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JP6736002B2 - 早産および／または低体重児出産のリスク判定を行うための方法およびキット - Google Patents

早産および／または低体重児出産のリスク判定を行うための方法およびキット Download PDF

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Description

本特許出願は、日本国特許出願第２０１４−１６５２８０号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定することを含む、妊婦の早産および／または低体重児出産のリスクの判定方法、当該方法に使用し得るキットまたはマーカーに関する。本発明は、また、早産および／または低体重児出産のリスク低減に有効な薬剤、当該薬剤を含む薬学的組成物、または、当該薬剤または薬学的組成物を妊婦に投与することを含む早産および／または低体重児出産のリスク低減方法に関する。
早期低体重児出産（早産）は、新生児の罹患や死亡の最も重要なリスク因子である。２０１０年の疫学調査では、全世界の新生児の１１.１％が早産児であった。早産は、周産期死亡の７５％、脳性麻痺や気管支肺異形成等の長期疾患罹患児の約半数に関与するため、ＷＨＯは早産の減少を目的としたキャンペーン活動を行っている。早産の原因として絨毛羊膜炎が挙げられるが、早産のリスクを判定する方法は未だ確立されていない。
歯周病は、歯周病原細菌感染による持続性の軽微な慢性炎症疾患であり、その罹患率は８０％に上る。近年、歯周病原細菌やそれに由来する因子が血流を介して全身に移行し、糖尿病、心血管疾患、動脈硬化、骨粗鬆症などの全身疾患に影響を与えることが明らかにされている。
本発明者を含む研究グループは、歯周病原細菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis（Ｐ.ｇ.））をマウス臼歯の歯髄から感染させることにより、Ｐ.ｇ.の持続的供給源となる歯根肉芽腫を形成することに初めて成功し、新規の歯性感染モデルを得た（非特許文献１）。このモデルでは、胎盤にＰ.ｇ.が高頻度で検出され、非感染群と比較して有意に多い早産および低体重児出産が観察された（非特許文献２および３）。
本発明者らは、感染胎盤における免疫学的現象の解析を進める中で、マクロファージを検出するために抗ガレクチン−３抗体を使用したところ、興味深いことに、このモデルの胎盤の様々な細胞において、ガレクチン−３の発現が顕著に上昇していることを見出した（非特許文献２および３）。ガレクチン−３（Ｇａｌ−３）は、ベータ−ガラクトシド結合レクチンであり、炎症促進と抗炎症の両方の過程において重要な役割を果たす免疫調節因子である（非特許文献４）。ガレクチン−３は、このモデルのマウスの羊水においても有意に上昇していた（非特許文献２および３）。しかしながら、このモデルの母体マウスの血清中のガレクチン−３レベルは開示されなかった。
Demmert, M. らは、ヒト新生児の臍帯血におけるガレクチン−３の発現を調べ、在胎期間と臍帯血中のガレクチン−３レベルに正の相関があり、早産児の臍帯血では正期産児と比較してガレクチン−３レベルが高いことを報告した（非特許文献５）。しかしながら、妊婦の血清中のガレクチン−３レベルと早産の関連は言及されていない。
このように、胎盤、羊水または臍帯血におけるガレクチン−３の発現レベルと早産の関連は示唆されていたが、妊婦から胎盤、羊水または臍帯血を採取することは胎児に障害を与え得るので、この関連を利用して早産のリスクを判定することは不可能であった。
Furusho, H., et al., Dental infection of Porphyromonas gingivalis exacerbates high fat diet-induced steatohepatitis in mice. J Gastroenterol, November 2013, 48 (11), pp 1259-1270 Ao M, et al., Odontogenic infection of P. gingivalis induces preterm delivery through Galectin-3, Abstract for International Association of Dental Research General Session (Seattle), March 20-23, 2013 Ao M, et al., Role of Galectin-3 in preterm delivery induced by odontogenic infection of Porphyromonas gingivalis, Abstract for 56th Annual Meeting in Spring, May 31- June 1, 2013 in Tokyo, the Japanese Society of Periodontology Dumic, J., S. Dabelic, and M. Flogel. 2006. Galectin-3: an open-ended story. In Biochim Biophys Acta. Netherlands. 616-635 Demmert M, et al., Galectin-3 in cord blood of term and preterm infants. Clin Exp Immunol. 2012, 167(2):246-51
本発明者らは、鋭意研究の末、妊婦の血清中のガレクチン−３濃度が、早産妊婦では正期産妊婦よりも高いことを見出し、本発明を完成した。
本発明のある態様は、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定することを含む、妊婦の早産および／または低体重児出産のリスクの判定方法を提供する。
本発明のある態様は、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定するための抗ガレクチン−３抗体を含む、早産および／または低体重児出産のリスクの判定用キットを提供する。
本発明のある態様は、血液、血漿または血清中のガレクチン−３である、早産および／または低体重児出産のリスクのマーカーを提供する。本発明の別の態様は、早産および／または低体重児出産のリスクのマーカーとしての、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３の使用を提供する。
本発明のある態様は、ガレクチン−３阻害剤を有効成分として含有する、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させるための薬学的組成物を提供する。
本発明のある態様は、有効量のガレクチン−３阻害剤を妊婦に投与することを含む、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させる方法を提供する。本発明の別の態様は、ガレクチン−３阻害剤を有効成分として含有する薬学的組成物を妊婦に投与することを含む、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させる方法を提供する。
本発明のある態様では、血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定するという簡便な方法により、妊婦および胎児に悪影響を与え得る羊水の採取を伴わずに、早産および／または低体重児出産のリスクを判定することができる。この判定結果を参照することにより、早産および／または低体重児出産のリスクの高い妊婦に対して集中的に予防処置をとることができ、早産および／または低体重児出産の減少が達成され得る。また、本発明の別の態様では、ガレクチン−３を阻害することにより、早産および／または低体重児出産のリスクを低減し得る。
