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JP6653009B2 - 抗補体因子Ｃ１ｑ抗体及びその使用 - Google Patents

抗補体因子Ｃ１ｑ抗体及びその使用 Download PDF

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JP6653009B2 JP2018243892A JP2018243892A JP6653009B2 JP 6653009 B2 JP6653009 B2 JP 6653009B2 JP 2018243892 A JP2018243892 A JP 2018243892A JP 2018243892 A JP2018243892 A JP 2018243892A JP 6653009 B2 JP6653009 B2 JP 6653009B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年7月9日に出願した米国仮出願第61/844,369号及び2013年8月29日に出願した米国仮出願第61/871,813号の利益を主張し、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルによる配列表の提出
ASCIIテキストファイルによる以下の提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる:配列表(ファイル名:717192000640SeqList.txt、記録された日:2014年7月9日、サイズ:21KB)のコンピュータに読み込み可能な形態(CRF)。
1.分野
本開示は、抗C1q抗体及びそれを使用する方法に関する。
2.関連技術の説明
過剰な補体活性化は、多くの炎症性及び自己免疫疾患を含む、ある範囲の疾患状態に関連している。より最近では、補体系はまた、神経変性疾患病理学に寄与することが示されている。具体的には、C1qなどの補体因子は、ニューロンシナプスにおいて発現され、排除のためにこれらのシナプスにマークを付すことが示された。例えば、米国特許公開第2012/0195880号及び第2012/328601号を参照されたい。選択的シナプス喪失は、正常な脳の発達の本質的な側面(「シナプス刈り込み」)であるが、過剰なシナプス喪失は、特に成熟又は加齢脳において、神経変性及び認知低下をもたらす。シナプス補体発現の上昇は、正常な加齢及び神経変性疾患の進行におけるシナプス喪失に寄与することが見出された。逆に、神経補体発現の低下は、神経保護的であることが見出された。これらの知見に基づいて、C1qなどの補体因子の活性を中和することは、シナプス喪失を防止し、神経変性疾患の進行並びに正常な加齢における認知低下を遅延させる有望な治療戦略として考えられる。
シナプス喪失を伴い、C1qなどの補体因子の中和を目的とした治療に対して影響を受けやすいと考えられる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病、ハンチントン病などが含まれる。
ほんの僅かな数の補体を中和する抗体が今日までに知られている(例えば、Klos A. et al., Mol Immunol. 2009, 46(14), 2753-2766、Carroll S. & Georgiou G., Immunobiology 2013, 218(8), 1041-1048、Tuzun et al., J. Neuroimmunol. 2007, 182, 167-176、Nelson et al., J. Clin. Invest. 2006, 116:2892-2900、Heinz et al., J. Immunol. 1984, 133, 400-404、Jiang et al., J. Immunol. 1991, 146, 2324-2330、Trinder et al., Scand. J. Immunol. 1999, 50, 635-641、Hwang et al., Mol. Immunol. 2008, 45, 2570-2580を参照されたい)。末端の補体活性化経路の阻害剤である、C5中和抗体であるエクリズマブ(Eculizumab)だけが、今日まで規制当局の承認を得ている。エクリズマブは、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH、Hillmen et al., N Engl J Med. 2006, 355(12):1233-43)の治療のために市販されている。
このように、C1qなどの補体因子に特異的に結合し、その生物学的活性を中和するさらなる抗体を開発する必要がある。
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用されている全ての引用文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において、抗C1q抗体、及び抗C1q抗体を使用する方法が提供される。
特定の態様において、本開示は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む単離された抗C1q抗体であって、軽鎖可変ドメインが、受託番号PTA-120399で寄託されたハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含み、かつ/又は重鎖可変ドメインが、ATCC受託番号PTA-120399で寄託されたハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む、抗体を提供する。
特定の態様において、本開示は、C1qタンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3からなる群から選択される軽鎖HVRを含み、かつ/又は配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3からなる群から選択される重鎖HVRを含む抗体を提供する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ/又は該抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号4と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号8と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
特定の態様において、本開示は、ATCC受託番号PTA-120399で寄託されたハイブリドーマ細胞株又はその子孫によって産生される、単離されたマウス抗ヒトC1qモノクローナル抗体M1を提供する。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qの両方に特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ラットC1qに特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1q、マウスC1q及びラットC1qに特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満〜約100pM未満の範囲である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約20nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約10nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約5nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約1nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が100pM未満又は約100pM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、C1qの生物学的活性は、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球形C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)B-アミロイドへのC1q結合又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、C1qの生物学的活性は、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、CH50溶血は、ヒト、マウス及び/又はラットCH50溶血を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、少なくとも50％、少なくとも80％又は少なくとも90％のCH50溶血を中和することができる。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、200ng/ml未満、100ng/ml未満、50ng/ml未満又は20ng/ml未満の用量で少なくとも50％のCH50溶血を中和することができる。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体はマウス抗体である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体はヒト化又はキメラ抗体である。
特定の態様において、本開示は、ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体M1又はその抗C1q結合断片と同じC1qエピトープに本質的に結合する単離された抗C1q抗体を提供する。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変ドメインは、配列番号4と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号8と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、本開示は、単離された抗C1q抗体を提供し、該抗体は、C1qタンパク質に結合し、i.配列番号1のアミノ酸残基96-226(配列番号16)又は配列番号1のアミノ酸残基196-226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(配列番号16)に対応するC1qタンパク質鎖A(C1qA)のアミノ酸残基、ii.配列番号1のアミノ酸残基196-221(配列番号17)又は配列番号1のアミノ酸残基196-221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号17)に対応するC1qAのアミノ酸残基、iii.配列番号1のアミノ酸残基202-221(配列番号18)又は配列番号1のアミノ酸残基202-221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号18)に対応するC1qAのアミノ酸残基、iv.配列番号1のアミノ酸残基202-219(配列番号19)又は配列番号1のアミノ酸残基202-219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(配列番号19)に対応するC1qAのアミノ酸残基、並びにv.配列番号1のアミノ酸残基Lys219及び/若しくはSer202又は配列番号1のLys219及び/若しくはSer202に対応するC1qAのアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qタンパク質鎖C(C1qC)のアミノ酸残基、(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、及び(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸にさらに結合する。特定の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。特定の実施形態において、該抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219とSer202又は配列番号1に示されるLys219とSer202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3に示されるTyr225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。特定の実施形態において、該抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219又は配列番号1に示されるLys219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Ser185又は配列番号3に示されるSer185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。
特定の態様において、本開示は、単離された抗C1q抗体を提供し、該抗体は、C1qタンパク質に結合し、(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基及び(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する。特定の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。特定の実施形態において、該抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219とSer202又は配列番号1に示されるLys219とSer202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3に示されるTyr225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。特定の実施形態において、該抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219又は配列番号1に示されるLys219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Ser185又は配列番号3に示されるSer185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qの両方に特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ラットC1qに特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1q、マウスのC1q及びラットC1qに特異的に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満〜約100pM未満の範囲である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約20nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約10nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約5nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が約1nM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトC1qとマウスC1qについての解離定数(KD)が100pM未満又は約100pM未満である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、生物学的活性は、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球形C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)ベータ-アミロイドへのC1q結合又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、生物学的活性は、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、CH50溶血は、ヒト、マウス及び/又はラットCH50溶血を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、少なくとも50％、少なくとも80％又は少なくとも90％のCH50溶血を中和することができる。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、200ng/ml未満、100ng/ml未満、50ng/ml未満又は20ng/ml未満の用量で少なくとも50％のCH50溶血を中和することができる。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、抗体は二重特異性抗体である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、脳透過性を増加させるように操作されている。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、第1の抗原はC1qタンパク質であり、第2の抗原は血液脳関門を横断する輸送を促進する抗原である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、第2の抗原は、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、angiopepペプチド並びにANG1005からなる群から選択される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体はIgGクラスのものである。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプを有する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体は抗体断片である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体はFab、F(ab')2又はFab'断片である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体断片は、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体断片は、その対応する全長抗体と比較してより良好な脳透過性を有する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該抗体断片は、その対応する全長抗体と比較してより短い半減期を有する。
特定の態様において、本開示は、本開示の抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の態様において、本開示は、先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の態様において、本開示は、本開示の核酸配列を含む、単離された宿主細胞を提供する。特定の態様において、本開示は、先行する実施形態のいずれかの核酸配列を含む、単離された宿主細胞を提供する。特定の態様において、本開示は、ATCC受託番号PTA-120399で寄託されたハイブリドーマ細胞又はその子孫を提供する。特定の態様において、本開示は、本開示の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。特定の態様において、本開示は、先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
特定の態様において、本開示は、そのような治療を必要とする個体における補体活性化に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、治療有効用量の本開示の抗体を投与することを含む方法を提供する。特定の態様において、本開示は、そのような治療を必要とする個体における補体活性化に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、治療有効用量の先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体を投与することを含む方法を提供する。他の態様において、本開示は、そのような治療を必要とする個体における補体活性化に関連する疾患の治療又は予防に使用するための先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体を提供する。他の態様において、本開示は、そのような治療を必要とする個体における補体活性化に関連する疾患を治療又は予防するための医薬の製造における先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体の使用を提供する。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は神経変性障害である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、神経変性障害は、シナプス又は神経接合部の喪失に関連する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、神経変性障害は、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、神経変性障害は、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、神経変性障害は、ミクログリアによるシナプス食作用に関連する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、神経変性障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病又はハンチントン病である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害は、糖尿病、肥満、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、眼内炎、眼内新生血管疾患、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、アロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息又は誤嚥性肺炎である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患である。
特定の態様において、本開示は、先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体、及びそのような治療を必要とする個体において補体活性化に関連する疾患を治療又は予防するために該抗体を使用するための指示を含む添付文書を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は神経変性障害である。いくつかの実施形態において、神経変性障害はシナプスの喪失又は神経接合部喪失に関連する。いくつかの実施形態において、神経変性障害は、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する。いくつかの実施形態において、神経変性障害は、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する。いくつかの実施形態において、神経変性障害は、ミクログリアによるシナプス食作用に関連する。いくつかの実施形態において、神経変性障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病及びハンチントン病からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害である。いくつかの実施形態において、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害は、糖尿病、肥満、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、眼内炎、眼内新生血管疾患、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、アロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息並びに誤嚥性肺炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、補体活性化に関連する疾患は、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患である。
特定の態様において、本開示は、本開示の抗体を含む診断用キットを提供する。特定の態様において、本開示は、先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に開示される診断的又は治療的使用のためである。
特定の態様において、本開示は、神経変性疾患又は自己免疫疾患を有する個体におけるシナプスを検出する方法であって、a)本開示の抗体を個体に投与するステップ、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって個体におけるシナプスを検出するステップを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、a)先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体を個体に投与し、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって個体におけるシナプスを検出することによって、個体におけるシナプスを検出する方法を提供する。他の態様において、本開示は、個体におけるシナプスの検出に使用するための先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体を提供する。他の態様において、本開示は、個体におけるシナプスを検出するための医薬の製造における先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体の使用を提供する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、シナプスに結合した抗体は、陽電子放出断層撮影(PET)、X線コンピュータ断層撮影、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)、コンピュータ断層撮影(CT)及びコンピュータ体軸断層撮影(CAT)からなる群から選択される画像技術を用いて検出される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、シナプスに結合した抗体の検出は個体におけるシナプス数の定量的測定をもたらす。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、個体は神経変性疾患又は自己免疫疾患を有する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、個体におけるシナプス数は、ある期間にわたって反復して測定され、個体におけるシナプスの喪失は経時的に検出される。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、経時的なシナプスの喪失は、神経変性疾患又は自己免疫疾患に対する治療の有効性についての尺度である。
特定の態様において、本開示は、生物学的試料におけるシナプスを検出する方法であって、a)生物学的試料を本開示の抗体と接触させるステップ、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって生物学的試料におけるシナプスを検出するステップを含む、方法を提供する。特定の態様において、本開示は、生物学的試料におけるシナプスを検出する方法であって、a)生物学的試料を本開示の抗体と接触させるステップ、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって生物学的試料におけるシナプスを検出するステップを含む、方法を提供する。他の態様において、本開示は、a)生物学的試料を先行する実施形態のいずれかの抗C1q抗体と接触させ、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって個体におけるシナプスを検出することによって、生物学的試料におけるシナプスを検出する方法を提供する。
先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、該方法は、ステップa)の前に、個体から生物学的試料を得るステップをさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、生物学的試料は、生検標本、組織又は細胞を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせてもよいいくつかの実施形態において、抗体は、免疫蛍光顕微鏡法、免疫細胞化学、免疫組織化学、ELISA、FACS分析又は免疫沈降によって検出される。
本明細書に記載されている様々な実施形態の1つ、いくつか又は全ての特性は、本明細書に提供される組成物及び方法の他の実施形態を形成するために組み合わせてもよいことは理解されなければならない。本明細書に提供される組成物及び方法のこれらの態様及び他の態様は、当業者に明らかとなる。
ヒトC1qに特異的に結合する抗体についてのELISAスクリーニングの結果を示す図である。抗C1q抗体1C7、2A1、3A2又は5A3をそれぞれ含有するハイブリドーマ上清を試験した。左の列(灰色)は、抗C1q抗体のヒトC1qタンパク質への結合についてのシグナルを表す。右の列(黒色)は、抗C1q抗体のヒトトランスフェリン(HT)への結合についてのシグナルを表す。 単回用量形式でのヒトCH50溶血アッセイにおける抗C1q抗体1C7、2A1、3A2及び5A3のC1q中和活性を示す図である。 用量応答形式でのヒトCH50溶血アッセイにおける抗C1q抗体1C7、3A2及び4A4B11のC1q中和活性を示す図である。 用量応答形式でのヒト、マウス及びラットCH50溶血アッセイにおける抗C1q抗体M1及び4A4B11のC1q中和活性を示す図である。図4Aは、ヒトCH50溶血アッセイの結果を示す。 用量応答形式でのヒト、マウス及びラットCH50溶血アッセイにおける抗C1q抗体M1及び4A4B11のC1q中和活性を示す図である。図4Bは、マウスCH50溶血アッセイの結果を示す。 用量応答形式でのヒト、マウス及びラットCH50溶血アッセイにおける抗C1q抗体M1及び4A4B11のC1q中和活性を示す図である。図4Cは、ラットCH50溶血アッセイの結果を示す。 C1q抗体複合体の質量分析の特性決定を示す図である。図5Aは、ANN-001(4A4B11)とC1qの混合物を示し、ANN-001単量体の予測された質量が約150kDaであり、C1q単量体の予期された質量が約460kDaであり、C1q/ANN-001の1:1複合体の予測された質量が約600kDaであることを示す。図5Bは、ANN-005(M1)とC1qの混合物を示し、ANN-005単量体の予測された質量が約150kDaであり、C1q単量体の予期された質量が約460kDaであり、C1q/ANN-005の1:1複合体の予測された質量が約600kDaであることを示す。 C1qペプチドがモノクローナル抗体ANN-005(M1)への結合に関してインタクトC1qと競合しないことを示す図である。図6Aは、等モル濃度で混合され、C1qペプチドの混合物の非存在下でインキュベートされたC1qとANN-005を示す。図6Bは、等モル濃度で混合され、C1qのペプシン消化によって生じたC1qペプチドの混合物の存在下でインキュベートされ、質量分析によって分析されたC1qとANN-005を示す。各々の場合において、未結合抗体と抗原(ANN-005及びC1q)の一部は、単量体について予期された質量(それぞれ約150kDaと約460kDa)で同定することができ、1:1複合体は約615kDaの質量で存在する。
一般技術
本明細書において記載され又は参照される技術及び手法は、当業者に一般的に十分に理解され、従来の方法を用いて通常使用され、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))、the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)に記載されている幅広く利用される方法が挙げられる。
定義
本明細書で使用するとき、用語「予防すること」には、個体における特定の疾患、障害又は状態の発生又は再発に対して予防を提供することが含まれる。個体は、特定の疾患、障害若しくは状態に対する素因がある、罹りやすい、又はこのような疾患、障害若しくは状態を発症する危険性があり得るが、該疾患、障害若しくは状態とまだ診断されていない。
本明細書で使用するとき、特定の疾患、障害若しくは状態を発症する「危険性がある」個体は、検出可能な疾患若しくは疾患の症状があってもよく又はなくてもよく、本明細書に記載されている治療方法の前に検出可能な疾患若しくは疾患の症状を示していてもよく又は示していなくてもよい。「危険性がある」とは、個体が1つ以上の危険因子を有することを示し、該危険因子は、当該技術分野において公知の特定の疾患、障害又は状態の発症と相関する測定可能なパラメータである。これらの危険因子の1つ以上を有する個体は、これらの危険因子の1つ以上がない個体よりも、特定の疾患、障害又は状態を発症する確率が高い。
