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JP6618191B2 - 脳マラリアの診断および治療 - Google Patents

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JP6618191B2 JP2016510589A JP2016510589A JP6618191B2 JP 6618191 B2 JP6618191 B2 JP 6618191B2 JP 2016510589 A JP2016510589 A JP 2016510589A JP 2016510589 A JP2016510589 A JP 2016510589A JP 6618191 B2 JP6618191 B2 JP 6618191B2
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Description

本発明は、脳マラリア（本明細書中「ＣＭ」と称することがある。）の診断および治療に関する。
脳マラリア（ＣＭ）は、突然の昏睡状態、死、または、神経障害によって特徴づけられる、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染の最も致命的な合併症である。脳が重度に冒されるが、ＣＭがどのように生じるかについて、脳の位置と空間時間的機構はあまり理解されていない。
脳マラリア（ＣＭ）は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫によって引き起こされるヒトにおけるマラリア感染症の重篤な合併症であり、高い死亡率または長期の身体障害を伴う痙攣や昏睡状態のような突然の臨床症状によって特徴づけられる（非特許文献１＝Ｉｄｒｏ，Ｒ．ら（２０１０）．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ６８，２６７−２７４．；非特許文献２＝Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．Ｅ．ら（２００４）．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０，１４３−１４５．）。ＣＭは非特異的な症状を呈するため、ＣＭの早期診断は容易でなく、しばしば、ＣＭ治療があまり効果的でない時点で疾患の症状が顕在化する（非特許文献３＝Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．ら（２０１３）．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９，１５６−１６７．）。それゆえ、適時のインターベンションを可能にする、ＣＭの早期の迅速かつ安価な診断が必要とされている。
脳マラリア（ＣＭ）の病理を理解するために、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）寄生虫を使用したＣＭのマウスモデル（実験的脳マラリア、ＥＣＭとして知られる）が広く用いられている（非特許文献４＝Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｊ．ら（２０１１）．Ｍａｌａｒ Ｊ １０，２３．）。脳は、密な内皮細胞が特定の血管にしっかりと固定された血液脳関門（ＢＢＢ）を形成しており、外来性病原体の侵入を防止する特権的な部位であるが、ＥＣＭは、ＢＢＢの破壊と、その後の炎症性応答および脳内の細胞蓄積から生じると考えられている。実際、多数の研究が、様々な細胞（その大部分は白血球）が、脳の血管に多数蓄積し、そこで、感染赤血球（ｉＲＢＣ）と、ＣＤ８α＋樹状細胞（ＤＣ）によってクロスプライミングされた寄生虫特異的な病原性ＣＤ８ Ｔ細胞がＥＣＭの発病において重要な役割を担うことに言及している（非特許文献５＝Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｆ．Ｇ．ら（２０１０）．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ ７８，４０３３−４０３９．；非特許文献６＝Ｈａｑｕｅ，Ａ．ら（２０１１）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８６，６１４８−６１５６．；非特許文献７＝Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｓ．Ｗ．ら（２０１３）．Ｂｒａｉｎｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍａｌａｒｉａ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１３年５月１６日オンライン版公開，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１２０２２７３）；非特許文献８＝Ｌｕｎｄｉｅ，Ｒ．Ｊ．ら（２００８）．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，１４５０９−１４５１４．；非特許文献９＝ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｊ．Ａ．ら（２０１１）．Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ４１，１５５−１６３．；非特許文献１０＝Ｒｅｎｉａ，Ｌ．ら（２０１２）．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ３，１９３−２０１．；非特許文献１１＝Ｙｕｉ，Ｋ．（２０１３）．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１３年６月５日オンライン版公開，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１３０２８４９））。さらに、最近の研究は、ＰｂＡ感染中の活性化ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣＤ１１ｃの発現を報告しているが、ＥＣＭの間のその正確な役割については十分に研究されていない（非特許文献１２＝Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、（２０１１）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７９，３９４７−３９５６．）。ＢＢＢ機能不全は、ＥＣＭの主な特徴であり、全身性ならびに局所性の事象がこれに寄与している（非特許文献１３＝Ｃｏｍｂｅｓ，Ｖ．ら、（２０１２）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ２８，３１１−３１９．；非特許文献１４＝Ｎａｃｅｒ，Ａ．ら、（２０１２）．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８，ｅ１００２９８２．）。
