JP6628970B2 - ベンゾトロポロン環含有化合物を定量する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を定量する方法に関する。
紅茶やウーロン茶などの茶飲料には、ベンゾトロポロン環を有する様々な有色化合物が含まれている。これらの化合物は紅茶重合ポリフェノール（Black Tea Polymerized Polyphenols：BTPP）などとして知られており、茶葉の発酵過程において、茶葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酵素作用により、カテキン又は没食子酸などのポリフェノール類が縮合して生成される。
ベンゾトロポロン環含有化合物は、様々な生理活性を有することが知られている。例えば、特許文献１ではベンゾトロポロン誘導体が抗炎症作用を有することが報告されており、特許文献２では、ベンゾトロポロン環含有化合物がリパーゼ阻害活性及びα−グルコシダーゼ阻害活性を有することが報告されている。また、ベンゾトロポロン環を含むエピテアフラガリン-3-O-ガレートやテアフラビンが中性脂肪吸収抑制作用を有することも報告されている（特許文献３及び４）。
従来知られているべンゾトロポロン環含有化合物の検出方法は、ポリフェノール類が有する２８０ｎｍの吸収極大を利用するものである（非特許文献１及び２）。しかしながら、当該方法では、ベンゾトロポロン環含有化合物と他のポリフェノール類をまとめて検出することになり、ベンゾトロポロン環含有化合物のみを定量することはできない。また、代表的なテアフラビン類の特定の化合物を分析する方法は知られているが、ベンゾトロポロン環含有化合物総量としてまとめて定量する簡便な方法は知られていない。
J. Agric. Food Chem., 2005, 53(11), pp.4593-4598
Nutrition, 2011, 27(3), pp.287-292
本発明は、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を、特定の化合物ごとに単離することなく、一群の化合物類としてまとめて特異的に定量する簡便な方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討した結果、液体試料をカラムで処理し、カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定することで、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を定量できることを見出した。さらに、カラム処理後の液体試料の４３７〜４６７ｎｍの吸光度も併せて測定することで、ベンゾトロポロン環含有化合物の検出特異性及び定量性を高めることができることも見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下のものに関するが、これらに限定されない。
（１）液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を定量する方法であって、
液体試料をカラムで処理する工程、及び
カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、を含む、
前記方法。
（２）カラム処理後の液体試料の４３７〜４６７ｎｍの吸光度を測定する工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）ベンゾトロポロン環含有化合物が茶重合ポリフェノールである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）茶重合ポリフェノールが紅茶重合ポリフェノール、又はウーロン茶重合ポリフェノールである、（３）に記載の方法。
（５）カラム処理工程の前に、植物原料から液体試料を抽出する工程を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）植物原料が茶葉、紅茶葉、及びウーロン茶葉からなる群より選択される、（５）に記載の方法。
（７）液体試料をカラムで処理する工程、及びカラム処理後の液体試料の吸光度を測定する工程を、高速液体クロマトグラフィーを用いて行う、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）カラムが逆相系カラムである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）逆相系カラムが、シリカゲル系樹脂を充填したものである、（８）に記載の方法。
（１０）逆相系カラムが、コアシェル型樹脂を充填したものである、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）カラム処理が、移動相に水と有機溶媒の混合溶媒を用いた、溶媒グラジエント法によるものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）移動相の有機溶媒が、メタノール、エタノール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１以上を含むものである、（１１）に記載の方法。