本明細書で使用するとき、用語「治療」とは、臨床的病理の経過中に治療されている個体の自然経過を変更するために設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果としては、特定の疾患、障害若しくは状態の進行速度の減少、改善又は病理学的状態の緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。個体は、例えば、特定の疾患、障害又は状態に関連する1つ以上の症状が軽減又は排除される場合、成功的に「治療される」。
「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要とされる用量及び期間での少なくとも効果的な量を指す。有効量は、1回以上の投与で提供することができる。
「治療有効量」は、特定の疾患、障害又は状態の測定可能な改善を達成するために必要とされる少なくとも最小濃度である。本明細書において、治療有効量は、疾患状態、患者の年齢、性別及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する抗C1q抗体の能力などの因子に応じて変化しうる。治療有効量はまた、抗C1q抗体の任意の毒性又は有害な作用を治療的に有益な効果が上回るものである。
「慢性的」投与とは、長期間にわたり、初期の治療効果(活性)を維持するように急性様式とは異なり連続的な医薬(単数又は複数)の投与を指す。「間欠」投与とは、中断することなく連続的に行われないが、むしろ本質的には周期的である治療を指す。
本明細書で使用するとき、別の化合物又は組成物と「併用した」投与は、同時投与及び/又は異なる時点での投与を含む。併用投与にはまた、同時処方としての投与又は別々の組成物としての投与が包含され、異なる投与頻度又は間隔で、並びに同じ投与経路又は異なる投与経路を用いることを含む。
治療、予防又は危険性の低減の対象となる「個体」とは、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、例えば、ヒト、家畜及び農場動物、並びに動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
本明細書で使用するとき、「自己抗体」とは、宿主抗原を認識する任意の抗体を意味する。
用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び抗体断片を含む。
基本的な4本鎖抗体ユニットは、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。VH及びVLの対は一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性について、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
任意の脊椎動物種由来のL鎖を、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(「κ」)及びラムダ(「λ」)と呼ばれる2つの明確に異なるタイプのうちの1つに割り当てることができる。それらの重鎖(CH)の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには5クラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それぞれ、アルファ(「α」)、デルタ(「δ」)、イプシロン(「ε」)、ガンマ(「γ」)及びミュー(「μ」)と称する重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の相対的にわずかな差異に基づいて、サブクラス(アイソタイプ)にさらに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2を発現する。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知であり、例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders Co., 2000)に一般的に記載されている。
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)、続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)、その他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
「単離された」抗体、例えば、本開示の抗C1q抗体は、その生成環境(例えば、天然又は組換え)の成分から同定、分離及び/又は回収された抗体である。いくつかの実施形態において、単離されたポリペプチドは、その生成環境に由来する他の全ての夾雑成分が付随していない。その生成環境に由来する夾雑成分、例えば、トランスフェクトされた組換え細胞から生じるものは、典型的には、抗体の研究、診断的又は治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、(1)例えばLowry法によって決定したとき抗体の95重量％を超えるまで、いくつかの実施形態において99重量％を超えるまで、(2)スピンニングカップシークェネーター（Spinning cup sequenator）の使用によってN末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度に、又は(3)非還元又は還元条件下でクーマシーブルー又は銀染色を用いたSDS-PAGEで均質になるまで精製される。単離された抗体には、組換えT細胞内のインサイチュ抗体が含まれる。これは、該抗体の天然の環境の少なくとも1つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチド又は抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製される。
抗体、例えば、本開示の抗C1q抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「VH」及び「VL」と称することができる。これらのドメインは、一般的に、抗体の最可変部分(同じクラスの他の抗体と比較して)であり、抗原結合部位を含む。
用語「可変」とは、可変ドメインの一定のセグメントが、本開示の抗C1q抗体などの抗体間で配列に関して広範囲に相違するという事実を指す。Vドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全長にわたって均質に分布していない。代わりに、可変性は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方の超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々4つのFR領域を含み、大部分はベータシート立体配置を採り、3つのHVRによって連結され、それらはベータシート構造を連結するループを形成し、いくつかの場合ではベータシート構造の部分を形成する。各鎖のHVRは、FR領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖のHVRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照されたい)。定常ドメインは、抗原への抗体の結合には直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害への抗体の参加などの多様なエフェクター機能を示す。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するとき、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体、例えば、本開示の抗C1q抗体を指す。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性がある突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、ただ1つの抗原部位に指向される。典型的には種々の決定基(エピトープ)に指向される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上のただ1つの決定基に指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる夾雑がないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれかの具体的な方法による抗体の生成を要求すると解されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えばKohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975)、Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)、Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988)、Hammerling et al, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)、Marks et al, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992)、Sidhu et al, J. Mol Biol. 338(2): 299-310 (2004)、Lee et al, J. Mol Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)、Fellouse, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 101(34): 12467-472 (2004)、及びLee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, (2004)を参照されたい)、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を製造する技術(例えば、WO1998/24893、WO1996/34096、WO1996/33735、WO1991/10741、Jakobovits et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 90: 2551 (1993)、Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993)、Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993)、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号及び第5,661,016号、Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)、Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)、Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)、並びにLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, (1995)を参照されたい)を含む多様な技術によって作製できる。
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」又は「全抗体」は、抗体断片とは対照的に、実質的に無傷な形態で、本開示の抗C1q抗体などの抗体を指すために互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Fc領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。いくつかの場合において、インタクト抗体は、1つ以上のエフェクター機能を有することができる。
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、インタクト抗体の抗原結合領域及び/又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2、Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)を参照されたい)、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
本開示の抗C1q抗体などの抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、及び残留物の「Fc」断片(容易に結晶化する能力を反映した呼称)を生じる。Fab断片は、完全なL鎖と併せてH鎖の可変領域ドメイン(VH)及び1つの重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)からなる。各Fab断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それはただ1つの抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、ただ1つの大きなF(ab')2断片を生じ、それは大ざっぱに、異なる抗原結合活性を有する2つのジスルフィド連結されたFab断片に対応し、なお抗原を架橋することができる。Fab'断片は、抗体のヒンジ領域に由来する1つ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端にいくつかの追加の残基を有するという点でFab断片と異なる。Fab'-SHは、Fab'についての本明細書における呼称であり、定常ドメインのシステイン残基(単数又は複数)が遊離チオール基を保持する。F(ab')2抗体断片は、もともとFab'断片の間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合物もまた公知である。
Fc断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両H鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列によって決定され、その領域はまたある種の細胞上で見出されるFc受容体(FcR)によって認識される。
「Fv」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、しっかり固定された非共有結合の1つの重鎖及び1つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの折畳みから2つのドメインは、6つの超可変ループを生じ(H鎖及びL鎖からそれぞれ3ループ)、それは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、ただ1つの可変ドメイン(又は1つの抗原に特異的な3つのHVRのみを含む半分のFV)でも、抗原を認識し、結合する能力を有するが、親和性は完全な結合部位よりも低い。
「一本鎖Fv」は、「sFv」又は「scFv」とも略され、1本のポリペプチド鎖に連結されたVH及びVL抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態において、sFvポリペプチドはさらに、抗原結合のためにsFvに所望の構造を形成させることができるポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に含む。sFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
本開示の抗C1q抗体などの抗体の「機能的断片」は、インタクト抗体の一部分を含み、一般的には、インタクト抗体の抗原結合領域若しくは可変領域、又は修飾されたFcR結合能力を保持若しくは有する抗体のF領域が含まれる。抗体断片の例には、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
用語「ダイアボディ」は、Vドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されるように、それによって二価断片、すなわち、2つの抗原結合部位を有する断片を生じるように、VHとVLドメインの間に短いリンカー(約5〜10残基)を有するsFv断片(先行する段落を参照されたい)を構築することによって調製された小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、2つの「クロスオーバー」sFv断片のヘテロダイマーであり、2つの抗体のVH及びVLドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、Hollinger et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 90: 6444-48 (1993)に非常に詳細に記載されている。
本明細書で使用するとき、「キメラ抗体」は、本開示の抗C1q抗体などの抗体(免疫グロブリン)を指し、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖(単数又は複数)の残余部分は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片と同様に、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である(米国特許第4,816,567号、Morrison et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA, 81: 6851-55 (1984))。本明細書において対象とするキメラ抗体は、PRIMATIZED(登録商標)抗体を含み、該抗体の抗原結合領域は、例えば、対象とする抗原を用いてマカクザルを免疫することによって産生される抗体由来である。本明細書で使用するとき、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして用いられる。
本開示の抗C1q抗体などの非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、レシピエントのHVR由来の残基が、所望の特異性、親和性及び/又は能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のHVR由来の残基によって置き換えられる。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体及びドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、結合親和性などの抗体の性能をさらに洗練するために実施され得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン配列のものと対応し、FR領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、FR領域は、抗体の性能、例えば、結合親和性、異性化、免疫原性などを改善する個々のFR残基の1つ以上の置換を含むことができる。FRにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、H鎖では6個以下であり、L鎖では3個以下である。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986)、Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照されたい。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998)、Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995)、Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994)、並びに米国特第許6,982,321号及び
第7,087,409号を参照されたい。
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された、本開示の抗C1q抗体などの抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するヒト抗体、及び/又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されたヒト抗体である。このヒト抗体の定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知の多様な技術を用いて製造することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991)、Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581 (1991)。さらにヒトモノクローナル抗体の調製には、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)、Boerner et al, J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991)に記載された方法が利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座は不能にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫ゼノマウスに抗原を投与することによって調製できる(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関しては米国特許第6,075,181号及び第6,150,584号を参照されたい)。さらに、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Li et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)を参照されたい。
用語「超可変領域」、「HVR」又は「HV」は、本明細書で使用するとき、配列が超可変である及び/又は構造的に規定されたループを形成する抗体の可変ドメイン領域、例えば、本開示の抗C1q抗体の可変ドメイン領域を指す。一般的に、抗体は、6つのHVRを含み、3つはVHにあり(H1、H2、H3)、3つはVLにある(L1、L2、L3)。天然の抗体では、H3及びL3は6つのHVRで最大の多様性を示し、特に、H3は抗体に精密な特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000)、Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ (2003))を参照されたい。実際に、天然に存在するラクダ科の重鎖のみからなる抗体は、軽鎖の非存在下で機能し、安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)及びSheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996)を参照されたい。
いくつかのHVRの範囲決定が用いられ、本明細書に包含される。Kabatの相補性決定領域(CDR)であるHVRは配列可変性に基づき、最も一般的に用いられている(Kabat et al.、上述)。Chothiaは、むしろ構造性ループの配置に言及する(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))。AbM HVRは、Kabat CDRとChothia構造性ループの折衷案を提示し、オックスフォードモレキュラー(Oxford Molecular)のAbM抗体モデリングソフトウェアで用いられている。「接触」HVRは、利用可能な複合結晶構造の分析に基づいている。これらHVRの各々の残基を下記に記す。
Figure 0006653009
HVRは以下の通りの「伸長HVR（extended HVR）」を含むことができる:VLにおいて24-36又は24-34(L1)、46-56又は50-56(L2)及び89-97又は89-96(L3)、並びにVHにおいて26-35(H1)、50-65又は49-65(H2)及び93-102、94-102又は95-102(H3)。可変ドメイン残基は、これらの伸長HVRの定義の各々についてKabat et al.(上述)に従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「FR」残基は、本明細書で定義されるHVR残基以外の可変ドメイン残基である。
語句「Kabatの可変ドメイン残基の番号付け」又は「Kabatのアミノ酸の位置の番号付け」及びそれらの変型は、抗体の編集に関して重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて用いられるKabat et al.(上述)の番号付与システムを指す。この番号付与システムを用いると、実際の直線的なアミノ酸配列は、可変ドメインのFR又はHVRにおける短縮又は挿入に対応してアミノ酸の減少又は付加を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後ろに1アミノ酸の挿入(Kabatによる残基52a)及び重鎖FR残基82の後ろに挿入残基(例えば、Kabatによる残基82a、82b及び82cなど)を含むことができる。残基のKabat番号付与は、Kabat番号付与が実施された「標準」配列と所与の抗体の配列の相同性領域におけるアラインメントによって該抗体について決定することができる。
Kabat番号付与システムは、一般的に、可変ドメインにおける残基(軽鎖の残基1-107程度及び重鎖の残基1-113程度)に言及する場合に使用される(例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「EU番号付与システム」又は「EUインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及するときに使用される(例えば、Kabat et al.(上述)において報告されているEUインデックス)。「KabatにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付与を指す。本明細書において他に記述がなければ、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Kabat番号付与システムによる残基番号付与を意味する。本明細書において他に記述がなければ、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、EU番号付与システムによる残基番号付与を意味する(例えば、米国特許公開第2010-280227号を参照されたい)。
「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書で使用するとき、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来のVL又はVHフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態において、既存のアミノ酸変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下又は2個以下である。いくつかの実施形態において、既存のアミノ酸変化がVHに存在する場合、それらの変化は、位置71H、73H及び78Hのほんの3つ、2つ又は1つで起こり、例えば、それらの位置でのアミノ酸残基は71A、73T及び/又は78Aであってもよい。一実施形態において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのVL又はVHフレームワーク配列の選択における最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンのVL又はVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)におけるようなサブグループである。VLについての例には、Kabat et al.(上述)におけるようなサブグループであり得るカッパI、カッパII、カッパIII又はカッパIVが含まれ得る。さらに、VHについては、サブグループは、Kabat et al.(上述)におけるようなサブグループI、サブグループII又はサブグループIIIであり得る。
例えば、本開示の抗C1q抗体の特定の位置の「アミノ酸修飾」は、特定の残基の置換若しくは欠失、又は特定の残基に隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入は、その1つ又は2つの残基内の挿入を意味する。挿入は、特定の残基のN末端側又はC末端側であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書ではアミノ酸修飾は置換である。
本開示の抗C1q抗体などの「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のHVRにおいて1つ以上の変更を有する抗体であり、該変更は、そのような変更(単数又は複数)をもたない親抗体と比較して、抗原に対す該抗体の親和性の改善をもたらす。一実施形態において、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル親和性又はピコモル親和性さえ有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野において公知の手法によって製造される。例えば、Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、VH及びVLドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。HVR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci USA 91:3809-3813 (1994)、Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)、Yalton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)、Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)及びHawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載されている。
本明細書で使用するとき、用語「特異的に認識する」又は「特異的に結合する」とは、測定可能であり、再現性を有する相互作用、例えば、標的と、本開示の抗C1q抗体などの抗体との間の引力又は結合を指し、生物学的分子を含む不均質な分子集団の存在下で該標的の存在を決定できる。例えば、標的又はエピトープと特異的に又は優先的に結合する抗体、例えば、本開示の抗C1q抗体は、それが他の標的又は標的の他のエピトープと結合するよりもはるかに高い親和性、結合性(avidity)で、より迅速に及び/又ははるかに長い時間、この標的又はエピトープと結合する抗体である。また、この定義を読むことによって、例えば、第1の標的に特異的又は優先的に結合する抗体(又は部分)は、第2の標的に特異的に又は優先的に結合してもよく又は結合しなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない(ただし、排他的な結合を含んでもよい)。標的に特異的に結合する抗体は、少なくとも約103M-1若しくは104M-1、時々約105M-1若しくは106M-1、他の例においては約106M-1若しくは107M-1、約108M-1〜109M-1、又は約1010M-1〜1011M-1あるいはそれを超える結合定数を有してもよい。様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイを慣用的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
本明細書で使用するとき、補体因子C1qなどの補体タンパク質と第2のタンパク質の間の「相互作用」は、限定されないが、タンパク質-タンパク質相互作用、物理的相互作用、化学的相互作用、結合、共有結合及びイオン結合を包含する。本明細書で使用するとき、抗体は、抗体が2つのタンパク質間の相互作用を破壊し、減少し、又は完全に排除するとき、2つのタンパク質間の「相互作用を阻害する」。本開示の抗体又はその断片は、該抗体又はその断片が2つのタンパク質のうちの1つに結合するとき、2つのタンパク質間の「相互作用を阻害する」。
「ブロッキング」抗体、「アンタゴニスト」抗体、「阻害」抗体又は「中和」抗体は、該抗体が結合する抗原の1つ以上の生物学的活性、例えば、1つ以上のタンパク質との相互作用を阻害又は低減する、本開示の抗C1q抗体などの抗体である。いくつかの実施形態において、ブロッキング抗体、アンタゴニスト抗体、阻害抗体又は「中和」抗体は、1つ以上の生物学的活性又は抗原の相互作用を実質的に又は完全に阻害する。
