンピュータシステム４００によって提供される。そのような命令は、記憶装置４１０などの他のコンピュータ可読媒体からメモリ４０６に読み取られることができる。メモリ４０６に含まれる命令のシーケンスの実行は、プロセッサ４０４に本願明細書に記載された処理状態を実行させる。あるいは、ハードワイヤード回路が本教示の実施形態を実装するためにソフトウェア命令の代わりに又はソフトウェア命令と組み合わせて使用され てもよい。それゆえに、本教示の実施形態の実装は、ハードウェア回路及びソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されるものではない。

本願明細書において使用される場合、用語「コンピュータ可読媒体」及び「コンピュータプログラム製品」は、一般に、実行のためにプロセッサ４０４に対する１つ以上のシーケンス又は１つ以上の命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。一般に（コンピュータプログラム又は他のグルーピングの形態でグループ化されることができる）「コンピュータプログラムコード」と称されるそのような命令は、実行されると、コンピューティングシステム４００が本発明の実施形態の特徴又は機能を実行するのを可能とする。非一時的コンピュータ可読媒体のこれらの及び他の形態は、限定されるものではないが、不揮発性媒体、揮発性媒体、及び伝送媒体を含む多くの形態をとり得る。不揮発性媒体は、例えば、記憶装置４１０などのソリッドステート、光又は磁気ディスクを含む。揮発性媒体は、メモリ４０６などの動的メモリを含む。伝送媒体は、バス４０２を含むワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバを含む。

コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、又は任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光媒体は、パンチカード、紙テープ、孔パターンを有する任意の他の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ又はカートリッジ、後述するような搬送波、又はコンピュータが読み取ることができる任意の他の媒体を含む。

コンピュータ可読媒体の様々な形態は、実行のためにプロセッサ４０４に対して１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを搬送することに関与することができる。例えば、命令は、遠隔コンピュータの磁気ディスク上に最初に担持されてもよい。遠隔コンピュータは、その動的メモリに命令をロードすることができ、モデムを使用して電話回線を介して命令を送信することができる。コンピューティングシステム４００に対してローカルなモデムは、電話回線上のデータを受信することができ、データを赤外線信号に変換するために赤外線送信機を使用することができる。バス４０２に結合された赤外線検出器は、赤外線信号で搬送されたデータを受信することができ、バス４０２上にデータを配置することができる。バス４０２は、プロセッサ４０４が命令を取得して実行するデータをメモリ４０６に搬送する。メモリ４０６によって受信された命令は、必要に応じて、プロセッサ４０４による実行の前後のいずれかにおいて記憶装置４１０に記憶されてもよい。

明確化の目的のために、上記説明は、異なる機能ユニット及びプロセッサを参照して本発明の実施形態を記載していることが理解されるであろう。しかしながら、異なる機能ユニット、プロセッサ又はドメイン間の機能の任意の適切な分布は、本発明から逸脱することなく使用することができることは明らかであろう。例えば、別個のプロセッサ又はコントローラにより実行されるように示されている機能は、同じプロセッサ又はコントローラによって実行されてもよい。したがって、特定の機能ユニットへの言及は、厳密な論理的又は物理的構造又は組織を示すよりもむしろ、記載された機能を提供する適切な手段への言及としてみられるべきであるにすぎない。
分散型システム

典型的なインターネットネットワーク構成５００の要素の一部が図５に示されており、おそらくは遠隔オフィスにおける多数のクライアントマシン５０２が、それ自体がいくつかのインターネットサービスプロバイダ（ＩＳＰ）接続５１０を介してインターネット５０８に接続されたゲートウェイ／ハブ／トンネルサーバ／など５１０に接続されて示されている。例えば、様々なローカルクライアント５３０に対して他のハブ／ルータ５２６を介して接続されることができる様々な企業アプリケーションサーバに５２２に接続されたゲートウェイ／トンネルサーバ５１８に対してＩＳＰ接続５１６を介しておそらくは中央研究室又はオフィスに通信するこれらのユニットを有して同様にＩＳＰ接続５１４を介してインターネット５０８に接続された他の可能なクライアント５１２も示されている。これらのサーバ５２２のいずれかは、本発明において記載されるように、より完全には以下に記載されるように、潜在的なコンテンツ管理及び配信設計ソリューションの分析のための開発サーバとして機能することができる。
関心領域（ＲＯＩ）校正

上述したように、本教示は、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）機器を参照して記載される。特に、本教示の実施形態は、ウェルプレートの光学撮像を用いるＲＴ−ＰＣＲ機器について行われる。そのような機器は、分析目的のために複数のサンプル又はスポットからの信号を同時に測定することができ、大抵の場合、校正を必要とする。校正を必要とするプロセスの例は、ＲＯＩ又は関心領域の特定である。

一般に、ＲＯＩ校正は、全てのフィルタに対応する各セルにおいて強い放射を有するプレートを使用して行うことができる。ＲＯＩが各フィルタについて同一ではないことがあるため、これは有用であり得る。フィルタ間のＲＯＩの差異は、フィルタ及び他のフィルタの分光特性の僅かな角度の差異によって生じることができる。それゆえに、様々な実施形態は、フィルタ毎に／ウェル（ＰＦＰＷ）−ＲＯＩ校正毎に行う。これらのＰＦＰＷ−ＲＯＩ校正は、各フィルタについての９６ウェルプレートにおけるウェルの位置を判定するのに有用である。ＲＯＩ校正は、米国特許第６，５１８，０６８号明細書に記載されているように適応マスク作製教示などの方法を使用して行うことができる。

本教示は、ユーザ相互作用の最小化又は排除によってＲＯＩ校正を自動化することができる。様々な実施形態は、ヒストグラム分析及びバイナリ検索パターンを使用してフィルタあたりの最適な露光時間を判定するソフトウェアを提供することによってプロセスを自動化することができる。露光時間は、プレートの画像を撮像するために必要な時間量である。同様に、この値は、フィルタの分光特性に応じて変えることができる。一般に、ＲＯＩ校正は、検出器の視野内のウェルの位置を定義する情報を生成する。この情報は、グローバルマスク又は異なるフィルタに対応する複数のマスクのいずれかによって３０４においてマスクファイルとして記憶されることができる。

上述したものなどの校正プロセスは、頻繁に、行列射影及び強度プロファイルを使用する。これは、ウェル内のアーチファクト及び飽和、グリッドの回転、拡大率及び光ラジアル歪みの変化の影響を受けやすいＲＯＩの判定をもたらすことができる。したがって、そのような感受性を最小化し且つ検出された放射データにおける歪みや他の不要な背景ノイズを除去するためにＲＯＩのよりロバストな判定を有することが有利であり得る。

背景ノイズは、固有のシステムノイズのみならず、他の望ましくない信号を指すことがある。例えば、データにおける一部の背景ノイズは、例えば、ダスト粒子又はスクラッチなどの基材上の物理的ソースに起因することがある。背景ノイズを提供することができる物理的ソースの他の例は、サンプルを保持又は封入するホルダ又はケースである。データにおける他の背景ノイズは、反射及び自然蛍光などの機器における表面からの自然放射線に起因することがある。他の背景ノイズはまた、例えば、放射データを検出する光学系又は光源からの結果でもあり得る。

生物学的機器は、数百から数千のサンプルを検出することができ、それらの全てがナノリットル未満などの非常に少量であり得る。そのため、他の背景ノイズ除去方法は、サンプルボリュームから放射データを判定して分析することができるように、様々な実施形態にかかる本願明細書において記載された校正方法によって単独で又は組み合わせて使用されることができる。いくつかの実施形態において、サンプルボリュームの位置は、より正確な分析を行うために基材内においてより正確に判定されることができる。例えば、ディジタルＰＣＲ分析において、非反応に対するサンプルボリュームにおける反応をより正確に区別可能なことは、より正確な結果を生成することができる。さらに、本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、空のウェル又は貫通孔は、反応しなかったウェル又は貫通孔のサンプルボリュームから区別されることもできる反応しなかったウェル又は貫通孔におけるサンプルボリュームから区別することができる。

本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、背景ノイズ除去は、画像データ分析及び処理を含むことができる。本方法は、基材の画像から除去されることができる背景ノイズを補間するように画像データの強度値を分析することを含むことができる。このように、画像内の関心領域の位置もまた判定されることができる。背景ノイズ除去はまた、関心領域を含むことが知られている画像の領域からの補間データを含むことができる。画像上の背景ノイズを判定した後、背景ノイズは、画像データから減算されることができる。

図６は、本発明の１つの実施形態にかかるコンピュータ内方法６００における例を示している。コンピュータ内方法６００は、バイオテクノロジープロセスのためのサブルーチンを含むことができるコンピュータ可読形式における複数のワークフローサブルーチンを含む。図６は、単なる例示的な方法であり、当業者は、本開示に照らして、サブルーチンの実際の数が少なくとも約２つのサブルーチンから多数まで（例えば、２−１０、２−２０、２−３０、２−ｎ（ｎは、３−１００、３−１０００からなどの任意数のサブルーチンとすることができる））変化することができることを理解するであろう。各セットサブルーチン３１０−３７０は、単一のステップ又はタスクを含むことができ、又は必要に応じて、同様にコンピュータ可読形式で、複数のステップ又はタスクを含むことができ、各ステップは、さらに、追加の任意のカスタマイズ可能なステップ又はタスクを含むことができる。任意の／カスタマイズ可能なステップ又はタスクのそれぞれは、ユーザによって視認、検討、設定又はカスタマイズ可能である１つ以上の任意のパラメータ（任意）を有することができる。いくつかの実施形態において、本発明のコンピュータ内方法は、任意の／カスタマイズ可能なそれぞれのステップについての少なくとも１つのパラメータを選択するためにグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を使用してバイオ技術プロセスの任意の／カスタマイズ可能なそれぞれのステップについての少なくとも１つのパラメータのそれぞれのユーザによる選択を含む。特定の実施形態において、ワークフローのサブルーチンの全てのステップ及び全てのパラメータは、視認、及び必要に応じて編集するためにするユーザに利用可能である。バイオインフォマティクスプログラムは、典型的には、これらのパラメータ及び／又はステップの一部をユーザから隠蔽し、特に、コンピュータ内設計された実験における結果がユーザにとって予想された結果ではない場合にユーザのフラストレーション及び非効率性を引き起こす。

図６において一般に示された本開示のコンピュータ内方法における例は、コンピュータシステムにおいて少なくとも１つの方法ファイル（図４に示されるものなど）を生成することによって行う（実行される）ことができ、方法ファイルは、視認、選択、変更又は入力されることができる１つ以上のパラメータを有することができるカスタマイズ可能なステップ（Ａ、Ｂ、Ｃ）のそれぞれの複数のサブルーチン（１０、２０、３０・・）についてのコンピュータ可読命令を含み、コンピュータ内でバイオ技術プロセスを行うことは、少なくとも１つのバイオテクノロジー製品を得るためにコンピュータシステムによってコンピュータ可読命令を含む少なくとも１つの方法ファイルを実行することを備える。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカスタマイズ可能な／任意のパラメータは、デフォルトパラメータから選択され、デフォルトパラメータは、コンピュータシステムの要素（例えば、ストレージ、データベースなど）に記憶される。