図１は、ＮＣ（negative control）群およびＰ.ｇ.感染群のマウスにおける在胎日数（ｇｄ）（Ａ）および新生児体重（Ｂ）を示す。 図２は、ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群のマウスの胎盤組織におけるＰ.ｇ.の局在を示す免疫組織化学染色である。 図３は、ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群のマウスの胎盤組織におけるガレクチン−３の局在を示す免疫組織化学染色である。 図４は、ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群のマウスの羊水（Ａ）および血清（Ｂ）中のガレクチン−３の濃度を示す。 図５は、Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ刺激を受けたヒト栄養芽細胞株（ＨＴＲ−８）におけるガレクチン−３タンパク質（上のグラフ）および遺伝子（下の電気泳動図）のレベルを示す。 図６は、ＴＮＦ−α刺激を受けたＨＴＲ−８におけるガレクチン−３タンパク質レベルを示す。 図７Ａは、正期産および早産のヒト妊婦における血清中のガレクチン−３濃度を示し、各在胎週数でのガレクチン−３濃度の平均値を棒グラフで表したものである。 図７Ｂは、正期産および早産のヒト妊婦における血清中のガレクチン−３濃度を示し、各被験者のガレクチン−３濃度を在胎週数に対してプロットしたものである。 図７Ｃは、正期産および早産のヒト妊婦における血清中のガレクチン−３濃度を示し、正期産の妊婦の３８週でのガレクチン−３濃度と、早産の妊婦の出産直前のガレクチン−３濃度をプロットしたものである。 図８は、ヒト妊婦における各在胎週数でのガレクチン−３濃度の平均値を棒グラフで表したものである。 図９は、ＮＣ群、Ｐ.ｇ.群およびＰ.ｇ.／Ｎ−Ｌａｃ群のマウスの在胎日数を示す。 図１０は、ＮＣ群、Ｐ.ｇ.群およびＰ.ｇ.／Ｎ−Ｌａｃ群のマウスの胎盤組織におけるＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、Ｇａｌ−３の免疫局在を示す免疫組織化学染色である。 図１１は、Ｐ.ｇ.−ＬＰＳおよび／またはＮ−Ｌａｃ存在下でのＨＴＲ−８のＴＮＦ−αおよびガレクチン−３タンパク質レベルを示す。
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
本発明に関して、「早産」は、正期産より短い在胎期間での出産を意味し、ヒトの場合、在胎２２週０日ないし在胎３６週６日での出産を意味する。ヒトの在胎３１週６日までの出産を極早産と称することもある。ヒトの正期産は、在胎３７週０日ないし在胎４１週６日での出産を意味する。ヒトの在胎週数は、性周期が一定していて２８日前後である場合、妊娠前の最後の月経開始日を０週０日とした週数である。性周期が不定である場合、妊娠初期の胎児の大きさから在胎週数を推定する。性周期が安定していた場合でも、胎児の大きさに基づいて在胎週数を修正してもよい。高い確度で排卵時期の特定が可能な場合は、推定排卵日を２週０日とみなして在胎週数を数えてもよい。
本発明に関して、「低体重児出産」は、その種について遺伝的に定められている標準的な出産時の体重より低い体重での出産を意味し、ヒトの場合、２５００ｇよりも低い体重での出産を意味する。
本発明のある態様では、ヒト妊婦の早産および／または低体重児出産のリスクを判定する。ヒト妊婦は、例えば、在胎３６週６日までの妊婦である。不妊治療を受けている患者において、将来妊娠したときの該患者の早産および／または低体重児出産のリスクを判定することもできる。
本発明のある実施態様では、妊婦は早産および／または低体重児出産のリスク因子を有する。早産および／または低体重児出産のリスク因子には、当分野で知られているあらゆるリスク因子が含まれ、例えば、多胎妊娠、早産もしくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢もしくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症、または、子宮もしくは子宮頸の障害が含まれる。
本発明のある実施態様では、妊婦は歯周病に罹患している。歯周病の病原菌には、ポルフィノモナス・ジンジバリス、プレボテラ・インターメディア（Prevotella intermedia）、アグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Tannerella forsythensis）が含まれる。例えば、妊婦は、ポルフィロモナス・ジンジバリスに起因する歯周病に罹患している。
本発明のある実施態様では、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定する。血液は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から、採取される。血漿または血清は、当業者に周知の方法により血液を適宜処理することにより調製することができる。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあり得る。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。また、妊婦から採取された血液、血漿または血清を、ガレクチン−３濃度の測定に先立ち、その調製中または調製後に低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。
本発明に関して、当分野で知られているいかなる方法を用いてガレクチン−３濃度を測定してもよい。例えば、生体特異的親和性に基づく検査によってガレクチン−３濃度を測定し得る。生体特異的親和性に基づく検査の方法は当業者に周知であり、特に限定されないが、イムノアッセイが挙げられる。例えば、イムノアッセイには、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：サンドイッチイムノ法、競合法、直接吸着法などを含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合および非競合アッセイ系が含まれる。
イムノアッセイでは、抗ガレクチン−３抗体を使用し得る。ガレクチン−３と抗ガレクチン−３抗体とが免疫複合体を形成し得る条件のもと、妊婦から採取された血液、血漿または血清を抗ガレクチン−３抗体に接触させることにより、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定する。当業者は、抗ガレクチン−３抗体を適宜選択し得る。
本発明に関して、「ガレクチン−３に結合する抗体」または「抗ガレクチン−３抗体」は、ガレクチン−３に結合する抗体、その断片およびその誘導体、即ち、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドからなる群から選択され得る。抗体は、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生できる。抗体の断片および誘導体は、ガレクチン−３と選択的に相互作用できるものである。抗体の断片および誘導体は、例えば、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂ断片；２個の可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖ断片；可動性ペプチドリンカーにより連結された２個のＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；ラクダ科の重鎖二量体および単一可変領域、および、テンジクザメの新規抗原受容体などの単一ドメイン骨格および、可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）を含む。
