JP6648348B1

JP6648348B1 - Ｉ型アレルギー用組成物

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Publication number: JP6648348B1
Application number: JP2019545831A
Authority: JP
Inventors: 杉山　政則; 政則杉山
Original assignee: Sone Farm Co Ltd
Current assignee: Sone Farm Co Ltd
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: US20210154246A1; JPWO2019208149A1; WO2019208149A1; EP3714702A1; TWI746955B; KR102368626B1; AU2019260951C1; CA3085995A1; KR20200092951A; CA3085995C; AU2019260951A1; EP3714702A4; CN111565582A; AU2019260951B2; TW201945016A

Abstract

ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含有する組成物は、I型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特に、アナフィラキシーの予防もしくは改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。

Description

本発明はI型アレルギー用組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするI型アレルギー、特にアナフィラキシーの予防又は改善のための組成物に関する。

近年、食生活の変化、大気汚染の悪化、アレルゲン物質、金属性装飾物への曝露などの様々な原因により、花粉症やアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などのアレルギーの著しい増加が指摘されている。アレルギーは免疫反応に基づく生体に対する全身的又は局所的な障害とされている。そして、アレルギーには、血中抗体による液性免疫反応に基づくI、II及びIII型アレルギーと、感作リンパ球による細胞性免疫反応に基づくIV型アレルギーに大別される。I型アレルギーは、花粉などの抗原の体内への侵入に対して抗原提示細胞がT細胞の分化に偏りを起こし、B細胞によるIgE抗体産生が誘導されることが起因とされている。アナフィラキシーは、I型アレルギーに分類される全身性疾患であり、時に生命を脅かすようなショック状態（アナフィラキシーショック）に陥ることがあるものである。

このようなアレルギーに対して用いられる薬物としては、抗ヒスタミン剤、ステロイド薬などがある。しかしながら、これらの薬物は種々の副作用を示すことが指摘されていて、必ずしも安全とはいえない。

こうした状況のなか、近年では、免疫反応に関与し抗アレルギー作用を有する乳酸菌が安全性の高い抗アレルギー素材として注目されている。例えば、ラクトバチルス・ブレビスなどのIgE抗体産生を抑制する乳酸菌（特許文献１）、ヒスタミン遊離抑制効果を有するラクトバチルス・ロイテリ（AD0002株）の乳酸菌（特許文献２）、腸管免疫又はI型ヘルパーT細胞を賦活するエンテロコッカス・フェシウム乳酸菌（特許文献３及び４）、Th1免疫増強作用とTh2免疫抑制作用を有するラクトバチルス・パラカゼイKW3110株の乳酸菌（非特許文献１）などが提案されている。

特開平０９−２９５９号公報特開２０００−９５６９７号公報特開２００６−６７８８１号公報特開２００６−１０４１０７号公報

International archives of allergy and immunology 2004; 135:205-215

このような背景技術下においては、乳酸菌を有効成分とする新たな抗アレルギー用組成物の開発が望まれている。したがって、本発明は、I型アレルギー、特にアナフィラキシーの予防もしくは改善に有効な、乳酸菌を有効成分とする新たな組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、本発明は、I型アレルギー、特にアナフィラキシーの予防もしくは改善のための新たな組成物を開発することを目的として鋭意検討した結果、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌が、マウス能動的皮膚アナフィラキシーに対する抑制作用を有し、I型アレルギー、特にアナフィラキシーを予防もしくは改善する作用があることを見出し、この知見に基づき更に研究を重ねて本発明を完成した。

本発明の一つの局面では、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするI型アレルギーの予防又は改善のための組成物に関する。
本発明の組成物は、アナフィラキシーの予防又は改善のために好ましく使用することができる。
本発明の組成物においては、乳酸菌はイチジク由来の乳酸菌であるのが好ましく、特に、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌が好ましい。
本発明の組成物においては、乳酸菌の培養物若しくは発酵物は、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物が好ましい。
本発明の組成物においては、乳酸菌が産生する多糖類としては、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体、あるいは、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体が挙げられる。
本発明の組成物は飲食品組成物が好ましく、飲食品としては、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントが好ましく挙げられる。
また、本発明の組成物は、医薬組成物が好ましい。
さらには、本発明の組成物は、飼料組成物および化粧品組成物が好ましい。