再度図６を参照すると、ＲＯＩ位置を計算するための第１のステップは、ステップ６１０において蛍光閾値から初期ＲＯＩ中心を推定することである。複数の生物学的サンプルを含むように構成されたサンプルプレートは、ＰＣＲのプロセスを介して生物学的サンプルを分析することができる分析機器内に供給されて挿入される。各生物学的サンプルは、サンプルウェルに含まれ、光源によって励起されることができ、励起に応答して蛍光検出器によって検出可能な所定の波長で蛍光を発することができる。図２に関して上述したように、光源２０２は、システム２００によって検出されることになるスペクトル種と相互作用するスペクトルを放射することができるレーザ、ＬＥＤ又は他の種類の励起源とすることができる。さらに、生物学的サンプルは、ＦＡＭ、ＳＹＢＲグリーン、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ＣＹ−３、テキサスレッド、ＣＹ−５、ＲＯＸ（受動基準）又は検出可能な信号を放射する任意の他の蛍光色素のうちの１つ以上などのスペクトル区別可能な色素を含むことができる。

生物学的サンプルを励起する前に、ＲＯＩ判定のための出発点を提供するように入力パラメータ及びアルゴリズムパラメータが設定される。入力パラメータは、ウェルサイズ、ウェル中心間距離、ミリメートルあたりの光画素及びプレートレイアウトを含むことができる。プレートレイアウトは、ウェルの総数及びサンプルウェルの構成を含むことができる。頻繁に使用される構成は、複数の行及び複数の列を含む矩形アレイとすることができるが、当業者は、構成が使用される機器に適した任意の幾何学的形状とすることができることを理解するであろう。さらに、ウェルの総数は変えることができる。当業者は、単一サンプルプレート又はサンプル閉じ込め構造において総計１ウェルから数千のウェルになる構成に精通しているであろう。アルゴリズムパラメータを求めるＲＯＩは、ウェルサイズ、ウェル中心間距離及び最小真円度の許容範囲を設定することができる。真円度は、算出される値であり、面積に対する周長の比とすることができる。

入力パラメータ及びアルゴリズムパラメータが判定されると、複数のサンプルは、適切な光源からのエネルギによって励起され、サンプルプレートにおける各サンプルウェルから放射された蛍光の画像が収集される。サンプルプレートの蛍光画像は、入力パラメータ及びアルゴリズムパラメータに基づいてＲＯＩ候補を選択するためにさらに分析される。パラメータを満たすＲＯＩ候補は、さらなる分析のために保存され、各ウェルのサイズ及び真円度は、ステップ６２０において判定される。パラメータを満たしていないＲＯＩ候補は、蛍光を発しなかった任意の位置とともに破棄されることができる。保持されるＲＯＩ候補は、さらに、ウェル間隔パラメータ及びウェル間隔の許容範囲パラメータに基づいてＲＯＩ間の距離を判定するために評価される。ウェル間隔パラメータに基づいて互いに近接している中心を有するＲＯＩは、同じサンプルウェルであると考えることができ、最高の真円度を有するものは、そのウェルについてのＲＯＩとして選択される。全てのＲＯＩ候補が判定されると、平均ウェルサイズが計算され、平均は、ステップ６３０において各サンプルウェルのＲＯＩに割り当てられ、初期推定ＲＯＩが保存される。

予想されるウェル位置は、プレートレイアウトパラメータに基づいて判定されたグリッドパターンで配置される。このパラメータは、各ウェルがプレートレイアウトパラメータに基づいてＸＹグリッド座標の予想される組を有する場合、ウェルの数、列数及び行数を含むことができる。さらなる分析は、各初期ＲＯＩの位置をより良好に定義するために初期推定ＲＯＩ上で開始されることができ、グローバルグリッディングと称することができる。グローバルグリッディングの第１のステップは、隣接するＲＯＩをみつけるために初期推定ＲＯＩの中心を分析することである。これは、プレートレイアウトに基づいてグリッド座標に対するＲＯＩの中心間距離を比較することによって判定されることができる。そして、ＸＹグリッド座標は、ＲＯＩ間の空間的関係に基づいて初期推定ＲＯＩのそれぞれについて判定されることができる。

ＲＯＩ位置の精度を向上させるために、プレートレイアウトのグリッド座標に中心間ＲＯＩ座標を関連付けることが有利であろう。これは、マッピング関数を判定して適用することによって達成されることができる。マッピング関数は、２次元の二次多項式関数の対である。これらの関数は、Ｘ（又はＹ）方向においてＲＯＩ中心位置にＸ（又はＹ）グリッド位置をマッピングするように計算される。マッピング関数が判定されると、それらは、２つの利点を提供するように予想されるグリッド座標に適用することができる。第１に、ＲＯＩ中心位置の精度が向上されることができ、第２に、初期ＲＯＩ発見中に欠落したＲＯＩを回復するのが可能とすることができる。

ＲＯＩのさらなる調整は、光学性能にさらなる利益を提供することができる。本発明者らは、ＲＯＩサイズと光学系の信号対雑音比（ＳＮＲ）との間に関係があったことを発見した。当業者は、電気システム及び光学系のＳＮＲを計算するためのいくつかの方程式があることを知っているであろう。ＳＮＲは、例えば、以下の式１によって特徴付けることができる。

ここで、以下のとおりである：ＳＮＲ＝信号対雑音比
Ｓｄｙｅ ｐｌａｔｅ＝色素画像からの関心領域内の全ての画素強度の和
Ｓ_ＢＧ＝背景画像からのＲＯＩ内の全ての画素強度の和
Ｓｄｙｅ＝色素からのＲＯＩ内の全ての画素強度の和
Ｎ＝ＲＯＩ内の画素数
ｏｆｆｓｅｔ＝カメラオフセット
Ｇ＝カメラゲイン
δ５２Ｒ，ｙ＝読み取りノイズ

実験は、６対のフィルタを含んだ光学系を使用して行われた。各対のフィルタは、励起フィルタ（Ｘｎ）及び発光フィルタ（Ｍｎ）を含んでいた。各フィルタは、ＰＣＲプロセスと適合するように構成された色素の励起周波数及び発光周波数に対応する狭帯域波長に対して感受性があった。さらに、ＲＯＩは、本願明細書に提示された教示にしたがって最適化された。信号対雑音上のＲＯＩのサイズの効果を研究するために、蛍光が６対のフィルタを使用して９６ウェルサンプルプレートから検出された。各ＲＯＩの半径は、１画素ずつ増分的に拡張された。式１は、６対のフィルタのそれぞれのＳＮＲ及び各画素増分を計算するために使用された。実験結果を以下の表１に示す。

太字のエントリは、６対のフィルタのそれぞれについて最高のＳＮＲを特定し、２画素半径拡張は、６対のフィルタにわたって約６％のＳＮＲの全体的な改善を提供する。

図７は、９６ウェル７１０を有するサンプルプレートの画像を示している。ウェル７１０のそれぞれが蛍光画像を生成した。本願明細書の教示の適用後、ＲＯＩが最適化され、青色の円は、各ウェルの位置についてのＲＯＩを特定している。
純色素校正

上述したように、操作者がそれらの意図される目的のために生物学的な分析システムをより迅速に且つ効率的に使用することができるように、生物学的分析システムの設置及び設定を簡便化する必要性が高まっている。この必要性は、例えば、生物学的分析機器及び関連する要素を校正する際に明らかである。１つの例示的な校正は、例えば、ｑＰＣＲシステムなどの生物学的分析システムにおける蛍光検出のために使用される蛍光色素の校正である。

ｑＰＣＲ機器において使用される蛍光色素校正は、機器ソフトウェアが機器によって収集された全蛍光における各色素の個々の寄与を特徴付けて区別するように色素標準から収集された校正データを使用するのを可能とする。サンプルが広がった後、機器ソフトウェアは、読み取り値毎に生スペクトル信号の形式でデータを受信する。ソフトウェアは、純スペクトル校正データと各色素によって寄与される生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素のそれぞれの寄与を判定する。分析後にユーザが実験を保存すると、機器ソフトウェアは、その実験について収集された蛍光データ並びにウェル毎の各蛍光色素の寄与とともに純スペクトルを記憶する。

ｑＰＣＲ機器における色素校正の生成物は、例えば、各反応部位についての各色素標準の蛍光シグネチャを表すスペクトルプロファイルの集合である。各プロファイルは、例えば、校正プレート又はアレイカードなどのサンプルホルダのウェルなどの反応部位から収集された蛍光に対応するスペクトルのセットから構成される。各色素の校正に続いて、機器ソフトウェアは、各反応部位における各色素のスペクトルプロファイルを「抽出する」。ソフトウェアは、蛍光対フィルタのグラフにおける各プロファイルについての結果データをプロットする。ソフトウェアが色素校正データを抽出すると、それは、全校正プレート又はアレイカードについての集合スペクトルの観点で各ウェルによって生成される蛍光信号を評価する。色素スペクトルは、一般に、それらのグループと同じフィルタ内にピークがある場合には許容可能であるが、他の波長においては僅かに発散する。

校正プレートなどのサンプルホルダ上の色素校正を実行する場合、反応部位（例えば、ウェル）は、一般に、プレートの各ウェルにおける純スペクトル値の生成を可能とするために色素の同じ濃度を含む。図８は、９６ウェル校正プレートの各ウェルを占める単一色素（この場合、ＦＡＭ色素）を有する校正プレートの画像を表示している。これは、そのウェルについて読み取られた純スペクトルと実行中に各ウェルによって生成された蛍光信号の比較を可能とする。校正プレートの各ウェルについての単一色素を使用すると、ウェルについて得られた信号は、類似していなければならない。スペクトル位置及びピーク位置の変動は、例えば、個々のウェル間の光学的特性及び励起エネルギの僅かな差異によって生じることができる。色素校正においてこれらの変動を考慮すると、理論的には、より正確な色素校正をもたらす。

しかしながら、校正プレートあたり単一色素の使用は、特に多くの色素を校正する場合、非常に時間がかかり且つ複雑である可能性がある。蛍光色素の非限定的な例は、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＭＰ、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ及びＣｙ５を含む。したがって、必要性は、色素校正プロセスを簡便化し、色素校正の結果の同じ品質を維持しながら、校正に要する時間を短縮することに存在する。

図９及び図１０は、本願明細書に記載された実施形態にかかる蛍光色素を校正する例示的な方法９００を示すフローチャートを示している。方法９００のステップは、図４に示されるように、プロセッサ４０４によって行うことができる。さらにまた、プロセッサ４０４によって方法を実行するための命令は、メモリ４０６に記憶されることができる。

図９を参照すると、ステップ９０２において、処理するための基材の反応部位に色素を装填することによって校正プレートが準備される。この場合、基材は、９６ウェルプレートであるが、異なる基材は、例えば３８４ウェルプレートなどを使用可能である。様々な実施形態において、基材は、複数のサンプル領域を有するガラス又はプラスチックスライドとすることができる。基材のいくつかの例は、限定されるものではないが、標準的なマイクロタイター９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、若しくはマイクロカードなどのマルチウェルプレート、又はガラス若しくはプラスチックスライドなどの略平面支持部、又は任意の他の種類のアレイ若しくはマイクロアレイを含むことができる。基材の様々な実施形態において、反応部位は、基材の表面上に形成された規則的又は不規則な配列でパターン化された、窪み、刻み目、隆起及びそれらの組み合わせを含むことができる。従来、ウェル又はプレートへの言及は、例示的な目的にすぎず、本願明細書において使用可能な反応部位又はサンプルホルダの種類を限定する任意の方法ではない。

校正プレートは、図１１Ａに示されるように、格子状パターンで準備されることができる。示されるように、校正プレート１１００、１１２０及び１１４０において、プレート自体は、９６ウェル形式とすることができるが、校正プレート上のウェルの数は、例えば、校正に必要な色素数、校正プレートを許容するサンプル部３１４（図３を参照）の形式、又は異なるウェル密度の画像プレートに対する機器（例えば、ＰＣＲ機器３００）の機能に応じて、必要に応じて変えることができる。