抗ガレクチン−３抗体は、標識されていてもよい。標識は、当業者が適宜選択し得る。標識の非限定的な例には、蛍光染料または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色団の染料（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ）、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）、粒子（例えば、金などの金属粒子）、蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット）が含まれる。例えば、標識は、蛍光化合物、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。各種標識を、当業者に周知の様々な化学反応、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用して、抗ガレクチン−３抗体に結合させることができる。アミンおよびチオール以外の反応基、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンも使用できる。
標識の検出方法には、蛍光定量的、発光定量的および酵素的技法が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光標識は、蛍光標識を特定の波長の光に曝し、その後、特定の波長領域で発せられる光を検出および／または定量することにより、検出および／または定量する。発光標識は、化学反応中に生じる発光を検出および／または定量することにより、検出および／または定量する。酵素標識は、化学反応から生じるサンプル中の色の変化を検出および／または定量することにより、検出および／または定量する。ＥＬＩＳＡは、酵素的反応を基礎とする方法の一例である。当業者は、適切な検出および／または定量のためにプロトコルを改変することができる。
イムノアッセイの方法は、当業者に周知であり、一例を挙げると、以下のとおりである。プラスチックチューブ、マイクロプレート、ガラスビーズ、基板などの固相に、捕獲抗体を吸着させる。捕獲抗体としては、例えば、上記の標識された抗ガレクチン−３抗体のエピトープとは異なるガレクチン−３タンパク質中のエピトープを認識する、ガレクチン−３に結合する抗体、その断片および誘導体、例えば、ガレクチン−３のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられ得る。吸着に用いる捕獲抗体溶液の濃度は、当業者が適宜決定し得る。例えば、捕獲抗体溶液の濃度は、１〜１０μｇ／ｍＬの範囲で決定し得、例えば、２μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬとすることができる。
抗原抗体反応および酵素反応に関与しないタンパク質により、捕獲抗体を吸着させた固相をブロッキングする。ブロッキングに適するタンパク質としては、スキムミルク、アルブミン、フィッシュゼラチン、カゼインなどが挙げられる。例えば、ブロッキング用のタンパク質の濃度は、０.１〜５％または０.５％〜２％の範囲で決定し得、例えば、１％とすることができる。
固相上の捕獲抗体に、妊婦から採取された血液、血漿または血清を加え、捕獲抗体と妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。妊婦から採取された血液、血漿または血清を、必要に応じて適宜希釈した後に、上述の処理を行うことができる。妊婦から採取された血液、血漿または血清の希釈率は、当業者が適宜決定し得る。例えば、測定するサンプルの種類や他の条件に基づいて、１〜２０倍または５〜１０倍の範囲で決定し得、例えば、５倍または１０倍とすることができる。あるいは、妊婦から採取された血液、血漿または血清を希釈せずに、上述の処理を行うことができる。
固相を洗浄し、その後、上記の標識された抗ガレクチン−３抗体を加え、捕獲抗体に結合したガレクチン−３と標識された抗ガレクチン−３抗体とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。加えられる標識された抗ガレクチン−３抗体の濃度は、測定するサンプルの種類や他の条件等を考慮して、当業者が適宜決定し得る。例えば、標識された抗ガレクチン−３抗体の濃度は、０.１〜１０μｇ／ｍＬまたは０.１〜２μｇ／ｍＬの範囲で決定し得、例えば、０.１μｇ／ｍＬとすることができる。
さらに固相を洗浄し、ガレクチン−３に結合した、標識された抗ガレクチン−３抗体に由来するシグナルを、上記の蛍光定量的技法、発光定量的技法、酵素的技法などにより、検出および定量する。このシグナルの測定値は、使用した血液、血漿または血清中のガレクチン−３の濃度に相関する。
あるいは、捕獲抗体に結合したガレクチン−３を検出するために、標識されていない抗ガレクチン−３抗体を使用することもできる。この場合は、検出用の抗ガレクチン−３抗体を認識する、標識された二次抗体をさらに使用する。二次抗体の標識およびその検出方法は、上記の標識された抗ガレクチン−３抗体のものと同様であり得る。
本発明のある実施態様では、妊婦から異なる時点で採取された２以上の血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定し、各測定値を比較する。より正確な比較のために、比較される測定値は、同じ条件で調製および保存された血液、血漿または血清を、同じ方法で測定した値であることが好ましい。血液、血漿または血清の採取およびガレクチン−３濃度の測定は、２回以上、例えば、２〜１０回またはそれ以上の回数で実施する。採取および測定の間隔は、一定であってもなくてもよい。例えば、３月に１回、２月に１回、月に１回、２週に１回、週に１回、５日に１回、３日に１回、２日に１回、１日に１回などの頻度で採取および測定する。
この実施態様では、後の時点で採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が、以前に採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度よりも高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが上昇したと判定し得る。あるいは、後の時点で採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が、以前に採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度よりも低い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが低下したと判定し得る。
本発明のある実施態様では、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を基準値と比較する。基準値は、正期産のグループの妊婦および早産のグループの妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定し、各グループの測定結果を比較することにより決定され得る。
この実施態様では、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が基準値より高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定し得る。この場合の基準値は、例えば、正期産妊婦の出産時のガレクチン−３濃度の平均値、例えば、在胎３７週０日ないし在胎４１週６日の正期産妊婦のガレクチン−３濃度の平均値に基づく。そして、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度がこの基準値より低い場合には、早産および／または低体重児出産のリスクが低いと判定し得る。
例えば、実施例９の表４と図７および図８に示すデータをもとに基準値を設定する。例えば、実施例９において、正期産における在胎３８週から４０週の血清ガレクチン−３濃度の平均値−標準偏差値（σ）の値が１７.６≒１８であることから、早産が起こり得る在胎３６週６日までの血清ガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌより高ければ、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するが、測定等の諸条件の影響を考慮して、血清ガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌよりも小さい場合でも、１３ｎｇ／ｍｌ以上、更には、１５ｎｇ／ｍｌ以上であるときには早産および／または低体重児出産のリスクがあると判定してもよい。また、例えば、実施例９において、正期産における在胎３８週から４０週の血清ガレクチン−３濃度の平均値が２４.９≒２５であることから、早産が起こり得る在胎３６週６日までの血清ガレクチン−３濃度が２５ｎｇ／ｍｌより高ければ、早産および／または低体重児出産のリスクが非常に高いと判定する。