（１３）移動相が、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、及び過塩素酸からなる群より選択される１以上を含むものである、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法であって、
液体試料をカラムで処理する工程、
カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、及び、
ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係を利用して、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する工程、を含む、
前記方法。
（１）液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を定量する方法であって、
液体試料をカラムで処理する工程、及び
カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、を含む、
前記方法。
（２）カラム処理後の液体試料の４３７〜４６７ｎｍの吸光度を測定する工程を含む、（１）に記載の方法。
（３）ベンゾトロポロン環含有化合物が茶重合ポリフェノールである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）茶重合ポリフェノールが紅茶重合ポリフェノール、又はウーロン茶重合ポリフェノールである、（３）に記載の方法。
（５）カラム処理工程の前に、植物原料から液体試料を抽出する工程を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）植物原料が茶葉、紅茶葉、及びウーロン茶葉からなる群より選択される、（５）に記載の方法。
（７）液体試料をカラムで処理する工程、及びカラム処理後の液体試料の吸光度を測定する工程を、高速液体クロマトグラフィーを用いて行う、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）カラムが逆相系カラムである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）逆相系カラムが、シリカゲル系樹脂を充填したものである、（８）に記載の方法。
（１０）逆相系カラムが、コアシェル型樹脂を充填したものである、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）カラム処理が、移動相に水と有機溶媒の混合溶媒を用いた、溶媒グラジエント法によるものである、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）移動相の有機溶媒が、メタノール、エタノール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１以上を含むものである、（１１）に記載の方法。
（１３）移動相が、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、及び過塩素酸からなる群より選択される１以上を含むものである、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法であって、
液体試料をカラムで処理する工程、
カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、及び、
ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係を利用して、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する工程、を含む、
前記方法。
本発明では、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を、一群の化合物類として迅速かつ簡便に定量することができる。
１．測定対象
１−１．ベンゾトロポロン環含有化合物
本発明により定量される物質は、ベンゾトロポロン環含有化合物である。
１−１．ベンゾトロポロン環含有化合物
本発明により定量される物質は、ベンゾトロポロン環含有化合物である。
本明細書においてベンゾトロポロン環含有化合物とは、式（１）に示すベンゾトロポロン環骨格を分子内に有する化合物をいう。
ベンゾトロポロン環含有化合物は、分子内にベンゾトロポロン環を有するものであればよく、具体的には、テアフラビン、テアフラビン-3-O-ガレート、テアフラビン-3’-O-ガレート、テアフラビン-3,3’-O-ジガレート、テアフラバニン、テアフラバニン-3-O-ガレート、テアフラビンジガレート-トリマー1、テアフラビンジガレート-トリマー2、テアフラベートA、テアジベンゾトロポロンA、エピテアフラガリン、エピテアフラガリン-3-O-ガレート、プルプロガリン、EGCG-カテコール、3,4,6-トリヒドロキシ-1-((2R,3R)-3,5,7-トリヒドロキシクロマン-2-イル）-5H-ベンゾ［7］アヌレン-5-オン、(2R,3R)-2-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-５,７-ジヒドロキシクロマン-3-イル2,3,4,6-テトラヒドロキシ-5-オキソ-5H-ベンゾ［7］アヌレン-8-カルボキシレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ベンゾトロポロン環含有化合物としては、例えば茶重合ポリフェノール、好ましくは紅茶重合ポリフェノール、ウーロン茶重合ポリフェノールなどが挙げられる。これらのベンゾトロポロン環含有化合物は、茶葉の発酵過程において、茶葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酵素作用により、カテキン又は没食子酸などのポリフェノール類が縮合することで生成される。