色素分布の格子状パターンは、複数の色素が校正プレート毎に校正されるのを可能とする。校正プレート毎に１つの色素を校正するのとは対照的に、格子状パターンは、有利には、ユーザが色素セットを校正するために少数のプレートを使用するのを可能とし、それゆえに、色素校正に必要な時間及びプロセスステップを低減させる。

図１１Ａに示される実施形態において、１０個の別個の色素を校正するために３枚のプレートが使用される。各校正プレート１１００／１１２０／１１４０は、各ウェルが繰り返しパターンで特定の色素を提示するように（ウェル提示色素）、プレートの各列のウェルに沿って色素を交互に繰り返しパターンで４つの異なる色素を収容するように構成されている。例えば、プレート１１００は、ウェル１１０２（ＦＡＭ）、１１０４（ＶＩＣ）、１１０６（ＲＯＸ）及び１１０８（ＳＹＢＲ）によって例示されるウェルに交互にＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ及びＳＹＢＲ色素を収容する。プレート１１２０は、ウェル１１２２（バッファ）、１１２４（ＭＰ）、１１２６（ＡＢＹ）及び１１２８（ＪＵＮ）によって例示されるウェルに交互にバッファ、ＭＰ色素、ＡＢＹ色素及びＪＵＮ色素を収容する。プレート１１４０は、ウェル１１４２（ＮＥＤ）、１１４４（ＴＡＭＲＡ）、１１４６（ＣＹ５）及び１１４８（バッファ）によって例示されるウェルに交互にＮＥＤ色素、ＴＡＭＲＡ色素、ＣＹ５色素及びバッファを収容する。この実施形態において、１０個の色素のみが校正されることから、校正されるべき色素を収容しないウェルのフィラーとしてプレート１１２０及び１１４０においてバッファが使用される。

図１１Ａ及び図１１Ｂにおける実施形態は例にすぎず、校正される総色素数、プレートあたりの色素数、及びプレート数は、例えば、ユーザの校正の必要性、プレート上のウェル数、及び校正を扱う機器の能力に基づいて必要に応じて変化することができることが理解されるべきである。例えば、１２個の色素が図１１Ａに示された実施形態において校正された場合、４つの色素が総計１２個の色素について３つの校正プレート１１００／１１２０／１１４０のそれぞれにおいて校正されることができるため、バッファは、プレート１１２０及び１１４０において必要とされないであろう。

さらに、プレートあたりの色素数は、例えば、校正プレート上のウェル数、フルプレートを適切にモデル化するために使用される機器の能力（さらなる説明のために以下を参照）、及び選択されたプレートから使用可能な蛍光データを取得するための撮像システムの能力に基づいてプレートあたりの色素の最大数を有して２つ以上とすることができる。例えば、図１１Ａに示されるような９６ウェルプレートを使用するよりもむしろ、３８４ウェル校正プレートを使用することができるように十分にロバストな機器及び関連する撮像システムを有することができる。追加のウェル密度を提供することにより、例えばプレートあたり１６個の色素など、プレートあたりより多くの色素を校正することができ、（以下により詳細に記載される）十分なグローバルモデルを得るために必要とされる色素あたり同数（例えば、２４）のデータポイント（すなわち、ウェル提示色素）をなおも得ることができる。例えば、３８４ウェルプレートにより、１０個の色素が２つのプレート及びプレートあたり５つの色素を使用して校正されることができる。

サンプルホルダの種類及び反応部位の種類でさえも、可能な色素数に影響を及ぼすことがある。上述したように、他の種類のサンプルホルダ及び反応部位は、校正のために使用可能である。

図９を参照すると、ステップ９０４において、準備された格子状校正プレートが機器に装填されることができる。１度に機器に装填可能なプレート数は、使用される機器の機能や能力に依存する。例えば、９６ウェルブロックを有する標準ｑＰＣＲサーマルサイクラーは、１度に校正プレートに受け入れるにすぎない。しかしながら、マルチブロックサーマルサイクラーは、校正プレートをそれぞれ受け入れることができる複数のブロックを提供することができる。さらに、校正プレートが使用されない場合、使用されるサンプルホルダ（例えば、マイクロアレイ又はマイクロチップアレイ）の形式に応じて、複数のサンプルホルダは、例えば、機器内に収まる装填アセンブリを使用して単一機器内に受けられることができる。

図９のステップ９０６において、その関連する光学撮像システム（例えば、図３を参照）を使用する機器は、直列又は並列に装填された校正プレート又は複数のプレートの画像を取得する。取得された画像及び関連するデータは、例えば、図４におけるコンピューティングシステム４００のメモリ４０６又は記憶装置４１０上に記憶されることができる。光学撮像システムは、各光チャンネルにおいて各プレートの画像を取得することができる。チャンネルの数は、撮像システム内に設けられた励起及び発光フィルタの数に依存する。例えば、６つの励起フィルタ（Ｘフィルタ）及び６つの発光フィルタ（Ｍフィルター）を有する光学撮像システムについて、チャンネルの総数は、以下のフィルタの組み合わせによって表される２１である：Ｘ１Ｍ１、Ｘ１Ｍ２、Ｘ１Ｍ３、Ｘ１Ｍ４、Ｘ１Ｍ５、Ｘ１Ｍ６、Ｘ２Ｍ２、Ｘ２Ｍ３、Ｘ２Ｍ４、Ｘ２Ｍ５、Ｘ２Ｍ６、Ｘ３Ｍ３、Ｘ３Ｍ４、Ｘ３Ｍ５、Ｘ３Ｍ６、Ｘ４Ｍ４、Ｘ４Ｍ５、Ｘ４Ｍ６、Ｘ５Ｍ５、Ｘ５Ｍ６及びＸ６Ｍ６。各チャンネルにおいて取得された画像又は露光の数は変えることができる。例えば、撮像システムは、チャンネルあたり２枚の画像又は露光を取得することができる。チャンネルあたりのより少ない画像又は露光をとることが画像又は露光を取得するために必要な時間を低減させることができるとともに、チャンネルあたりにより多くの画像又は露光をとることが品質データのより大きな可能性を提供するため、撮像した画像又は露光数は、ユーザのニーズに依存する。

図９のステップ９０８において、機器は、光学撮像システムによって取得された画像又は露光から収集されたデータを使用して（例えば、図３を参照）、校正プレート上の各色素についてのピークチャンネルを特定する。各反応部位についてのこのピークチャンネルは、分析された特定の色素がその反応部位についての最大蛍光を示すチャンネルである。ピークチャンネル特定は、例えば、９５％以上の反応部位が色素占有されている場合に生じることができ、この場合には校正中において５％未満の異常値の反応部位しか許容しない。許容可能な異常値の割合は変えることができる。そして、異常値の反応部位は、将来の計算及び分析から破棄されることができる。例えば、誤った色素が装填されたとき、色素は不適切な構成に装填されたとき、色素の不適切な装填があったとき、又は光学部品が汚れたとき（例えば、ダスト粒子）、異常値が生じることができる。校正プレート上の各色素についてのピークチャンネルは、例えば、メモリ４０６に記憶されたデータを利用して、コンピューティングシステム４００のプロセッサ４０４によって特定されることができる。特定結果は、例えば、コンピューティングシステム４００のメモリ４０６又は記憶装置４１０に記憶されることができる。

あるいは、各反応部位上の各フィルタの組み合わせについての光学撮像システムによって取得された画像又は露光から収集された収集蛍光データは、当該技術分野において公知の背景及び均一性校正方法を使用して判定された背景成分及び均一性因子を使用して、ピークチャンネル特定の前に背景及び均一性補正によって補正されることができる。

図９のステップ９１０において、機器は、光学撮像システムによって取得された画像又は露光から収集されたデータを使用して（例えば、図２を参照）、ウェルに提示された全ての色素についてステップ９０８の特定されたピークチャンネルに各チャンネルを正規化する。各チャンネルは、例えば、メモリ４０６に記憶されたデータを利用して、コンピューティングシステム２００のプロセッサ４０４によって特定されたピークチャンネルに正規化されることができる。正規化結果は、例えば、コンピューティングシステム４００のメモリ４０６又は記憶装置４１０に記憶されることができる。

ウェルに提示された全ての色素は、正規化するように基線定量値を与えられる。一般に、定量値が大きいほど、検出される蛍光も大きくなる。したがって、所定の色素についての特定されたピークチャンネルは、ピークチャンネル異常値を除き、ウェルに提示された色素においてその色素の最大定量値を有するであろう。そのピークチャンネルにおける定量値にかかわらず、正規化するために、そのチャンネルにおける定量値は、１つの値にリセットされる。そして、他のチャンネルにおける同じ色素についての残りの定量値は、ピークチャンネルについての１つのリセット値に応じて調整される。例えば、色素Ｘについて、ピークチャンネルＡがウェルにおいて１００の定量値を有し且つ他のチャンネルＢがウェルにおいて４０の定量値を有した場合、正規化により、ピークチャンネルＡは１．０に設定され、チャンネルＢは、０．４０に設定される。この正規化された値はまた、上述したように１．０に設定されたピークチャンネルについての校正係数によって校正係数と称することができる。

図１１Ａ及び図１１Ｂに示される実施形態において、４つの色素が等しく９６ウェルプレートのウェルに分散されている場合、色素あたりウェルに提示された色素数は２４であろう。ウェルに提示された色素数は、例えば、サンプルホルダ（例えば、校正プレート）上の反応部位（例えば、ウェル）の数、サンプルホルダ上に分散された単位あたりの色素数など、上述した理由のために変えることができる。例えば、９６ウェルプレートにおいて、３つの色素が分散されている場合、ウェルに提示された色素数は、色素あたり３２であろう。９６ウェルプレート上に分散された６つの色素が存在する場合、色素あたりウェルに提示された１６個の色素が存在するであろう。

ここで図１０を参照すると、ステップ９１２において、機器は、色素あたり全てのウェルについてのグローバルモデリングを行う。サンプルホルダ形式の全てのウェルについての色素を校正するために、機器は、特定色素を有しないものを含む全てのウェルについてモデル化するために特定色素についてのウェルに提示された色素からのデータを使用することができる。グローバルモデリングは、例えば、全てのウェルについてモデル化するために特定色素についてのウェルに提示された色素からのデータを使用することにより、コンピューティングシステム４００のプロセッサ４０４によって実行されることができる。得られたモデルは、例えば、メモリ４０６又は記憶装置４１０に記憶されることができる。図１１Ａを参照すると、プレート１１００の２４個のウェル１１０２に提示されたＦＡＭ色素について、そのプレート上の他のウェル１１２は、提示されないＦＡＭ色素であろう。同じ２４個の提示された／７２個の提示されない分布は、図１１Ａにおける各色素に適用されるであろう。提示されないウェルの色素数は、上述したように、様々な理由のために依存することができる提示されたウェルの色素数に依存する。それにもかかわらず、所定のプレートについての提示された及び提示されないウェルの色素の総数は、そのプレート上のウェル数に等しい。図１１Ｂは、図１１Ａにおけるプレート１１００によって示されるのと同じ構成でＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ及びＳＹＢＲ色素を有する４つの色素格子状９６ウェル校正プレートの画像である。