本発明のある実施態様では、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定された妊婦において、早産および／または低体重児出産を予防する。早産および／または低体重児出産の予防は、安静により行い得る。加えて、薬剤、例えば、リトドリン塩酸塩、イソクスプリン塩酸塩、硫酸マグネシウムなどの子宮収縮抑制剤または後述するＮ−アセチルラクトサミンなどのガレクチン３−阻害剤を投与することもできる。
本発明のある態様は、妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定するための抗ガレクチン−３抗体を含む、早産および／または低体重児出産のリスクの判定用キットを提供する。抗ガレクチン−３抗体は、上記で説明した通りである。抗ガレクチン−３抗体は、標識されていてもよい。標識は、上記で説明した通りである。例えば、標識された抗ガレクチン−３抗体は、ペルオキシダーゼ標識された抗ガレクチン−３抗体である。このキットは、上記の妊婦の早産および／または低体重児出産のリスクの判定方法において使用され得る。
このキットは、さらに、捕獲抗体として、上述の抗ガレクチン−３抗体、その断片およびその誘導体を含み得る。捕獲抗体は、上述の濃度で調製された溶液として提供されてもよく、プラスチックチューブ、マイクロプレート、ガラスビーズ、基板などの固相に吸着されていてもよい。
本発明のある態様は、血液、血漿または血清中のガレクチン−３である、早産および／または低体重児出産のリスクのマーカーを提供する。当該マーカーは、早産および／または低体重児出産のリスクが高まると増加し、その濃度を測定することにより、早産および／または低体重児出産のリスクを判定することができる。本発明の別の態様では、早産および／または低体重児出産のリスクのマーカーとしての、ヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３の使用を提供する。
本発明のある態様は、ガレクチン−３阻害剤を有効成分として含有する、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させるための薬学的組成物を提供する。
本発明のある態様は、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させるためのガレクチン−３阻害剤の使用を提供する。
本発明のある態様は、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させるための薬学的組成物を製造するための、ガレクチン−３阻害剤の使用を提供する。
本発明のある態様は、有効量のガレクチン−３阻害剤またはガレクチン−３阻害剤を有効成分として含有する薬学的組成物を妊婦に投与することを含む、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させる方法を提供する。
本発明に関して、「早産および／または低体重児出産のリスクを低減させる」は、妊婦において、早産および／または低体重児出産を防止すること、在胎日数を延長させること、出産を遅延させること、または、正期産をもたらすことを意味する。この場合の妊婦は、例えば、在胎３６週６日までのヒト妊婦である。
妊婦は、本明細書に記載の方法または他の方法により、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定された妊婦であってもよい。早産および／または低体重児出産のリスク因子を有する妊婦であってもよい。早産および／または低体重児出産のリスク因子には、当分野で知られているあらゆるリスク因子が含まれ、例えば、多胎妊娠、早産もしくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢もしくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症、または、子宮もしくは子宮頸の障害が含まれる。
本発明に関して、「ガレクチン−３阻害剤」は、ガレクチン−３の活性を阻害または低減するいかなる物質であってもよい。例えば、ガレクチン−３阻害剤は、式Ｉ
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 ［式中、
Ｒ１は、−ＯＨ、アミノまたは−ＮＨ−Ｘ−Ｒ２であり、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−であり、
Ｒ２は、アルキル、アルケニル（アルキルおよびアルケニルは、ハロゲン、−ＣＯＯＨおよびアミノからなる群から選択される１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい）、フェニル（フェニルは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、−ＣＯＯＨ、ニトロからなる群から選択される１〜５個の置換基により置換されていてもよい）、または、アミノ（アミノは、フェニルにより置換されていてもよい）であり、
Ｒ３は、−ＯＨまたはメトキシである］
で示される化合物またはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物である。
本発明に関して、「アルキル」は、１〜１０個の炭素原子、例えば１〜６個の炭素原子を有する、１価飽和脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。「Ｃｘ−ｙアルキル」は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキル基を意味する。アルキルは、例えば直鎖および分枝鎖ヒドロカルビル基、例えばメチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）およびネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）を意味するが、これらに限定されない。
本発明に関して、「アルケニル」は、２〜６個の炭素原子、例えば２〜４個の炭素原子を有し、少なくとも１個、例えば１〜２個の炭素−炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）を有するヒドロカルビル基を意味する。アルケニルは、例えばビニル、アリルおよびブト−３−エン−イルを意味するが、これらに限定されない。
本発明に関して、「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル（ここで、アルキルは本明細書に定義されている）の基を意味する。アルコキシは、例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｎ−ペントキシを意味するが、これらに限定されない。
本発明に関して、「アミノ」は−ＮＨ２の基を意味する。
本発明に関して、「ニトロ」は−ＮＯ２の基を意味する。
本発明に関して、「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
「化合物」は、本明細書において使用するとき、本明細書に記載の式（Ｉ）で示される化合物、並びに、それらのエステル、薬学的に許容し得る塩および溶媒和物を意味する。該用語はさらに、化合物の立体異性体および互変異性体を含む。
本発明の化合物は、置換パターンによっては、像および鏡像をとるか（エナンチオマー）、または、像および鏡像をとらない（ジアステレオマー）立体異性体で存在し得る。エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらの各々の両方が含まれる。ジアステレオマーのようなラセミ体は、既知方法で立体異性的に純粋な成分に分離できる。ある種の化合物は、互変異性体でも存在し得る。これは当業者に知られており、そのような化合物は同様に本発明の化合物に含まれる。