Ｉｄｒｏ，Ｒ．ら（２０１０）．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ６８，２６７−２７４． Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．Ｅ．ら（２００４）．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０，１４３−１４５． Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．ら（２０１３）．Ｎａｔ Ｍｅｄ １９，１５６−１６７．）。 Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｊ．ら（２０１１）．Ｍａｌａｒ Ｊ １０，２３． Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ｆ．Ｇ．ら（２０１０）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７８，４０３３−４０３９． Ｈａｑｕｅ，Ａ．ら（２０１１）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８６，６１４８−６１５６ Ｈｏｗｌａｎｄ，Ｓ．Ｗ．ら（２０１３）．Ｂｒａｉｎ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍａｌａｒｉａ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１３年５月１６日オンライン版公開，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１２０２２７３） Ｌｕｎｄｉｅ，Ｒ．Ｊ．ら（２００８）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，１４５０９−１４５１４． ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｊ．Ａ．ら（２０１１）．Ｉｎｔ Ｊ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ４１，１５５−１６３ Ｒｅｎｉａ，Ｌ．ら（２０１２）．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ３，１９３−２０１ Ｙｕｉ，Ｋ．（２０１３）．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．（２０１３年６月５日オンライン版公開，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１３０２８４９） Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、（２０１１）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７９，３９４７−３９５６． Ｃｏｍｂｅｓ，Ｖ．ら、（２０１２）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ ２８，３１１−３１９． Ｎａｃｅｒ，Ａ．ら、（２０１２）．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８，ｅ１００２９８２
本発明者らは、最初のＢＢＢ破壊が、脳全体の血管において同時に生じるのか、脳内にＢＢＢをｉＲＢＣおよび病原性免疫細胞に対して寛容にさせる特定の場所が存在するのかは、理解するために鋭意研究を進めた。同様に、特定の脳領域および／または細胞における免疫応答の空間時間的制御についても解明するために鋭意研究を進めた。
本発明者らは、強力なイメージング技術である、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩおよび多光子（ＭＰ）顕微鏡法の組み合わせを用いて、マウスならびに非ヒト霊長類のＣＭの病態生理学的機構および免疫学的機構の空間時間的制御を調べた。本発明者らは、ＰｂＡ（マウスＣＭモデル）およびＰ．ｃｏａｔｎｅｙｉ（サルＣＭモデル）による全身感染の間にＢＢＢが破壊され、寛容となる、基礎的な機構を解明した。本発明者らは、独特な放射状および接線方向に密な微小毛細管構造から構成される嗅球（ＯＬＦ）が、寄生虫ならびに細胞の移動に適切な環境として機能し、マラリア感染を最初に検知する場所であり、そして、脳と活性化された免疫系との間の「クロストーク」を可能にすることを見出した。このことは、ＯＬＦを、嗅覚の喪失、高熱、星状細胞、ＣＣＬ２１、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ３およびＣＤ８ Ｔ細胞と関連づける。
本明細書において、発明者らは、ＣＭのマウスモデルならびにサルモデルにおいて、嗅球（ＯＬＦ）がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって物理的に破壊され、機能的に障害を受ける（嗅覚の喪失）領域であり（嗅覚の喪失）、次いで高熱が生じることを明らかにした。２つの強力な画像化技術、超高磁場ＭＲＩと生体内多光子顕微鏡法によって、ＯＬＦが寄生虫の蓄積および細胞閉塞を受け、その後、柵状微小毛細血管構造に起因した微小出血が生じる様子が可視化された。ＯＬＦの血管内を循環する寄生虫は、ＯＬＦの糸球および血管周囲の星状細胞によって、感染の初期段階で検知され、ＣＸＣＲ３を介してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞を誘引し得るＣＣＬ２１を放出する。このように、嗅覚喪失の早期検出と、病理学的な細胞の補充の即時妨害は、ＥＣＭのための新規治療を提供し得る。したがって、本発明は以下をも提供する。