代替実施形態において、機器は、全てのチャンネル又は例えば特定されたピークチャンネルの０．０１又は１％よりも大きい正規化された値を有するそれらのチャンネルについてのグローバルモデリングを実行する。この閾値以下のそれらのチャンネルについて、機器は、グローバルモデリングを実行する代わりにローカルモデリング（図１０のステップ９２２を参照）を実行する。グローバルモデリングは、検出された蛍光が、例えば、校正される実際の色素の寄与よりもむしろ、主にノイズ又は他の妨害の結果であるように、特定のチャンネルにおいてはそのような低レベルにおいて不要となることがある。

グローバルモデリングアルゴリズムは、ウェルに提示された特定色素の測定された色素校正係数に基づいて、各色素についての各フィルタチャンネルについての色素校正係数のモデルを導出するために色素校正において機能することができる。例えば、２４個のウェルが特定色素について９６ウェル格子状プレート上に提示されている場合、グローバルモデリングは、他の色素提示されていない７２個のウェルを含む全てのウェルについての校正係数を導出するためにそれらの２４個のウェルの色素校正係数を利用し、それゆえに、色素あたりチャンネルあたりのプレート全体のモデルを生成する。

２次元（２Ｄ）二次多項式関数は、色素校正係数についてのグローバルモデルとして適用することができる関数の例である。他のグローバルモデリング関数が知られており、本願明細書において使用可能である。モデリング残差（モデルから計算された値と測定された色素校正係数との差）を最小化することによって特定色素が提示されたウェル上で測定された色素校正係数から２Ｄ二次多項式関数を導出するために、非線形最小二乗解法が使用可能である。レーベンバーグ−マルカート信頼領域アルゴリズムは、この解法における最適化アルゴリズムとして使用可能である。多くの他の最適化アルゴリズムが本願明細書において使用可能であるが、１つの他の例は、その主要なアイデアが非線形目的を最適化するための最適化ステップを計算するために、ガウス−ニュートン及びコーシー法の双方を使用することであるドッグレッグ法である。このアプローチは、信頼領域として知られている探索空間の部分集合にわたってモデル関数（大抵の場合には二次）を使用して目的関数を近似する。モデル関数が真の目的関数を最小化することに成功した場合、信頼領域は拡張される。逆に、近似が不十分であった場合、領域は縮小され、モデル関数が再度適用される。損失関数はまた、例えば、高い残差（計算及び測定された校正係数の最大差）の影響を低減するために使用可能である。これらの高い残差は、通常、最適化における異常値を構成する。

図１０のステップ９１４において、全てのウェルが所定の色素又は複数の色素についてモデル化された後、機器は、適合度（ＧＯＦ）検査を実行する。これは、グローバルモデリングステップが十分に信頼性があることを確認することができる。ＧＯＦ検査は、例えば、例えば、メモリ４０６又は記憶装置４１０に記憶された結果を有するコンピューティングシステム４００のプロセッサ４０４によって実行することができる。適合度の測定は、典型的には、問題のモデルのもとに観測値と予想値との間の相違を要約する。ＧＯＦは、例えば、Ｒ二乗及び二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）値の判定の係数を含む多くの方法で判定されることができる。Ｒ二乗は、例えば、モデルの適合度に関するいくつかの情報を与える統計である。回帰において、判定のＲ二乗係数は、回帰直線が実際のデータ点をどれだけ近似するかの統計的尺度である。１のＲ二乗は、回帰直線が完全にデータをフィッティングすることを示している。ＲＭＳＥは、問題のモデルのもとでの観測値と予想値との差分又は残差の平均平方の平方根である。ＲＭＳＥは、モデルの断定精度の良好な指標である。０のＲＭＳＥは、モデルのもとでの予想値が観察値に正確に一致していることを示している。

図１０のステップ９１６において、良好なフィッティングがある場合、機器は、図９のステップ９１８における色素マトリクスを出力する。統計的に良好なフィッティングは、例えばＲ二乗分析において、Ｒ二乗値が例えば０．８５以上である場合又は図１０に示されるものなどの例えば０．０１以下であるＲＭＳＥ値の場合に生じることができる。色素マトリクスは、例えば、コンピューティングシステム２００のプロセッサ２０４によって準備されてディスプレイ２１２に出力されることができる。

図１０のステップ９２０において、悪いフィッティングがある場合、機器は、図１０のステップ９２２においてローカルモデリングを実行する。これは、例えば、ＧＯＦ検査についての計算されたＲ値が例えば０．８５未満であり且つＲＭＳＥ値が例えば０．０１よりも大きい場合に必要になり得る。ローカルモデリングは、例えば、残りのウェルに提示されていない色素についてモデル化するために、特定色素についてのウェルに提示された色素からのデータを使用することにより、コンピューティングシステム４００のプロセッサ４０４によって実行することができる。得られたモデルは、例えば、メモリ４０６又は記憶装置４１０に記憶されることができる。

ローカルモデリング法は、例えば、プレート上の同じ色素についてのウェルに提示された周囲色素からの校正係数を使用することを含むことができる。例えば、特定色素についてのウェルに提示されていない色素における校正係数値を判定するために、ローカルモデルは、周囲ウェルの５×５のローカルウィンドウ内にある又はプレート全体からの同じ色素のウェルに提示された全ての特定色素の中央値をとることができる。プレートの完全なモデリングが完了するまで、その中央値が判定される。ローカルモデリングの出力は、グローバルモデリングの出力を置き換えることができる。

ローカルモデリングの終わりにおいて、色素マトリクスは、機器が図１０のステップ９１８において色素マトリクスを出力するように十分である。この色素マトリクスは、各校正色素の蛍光シグネチャのプロファイルとして機能する。それぞれ広がった後、機器は、読み取り値毎に生スペクトル信号の形式でデータを受信する。機器は、色素マトリクスの純スペクトル校正データと生スペクトルを比較することによって各反応において使用される蛍光色素の寄与を判定する。機器は、機器によって収集された全蛍光における各色素の個々の寄与を特徴付けて区別するように色素標準（すなわち、色素マトリクス）から収集された校正データを使用する。
機器正規化校正

現在、推定３０，０００個のヒトゲノムのものを含むゲノム分析は、基礎の主要な焦点であり、生化学的及び薬学的研究に適用される。そのような分析は、多種多様な障害についての診断、薬剤及び治療法の開発に役立つことができる。しかしながら、ヒトゲノムの複雑性及び遺伝子の相互関係の機能は、大抵の場合、この作業を困難とする。一般に直面する１つの問題は、複数の機器上で実行される実験結果を容易に比較することが研究者にとってできないことである。光源、光学素子及び蛍光検出器などの要素のパラメータの物理的変動は、例えば、同一の生物学的サンプルとすることができるものについて分析結果に変化をもたらすことができる。したがって、成分の変動を最小化するのを支援するための方法及び装置についての継続的必要性が存在する。

ｑＰＣＲにおいて、増幅曲線は、大抵の場合、同じ溶液中の受動基準色素にレポーター色素の信号を正規化することによって判定される。レポーター色素の例は、限定されるものではないが、ＦＡＭ、ＳＹＢＲグリーン、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ ＣＹ−３、テキサスレッド、ＣＹ−５を含むことができる。受動基準の例は、限定されるものではないが、ＲＯＸとすることができる。この正規化は、ラベル付けされた正規化蛍光値又は「Ｒｎ」として報告されることができる。受動基準正規化は、全体信号レベルが液量又は全体的な照明強度によって影響を受けた場合であっても一定のＲｎ値を可能とする。しかしながら、受動基準正規化は、照明のスペクトルにおける機器間差異からなど、レポーター色素と基準色素との間の信号比が変化する場合、適切には機能することができない。これを調整するために、正規化溶液は、受動基準に対するレポーターの比を正規化するために製造されることができる。そのような正規化溶液の例は、「ＦＡＭ／ＲＯＸ」正規化溶液と称することができるＦＡＭ及びＲＯＸの５０：５０混合物とすることができる。

Ｒｎ値を調整するための「正規化係数」を得るために色素混合物からの蛍光を読み取ることを含む機器正規化のこの現在の方法は、追加の費用を必要とする。典型的には、正規化溶液及び正規化プレートの製造、並びに追加の校正を実行するための時間を必要とすることができる。さらに、この方法は、標準の対となるフィルタセットによって校正している色素混合物について動作するにすぎない。対となるフィルタセットは、励起フィルタ及び発光フィルタの組み合わせとすることができる。当業者は、追加色素の添加が異なる正規化溶液及び校正を必要とするであろうことを理解するであろう。

正規化溶液を生成するための製造プロセスはまた、色素の応答の変動に寄与する。絶対蛍光標準の欠如に起因して色素濃度を制御することが困難である可能性があることが見出された。これらの誤り及び変動を最小化するために、製造プロセスから所望の混合物の＋／−１５％以内又は所望の混合物の＋／−１０％以内の溶液の色素比率を標的とすることが有利であり得る。製造プロセスは、典型的には、単に色素の５０：５０混合物を混合してそれらの仕様を満たすように十分に制御されないため、プロセスにおける追加ステップは、蛍光光度によって色素混合物を調整する必要がある。

上記開示された許容可能なパーセント変動は、色素混合物の変動とＣｔｓとの関係を研究することによって判定されている。Ｃｔは、「閾値サイクル」についての共通の略語である。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、標的配列又はサンプル中に存在する遺伝子の量を判定するための方法を提供することができる。ＰＣＲの間、生物学的サンプルは、一連の３５又は４０温度サイクルにさらされる。サイクルは、複数の温度を有することができる。各温度サイクルについて、標的配列の量は、理論的に倍増することができ、ここに提示されない多数の要因に依存することができる。標的配列が蛍光色素を含むことから、標的配列の量が増加するのにともない、すなわち、３５又は４０温度サイクルにわたって増幅するのにともない、サンプル溶液は、各熱サイクルによってより明るい蛍光を発する。蛍光検出器によって測定されることになる蛍光量は、頻繁に、「閾値」と称され、蛍光が検出されたサイクル数は、「閾値サイクル」又はＣｔと称される。したがって、増幅及びＣｔがどのように効率的であるかを知ることにより、元のサンプルにおける標的配列の量が判定されることができる。

上述した許容パーセント変動はまた、機器におけるＣｔシフトの標準偏差に関連することができる。色素混合物における＋／−１５％の変動は、２つの標準偏差とすることができる０．２のＣｔの標準偏差をもたらすことができることが判定されている。

上記提示されたように、実験結果を確実に比較する能力は、複数の機器に由来するのが望ましく、機器間の変動は頻繁に問題である。この変動は、例えばランプ及びフィルタなどの機器内の要素の変動及び例えばランプ及びフィルタなどの経時変動という２つのソースから発生することができる。複数の機器からの実験結果が、確実に、容易に且つ安価に比較することができるプロセスを実施することが有利であろう。本願明細書において見出される教示は、そのようなプロセスを開示している。

光学系におけるサンプルの蛍光信号の量は、いくつかの要因に依存することができる。要因のいくつかは、限定されるものではないが、蛍光の波長、その蛍光の波長における検出器の効率、発光フィルタの効率、励起フィルタの効率及び色素の効率を含むことができる。本教示は、機器の物理的な光学素子が正規化されることができる場合、機器間変動は、最小限に抑えることができることを示唆している。

１つの実施形態において、正規化係数は、色素混合物からよりもむしろ純色素スペクトルから導出されることができる。純色素は、濃度が正確である必要はなく、唯一の蛍光成分があることから、色素混合物よりも製造が容易であることができる。この概念は、１０個の純色素を使用して機器における２つのフィルタセットを正規化し且つ色素混合物を使用することから得られた正規化に対する結果を比較することによってテストされた。正規化は、各励起フィルタ及び発光フィルタについての補正係数を判定することによって行われた。得られた補正係数は、異なる機器からさえも、色素の任意の組み合わせを正規化するために使用可能である。