生理的に許容し得る、即ち、薬学的に許容し得る塩は、本発明の化合物の無機または有機酸との塩であり得る。好ましい塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸または硫酸とのもの、または、有機カルボン酸またはスルホン酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸またはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸との塩である。
また、言及し得る薬学的に許容し得る塩は、常套の塩基との塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）、または、アンモニアまたは有機アミン（例えば、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジヒドロアビエチルアミンまたはメチルピペリジン）から誘導されるアンモニウム塩である。
「溶媒和物」は、本発明に関して、固体または液体状態で溶媒分子との配位により錯体を形成している本発明の化合物である。水和物は、配位が水と起こる、溶媒和物の一形態である。
本明細書において使用するとき、用語「エステル」は、インビボで加水分解されるエステルを意味し、人体で容易に分解されて親化合物またはその塩を放出するものを含む。好適なエステル基は、例えば、薬学的に許容し得る脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するもの（ここで、各アルキルまたはアルケニル基は、例えば６個以下の炭素原子を有する）を含む。具体的なエステルの例は、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ブチル酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルを含む。
ある実施態様において、本発明の化合物は、Ｒ１が、−ＯＨ、アミノまたは−ＮＨ−Ｘ−Ｒ２であり、Ｘ−Ｒ２が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３、−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、
Figure 0006736002
 である、式（Ｉ）の化合物、またはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物である。
ある実施態様において、本発明の化合物は、Ｒ１が、−ＯＨまたは−ＮＨ−Ｘ−Ｒ２であり、Ｘ−Ｒ２が、
Figure 0006736002
 である、式（Ｉ）の化合物、またはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物である。
ある実施態様において、本発明の化合物は、以下の構造
Figure 0006736002
で表されるＮ−アセチルラクトサミンまたはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物である。
当業者は、Soerme P. et al., "Low micromolar inhibitors of galectin-3 based on 3'-derivatization of N-acetyllactosamine", ChemBioChem, 2002, 3, 183-189 に記載の方法に準じて、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物を製造し得る。また、当業者は、同文献に記載の方法に準じて、式（Ｉ）の化合物またはそのエステル、薬学的に許容し得る塩もしくは溶媒和物のガレクチン−３阻害活性を確認することができる。
本発明に関して、「薬学的組成物」は、非毒性、不活性の医薬的に適する補助剤および／または担体と共に、１種またはそれ以上のガレクチン−３阻害剤を含む薬学的組成物を意味する。薬学的組成物は、常套法で、既知方法により、例えば、ガレクチン−３阻害剤を上記補助剤および／または担体と混合することにより、製造できる。
本発明のある実施態様では、薬学的組成物は、例えば、総重量の約０.０１％ないし約９９.９％、約０.５％ないし約５０％または約２.５％ないし約２５％のガレクチン−３阻害剤を含み得る。
本発明に関して、ガレクチン−３阻害剤の有効量は、２４時間につき、通常は、約０.１ないし約１０ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは、約０.５ないし約５ｍｇ／体重ｋｇである。
それにも拘わらず、必要に応じて、特に、体重、投与経路、有効成分に対する個体の応答、製剤のタイプおよび投与を行う時間または間隔に応じて、上述の量から逸脱することが必要であり得る。従って、上述の最小量より少なくても十分な場合があり得、一方上述の上限を超えなければならない場合もある。比較的大量に投与する場合、これらを１日に亘る複数の個別用量に分配するのが望ましいことがある。
本発明に関して、ガレクチン−３阻害剤は、全身的および／または局所的作用を有し得る。この目的で、それらは、適する方法で、例えば、経口で、非経腸で、肺に、鼻腔に、舌下に、直腸に、皮膚に、経皮で、もしくは経膣で、またはインプラントもしくはステントとして、投与できる。有効成分を、これらの投与経路に適する投与形で投与できる。
経口投与に適するのは、先行技術に準じて機能し、ガレクチン−３阻害剤を迅速に、かつ／または、改変された方法で送達し、ガレクチン−３阻害剤を結晶形および／または無定形および／または溶解形で含有するものであり、例えば、錠剤（非被覆および被覆錠剤、例えば、胃液耐性であるか、または、不溶であるかもしくは遅延して溶解し、有効成分の放出を制御する被覆を有する錠剤）、口中で迅速に崩壊する錠剤、またはフィルム／オブラート、フィルム／凍結乾燥剤、カプセル剤（例えば、ハードまたはソフトゼラチンカプセル剤）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、粉末剤、乳剤、懸濁剤、エアゾル剤または液剤である。
非経腸投与は、吸収段階を回避して（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、脊髄内または腰椎内に）、または吸収を含めて（例えば、関節内、吸入、筋肉内、皮下、皮内、経皮、経膣または腹腔内）、行うことができる。非経腸投与に適する投与形は、とりわけ、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤または滅菌粉末剤形態の注射および点滴用製剤である。
他の投与経路に適するのは、例えば、吸入用医薬形態（とりわけ、粉末吸入器、噴霧器エアロゾル）、点鼻薬、液、スプレー；舌投与用の錠剤、フィルム／オブラートまたはカプセル剤、坐剤、膣用カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチ）、ミルク、ペースト、フォーム、散布用粉末剤、インプラントまたはステントである。
ガレクチン−３阻害剤を、不活性、非毒性、医薬的に適する補助剤と混合することにより、それ自体既知の方法で上述の投与形に変換できる。これらの補助剤には、とりわけ、担体（例えば結晶セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば液体ポリエチレングリコール類）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えばポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えばアルブミン）、安定化剤（例えば抗酸化剤、例えばアスコルビン酸など）、着色料（例えば無機色素、例えば酸化鉄など）および香味および／または臭気の隠蔽剤が含まれる。
ガレクチン−３阻害剤を、さらなる有効成分と組み合わせることも可能である。さらなる有効成分には、例えば、リトドリン塩酸塩、イソクスプリン塩酸塩、硫酸マグネシウムなどの子宮収縮抑制剤が含まれる。