本発明の組成物は、マウス能動的皮膚アナフィラキシーに対する抑制作用を有し、I型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特にアナフィラキシーの予防又は改善のために使用することができる。本発明の組成物は、アナフィラキシーなどのI型アレルギーの予防又は改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。そして、本発明の組成物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするため、安全性が高く、長期適用が可能であり、また、安価に大量供給が可能であり、その有用性及び実用性は極めて高い。

図１は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の顕微鏡写真である。図１の（Ａ）がグラム染色顕微鏡写真、（Ｂ）が走査型電子顕微鏡（SEM）写真である。図２は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の多糖類の陰イオン交換クロマトグラフィー（TOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社)）による分離プロファイルである。0 mM〜500 mM の勾配濃度のNaCl（破線）で多糖類を溶出させ、各画分中の多糖類の存在をフェノール硫酸法により490 nmでモニターした（直線）。図３は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の多糖類を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製して得られた中性多糖体を、プロトン-NMR及びカーボン-NMRに付して得られたそれぞれのNMRプロファイルを示す。図３の（Ａ）がプロトン-NMRのNMRプロファイルであり、（Ｂ）がカーボン-NMRのNMRプロファイルである。図４は、NMRプロファイルからの中性多糖体の構造解析結果を示す。この構造解析結果から、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の中性多糖体は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかとなった。図５は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の発酵液がマウス能動的に誘発させた皮膚アナフィラキシーに対して抑制作用を有することを示すグラフである。

以下、本発明で提供される、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするI型アレルギーの予防又は改善のための組成物について詳細に説明する。
１．本発明で対象とする乳酸菌
本発明で対象とする乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌であり、イチジク由来の乳酸菌が好ましい。具体的には、本発明により、イチジクの葉から単離同定されたLactobacillus paracasei IJH-SONE68株が挙げられる。この菌株は、2016年4月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-02242として国内寄託され、その後にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、2017年5月26日にNITE BP-02242として国際寄託の受託番号が付与されている。

Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株は、図１の写真に示すように、カタラーゼ陰性のグラム陽性桿菌で、かつ、白色コロニー形成性を有し、条件的ヘテロ乳酸発酵の特性を持つという菌学的性質を有する。さらには、多糖類を産生する能力を有している。

本発明では、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株と同等の乳酸菌も対象とする。ここで、同等の乳酸菌とは、Lactobacillus paracasei に属する乳酸菌であって、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株と同様に、I型アレルギー、特にアナフィラキシーを抑制する作用を有する乳酸菌を指す。これらの同等の乳酸菌は、例えば、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株に対して突然変異、遺伝子組換え等の通常の変異処理技術を行うことによって得ることができ、また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。

２．本発明の有効成分
本発明の組成物は、上記した乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含む。
乳酸菌は、通常用いられるMRS培地やその修正培地等を用いて、液体静置培養等の通常用いられる培養方法により培養することができる。乳酸菌は、パイナップル属植物の果汁又はその抽出物の存在下で培養することにより、その増殖を促進することができ（国際公開第WO2011/046194号）、また、酒粕、酒粕抽出物又は酒粕の酵素分解物の存在下で培養することによっても、その増殖を促進することができる（特開平3-172171号公報、特開平5-15366号公報及び特許第2835548号公報）。乳酸菌を培養後、得られた培養物をそのまま有効成分として用いてもよく、得られた培養液を希釈又は濃縮、粉末化して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、培養後に加熱、及び凍結乾燥等の種々の追加操作を行うこともできる。また、乳酸菌の菌体は、その細胞表層に多糖類を付着している生菌体であっても死菌体であってもよく、生菌体及び死菌体の両方であってもよい。死菌体は、破砕物であってもよいが多糖類をその表層に付着していることが望ましい。また、乳酸菌の発酵物は、通常、栄養源としてグルコースなどを用い、必要に応じて、酵母エキス、パイナップル属植物の果汁、酒粕、焼酎粕等の植物乳酸菌の増殖促進物質を更に添加して、発酵させて得ることができる。