他の実施形態において、上記教示された正規化は、様々な種類の複数の機器に適用された。８つの色素混合物の溶液及び１０個の純色素溶液が作成された。各溶液は、３つの９６ウェルプレートの８つのウェルにピペッティングされた。潜在的な空間的なクロストークは、全ての他のウェルにピペッティングすることによって最小化された。使用された色素混合物が図１２Ａに示されており、使用された純色素が図４Ｂに示されている。さらに、使用された機器は、６セットのフィルタを含んでいた。図１２Ｂは、さらに、各純色素についての主な光チャンネルについてのフィルタ対を特定する。励起フィルタは、「Ｘ」によって示されており、発光フィルタは、「Ｍ」によって示されている。

正規化プロセスの有効性を定量化するための努力において、色素比は、正規化前後に測定された。図１３は、１７個のテストされた機器についての平均比からの色素混合物のパーセント偏差を示している。機器は、Ｘ軸上にラベル付けされ、パーセント偏差は、Ｙ軸上にある。当業者は、機器にわたる偏差が上述した所望の＋／−１５％よりも頻繁に大きいことがわかる。したがって、このデータは、現在の教示などの改善された正規化プロセスの必要性を示している。

現在の教示は、全ての１７個の機器に適用された。正規化方法は、各色素比よりもむしろ個々のフィルタのそれぞれについての補正係数を判定する。機器は、６個の励起及び６個の発光フィルタを設けていることから、１２個の係数が判定された。プロセスが図１６及びフローチャート１６００に示されている。ステップ１６０５において、校正スペクトルは、複数のフィルタの組み合わせにわたって複数の色素について生成された。正規化される機器について、１０個の純色素及び２１個のフィルタの組み合わせがあった。ステップ１６１０において、スペクトルが正規化されたため、最大信号は１である。ステップ１６１５において、色素スペクトルは、複数のウェルにわたって平均化される。この平均化は、色素あたりにスペクトルを生成することをもたらす。まとめて、色素スペクトルは、色素及びフィルタの組み合わせを含む色素マトリクス「Ｍ」と称することができる。この時点で、基準機器が特定される。基準機器は、テスト機器が正規化される機器又は機器のグループをあろう。テスト機器において使用される色素スペクトルの同じセットは、基準機器から得ることができる。いくつかの実施形態において、基準は、機器のグループとすることができる。そのような実施形態において、各色素についてのスペクトルは、グループ全体で平均化されることができる。このステップは、ステップ１６２０においてフローチャート１６００で表される。例として、基準スペクトルは、マトリクス「Ｍｒｅｆ」と称することができる。

ステップ１６２５において、１２個のフィルタのそれぞれは、最初に１に設定された調整係数を有する。望まれるものは、ステップ１６３０において示されるようにマトリクス「Ｍ」とマトリクスＭｒｅｆとの差異が最小化されるまで、０とランドとの間、好ましくは０．０４と１との間で調整係数を反復的に修正しながら、調整係数をマトリクス「Ｍ」倍乗算することである。ステップ１６３５において、各フィルタ対の補正係数が計算される。各フィルタ対についての補正係数は、励起フィルタ係数と発光フィルタ係数との積である。主なチャンネルフィルタ対が図４Ｂに示されている。各フィルタ対についての補正係数が判定されると、各フィルタ対係数は、純色素スペクトルとともにテスト機器についての蛍光データによって乗算されることができる。そして、補正された純色素スペクトルは、ステップ１６４５に示されるように、１の最大値に再正規化されることができる。ステップ１６５０におけるプロセスの最終ステップは、多成分データを生成することである。当業者は、蛍光データの生成物及び色素行列の擬似逆行列であるように多成分手順を理解するであろう。多成分値が既に正規化されるため、データがフィルタレベルにおいて正規化されていることから、色素の特定の補正を行う必要がないであろう。

正規化の終了時において、平均比からの色素混合物の％偏差が全ての１７個の機器にわたって計算された。結果が図１４に示されている。これらの結果は、正規化前の図１３におけるデータと比較して大幅に改善される。正規化されたデータの拡大図が図１５に示されており、正規化後の偏差は、先に提示されるように＋／−１５％の目標を十分に下回っている＋／−８％まで低減されている。
リボヌクレアーゼＰ検証

上述したように、特に新規設置後又は数回の使用後に適切に動作していることを確認するために機器を検証することが重要である。このように、ユーザは、実験結果及び分析が正確で信頼性があることを確認することがある。以前において、検証アッセイは、ユーザによって機器上で実行され、ユーザは、機器を検証するために検証アッセイからの増幅データについてデータ分析を手動で行った。データ分析は、ユーザによって手動で行われたことから、検証プロセスは、誤りを起こしやすく且つ時間がかかった。

本教示の様々な実施形態によれば、自動化された検証方法及びシステムが提供される。検証アッセイの例は、リボヌクレアーゼＰアッセイである。しかしながら、本願明細書において使用される場合、検証アッセイは、既知であり且つ信頼性の高い特性であり、機器を検証するために使用可能な任意のアッセイとすることができる。

設置後及びいくつかの使用後において、機器が適切に動作していることを検証することが重要である。大抵の場合、ユーザは、リボヌクレアーゼＰアッセイなどの機器を検証するために既知のアッセイを手動で実行する。リボヌクレアーゼＰ遺伝子は、リボヌクレアーゼＰ酵素のＲＮＡ部分をコーティングするシングルコピー遺伝子である。それは、大抵の場合、その既知の特性及び性質のために検証アッセイとして使用される。

検証プレートには、サンプルのゲノムコピーの検出及び定量に必要な試薬が予め装填される。例えば、リボヌクレアーゼＰ検証プレートにおいて、各ウェルは、ＰＣＲマスターミックス、リボヌクレアーゼＰプライマー、ＦＡＭ（商標）色素標識プローブ、及びヒトゲノムＤＮＡテンプレートの既知の濃度を含む。

従来のリボヌクレアーゼＰアッセイの例において、標準曲線は、複製標準（１，２５０、２，５００、５，０００、１０，０００及び２０，０００コピー）のセットから得られたＣｔ（サイクル閾値）値から生成される。そして、標準曲線は、２つのセットの未知のテンプレート（５，０００及び１０，０００個の複製集団）についてのコピー数を判定するために使用される。単一ウェル内で実行されるその後のサンプルについて９９．７％の信頼レベルを有して５，０００から１０，０００ゲノム等価物を区別する能力を示すことができた場合、機器が検証される。

設置を合格させるために、機器は、単一ウェル内で実行されるその後のサンプルについて９９．７％の信頼レベルを有して５，０００から１０，０００ゲノム等価物を区別する能力を示さなければならない。

様々な実施形態によれば、本教示は、障害が特定された場合、合格／不合格状態及びトラブルシューティングのフィードバックを提供する自動化された校正及び検証システムに専門知識を組み込むことができる。機器が検証プロセスに失敗した場合、ユーザは、例えば、修理技術者が呼び出されることができることを把握する。本教示は、設置及び校正手順のために必要なコスト及び時間を最小限に抑えることができる。

上述したように、本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、検証分析の目的は、同じサンプルの２つの量が機器によって十分に区別可能であることを確認することである。このように、機器の性能が検証されることができる。

本教示の様々な実施形態によれば、自動化された検証方法及びシステムが提供される。機器が２つの量のサンプルを十分に区別することができるかどうかを判定するために、検証アッセイのサイクル閾値（Ｃ_ｔ）が分析されてシステムによって比較される。検証アッセイの例は、リボヌクレアーゼＰアッセイである。この例において、システムは、５０００及び１００００ゲノムコピーからのデータが十分に区別可能であるかどうかを判定するために、５０００及び１００００ゲノムコピーのリボヌクレアーゼＰサンプルについて生成されたＣ_ｔ値を判定する。本願明細書に記載された実施形態によれば、十分に区別可能であることは、少なくとも３シグマ（３σ）（−９９．７％）が５０００及び１００００ゲノムコピー増幅データを分離することを意味する。様々な実施形態にかかる方法が図１７及び図１８を参照してさらに記載される。

図１７は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を検証するための例示的な方法を示している。一般に、プレート上のウェルにそれぞれ対応する複数の増幅曲線を生成するために検証アッセイプレートから増幅データを受信することによってステップ１７０２において始まる。

プレートは、複数のウェルを含む。いくつかの例において、プレートは、９６個のウェルを含む。他の例において、プレートは、３８４個のウェルを含む。プレートにおけるウェルの一部は、第１の量のサンプルを含んでいてもよく、プレートにおけるウェルの他の部分は、第２の量のサンプルを含んでいてもよい。第１の量及び第２の量は異なる。第２の量は、本願明細書に記載された様々な実施形態において第１の量よりも多い。第２の量は、いくつかの実施形態において第１の量よりも１．５倍の差であってもよい。他の実施形態において、第２の量は、第１の量よりも２倍の差であってもよい。本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、第２の量は、第１の量よりも任意倍の差であってもよい。いくつかの実施形態において、第１の量は、ウェルあたり５０００ゲノムコピーであってもよく、第２の量は、ウェルあたり１００００ゲノムコピーであってもよい。

再度図１７を参照すると、ステップ１７０４において、複数の蛍光閾値が複数の生成された増幅曲線に基づいて判定される。複数の増幅曲線の指数領域は、指数領域が落ちる蛍光値の範囲を判定するために比較される。例えば、複数の増幅曲線の指数領域の下位の最低蛍光値から指数領域の上位の最高蛍光値までの蛍光値の範囲が判定される。蛍光値の範囲は、本教示の実施形態にしたがって機器を検証するために複数の増幅曲線の自動分析において使用される。

図１９を参照すると、複数の増幅曲線及び蛍光値の範囲の判定及び対応するサイクル閾値が示されている。複数の増幅曲線のそれぞれは、曲線の指数領域を含む。軸１９０２は、蛍光値を示している。軸１９０４は、サイクル数を示している。蛍光領域１９０６は、複数の指数領域のうちの指数領域の判定された下位の最低蛍光値及び複数の指数領域のうちの指数領域の判定された上位の最高蛍光値からの蛍光値の範囲を示している。様々な実施形態によれば、蛍光値の範囲は、システムによって自動分析についての蛍光値のセットを生成するために所定数で均等に分割される。１つの例において、蛍光値１９０６の範囲は、蛍光閾値のセットについて１００個の蛍光値を判定するために１００で分割される。いくつかの実施形態において、上位５個の蛍光値及び下位５個の蛍光値は、９０個の蛍光閾値のセットによってその分析が進むように破棄される。

再度図１７を参照すると、ステップ１７０６において、蛍光値のセットの各蛍光値について、サイクル閾値（Ｃ_ｔ）は、第１の量のサンプルを含むウェルから生成された複数の増幅曲線のそれぞれについて判定される。同様に、蛍光値のセットの各蛍光値について、サイクル閾値（Ｃ_ｔ）は、第２の量のサンプルを含むウェルから生成された複数の増幅曲線のそれぞれについて判定される。

ステップ１７０８において、セットの蛍光値のそれぞれについて第１及び第２の量についてのＣ_ｔ値を使用すると、第１及び第２の量が十分に区別可能であるかどうかが判定される。十分に区別可能であることは、様々な実施形態によれば、式（１）を使用して、セットの蛍光値の少なくとも１つについて正の結果をもたらすということを意味する：
（（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}−３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}）−（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}＋３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}）） （１）