（１）被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を脳マラリアの指標とする方法。
（２）前記状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像から選択される少なくとも１つにより判定されることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（３）前記嗅覚異常は、基準嗅覚検査および静脈的嗅覚検査からなる群より選択される試験における異常である、項目２に記載の方法。（４）前記診断画像は、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によるものである、項目２または３に記載の方法。
（５）前記ＭＲＩは、７Ｔ以上の磁力で撮影される、項目４に記載の方法。
（６）前記診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である、項目２〜５のいずれか１項に記載の方法。
（７）前記細胞検査は、染色または免疫組織化学法で検査される、項目２〜６のいずれか１項に記載の方法。
（８）前記被験体の嗅球の異常は、罹患早期の指標である、項目１〜７のいずれか１項に記載の検出法。
（９）被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を測定することを包含する、脳マラリアを診断する方法。
（１０）前記被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標である、項目９に記載の方法。
（１１）嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置。
（１２）前記手段は磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手段である、項目１１に記載の装置。
（１３）前記ＭＲＩは、７Ｔ以上のＭＲＩである、項目１２に記載の装置。
（１４）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤。
（１５）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも１つ因子の阻害剤を含む、項目１４に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１６）前記阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む、項目１４または１５に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１７）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１６のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１８）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも２種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（１９）前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体の３種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、項目１４〜１８のいずれか１項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
（２０）脳マラリアの予防または治療のための、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤。
（２１）項目１５〜１９のいずれか１項または複数の項における特徴をさらに含む、項目２０に記載の阻害剤。
（２２）有効量のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法。
（２３）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子を含む、脳マラリアのマーカー。
（２４）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目２３に記載の脳マラリアのマーカー。
（２５）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９
（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ８Ｔ細胞および他のＴ細胞
からなる群より選択される、少なくとも１つの因子を含む、
項目２３または２４に記載の脳マラリアのマーカー。
（２６）（Ａ）嗅球におけるＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９の発現上昇；
（Ｂ）皮質におけるＩＦＮ−γの発現上昇；
（Ｃ）前記ＣＤ８α樹状細胞は、ＣＣＲ７依存的にプライミングされるものが観察されること；および／または
（Ｄ）脳または脾臓において活性化ＣＤ８Ｔ細胞が観察されること
を脳マラリアの発症の指標とする、項目２３〜２５のいずれか１項に記載の脳マラリアのマーカー。
（２７）前記脳マラリアは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる、項目２３〜２６のいずれか１項に記載の脳マラリアのマーカー。
（２８）前記脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものである、項目２３〜２７のいずれか１項に記載のマーカー。