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異Fc領域)に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプとともに変動する。
本明細書において、用語「Fc領域」は、天然配列Fc領域と変異Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変動する可能性があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基又はPro230からそのカルボキシル末端までの一続きの長さと規定される。Fc領域のC末端リジン(EU番号付与システムによる残基447)は、例えば、抗体の製造若しくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換えにより操作することによって除去することができる。したがって、インタクト抗体の組成は、全てのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団、及びK447残基をもつ抗体及びもたない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。本発明の抗体で使用するために適切な天然配列のFc領域としては、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4が含まれる。
「天然配列のFc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトFc領域には、天然配列のヒトIgG1 Fc領域(非A及びAアロタイプ)、天然配列のヒトIgG2 Fc領域、天然配列のヒトIgG3 Fc領域、及び天然配列のヒトIgG4 Fc領域並びに天然に存在するそれらの変異体が含まれる。
「変異Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾によって、天然配列のFc領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、変異Fc領域は、1つ以上のアミノ酸置換において異なる。いくつかの実施形態において、変異Fc領域は、天然配列のFc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のFc領域又は親ポリペプチドのFc領域において、約1個〜約10個のアミノ酸置換、及びいくつかの実施形態において約1個〜約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書において、変異Fc領域は、いくつかの実施形態において、天然配列のFc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80％相同性を有し、いくつかの実施形態において、それと少なくとも約90％相同性、いくつかの実施形態において、それと少なくとも約95％相同性を有する。
「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域と結合する受容体を表す。いくつかの実施形態において、FcRは、天然配列のヒトFcRである。さらに、いくつかの実施形態において、FcRは、IgG抗体と結合するもの(ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含み、これには対立遺伝子変異体及びこれらの受容体の別のスプライス型を含む。FcγRII受容体はFcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害性受容体」)を含み、それらは同様のアミノ酸配列を有し、主としてその細胞質ドメインにおいて相違する。活性化受容体FcγRIIAは、イムノレセプターチロシン系活性化モチーフ(「ITAM」)をその細胞質ドメインに含む。阻害性受容体FcγRIIBは、イムノレセプターチロシン系阻害モチーフ(「ITIM」)をその細胞質ドメインに含む。(例えば、M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)を参照されたい)。FcRは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)、Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994)及びde Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説されている。他のFcRは、将来同定されるものを含み、本明細書において用語「FcR」に包含される。また、FcRは、抗体の血清半減期を増加させ得る。
FcRnとのインビボでの結合及びヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株で、又は変異Fc領域を有するポリペプチドを投与した霊長類でアッセイすることができる。WO2004/42072(Presta)は、FcRとの結合が改善された又は低下した抗体変異体を記載している。例えば、Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照されたい。
用語「kon」は、本明細書で使用するとき、抗原への抗体の結合に関する速度定数を指すことが意図される。
用語「koff」は、本明細書で使用するとき、抗体/抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指すことが意図される。
用語「KD」は、本明細書で使用するとき、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
本明細書で使用するとき、ペプチド、ポリペプチド又は抗体の配列に関して「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列をアラインさせ、必要な場合にギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮しないで、該特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内である多様な方法、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMEGALIGN(商標)(DNASTAR)ソフトウェアを用いて達成できる。当業者は、アラインメントを測定するために適切なパラメータを決定することができ、それには、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な、当該技術分野で公知の任意のアルゴリズムが含まれる。
「単離された」分子又は細胞は、それが生成された環境において元来関連付けられる少なくとも1つの夾雑分子又は細胞から同定及び分離される分子又は細胞である。いくつかの実施形態において、単離された分子又は細胞は、生成環境に関連する全ての成分が付随していない。単離された分子又は細胞は、それが天然に見出される形態又は設定以外の形態にある。したがって、単離された分子は、細胞中に天然に存在する分子とは区別され、単離された細胞は、組織、器官又は個体において天然に存在する細胞と区別される。いくつかの実施形態において、単離された分子は、本開示の抗C1q抗体である。他の実施形態において、単離された細胞は、本発明の抗C1q抗体を産生する宿主細胞又はハイブリドーマ細胞である。
本開示の抗C1q抗体などの抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定されている核酸分子であって、該核酸分子が生成された環境で通常付随する少なくとも1つの夾雑核酸分子から分離されている核酸分子である。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、生成環境に関連する全ての成分が付随していない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然で見出される形態又は設定以外の形態にある。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸と区別される。
用語「ベクター」は、本明細書で使用するとき、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なDNAセグメントを連結させ得る環状の二本鎖DNAを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、この場合、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結させることができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞内に導入されたときに宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用することができる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書で互換的に使用するとき、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド若しくは塩基、及び/又はそれらの類似体、あるいはDNA若しくはRNAポリメラーゼによって又は合成反応によってポリマーに取り込ませることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾(単数又は複数)を含むことができる。他の修飾の種類には、例えば、「キャッピング」、天然に存在するヌクレオチドのうちの1つ以上を類似体に置換すること、例えば、非荷電結合(例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)を有するもの及び荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するものなどのヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ(ply)-L-リジンなど)などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有するもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するもの(例えば、アルファアノマー核酸など)、並びにポリヌクレオチド(単数又は複数)の非修飾形態が含まれる。さらに、糖の中に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換える、標準的な保護基によって保護する、若しくはさらなるヌクレオチドとのさらなる連結を調製するために活性化することができる、又は固体若しくは半固体の支持体にコンジュゲートさせることができる。5'及び3'末端のOHは、リン酸化するか、又はアミン若しくは1〜20個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを標準的な保護基へと誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、又は2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、アラビノース、キシロース、又はリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当該技術分野において一般に知られているリボース又はデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。1つ以上のリン酸ジエステル結合を代替の連結基によって置き換えることができる。これらの代替の連結基には、限定されないが、リン酸が、P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR'、CO、又はCH2(「ホルムアセタール」)によって置き換えられている実施形態が含まれ、ここで、各々のR又はR'は、独立して、H、又はエーテル(-O-)結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、若しくはアラルジルを場合によって含有する置換若しくは非置換アルキル(1〜20個のC)である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。前述の説明は、RNA及びDNAを含む、本明細書で言及された全てのポリヌクレオチドに適用される。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートの組み込み用のベクター(単数又は複数)のレシピエントとすることができる又はそれであった個々の細胞若しくは細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異のために、もとの親細胞と必ずしも完全に同一(形態構造において又はゲノムDNA相補体において)でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド(単数又は複数)をインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
「担体」は、本明細書で使用するとき、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含み、採用される用量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動物に対して毒性を示さない。多くの場合、生理学的に許容される担体はpH緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例には、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン、単糖類、二糖類及び他の糖質、例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン、キレート剤、例えば、EDTA、糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICS(商標)が含まれる。
用語「約」は、本明細書で使用するとき、本技術分野における当業者に容易に知られる各値に関する通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の付いたある値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む(及び記載する)。
本明細書で使用するとき、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が明確にその他を指示しない限り、複数への言及を含む。例えば、「抗体」への言及は、モル量などの1つから多数の抗体への言及であり、当業者に知られているその同等物を含む、などが挙げられる。
本明細書に記載されている本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
概観
本開示は、抗C1q抗体及びその使用を提供する。本開示の抗C1q抗体は、本開示のC1qタンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qを中和する抗体である。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、C1複合体に結合することができる。
特定の態様において、本開示は、マウスハイブリドーマC1q-M1 7788-1(M) 051613と称され、ATCC受託番号PTA-120399で、2013年6月6日にATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、マウスモノクローナル抗体M1を提供する。
特定の態様において、本開示は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む抗C1q抗体であって、軽鎖可変ドメインが、抗体M1の軽鎖可変ドメイン配列を含み、及び/又は重鎖が、抗体M1の重鎖可変ドメイン配列を含む抗体を提供する。
特定の態様において、本開示は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む抗C1q抗体であって、軽鎖可変ドメインが、ATCC受託番号PTA-120399でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含み、かつ/又は重鎖可変ドメインが、受託番号PTA-120399でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む抗体を提供する。
特定の態様において、本開示は、抗C1q抗体を提供し、これは、本質的に、(1)2013年6月6日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生される抗体M1、(2)抗体M1の抗原結合断片、又は(3)抗体M1のHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む抗体、と同じC1qエピトープに本質的に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、C1qの生物学的活性を中和する。抗C1q抗体の使用は、限定されないが、例えば、補体因子1(CF1)依存性の病理学的シナプス喪失に関連する神経変性障害を有する個体における補体因子C1qの検出を含む。さらなる非限定的な使用としては、例えば、古典的補体経路がNMO特異的自己抗体などの自己抗体によって活性化される場合において、補体活性化の古典的経路の阻害が挙げられる。抗C1q抗体に関するさらなる非限定的な使用としては、C1qなどの補体因子の発現上昇に関連する、又は補体経路の活性化に関連する障害の診断及び治療を含む。このような障害には、限定されないが、自己免疫障害、炎症性障害、及びシナプス喪失と関連する神経変性障害を含む神経変性障害を含むことができる。
別の態様において、本開示は、本開示の抗体をコードする単離された核酸分子を提供する。
本開示はまた、本開示の抗体をコードする核酸分子を含む単離された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、中和モノクローナルマウス抗体M1を産生する、単離された宿主細胞株が提供される。この単離された宿主細胞株は、ATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-120399を有する。
さらに、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本開示のC1q中和抗体などの抗C1q抗体を含む医薬組成物が提供される。本開示はまた、本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用するための抗C1q抗体を含むキットを提供する。
本開示は、そのような治療を必要とする個体において神経変性疾患又は自己免疫疾患を治療又は予防するために、神経変性疾患又は自己免疫疾患を有する個体におけるシナプスを検出するために、及び生物学的試料におけるシナプスを検出するために、本開示のC1q抗体(例えば、本開示のC1q中和抗体)を用いる方法をさらに提供する。また、本開示は、本開示のC1q抗体(例えば、本開示のC1q中和抗体)を含むキットを提供する。
補体タンパク質
本開示の抗体は、補体因子C1q及び/又は古典的補体活性化経路のC1複合体中のC1qを特異的に認識する。認識される補体因子は、限定されないが、補体系を有する任意の生物に由来してもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラクダ、ヒツジ、ヤギ又はブタなどの任意の哺乳類生物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「C1複合体」は、限定されないが、1つのC1qタンパク質、2つのC1rタンパク質及び2つのC1sタンパク質(例えば、C1qr2s2)を含むことができるタンパク質複合体を指す。
本明細書で使用するとき、「補体因子C1q」は、野生型配列と天然に存在する変異配列の両方を指す。
本発明の抗体によって認識される補体因子C1qの非限定的な例は、3つのポリペプチド鎖A、B及びCを含むヒトC1qである。
C1q、鎖A(ホモサピエンス)、アクセッション番号タンパク質データベース:NP_057075.1、GenBank番号:NM_015991:
>gi|7705753|ref|NP_057075.1|補体C1qサブコンポーネントサブユニットA前駆体[ホモサピエンス]
MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIRTGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAIRRNPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSRGQVRRSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGSEADSVFSGFLIFPSA (配列番号1)
C1q、鎖B(ホモサピエンス)、アクセッション番号タンパク質データベース:NP_000482.3、GenBank番号:NM_000491.3:
>gi|87298828|ref|NP_000482.3|補体C1qサブコンポーネントサブユニットB前駆体[ホモサピエンス]
MMMKIPWGSIPVLMLLLLLGLIDISQAQLSCTGPPAIPGIPGIPGTPGPDGQPGTPGIKGEKGLPGLAGDHGEFGEKGDPGIPGNPGKVGPKGPMGPKGGPGAPGAPGPKGESGDYKATQKIAFSATRTINVPLRRDQTIRFDHVITNMNNNYEPRSGKFTCKVPGLYYFTYHASSRGNLCVNLMRGRERAQKVVTFCDYAYNTFQVTTGGMVLKLEQGENVFLQATDKNSLLGMEGANSIFSGFLLFPDMEA (配列番号2)
C1q、鎖C(ホモサピエンス)、アクセッション番号タンパク質データベース:NP_001107573.1、GenBank番号:NM_001114101.1:
>gi|166235903|ref|NP_001107573.1|補体C1qサブコンポーネントサブユニットC前駆体[ホモサピエンス]
MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLPLRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGEPGIPAIPGIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQSVFTVTRQTHQPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGFLLFPD (配列番号3)
したがって、本開示の抗C1q抗体は、C1qタンパク質のポリペプチド鎖A、ポリペプチド鎖B及び/又はポリペプチド鎖Cに結合することができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、ヒトC1qのポリペプチド鎖A、ポリペプチド鎖B及び/若しくはポリペプチド鎖C、又はマウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラクダ、ヒツジ、ヤギ又はブタのC1qなどのそのホモログに結合する。
抗C1q抗体
本開示の抗体は、補体因子C1q及び/又は古典的補体経路のC1複合体中のC1qに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体はヒトC1qに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体はヒト及びマウスのC1qに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体はラットC1qに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ヒトC1q、マウスC1q及びラットC1qに特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、補体因子C1qの生物学的活性を中和する。いくつかの実施形態において、抗体は、補体因子C1qとC1r若しくはC1sなどの他の補体因子との間、又はC1qと自己抗体などの抗体との間の相互作用を阻害する。本明細書に開示されるように、本開示の自己抗体には、限定されないが、宿主抗原を認識し、補体活性化の古典的経路を活性化する抗体が含まれる。この活性化プロセスの第1のステップにおいて、補体因子C1qは、自己抗体-自己抗原の免疫複合体に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、補体因子C1qと非補体因子の間の相互作用を阻害する。非補体因子は、ホスファチジルセリン、ペントラキシン-3、C反応性タンパク質(CRP)、球状C1q受容体(gC1qR)、補体受容体1(CR1)、β-アミロイド及びカルレティキュリンを含むことができる。いくつかの実施形態において、抗体は、古典的補体活性化経路を阻害する。特定の実施形態において、抗体は代替経路をさらに阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害(CDC)を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、補体依存性の細胞媒介性細胞傷害(CDCC)を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、B細胞の抗体産生、樹状細胞成熟、T細胞増殖、サイトカイン産生又はミクログリア活性化を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体はアルサス反応を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、シナプス又は神経終末の食作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化を阻害する。
本発明の抗体の機能的特性、例えば、抗原に対する解離定数、タンパク質-タンパク質相互作用(例えば、C1q-自己抗体の相互作用)の阻害、自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害(CDC)の阻害、補体依存性の細胞媒介性細胞傷害(CDCC)の阻害又は病変形成は、限定されないが、インビトロ、エクスビボ又はインビボ実験で測定され得る。
C1qに対する抗C1q抗体の解離定数(KD)は、100nM未満、90nM未満、80nM未満、70nM未満、60nM未満、50nM未満、40nM未満、30nM未満、20nM未満、10nM未満、9nM未満、8nM未満、7nM未満、6nM未満、5nM未満、4nM未満、3nM未満、2nM未満、1nM未満、0.5nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.01nM未満又は0.005nM未満であってもよい。いくつかの実施形態において、解離定数は、約30nM未満〜約100pM未満の範囲である。いくつかの実施形態において、解離定数は約30nM未満である。いくつかの実施形態において、解離定数は約20nM未満である。いくつかの実施形態において、解離定数は約10nM未満である。いくつかの実施形態において、解離定数は約5nM未満である。いくつかの実施形態において、解離定数は約1nM未満である。いくつかの実施形態において、解離定数は約100pM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約30nM未満〜約100pM未満の範囲であり、マウスC1qについては約30nM未満〜約100pM未満の範囲である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約30nM未満、マウスC1qについては約30nM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約20nM未満、マウスC1qについては約20nM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約10nM未満、マウスC1qについては約10nM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約5nM未満、マウスC1qについては約5nM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては約1nM未満、マウスC1qについては約1nM未満である。特定の実施形態において、抗C1q抗体の解離定数は、ヒトC1qについては100pM未満、マウスC1qについては100pM未満である。C1qの以外の抗原に対する抗体の解離定数は、C1qに対する解離定数より少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1,000倍、少なくとも10,000倍又は少なくとも100,0
00倍高くてもよい。例えば、本開示のC1q抗体の解離定数は、C1qに対するよりもC1sに対して少なくとも1,000倍高くてもよい。解離定数は、任意の生化学的又は生物物理学的技術、例えば、ELISA、表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤー干渉法(例えば、ForteBioによるオクテットシステムを参照されたい)、等温滴定熱量測定(ITC)、示差走査熱量測定(DSC)、円偏光二色性(CD)、ストップフロー分析、及び比色又は蛍光タンパク質融解分析を含む任意の分析技術を介して決定され得る。C1qに対する抗C1q抗体の解離定数(KD)は、例えば、全長抗体又はFab断片などの抗体断片を用いて決定されてもよい。
C1qへの抗体の結合親和性を決定する1つの例示的な方法は、抗体の一機能性Fab断片の結合親和性を測定することによる。一機能性Fab断片を得るために、抗体(例えば、IgG)をパパインで切断する又は組換え的に発現させることができる。抗体のFab断片の親和性は、HBS-EP泳動緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005％v/vサーファクタントP20)を用いた、予め固定化されたストレプトアビジンセンサーチップ(SA)を備えた表面プラズモン共鳴(Biacore 3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム、Biacore(商標)、INC、Piscataway NJ)によって決定することができる。ビオチン化されたヒトC1q(又は任意の他のC1q)は、HBS-EP緩衝液中で0.5μg/mL未満の濃度に希釈され、可変の接触時間を用いて個々のチップチャネルにわたって注入され、抗原密度の2つの範囲、詳細な動態研究については50〜200応答単位(RU)又はスクリーニングアッセイについては800〜1,000RUを達成することができる。再生研究は、200回を超える注入に対してチップ上のC1qの活性を維持しながら、25％v/vエタノール中の25mM NaOHが結合したFabを効果的に除去することを示した。典型的には、精製されたFab試料の連続希釈物(0.1〜10倍のスパニング濃度、推定KD)を1分間、100μL/分で注入し、最大2時間の解離時間を容認する。Fabタンパク質の濃度は、標準として既知の濃度のFab(アミノ酸分析によって決定される)を用いて、ELISA及び/又はSDS-PAGE電気泳動によって決定される。動力学的結合速度(kon)及び解離速度(koff)は、BIA評価プログラムを用いて、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)に全体的にデータを当てはめることによって同時に得られる。平衡解離定数(KD)値はkoff/konとして計算される。このプロトコールは、ヒトC1q、別の哺乳動物のC1q(例えば、マウスC1q、ラットC1q、霊長類C1q)、並びに異なる形態のC1qを含む任意のC1qへの抗体の結合親和性を決定する際の使用に適している。抗体の結合親和性は、一般に、25℃で測定されるが、37℃で測定することもできる。
本開示の抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラクダ、ヒツジ、ヤギ、又はブタなどの任意の哺乳類生物を含む、補体系を有する任意の生物由来のC1q抗原に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ヒトC1q上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ヒト及びマウスの両方のC1q上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ヒト、マウス及びラットのC1q上のエピトープに特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書では、本開示の別の抗体によって結合されたC1qエピトープと同じである又は重複するC1qのエピトープに結合する抗C1q抗体が提供される。特定の実施形態において、本明細書では、抗C1q抗体M1によって結合されたC1qエピトープと同じである又は重複するC1qのエピトープに結合する抗C1q抗体が提供される。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qへの結合に関して、本開示の別の抗体と競合する。特定の実施形態において、抗C1q抗体は、C1qへの結合に関して、抗C1q抗体M1又はその抗原結合断片と競合する。