式１は、本願明細書に記載された実施形態にしたがって、第１及び第２の量が十分に区別可能であるかどうかを判定し、ｑｕａｎｔ２は、ｑｕａｎｔ１よりも大きい。十分に区別可能であることは、少なくとも３シグマ（３σ）（−９９．７％）が第１及び第２の量のＣ_ｔ値を分離することを意味する。量が十分に区別可能であることが判明した場合、機器が検証されるという指示がユーザに提供される。

図１８は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器を検証するための他の例示的な方法を示している。ステップ１８０２において、増幅データは、検証プレートのウェルに含まれる複数のサンプルから受信される。検証プレートにおけるウェルの一部は、第１の量のサンプルを含む。検証プレートのウェルの他の部分は、第２の量のサンプルを含む。第１の量及び第２の量は異なる。第２の量は、いくつかの実施形態において第１の量よりも１．５倍の差であってもよい。他の実施形態において、第２の量は、第１の量よりも２倍の差であってもよい。本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、第２の量は、第１の量よりも任意倍の差であってもよい。いくつかの実施形態において、第１の量は、ウェルあたり５０００ゲノムコピーであってもよく、第２の量は、ウェルあたり１００００ゲノムコピーであってもよい。

ステップ１８０４において、生成された複数の増幅曲線に基づいて第１のセットの蛍光閾値が判定される。複数の増幅曲線の指数領域は、指数領域が落ちる蛍光値の範囲を判定するために比較される。例えば、複数の増幅曲線の指数領域の下位の最低蛍光値から指数領域の上位の最高蛍光値までの蛍光値の範囲が判定される。蛍光値の範囲は、本教示の実施形態にしたがって機器を検証するために複数の増幅曲線の自動分析において使用される。

様々な実施形態によれば、蛍光値の範囲は、システムによって自動分析についての蛍光値のセットを生成するために所定数で均等に分割される。１つの例において、蛍光値１９０６の範囲は、蛍光閾値のセットについて１００個の蛍光値を判定するために１００で分割される。いくつかの実施形態において、上位５個の蛍光値及び下位５個の蛍光値は、９０個の蛍光閾値のセットによってその分析が進むように破棄される。

ステップ１８０６において、セットの各蛍光閾値について、第１の量に対応する増幅曲線についての第１のセットのＣ_ｔ値が判定される。同様に、セットの各蛍光閾値について、第１の量に対応する増幅曲線についての第２のセットのＣ_ｔ値が判定される。これは、セット内の全ての蛍光閾値について繰り返される。

いくつかの実施形態において、所定数の異常値Ｃ_ｔ値がさらなる計算が行われる前に各セットのＣ_ｔ値から除去される。例えば、いくつかの実施形態において、９６ウェルプレートが使用される場合、６つの異常値が各セットのＣ_ｔ値から除去される。異常値は、Ｃ_ｔ値のセットの平均値から最も遠いＣ_ｔ値である。他の例において、３６４ウェルプレートが使用される場合、１０個の異常値が各セットのＣ_ｔ値から除去される。異常値が除去された後、各セットの残りのＣ_ｔ値が本方法の残りのステップにおいて使用される。

ステップ１８０８において、各セットのＣ_ｔ値について、平均が計算される。換言すれば、ステップ１８０４において判定されたセットの各蛍光閾値について、第１のＣ_ｔの平均が第１の量の増幅曲線について計算され、第２のＣ_ｔの平均が第２の量の増幅曲線について計算される。

ステップ１８０８と同様に、ステップ１８１０において、各セットのＣ_ｔ値についての３シグマが計算される。換言すれば、ステップ１８０４において判定されたセットの各蛍光閾値について、第１の３シグマが第１の量の増幅曲線について計算され、第２の３シグマが第２の量の増幅曲線について計算される。

第１の量及び第２の量のＣ_ｔ値が十分に区別可能であるかどうかを判定するために、様々な実施形態によれば、蛍光値におけるＣ_ｔ値が比較される。様々な実施形態によれば、式（２）が比較のために使用される。
（（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}−３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}）−（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}＋３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}）） （２）

式２は、本願明細書に記載された実施形態にしたがって、第１及び第２の量が十分に区別可能であるかどうかを判定する。十分に区別可能であることは、少なくとも３シグマ（３σ）（−９９．７％）が第１及び第２の量のＣ_ｔ値を分離することを意味する。

ステップ１８１４において、セットの全ての蛍光閾値についての式（２）の結果が最大値を判定するために比較される。最大値が正数である場合、機器は、第１及び第２の量の間において十分に区別可能であり、機器が検証されるという指示がステップ１８１６においてユーザに供給される。最大値が負数である場合、機器は、第１及び第２の量の間において十分に区別することができず、機器が検証されないという指示がステップ１８１８においてユーザに供給される。

図２０は、本願明細書に記載された様々な実施形態にかかる機器の検証のためのシステム２０００を示している。システム２０００は、ＰＣＲ機器インターフェース２００２と、Ｃ_ｔデータベース２００４と、表示エンジン／ＧＵＩ２００６と、Ｃ_ｔ計算部２００８と、検証部２０１０とを含む。

ＰＣＲ機器インターフェース２００２は、増幅曲線を生成するためにＰＣＲ計器から増幅データを受信する。上述したように、ＰＣＲ機器は、検証プレートに含まれるサンプルを増幅する。検証プレートは、第１の量のサンプルを含むウェルの一部及び第２の量のサンプルを含むウェルの他の部分を含む。サンプルの増幅から生成された蛍光データは、ＰＣＲ機器インターフェース２００２によって受信される。

それぞれ、図１７及び図１８を参照して、ステップ１７０４及び１８０４のように蛍光閾値のセットが判定された後、Ｃ_ｔ計算部２００６は、それぞれ、第１の量及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線に対応する第１及び第２のセットのＣ_ｔ値を計算する。第１及び第２のセットのＣ_ｔ値が蛍光閾値のセットにおける各蛍光閾値について計算される。複数のセットのＣ_ｔ値は、Ｃ_ｔデータベース２００４に記憶される。

検証部２０１０は、図１７におけるステップ１７０８並びに図１８におけるステップ１８１０及び１８１２において記載されたように、第１及び第２の量が十分に区別可能であるかどうかを判定する。

表示エンジン／ＧＵＩは、ユーザに複数の増幅曲線を表示する。さらに、検証部２０１０が第１及び第２の量が十分に区別可能であるかどうかを判定した後、表示エンジン／ＧＵＩ２００６は、ユーザに検証又は検証失敗の指示を表示する。

さらにまた、最適な蛍光閾値が判定されることができる。最適な蛍光閾値は、様々な実施形態によれば、（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}−３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}）と（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}＋３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}）との間の最大分離をもたらすＣｔ値を選択することによって判定されることができる。さらに、最適な蛍光閾値はまた、判定された異常値の最小数をもたらしたＣｔ値に基づいて選択されることができる。最適な蛍光閾値はまた、判定された異常値の最小数とともに、（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}−３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ１}）と（μＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}＋３σＣ_{ｔｑｕａｎｔ２}）との間の最大分離をもたらしたＣｔ値に基づいて選択されることができる。
自動色素補正

本教示の様々な実施形態によれば、多成分データのリアルタイムスペクトル校正を実行するために自動色素補正方法が使用可能である。自動色素補正は、リアルタイムで又は増幅データが収集されて二次分析が実行された後に実行することができる。自動色素補正アルゴリズムにおいて、多成分相関マトリクスが生成される。様々な実施形態によれば、自動色素補正アルゴリズムは、多成分相関マトリクスにおける非対角項が最小化されるように色素マトリクスの要素を調整する。この方法において、Ｃｔ判定における誤差が最小化される。
自動背景校正

本教示の様々な実施形態によれば、自動背景校正は、背景校正プレートの必要性を低減して背景補正の全体的な有効性を向上させるために実行することができる。

機器の使用によって生じるブロック（粒子又は化学的）における物理的汚染は、汚染によって影響を受ける分析されたウェルの特定のスペクトル成分を人工的に膨張させることによってシステムの分析結果に悪影響を与える可能性がある。再校正は、この問題に対処することができる。しかしながら、必要とされる校正間の期間を延長するために、背景校正後に変化する背景を自動的に計算／補償する方法が記載される。自動背景校正を達成するために、方法は、空の／非占有ブロックを使用して実行される。消耗品の有効信号ブリードスルーが知られており（経験的に判定される）、効果的な背景校正勾配及びオフセットは、有効信号ブリードスルーに対処するスケーリング係数を使用して近似することができる。
プレート検出

本願明細書に記載された様々な実施形態によれば、プレート検出方法は、機器内のプレート配置における誤りを特定するように実行されることができる。

機器の使用中において、システムの光学系は、移動の上限（アイドル期間中）又は下限（動作中）のいずれかに位置している。移動限界間の中間位置における光学位置を読み出すための能力は、（光学位置の差異がチューブ又はプレートの存在から添加材料の厚さによって生じる場合）プレート又はチューブが存在するか又は存在しないかを判定するためにモータ位置値をあてにすることができないものなど、ハードウェアに設計されていなかった。プレート又はチューブを検出するための追加の要素（押下スイッチ又は位置センサなど）を必要とすることなく、システムにおける検出カメラがサンプル検出のために使用される。しかしながら、ブロック領域の小部分のみが離散及び分離ウェルレンズアレイの使用によって撮像される（アレイ内の各レンズは、１つ及び１つのウェルのみからの光をフォーカスして集光する）ことから、全ブロック領域を撮像する面の消耗品の従来の「写真」は、画像処理のために取得されることができない。各ウェルからのフォーカスされた光のみが集光されて検出器において明るさの循環スポットとして現れることから、検出された画像には空間的又はダイナミックレンジがない。しかしながら、光学系が容器のシール又は蓋へのフォーカスを可能とする中間位置に移動される場合、このフォーカススポットは、（システムによって収集された通常信号である蛍光とは対照的な）反射像として撮像されてプレート／チューブの検出のために使用されることができる。フォーカスのスポットは、ウェルよりも小さく、これは、（調査領域、ＲＯＩとしても知られる）ウェルのサイズに対して小さい明るい領域として撮像画像に現れるであろう。フォーカススポットが明るい画素をもたらし且つ全ての他の領域がより暗い画素をもたらすであろうことを理解すると、画素レベル情報の数値分析は、本願明細書に記載された様々な実施形態にしたがって存在／非存在の判定を得ることができる。
反射性材料を使用した機器正規化

本教示の様々な実施形態によれば、フォトダイオードなどの反射性材料を使用した機器正規化は、製造に又は設置後に行われる任意の初期校正後に機器を自動校正するために使用可能である。

様々な実施形態によれば、安定した反射性材料が制御として製造中に測定される。反射性材料は、加熱カバーの上方に配置されることができる。その後、安定した反射性材料は、任意の変化又は変動を検出するために全てのチャンネルにおいて測定されることができる。励起光の変化のために再正規化するように機器正規化校正方法において上述したように色バランス係数を調整するために任意の変更又は変動が使用されてもよい。
例

例１において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するための方法において、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行することを備える方法が提供される。

例２において、ＲＯＩ校正が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、各ＲＯＩの中心位置を推定することと、各ＲＯＩのサイズを推定することと、複数の反応部位からＲＯＩの平均サイズを判定することと、グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、ＲＯＩにグローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、グローバル・グリッディング・モデルの適用がＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、欠落したＲＯＩを回復することと、ＲＯＩの半径を調整することであって、調整が光学系の信号対雑音比を向上させることとを備える例１が提供される。