（２９）前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、配列番号１、３または５に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体または配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくは改変体を含む、項目２３〜２８のいずれか１項に記載のマーカー。
（３０）（１）ＣＣＬ２１タンパク質またはこれをコードする核酸；
（２）ＣＸＣＲ３またはこれをコードする核酸；および／または
（３）ＣＣＲ７タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む項目２３〜２９のいずれか１項に記載のマーカー。
（３１）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤。
（３２）前記検出剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいは核酸である、項目３１に記載の検出剤または診断剤。
（３３）前記検出剤または診断剤は、標識されたものである、項目３１または３２に記載の検出剤または診断剤。
（３４）前記検出剤または診断剤は、核酸であり、該核酸はプローブまたはプライマーである、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の検出剤または診断剤。
（３５）ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別する方法。
（３６）対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断されることを特徴とする、項目３５に記載の方法。
（３７）前記識別は、項目３１〜３４のいずれか１項に記載の検出剤または診断剤を用いて行われる、項目３５または３６に記載の方法。
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
本発明は従来存在しなかった、脳マラリアの診断および治療技術を提供する。
図１は、超高磁場ＭＲＩが、嗅球をＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ寄生虫に攻撃されやすい場所として同定する様子を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０６ＰｂＡ寄生虫を感染させた。（Ａ）マウス頭部の冠状断面および矢状断面の１１．７Ｔ ＭＲＩ（Ｃ５７ＢＬ／６、ＦＬＡＳＨ Ｔ２＊シグナル、ナイーブ 対 感染後６日目）を示す。冠状断面の点線で囲った円と、矢状断面の矢印は、嗅球（ＯＬＦ）に対応する。（Ｂ）６日目のマウス頭部の冠状断面の拡散強調画像を示す。灰色の点線で囲った四角と矢印は（Ｃ）におけるＨＥ染色の箇所を指す。ＡおよびＢの像は、少なくとも５匹の動物のうちの代表的なものである。（Ｃ）感染後６日目のＯＬＦの冠状断面の組織学は、ＨＥ染色によるいくつかの出血部位に対応する低密度領域を示す（スケールバーは１ｍｍである）。ＯＮＬ（嗅神経層）、ＧＬ（糸球層）、ＭＣＬ（僧帽細胞層）、ＧＣＬ（顆粒細胞層）。（Ｄ）６日目のＯＬＦ断面のＩＨＣを示す。赤血球をＴＥＲ１１９（赤色）およびＧＦＰ−寄生虫（緑色）で染色した。ＤＡＰＩ（青色）により核を可視化した。スケールバーは１００μｍである。 図１（Ｅ）〜（Ｆ）は生体およびパラホルムアルデヒドで固定したマウス脳のＲＩ像を示す。（Ｅ）ナイーブなマウス頭部の生体およびパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定１１．７Ｔ ＭＲＩイメージング（冠状断面）を示す。（Ｆ）ＰｂＡ感染マウスの感染初期１１．７Ｔ ＭＲＩ像の冠状および矢状断面を示す。 図２は、図２は、感染中のＯＬＦの柵状微小血管の生体内多光子イメージングを示す。（Ａ）背部ＯＬＦの薄型頭蓋を介したＭＰ顕微鏡観察の概略図を示す。像の深さは、軟膜表面から約１５０μｍであり、ＧＬ内の毛細管（赤色、直径５μｍ未満）が可視化される。より大きな血管（表在性の動脈および細動脈、直径約２０〜４０μｍ）は、ＯＮＬ内に位置する。ＧＬ（糸球層）、ＯＮＬ（嗅神経層）、ＭＣＬ（僧帽細胞層）。（Ｂ）ＧＦＰ−ＰｂＡ感染後５日目のＷＴマウスのＯＬＦからの代表的なスナップショットＭＰ像（データは示さないが動画でも確認している）。矢印は、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識された血管に付着／閉塞したＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を示す。点線はより大きな血管と毛細管を分けている。スケールバーは５０μｍである。（Ｃ）感染後３、４、５および６日目に、ＰｂＡ １８Ｓ ｒＲＮＡおよびＣＤ３ε（汎Ｔ細胞表面マーカー）特異的プライマーを用いたｑ−ＰＣＲにより、ＯＬＦ、皮質および小脳におけるＰｂＡ寄生虫負荷量およびＣＤ３εを定量した。結果は、対応する１８ＳｒＲＮＡに対して標準化した相対的ｍＲＮＡ単位として表す（平均±ＳＤ、３〜５日目についてはｎ＝３、６日目についてはｎ＝８）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により、感染マウス 対 非感染マウスで、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）嗅球における新たな微小出血を示す。感染後６日目の代表的なスナップショット像（０および５１分の時点）。赤色は赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識された血管を示し、緑色（緑矢印）は、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫を示し、青色はＣＤ８ Ｔ細胞を示す（抗ＣＤ８抗体、白矢印）。円内の赤色領域は、既に出血した領域を示しているが、黄矢印は、将来的に新たな出血が生じる角のある血管を示し、右側の像における白矢印は、新たな出血が既に生じていることを示す拡張された血管を示す。 図３は、マウス脳マラリア中に嗅覚の喪失と発熱が生じる様子を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０６ＰｂＡ寄生虫を感染させた。（Ａ）ＯＬＦ機能を評価するために、感染後の示した時点でマウスを食料埋設試験に供した。