乳酸菌が産生する多糖類は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の培養物から、通常の方法により分離精製して得ることができる。具体的には、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去し、得られた培養物から、エタノールやアセトン等を用いて多糖類を沈殿させて得ることができる。また、イオン交換クロマトグラフィーによって、さらに分離精製して得ることもできる。

本発明においては、乳酸菌が産生する多糖類としては、具体的には、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体、あるいは、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体が挙げられる。この中性多糖体は、後述する実施例２に記載するように、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の培養物から得られる多糖類を陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製することにより得ることができる。この中性多糖体は、図３に示すプロトン-NMR及びカーボン-NMRのNMRプロファイルから、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかとなった。また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株は、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体を菌体外に分泌する。より具体的には、この酸性多糖体は、グルコース、マンノース、ガラクトース及びラムノースから構成され、それらの組成比は、おおよそ10:170:2:1である。

３．本発明の組成物
本発明の組成物は、飲食品組成物、医薬組成物、飼料組成物、化粧品組成物などの各種の形態で用いることができる。

飲食品組成物の飲食品としては、特に制限されず、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料、これらの飲料の濃縮原液、調製用粉末等；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、グミ、シリアル、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子等の菓子類；加工乳、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；ピューレなどの食品；その他機能性食品等が例示される。また、飲食品は、サプリメントであってもよく、例えば、顆粒状、粉末状、タブレット状のサプリメントであってもよい。

上記のような飲食品は、飲食品の原料に乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加することにより製造することができ、あるいは通常の飲食品と同様にして製造することができる。乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類の添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行ってもよい。添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飲食品が製造されてもよい。そのような飲食品としては、乳酸菌飲料、発酵乳などの発酵食品等が挙げられる。

飲食品組成物における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、飲食品の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品組成物中に、1×10⁶〜1×10¹²cfu/g又は1×10⁶〜1×10¹²cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×10⁷〜1×10¹¹cfu/g又は1×10⁷〜1×10¹¹cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/g又はcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、飲食品組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、さらには0.01重量％以上含まれるのが好ましい。

医薬組成物は、通常、乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を、通常使用される生理的に許容される液体又は固体の製剤担体に配合し製剤化して使用される。医薬組成物の剤形は特に制限されず、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。

本発明の医薬組成物の製剤における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、剤形、用法、対象の年齢、性別、疾患の種類、疾患の程度、及びその他の条件等により適宜設定されるが、通常、1×10⁶〜1×10¹²cfu/g又は1×10⁶〜1×10¹²cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×10⁷〜1×10¹¹cfu/g又は1×10⁷〜1×10¹¹cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/g又はcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、医薬組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、0.01重量％以上含まれるのが好ましい。

本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、適用対象に応じて、適宜投与時期を選択することができる。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。投与形態は製剤形態、投与対象の年齢、性別、その他の条件、投与対象の症状の程度等に応じて適宜決定されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、いずれの場合も1日1回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に1回の投与としてもよい。

飼料組成物の飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。このような飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、乳清（ホエイ）、にがり、鉱物質飼料、酵母類等に乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を混合することにより製造することができる。また、例えば、サイレージの場合のように、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、愛玩動物等に経口的に投与することができる。また、養魚類の場合には、乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加した発酵物を養魚場に撒く方法を採用することもできる。

飼料組成物における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、飼料の態様や適用対象によって適宜設定されるが、1×10⁶〜1×10¹²cfu/g又は1×10⁶〜1×10¹²cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×10⁷〜1×10¹¹cfu/g又は1×10⁷〜1×10¹¹cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/g又はcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、飼料組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、さらには0.01重量％以上含まれるのが好ましい。

本発明の化粧品組成物の化粧品としては、例えば、石けん、ボデイーシャンプー、クレンジングクリーム、洗顔料等の洗浄料；化粧水（ローション）、バニシングクリーム、コールドクリーム、エモリエントクリーム、マッサージクリーム等のクリーム；乳液、美容液等が挙げられる。これらの化粧品に通常使用される材料に、本発明の乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加することにより、本発明の化粧品組成物を得ることができる。