例３において、ＲＯＩ校正が、複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する例１が提供される。

例４において、純色素校正が、複数のチャンネルにおいて、機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、各色素についてのピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成することとを備える例１が提供される。

例５において、サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる例４が提供される。

例６において、光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、機器正規化校正が、励起フィルタ及び発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することとを備える例１が提供される。

例７において、フィルタ正規化係数が、機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする例１が提供される。

例８において、リボヌクレアーゼＰ検証が、複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、セットの各蛍光閾値について、第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）の第１のセット及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣｔ値の第２のセットを判定することと、第１及び第２の量が複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算することとを備える例１が提供される。

例９において、リボヌクレアーゼＰ検証が機器に接続されたプロセッサによって実行される例１が提供される。

例１０において、リボヌクレアーゼＰ検証が、さらに、表示画面上で前記機器の検証又は失敗の指示を表示することを備える例８が提供される。

例１１において、さらに、多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するようにプレート検出を実行することと、背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行することとを備える例１が提供される。

例１２において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するためのシステムにおいて、プロセッサと、プロセッサ実行可能命令によって符号化されたメモリとを備え、命令が、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を含むシステムが提供される。

例１３において、ＲＯＩ校正のための命令が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、各ＲＯＩの中心位置を推定することと、各ＲＯＩのサイズを推定することと、複数の反応部位からＲＯＩの平均サイズを判定することと、グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、ＲＯＩにグローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、グローバル・グリッディング・モデルの適用がＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、欠落したＲＯＩを回復することと、ＲＯＩの半径を調整することであって、調整が光学系の信号対雑音比を向上させるための命令を備える例１２が提供される。

例１４において、ＲＯＩ校正が、複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する例１２が提供される。

例１５において、純色素校正のための命令が、純色素校正が、複数のチャンネルにおいて、機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、各色素についてのピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令を備える例１２が提供される。

例１６において、サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる例１５が提供される。

例１７において、光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、機器正規化校正が、励起フィルタ及び発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することを備える例１２が提供される。

例１８において、フィルタ正規化係数が、機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする例１２が提供される。

例１９において、リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、セットの各蛍光閾値について、第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）の第１のセット及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣｔ値の第２のセットを判定することと、第１及び第２の量が複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令を備える例１２が提供される。

例２０において、リボヌクレアーゼＰ検証が機器に接続されたプロセッサによって実行される例１２が提供される。

例２１において、リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、さらに、表示画面上で機器の検証又は失敗の指示を表示するための命令を備える例１９が提供される。

例２２において、さらに、多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するようにプレート検出を実行することと、背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令を備える例１２が提供される。

例２３において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するためのプロセッサ実行可能命令によって符号化されたコンピュータ可読記憶媒体において、命令が、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を備えるコンピュータ可読記憶媒体が提供される。

例２４において、ＲＯＩ校正のための命令が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、各ＲＯＩの中心位置を推定することと、各ＲＯＩのサイズを推定することと、複数の反応部位からＲＯＩの平均サイズを判定することと、グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、ＲＯＩにグローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、グローバル・グリッディング・モデルの適用がＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、欠落したＲＯＩを回復することと、ＲＯＩの半径を調整することであって、調整が光学系の信号対雑音比を向上させるための命令を備える例２３が提供される。

例２５において、ＲＯＩ校正が、複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する例２３が提供される。

例２６において、純色素校正のための命令が、純色素校正が、複数のチャンネルにおいて、機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占めることと、サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、各色素についてのピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令を備える例２３が提供される。

例２７において、サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる例２６が提供される。

例２８において、光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、機器正規化校正のための命令が、励起フィルタ及び発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用するための命令を備える例２３が提供される。

例２９において、フィルタ正規化係数が、機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする例２３が提供される。

例３０において、リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、セットの各蛍光閾値について、第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）の第１のセット及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣｔ値の第２のセットを判定することと、第１及び第２の量が複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令を備える例２３が提供される。

例３１において、リボヌクレアーゼＰ検証が前記機器に接続されたプロセッサによって実行される例２３が提供される。

例３２において、リボヌクレアーゼＰ検証のための命令が、さらに、表示画面上で機器の検証又は失敗の指示を表示するための命令を備える例３０が提供される。

例３３において、さらに、多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するようにプレート検出を実行することと、背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令を備える例２３が提供される。

例３４において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するためのシステムにおいて、画像内の反応部位位置を判定するように構成された関心領域（ＲＯＩ）校正部と、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように構成された純色素校正部と、フィルタ正規化係数を判定するように構成された機器正規化校正部と、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するように構成されたリボヌクレアーゼＰ検証部と、校正結果を表示するように構成された表示エンジンとを備えるシステムが提供される。

例３５において、ＲＯＩ校正部が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定し、各ＲＯＩの中心位置を推定し、各ＲＯＩのサイズを推定し、複数の反応部位からＲＯＩの平均サイズを判定し、グローバル・グリッティング・モデルを導出し、ＲＯＩにグローバル・グリッディング・モデルを適用し、グローバル・グリッディング・モデルの適用がＲＯＩの中心位置の精度を向上させ、欠落したＲＯＩを回復し、ＲＯＩの半径を調整し、調整が光学系の信号対雑音比を向上させるように構成されている例３４が提供される。

例３６において、ＲＯＩ校正部が、複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する例３４が提供される。

例３７において、純色素校正部が、複数のチャンネルにおいて、機器に装填されたサンプルホルダを撮像し、サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占め、サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定し、各色素についてのピークチャンネルに各チャンネルを正規化し、色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するように構成されている例３４が提供される。

例３８において、校正部が、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回サンプルホルダを撮像するように構成されている例３７が提供される。

例３９において、光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、機器正規化校正部が、励起フィルタ及び発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用するように構成されている例３４が提供される。

例４０において、フィルタ正規化係数が、機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする例３４が提供される。

例４１において、リボヌクレアーゼＰ検証部が、複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信し、検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含み、複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定し、セットの各蛍光閾値について、第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）の第１のセット及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣｔ値の第２のセットを判定し、第１及び第２の量が複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するように構成されている例３４が提供される。

例４２において、リボヌクレアーゼＰ検証部が、さらに、表示画面上で機器の検証又は失敗の指示を表示するように構成されている例４１が提供される。

例４３において、さらに、多成分データのリアルタイムスペクトル校正を実行するように構成された自動色素補正部と、プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するように構成されたプレート検出部と、背景変化を補償するように構成された自動背景校正部と、蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用するように構成された機器正規化部とを備える例３４が提供される。

例４４において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するための方法において、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行することとを備える方法が提供される。

例４５において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む前記機器を校正するためのシステムにおいて、プロセッサと、プロセッサ実行可能命令によって符号化されたメモリとを備え、命令が、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を含むシステムが提供される。

例４６において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するためのプロセッサ実行可能命令によって符号化されたコンピュータ可読記憶媒体において、命令が、画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することと、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令を備えるコンピュータ可読記憶媒体が提供される。

例４７において、機器が複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することができる光学系を含む機器を校正するためのシステムにおいて、画像内の反応部位位置を判定するように構成された関心領域（ＲＯＩ）校正部と、蛍光色素の純スペクトル校正データと蛍光色素の生スペクトルを比較することによって各反応部位において使用される蛍光色素の寄与を判定するように構成された純色素校正部と、フィルタ正規化係数を判定するように構成された機器正規化校正部と、機器が２つの異なる量のサンプルを区別することができることを検証するように構成されたリボヌクレアーゼＰ検証部と、校正結果を表示するように構成された表示エンジンとを備えるシステムが提供される。

代替例４８において、ＲＯＩ校正部が、各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定し、各ＲＯＩの中心位置を推定し、各ＲＯＩのサイズを推定し、複数の反応部位からＲＯＩの平均サイズを判定し、グローバル・グリッティング・モデルを導出し、ＲＯＩにグローバル・グリッディング・モデルを適用し、グローバル・グリッディング・モデルの適用がＲＯＩの中心位置の精度を向上させ、欠落したＲＯＩを回復し、ＲＯＩの半径を調整し、調整が光学系の信号対雑音比を向上させることを備える、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例４９において、ＲＯＩ校正部が、複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、及び光ラジアル歪みの群のうちの少なくとも１つを最小化することによって反応部位判定誤差を改善する、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５０において、純色素校正部が、複数のチャンネルにおいて、機器に装填されたサンプルホルダを撮像し、サンプルホルダが複数の反応部位及び複数の色素型を含み、各色素が複数の反応部位を占め、サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定し、各色素についてのピークチャンネルに各チャンネルを正規化し、色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成することを備える、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５１において、サンプルホルダを撮像することが、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、例４４、４５、４６、４７、５０又は任意の先行例が提供される。

代替例５２において、光学系が、複数の励起フィルタ及び複数の発光フィルタを備え、機器正規化校正部が、励起フィルタ及び発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、１対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタが、１つの励起フィルタ及び１つの発光フィルタを備えることと、データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することとを備える、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５３において、フィルタ正規化係数が、機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されるのを可能とする、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５４において、リボヌクレアーゼＰ検証が、複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信し、検証プレートが第１の量及び第２の量のサンプルを含み、各増幅曲線が指数領域を含むことと、複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、セットの各蛍光閾値について、第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃｔ）の第１のセット及び第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣｔ値の第２のセットを判定することと、第１及び第２の量が複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算することとを備える、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５５において、リボヌクレアーゼＰ検証が機器に接続されたプロセッサによって実行される、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

代替例５６において、リボヌクレアーゼＰ検証が、さらに、表示画面上で機器の検証又は失敗の指示を表示することを備える、例４４、４５、４６、４７、５４又は任意の先行例が提供される。

代替例５７において、さらに、多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するようにプレート検出を実行することと、背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、蛍光発光における変化又は変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行することとを備える、例４４、４５、４６、４７又は任意の先行例が提供される。

本願明細書において記載された様々な実施形態に関連する方法についての例示的なシステムは、以下の特許出願に記載されているものを含む：
・２０１５年２月６日に出願された米国意匠特許出願第２９／５１６，８４７号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国意匠特許出願第２９／５１６，８８３号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１２，９１０号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，００６号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，０７７号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，０５８号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１２，９６４号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，１１８号；及び
・２０１５年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／１１３，２１２号；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０１１）：及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２３）；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２５）；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２８）；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０２９）；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０３２）；及び
・２０１６年２月５日に出願された米国特許出願第＿（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ整理番号ＬＴ０１０３３）
これらの全てはまた、その全体を参照することによって本願明細書に組み込まれる。

様々な実施形態が特定の例示的な実施形態、例、及び用途に関して記載されてきたが、様々な変更及び変形が本教示から逸脱することなくなされ得ることが当業者にとって明らかであろう。

Claims (39)