食料を見つけるまでの時間の遅れを秒単位で示す（平均±ＳＤ、各時点につきｎ＝４〜６）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により、ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。＞＞＞は時間が９００秒より長かったことを示す。（Ｂ）感染後６日目の食料埋設試験によって評価したナイーブおよびＰｂＡもしくはＰｙＬ感染させたＣ５７ＢＬ／６、Ｒａｇ２−／−およびＢＡＬＢ／ｃマウスのＯＬＦ機能を示す（食料を見つけるまでの時間を秒単位で示す。平均±ＳＤ、各群ｎ＝５〜８）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定による統計的有意差は群間で観察されなかった。＞＞＞は時間が９００秒より長かったことを示す。（Ｃ）ナイーブおよび感染マウスにおけるＢＢＢ漏出を評価するために、示した時点において、エバンスブルー染料を静脈内注射した。染料の注射から２時間後にマウスを屠殺し、脳を摘出し、解剖顕微鏡によって撮像した。矢印はＯＬＦを示す。スケールバーは１ｍｍである。（Ｄ）示した時点は（Ｅ）における赤い点が該当する。ここでは、ＯＬＦを摘出し、ＩＨＣのための切片を調製した。これらの切片を、密着結合タンパク質ＺＯ−１（赤色）およびＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫（緑色）に対する抗体で染色し、核（ＤＡＰＩ、青色）を可視化した。矢印は、ナイーブなマウスにおける連続的なＭＣＬ周囲のＺＯ−１タンパク質のラインを示し、これは、ＰｂＡ感染後６日目には破壊された（スケールバーは１０μｍである）。（Ｅ）感染Ｃ５７ＢＬ／６マウスのサーマルカメラモニタリングを示す。マウスの動きと発熱をケージ内で同時に記録した。絶対値データをＥｘｃｅｌ（登録商標）ファイルにエクスポートし、３時間毎に平均発熱測定値を計算した。点線は、感染前の同一マウスのメジアン発熱レベルを示す。赤色の点は毎日の午前０〜３時の時点を示す。示すデータは、少なくとも３匹の感染動物を代表するものである。（Ｆ−Ｇ）ＰｂＡ感染Ｒａｇ２−／−マウス（Ｆ）およびＰｙＬ感染Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｇ）における発熱を、サーマルカメラモニターにより記録した。ナイーブおよび感染マウスをケージに収容し、継続的に発熱をモニタリングした。値をＥｘｃｅｌ（登録商標）ファイルにプロットし、３時間毎に平均発熱測定値を計算した。示すデータは、各群少なくとも３匹の感染マウスを代表するものである。 図３（Ｈ）〜（Ｉ）はＰｙＬの間およびＰｂＡ感染を伴うＲａｇ２−／−マウスにおけるＯＬＦ嗅球の関与の欠如を示す。（Ｈ）は、ＰｙＬへの感染５日目でのＣ５８Ｂ／６マウス頭部の１１．７Ｔ ＭＲＩ像を示す。（Ｉ）は、ＰｂＡ感染後６日目のＲａｇ２−／−マウス頭部の１１．７Ｔ ＭＲＩ像を示す（ＦＬＡＳＨ Ｔ２＊シグナル、冠状断面）。点線で囲った円はＯＬＦ嗅球に対応する。 図４は、ＰｂＡ感染中に嗅球においてケモカインＣＣＬ２１活性が生じる様子を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１０６ＰｂＡ寄生虫を感染させ、感染後３日目に脳組織（ＯＬＦ−皮質−小脳）を摘出した。総ＲＮＡを抽出し、所定のケモカイン／サイトカインｍＲＮＡの発現をリアルタイムｑ−ＰＣＲにより分析した。結果（平均±ＳＤ）は、対応する１８Ｓ ｒＲＮＡレベルによって標準化したナイーブマウスの相対的ｍＲＮＡ単位と比較した倍数として示される（ｎ＝３）。点線は１に対応する。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により感染ＷＴ対 非感染ＷＴマウスで、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）感染ＷＴマウス（感染後０〜３日目）からのＯＬＦ切片を抗ＣＣＬ２１抗体（赤色）で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）により可視化した。像は、各時点について３匹の異なる動物を代表するものである。スケールバーは１０μｍである。（Ｃ）１０６ＰｂＡ感染後のＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝２１）、Ｃｃｒ７＋／−（ｎ＝２７）およびＣｃｒ７−／−（ｎ＝２３）マウスの生存曲線を示す。生存は毎日モニタリングした。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、＊＊＊ｐ＝０．０００４。（Ｄ）ＷＴおよびＣｃｒ７−／−マウスを感染させ、食料埋設試験に供してＯＬＦ機能を測定した。食料を見つけるまでの時間を秒単位で示す（平均±ＳＤ、各時点につきｎ＝４）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、＊＊＊ｐ＜０．００１。＞＞＞は時間が９００秒より長かったことを示す。（Ｅ）サーマルカメラによる感染ＷＴおよびＣｃｒ７−／−マウスの連続発熱モニタリング。絶対値データをＥｘｃｅｌ（登録商標）ファイルにエクスポートし、３時間毎に平均発熱測定値を計算した。青色および赤色の点は毎日の午前０〜３時の時点を示す。示すデータは、各群少なくとも３匹の感染動物を代表するものである。 図５は、ＣＣＲ７発現がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８αＤＣプライミングには重要であるが、その脳内への移動には重要でないことを示す。（Ａ−Ｂ）感染後６日目の脳全体（Ａ）および脾臓（Ｂ）細胞のフローサイトメトリー分析。差込図内の数は、ＣＤ８ Ｔ細胞とそのＣＤ１１ｃ発現のパーセンテージを示し、そして、Ａの右図は、脳内のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数を示す（各群４〜８匹のマウスの平均±ＳＤ。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により感染Ｃｃｒ７−／− 対 感染Ｃｃｒ７＋／−マウスで、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＷＴ（Ｃｃｒ７＋／−）およびＣｃｒ７−／−マウスの脾臓におけるＣＤ１１＋ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化状態を、ＣＤ４４表面染色により決定した。