１−２．液体試料
本明細書において液体試料とは、カラムで処理することができる液状のものであれば特に限定されず、例えば、天然物の処理物又は抽出物、飲食物、医薬品、化粧品などが挙げられる。好ましくは茶葉抽出物であり、特に紅茶葉抽出物又はウーロン茶葉抽出物である。
本明細書において液体試料とは、カラムで処理することができる液状のものであれば特に限定されず、例えば、天然物の処理物又は抽出物、飲食物、医薬品、化粧品などが挙げられる。好ましくは茶葉抽出物であり、特に紅茶葉抽出物又はウーロン茶葉抽出物である。
１−３．植物原料
本発明は、植物原料から液体試料を得る工程を含んでもよい。植物原料は特に限定されないが、好ましくは茶葉、より好ましくは紅茶葉、又はウーロン茶葉である。植物原料から液体試料を得る方法は特に限定されないが、例えば、植物原料を抽出処理することで液体試料を得ることができる。当該抽出工程では、植物原料として茶葉などをそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出溶媒には、水、熱水、有機溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなど）、又はこれらの混合溶媒などを用いることができるが、熱水が好ましい。
本発明は、植物原料から液体試料を得る工程を含んでもよい。植物原料は特に限定されないが、好ましくは茶葉、より好ましくは紅茶葉、又はウーロン茶葉である。植物原料から液体試料を得る方法は特に限定されないが、例えば、植物原料を抽出処理することで液体試料を得ることができる。当該抽出工程では、植物原料として茶葉などをそのまま用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。抽出溶媒には、水、熱水、有機溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなど）、又はこれらの混合溶媒などを用いることができるが、熱水が好ましい。
本明細書において紅茶葉とは、摘み取った茶葉を乾燥後に完全発酵させたものをいう。紅茶葉の産地は特に限定されないが、例えば、インド（アッサム、ダージリン、ニルギリ、ドアーズ、シッキムなど）、インドネシア（ジャワなど）、スリランカ（セイロンなど）、中国（キーマンなど）、ケニア、日本などが挙げられる。紅茶葉の品種は特に限定されないが、例えば、ケニアCTC、アッサムCTC、アッサム・ファニングス、ニルギリBOP、ジャワなどが挙げられる。また、本明細書においてウーロン茶葉とは、茶葉の発酵途中で加熱して発酵を止め、半発酵させたものをいう。ウーロン茶葉の産地は特に限定されないが、例えば、福建省武夷山、福建省安渓、広東省潮州、台湾などが挙げられる。また、ウーロン茶葉の品種も特に限定されない。
２．カラム
本発明において、液体試料を処理するカラムは特に限定されないが、逆相系カラムであることが好ましい。本明細書において「カラム処理」とは、液体試料をカラムに供し、べンゾトロポロン環含有化合物が溶出する保持時間において、当該化合物を含む画分を分離することをいう。べンゾトロポロン環含有化合物を含有する画分には、当該化合物以外の成分が含まれていなくても、含まれていてもよい。また、逆相系カラムの充填樹脂はシリカゲル系であることが好ましく、例えば、オクタデシル基が化学結合した充填剤（ODS）、ブチル基が化学結合した充填剤（C4）、オクチル基が化学結合した充填剤（C8）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ph）、C30のアルキル鎖が化学結合した充填剤（C30）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した（ODP）、逆相系合成ポリマー担体、を用いることができるが、これらカラムに限定されるわけではない。具体的には、TSKgel ODS-80TsQA（東ソー株式会社製）等が挙げられる。また、移動相にグラジエント条件を用いる場合は、溶媒の組成変化に強いカラムを用いることが好ましい。
本発明において、液体試料を処理するカラムは特に限定されないが、逆相系カラムであることが好ましい。本明細書において「カラム処理」とは、液体試料をカラムに供し、べンゾトロポロン環含有化合物が溶出する保持時間において、当該化合物を含む画分を分離することをいう。べンゾトロポロン環含有化合物を含有する画分には、当該化合物以外の成分が含まれていなくても、含まれていてもよい。また、逆相系カラムの充填樹脂はシリカゲル系であることが好ましく、例えば、オクタデシル基が化学結合した充填剤（ODS）、ブチル基が化学結合した充填剤（C4）、オクチル基が化学結合した充填剤（C8）、フェニル基が化学結合した充填剤（Ph）、C30のアルキル鎖が化学結合した充填剤（C30）、オクタデシル基が合成ポリマーに結合した（ODP）、逆相系合成ポリマー担体、を用いることができるが、これらカラムに限定されるわけではない。具体的には、TSKgel ODS-80TsQA（東ソー株式会社製）等が挙げられる。また、移動相にグラジエント条件を用いる場合は、溶媒の組成変化に強いカラムを用いることが好ましい。