さらなる有効成分およびその治療上有効量は、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で決定され得る。さらなる有効成分は、ガレクチン−３阻害剤と同一の医薬製剤中に存在してもよく、ガレクチン−３阻害剤とは別に提供されてもよい。
本発明に関して、成分を「組み合わせる」または「併用する」ことは、全成分を含有する投薬形の使用および各成分を別個に含有する投薬形の組合せの使用のみならず、それらが早産および／または低体重児出産のリスクを低減させるために使用される限り、各成分を同時もしくは連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を組み合わせて使用することも可能である。
本発明に関する上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
歯性感染モデルマウスの作成
下記の実験プロトコルは、広島大学の動物実験委員会により承認されたものである。５２匹の８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社、横浜、日本）を、一定の環境温度（２２℃）で飼育し、固形飼料を自由摂取で与えた。マウスを無作為に、Ｐ.ｇ.に感染させる群とさせない群に分け、各々Ｐ.ｇ.感染群またはＮＣ群と称した。Ｐ.ｇ.ｗ８３株の歯性感染は、以前に記載された通りに実施した（Furusho, H., et al., Dental infection of Porphyromonas gingivalis exacerbates high fat diet-induced steatohepatitis in mice. J Gastroenterol, November 2013, 48 (11), pp 1259-1270）。簡潔に述べると、両側の上部第１臼歯の髄腔を、＃１／２ラウンドバーで切開し、歯冠歯髄を除去した後、１０８ＣＦＵのＰ.ｇ.Ｗ８３株を含む綿棒を髄腔に挿入し、キャビトン（株式会社ジーシー、東京、日本）で密閉した。感染６週間後には、歯根肉芽腫が確立され、血清ＬＰＳレベルは上昇していた。また、感染６週間後に炎症促進性サイトカインの血清レベルを調べたところ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１７の上昇が見られ、軽微な全身性の炎症が確立されたことが示された。
歯性感染モデルマウスの早産および低体重児出産
ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群における在胎日数（ｇｄ）および新生児体重の差異を調べた。Ｐ.ｇ.感染群では、感染６週間後に交配を開始し、週に１回の交配方法によりｇｄを確認した。実験群間の統計的差異を、GraphPad Prism（version 6.0c, CA, USA）を使用して、Ｔ検定またはカイ二乗検定により評価した。有意レベルをＰ＜０.０１＊＊と設定した。
Ｐ.ｇ感染は、母体の体重に影響を与えなかった。ＮＣ群の平均ｇｄが２０.５だったのに対し、Ｐ.ｇ.群の平均ｇｄは１８.４であり、有意に短かった（Ｔ検定でＰ＜０.０１）（図１Ａ）。これは、マウスの早産に相当する（表１）。ｇｄ１７での出産（マウスの極早産に相当）さえ観察された。さらに、Ｐ.ｇ.感染群の新生児体重（１.２３ｇ）は、ＮＣ群のもの（１.３３ｇ）より有意に低かった（Ｔ検定でＰ＜０.０１）（図１Ｂ）。加えて、Ｐ.ｇ.感染群は、同腹仔の数に拘わらず、低体重児出産であった。低体重児出産であるか否かを判定するために、新生児体重の基準または胎児発育遅延（small-for-gestational age birth：SGA）の基準（在胎週数平均体重に対して１０％以上の低体重）を使用した（Battaglia FC, Lubchenco LO. A practical classification of newborn infants by weight and gestational age. J Pediatr. 1967 Aug;71(2):159-63）。ヒトの低体重児出産の基準（表２）に照らすと、マウスの新生児体重（１.２３）は、基準（＜０.９３ｇ）を満たさなかった。Ｐ.ｇ.感染群では、１５３匹の胎児のうち３０匹（４同腹仔）（１９.６％）が正期産であった。内訳は、５匹同腹の１例がｇｄ１９.５；９匹同腹の１例がｇｄ１９.５；８匹同腹の２例がｇｄ２０であった。３０匹のうち１３匹（４３％）がＳＧＡであり、ＮＣ群より１０％以上小さかった（カイ二乗検定でＰ＜０.０００１）。
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Ｐ.ｇ.感染群の胎盤におけるＰ.ｇ.の検出
ｇｄ１５のＰ.ｇ.感染群の胎盤組織にＰ.ｇ.が存在するか否かを調べた。
免疫組織化学染色は、常套の方法により行った。胎盤組織におけるＰ.ｇ.の免疫局在を、Ｐ.ｇ.全体に対するウサギ抗血清（石原和幸教授（東京歯科大学、日本）および應原一久博士（広島大学、日本）より譲渡）により調べた（１：１，０００希釈）。免疫組織化学染色による検出には、高分子ポリマー法（ヒストファインＭａｘ−ＰＯ；ニチレイバイオサイエンス）を使用した。各抗体をＰＢＳおよびウサギ血清で置き換えることにより、特異性を確認した。
免疫組織化学染色により、Ｐ.ｇ.感染群の胎盤組織にＰ.ｇ.のコロニーが検出された（図２）。
Ｐ.ｇ.の歯性感染による、胎盤組織における炎症性細胞浸潤の免疫局在、炎症メディエーターおよびガレクチン−３の増加
正期産は、白血球の浸潤および炎症促進性サイトカインの産生などの生理的炎症過程を伴うことが知られている。そこで、ｇｄ１５のマウス胎盤組織における多形核白血球（ＰＭＮＬ）やマクロファージなどの炎症性細胞の局在を免疫組織化学法により調べた。
免疫組織化学染色は、常套の方法により行った。ＰＭＮＬマーカーとして、ＭＣＡ７７１ＧＡ（ラット抗好中球抗体、AbD Serotec, Raleigh, NC, USA より購入、１：５０００希釈）、ウサギモノクローナル抗ＣＯＸ−２抗体（Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA より購入、１：１００希釈）、ヤギ抗ＴＮＦ−α抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA より購入、１：５０）、ラット抗ガレクチン−３抗体（BioLegend, Inc, San Diego, CA, USA より購入、１：５００希釈）を使用した。マーカーの免疫組織化学染色は、高分子ポリマー法（ヒストファインＭａｘ−ＰＯ；ニチレイバイオサイエンス）を使用して実施した。各抗体をＰＢＳ／血清で置き換えることにより、特異性を確認した。
Ｐ.ｇ.感染群では、炎症性細胞の胎盤への浸潤が見られた。ＮＣ群では、ＰＭＮＬは血管領域に限定され、一方、Ｐ.ｇ.感染群では、多数のＰＭＮＬが栄養膜の間にも観察された。炎症促進性メディエーターのＴＮＦ−αおよびＣＯＸ−２陽性細胞は、ＮＣ群の胎盤では殆ど検出されなかったが、多数のＴＮＦ−αおよびＣＯＸ−２陽性細胞がＰ.ｇ.群の胎盤で観察された。
興味深いことに、Ｐ.ｇ.感染群のｇｄ１５の胎盤組織で、広範囲に分布するガレクチン−３染色が検出された。それは、ＮＣ群の胎盤と異なり、炎症性マクロファージのみならず、栄養芽細胞および内皮細胞でも発現されていた（図３）。
Ｐ.ｇ.の歯性感染による、マウスの羊水および血清のガレクチン−３の増加
ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群におけるマウスの羊水および血清中のガレクチン−３の濃度を調べた。
ＮＣ群およびＰ.ｇ.感染群のｇｄ１５のマウスから羊水および血清を採取した。これらのガレクチン−３濃度を、Mouse Galectin-3 DuoSet ELISA Development Kit（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を製造業者の指示通りに使用して測定した。実験群間の統計的差異を、GraphPad Prism（version 6.0c, CA, USA）を使用して、Ｔ検定により評価した。有意レベルをＰ＜０.０１＊＊と設定した。