（Ｄ）感染後６日目のＷＴマウスの脾臓におけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞内染色。（Ｅ）感染Ｒａｇ２−／−脾臓からの濃縮ＣＤ８αＤＣでＣｃｒ７−／−マウスを養子免疫し、ＰｂＡで感染させ、生存をモニターした。感染後のＣｃｒ７＋／−（ｎ＝９）、Ｃｃｒ７−／−（ｎ＝７）および養子免疫Ｃｃｒ７−／−（ｎ＝５）マウスの生存曲線を示す。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、Ｃｃｒ７−／− 対ＣＤ８α ＤＣを養子免疫したＣｃｒ７−／−マウスで、＊＊＊ｐ＝０．０００５。６日目にＦＡＣＳ分析を行って、養子免疫したＣｃｒ７−／−マウスの脳内に蓄積したＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の数を決定した（各群３匹のマウスの平均±ＳＤ）。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により、感染Ｃｃｒ７＋／−マウス 対 感染Ｃｃｒ７−／−マウス、および、Ｃｃｒ７−／−マウス 対 感染ＣＤ８α ＤＣ養子免疫Ｃｃｒ７−／−マウスで、＊＊ｐ＜０．０１。 図５（Ｆ）〜（Ｇ）は、ＰｂＡ感染５日目のサイトカインストーム、および非致死性ＰｙＮＬ感染の間の熱の関与の欠如を示す。（Ｆ）サーマルカメラモニターによって記録されたＰ．ｙｏｅｌｉｉ ＮＬ感染したＣ５７Ｂ／６マウスにおける熱を示す。平均熱測定は３時間ごとに計算した。提示されたデータは、１群あたり少なくとも３匹の感染したマウスの代表である。（Ｇ）ＥＬＩＳＡにより測定されたＰｂＡ感染後５日目のマウスの血清サイトカインレベルを示す（Ｂ６、ｎ＝５、平均のＬｏｇ±ＳＤ，＊＊ｐ＜０．０１（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定））。 図５（Ｈ）〜（Ｉ）は、感染後６日目のＣｃｒ７−／−マウスに徴候が存在しないことを示す。（Ｈ）感染後６日目でナイーブおよび感染したＣｃｒ７−／−マウスからの冠状断面のＭＲＩ像を示す。（Ｉ）ＰｂＡ感染後６日目および８日目のＣｃｒ７−／−マウスにおけるＢＢＢ漏出のエバンスブルー染色による評価を示す。エバンスブルー静脈内注射後２時間で、脳を摘出し、解剖顕微鏡により撮像した画像を示す（スケールバー＝１ｍｍ）。 図６は、ＯＬＦ内に発現されるＣＣＬ２１が、星状細胞の活性化と一致し、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＯＬＦ内への移動に関与し得ることを示す。（Ａ）ＣＣＬ２１染色の星状細胞マーカーＧＦＡＰとの共局在を示す。感染後６日目のＰｂＡ感染ＷＴマウスからのＯＬＦ切片を、ＧＦＡＰ（緑色）およびＣＣＬ２１（赤色）抗体で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）により可視化した。像は、少なくとも３匹の異なる動物を代表するものである。スケールバーは５０μｍである。（Ｂ）星状細胞のエンドフィートがＧＬ内の血管を包む様子を示す。ナイーブおよび感染ＷＴマウス（６日目）からのＯＬＦ ＧＬ切片を、ＰＥＣＡＭ（緑色）およびＧＦＡＰ（赤色）抗体で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）により可視化した。矢印は、インタクトな血管（ナイーブマウス）および破壊された血管（感染マウス）を示す。スケールバーは１０μｍである。（Ｃ）ＷＴマウスに、感染の０日目から３日間、毎日（１日あたり５０μｇ）、組換えマウス抗ＣＣＬ２１抗体とアイソタイプコントロールをｉ．ｖ．注射し、生存をモニターした。１０６ＰｂＡでの感染後のマウスの、アイソタイプコントロール処置群（ｎ＝５）、抗ＣＣＬ２１抗体処置群（ｎ＝５）の生存曲線を示す。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）１０６ＰｂＡでの感染後のＷＴおよびＣｃｒ７−／−マウスの、組換え抗ＣＸＣＲ３抗体およびアイソタイプコントロール抗体処置群の生存曲線を示す。マウスに、感染後４日目と５日目に、マウス１匹につき１日あたり１００μｇの抗体を２回、ｉ．ｖ．注射した。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、アイソタイプコントロール 対 抗ＣＸＣＲ３抗体投与群でＰ＝０．０９、Ｃｃｒ７−／−アイソタイプコントロール 対 Ｃｃｒ７−／−抗ＣＸＣＲ３抗体投与群で＊＊ｐ＜０．０１（各群ｎ＝５）。 図６（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）は、ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）がＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８ Ｔ細胞活性化および脳マラリア発病に必要であることを示す。（Ｅ）野生型（ＷＴ）、Ｃｃｒ７−／−およびＢａｔｆ３−／−のマウスのナイーブ脾臓細胞におけるＣＤ８α ＤＣの割合をＦＡＣＳ分析によって決定したものを示す（平均±ＳＤ、１群あたり３匹、ただしＢａｔｆ３−／−はｎ＝１）。（Ｆ）感染後６日での脳全体および脾臓のＣＤ８ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。中の数字は脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞およびそのＣＤ１１ｃ発現の割合を示す。（Ｇ）１０６のＰｂＡ感染後のＢａｔｆ３＋／−（ｎ＝３）およびＢａｔｆ−／−（ｎ＝８）の生存曲線を示す。生存は毎日観察した。＊＊ｐ＝０．０１、Ｌｏｇランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定。 図６（Ｈ）および（Ｉ）は、Ｒａｇ２−／−マウス脾臓ＣＤ８α ＤＣの感染後５日目のフローサイトメトリー分析を示す。