抗C1q抗体のどのC1qエピトープが結合するかを決定し、又は2つの抗体が同じ若しくは重複するエピトープに結合するかどうかを決定するために使用され得る方法としては、限定されないが、X線結晶学、NMR分光法、アラニンスキャニング突然変異誘発、重複するC1q配列を有するC1q由来のペプチドを含むペプチドライブラリーのスクリーニング、及び競合アッセイが挙げられ得る。競合アッセイは、2つの抗体が同一若しくは立体的に重複するエピトープを認識することによって同じエピトープに結合するかどうか、又は1つの抗体が抗原への別の抗体の結合を競合的に阻害するかどうかを決定するのに特に有用である。これらのアッセイは、当該技術分野において公知である。典型的には、抗原又は抗原を発現する細胞をマルチウェルプレートに固定し、標識抗体の結合をブロックする非標識抗体の能力を測定する。このような競合アッセイのための一般的な標識は、放射性標識又は酵素標識である。
本明細書において包含される競合抗体は、C1qへの本開示の任意の抗C1q抗体(例えば、M1又はM1の抗原結合断片)の結合を、1μM以下で少なくとも50％、60％、70％、80％、90％及び95％阻害する(すなわち、対照と比較して妨げる若しくは干渉する)又は減少させる抗体である。例えば、競合アッセイにおいて抗体と競合する濃度は、抗体M1又はM1の抗原結合断片のKD以下であり得る。結合メンバー間の競合は、例えば、ELISAを用いて、及び/又は溶液中でC1qとの抗体の相互作用をモニターすることによって、インビトロで容易にアッセイされ得る。分析を行うための正確な手段は重要ではない。C1qを96ウェルプレートに固定してもよく、又は均一な溶液中に入れてもよい。特定の実施形態において、標識された抗C1q抗体、例えばM1の結合をブロックする非標識の候補抗体(単数又は複数)の能力は、放射性、酵素又は他の標識を用いて測定することができる。逆アッセイでは、C1qとの標識された抗C1q抗体の相互作用を干渉する非標識の抗体の能力が決定され、ここで、前記標識された抗C1q抗体、例えば、M1、及びC1qは、すでに結合されている。読み出しは、結合した標識の測定を介する。C1q及び候補抗体(単数又は複数)は、任意の順序で又は同時に添加されてもよい。
いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qと自己抗体の間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ATCC受託番号PTA-120399で、2013年6月6日にATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるマウス抗ヒトC1qモノクローナル抗体M1である。
いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、M1と本質的に同じC1qエピトープに結合する単離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ATCC受託番号PTA-120399で2013年6月6日にATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株又はその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1の軽鎖可変ドメインのHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含む単離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ATCC受託番号PTA-120399で2013年6月6日にATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株又はその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1の重鎖可変ドメインのHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む単離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、ATCC受託番号PTA-120399で2013年6月6日にATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞株又はその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1の軽鎖可変ドメインのHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3、並びに重鎖可変ドメインのHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3含む単離された抗体である。
いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qタンパク質に結合し、(a)配列番号1のアミノ酸残基196-226(配列番号16)又は配列番号1のアミノ酸残基196-226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(配列番号16)に対応するC1qタンパク質鎖A(C1qA)のアミノ酸残基、(b)配列番号1のアミノ酸残基196-221(配列番号17)又は配列番号1のアミノ酸残基196-221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号17)に対応するC1qAのアミノ酸残基、(c)配列番号1のアミノ酸残基202-221(配列番号18)又は配列番号1のアミノ酸残基202-221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号18)に対応するC1qAのアミノ酸残基、(d)配列番号1のアミノ酸残基202-219(配列番号19)又は配列番号1のアミノ酸残基202-219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(配列番号19)に対応するC1qAのアミノ酸残基、並びに(e)配列番号1のアミノ酸残基Lys219及び/若しくはSer202又は配列番号1のLys219及び/若しくはSer202に対応するC1qAのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する。
いくつかの実施形態において、抗体は、(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qタンパク質鎖C(C1qC)のアミノ酸残基、(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基、から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸にさらに結合する。
特定の実施形態において、抗C1q抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219とSer202又は配列番号1に示されるLys219とSer202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3に示されるTyr225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。特定の実施形態において、抗C1q抗体は、配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219又は配列番号1に示されるLys219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Ser185又は配列番号3に示されるSer185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する。
いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qタンパク質に結合し、(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基、から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、C1qとC1sの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qとC1sの間及びC1qとC1rの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qと自己抗体などの別の抗体の間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、2.5:1、2.0:1、1.5:1、又は1.0:1未満の化学量論で、それぞれの相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、C1q抗体は、C1q及び抗C1q抗体のほぼ等モル濃度で、C1q-C1s相互作用などの相互作用を阻害する。他の実施形態において、抗C1q抗体は、20:1未満、19.5:1未満、19:1未満、18.5:1未満、18:1未満、17.5:1未満、17:1未満、16.5:1未満、16:1未満、15.5:1未満、15:1未満、14.5:1未満、14:1未満、13.5:1未満、13:1未満、12.5:1未満、12:1未満、11.5:1未満、11:1未満、10.5:1未満、10:1未満、9.5:1未満、9:1未満、8.5:1未満、8:1未満、7.5:1未満、7:1未満、6.5:1未満、6:1未満、5.5:1未満、5:1未満、4.5:1未満、4:1未満、3.5:1未満、3:1未満、2.5:1未満、2.0:1未満、1.5:1未満、又は1.0:1未満の化学量論で、C1qに結合する。特定の実施形態において、抗C1q抗体は、20:1〜1.0:1又は1.0:1未満の範囲にある結合化学量論でC1qに結合する。特定の実施形態において、抗C1q抗体は、6:1〜1.0:1又は1.0:1未満の範囲にある結合化学量論でC1qに結合する。特定の実施形態において、抗C1q抗体は、2.5:1〜1.0:1又は1.0:1未満の範囲にある結合化学量論でC1qに結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間、又はC1qとC1sの間、又はC1qと、C1r及びC1sの両方の間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間、C1qとC1sの間、及び/又はC1qと、C1r及びC1sの両方の間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1q A鎖に結合する。他の実施形態において、抗C1q抗体は、C1q B鎖に結合する。他の実施形態において、抗C1q抗体は、C1q C鎖に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1q A鎖、C1q B鎖及び/又はC1q C鎖に結合する。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、C1q A鎖、B鎖及び/又はC鎖の球状ドメインに結合する。他の実施形態において、抗C1q抗体は、C1q A鎖、C1q B鎖及び/又はC1q C鎖のコラーゲン様ドメインに結合する。
本開示の抗体がC1qとC1sの相互作用、又はC1qとC1rの間の相互作用などの2つ以上の補体因子間の相互作用を阻害する場合、抗体の存在下で生じる相互作用は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％又は少なくとも99％減少し得る。特定の実施形態において、抗体の存在下で生じる相互作用は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけ減少する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％若しくは少なくとも99％、又は少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけC4切断を阻害する。C4切断を測定する方法は当該技術分野において周知である。各C4切断に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、C1qと各抗C1q抗体のほぼ等モル濃度でC4切断を阻害する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％若しくは少なくとも99％、又は少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけ自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害(CDC)を阻害する。自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害の阻害に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％若しくは少なくとも99％、又は少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけ補体依存性の細胞媒介性細胞傷害(CDCC)を阻害する。CDCCを測定する方法は、当該技術分野において周知である。CDCC阻害に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、CDCCを阻害するが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を阻害しない。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照又は補体因子若しくは自己抗体などの別の抗体に結合しない対照抗体が使用される対照と比較して、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％若しくは少なくとも99％、又は少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけ、C1F溶血(CH50溶血とも呼ばれる)を阻害する(例えば、実施例3を参照されたい)。C1F溶血を測定する方法は、当該技術分野において周知である(例えば、実施例3を参照されたい)。C1F溶血に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、200ng/ml未満、100ng/ml未満、50ng/ml未満又は20ng/ml未満の用量で少なくとも50％のC1F溶血を中和する。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、C1q及び抗C1q抗体のほぼ等モル濃度でC1F溶血を中和する。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、ヒトC1F溶血アッセイにおいて溶血を中和する。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、ヒト、マウス及びラットのC1F溶血アッセイにおいて溶血を中和する(例えば、実施例3を参照されたい)。
いくつかの実施形態において、代替経路は、C1q結合及びその後のC1sの活性化によって開始されるCDCを増幅してもよい。これらの実施形態の少なくともいくつかにおいて、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％若しくは少なくとも99％、又は少なくとも30％〜少なくとも99％の範囲にある量だけ代替経路を阻害する。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、シナプス喪失の細胞インビトロモデル又はインビボモデル、例えば、インビボのマウスモデルにおけるシナプス喪失を防ぐ。インビボのマウスモデルは、アルツハイマー病のマウスアミロイド前駆体タンパク質(APP)のトランスジェニックモデルであるTg2576、ハンチントン病のトランスジェニックモデルであるR6/2 NT-CAG150、又は脊髄性筋萎縮症のマウスモデルであるSMAΔ7、又は緑内障の遺伝的マウスモデルであるDBA/2Jを含むことができる。一般に、シナプス喪失を表示する任意の神経変性疾患モデルを使用することができる。
インビトロ又はインビボでのシナプス喪失を測定する方法は、当該技術分野において周知である。インビトロの病変形成は、本開示の抗体が存在しない対照実験と比較して、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％、又は少なくとも30％〜少なくとも95％の範囲にある量だけ低減させることができる。インビトロでの病変形成の防止に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であってもよい。インビボでのシナプス喪失は、本開示の抗体が存在しない対照実験と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも35％、少なくとも40％若しくは少なくとも50％、又は少なくとも5％〜少なくとも50％の範囲にある量だけ低減させてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、NMOのエクスビボでの脊髄スライスモデル又はNMOのインビボでのマウスモデルにおいて病変形成を防ぐ。エクスビボ又はインビボでの病変形成を測定する方法は、当該技術分野において周知である。エクスビボでの病変形成は、少なくとも0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5又は4.0の相対スコアだけ低減することができる。エクスビボでの病変形成の防止に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml未満、2.5μg/ml未満、2.0μg/ml未満、1.5μg/ml未満、1.0μg/ml未満、0.5μg/ml未満、0.25μg/ml未満、0.1μg/ml未満、又は0.05μg/ml未満であってもよい。インビボでの病変形成は、染色の喪失(面積の％)との関係で、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも35％、少なくとも40％若しくは少なくとも50％、又は少なくとも5％〜少なくとも50％の範囲の量だけ低減させることができる。染色は、限定されないが、APQ4染色、GFAP染色又はMBP染色によって評価することができる。
本開示は、抗C1q抗体を提供する。本開示の抗体は、以下の特徴の1つ以上を有することができる。本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体断片、二重特異性及び多特異性抗体、多価抗体又はヘテロコンジュゲート抗体であってもよい。本開示の抗体断片は、本開示の抗C1q抗体のいずれかと同じエピトープに結合する機能的断片であってもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体断片は、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する。いくつかの実施形態において、抗体断片は、対応する全長抗体と同じエピトープを有するが、非常に小さな分子量を有する、本開示の抗C1q抗体又は抗体断片の小型化バージョンである。このような小型化された抗C1q抗体断片は、画像的及び診断的用途に有利である、より良好な脳浸透能及びより短い半減期を有してもよい(例えば、Lutje S et al., Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2):335-41、Tavare R et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jan 21; 111(3): 1108-13、及びWiehr S et al., Prostate. 2014 May、74(7): 743-55を参照されたい)。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の抗C1qの抗体断片は、それらの対応する全長抗体と比較してより良好な脳透過性を有し、及び/又はそれらの対応する全長抗体と比較してより短い半減期を有する。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、第1の抗原はC1q抗原である。いくつかの実施形態において、第2の抗原は、血液脳関門を横断する輸送を促進する抗原であり、限定されないが、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、angiopepペプチド並びにANG1005が挙げられる。本開示の抗体は、操作されたエフェクター機能、アミノ酸配列の修飾又は当該技術分野で公知の他の抗体の修飾をさらに含んでもよく、例えば、本明細書に記載されている抗C1q抗体の定常領域は、補体活性化を損なうように修飾されてもよい。
追加の抗C1q抗体、例えば、本開示のC1qタンパク質に特異的に結合する抗体は、当該技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、スクリーニングされ、かつ/又はそれらの物理的/化学的特性及び/若しくは生物学的活性について特性決定されてもよい。
抗体調製
本開示の抗C1q抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab'-SH、Fv、scFv及びF(ab')2断片)、二重特異性及び多特異性抗体、多価抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ライブラリー由来の抗体、改変されたエフェクター機能を有する抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、並びに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体及び共有結合的に修飾された抗体を含む、本開示のC1qタンパク質のアミノ酸残基を有するエピトープなどの抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾立体配置を包含することができる。抗C1q抗体は、ヒト、マウス、ラット又は任意の他の起源(キメラ若しくはヒト化抗体を含む)であってもよい。
(1)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗C1q抗体などのポリクローナル抗体は、一般に、関連する抗原及びアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射によって動物において生起させる。関連する抗原(例えば、本開示の精製された又は組換えC1qタンパク質)を、免疫されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリン又は大豆トリプシン阻害剤に、二機能性又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション)、N-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はR1N=C=NR、式中、R及びR1は独立して低級アルキル基である、を用いてコンジュゲートすることは有用であり得る。採用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート)が挙げられる。免疫化プロトコールは、過度の実験を行うことなしに当業者によって選択され得る。
動物は、例えば、100μg(ウサギ用)若しくは5μg(マウス用)のタンパク質又はコンジュゲートを3容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、該溶液を複数部位で皮内に注射することによって、所望の抗原、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化される。1カ月後、動物は、複数部位での皮下注射によってフロイント完全アジュバント中の初期量の1/5〜1/10のペプチド又はコンジュゲートで追加免疫される。7〜14日後、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。また、コンジュゲートはタンパク融合として組換え細胞培養で作製することができる。さらに、ミョウバンなどの凝集剤は、免疫応答を増強するのに適している。
(2)モノクローナル抗体
モノクローナル抗C1q抗体などのモノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に生じる可能性がある突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、個別の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えば、モノクローナル抗C1q抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)によって記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法において、マウス又はハムスターなどの他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質(例えば、本開示の精製又は組換えC1qタンパク質)に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発するために、上述されたように免疫化される。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次に、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986))。
免疫剤は、典型的には、抗原タンパク質(例えば、本開示の精製若しくは組換えC1qタンパク質)又はその融合変異体を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、一方、非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾臓又はリンパ節細胞が使用される。次に、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合される。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103。
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ又はヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞株が採用される。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を播種し、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する1以上の物質を含有することができる適切な培養培地中で増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠損する場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRTを欠損した細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン(HAT培地)を含む。
いくつかの実施形態において、不死化された骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、HAT培地などの培地に対して感受性であるものである。これらの中には、マウス骨髄腫株があり、例えば、MOPC-21及びMPC-11マウス腫瘍由来のもの(Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、California USAから入手可能である)、並びにSP-2細胞及びその誘導株(例えば、X63-Ag8-653)(American Type Culture Collection、Manassas、Virginia USAから入手可能である)が挙げられる。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、抗原(例えば、本開示のC1qタンパク質)に対して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって決定される。
バイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、所望の抗原(例えば、本開示のC1qタンパク質)に対して指向されるモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合アッセイ(ELISA)によって決定され得る。このような技術及びアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、結合親和性は、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって決定されてもよい。
所望の特異性、親和性及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding、上述)。この目的に対して適切な培養培地としては、例えば、D-MEM又はRPMI-1640培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインA-セファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー、及び上記した他の方法などの慣用の免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水又は血清から適切に分離される。
また、抗C1qモノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に開示されたもの及び上述したものなどの組換えDNA法によって作製されてもよい。モノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用的な手法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNAの供給源として役立つ。単離されると、DNAを発現ベクターに入れることができ、次に、これを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、このような組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成する。抗体をコードするDNAの細菌における組換え発現に関する概説文献には、Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Rev. 130:151-188 (1992)が挙げられる。
特定の実施形態において、抗C1q抗体は、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技術を用いて産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、それぞれ、ファージライブラリーからのマウス及びヒト抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性(ナノモル(「nM」)範囲)のヒト抗体の産生(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染及びインビボ組換え(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993))を記載している。このようにして、これらの技術は、所望の特異性のモノクローナル抗体(例えば、本開示のC1qタンパク質に結合する抗体)の単離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な代替法である。
また、抗体又はそれらの断片をコードするDNAは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号、Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることにより改変することができる。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインを置換し、又は抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインを置換し、抗原に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
本明細書に記載されているモノクローナル抗体(例えば、本開示の抗C1q抗体又はそれらの断片)は、一価であり得、その調製は当該技術分野で周知である。例えば、1つの方法としては、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現が含まれる。重鎖の架橋を防止するように、重鎖は、一般的に、Fc領域内の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換してもよく、又は架橋を防止するために欠失させる。インビトロ法もまた一価抗体を調製するのに適している。抗体の断片、特にFab断片を生じさせるための抗体の消化は、当該技術分野において公知の通常の技術を用いて達成され得る。