本発明の化粧品組成物においては、例えば、鶏等の鳥類の卵を割卵し卵黄を分離して得た液状の卵白に本発明の乳酸菌を添加して発酵させることにより得られる乳酸菌の発酵卵白を用いるのが好ましい。このような乳酸菌の発酵は、一般的に栄養源としてグルコースなどを用い、かつ、必要に応じて、酵母エキス、パイナップル果汁、酒粕、焼酎粕等の植物乳酸菌の増殖促進物質を添加して、発酵させるのがよい。乳酸菌の発酵卵白の形態は、配合する化粧品に応じて、例えば、液状、粉末状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等が挙げられる。

本発明の化粧品組成物に用いる乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、化粧品の態様や適用対象によって適宜設定されるが、1×10⁶〜1×10¹²cfu/g又は1×10⁶〜1×10¹²cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×10⁷〜1×10¹¹cfu/g又は1×10⁷〜1×10¹¹cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/g又はcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。例えば、乳酸菌の発酵卵白の場合には、発酵卵白の含有量は、発酵卵白の乾物換算で通常0.001重量％以上、更には0.01重量％以上とするのが好ましい。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、化粧品組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、0.01重量％以上含まれるのが好ましい。

４．本発明の組成物の用途
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、マウス能動的皮膚アナフィラキシーに対する抑制作用を有し、I型アレルギー、特にアナフィラキシーを抑制する作用を有する。したがって、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、花粉アレルギ−、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、皮膚の痒み、結膜炎などのI型アレルギーの予防又は改善に用いることができる。特に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、アナフィラキシー抑制作用を有するため、食物などの経口摂取によるアナフィラキシー、薬品などによる皮膚、粘膜を介した非侵襲的曝露によるアナフィラキシ−、昆虫などに刺されるなどの侵襲的曝露によるアナフィラキシー等の予防又は改善に用いることができる。また、本発明の組成物は、I型アレルギーの予防又は改善に有効であることから、特に、健康維持や健康増進用の飲食品の素材として利用することができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１
乳酸菌の分離及び同定
１．乳酸菌サンプルの分離
イチジク(品種「とよみつ姫」)の葉、茎、および果実を選択し、殺菌済みピンセットとハサミを用いて2〜3 mmに細断片化した後、滅菌済のMRS液体培地入りの試験管に5〜6個ずつの細片を入れ、28℃および37℃にて、乳酸菌の標準培地であるMRS培地が濁る (増殖する) まで静置培養した。ちなみに、乳酸菌候補株の増殖が目視できるまでに2〜4日間を要した。
上記乳酸菌候補株の各培養液の一部をMRS寒天培地上にディスポーザブルループで線画塗菌後、静置培養を行った。寒天培地上に形成されたコロニーのうち、「色、つや、形状の異なるもの」を全てピックアップし、フレッシュなMRS寒天培地上に線画塗菌を行い、コロニーを純化した。
純化された各コロニーに対し、カタラーゼ酵素の産生の有無を検証するため、H₂O₂テストを行った。これは、10%のH₂O₂溶液に菌体を曝した際に起こる、カタラーゼが存在すれば生成する酸素の発生の有無を観察する試験法である。ちなみに、乳酸菌はカタラーゼを産生しない。
イチジクからの探索分離を試みた結果、イチジクの葉を分離源としたものから、カタラーゼ陰性を示す乳酸菌候補株を1株得ることができた。

２．分離株の同定
上記乳酸菌候補株をMRS液体培地で改めて培養し、遠心により菌体を取得した。細胞壁溶解酵素で処理した後, DNAzol試薬を使用し、ゲノムDNAを抽出した。
Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics、pp.115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester : Wileyに記載された方法にしたがって、ゲノムDNAを鋳型として、27fプライマーおよび1525rプライマーを用いたPCR反応により16S rDNA部分を増幅させ、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit（マッハライ・ナーゲル社製）により、アガロースゲルより目的断片を回収した。塩基配列決定のためのダイターミネーター法によるシークエンス反応は, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1（ThermoFisher Scientific社製）にて行い、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（ThermoFisher Scientific社製）にて解析した。解析した16S rDNAの塩基配列に対してBLAST programによる相同性検索を行い、DNA data bank（DDBJ/EMBL/GenBank）のデータベースと比較することで、分離株の分類学的同定を行った。