本発明では、逆相系カラムの充填樹脂としてコアシェル型の樹脂を用いることができる。コアシェル型樹脂は、中心部分のノンポーラス粒子（コア）と外側部分の多孔質層（シェル）で構成される樹脂をいい、例えば、COSMOCORE 2.6 C18等が挙げられる。コアシェル型樹脂を逆相系カラムの充填樹脂として使用することで、分析時間を短縮することが可能になる。
本発明では、カラム処理に用いる移動相に水又は有機溶媒を用いることができる。有機溶媒は特に限定されないが、水に可溶なものが好ましく、例えば、エタノール、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。水と１種類以上の有機溶媒とを混合して用いることもでき、その混合比率も特に限定されず、例えば、移動相中の有機溶媒の比率を０〜１００％として用いることができる。移動相は酸性である方が分離能の向上及び分析対象化合物の安定性向上などのために好ましく、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、過塩素酸などを０．００１％〜５％混合して用いることができる。特に、０．０５％〜０．１％のトリフルオロ酢酸を用いることが好ましい。
本発明では、移動相の有機溶媒比率、移動相のイオン強度、移動相のｐＨなどを時間に応じて変化させるグラジエント法を用いることができる。本発明では、移動相の有機溶媒比率を時間に応じて変化させる、溶媒グラジエント法を用いることが好ましい。本発明において溶媒グラジエント法を用いることにより、液体試料中におけるベンゾトロポロン環含有化合物を含有する画分の分離能を向上させることができる。溶媒グラジエント法では、移動相の有機溶媒比率を時間経過に応じて直線的、非直線的（凸型又は凹型）、又は段階的に増加及び／又は低下させることができる。また、移動相の有機溶媒比率を一定に保持する時間を設けることもできる。例えば、本発明のグラジエント分析の一態様では、移動相の有機溶媒比率を時間経過に応じて段階的に増加させ、その後、一定時間移動相の有機溶媒比率を一定に保持し、さらに、移動相の有機溶媒比率を分析開始時の有機溶媒比率にまで時間経過に応じて又は急速に低下させることができる。以下にグラジエント分析条件の一例を示すが、液体試料中のベンゾトロポロン環含有化合物のピークが得られる条件であれば、特に限定されない。
＜グラジエント分析条件例＞
・カラム：TSK-gel ODS-８０TsQA（4.6mmφ×150mm、東ソー株式会社）
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／10%アセトニトリル／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／80%アセトニトリル／水
・流速：１．０ｍＬ／分
・グラジエント条件：分析開始から５分後まではＢ液０％、
５分から１１分まででＢ液８％、
１１分から２１分まででＢ液１０％、
２１分から２２分まででＢ液１００％、
２２分から３０分までＢ液１００％保持、
３０分から３１分まででＢ液０％、
３１分から４２分までＡ液１００％保持
移動相の流速は特に限定されないが、例えば好ましくは０．２〜２ｍＬ／分、より好ましくは０．５〜１．５ｍＬ／分である。
＜グラジエント分析条件例＞
・カラム：TSK-gel ODS-８０TsQA（4.6mmφ×150mm、東ソー株式会社）
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／10%アセトニトリル／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／80%アセトニトリル／水
・流速：１．０ｍＬ／分
・グラジエント条件：分析開始から５分後まではＢ液０％、
５分から１１分まででＢ液８％、
１１分から２１分まででＢ液１０％、
２１分から２２分まででＢ液１００％、
２２分から３０分までＢ液１００％保持、
３０分から３１分まででＢ液０％、
３１分から４２分までＡ液１００％保持
移動相の流速は特に限定されないが、例えば好ましくは０．２〜２ｍＬ／分、より好ましくは０．５〜１．５ｍＬ／分である。
３．検出
本発明において、ベンゾトロポロン環含有化合物の検出は、３６０〜３９０ｎｍ、好ましくは３６５〜３８５ｎｍ、より好ましくは３７０〜３８０ｎｍの任意の波長における吸光度を測定することで行う。ベンゾトロポロン環含有化合物を検出するための最も好ましい波長は３７５ｎｍである。
本発明において、ベンゾトロポロン環含有化合物の検出は、３６０〜３９０ｎｍ、好ましくは３６５〜３８５ｎｍ、より好ましくは３７０〜３８０ｎｍの任意の波長における吸光度を測定することで行う。ベンゾトロポロン環含有化合物を検出するための最も好ましい波長は３７５ｎｍである。
ベンゾトロポロン環含有化合物を含む一般的なポリフェノール類は、２８０ｎｍ付近の波長域に吸収極大を有する（図１）。そのため、ベンゾトロポロン環含有化合物を２８０ｎｍ付近の波長で検出した場合には、カテキン類やタンニン類などの他のポリフェノール類を含むピークとして検出される。一方で、ベンゾトロポロン環含有化合物以外の他のポリフェノール類は、一般的には３６０〜３９０ｎｍ付近に吸収極大を有しない（図１）。従って、本発明では、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物の濃度を特異的に測定することができる。