また、キメラ又はハイブリッド抗C1q抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。この目的に対して適切な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデートが挙げられる。
(3)ヒト化抗体
本開示の抗C1q抗体又はそれらの抗体断片は、ヒト化又はヒト抗体をさらに含み得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片(例えば、抗体のFab、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab')2又は他の抗原結合部分配列)である。ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種CDR(ドナー抗体)からの残基によって、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基が置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたCDR、フレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものも含む。Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)及びPresta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)。いくつかの実施形態において、抗C1q抗体は、本明細書に記載されている抗C1q抗体(例えば、抗体M1及び4A4B11)のいずれかの重鎖及び軽鎖の可変ドメインとヒト免疫グロブリンの定常領域を含むキメラ抗体である。
非ヒト抗C1q抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源の1つ以上のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には、Winter and co-workers, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)の方法に従って、又はヒト抗体の対応する配列をげっ歯類CDR又はCDR配列に置換することを介して実施することができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基及び場合によってはいくつかのFR残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」によれば、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯類のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受け入れる。Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)、Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる。Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)。
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するために、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を分析するプロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測される三次元立体構造を例証し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これら表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補免疫グログリンのその抗原への結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば、標的抗原(単数又は複数)(例えば、本開示のC1qタンパク質)に対する親和性が高まるといった所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接的及び最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗C1q抗体の種々の形態が企図される。例えば、ヒト化抗C1q抗体は、免疫コンジュゲートを生成させるために、場合により、1つ以上の細胞毒性剤とコンジュゲートされる、Fabなどの抗体断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗C1q抗体は、インタクトIgG1抗体などのインタクト抗体であり得る。
(4)ヒト抗体
あるいは、ヒト抗C1q抗体を生じさせ得る。例えば、ここで、内因性の免疫グロブリン産生がない場合、免疫化することでヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することができる。キメラ及び生殖系列変異型マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合欠失が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらす。このような生殖系列変異型マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)、Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)、Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)、米国特許第5,591,669号及びWO97/17852を参照されたい。
あるいは、免疫されていないドナーからの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗C1q抗体及び抗体断片を生成するためにファージディスプレイ技術を用いることができる。McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991)。この技術によれば、抗体Vドメイン遺伝子は、M13又はfdなどの繊維状バクテリオファージの主要（major）又はマイナー（minor）コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として展示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージはB細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、多様な形式で行うことができ、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)に概説される。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用することができる。Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)は、免疫したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫していないヒトのドナー由来のV遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原(自己抗原を含む)の多様なアレイに対する抗体は、本質的に、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)又はGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)によって記載されている技術に従って単離され得る。米国特許第5,565,332号及び第5,573,905号も参照されたい。さらに、酵母ディスプレイ技術は、インビトロでヒト抗C1q抗体及び抗体断片を生成するために使用され得る(例えば、WO2009/036379、WO2010/105256、WO2012/009568、US2009/0181855、US2010/0056386、及びFeldhaus and Siegel (2004) J. Immunological Methods 290:69-80)。他の実施形態において、リボソームディスプレイ技術は、インビトロでヒト抗C1q抗体及び抗体断片を生成するために使用され得る(例えば、Roberts and Szostak (1997) Proc Natl Acad Sci 94:12297-12302、Schaffitzel et al. (1999) J. Immunolical Methods 231:119-135、Lipovsek and Pluckthun (2004) J. Immunological Methods 290:51-67)。
Cole et al.及びBoerner et al.の技術はまた、ヒト抗C1qモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)及びBoerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991))。同様に、ヒト抗C1q抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより作製することができる。チャレンジ時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、並びに以下の科学刊行物:Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)、Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368: 812-13 (1994)、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)に記載されている。
最後に、ヒト抗C1q抗体はまた、活性化されたB細胞によってインビトロで生成され得る(米国特許第5,567,610号及び第5,229,275号を参照されたい)。
(5)抗体断片
特定の実施形態において、抗C1q抗体の全体よりも、抗C1q抗体断片を使用することに利点がある。より小さな断片サイズは、迅速なクリアランスを可能にする。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクト抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は、現在、例えば、本開示の抗C1q抗体をコードする核酸を用いて、組換え宿主細胞により直接産生することができる。Fab、Fv及びscFv抗体断片は全て、大腸菌に発現させ、そこから分泌させることができ、よって、多量のこれらの断片の直接的な産生を可能にする。また、抗C1q抗体断片は、上記で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、F(ab')2断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。インビボでの半減期が増加したFab及びF(ab')2抗体断片の生産は、米国特許第5,869,046号に記載されている。他の実施形態において、最適な抗体は一本鎖Fv断片(scFV)である。WO93/16185、米国特許第5,571,894号及び米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗C1q、抗C1r又は抗C1q抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているように、「線状抗体」であり得る。このような線状抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であってもよい。
(6)二重特異性及び多特異性抗体
二重特異性抗体(BsAb)は、少なくとも2つの異なるエピトープ（例えば同じ又は別のタンパク質(例えば、本開示の1つ以上のC1qタンパク質)上のものを含む）に対する結合特異性を有する抗体である。あるいは、BsAbの一部分は、標的C1q抗原に結合するアームを備えることができ、別のものは、第2のタンパク質に結合するアームと組み合わせることができる。このような抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab')2二重特異性抗体)に由来し得る。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、2つの鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリンの重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく。Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、1つだけが正しい二重特異性構造を有する10個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成する。通常、アフィニティークロマトグラフィーステップにより行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の手法は、WO93/08829及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合させる。融合体は、ヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含んでいるものであってもよい。いくつかの実施形態において、軽鎖結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)は、融合体の少なくとも1つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするDNA及び、所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトさせる。これは、構築に使用される3つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす実施形態において、3つのポリペプチド断片の相互の割合の調整に大きな融通性を与える。しかしながら、等比率の少なくとも2つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、又は該比率が特に重要でない場合には、1つの発現ベクターに、2つ又は3つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。
このアプローチのいくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、1つのアームに第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を与える)で構成される。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するため、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進することが見出された。このアプローチは、WO94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生するさらなる詳細については、例えば、Sureshら, Methods in Enzymology 121: 210 (1986)を参照されたい。
WO96/27011又は米国特許第5,731,168号に記載されている別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように操作することができる。界面は、抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含むことができる。この方法において、第1の抗体分子の界面からの1つ以上の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えば、チロシン又はトリプトファン)で置き換えられる。大きな側鎖(単数又は複数)と同一又は類似のサイズの代償的な「空洞(cavity)」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えば、アラニン又はスレオニン)で置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物と比較してヘテロ二量体の収量を増大させる機構を提供する。
抗体断片から二重特異性抗体を生成させるための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229: 81 (1985)は、F(ab')2断片を生成するためにインタクト抗体をタンパク質分解で切断する手法を記載する。これらの断片は、隣接ジチオールを安定化し、分子間のジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次に、生成されたFab'断片は、チオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換される。次いで、Fab'-TNB誘導体の1つは、二重特異性抗体を形成するためにFab'-TNB誘導体に再変換される。産生された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用薬剤として使用することができる。
Fab'断片は大腸菌から直接回収され、二重特異性抗体を形成させるために化学的に結合され得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)は、完全ヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の製造を記載する。各Fab'断片は、大腸菌から別個に分泌され、二重特異性抗体を形成するために、インビトロで指定性化学カップリングに供された。このようにして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体及び正常ヒトT細胞を過剰発現する細胞に結合し、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
また、組換え細胞培養から直接的に二価抗体断片を作製し、単離する様々な技術が記載されている。例えば、二価ヘテロ二量体は、ロイシンジッパーを用いて生成されている。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により2つの異なる抗体のFab'部分に連結された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元し、単量体を形成させ、次に、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記載されている「ダイアボディ」技術は、二重特異性/二価抗体断片を作製するための代替の機構を提供している。断片は、同じ鎖上の2つのドメイン間に対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより、軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。したがって、1つの断片のVH及びVLドメインは、別の断片の相補的なVL及びVHドメインと対形成するように強いられ、それによって、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(sFv)二量体の使用により二重特異性/二価抗体断片を作製する別の方策もまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
2を超える原子価を有する抗体もまた企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
例示的な二重特異性抗体は、2つの異なる抗原に結合することができる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、第1の抗原であるC1qに結合し、血液脳関門を横断する輸送を促進する第2の抗原に結合する。血液脳関門を横断する輸送を促進する多数の抗原が、当該技術分野において公知である(例えば、Gabathuler R., Approaches to transport therapeutic drugs across the blood-brain barrier to treat brain diseases, Neurobiol. Dis. 37 (2010) 48-57を参照されたい)。このような第2の抗原としては、限定されないが、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、例えば、CRM197(ジフテリア毒素の非毒性突然変異体)、ラマ単一ドメイン抗体、例えば、TMEM 30(A)(フリッパーゼ)、タンパク質導入ドメイン、例えば、TAT、Syn-B又はペネトラチン、ポリアルギニン又は全体として正に荷電したペプチド、及びAngiopepペプチド、例えば、ANG1005が挙げられる(例えば、Gabathuler, 2010を参照されたい)。
(7)多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも速く内在化(及び/又は異化)され得る。本開示の抗C1q抗体又はそれらの抗体断片は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる、3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のものである)(例えば、四価抗体)であり得る。多価抗体は、二量体化ドメインと3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態において、二量体化ドメインは、Fc領域又はヒンジ領域を含む。このシナリオにおいて、抗体は、Fc領域とアミノ末端でのFc領域に対する3つ以上の抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態において、本明細書における多価抗体は、3〜約8個、及びいくつかの実施形態において4個の抗原結合部位を含む。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(及びいくつかの実施形態において2つのポリペプチド鎖)を含み、ここで、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを含んでもよく、ここで、VD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。同様に、ポリペプチド鎖(単数又は複数)は、VH-CH1-フレキシブルリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を含み得る。本明細書における多価抗体は、少なくとも2つ(及びいくつかの実施形態において4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。本明細書における多価抗体は、例えば、約2個〜約8個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでよい。本明細書において企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、場合により、CLドメインをさらに含む。
(8)ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体はまた、本開示の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体(例えば、本開示の抗C1q抗体又はそれらの抗体断片)で構成される。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の1つは、アビジンに結合し、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞へと免疫系細胞を標的化することが提唱され、米国特許第4,676,980号、HIV感染を治療するために使用されている。国際公開第WO91/00360、WO92/200373及びEP0308936。抗体は、架橋剤を伴うものを含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製されてもよいことが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて又はチオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。この目的に対して適切な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、並びに例えば米国特許第4,676,980号で開示されているものが含まれる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術とともに米国特許第4,676,980号に開示されている。
(9)エフェクター機能操作
また、エフェクター機能を改変し、及び/又は抗体の血清半減期を増加させるために、本開示の抗C1q抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、定常領域上のFc受容体結合部位を修飾又は突然変異して、FcγRI、FcγRII及び/又はFcγRIIなどの特定のFc受容体に対する結合親和性を除去又は減少させてもよい。いくつかの実施形態において、エフェクター機能は、抗体のFc領域(例えば、IgGのCH2ドメインにおける)のN-グリコシル化を除去することにより損なわれる。いくつかの実施形態において、エフェクター機能は、PCT WO99/58572及びArmour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003)、Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000)に記載されているように、ヒトIgGの233-236、297及び/又は327-331などの領域を修飾することによって損なわれる。
本明細書に記載されている抗補体抗体の定常領域はまた、補体活性化を損なうように修飾され得る。例えば、補体のC1成分の結合後のIgG抗体の補体活性化は、C1結合モチーフ(例えば、C1qの結合モチーフ)における定常領域中のアミノ酸残基を変異させることによって減少させることができる。ヒトIgG1のD270、K322、P329、P331の各々についてのAla突然変異は、C1qに結合し補体を活性化する抗体の能力を有意に減少させることが報告されている。マウスIgG2bに関して、C1q結合モチーフは、残基E318、K320及びK322を構成する。Idusogie et al. (2000) J. Immunology 164:4178-4184、Duncan et al. (1988) Nature 322: 738-740。マウスIgG2bについて同定されたCls結合モチーフE318、K320及びK322は、他の抗体アイソタイプ(Duncan et al. (1988) Nature 322:738-740)に対して共通であると考えられるため、IgG2bに対するC1q結合活性は、3つの特定の残基のいずれか1つをその側鎖に不適切な官能性を有する残基で置き換えることによって無効にすることができる。C1q結合を無効にするためにAlaだけでイオン残基を置き換える必要はない。また、C1q結合を無効にするために、3つの残基のいずれか1つに代えて、Gly、Ile、Leu若しくはValなどの他のアルキル置換された非イオン性残基、又はPhe、Tyr、Trp及びProなどの芳香族非極性残基を用いることができる。さらに、C1s結合活性を無効にするために、残基318ではなく、残基320及び322に代えて、Ser、Thr、Cys及びMetなどの極性非イオン性残基を用いることもできる。さらに、補体結合に必要なFc領域の糖修飾の除去は、補体活性化を防止することができる。IgG重鎖のCH2ドメイン上の保存されたアスパラギン(Asn-297)のグリコシル化は、抗体エフェクター機能に不可欠である(Jefferis et al. (1998) Immunol Rev 163:59-76)。Fcグリカンの修飾は、IgGの立体構造を変化させ、補体タンパク質C1qとエフェクター細胞受容体FcRの結合に対するFc親和性を低減させる(Alhorn et al. (2008) PLos ONE 2008;3:e1413)。Fcグリカンの完全な除去は、CDC及びADCCを無効にする。脱グリコシル化は、他の免疫グロブリンクラス及び他の糖タンパク質に作用することなく、グリコシダーゼ酵素、例えば、全てのIgGサブクラスの重鎖上のアスパラギン結合型グリカンを選択的に消化するストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)の遺伝子endoSによってコードされた108kDa酵素であるエンドグリコシダーゼS(EndoS)を用いて行うことができる(Collin et al. (2001) EMBO J 2001;20:3046-3055)。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第5,739,277号に記載されているように、抗体(特に、抗体断片)にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる。本明細書で使用するとき、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、IgG分子のインビボでの血清半減期の増加に関与するIgG分子(例えば、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4)のFc領域のエピトープを指す。
(10)他のアミノ酸配列改変
本開示の抗C1q抗体又はそれらの抗体断片のアミノ酸配列改変も企図される。例えば、抗体又は抗体断片の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体又は抗体断片のアミノ酸配列変異体は、該抗体若しくは抗体断片をコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製される。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又はそれへの挿入及び/又はその置換を含む。欠失、挿入及び置換の任意の組合せは、最終構築物が所望の特徴(すなわち、本開示のC1qタンパク質に結合する又はそれと物理的に相互作用する能力)を有する限り、最終構築物に到達するためになされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
突然変異誘発に好ましい位置である抗C1q抗体の特定の残基又は領域を同定するために有用な方法は、Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)によって記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれている。ここで、残基又は標的残基の群は同定され(例えば、arg、asp、his、lys及びgluなどの荷電残基)、アミノ酸と標的抗原の相互作用に影響を与えるために、中性又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン)によって置き換えられる。次に、置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置は、置換の部位で又は置換の部位に関してさらなる又は他の変異体を導入することによって改良される。このようにして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、アラニンスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、1残基〜100以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端(「N」)及び/又はカルボキシ(「C」)末端融合体、並びに1つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドに対する抗体のN末端又はC末端への融合体を含む。
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置き換えられた抗体分子において少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異誘発について最も関心ある部位は超可変領域を含むが、FR変化もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下に、以下の表Aに示されている。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Aにおいて「例示的な置換」と表示され、又はアミノ酸クラスを参照して以下にさらに説明されるようなより実質的な変化が導入されてもよく、生成物がスクリーニングされてもよい。
Figure 0006653009