イチジクの葉より分離された乳酸菌候補株を、IJH-SONE68株と命名し、DNA data bank（DDBJ/EMBL/GenBank）に既に登録されている「Lactobacillus paracasei R094」の菌株で塩基配列のaccession番号が「NR_025880」である塩基配列と100%一致したため、Lactobacillus paracaseiと同定した。
この菌株は、2016年4月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-02242として国際寄託され、その後にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、2017年5月26日にNITE BP-02242として国際寄託の受託番号が付与されている。

３．分離同定された乳酸菌の菌学的性質
分離同定された上記乳酸菌IJH-SONE68株は、図１の写真に示すように, カタラーゼ陰性のグラム陽性桿菌で、かつ、白色コロニー形成性を有し、条件的ヘテロ乳酸発酵の特性を有するとともに、多糖類を産生する能力を有していた。

４．分離同定された乳酸菌の糖類の資化能力
（１）資化能力の試験方法
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力について以下の試験方法により調べた。
IJH-SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。遠心して得られた菌体を適量のsuspension medium (ビオメリュー社製) で洗浄した後、最終的に2 mLのsuspension mediumに懸濁した。この一部を、5 mLのsuspension mediumに加えてマクファーランド濁度が2になる量 (n) を求めた。続いて、API 50 CHL培地 (ビオメリュー社製) に2nの菌液を添加し、これをAPI 50 CHLキット (ビオメリュー社製、各ウェルの底にはそれぞれ49種類の糖が塗り付けられている) の各ウェルへ分注した。最後にミネラルオイルを重層し、滅菌水を入れたトレイにセットした。37℃で48時間培養した後に、各ウェルにおける色調の変化を観察することで、資化能の有無の判定を行った。

５．資化能力の試験結果
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力を調べた結果は、表１に示したとおりである。

実施例２
１．IJH−SONE68株が産生する多糖類の分離精製
IJH−SONE68株が産生する多糖類を以下の方法で分離精製した。
IJH−SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。この培養液5 mLを種培養液とし、5 Lの多糖類産生用半合成培地 (その組成は後述する) に植菌した後、37℃で120時間静置培養した。培養液を4℃に冷却した後、培養液上清中に含まれるタンパク質を変性させて、後のステップで沈殿として除去するために、202.5 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加え、混和した後に30分間静置した。遠心によって沈殿を取り除き、回収した上清に等量のアセトンを加えて混和した後、4℃で一晩静置させることによって、IJH−SONE68株が産生する多糖体を沈殿させた。沈殿物を遠心によって回収した後、250 mLの70%エタノールで沈殿物の洗浄を行った。沈殿物を風乾させた後、75 mLの50 mM Tris−HCl buffer (pH 8.0) を加えて1時間混和することで、沈殿物を溶解させた。遠心によって不溶性の夾雑物を取り除いた後、回収した上清に対し、それぞれ750 μLの1 mg/mL DNase溶液 (Worthington社) および1 mg/mL RNase溶液 (ナカライテスク社) を加え、37℃で8時間反応させた。続いて750 μLの2 mg/mL proteinase K溶液 (和光純薬工業社製) を加え、37℃で16時間反応させた。反応後の溶液を4℃に冷却した後、添加した各酵素を変性させ、次の遠心で沈殿として除去するために、8.75 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加えて混和し、4℃で1時間静置した。遠心によって沈殿物を取り除き、得られた上清に対し262.5 mLの100%エタノールを加え、しっかりと混和した後、遠心によってIJH−SONE68株が産生する多糖類を沈殿物として回収した。50 mLの70%エタノールで沈殿物を洗浄した後に風乾させ、適量 (約25 mL) の精製水を加えて4℃で一晩静置することで、多糖類を溶解させた。溶解後の多糖類サンプルは、10,000 MWCOの限外濾過ユニット (メルク社) を用い、溶媒を精製水に置換しながら、回収したサンプル中の単糖類などの小分子を取り除いて、精製された多糖類サンプルを得た。