ベンゾトロポロン環含有化合物は、４３７〜４６７ｎｍの波長域にも吸収極大を有する。そのため、前記３６０〜３９０ｎｍの任意の波長における吸光度測定に加えて、さらに４３７〜４６７ｎｍ、好ましくは４４２〜４６２ｎｍ、より好ましくは４４７〜４５７ｎｍ、最も好ましくは４５２ｎｍの吸光度測定を行うことにより、ベンゾトロポロン環含有化合物をより特異的に検出及び定量することができる。これにより、ベンゾトロポロン環含有化合物の検出特異性及び定量性を高めることができる。
４．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
本発明では、液体試料をカラムで処理する工程、及びカラム処理後の液体試料の吸光度を測定する工程を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行うことができる。本発明で使用されるＨＰＬＣ機器は、特に限定されないが、例えば、化学計測機器として市販されている通常のＨＰＬＣ装置などを用いることができる。また、検出器として紫外可視分光検出器を有するものが好ましい。さらに、溶媒グラジエントシステムを有するものがより好ましい。尚、測定対象、カラム・樹脂の種類、移動相の組成・流速、及び検出条件などの分析条件は前記と同様である。
本発明では、液体試料をカラムで処理する工程、及びカラム処理後の液体試料の吸光度を測定する工程を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行うことができる。本発明で使用されるＨＰＬＣ機器は、特に限定されないが、例えば、化学計測機器として市販されている通常のＨＰＬＣ装置などを用いることができる。また、検出器として紫外可視分光検出器を有するものが好ましい。さらに、溶媒グラジエントシステムを有するものがより好ましい。尚、測定対象、カラム・樹脂の種類、移動相の組成・流速、及び検出条件などの分析条件は前記と同様である。
５．液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法
本発明の一態様は、液体試料をカラムで処理する工程、カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、及び、ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係を利用して、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する工程、を含む、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法である。ベンゾトロポロン環含有化合物がリパーゼ阻害活性を有することは、ＷＯ２０１０／１３４５９５号公報に開示されている。さらに、ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性には相関関係が認められる（実施例３）。従って、本発明により、液体試料中のベンゾトロポロン環含有化合物の濃度を測定することで、液体試料のリパーゼ阻害活性の多寡を評価することができる。また、本発明は４３７〜４６７ｎｍの吸光度を測定する工程や、植物原料から液体試料を得る工程をさらに含んでもよい。尚、測定対象、カラム・樹脂の種類、移動相の組成・流速、及び検出条件などの分析条件は前記と同様である。
本発明の一態様は、液体試料をカラムで処理する工程、カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定する工程、及び、ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係を利用して、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する工程、を含む、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法である。ベンゾトロポロン環含有化合物がリパーゼ阻害活性を有することは、ＷＯ２０１０／１３４５９５号公報に開示されている。さらに、ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性には相関関係が認められる（実施例３）。従って、本発明により、液体試料中のベンゾトロポロン環含有化合物の濃度を測定することで、液体試料のリパーゼ阻害活性の多寡を評価することができる。また、本発明は４３７〜４６７ｎｍの吸光度を測定する工程や、植物原料から液体試料を得る工程をさらに含んでもよい。尚、測定対象、カラム・樹脂の種類、移動相の組成・流速、及び検出条件などの分析条件は前記と同様である。
以下、実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：ＨＰＬＣ分析条件の確立
紅茶重合ポリフェノールのＨＰＬＣ条件を以下のように確立した。
＜条件＞
・カラム：TSK-gel ODS-８０TsQA（4.6mmφ×150mm、東ソー株式会社）
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／10%アセトニトリル／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／80%アセトニトリル／水