結果を図４に示す。ｇｄ１５のマウスの羊水および血清中のガレクチン−３濃度は、Ｐ.ｇ.感染群で有意に高かった（Ｐ＜０.０１）。
Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ刺激によるガレクチン−３の増加
Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ刺激による、培養中の栄養芽細胞によるガレクチン−３発現の変化を調べた。
ヒト栄養芽細胞株−ＨＴＲ−８／Ｓｖｎｅｏ細胞は、Charles H. Graham 教授（Queen's University, Canada）より譲渡された。１０％熱非動化ＦＢＳ（Invitrogen）および１００Ｕｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社、東京、日本）中で細胞を増殖させた。実験のために、細胞を３５ｍｍの培養皿に５ｘ１０５個の密度で播いた。５％ＣＯ２を含む通常の大気中、３７℃で細胞を維持した。1μｇ／ｍｌ濃度の Porphyromonas gingivalis のＬＰＳ（Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ；Invivogen, SanDiego, CA, USA）により、細胞を刺激し、１、２および３日後のガレクチン−３ｍＲＮＡ発現および培養上清中のガレクチン−３濃度を調べた。
全ＲＮＡを、細胞ペレット（細胞１.５ｘ１０５個）から、RNeasy Mini Kit（Qiagen, Venlo, The Netherlands）を製造業者の指示に従って使用して抽出した。ＲＮＡの濃度および純度を、標準的な分光光度法により測定した。１μｇの全ＲＮＡを使用して、ReverTra Dash kit（東洋紡株式会社、大阪、日本）により、ｃＤＮＡを合成した。全ｃＤＮＡのアリコートを、Go Taq（登録商標）- Green Master Mix（Promega, Madison, WI, USA）により増幅させた。ヒトガレクチン−３の増幅は、MyCyclerTM サーマルサイクラー（BIO-RAD, Hercules, CA, USA）にて、９４℃の変性段階を３０秒間、５８℃のアニーリング段階を３０秒間、７２℃の伸長段階を１分間のサイクルを、３０回繰り返して実施した。ＧＡＰＤＨおよび１８Ｓを内部対照として使用した。増幅反応の産物を、１.５％アガロース／ＴＡＥゲル（ナカライテスク株式会社、京都、日本）にアプライし、１００ｍＶで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。ＰＣＲプライマーは、フォワード：ＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣＡＣＧＣＴＴＣＡＡ、リバース：ＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴＴであった。
細胞培養上清中のガレクチン−３のタンパク質レベルを、Human Galectin-3 Immunoassay（R&D Systems）により、製造業者の推奨の通りに分析した。実験群間の統計的差異を、GraphPad Prism（version 6.0c, CA, USA）を使用して、Ｔ検定により評価した。有意レベルをＰ＜０.０１＊＊と設定した。
結果を図５に示す。Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ刺激は、ＨＴＲ−８細胞において、ｍＲＮＡ発現およびタンパク質（Ｐ＜０.０１）の両方のガレクチン−３レベルを３日目に上昇させた。
ＴＮＦ−α刺激によるガレクチン−３の増加
Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ刺激により産生されるＴＮＦ−αの、ガレクチン−３産生に対する影響を調べた。
１０ｎｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＴＮＦ−α（ｒｈＴＮＦ−α）（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）をＨＴＲ−８細胞に１、２または３日間適用し、細胞培養上清中のガレクチン−３のタンパク質レベルを測定した。細胞の培養および細胞培養上清中のガレクチン−３のタンパク質レベルの測定は、実施例６と同様に実施した。
結果を図６に示す。ＴＮＦ−α刺激の２日後に、ガレクチン−３レベルの有意な上昇が検出された（Ｐ＜０.０１）。
正期産および早産のヒト妊婦における血清中のガレクチン−３濃度
ヒトの早産とガレクチン−３発現の関連を調べた。
正期産妊婦から在胎１２週（ｎ＝２）、２８週（ｎ＝２）、３２週（ｎ＝２）および３８週（ｎ＝３）に、早産妊婦（ｎ＝６）から出産直前に、血液を採取し、血清を調製した。早産妊婦は、平均在胎３３週で出産した。Human Galectin-3 DuoSet ELISA Development Kit（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を製造業者の指示通りに使用してこれらの血清中のガレクチン−３濃度を測定した。実験群間の統計的差異を、GraphPad Prism（version 6.0c, CA, USA）を使用して、Ｔ検定により評価した。有意レベルをＰ＜０.０５と設定した。
結果を下表および図７に示す。
Figure 0006736002
正期産妊婦では、ガレクチン−３濃度は、在胎１２週、２８週および３２週でほぼ一定であり、この期間の平均血清ガレクチン−３濃度は、１１.３６ｎｇ／ｍｌ（±３.２７ＳＤ）であった。正期産妊婦のガレクチン−３濃度は３８週で平均２４.３６ｎｇ／ｍｌ（±８.７６ＳＤ）に上昇した（図７ＡおよびＢ）。早産妊婦の出産直前の平均ガレクチン−３濃度は３９.５２ｎｇ／ｍｌ（±１３.８４ＳＤ）であり、正期産妊婦よりも高く、平均で在胎３３週に出産したにも拘わらず、正期産妊婦の在胎３８週の値よりも高かった（Ｐ＜０.０５）（図７Ｃ）。
ヒト妊婦における血清中のガレクチン−３濃度
実施例８と同様に、在胎１１週ないし４０週のヒト妊婦において、血清ガレクチン−３濃度を測定した。結果を下表および図８に示す。下表の結果のうち、＊で示す値は、実施例８に記載した正期産の妊婦のものである。＊のない値の妊婦は出産前であり、在胎１１週ないし３７週では正期産か早産か不明である。実施例８の早産妊婦の結果を併記する（ＰＴＢ（早期産）、＊＊で示す値）。
Figure 0006736002
在胎１１週ないし３７週では、血清ガレクチン−３濃度は１０〜１５ｎｇ／ｍｌ前後で推移し、３８週周辺で２５〜３０ｎｇ／ｍｌに増加した。在胎１１週ないし３７週の平均血清ガレクチン−３濃度は、１３.７０ｎｇ／ｍｌ（±７.２３ＳＤ）であった。これより極端に高い値も見られ、特に、＊＊＊で示す値は、平均＋２σを超えるものであった。これらを除くと、在胎１１週ないし３７週の平均血清ガレクチン−３濃度は、１２.２１ｎｇ／ｍｌ（±３.９０ＳＤ）であった。
早産および／または低体重児出産に対するガレクチン−３阻害剤の影響
Ｇａｌ−３の阻害剤であるＮ−アセチルラクトサミン（Ｎ−Ｌａｃ）の投与がＰ．ｇ．歯性感染の誘導する早産に及ぼす影響を調べた。
８週齢雌性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６５）の第１臼歯歯髄からＰ．ｇ．（Ｗ８３株）を感染させ、感染６週後にＰ．ｇ．の継続的供給源となる歯根肉芽腫を確認した後、交配させた（Ｐ．ｇ．群）。Ｐ．ｇ．感染群の半数には、妊娠１２日目、１５日目および１８日目に、５ｍｇ／ｋｇのＮ−Ｌａｃ（Sigma-Aldrich 社）を腹腔内投与した（Ｐ.ｇ．／Ｎ−Ｌａｃ群）。Ｐ．ｇ．に感染していない通常の妊娠マウスを対照群（ＮＣ群）とし、在胎期間を比較した。また、妊娠１７日目に胎盤を採取し、炎症細胞浸潤（ＭΦ、好中球）、内皮細胞障害（ＣＤ３１）、出産促進因子（ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、Ｇａｌ−３）の免疫局在を比較した。