（Ｈ）上（緑色）の長方形の領域（ＣＤ８α＋ＤＣ）は、ＣＤＲ７を高度に発現するが、下（黒色）の長方形領域（ＣＤ８α−ＤＣ）は、低レベルのＣＣＤ７を発現する。（Ｉ）養子移植の感染したＲａｇ２−／−脾臓のＣＤ８α ＤＣの濃縮戦略を示す。第１のＣＤ１１ｂ＋細胞および後のＣＤ４＋細胞は、脾臓細胞から消極的に枯渇した。ＣＤ８α＋細胞の純度は９５％を超えていた。 図７は、嗅球がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染赤血球の脳内への蓄積の「出入口」となり得ることを示す。いったん宿主がＰｂＡＮＫＡ寄生虫に感染すると、血液や脾臓などの末梢において免疫細胞が活性化される。脾臓における感染により活性化されたＣＤ８α＋ＤＣ（１）が、ＣＣＲ７の発現を介してＣＤ８Ｔ細胞に対して抗原をクロスプライミングする能力を獲得する。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の一部は、ＣＤ１１ｃおよびＣＸＣＲ３を発現することによって、エフェクターの表現型となる（２）。これらの活性化された免疫細胞、感染赤血球（ｉＲＢＣ）または寄生虫の産生物が、ＯＬＦの糸球内の血管付近の星状細胞およびその周囲のエンドフィートによって感知され（３）、これにより、おそらくは星状細胞からの段階的なＣＣＬ２１分泌を誘導し（４）、そして、プライムされた免疫細胞に対するＢＢＢ出入口の開口に部分的に関与する。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＬＦへと特異的に移動し、ここでＣＣＬ２１および様々な他のケモカインが分泌され（５、６）、ＯＬＦにおける発熱および出血につながる（７）。
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。
本明細書において「脳マラリア」とは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアの最も致命的な合併症であり、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊に起因して生じるとされる。意識低下、言語のもつれなどの神経症状が起こるとされており、進行すると昏睡状態に陥り、死亡するとされている。脳マラリア（ＣＭ）の病理を理解するために、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）寄生虫を使用したＣＭのマウスモデルが広く用いられており（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｊ．ら（２０１１）．Ｍａｌａｒ Ｊ １０，２３．）、このマウスモデルにおける結果は、当該分野においてヒトに外挿可能であるとされている。
本明細書において「嗅球（ＯＬＦと略称することがある）」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味で用いられ、嗅葉前端の隆起であり、終脳の前端に位置し球状に突出した構造をしている。内部は層構造を示す主嗅球および副嗅球があり、それぞれ化学感覚受容器である嗅覚器からの嗅神経と鋤鼻器官からの鋤鼻神経が終始するとされている。嗅覚情報処理において重要な役割を果たすとされる。
本明細書において「嗅球の状態」は、嗅球の外見上、構造上または機能上の状態を包含する。より詳細には、嗅球の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等によって判定することができるが、これに限定されない。
本明細書において「超高磁場」の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）とは、現在臨床用として使用されている３テスラの磁場を超える高い磁場でのＭＲＩをいい、例えば、約４テスラ以上、約５テスラ以上、約６テスラ以上、約７テスラ以上などをさす。実施例では、１１．７テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。
本明細書において診断画像における「スポット」とは、正常な状態で見出される嗅球においては密に詰まった映像において、斑点状のものが見えることをいう。機能不全が推定される。
本明細書において、「細胞検査」は当該分野において慣用されるのと同じ意味を持ち、染色（例えば、ＨＥ染色）や免疫組織化学法等の染色が含まれる。
本明細書において、「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」または「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７軸」とは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいう。その模式図は図７に示される。「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」の因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７のほか、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ），ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１２ｐ４０、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＫＣ、ＭＣＰ−１（ＣＣＲ２リガンド）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳからなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞などもこの因子として考慮することができる。いったん宿主がマラリア原虫に感染すると、血液や脾臓などの末梢において免疫細胞が活性化される。脾臓における感染により活性化されたＣＤ８α＋樹状細胞が、ＣＣＲ７の発現を介してＣＤ８ Ｔ細胞に対して抗原をクロスプライミングする能力を獲得する。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の一部は、ＣＤ１１ｃおよび／またはＣＸＣＲ３を発現することによって、エフェクターの表現型となる。これらの活性化された免疫細胞、感染赤血球（ｉＲＢＣ）または寄生虫の産生物が、ＯＬＦの糸球内の血管付近の星状細胞およびその周囲のエンドフィートによって感知され、これにより、星状細胞からの段階的なＣＣＬ２１分泌を誘導し、プライムされた免疫細胞に対するＢＢＢ出入口を開口すると考えられる。活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＬＦへと特異的に移動し、ここでＣＣＬ２１が分泌され、ＯＬＦにおける発熱および出血につながると考えられる。