1. 機器を校正するための方法であって、前記機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することが可能な光学系を含み、前記方法は、
   画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行することであって、前記ＲＯＩ校正は、反応部位判定誤差の群である、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、光ラジアル歪みのうちの少なくとも１つを最小化する、ことと、
   蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルとを比較することによって、各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行することと、
   フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行することと、
   前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することが可能であることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行することと
   を含む、方法。
2. 前記ＲＯＩ校正は、
   各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定することと、
   各ＲＯＩの中心位置を推定することと、
   各ＲＯＩのサイズを推定することと、
   前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定することと、
   グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、
   前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することは、前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させる、ことと、
   欠落したＲＯＩを回復することと、
   前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整することは、前記光学系の信号対雑音比を向上させる、ことと
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記純色素校正は、
   複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、前記サンプルホルダは、複数の反応部位と２つ以上の色素型とを含み、各色素は、２つ以上の反応部位を占める、ことと、
   前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、
   各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、
   色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成することと
   を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記サンプルホルダを撮像することは、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、請求項３に記載の方法。
5. 前記光学系は、複数の励起フィルタと複数の発光フィルタとを含み、前記機器正規化校正は、
   前記複数の励起フィルタおよび前記複数の発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
   １対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタは、１つの励起フィルタと１つの発光フィルタとを含む、ことと、
   データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することと
   を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記フィルタ正規化係数は、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されることを可能にする、請求項１に記載の方法。
7. 前記リボヌクレアーゼＰ検証は、
   複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、前記検証プレートは、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとを含み、各増幅曲線は、指数領域を含む、ことと、
   前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、
   前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ_ｔ）の第１のセットおよび前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ_ｔ値の第２のセットを判定することと、
   前記第１の量および前記第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ_ｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算することと
   を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記リボヌクレアーゼＰ検証は、前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、請求項１に記載の方法。
9. 前記リボヌクレアーゼＰ検証は、前記機器の検証または失敗を示すものを表示画面上に表示することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
10. 多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行することと、
    プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためのプレート検出を実行することと、
    背景変化を補償するように自動背景校正を実行することと、
    蛍光発光における変化または変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行することと
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 機器を校正するためのシステムであって、前記機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することが可能な光学系を含み、前記システムは、
    プロセッサと、
    プロセッサ実行可能な命令によって符号化されたメモリと
    を含み、
    前記命令は、
    画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行するための命令であって、前記ＲＯＩ校正は、反応部位判定誤差の群である、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、光ラジアル歪みのうちの少なくとも１つを最小化する、命令と、
    蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルとを比較することによって、各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行するための命令と、
    フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行するための命令と、
    前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することが可能であることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令と
    を含む、システム。
12. 前記ＲＯＩ校正のための命令は、
    各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定するための命令と、
    各ＲＯＩの中心位置を推定するための命令と、
    各ＲＯＩのサイズを推定するための命令と、
    前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定するための命令と、
    グローバル・グリッティング・モデルを導出するための命令と、
    前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用するための命令であって、前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することは、前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させる、命令と、
    欠落したＲＯＩを回復するための命令と、
    前記ＲＯＩの半径を調整するための命令であって、前記調整することは、前記光学系の信号対雑音比を向上させる、命令と
    を含む、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記純色素校正のための命令は、
    複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像するための命令であって、前記サンプルホルダは、複数の反応部位と２つ以上の色素型とを含み、各色素は、２つ以上の反応部位を占める、命令と、
    前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定するための命令と、
    各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化するための命令と、
    色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令と
    を含む、請求項１１に記載のシステム。
14. 前記サンプルホルダを撮像することは、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記光学系は、複数の励起フィルタと複数の発光フィルタとを含み、前記機器正規化校正は、
    前記複数の励起フィルタおよび前記複数の発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
    １対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタは、１つの励起フィルタと１つの発光フィルタとを含む、ことと、
    データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することと
    を含む、請求項１１に記載のシステム。
16. 前記フィルタ正規化係数は、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されることを可能にする、請求項１１に記載のシステム。
17. 前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令は、
    複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信するための命令であって、前記検証プレートは、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとを含み、各増幅曲線は、指数領域を含む、命令と、
    前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定するための命令と、
    前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ_ｔ）の第１のセットおよび前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ_ｔ値の第２のセットを判定するための命令と、
    前記第１の量および前記第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ_ｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令と
    を含む、請求項１１に記載のシステム。
18. 前記リボヌクレアーゼＰ検証は、前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、請求項１１に記載のシステム。
19. 前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令は、前記機器の検証または失敗を示すものを表示画面上に表示するための命令をさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
20. 多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行するための命令と、
    プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためにプレート検出を実行するための命令と、
    背景変化を補償するように自動背景校正を実行するための命令と、
    蛍光発光における変化または変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令と
    をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
21. 機器を校正するためのプロセッサ実行可能な命令によって符号化されたコンピュータ読み取り可能な記憶媒体であって、前記機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することが可能な光学系を含み、
    前記命令は、
    画像内の反応部位位置を判定するように関心領域（ＲＯＩ）校正を実行するための命令であって、前記ＲＯＩ校正は、反応部位判定誤差の群である、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、光ラジアル歪みのうちの少なくとも１つを最小化する、命令と、
    蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルとを比較することによって、各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように純色素校正を実行するための命令と、
    フィルタ正規化係数を判定するように機器正規化校正を実行するための命令と、
    前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することが可能であることを検証するようにリボヌクレアーゼＰ検証を実行するための命令と
    を含む、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
22. 前記ＲＯＩ校正のための命令は、
    各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定するための命令と、
    各ＲＯＩの中心位置を推定するための命令と、
    各ＲＯＩのサイズを推定するための命令と、
    前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定するための命令と、
    グローバル・グリッティング・モデルを導出するための命令と、
    前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用するための命令であって、前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することは、前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させる、命令と、
    欠落したＲＯＩを回復するための命令と、
    前記ＲＯＩの半径を調整するための命令であって、前記調整することは、前記光学系の信号対雑音比を向上させる、命令と
    を含む、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
23. 前記純色素校正のための命令は、
    複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像するための命令であって、前記サンプルホルダは、複数の反応部位と２つ以上の色素型とを含み、各色素は、２つ以上の反応部位を占める、命令と、
    前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定するための命令と、
    各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化するための命令と、
    色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成するための命令と
    を含む、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
24. 前記サンプルホルダを撮像することは、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回行われる、請求項２３に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
25. 前記光学系は、複数の励起フィルタと複数の発光フィルタとを含み、前記機器正規化校正のための命令は、
    前記複数の励起フィルタおよび前記複数の発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定するための命令と、
    １対のフィルタについての第２の補正係数を計算するための命令であって、各対のフィルタは、１つの励起フィルタと１つの発光フィルタとを含む、命令と、
    データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用するための命令と
    を含む、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
26. 前記フィルタ正規化係数は、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されることを可能にする、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
27. 前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令は、
    複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信するための命令であって、前記検証プレートは、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとを含み、各増幅曲線は、指数領域を含む、命令と、
    前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定するための命令と、
    前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ_ｔ）の第１のセットおよび前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ_ｔ値の第２のセットを判定するための命令と、
    前記第１の量および前記第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣ_ｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算するための命令と
    を含む、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
28. 前記リボヌクレアーゼＰ検証は、前記機器に接続されたプロセッサによって実行される、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
29. 前記リボヌクレアーゼＰ検証のための命令は、前記機器の検証または失敗を示すものを表示画面上に表示するための命令をさらに含む、請求項２７に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
30. 多成分データのリアルタイムスペクトル校正についての自動色素補正を実行するための命令と、
    プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するためにプレート検出を実行するための命令と、
    背景変化を補償するように自動背景校正を実行するための命令と、
    蛍光発光における変化または変動を検出するように反射性材料を使用して機器正規化を実行するための命令と
    をさらに含む、請求項２１に記載のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
31. 機器を校正するためのシステムであって、前記機器は、複数の反応部位からの蛍光発光を撮像することが可能な光学系を含み、前記システムは、
    画像内の反応部位位置を判定するように構成された関心領域（ＲＯＩ）校正部であって、前記ＲＯＩ校正部は、反応部位判定誤差の群である、前記複数の反応部位内の色素飽和、グリッドの回転、拡大率の変化、光ラジアル歪みのうちの少なくとも１つを最小化する、ＲＯＩ校正部と、
    蛍光色素の純スペクトル校正データと前記蛍光色素の生スペクトルとを比較することによって、各反応部位において使用される前記蛍光色素の寄与を判定するように構成された純色素校正部と、
    フィルタ正規化係数を判定するように構成された機器正規化校正部と、
    前記機器が２つの異なる量のサンプルを区別することが可能であることを検証するように構成されたリボヌクレアーゼＰ検証部と、
    校正結果を表示するように構成された表示エンジンと
    を含む、システム。
32. 前記ＲＯＩ校正部は、
    各サンプルウェルからの蛍光閾値から関心領域（ＲＯＩ）の初期領域を推定し、
    各ＲＯＩの中心位置を推定することと、
    各ＲＯＩのサイズを推定することと、
    前記複数の反応部位から前記ＲＯＩの平均サイズを判定することと、
    グローバル・グリッティング・モデルを導出することと、
    前記ＲＯＩに前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することであって、前記グローバル・グリッディング・モデルを適用することは、前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させる、ことと、
    欠落したＲＯＩを回復することと、
    前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整することは、前記光学系の信号対雑音比を向上させる、ことと
    を行うように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
33. 前記純色素校正部は、
    複数のチャンネルにおいて、前記機器に装填されたサンプルホルダを撮像することであって、前記サンプルホルダは、複数の反応部位と２つ以上の色素型とを含み、各色素は、２つ以上の反応部位を占める、ことと、
    前記サンプルホルダ上の各色素についてのピークチャンネルを特定することと、
    各色素についての前記ピークチャンネルに各チャンネルを正規化することと、
    色素基準値のセットを含む色素マトリクスを生成することと
    を行うように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
34. 前記校正部は、４つの異なるサンプルホルダの撮像について４回前記サンプルホルダを撮像するように構成されている、請求項３３に記載のシステム。
35. 前記光学系は、複数の励起フィルタと複数の発光フィルタとを含み、前記機器正規化校正部は、
    前記複数の励起フィルタおよび前記複数の発光フィルタのそれぞれについて第１の補正係数を判定することと、
    １対のフィルタについての第２の補正係数を計算することであって、各対のフィルタは、１つの励起フィルタと１つの発光フィルタとを含む、ことと、
    データをフィルタリングするために第２の補正係数を適用することと
    を行うように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
36. 前記フィルタ正規化係数は、前記機器からのデータが第２の機器からのデータと比較されることを可能にする、請求項３１に記載のシステム。
37. 前記リボヌクレアーゼＰ検証部は、
    複数の増幅曲線を生成するように検証プレートから増幅データを受信することであって、前記検証プレートは、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとを含み、各増幅曲線は、指数領域を含む、ことと、
    前記複数の増幅曲線の指数領域に基づいて蛍光閾値のセットを判定することと、
    前記セットの各蛍光閾値について、前記第１の量のサンプルから生成された増幅曲線のサイクル閾値（Ｃ_ｔ）の第１のセットおよび前記第２の量のサンプルから生成された増幅曲線のＣ_ｔ値の第２のセットを判定することと、
    前記第１の量および前記第２の量が前記複数の蛍光閾値のそれぞれにおけるＣｔ値に基づいて十分に区別可能であるかどうかを計算することと
    を行うように構成されている、請求項３１に記載のシステム。
38. 前記リボヌクレアーゼＰ検証部は、前記機器の検証または失敗を示すものを表示画面上に表示するようにさらに構成されている、請求項３７に記載のシステム。
39. 多成分データのリアルタイムスペクトル校正を実行するように構成された自動色素補正部と、
    プレート装填の誤りがあるかどうかを判定するように構成されたプレート検出部と、
    背景変化を補償するように構成された自動背景校正部と、
    蛍光発光における変化または変動を検出するように反射性材料を使用するように構成された機器正規化部と
    をさらに含む、請求項３１に記載のシステム。