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、(a)例えばシート若しくはらせん立体構造のような置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は(c)側鎖のバルク、の維持に対する置換の効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてグループに分けられる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile
(2)中性親水性:cys、ser、thr
(3)酸性:asp、glu
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro、及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。
また、抗体の適切な立体構造の維持に関与しないいずれかのシステイン残基は、一般に、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐためにセリンで置換されてもよい。逆に、システイン結合(単数又は複数)は、その安定性(特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合)を改善するために抗体に付加されてもよい。
いくつかの実施形態において、置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗C1q抗体)の1つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択された得られた変異体(単数又は複数)は、それらが生成される親抗体に対して生物学的特性を改善する。このような置換変異体を生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡単に言えば、いくつかの超可変領域部位(例えば、6〜7部位)は、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生じさせるために変異される。このように生じさせた抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価の様式で提示される。次に、ファージディスプレイ変異体は、本明細書中に開示されるように、それらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために行うことができる。あるいは又はさらに、抗体と抗原(例えば、本開示のC1qタンパク質)の間の接触点を同定するために、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析することは有益であり得る。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述する技術に従った置換の候補である。このような変異体が生成されると、変異体の一団は、本明細書に記載されるようなスクリーニングに供され、1つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
抗体の別のタイプのアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更させる。変更させるとは、抗体に見られる1つ以上の糖部分の欠失、及び/又は抗体に存在しない1つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N結合型又はO結合型のいずれかである。N結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である)は、アスパラギン側鎖への糖部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコシル化部位を作る。O結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖であるN-アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースのうちの1つの結合を指すが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた使用することができる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(N結合グリコシル化部位について)上記のトリペプチド配列の1つ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成される。変更はまた、(O結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列への1つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又はそれによる置換によってなされ得る。
抗IgE抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において公知の種々の方法によって調製される。これらの方法には、限定されないが、抗体(例えば、本開示の抗C1q抗体)又は抗体断片の先に調製された変異体又は非変異バージョンのオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、PCR突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による、天然供給源からの単離(天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合)又は調製が含まれる。
(11)他の抗体修飾
本開示の抗C1q抗体又はそれらの抗体断片は、当該技術分野において公知であり、容易に利用できるさらなる非タンパク性部分を含むようにさらに修飾することができる。いくつかの実施形態において、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中におけるその安定性のために製造に利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝又は非分枝であってもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、1を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じ又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療に使用されるかどうかなどを含む考慮事項に基づいて決定され得る。このような技術及び他の適切な製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)に開示されている。
核酸、ベクター及び宿主細胞
本開示の抗C1q抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え法及び組成物を用いて生成することができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗C1q抗体(例えば、該抗体の軽鎖及び/又は重鎖)のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列をコードすることができる。いくつかの実施形態において、このような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。いくつかの実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞も提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、を含む(例えば、それで形質導入されている)。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。
本開示の抗C1q抗体を作製する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、抗体の発現に適した条件下で、抗C1q抗体をコードする核酸を含有する本開示の宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、その後、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から回収される。実施例1も参照されたい。
本開示の抗C1q抗体の組換え産生のために、抗C1q抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び/又は発現のための1つ以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離され、配列決定され得る。
本明細書に記載されている、本開示の抗C1q抗体又はそれらの断片ポリペプチド(抗体を含む)のいずれかをコードする核酸配列を含む適切なベクターは、限定されないが、クローニングベクター及び発現ベクターを含む。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができ、又は当該技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。使用を意図された宿主細胞に応じて、選択されたクローニングベクターが変化し得る一方で、有用なクローニングベクターは、一般的に自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有し得、及び/又はベクターを含むクローンの選択に使用することができるマーカー遺伝子を担持することができる。適切な例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、pUC18、pUC19、Bluescript(例えば、pBS SK+)及びその誘導体、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、並びにpSA3及びpAT28などのシャトルベクターが挙げられる。これら及び多くの他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene及びInvitrogenなどの市販業者から入手可能である。
発現ベクターは、一般的に、本開示の核酸を含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして又は染色体DNAの不可欠な部分として宿主細胞中で複製することができる。適切な発現ベクターとしては、限定されないが、PCT公開第WO87/04462号に開示されているプラスミド、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、コスミド、及び発現ベクター(単数又は複数)が挙げられる。ベクター成分は、一般的に、限定されないが、以下:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、適切な転写調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー及びターミネーター)、の1つ以上を含み得る。発現(すなわち、翻訳)に関して、リボソーム結合部位、翻訳開始部位及び終止コドンなどの1つ以上の翻訳調節エレメントも通常必要とされる。
対象とする核酸を含むベクターは、いくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入され得、手段としては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン又は他の物質を採用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、及び感染(例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合)が含まれる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。いくつかの実施形態において、ベクターは、本開示の抗C1q抗体をコードする1つ以上のアミノ酸配列を含む核酸を含む。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞には、原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、本開示の抗C1q抗体は、特に、グリコシル化及びFcエフェクター機能が必要ない場合、細菌中で産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関して、(例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号及び第5,840,523号、並びに大腸菌における抗体断片の発現を記載するCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、繊維状真菌又は酵母などの真核微生物はまた、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている、真菌及び酵母菌株などの抗体をコードするベクター用の適したクローニング又は発現宿主である(例えば、Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。
また、グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)から誘導することができる。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物はまた宿主として利用することができる(例えば、トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術を記載する米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号及び第6,417,429号)。
また、脊椎動物細胞を宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)、ヒト胚腎臓株(例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載されている293又は293細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍(MMT 060562)、例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されているTRI細胞、MRC 5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、DHFR-CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、並びにY0、NS0及びSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。
医薬組成物
本開示の抗C1q抗体は、抗体と適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤とを組み合わせることによって、治療的使用(例えば、投与による)の様々な製剤に組み込むことができ、又は医薬(例えば、神経変性疾患若しくは自己免疫疾患を治療又は予防するため)の製造に組み込むことができ、固体、半固体、液体又は気体の形態の調製物に製剤化され得る。このような製剤の例としては、限定されないが、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロスフェア及びエアロゾルが挙げられる。医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために通常使用されるビヒクルである、薬学的に許容される希釈剤の非毒性担体を含むことができる。組合せの生物学的活性に影響を与えないように希釈剤が選択される。このような希釈剤の例としては、限定されないが、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、PBS、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液が含まれる。本開示の医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定化剤、賦形剤などをさらに含むことができる。組成物はまた、pH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤及び界面活性剤などの生理学的条件に近づけるための追加の物質を含むことができる。
本開示の医薬組成物はまた、例えば、酸化防止剤などの種々の安定化剤のいずれかを含むことができる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を増強する、又はそうでなければその薬理学的特性を高める(例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低減させる及び溶解性又は取り込みを高める)様々な周知の化合物と複合体を形成することができる。このような修飾又は錯化剤の例としては、限定されないが、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩及びリン酸塩が挙げられる。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボでの属性を高める分子とともに複合体を形成することができる。このような分子としては、限定されないが、糖質、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン(例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン)、及び脂質が挙げられる。
様々なタイプの投与に適した製剤のさらなる例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)に見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい。
経口投与について、有効成分は、カプセル、錠剤及び粉末などの固体剤形、又はエリキシル、シロップ及び懸濁液などの液体剤形で投与することができる。有効成分(単数又は複数)は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの不活性成分及び粉末担体とともにゼラチンカプセルに封入することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散又は他の公知の望ましい特徴を提供するために添加することができる追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン及び食用白色インクである。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作製することができる。錠剤とカプセルの両方は、数時間にわたって薬剤の連続放出を提供する徐放製品として製造することができる。圧縮錠剤は、いずれもの不快な味をマスクし、錠剤を大気から保護するために糖衣で被覆され若しくはフィルムで被覆され、又は胃腸管における選択的崩壊に関して腸溶被覆され得る。経口投与用の液体剤形は、患者の許容性を高めるために着色料及び香味料を含有することができる。
非経口投与に適した製剤には、水性及び非水性、等張滅菌注射溶液が挙げられ、それらには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が含まれ得る。
医薬組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは、高純度のものであり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない(例えば、少なくともナショナルフード(NF)グレード、一般には、少なくとも分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード)。さらに、インビボでの使用に意図された組成物は、通常、無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない程度に、得られた生成物は、典型的には、合成又は精製プロセス中に存在し得る、いずれもの潜在的に有毒な作用物質、特にいずれもの内毒素を実質的に含まない。非経口投与用の組成物はまた、無菌であり、実質的に等張性であり、GMP条件下で作製される。
製剤は、脳又は中枢神経系における保持及び安定化のために最適化することができる。薬剤が頭蓋区画に投与される場合、薬剤は、区画内に保持され、拡散されず又は他には血液脳関門を通過しないことが望ましい。安定化技術は、分子量の増加を達成するために、架橋、多量体化、又はポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体などの基への連結などを含む。
保持を増加させるための他の方策には、生分解性又は生侵食性移植物への本開示の抗C1q抗体などの抗体の取り込みが含まれる。治療的活性剤の放出速度は、ポリマーマトリックスを通過する輸送速度及び移植物の生分解によって調節される。また、ポリマー障壁を通過する薬物の輸送は、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋の程度、ポリマー障壁が薬物に対してより透過性になるような吸水時のポリマーの膨張、移植物の形状などにより影響を受ける。移植物は、移植の部位として選択される領域のサイズ及び形状に見合った大きさのものである。移植物は、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセルなどであってもよく、挿入の選択部位と適合する任意のサイズ又は形状であってもよい。
移植物は、モノリシックであってもよく、すなわち、活性剤をポリマーマトリックスを介して均一に分布させ又はカプセル化させ、この場合、活性剤のリザーバはポリマーマトリックスによってカプセル化される。採用されるポリマー組成物の選択は、投与部位、治療の所望の期間、患者の耐性、治療されるべき疾患の性質などにより変化する。ポリマーの特徴としては、移植部位での生分解性、目的の薬剤との互換性、カプセル化の容易性、生理学的環境における半減期が含まれる。
採用することができる生分解性ポリマー組成物は、分解したとき、単量体を含む生理学的に許容される分解生成物をもたらす有機エステル又はエーテルであり得る。無水物、アミド、オルトエステルなどは、単独で又は他の単量体と組み合わせて、用途を見出すことができる。ポリマーは、縮合ポリマーである。ポリマーは、架橋又は非架橋であってもよい。特に興味深いのは、ヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、ホモポリマー又はコポリマーのいずれか、及び多糖類である。対象とするポリエステルには、D-乳酸、L-乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、ポリカプロラクトン及びそれらの組合せのポリマーが含まれる。L-ラクテート又はD-ラクテートを採用することによって、ゆっくりと生分解するポリマーが達成され、一方、分解は、ラセミ化合物で実質的に高められる。グリコール酸と乳酸のコポリマーは、特に関心が高く、この場合、生分解速度は乳酸に対するグリコール酸の比率によって調節される。最も急速に分解されるコポリマーは、ほぼ同量のグリコール酸と乳酸を有し、この場合、ホモポリマーのいずれかは分解に対してより抵抗性がある。乳酸に対するグリコール酸の比率はまた移植物における脆性に影響し、この場合、より柔軟な移植物はより大きい形状に望ましい。対象とする多糖類には、アルギン酸カルシウム、及び官能化セルロース、特に約5kD〜500kDの分子量である、水不溶性によって特徴付けられるカルボキシメチルセルロースエステルなどがある。生分解性ハイドロゲルはまた、本発明の移植物に採用することができる。ハイドロゲルは、典型的には、液体を吸収する能力によって特徴付けられるコポリマー材料である。採用され得る例示的な生分解性ハイドロゲルは、Heller: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149に記載されている。
医薬投与
本開示の抗C1q抗体を含む本開示の医薬組成物は、公知の方法、例えば、ボーラスとしての静脈内投与に合致させて、又はある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所又は吸入経路によって使用され得る(例えば、ヒト個体などの抗C1q抗体を用いた治療を必要とする個体に投与され得る)。
本開示の医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の用途に応じて変えることができる。適切な用量又は投与経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内にある。動物実験は、ヒト治療のための有効な用量の決定に信頼できる指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、Mordenti, J. and Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46に記載される原理に従って行うことができる。
本開示の抗C1q抗体のいずれかのインビボ投与について、通常の投与量は、投与経路に応じて、1日あたり個体の体重の約10ng/kg〜約100mg/kgまで変えてもよい。いくつかの実施形態において、用量は約1mg/kg/日〜10mg/kg/日である。治療される疾患、障害又は状態の重症度に応じて、数日又はそれより長い期間の反復投与について、治療は、症状の所望の抑制が達成されるまで持続される。
例示的な投薬計画は、約2mg/kgの抗C1q抗体の最初の用量を投与し、続く、隔週で約1mg/kgの週1回の維持用量を含むことができる。他の投薬計画は有用であり得、医師が達成したい薬物動態学的崩壊のパターンに応じる。例えば、1週あたり1回〜21回の個体への投薬は、本明細書において企図される。特定の実施形態において、約3μg/kg〜約2mg/kgの範囲(例えば、約3μg/kg、約10μg/kg、約30μg/kg、約100μg/kg、約300μg/kg、約1mg/kg又は約2mg/kgなど)の投与を用いてよい。特定の実施形態において、投与頻度は、1日3回、1日2回、1日1回、1日おきに1回、週1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、9週間に1回、10週間に1回、又は月1回、2カ月に1回、3カ月に1回又はそれより長い。治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。投与される抗C1q抗体を含む投与計画は、使用される用量と独立して経時的に変えてもよい。
特定の抗C1q抗体のための用量は、抗C1q抗体の1つ以上の投与を与えられた個体において経験的に決定することができる。個体は、抗C1q抗体の漸増用量を与えられる。抗C1q抗体の有効性を評価するために、神経変性障害、炎症性障害又は自己免疫障害の臨床的症状をモニターすることができる。
本開示の抗C1q抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるのかどうか及び当業者に公知の他の因子に応じて、連続的又は間欠的であってもよい。抗C1q抗体の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は間隔を置いた一連の用量であってもよい。
特定の用量及び送達の方法に関する指針は文献に提供されており、例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号を参照されたい。異なる製剤が異なる治療及び異なる障害に効果的であり、特定の臓器又は組織を治療することが意図された投与が別の臓器又は組織に対するものとは異なる様式で送達を必要とし得ることは、本発明の範囲内である。さらに、投薬は、1つ以上の別個の投与によって、又は持続注入によって投与されてもよい。状態に応じた数日又はそれより長い期間の反復投与について、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の投薬計画が有用であり得る。この治療の進行は従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
治療用途
本開示は、C1qに結合し、C1qの生物学的活性を中和することができる抗C1q抗体及びそれらの抗原結合断片を提供する。これらの抗C1q抗体は、限定されないが、神経変性障害、炎症性障害及び自己免疫障害を含む補体活性化に関連するある範囲の疾患の予防、危険性の減少又は治療に有用である。したがって、本明細書に開示されるように、本開示の抗C1q抗体は、個体における、限定されないが、神経変性障害、炎症性障害及び自己免疫障害を含む補体活性化に関連する疾患の治療、予防又は危険性の減少に使用され得る。いくつかの実施形態において、個体はこのような疾患を有する。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
本開示の抗C1q抗体を用いて治療され得る神経変性障害は、CF1依存性シナプス喪失を含む神経接合部又はシナプスの喪失に関連する障害を含む。このような障害としては、限定されないが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病及びハンチントン病が含まれ得る。いくつかの神経変性障害では、シナプス喪失は、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存する。いくつかの神経変性障害において、シナプス喪失は、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する。いくつかの障害において、シナプスはミクログリアによって貪食される。したがって、本開示の抗C1q抗体は、本開示の神経変性障害の1つ以上の症状を治療、予防又は改善するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、C1qと自己抗体、例えば抗ガングリオシド自己抗体の間の相互作用、C1qとC1rの相互作用及び/又はC1qとC1sの相互作用を阻害するために、本開示の抗C1q抗体を投与することによって、本開示の神経変性障害を有する個体において、1つ以上の症状を治療、予防又は改善する方法を提供する。
本開示の抗C1q抗体を用いて治療され得る炎症性又は自己免疫疾患としては、限定されないが、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、例えば、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性及び他の虚血関連網膜症、眼内炎、及び他の眼内新生血管疾患、例えば、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、並びにアロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息及び誤嚥性肺炎が挙げられる。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患としては、限定されないが、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症がさらに挙げられ得る。
視神経脊髄炎(NMO)などの自己免疫疾患では、自己抗体が補体系を活性化する。NMO患者において、古典的補体経路は、AQP4標的自己抗体などの自己抗体がその自己抗原AQP4に結合することによって誘発される。それによって、AQP4は補体活性化の古典的経路を活性化する。この活性化プロセスの第1のステップでは、補体因子C1qは、自己抗体-自己抗原の免疫複合体に結合する。自己抗体は、天然に存在する抗体、例えば、NMO患者由来の血清抗体(通常、NMO-IgGのと呼ばれる)又はrAb-53などのモノクローナル抗体を含むことができる。
したがって、本開示の抗C1q抗体は、本開示の炎症性又は自己免疫疾患の1つ以上の症状を治療、予防又は改善するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、C1qと自己抗体、例えば抗ガングリオシド自己抗体の間の相互作用、C1qとC1rの相互作用及び/又はC1qとC1sの相互作用を阻害するために、本開示の抗C1q抗体を投与することによって、本開示の炎症性又は自己免疫疾患を有する個体において、1つ以上の症状を治療、予防又は改善する方法を提供する。
抗C1q抗体を用いて治療され得る代謝性疾患としては、限定されないが、糖尿病、例えば、II型糖尿病及び肥満が挙げられる。抗C1q抗体の試験に使用することができる代謝性障害のインビトロ及びインビボモデルは、当該技術分野において周知である。したがって、本開示の抗C1q抗体は、本開示の代謝性疾患の1つ以上の症状を治療、予防又は改善するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、C1qと自己抗体、例えば抗ガングリオシド自己抗体の間の相互作用、C1qとC1rの相互作用及び/又はC1qとC1sの相互作用を阻害するために、本開示の抗C1q抗体を投与することによって、本開示の代謝性疾患を有する個体において、1つ以上の症状を治療、予防又は改善する方法を提供する。
併用治療
本開示の抗体は、限定されないが、神経変性障害、炎症性障害及び/又は自己免疫障害の任意の追加治療と併用して使用することができる。
いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、抗C1s若しくは抗C1r抗体などの第2の抗補体因子抗体(例えば、中和抗補体因子抗体)又は第2の抗C1q抗体を併用して治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、第2の抗C1q抗体、抗C1s抗体及び/又は抗C1r抗体などの第2及び第3の中和抗補体因子抗体を用いて、治療有効量で投与される。
いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の阻害剤を併用して投与される。ADCC阻害剤には、限定されないが、HLA-A、HLA-B又はHLA-Cを認識するキラー細胞Ig様受容体(KIR)及びHLA-Eを認識するC型レクチンCD94/NKG2Aヘテロ二量体などの可溶性NK細胞阻害性受容体(例えば、Lopez-Botet M., T. Bellon, M. Llano, F. Navarro, P. Garcia & M. de Miguel. (2000), Paired inhibitory and triggering NK cell receptors for HLA class I molecules. Hum. Immunol. 61: 7-17、Lanier L.L. (1998) Follow the leader: NK cell receptors for classical and nonclassical MHC class I. Cell 92: 705-707を参照されたい)、及びカドミウム(例えば、Immunopharmacology 1990、Volume 20, Pages 73-8を参照されたい)が含まれ得る。
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、補体活性化の代替経路の阻害剤を併用して投与される。このような阻害剤としては、限定されないが、因子B遮断抗体、因子D遮断抗体、可溶性、膜結合、タグ化又は融合タンパク質形態のCD59、DAF、CR1、CR2、Crry、又はC3の切断をブロックするコンプスタチン様ペプチド、非ペプチドC3aRアンタゴニスト、例えばSB290157、コブラ毒因子又は非特異的補体阻害剤、例えばナファモスタットメシル酸塩(FUTHAN、FUT-175)、アプロチニン、K-76モノカルボン酸(MX-1)及びヘパリンが挙げられ得る(例えば、T.E. Mollnes & M. Kirschfink, Molecular Immunology 43 (2006) 107-121を参照されたい)。いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、自己抗体とその自己抗原の間の相互作用の阻害剤を併用して投与される。このような阻害剤は、ペプチド又はRNA由来のミモトープ、例えばAQP4抗原のミモトープなどの精製された可溶性形態の自己抗原又は抗原模倣物を含むことができる。あるいは、このような阻害剤は、古典的補体経路を誘発することなく、自己抗原を認識し、自己抗体の結合を防ぐブロッキング剤を含むことができる。このようなブロッキング剤としては、例えば、自己抗原結合RNAアプタマー又はそれらのFcドメインにおいて機能性C1q結合部位を欠損している抗体(例えば、Fab断片又はC1qに結合しないように他に操作された抗体)が含まれ得る。
診断用途
本開示の抗体又はそれらの機能的断片はまた診断的有用性を有する。したがって、本開示は、個体における又は個体由来の組織試料におけるC1qの検出などの診断目的で、本開示の抗体又はそれらの機能的断片を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、神経変性障害又は炎症性若しくは自己免疫疾患に罹患しているヒト患者である。いくつかの実施形態において、本開示の抗C1q抗体は、シナプスとシナプス喪失を検出するために使用される。例えば、シナプス喪失は、アルツハイマー病又は緑内障などの神経変性障害に罹患している個体において測定することができる。
いくつかの実施形態において、診断方法は、本開示の抗C1q抗体又はその機能的断片を個体に投与するステップ、及び個体のシナプスに結合した抗体を検出するステップを含む。シナプスへの抗体結合は、例えば、陽電子放出断層撮影(PET)、X線コンピュータ断層撮影、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)、コンピュータ断層撮影(CT)及びコンピュータ体軸断層撮影(CAT)などの非侵襲性技術によって定量され得る。
いくつかの実施形態において、診断方法は、生検標本、組織又は細胞などの生物学的試料におけるシナプスを検出するステップを伴う。抗C1q抗体又はその機能的断片を生物学的試料と接触させ、シナプスに結合した抗体を検出する。検出方法は、シナプスに結合した抗体の定量化を含んでもよい。生物学的試料中の抗体の検出は、免疫蛍光顕微鏡法、免疫細胞化学、免疫組織化学、ELISA、FACS分析又は免疫沈降を含む、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。
シナプスに結合した抗体の定量化は、個体に存在するシナプスの数の相対的な尺度を提供する。典型的に、シナプスは、ある期間にわたって繰り返して定量化される。シナプス定量化の正確な周期性は、神経変性疾患の性質、疾患の進行の段階、治療法及び多くの他の因子を含む多くの因子に依存する。反復測定は、一般的に、神経変性障害を有する個体における進行性のシナプス喪失を明らかにする。あるいは、相対的なシナプスカウントは、単一時点での罹患個体及び健常な対照個体の集団において比較してもよい。治療を受けている罹患個体において、治療の有効性は、治療された個体におけるシナプス喪失の速度と対照群におけるシナプス喪失の速度を比較することによって評価することができる。対照群のメンバーは、治療なし又はプラセボ対照などの対照治療のいずれかを受けている。
キット
本発明はまた、本開示の抗体又はその機能的断片を含むキットを提供する。本発明のキットは、本開示の精製された抗C1q抗体を含む1つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、本開示の方法に従って使用するための指示をさらに含む。いくつかの実施形態において、これらの指示は、本開示の任意の方法に従って、限定されないが、神経変性障害(例えば、アルツハイマー病)、炎症性疾患、自己免疫疾患及び/又は代謝性障害を含む補体活性化に関連する疾患を治療又は診断するための抗C1q抗体の投与の説明を含む。いくつかの実施形態において、指示は、例えば、個体において、組織試料において又は細胞においてC1qを検出する方法の説明を含む。キットは、その個体が疾患及び疾患の段階を有するかどうかを同定することに基づいて、治療に適した個体を選択する説明をさらに含んでもよい。
指示は、一般的に、意図された治療のための用量、投薬スケジュール及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、複数用量パッケージ)又はサブユニット用量であってもよい。本発明のキットに付属される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれる紙シート)の指示書であるが、機械によって読むことができる指示(例えば、磁気又は光学記憶ディスク上に担持された指示)も許容される。
ラベル又は添付文書は、組成物が、例えば、神経変性疾患を治療するために使用されることを示す。指示は、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するために提供されてもよい。
本発明のキットは、適切なパッケージの状態にある。適切なパッケージには、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージング(例えば、密封されたマイラー（Mylar）又はプラスチックバッグ)などが挙げられる。また、吸入器、経鼻投与デバイス(例えば、アトマイザー)又は注入デバイス、例えばミニポンプなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージが企図される。キットは無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。容器はまた無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は古典的補体経路の阻害剤である。容器は、第2の薬学的活性剤をさらに含んでもよい。
キットは、場合により、緩衝液及び解釈的情報などの追加の要素を提供することができる。通常、キットは、容器と、容器上又は容器に関連するラベル若しくは添付文書(単数又は複数)を含む。
本発明は以下の実施形態を包含する：
１．軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む単離された抗C1q抗体であって、軽鎖可変ドメインが、ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-L1、HVR-L2及びHVR-L3を含み、かつ/又は重鎖可変ドメインが、ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株若しくはその子孫によって産生されるモノクローナル抗体M1のHVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含む、抗体。
２．C1qタンパク質に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3からなる群から選択される軽鎖HVRを含み、かつ/又は配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3からなる群から選択される重鎖HVRを含む抗体。
３．配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ/又は配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、実施形態2に記載の抗体。
４．配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、実施形態2又は3に記載の抗体。
５．配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、実施形態2〜4のいずれかに記載の抗体。
６．ヒトC1qとマウスC1qの両方に特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれかに記載の抗体。
７．ラットC1qに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれかに記載の抗体。
８．ヒトC1q、マウスC1q及びラットC1qに特異的に結合する、実施形態1〜5のいずれかに記載の抗体。
９．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満〜約100pM未満の範囲である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１０．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１１．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約20nM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１２．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約10nM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１３．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約5nM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１４．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約1nM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１５．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約100pM未満である、実施形態1〜8のいずれかに記載の抗体。
１６．C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する、実施形態1〜15のいずれかに記載の抗体。
１７．前記生物学的活性が、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球形C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)ベータ-アミロイドへのC1q結合又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合である、実施形態16に記載の抗体。
１８．前記生物学的活性が、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である、実施形態16又は17に記載の抗体。
１９．CH50溶血が、ヒト、マウス及び/又はラットCH50溶血を含む、実施形態18に記載の抗体。
２０．少なくとも50％、少なくとも80％又は少なくとも90％のCH50溶血を中和することができる、実施形態18又は19に記載の抗体。
２１．200ng/ml未満、100ng/ml未満、50ng/ml未満又は20ng/ml未満の用量で少なくとも50％のCH50溶血を中和することができる、実施形態18〜20のいずれかに記載の抗体。
２２．マウス抗体である、実施形態1〜21のいずれかに記載の抗体。
２３．ヒト化又はキメラ抗体である、実施形態1〜21のいずれかに記載の抗体。
２４．ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株又はその子孫によって産生される単離されたマウス抗ヒトC1qモノクローナル抗体M1。
２５．ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体M1又はその抗C1q結合断片と同じC1qエピトープに本質的に結合する単離された抗C1q抗体。２６．C1qタンパク質に結合し、以下：
i.配列番号1のアミノ酸残基196-226(配列番号16)、又は配列番号1のアミノ酸残基196-226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(配列番号16)に対応するC1qタンパク質鎖A(C1qA)のアミノ酸残基、
ii.配列番号1のアミノ酸残基196-221(配列番号17)、又は配列番号1のアミノ酸残基196-221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号17)に対応するC1qAのアミノ酸残基、
iii.配列番号1のアミノ酸残基202-221(配列番号18)、又は配列番号1のアミノ酸残基202-221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号18)に対応するC1qAのアミノ酸残基、
iv.配列番号1のアミノ酸残基202-219(配列番号19)、又は配列番号1のアミノ酸残基202-219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(配列番号19)に対応するC1qAのアミノ酸残基、並びに
v.配列番号1のアミノ酸残基Lys219及び/若しくはSer202、又は配列番号1のLys219及び/若しくはSer202に対応するC1qAのアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する、単離された抗C1q抗体。
２７．(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)、又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qタンパク質鎖C(C1qC)のアミノ酸残基、
(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)、又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)、又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225、又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)、又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)、又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187、又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185、又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸にさらに結合する、実施形態26に記載の抗体。
２８．C1qタンパク質に結合し、以下：
(a)配列番号3のアミノ酸残基218-240(配列番号20)、又は配列番号3のアミノ酸残基218-240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(b)配列番号3のアミノ酸残基225-240(配列番号21)、又は配列番号3のアミノ酸残基225-240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(c)配列番号3のアミノ酸残基225-232(配列番号22)、又は配列番号3のアミノ酸残基225-232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr225、又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr225に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(e)配列番号3のアミノ酸残基174-196(配列番号23)、又は配列番号3のアミノ酸残基174-196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(f)配列番号3のアミノ酸残基184-192(配列番号24)、又は配列番号3のアミノ酸残基184-192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基、
(g)配列番号3のアミノ酸残基185-187、又は配列番号3のアミノ酸残基185-187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、及び
(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser185、又は配列番号3のアミノ酸残基Ser185に対応するC1qCのアミノ酸残基
からなる群から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸に結合する、単離された抗C1q抗体。
２９．配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219とSer202又は配列番号1に示されるLys219とSer202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr225又は配列番号3に示されるTyr225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する、実施形態28に記載の抗体。
３０．配列番号1に示されるヒトC1qAのアミノ酸残基Lys219又は配列番号1に示されるLys219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基、及び配列番号3に示されるヒトC1qCのアミノ酸残基Ser185又は配列番号3に示されるSer185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合する、実施形態28に記載の抗体。
３１．ヒト化抗体、キメラ抗体又はヒト抗体である、実施形態25〜30のいずれかに記載の抗体。
３２．ヒトC1qとマウスC1qの両方に特異的に結合する、実施形態25〜31のいずれかに記載の抗体。
３３．ラットC1qに特異的に結合する、実施形態25〜31のいずれかに記載の抗体。
３４．ヒトC1q、マウスC1q及びラットC1qに特異的に結合する、実施形態25〜31のいずれかに記載の抗体。
３５．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満〜約100pM未満の範囲である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
３６．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約30nM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
３７．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約20nM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
３８．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約10nM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
３９．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約5nM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
４０．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約1nM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
４１．ヒトC1q及びマウスC1qについての解離定数(KD)が約100pM未満である、実施形態25〜34のいずれかに記載の抗体。
４２．C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する、実施形態25〜41のいずれかに記載の抗体。
４３．前記生物学的活性が、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球形C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)ベータ-アミロイドへのC1q結合又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合である、実施形態42に記載の抗体。
４４．前記生物学的活性が、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である、実施形態42又は43に記載の抗体。
４５．CH50溶血が、ヒト、マウス及び/又はラットCH50溶血を含む、実施形態44に記載の抗体。
４６．少なくとも50％、少なくとも80％又は少なくとも90％のCH50溶血を中和することができる、実施形態44又は45に記載の抗体。
４７．200ng/ml未満、100ng/ml未満、50ng/ml未満又は20ng/ml未満の用量で少なくとも50％のCH50溶血を中和することができる、実施形態44〜46のいずれかに記載の抗体。
４８．二重特異性抗体である、実施形態1〜23及び25〜47のいずれかに記載の抗体。
４９．脳透過性を増加させるように操作されている、実施形態1〜23及び25〜47のいずれかに記載の抗体。
５０．第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である、実施形態1〜23及び25〜47のいずれかに記載の抗体。
５１．第1の抗原がC1qタンパク質であり、第2の抗原が血液脳関門を横断する輸送を促進する抗原である、実施形態50に記載の抗体。
５２．第2の抗原が、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、angiopepペプチド並びにANG1005からなる群から選択される、実施形態50又は51に記載の抗体。
５３．IgGクラスのものである、実施形態1〜23及び25〜47のいずれかに記載の抗体。
５４．IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプを有する、実施形態53に記載の抗体。
５５．抗体断片である、実施形態1〜23及び25〜47のいずれかに記載の抗体。
５６．Fab、F(ab')2又はFab'断片である、実施形態55に記載の抗体。
５７．抗体断片が、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する、実施形態55又は56に記載の抗体。
５８．抗体断片が、その対応する全長抗体と比較してより良好な脳透過性を有する、実施形態55〜57のいずれかに記載の抗体。
５９．抗体断片が、その対応する全長抗体と比較してより短い半減期を有する、実施形態55〜58のいずれかに記載の抗体。
６０．実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
６１．実施形態60に記載の核酸配列を含む、単離された宿主細胞。
６２．ATCC受託番号PTA-120399を有するハイブリドーマ細胞又はその子孫。
６３．実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
６４．そのような治療を必要とする個体における補体活性化に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、治療有効用量の実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体を投与することを含む方法。
６５．補体活性化に関連する疾患が神経変性障害である、実施形態64に記載の方法。
６６．神経変性障害が、シナプスの喪失又は神経接合部喪失に関連する、実施形態65に記載の方法。
６７．神経変性障害が、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する、実施形態65又は66に記載の方法。
６８．神経変性障害が、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する、実施形態65〜67のいずれかに記載の方法。
６９．神経変性障害が、ミクログリアによるシナプス食作用に関連する、実施形態65〜68のいずれかに記載の方法。
７０．神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病及びハンチントン病からなる群から選択される、実施形態65〜69のいずれかに記載の方法。
７１．補体活性化に関連する疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害である、実施形態64に記載の方法。
７２．炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害が、糖尿病、肥満、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、眼内炎、眼内新生血管疾患、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、アロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息並びに誤嚥性肺炎からなる群から選択される、実施形態71に記載の方法。
７３．補体活性化に関連する疾患が、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患である、実施形態64に記載の方法。
７４．実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体、及びそのような治療を必要とする個体において補体活性化に関連する疾患を治療又は予防するために該抗体を使用するための指示を含む添付文書を含むキット。
７５．補体活性化に関連する疾患が神経変性障害である、実施形態74に記載のキット。
７６．神経変性障害が、シナプスの喪失又は神経接合部喪失に関連する、実施形態75に記載のキット。
７７．神経変性障害が、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する、実施形態75又は76に記載のキット。
７８．神経変性障害が、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する、実施形態75〜77のいずれかに記載のキット。
７９．神経変性障害が、ミクログリアによるシナプス食作用に関連する、実施形態75〜78のいずれかに記載のキット。
８０．神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病及びハンチントン病からなる群から選択される、実施形態75〜79のいずれかに記載のキット。
８１．補体活性化に関連する疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害である、実施形態74に記載のキット。
８２．炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害が、糖尿病、肥満、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、眼内炎、眼内新生血管疾患、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、アロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息並びに誤嚥性肺炎からなる群から選択される、実施形態81に記載のキット。
８３．補体活性化に関連する疾患が、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患である、実施形態74に記載のキット。
８４．実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体を含む診断用キット。
８５．個体におけるシナプスを検出する方法であって、
a)実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体を個体に投与するステップ、及び
b)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって個体におけるシナプスを検出するステップ
を含む、方法。
８６．シナプスに結合した抗体が、陽電子放出断層撮影(PET)、X線コンピュータ断層撮影、単一光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)、コンピュータ断層撮影(CT)及びコンピュータ体軸断層撮影(CAT)からなる群から選択される画像技術を用いて検出される、実施形態85に記載の方法。
８７．シナプスに結合した抗体の検出が、個体におけるシナプス数の定量的測定をもたらす、実施形態85又は86に記載の方法。
８８．個体が神経変性疾患又は自己免疫疾患を有する、実施形態85〜87のいずれかに記載の方法。
８９．個体におけるシナプス数が、ある期間にわたって反復して測定され、個体におけるシナプスの喪失が経時的に検出される、実施形態85〜88のいずれかに記載の方法。
９０．経時的なシナプスの喪失が、神経変性疾患又は自己免疫疾患に対する治療の有効性についての尺度である、実施形態89に記載の方法。
９１．生物学的試料におけるシナプスを検出する方法であって、
a)生物学的試料を実施形態1〜59のいずれかに記載の抗体と接触させるステップ、及びb)シナプスに結合した抗体を検出し、それによって生物学的試料におけるシナプスを検出するステップ
を含む、方法。
９２．ステップa)の前に、個体から生物学的試料を得るステップをさらに含む、実施形態91に記載の方法。
９３．生物学的試料が、生検標本、組織又は細胞を含む、実施形態91又は92に記載の方法。
９４．抗体が、免疫蛍光顕微鏡法、免疫細胞化学、免疫組織化学、ELISA、FACS分析又は免疫沈降によって検出される、実施形態91〜93のいずれかに記載の方法。
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。開示全体での全ての引用文献は、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
[実施例]
[実施例1]
抗C1q抗体の生成
抗C1q抗体M1は、標準的なマウスの免疫化及びハイブリドーマスクリーニング技術を用いて、ヒトC1qでC1qノックアウトマウスを免疫することによりAntibody Solutions Inc.(Sunnyvale CA)によって生成された(Milstein, C (1999). Bioessays 21: 966-73、Mark Page, Robin Thorpe, The Protein Protocols Handbook 2002, Editors: John M. Walker, pp 1111-1113)。