精製した多糖類サンプルを、予め50 mM Tris−HCl buffer (pH 8.0) で平衡化したTOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社) を充填したオープンカラム (2.5 × 22 cm) にアプライし、中性多糖画分と酸性多糖画分に分離精製するためのカラムワークを行った。溶液は同bufferを用い、流速は1 mL/minで固定した。また、溶出液は6 mLごとに異なる試験管に回収した。まず、開始から240分までの間は同bufferで溶出させた (試験管番号1-40)。次に、240分の時点から600分の時点までは、同bufferを用いた0-500 mM NaClの濃度勾配を作り、溶出を続けた (試験管番号41-100)。カラム分離スぺクトルを図２に示す。試験管に溶出させた全てのサンプルに対し、フェノール硫酸法 (後述する) によって多糖類の存在を確認した後、該当する試験管内の溶液をそれぞれ中性多糖画分、酸性多糖画分として取りまとめた。それぞれの画分は10,000 MWCOの限外濾過ユニットを用い、溶媒を精製水に置換しながら、回収したサンプル中の単糖類などの小分子を取り除いた。
以上により、IJH−SONE68株が産生する多糖類として中性多糖画分および酸性多糖画分が分離精製された。

多糖類産生用半合成培地はKimmel SA、Roberts RF. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR. Int. J. Food Microbiol.、40、87-92 (1998) に記載された培地を以下のように改変した。

多糖類産生用半合成培地 [g/L]
Glucose 20
Tween 80 1.0
Ammonium citrate 2.0
Sodium acetate 5.0
MgSO₄・7H₂O 0.1
MnSO₄・5H₂O 0.05
K₂HPO₄ 2.0
Bacto casitone 10.0
Vitamine Soln. 2 mL
Trace element Soln. 1 mL

Vitamine Soln. [g/L]
4−aminobenzoic acid 0.05
Biotin 0.001
Folic acid 0.025
Lipoic acid 0.025
Nicotinic acid 0.1
Pantothenic acid 0.05
Pyridoxamin−HCl 0.25
Vitamine B12 0.05
Pyridoxine 0.025
Riboflavin 0.05
Thiamine 0.1

Trace element Soln.は、Kets EPW, Galinski EA, de Bont JAM. Carnitine: a novel compatible solute in Lactobacillus plantarum. Arch. Microbiol., 192, 243-248 (1994) に記載されており、その組成は以下のとおりである。

Trace element Soln. [g/L]
25% HCl 10 mL
FeCl₂・4H₂O 1.5
CoCl₂・6H₂O 0.19
MnCl₂・4H₂O 0.1
ZnCl₂0.07
H₃BO₃0.006
Na₂MoO₄・2H₂O 0.036
NiCl₂・6H₂O 0.024
CuCl₂・2H₂O 0.002

フェノ−ル硫酸法（DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances., Anal. Chem., 28, 350-356 (1956)）

30 μLの対象サンプルと等量の5 w/v %フェノール水溶液を混和した後、150 μLの濃硫酸を加えて混和させ、反応を開始させる。10分後に直ちに氷冷し、反応を停止させる。反応液の490 nmにおける吸光度を測定することで、糖類の濃度を測定した。なお、濃度の決定には、グルコースを標品として同実験を行うことで作製した検量線を用いた。

２．菌体外中性多糖体の構造解析
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（TOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社)）によって精製された中性多糖体を、プロトン-NMRおよびカーボン-NMRに付し、得られたそれぞれのNMRプロファイルを図３に示した。これらのNMRプロファイルからの中性多糖体の構造解析結果を図４に示した。
この構造解析結果から、IJH−SONE68株が産生する菌体外中性多糖体は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかになった。