・流速：１．０ｍＬ／分
・カラム温度：４０℃
・グラジエント条件：
分析開始から５分後まではＢ液０％、
５分から１１分まででＢ液８％、
１１分から２１分まででＢ液１０％、
２１分から２２分まででＢ液１００％、
２２分から３０分までＢ液１００％保持、
３０分から３１分まででＢ液０％、
３１分から４２分までＡ液１００％保持
・検出：２８０ｎｍ、３７５ｎｍ
・注入量：１０μＬ
・標準物質：テアフラビン-3,3’-ジガレート（紅茶重合ポリフェノール（BTPP）測定のための標準物質）及びウーロンホモビスフラバンB（ウーロン茶重合ポリフェノール（OTPP）測定のための標準物質）
本ＨＰＬＣ分析では標準物質として、テアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンB（ともに長良サイエンス社製）を用い、62.5、125、250、及び500μg/mL溶液を用いて検量線を作製した。作成したテアフラビン-3,3’-ジガレートの検量線を図１に示す。
実施例１：ＨＰＬＣ分析条件の確立
紅茶重合ポリフェノールのＨＰＬＣ条件を以下のように確立した。
＜条件＞
・カラム：TSK-gel ODS-８０TsQA（4.6mmφ×150mm、東ソー株式会社）
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／10%アセトニトリル／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／80%アセトニトリル／水
・流速：１．０ｍＬ／分
・カラム温度：４０℃
・グラジエント条件：
分析開始から５分後まではＢ液０％、
５分から１１分まででＢ液８％、
１１分から２１分まででＢ液１０％、
２１分から２２分まででＢ液１００％、
２２分から３０分までＢ液１００％保持、
３０分から３１分まででＢ液０％、
３１分から４２分までＡ液１００％保持
・検出：２８０ｎｍ、３７５ｎｍ
・注入量：１０μＬ
・標準物質：テアフラビン-3,3’-ジガレート（紅茶重合ポリフェノール（BTPP）測定のための標準物質）及びウーロンホモビスフラバンB（ウーロン茶重合ポリフェノール（OTPP）測定のための標準物質）
本ＨＰＬＣ分析では標準物質として、テアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンB（ともに長良サイエンス社製）を用い、62.5、125、250、及び500μg/mL溶液を用いて検量線を作製した。作成したテアフラビン-3,3’-ジガレートの検量線を図１に示す。
また、テアフラビン-3,3’-ジガレートとウーロンホモビスフラバンBの吸収スペクトルを図２に示す。その結果、分子内にベンゾトロポロン環を有するテアフラビン-3,3’-ジガレートは、２８０ｎｍ付近、３７５ｎｍ付近、及び４５２ｎｍ付近に吸収極大が認められた。一方で、分子内にベンゾトロポロン環を有しないウーロンホモビスフラバンBは、２８０ｎｍ付近にのみ吸収極大が認められた。従って、テアフラビン-3,3’-ジガレートにおいて認められた３７５ｎｍ付近、及び４５２ｎｍ付近の吸収極大は、ベンゾトロポロン環に起因するものであることが明らかとなった。
実施例２：ベンゾトロポロン環含有化合物のＨＰＬＣ分析
実施例１のＨＰＬＣ条件に従い、分子内にベンゾトロポロン環を有するテアフラビン-3,3’-ジガレートの250μg/mL溶液と、分子内にベンゾトロポロン環を有しないウーロンホモビスフラバンB（OHBF-B）の250μg/mL溶液の分析を行った。その結果、図３に示すように、２８０ｎｍの波長で検出した場合には、テアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンB共に保持時間（R.T.）24分付近に単一ピークが認められ、分子内のベンゾトロポロン環の有無に関わらずテアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンBが検出されることが示された。一方で、３７５ｎｍの波長で検出した場合には、ウーロンホモビスフラバンBのピークは検出されなかったが、テアフラビン-3,3’-ジガレートは保持時間24分付近に単一ピークとして検出された。従って、３７５ｎｍの検出波長を用いることで、ベンゾトロポロン環含有化合物を特異的に検出できることが示された。
実施例１のＨＰＬＣ条件に従い、分子内にベンゾトロポロン環を有するテアフラビン-3,3’-ジガレートの250μg/mL溶液と、分子内にベンゾトロポロン環を有しないウーロンホモビスフラバンB（OHBF-B）の250μg/mL溶液の分析を行った。その結果、図３に示すように、２８０ｎｍの波長で検出した場合には、テアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンB共に保持時間（R.T.）24分付近に単一ピークが認められ、分子内のベンゾトロポロン環の有無に関わらずテアフラビン-3,3’-ジガレート及びウーロンホモビスフラバンBが検出されることが示された。一方で、３７５ｎｍの波長で検出した場合には、ウーロンホモビスフラバンBのピークは検出されなかったが、テアフラビン-3,3’-ジガレートは保持時間24分付近に単一ピークとして検出された。従って、３７５ｎｍの検出波長を用いることで、ベンゾトロポロン環含有化合物を特異的に検出できることが示された。