抗C1q抗体1C7、2A1、3A2及び5A3は、ヒト血漿から精製されたヒトC1qタンパク質でマウスを免疫することによって、ImmunoPrecise Ltd (Victoria、BC Canada)にて生成された(Complement Technology Inc. Tyler Texas、Cat #A-099)。簡単には、雌性BALB/cマウスを0日目に完全フロイントアジュバント(CFA)中のタンパク質25μgで腹腔内に注射し、追加免疫を21、42、52日目に不完全フロイントアジュバント(IFA)中のC1q酵素25μgを用いて行い、最終の静脈内追加免疫を63日目に行った。最後の追加免疫から4日後にマウスを安楽死させ、脾臓を取り出し、脾細胞を骨髄腫細胞株SP2/0と融合させた。融合細胞を10〜12日間、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン(HAT)選択的半固体培地上で増殖させ、得られたハイブリドーマクローンを96ウェル組織培養プレートに移し、抗体力価が高くなるまでHAT培地で増殖させた。クローンの抗体に富んだ上清を単離し、C1qとの反応性についてELISAアッセイで試験した。陽性クローンをアイソタイプ決定し、(HAT選択後)32日間培養して、安定に発現するクローンを同定した。
抗C1q抗体M1を産生し、マウスハイブリドーマC1q-M1 7788-1(M)051613と呼ばれるハイブリドーマ細胞株は、ATCC受託番号PTA-120399を有し、2013年6月6日にATCCに寄託された。M1はヒト及びマウスのC1qに特異的に結合し、補体が媒介する溶血などのC1qの生物学的機能を中和することが示された(例えば、実施例3を参照されたい)。
[実施例2]
抗C1q抗体はC1qに特異的に結合する
ELISAスクリーニング
抗C1q抗体1C7、2A1、3A2及び5A3は、標準的なELISAプロトコールを用いて、C1q結合についてスクリーニングされた。
簡単に述べると、アッセイが行われる前日に、96ウェルマイクロタイタープレートを一晩4℃で100μL/ウェルの炭酸塩被覆緩衝液pH9.6中の0.2μg/ウェルのC1q酵素抗原で被覆した。対照ウェルをヒトトランスフェリンで被覆した。次に、プレートを室温で1時間、PBS中の3％粉乳でブロッキングした。次に、ハイブリドーマ組織培養上清を、振盪しながら37℃で1時間、100μL/ウェルで播種した。二次抗体(1:10,000ヤギ抗マウスIgG/IgM(H+L)-HRP)を振盪しながら室温で1.5時間、100μL/ウェルで適用した。TMB基質を暗所にて室温で5分間、50μL/ウェルで添加した。反応を50μL/ウェルの1M HClで停止させ、吸光度の読み取りを450nmの波長で行った。
抗C1q抗体1C7、2A1、3A2及び5A3を含む4つのハイブリドーマ上清をヒトC1qへの結合について試験した(図1)。ELISAによれば、4つ全ての上清は、ヒトC1qの存在下で強力な結合シグナルを示し、一方、ヒトトランスフェリンを含む対照ウェルではバックグラウンドシグナルだけが観察された。この実験は、抗C1q抗体1C7、2A1、3A2及び5A3がヒトC1qに特異的に結合することを実証した。
動態分析
ヒト及びマウスのC1qタンパク質との全長抗C1q抗体M1の相互作用は、最初に、動態モードで測定され、その後、熱力学的解離定数を算出した。さらに、M1結合データは、参照抗体4A4B11を用いて得られた対応データと比較した。4A4B11は、米国特許第4,595,654号に記載されている。4A4B11を産生するハイブリドーマ細胞株はATCC(ATCC HB-8327TM)から入手可能である。
C1q-抗体の相互作用は、標準的なプロトコール及び製造業者の指示に従って、OCTET(商標)システムを用いて測定された。簡単に言うと、ヒト及びマウスのC1qタンパク質を、3つの濃度(3nM、1.0nM及び0.33nM)でバイオセンサー上で別々に固定化した。次に、抗C1q抗体M1は、2.0μg/mlの濃度でC1q被覆されたバイオセンサー上に注入され、抗C1q抗体M1と4A4B11についての結合定数(kon)及び解離定数(koff)を測定した。データは非線形回帰分析によって適合させ、オクテットデータ分析ソフトウェアを用いて、それぞれヒト及びマウスC1qとのM1及び4A4B11の相互作用について親和性(KD)と動態パラメータ(kon/off)を得た(表Bを参照されたい)。
Figure 0006653009
この実験シリーズにおいて、抗C1q抗体M1は、非常に高い親和性(KD<10-10M)でヒトとマウスのC1qタンパク質の両方に結合することが示された。比較すると、参照抗体4A4B11はヒトC1qに結合することが見出され、一方、マウスC1qへの結合は検出できなかった。ヒトC1qに対するM1及び4A4B11の親和性は同じ桁の大きさであったが(すなわち、二桁のピコモル範囲、KD約10〜30pM)、マウスC1qに対するM1の親和性(KD約30pM)は、マウスC1qに対する4A4B11の親和性(KD約40nM)よりも約4桁高い大きさであることが判明した。
抗C1q抗体M1及び4A4B11はC1q結合について競合しない
ブロッキング実験は、抗C1q抗体M1と4A4B11がヒトC1qの同じ若しくは重複するエピトープに結合するかどうか又はM1と4A4B11が別々のC1qエピトープに結合するかどうかを決定するために行われた。
この目的のため、M1をバイオセンサーチップ(BIACORE(商標))上に被覆し、その後、ヒトC1qとM1の組合せ、ヒトC1qと4A4B11の組合せ、又はヒトC1q単独と接触させた。M1へのC1q結合を10分間追跡し、M1-C1q複合体の解離は、その後20分間追跡した。相対的結合シグナルを結合及び解離期間の終了時に記録した。表Cはこれらの実験の結果を示す。
Figure 0006653009
C1q単独はバイオセンサーチップ上の固定化されたM1抗体に効果的に結合することが見出された。可溶性M1抗体とのC1qのプレインキュベーションは、得られたM1-C1q複合体の固定化されたM1への全ての結合を防いだ。対照的に、4A4B11とのC1qのプレインキュベーションは、得られた4A4B11-C1q複合体と固定化されたM1との相互作用を防がなかった。C1qだけを伴う結合実験と比較して、4A4B11-C1q複合体を伴う結合実験において観察された相対的により大きな結合シグナルは、相対的な結合シグナルが可溶性結合パートナーの分子量と相関し、4A4B11-C1q複合体がC1q単独よりも高い分子量を有するという事実に起因する。
これらの結果は、4A4B11がC1q結合に関してM1と競合しないことを実証する。したがって、4A4B11及びM1は、C1q上の別々のエピトープを認識し得る。
[実施例3]
抗C1q抗体は補体が媒介する溶血を阻害する
抗C1q抗体は、C1qを中和し、下流の補体カスケードのその活性化をブロックする能力について、ヒト及びげっ歯類の溶血アッセイ(CH50)で試験された。本質的にはCurrent Protocols in Immunology (1994) Supplement 9 Unit 13.1に記載されているようにCH50アッセイを行った。簡単には、5マイクロリットル(μl)のヒト血清(Cedarlane、Burlington、NC)、0.625μlのウィスターラット血清又は2.5μlのC57Bl/6マウス血清は、50μlのGVB緩衝液(Cedarlane、Burlington、NC)で希釈して、GVB緩衝液で希釈された50μlのモノクローナル抗体(1μg)に添加した。抗体:血清混合物を氷上で30分間プレインキュベートし、次に、ラットとヒトのアッセイについて100μlのEA細胞(2×108/ml)に添加し、マウスのアッセイについて4×107/mlに添加した。EA細胞は、Alsever'sのヒツジ血液(Cedarlane Cat #CL2581)と溶血素(Cedalane Cat #CL9000)を使用して、Current Protocolsにおいて指定されているように正確に生成された。EA細胞、血清及び抗体混合物を37℃で30分間インキュベートし、次に氷上に置いた。次に、1.2mlの0.15M NaClを混合物に添加し、試料のOD412を分光光度計で読み取り、細胞溶解の量を決定した。試験抗体の阻害率は、対照マウスIgG1抗体(Abcam ab18447)と比較して決定された。
C1活性及び潜在的なC1阻害の評価についてより高い感受性を提供するために、ヒト血清由来のC1複合体の限定的な量を提供する、修飾されたCH50アッセイ(C1F溶血アッセイとも呼ばれる)を実施した。簡単に説明すると、アッセイを次のように行った。最初に、3×107個のヒツジ赤血球(RBC)を抗ヒツジRBC IgM抗体とともにインキュベートし、活性化された赤血球(EA細胞)を生じさせた。次に、EA細胞を精製したC4bタンパク質とともにインキュベートし、EAC4b細胞を作製した。その後、抗C1qと対照マウスIgG抗体あり又はなしでプレインキュベートした、希釈(1:1000〜1:10000)された正常ヒト血清(NHS)とともにEAC4b細胞をインキュベートし、ヒトC1の限定的な量を提供した。次に、得られたEAC14細胞を精製したヒトC2タンパク質とともにインキュベートし、EAC14b2a細胞を生じさせた。最後に、モルモット血清をEDTA緩衝液に添加し、30分間37℃でインキュベートした。細胞溶解を450nmの波長にて分光光度計で測定した。
最初に、4つのC1q結合抗体(1C7、2A1、3A2及び5A3)を単一濃度(1μg)でヒトCH50アッセイにおいて試験した(図2)。4つ全ての抗体は、溶血を阻害することが見出された。抗C1q抗体1C7は90％を超えて溶血を阻害し、2A1は40％を超えて溶血を阻害し、3A2は60％を超えて溶血を阻害し、5A3は50％を超えて溶血を阻害した。
次に、抗C1q抗体1C7及び3A2を用量-応答形式でヒトCH50溶血アッセイにおいて試験した(図3)。抗C1q抗体4A4B11を参照として使用した。1C7と3A2抗体の両方は、用量依存的にCH50溶血を阻害した。約100ngの1C7抗体と約200ngの3A2は、観察された溶血の50％を阻害するのに必要とされた(図3)。
抗C1q抗体M1は、ヒト、マウス及びラットCH50アッセイにおいてそのC1q中和活性について試験した(図4A〜C)。用量応答の形式で試験を行った。抗C1q抗体4A4B11を参照として使用した。M1は、ヒト、マウス及びラットCH50溶血アッセイにおいて用量依存的にC1q活性を中和することが実証された(図4A〜4C)。対照的に、4A4B11は、ヒトCH50アッセイにおいてのみC1q活性を中和することが見出され、一方、参照抗体は、マウス及びラットCH50溶血アッセイにおいて(2μgまで)不活性であった。ヒト及びラットCH50溶血アッセイにおいて、M1は90％を超えて100％まで溶血を阻害した(図4A及び4C)。マウスのアッセイにおいて、M1は50％を超えて溶血を阻害した(図4B)。ヒトCH50アッセイにおいて、125ng未満のM1が、溶血の50％阻害を達成するために必要とされた。マウスCH50アッセイにおいて、約500ngのM1が、溶血の50％阻害を達成するために必要とされた。ラットCH50アッセイにおいて、16ng未満が、溶血の50％阻害を達成するために必要とされた。
[実施例4]
抗体4A4B11及びM1についてのエピトープマッピング
エピトープの性質(すなわち、直線状又は立体構造)を決定するために、C1q抗原のタンパク質分解によって生成された非構造化ペプチドによる、C1Qタンパク質と抗体4A4B11(ANN-001)及びM1(ANN-005)との間の相互作用の阻害を評価した。この抗原の完全なタンパク質分解によって生成されたペプチドが抗体上の抗原の結合を阻害することができる場合は、相互作用は立体構造に基づかず、エピトープは直線状である。抗原の完全なタンパク質分解によって生成されたペプチドが抗体4A4B11とM1上の抗原の結合を阻害することができない場合は、立体構造が相互作用に必要である。以下に詳細に記載されたデータに基づくと、天然のC1qの消化によって生成された非構造化ペプチドは、4A4B11(ANN-001)及びM1(ANN-005)抗体への結合に対してインタクトC1qと競合しなかった(図2を参照されたい)。これは、これらの抗体に対するC1qエピトープが複雑な立体構造エピトープであることを示唆している。
C1Q抗原上のANN-001及びANN-005に結合する立体構造的C1qエピトープの主要な残基を高分解能で決定するために、重水素化架橋剤とともに抗体/抗原複合体をインキュベートし、多酵素的タンパク質分解的切断に供した。架橋されたペプチドを濃縮した後、高分解能質量分析(nLC-Orbitrap MS)によって試料を分析し、生じたデータをXQuestソフトウェアを用いて分析した。以下に記載されている分析は、抗体4A4B11(ANN-001)が、ヒトC1QAのアミノ酸S202とK219、及びヒトC1QCのY225を含むエピトープに結合し、抗体M1(ANN-005)が、ヒトC1QAのアミノ酸K219及びヒトC1QCのS185を含むエピトープに結合することを示す。以下に示されるヒト及びマウスC1qAとC1qCのアミノ酸配列アラインメントを参照されたい。
ヒト及びマウスC1qAのアミノ酸配列アラインメント
MEGPRGWLVLCVLAISLASMVTEDLCRAPDGKKGEAGRPGRRGRPGLKGEQGEPGAPGIR ヒト
METSQGWLVACVLTMTLVWTVAEDVCRAPNGKDGAPGNPGRPGRPGLKGERGEPGAAGIR マウス
** .:**** ***:::*. *:**:****:**.* .*.*** ********:*****.***
TGIQGLKGDQGEPGPSGNPGKVGYPGPSGPLGARGIPGIKGTKGSPGNIKDQPRPAFSAI ヒト
TGIRGFKGDPGESGPPGKPGNVGLPGPSGPLGDSGPQGLKGVKGNPGNIRDQPRPAFSAI マウス
***:*:*** **.**.*:**:** ******** * *:**.**.****:**********
RRNPPMGGNVVIFDTVITNQEEPYQNHSGRFVCTVPGYYYFTFQVLSQWEICLSIVSSSR ヒト
RQNPMTLGNVVIFDKVLTNQESPYQNHTGRFICAVPGFYYFNFQVISKWDLCLFIKSSSG マウス
*:** *******.*:****.*****:***:*:***:***.***:*:*::** * ***
GQVRRSLGFCDTTNKGLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHIYQGSEADSVFSGFL ヒト
GQPRDSLSFSNTNNKGLFQVLAGGTVLQLRRGDEVWIEKDPAKGRIYQGTEADSIFSGFL マウス
** * **.*.:*.*******::** ****::**:**:**** **:****:****:*****
IFPSA ヒト (配列番号1)
IFPSA マウス (配列番号14)
*****
ヒト及びマウスC1qCのアミノ酸配列アラインメント
MDVGPSSLPHLGLKLLLLLLLLP-LRGQANTGCYGIPGMPGLPGAPGKDGYDGLPGPKGE ヒト
MVVGPSCQPPCGLCLLLLFLLALPLRSQASAGCYGIPGMPGMPGAPGKDGHDGLQGPKGE マウス
* ****. ** ** ****:** **.**.:**********:********:*** *****
PGIPAIPGIRGPKGQKGEPGLPGHPGKNGPMGPPGMPGVPGPMGIPGEPGEEGRYKQKFQ ヒト
PGIPAVPGTRGPKGQKGEPGMPGHRGKNGPRGTSGLPGDPGPRGPPGEPGVEGRYKQKHQ マウス
*****:** ***********:*** ***** * *:** *** * ***** ******* *
SVFTVTRQTHQPPAPNSLIRFNAVLTNPQGDYDTSTGKFTCKVPGLYYFVYHASHTANLC ヒト
SVFTVTRQTTQYPEANALVRFNSVVTNPQGHYNPSTGKFTCEVPGLYYFVYYTSHTANLC マウス
********* * * .*:*:***:*:*****.*:.*******:*********::*******
VLLYRSGVKVVTFCGHTSKTNQVNSGGVLLRLQVGEEVWLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSG ヒト
VHLNLNLARVASFCDHMFNSKQVSSGGVLLRLQRGDEVWLSVNDYNGMVGIEGSNSVFSG マウス
* * . .:*.:**.* :::**.********* *;****;**** .****:**:*****
FLLFPD ヒト (配列番号3)
FLLFPD マウス (配列番号15)
******
1.質量分析によるC1q/抗体複合体の同定
C1q/抗体複合体は、C1q抗原と抗体の等モル溶液(それぞれ5μl中に4μM)を混合することによって生成された。得られた混合物の1μlを、アセトニトリル/水(1:1、v/v)中の再結晶化されたシナピン酸マトリックス(10mg/ml)、0.1％TFA(K200 MALDIキット)で構成されたマトリックスの1μlと混合した。混合した後、各試料の1μlをMALDIプレート(SCOUT384)上にスポットした。室温で結晶化した後、プレートをMALDI質量分析計に導入し、直ちに分析した。分析を三連で繰り返した。図5は、C1q/4A4B11(図5A)とC1q/M1(図5B)に関する、抗原、抗体及び抗原/抗体複合体の存在を示す。ピークは、単量体抗体(約150kDa)とC1q単量体(約460kDa)の予測された分子量で存在し、約615kDaで存在する抗体:抗原の1:1複合体がある。
2.タンパク質分解によって生成された非構造化C1qペプチドは抗体へのC1qの結合に関して競合しない
C1q/抗体複合体がペプチドと競合することができたかどうかを決定するために、C1q抗原を固定化ペプシンで消化した。10μMの濃度の抗原25μlを固定化ペプシン5μMと混合し、室温で30分間インキュベートした。インキュベーション時間後、試料を遠心分離し、上清をピペットで移した。タンパク質分解の完了は、線形モードで高質量MALDI質量分析によって調節された。ペプシンのタンパク質分解は、1000〜3500Daの範囲の大量のペプチドを得るために最適化された。次に、タンパク質分解によって生成された抗原ペプチド5μlをANN-001又はANN-005(8μM)5μlと混合し、37℃で6時間インキュベートした。C1Q抗原ペプチドを伴うANN-001又はANN-005のインキュベーション後、混合物5μlをC1Q抗原5μl(4μM)と混合し、それにより、最終混合物は2μM/2μM/2.5μMのC1Q抗原/4A4B11又はM1/C1Q抗原ペプチドを含んだ。
MALDI TOF MS分析は、標準的な窒素レーザーでCovalXのHM3相互作用モジュールを使用し、0〜2000kDaの異なる質量範囲に着目して行われた。分析のために、以下のパラメータが適用された。質量分析計について:線形とポジティブモード、イオン源1:20kV、イオン源2:17kV、イオン抽出パルス:400ns、HM3について:ゲイン電圧:3.14kV、ゲイン電圧:3.14kV、加速電圧:20kV。
装置を較正するために、インスリン、BSA及びIgGのクラスタを用いた外部較正を適用した。各試料について、3スポットを分析した(スポットあたり300レーザーショット)。示されたスペクトルは、300レーザーショットの合計に対応する。MSデータは、Complex Tracker分析ソフトウェア バージョン2.0(CovalX Inc.)を用いて分析された。
結果を図6に示し、C1qペプチドが、モノクローナル抗体ANN-005(M1)に結合するためにインタクトC1qと競合しないことを実証する。
3.ANN-001及びANN-005へのC1q結合用の立体構造エピトープの同定
化学的架橋、高質量MALDI質量分析及びnLC-オービトラップ質量分析を用いて、抗原C1Qと2つのモノクローナル抗体ANN-001及びANN-005との間の相互作用インターフェイスを特徴付けた。最終濃度が2μM/2μMの抗体/抗原混合物を得るために、5μlの試料C1Q抗原(濃度4μM)を5μlの試料ANN-001(濃度4μM)又はANN-005(濃度4μM)と混合した。混合物を37℃で180分間インキュベートした。第1のステップにおいて、1mgのジスクシンイミジルスベレートH12(DSS-H12)架橋剤を1mgのジスクシンイミジルスベレートD12(DSS-D12)架橋剤と混合した。DSS H12/D12の2mg/ml溶液を得るために、2mgの調製物を1mlのDMFと混合した。先に調製された10μlの抗体/抗原混合物を、調製された架橋剤d0/d12(2mg/ml)の溶液1μlと混合した。架橋反応を達成するために、溶液を室温で180分間インキュベートした。タンパク質分解を促進するために、このタンパク質に存在する結合したジスルフィドを減らす必要があった。架橋された試料を20μlの重炭酸アンモニウム(25mM、pH8.3)と混合した。混合した後、2.5μlのDTT(500mM)を溶液に添加する。次に、混合物を55℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、2.5μlのヨードアセトアミド(1M)を添加し、その後、暗室内で室温にて1時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、タンパク質分解のために使用される120μlの緩衝液を添加することによって溶液を1/5に希釈した。145μlの還元/アルキル化された架橋試料を2μlのトリプシン(Sigma、T6567)と混合した。タンパク質分解混合物を37℃で一晩インキュベートした。キモトリプシンタンパク質分解について、タンパク質分解の緩衝液は100mMのTris-HCL、10mMのCaCl2、pH7.8であった。145μlの還元/アルキル化された架橋複合体を2μlのα-キモトリプシン200μMと混合し、30℃で一晩インキュベートした。この分析について、オービトラップ質量分析と組み合わせてnLCを使用した。架橋剤ペプチドは、Xquest バージョン2.0及びstavroxソフトウェアを用いて分析された。同定されたペプチドと架橋されたアミノ酸を以下の表Dに示す。
Figure 0006653009
4.抗体M1の軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列
標準的な技術を用いて、抗体M1の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインをコードする核酸及びアミノ酸配列を決定した。
抗体M1の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSINKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK(配列番号4)である。軽鎖可変ドメインの超可変領域(HVR)を太字で、下線のある文字列で示す。いくつかの実施形態において、M1軽鎖可変ドメインのHVR-L1は配列RASKSINKYLA(配列番号5)を有し、M1軽鎖可変ドメインのHVR-L2は配列SGSTLQS(配列番号6)を有し、M1軽鎖可変ドメインのHVR-L3は配列QQHNEYPLT(配列番号7)を有する。
抗体M1の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKSSGYHFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIHPNSGSINYNEKFESKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAGERDSTEVLPMDYWGQGTSVTVSS(配列番号8)である。重鎖可変ドメインの超可変領域(HVR)を太字で、下線のある文字列で示す。いくつかの実施形態において、M1重鎖可変ドメインのHVR-H1は配列GYHFTSYWMH(配列番号9)を有し、M1重鎖可変ドメインのHVR-H2は配列VIHPNSGSINYNEKFES(配列番号10)を有し、M1重鎖可変ドメインのHVR-H3は配列ERDSTEVLPMDY(配列番号11)を有する。
軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、
GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAACAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAACATAATGAATACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(配列番号12)
であると決定した。重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGTCTTCTGGCTACCATTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGTGATTCATCCTAATAGTGGTAGTATTAACTACAATGAGAAGTTCGAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCGGCGGTCTATTATTGTGCAGGAGAGAGAGATTCTACGGAGGTTCTCCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(配列番号13)
であると決定した。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例により幾分詳細に説明してあるが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書において引用されている全ての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が明確に組み込まれる。
材料の寄託
以下の材料は、American Type Culture Collection、ATCC Patent Depository、10801 University Blvd.、Manassas、Va. 20110-2209、USA (ATCC)においてブダペスト条約に従って寄託された。
Figure 0006653009
M1抗体を産生するハイブリドーマ細胞株(マウスハイブリドーマC1qM1 7788-1(M) 051613)は、培養物へのアクセスが特許出願の係属中及び30年間、又は最新の請求後5年間、又は特許の有効期間(いずれか長いほうの期間)の間に利用可能であることを保証するという条件下でATCCに寄託された。寄託物がその期間中に生育不能になった場合には、寄託物は取り替えられる。寄託物は、本出願の対応物又はその後継出願が出願された国の外国特許法で要求される場合に入手可能である。しかしながら、寄託物の利用可能性は、行政措置によって承認された特許権に反して、本発明を実施するライセンスを構成するものではないことを理解すべきである。

Claims (26)

  1. 軽鎖可変ドメインを含む軽鎖及び重鎖可変ドメインを含む重鎖を含む抗C1q抗体を含む、補体活性化に関連する疾患の治療又は予防のための組成物であって、
    （i）軽鎖可変ドメインが、配列番号5のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号6のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、かつ
    （ii）重鎖可変ドメインが、配列番号9のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、上記組成物。
  2. 前記抗体が、配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記抗体が、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、請求項1又は2に記載の組成物。
  4. 前記抗体がマウス抗体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記抗体がヒト化又はキメラ抗体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記抗体が、脳透過性を増加させるように操作されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記抗体が、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 第1の抗原がC1qタンパク質であり、第2の抗原が血液脳関門を横断する輸送を促進する抗原である、請求項8に記載の組成物。
  10. 第2の抗原が、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、angiopepペプチド並びにANG1005からなる群から選択される、請求項8又は9に記載の組成物。
  11. 前記抗体がIgGクラスのものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプを有する、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記抗体が抗体断片である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記抗体が、Fab、F(ab')2又はFab'断片である、請求項13に記載の組成物。
  15. 前記抗体が、C1qに特異的に結合し、C1qの生物学的活性を中和する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記生物学的活性が、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球形C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)ベータ-アミロイドへのC1q結合又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合である、請求項15に記載の組成物。
  17. 前記生物学的活性が、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である、請求項15又は16に記載の組成物。
  18. 補体活性化に関連する疾患が神経変性障害である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 神経変性障害が、シナプスの喪失又は神経接合部喪失に関連する、請求項18に記載の組成物。
  20. 神経変性障害が、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する、請求項18又は19に記載の組成物。
  21. 神経変性障害が、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 神経変性障害が、ミクログリアによるシナプス食作用に関連する、請求項18〜21のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 神経変性障害が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋緊張性ジストロフィー、ダウン症候群、パーキンソン病及びハンチントン病からなる群から選択される、請求項18〜22のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 補体活性化に関連する疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 炎症性疾患、自己免疫疾患又は代謝性障害が、糖尿病、肥満、関節リウマチ(RA)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、虚血及び再灌流後の遠隔組織傷害、心肺バイパス手術中の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎とその結果生じる糸球体腎炎及び血管炎、心肺バイパス、心臓麻痺に誘発される冠動脈内皮機能障害、II型膜性増殖性糸球体腎炎、IgA腎症、急性腎不全、寒冷グロブリン血症、抗リン脂質症候群、黄斑変性疾患、加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、虚血関連網膜症、眼内炎、眼内新生血管疾患、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル-リンダウ病、眼のヒストプラスマ症、視神経脊髄炎(NMO)、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、角膜血管新生、網膜血管新生、アロ移植、超急性拒絶反応、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群(COPD)、喘息並びに誤嚥性肺炎からなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
  26. 補体活性化に関連する疾患が、重症筋無力症、1型真性糖尿病、橋本甲状腺炎、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫性溶血性貧血、腫瘍随伴症候群、血管炎病、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫疾患である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
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