３．菌体外酸性多糖の糖組成分析
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製された酸性多糖体の糖組成分析を高速液体クロマトグラフ（HPLC）法で測定することにより行った。
精製された酸性多糖体(7.3 mg/mL)10μLと水60μLを混合して7倍希釈試料溶液を調製し、試験管に調製した希釈試料溶液20μLを採取し、減圧乾固し、2 mo1/Lトリフルオロ酢酸100μLを添加して溶解し、窒素置換、減圧封管、100℃で6時間加水分解し、次いで減圧乾固した。得られた残澄に水200μLを添加して溶解し、0.22μmのフィルターでろ過して測定用試料溶液を得、測定用試料溶液を水で10倍希釈して希釈測定用試料溶液を得た。これらの測定用試料溶液および希釈測定用試料溶液50μLを分析した。分析機器として、HPLCシステム:LC-20Aシステム(株式会社島津製作所)および分光蛍光光度計M-10AxL(株式会社島津製作所)を用いた。分析条件は以下の通りであった。
カラム:TSK-gel Sugar AXG 4.6 mmI.D.×15 cm(東ソー株式会社)
カラム温度:70℃
移動相:0.5 mo1/Lホウ酸カリウム緩衝液、pH 8.7
移動相流速:0.4 mL/min
ポストカラム標識:反応試薬:l w/v%アルギニン・3 w/v%ホウ酸
反応試薬流速:0.5 mL/min
反応温度:150℃
検出波長:Ex.320 nm Em.430 nm

菌体外酸性多糖体より調製した試料のクロマトグラムおよび各単糖類の検量線データを求め、検量線より菌体外酸性多糖の構成糖の試料中濃度を求めた。得られた結果を表２に示した。

実施例３
IJH-SONE68株のマウス能動的皮膚アナフィラキシーに対する抑制作用
実施例１で得られたIJH−SONE68株の乳酸菌のマウス能動的皮膚アナフィラキシーに対する抑制作用を、次に記載される方法にしたがって調べた。

１．試験方法
（１）マウス試験用サンプルの調製
Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株を、果汁培地 (パイナップル果汁の最終濃度：50%、日本酒抽出物の最終濃度：10%) で48時間培養し、発酵液を2倍濃縮したものをマウス試験用のサンプルとした。このサンプルは、実施例２で得られたIJH−SONE68株が産生する多糖類である、中性多糖画分および酸性多糖画分を含む多糖類を約40 mg/Lの濃度で含有すると推定される。

（２）試験で用いた試薬
オボアルブミン（OVA）(Cat.A5503-5G, Grade V) およびAluminum hydroxide (Cat.239186-25G) はSIGMA-ALDRICHより、KOH、EvansBlue、リン酸, アセトンは和光純薬工業より、蒸留水および生理食塩水は株式会社大塚製薬工場より購入した。

（３）方法
動物は雄性BALB/c AnNCrlCrlj系マウス（7週齢、日本チャールス・リバー株式会社：入荷時）を用いた。マウスは、飼育ケージで1〜5匹飼いとし、温度：20〜25℃、湿度：40〜70％、換気回数：13回以上／時間、照明時間：12時間（7：00〜19：00）の環境に調節された動物飼育室で飼育し、餌は固型飼料CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）を自由摂取させた。また飲水に関しては、フィルター濾過水を自由に摂取させた。
マウス搬入後、約1週間馴化した。馴化飼育後、マウスの体重を測定し、各群の体重が均等になるように群分けを行った (A群: 水投与群; B群: IJH-SONE68株パイン果汁発酵液投与群)（A群：９匹、B群：９匹）。この時点をDay 0とし、マウスにはサンプルをDay 0から1回/日の頻度で30日間連続経口投与を行った。なお、1日あたりの投与容量は0.75 mL/匹とした。合わせて、Day 0〜30の期間, 全てのマウスに対し、週1回体重測定を行った。なお体重測定はサンプルの投与前に行った。

Day 14に、全てのマウスに対し、OA抗原溶液 (OVA 20 μg + Aluminum hydroxide 2 mg) を0.2 mL/匹の投与量で腹腔内投与した (抗原感作)。その後、Day 30にマウスの左耳介に1% OVA溶液を10 μL/匹の投与量で皮内投与し、続けて0.5% エバンスブルー溶液を0.25 mL/匹の投与量で尾静脈投与した。30分後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、死亡確認後、左右の耳介を採取した。
採取した耳介は左右別々に試験管に入れ、0.75 mLの1N KOHを加えて37℃で1晩かけて溶解した。それに0.2 Mリン酸とアセトンを5：13で混和した混合液を9.25 mL加えて振とうした。上清をマイクロプレートに移し、620 nmで吸光度を測定した。色素漏出量は左右耳介のエバンスブルー量の差として算出した。なお、データは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはWelchの方法によるｔ検定を用い、危険率（p値）が0.05未満で有意差有りと判定した。
以上の方法により、マウス能動的皮膚アナフィラキシー (ACA) に対するサンプルの抑制作用の有無を評価した。