さらに、テアフラビン-3,3’-ジガレートの250μg/mL溶液に、ウーロンホモビスフラバンBを31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、及び250μg/mLとなるように添加した混合溶液の分析を行った。結果を表１に示す。
表１に示すように、２８０ｎｍで測定した場合には、ウーロンホモビスフラバンBの添加量の増加に伴い検量線から求められるウーロン茶重合ポリフェノール（OTPP）の濃度が実際の含有量よりも増大することが示された。これに対して、３７５ｎｍで定量した場合には、ウーロンホモビスフラバンBの添加量を増加させても、検量線から求められる紅茶重合ポリフェノール（BTPP）濃度は実際の含有量250μg/mLにきわめて近い値であることが示された。従って、３７５ｎｍの波長を用いて測定することで、混在するウーロン茶重合ポリフェノールの影響を受けることなく、紅茶重合ポリフェノールのようなベンゾトロポロン環を含有する化合物の濃度を正確に測定できることが明らかとなった。
実施例３：紅茶重合ポリフェノール濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係
（１）紅茶葉抽出物中の紅茶重合ポリフェノール濃度の測定
紅茶葉16gを800mLの熱水（90℃）で5分ごとに攪拌しながら20分間抽出した。紅茶葉は、ケニアCTC、アッサムCTC、アッサム・ファニングス、ニルギリBOP、及びジャワの5種類の品種を用いた。東洋濾紙No.2で濾過後、50%アセトニトリルで２倍希釈し、さらにミリポアフィルター（0.45μm、マイレクスLH-4）で濾過したものを、実施例１のＨＰＬＣ条件で分析した。
（２）リパーゼ阻害活性測定
特許文献２に記載の通り、ベンゾトロポロン環含有化合物はリパーゼ阻害活性を示すことが知られている。そして、この変化は濃度依存的であると考えられている。そこで、異なる濃度の紅茶重合ポリフェノールを含有する紅茶抽出物を用いて、リパーゼ阻害活性力価（1/IC50）の違いを評価した。
（１）紅茶葉抽出物中の紅茶重合ポリフェノール濃度の測定
紅茶葉16gを800mLの熱水（90℃）で5分ごとに攪拌しながら20分間抽出した。紅茶葉は、ケニアCTC、アッサムCTC、アッサム・ファニングス、ニルギリBOP、及びジャワの5種類の品種を用いた。東洋濾紙No.2で濾過後、50%アセトニトリルで２倍希釈し、さらにミリポアフィルター（0.45μm、マイレクスLH-4）で濾過したものを、実施例１のＨＰＬＣ条件で分析した。
（２）リパーゼ阻害活性測定
特許文献２に記載の通り、ベンゾトロポロン環含有化合物はリパーゼ阻害活性を示すことが知られている。そして、この変化は濃度依存的であると考えられている。そこで、異なる濃度の紅茶重合ポリフェノールを含有する紅茶抽出物を用いて、リパーゼ阻害活性力価（1/IC50）の違いを評価した。
リパーゼ活性は、基質として蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（4-MUO）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより測定した。測定にあたり、緩衝液は150mM NaCl、1.36mM CaCl2を含む13mM Tris-HCl（pH8.0）を用いた。基質である4-MUOは0.1MのDMSO溶液とした後に上記緩衝液で1000倍希釈したものを用いた。また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（シグマ社製）を同様に上記緩衝液を用いて400U/mL溶液として調製したものを酵素測定に供した。
酵素反応は、25℃条件下において、96穴マイクロプレートに50μLの4-MUO緩衝液、25μLの蒸留水（あるいは試料水溶液）を添加し混合した後に、25μLのリパーゼ緩衝液を添加することにより開始させた。30分間反応を行った後に、100μLの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Labsystem社製Fluoroskan Asent CF）を用いて測定した。
試料の阻害活性は、対照（蒸留水）の活性に対して50%阻害を与える試料量IC50（μM）として求めた。また、IC50値の逆数をμgあたりの相対活性値（リパーゼ阻害活性力価（units））として算出し、試料溶液中のリパーゼ阻害活性を比較した。
（３）紅茶重合ポリフェノール濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係
上記（１）及び（２）の方法で、5種類の紅茶葉抽出物の紅茶重合ポリフェノール濃度及びリパーゼ阻害活性を測定した。結果を表２に示す。さらに、横軸に紅茶重合ポリフェノール濃度、及び縦軸にリパーゼ阻害活性力価をプロットして作成した相関図を図４に示す。その結果、紅茶重合ポリフェノール濃度が高い品種（ケニアCTC、アッサムCTC、及びアッサム・ファニング）は、リパーゼ阻害活性力価（1/IC50）も高いことが明らかとなり、両者の間には相関関係が認められた。
（３）紅茶重合ポリフェノール濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係
上記（１）及び（２）の方法で、5種類の紅茶葉抽出物の紅茶重合ポリフェノール濃度及びリパーゼ阻害活性を測定した。結果を表２に示す。さらに、横軸に紅茶重合ポリフェノール濃度、及び縦軸にリパーゼ阻害活性力価をプロットして作成した相関図を図４に示す。その結果、紅茶重合ポリフェノール濃度が高い品種（ケニアCTC、アッサムCTC、及びアッサム・ファニング）は、リパーゼ阻害活性力価（1/IC50）も高いことが明らかとなり、両者の間には相関関係が認められた。