在胎日数の平均を図９に示す。ＮＣ群、Ｐ．ｇ．群およびＰ．ｇ．／Ｎ−Ｌａｃ群の在胎日数の平均は、各々１８．３日、２０日および２０．７日であり、Ｎ−Ｌａｃ投与はＰ．ｇ．が誘導する早産を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。組織学的観察では、妊娠１７日目に、Ｐ．ｇ．群の胎盤では羊膜の変性剥離（早期破水の徴候）、胎盤変性壊死および炎症細胞浸潤の増加が見られたが、Ｐ．ｇ．／Ｎ−Ｌａｃ群では見られなかった。ＣＤ３１の減弱、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２、Ｇａｌ−３の発現は、Ｐ．ｇ．／Ｎ−Ｌａｃ群では改善されていた（図１０）。
ヒト胎盤細胞株に対するガレクチン−３阻害剤の効果
Ｐ.ｇ.−ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）およびＮ−Ｌａｃ（１０−９Ｍおよび１０−８Ｍ）でＨＴＲ−８細胞を刺激し、細胞培養上清中のガレクチン−３、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２およびＩＬ−８のタンパク質レベルをＲＴ−ＰＣＲおよびWestern-blot法にて測定した。
Western-blot法の結果を図１１に示す。Ｎ−Ｌａｃ投与はＧａｌ−３の促進するＴＮＦ−α発現を抑制した。また、Ｐ．ｇ．−ＬＰＳによるＴＮＦ−αおよびガレクチン−３の発現上昇は、Ｎ−Ｌａｃ投与により著しく減弱した。
本明細書に記載の方法により、早産および／または低体重児出産のリスクを判定することができる。この判定結果を、早産および／または低体重児出産に対する予防処置を必要とする妊婦の選択に使用でき、効果的かつ効率的な周産期医療が促進され得る。また、ガレクチン−３阻害剤により、早産および／または低体重児出産のリスクを低減させることができる。

Claims (12)

  1. ヒト妊婦の早産および／または低体重児出産のリスクの判定を行うために、ヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定することを含む方法であって、
    （１）ガレクチン−３濃度を、正期産妊婦の出産時のガレクチン−３濃度の平均値に基づく基準値と比較し、ガレクチン−３濃度が基準値よりも高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための方法、
    （２）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１３ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクがあると判定するための方法、
    （３）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための方法、または、
    （４）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が２５ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが非常に高いと判定するための方法。
  2. ガレクチン−３濃度を、正期産妊婦の出産時のガレクチン−３濃度の平均値に基づく基準値と比較し、ガレクチン−３濃度が基準値よりも高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための、請求項１に記載の方法。
  3. 在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１３ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクがあると判定するための、請求項１に記載の方法。
  4. 在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための、請求項１に記載の方法。
  5. 在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が２５ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが非常に高いと判定するための、請求項１に記載の方法。
  6. 抗ガレクチン−３抗体を使用してガレクチン−３濃度を測定する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
  7. ヒト妊婦が早産および／または低体重児出産のリスク因子を有する、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
  8. 該リスク因子が、多胎妊娠、早産もしくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢もしくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症、または、子宮もしくは子宮頸の障害である、請求項７に記載の方法。
  9. ヒト妊婦が歯周病菌に起因する歯周病に罹患している、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
  10. 歯周病菌がポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）である、請求項９に記載の方法。
  11. ヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度を測定するための抗ガレクチン−３抗体を含む、早産および／または低体重児出産のリスクの判定用キットであって、
    （１）ガレクチン−３濃度を、正期産妊婦の出産時のガレクチン−３濃度の平均値に基づく基準値と比較し、ガレクチン−３濃度が基準値よりも高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するためのキット、
    （２）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１３ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクがあると判定するためのキット、
    （３）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するためのキット、または、
    （４）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が２５ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが非常に高いと判定するためのキット。
  12. 早産および／または低体重児出産のリスクのマーカーとしての、ヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３の使用であって、
    （１）ガレクチン−３濃度を、正期産妊婦の出産時のガレクチン−３濃度の平均値に基づく基準値と比較し、ガレクチン−３濃度が基準値よりも高い場合に、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための使用、
    （２）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１３ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクがあると判定するための使用、
    （３）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が１８ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが高いと判定するための使用、または、
    （４）在胎３６週６日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿または血清中のガレクチン−３濃度が２５ｎｇ／ｍｌ以上であれば、早産および／または低体重児出産のリスクが非常に高いと判定するための使用。
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