２．試験結果
エバンスブルー色素漏出量の測定結果を表３に示した。

また、得られた結果を図５にも示した。マウス各個体より左右両耳介を回収し、左耳介から漏出した色素量の平均値を各群別に図５のグラフに示した。なお、この時、右耳介からの色素漏出量をブランクとして用いた。
表３及び図５から明らかなように、色素漏出量はコントロール群（A群：水投与群）が4.51±0.47μg/mL、サンプル投与群（B群）が2.66±0.65 μg/mLであった。コントロール群と比較して、サンプル投与群は約41%の有意な抑制作用 (p＜0.05) を示すことが確認された。以上の結果から、IJH-SONE68株パイン果汁発酵液の抗原感作前後の反復経口投与は卵白アルブミンを抗原として感作したマウスを用いたACA反応を抑制した。本サンプルは抗原抗体反応 (IgE依存性) において、抗体産生を抑制する可能性があると考えられる。

以上の詳細な説明から明らかなとおり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
[1] Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするI型アレルギーの予防又は改善のための組成物。
[2] アナフィラキシーの予防又は改善のための上記[1]に記載の組成物。
[3] 乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[1]又は[2]に記載の組成物。
[4] 乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[5] 培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[6] 多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[7] 多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[8] 組成物が飲食品組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[9] 飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[8]に記載の組成物。
[10] 組成物が医薬組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[11] 組成物が飼料組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[12] 組成物が化粧品組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[13] I型アレルギーの予防又は改善のための組成物の有効成分としてのLactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類の使用。
[14] アナフィラキシーの予防又は改善のための組成物である上記[13]に記載の使用。
[15] 乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[13]又は[14]に記載の使用。
[16] 乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[13]〜[15]のいずれかに記載の使用。
[17] 培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[18] 多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[19] 多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[20] 組成物が飲食品組成物である上記[13]〜[19]のいずれかに記載の使用。
[21] 飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[20]に記載の使用。
[22] 組成物が医薬組成物である上記[13]〜[19] のいずれかに記載の使用。
[23] 組成物が飼料組成物である上記[13]〜[19] のいずれかに記載の使用。
[24] 組成物が化粧品組成物である上記[13]〜[19] のいずれかに記載の使用。
[25] Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含む組成物を、それを必要とする対象に適用することを含む方法であって、対象においてI型アレルギーを予防又は改善する方法。
[26] アナフィラキシーを予防又は改善する上記[25]に記載の方法。
[27] 乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[25]又は[26]に記載の方法。
[28] 乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[25]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29] 培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[25]〜[28]のいずれかに記載の使用。
[30] 多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[31] 多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[32] 組成物が飲食品組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33] 飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[32]に記載の方法。
[34] 組成物が医薬組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[32] 組成物が飼料組成物である上記[25]〜[31] のいずれかに記載の方法。
[33] 組成物が化粧品組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。

以上に詳細に説明したとおり、本発明の組成物は、I型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特にアナフィラキシーの予防又は改善のために使用することができる。本発明の組成物は、アナフィラキシーなどのI型アレルギーの予防又は改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。そして、本発明の組成物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするため、安全性が高く、長期適用が可能であり、また、安価に大量供給が可能であり、その有用性及び実用性は極めて高い。

Claims

ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei） IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）である乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするアナフィラキシーの予防又は改善のための組成物。
培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、請求項１に記載の組成物。
多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である請求項１又は２に記載の組成物。
多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である請求項１又は２に記載の組成物。
組成物が飲食品組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである請求項５に記載の組成物。
組成物が医薬組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
組成物が飼料組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
組成物が化粧品組成物である請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。