実施例４：改良ＨＰＬＣ法
紅茶重合ポリフェノールの分析時間を短縮するため、コアシェルタイプの充填樹脂を用いたＨＰＬＣ法を確立した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
＜条件＞
・カラム：COSMOCORE 2.6 C18 3mm×75mm
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／90%アセトニトリル／水
・流速：０．８ｍＬ／分
・グラジエント条件：
分析開始から２．５分後まではＢ液１１．１％
２．５分から５．５分まででＢ液１７．３％
５．５分から８分まででＢ液１８．１％
８分から８．１分まででＢ液９０％
８．１分から１４．６分までＢ液９０％保持
１４．６分から１５分まででＢ液１１．１％
１５分から２１分まででＢ液１１．１％保持
・検出：３７５ｎｍ
・注入量：５μＬ
コアシェルタイプの樹脂を充填したカラムを用いることで、分析時間を約半分に短縮できることが明らかとなった。
紅茶重合ポリフェノールの分析時間を短縮するため、コアシェルタイプの充填樹脂を用いたＨＰＬＣ法を確立した。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
＜条件＞
・カラム：COSMOCORE 2.6 C18 3mm×75mm
・移動相：（Ａ）0.05%トリフルオロ酢酸／水、（Ｂ）0.05%トリフルオロ酢酸／90%アセトニトリル／水
・流速：０．８ｍＬ／分
・グラジエント条件：
分析開始から２．５分後まではＢ液１１．１％
２．５分から５．５分まででＢ液１７．３％
５．５分から８分まででＢ液１８．１％
８分から８．１分まででＢ液９０％
８．１分から１４．６分までＢ液９０％保持
１４．６分から１５分まででＢ液１１．１％
１５分から２１分まででＢ液１１．１％保持
・検出：３７５ｎｍ
・注入量：５μＬ
コアシェルタイプの樹脂を充填したカラムを用いることで、分析時間を約半分に短縮できることが明らかとなった。
本発明では、液体試料をカラムで処理し、カラム処理後の液体試料の３６０〜３９０ｎｍの吸光度を測定することで、液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を正確に定量できる。また、本発明では液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を、一連の化合物群として迅速かつ簡便に定量することができる。よって、本発明の方法によれば、ベンゾトロポロン環含有化合物に由来する生理活性の高い原材料や組成物を選抜することができる。
Claims (11)
- 液体試料に含まれるベンゾトロポロン環含有化合物を定量する方法であって、
液体試料を高速液体クロマトグラフィーにて逆相系カラムで処理する工程、及び、
カラム処理後の液体試料を高速液体クロマトグラフィーの検出器で測定する工程であって、測定する吸光度が３７０〜３８０ｎｍおよび４４７〜４５７ｎｍである工程、を含む、
前記方法。 - ベンゾトロポロン環含有化合物が茶重合ポリフェノールである、請求項１に記載の方法。
- 茶重合ポリフェノールが紅茶重合ポリフェノール、又はウーロン茶重合ポリフェノールである、請求項２に記載の方法。
- カラム処理工程の前に、植物原料から液体試料を抽出する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 植物原料が茶葉、紅茶葉、及びウーロン茶葉からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
- 逆相系カラムが、シリカゲル系樹脂を充填したものである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 逆相系カラムが、コアシェル型樹脂を充填したものである、請求項６に記載の方法。
- カラム処理が、移動相に水と有機溶媒の混合溶媒を用いた、溶媒グラジエント法によるものである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 移動相の有機溶媒が、メタノール、エタノール、及びアセトニトリルからなる群より選択される１以上を含むものである、請求項８に記載の方法。
- 移動相が、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、及び過塩素酸からなる群より選択される１以上を含むものである、請求項８又は９に記載の方法。
- 液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する方法であって、
液体試料を高速液体クロマトグラフィーにて逆相系カラムで処理する工程、
カラム処理後の液体試料を高速液体クロマトグラフィーの検出器で測定する工程であって、測定する吸光度が３７０〜３８０ｎｍおよび４４７〜４５７ｎｍである工程、及び、
ベンゾトロポロン環含有化合物濃度とリパーゼ阻害活性との相関関係を利用して、液体試料のリパーゼ阻害活性を評価する工程、を含む、
前記方法。
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