本明細書において「ＣＣＬ２１」とは、ＣＣＲ７の内因性リガンドであり、高内皮細静脈（そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管）にみられるとされるケモカインリガンドであり、ＣＣサブファミリーのメンバーである。６Ｃｋｉｎｅ、ＣＫｂ９、ＥＣＬ、ＳＣＹＡ２１、ＳＬＣ、ＴＣＡ４ともいわれる。ヒトＣＣＬ２１の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００２９８９（配列番号１）およびＮＰ＿００２９８０（配列番号２）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＭ＿０１１１２４およびＮＰ＿０３５２５４に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＣＬ２１としては、ＯＭＩＭ：６０２７３７とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＣＬ２１」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
なお、本発明で挙げる他のタンパク質すべてにも同じことがあてはまる。従って、既定のタンパク質または核酸の名称は、配列表に示すようなタンパク質または核酸を指すだけでなく、機能的に活性な誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で、好ましくは上述のような条件下で、前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、指す。本明細書で使用される「誘導体」または「構成要素タンパク質の類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。
ヒト以外の多くの哺乳動物が本発明のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１タンパク質）を発現していることが知られているため、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。本発明において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１）のフラグメントとは、タンパク質または核酸の場合、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の任意の領域を含むポリペプチドであり、本発明の目的を達成し得る限り天然のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の生物学的機能を有していなくてもよい。
ＣＣＬ２１の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＬ２１の有する活性をいう。
ＣＣＬ２１のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および
欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＬ２１の有する活性をいう。
本明細書において「ＣＸＣＲ３」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、Ｇタンパク質共役受容体であるＣＸＣケモカインレセプターファミリーの１つである。Ｇタンパク質共役受容体９（ＧＰＲ９）やＣＤ１８３のほか、ＣＤ１８２；ＣＫＲ−Ｌ２；ＣＭＫＡＲ３；ＩＰ１０−Ｒ；Ｍｉｇ−Ｒ；ＭｉｇＲなどとも呼ばれることがある。２つの変異体があるとされており、ＣＸＣＲ３−ＡおよびＣＸＣＲ３−Ｂの二種類がある。ＣＸＣＲ３−Ａは、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）に結合するとされており、ＣＸＣＲ３−Ｂは、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＸＣＬ１１ （Ｉ−ＴＡＣ）に加えてＣＸＣＬ４にも結合し得るとされている。ヒトＣＸＣＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００１１４２７９７（配列番号３）およびＮＰ＿００１１３６２６９（配列番号４）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＭ＿００９９１０およびＮＰ＿０３４０４０に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＸＣＲ３としては、ＯＭＩＭ：３００５７４とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＸＣＲ３」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
ＣＸＣＲ３の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＸＣＲ３の有する活性をいう。
ＣＸＣＲ３のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＸＣＲ３の有する活性をいう。
本明細書において「ＣＣＲ７」とは、当該分野で慣用されるのと同じ意味を有し、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ ｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７の略称であり、ケモカインレセプターの一つである。ＣＣＲ７には２種類の内因性リガンドが存在する。１つはＣＣＬ２１で、これは高内皮細静脈（そこを通ってリンパ球が血液を離れリンパ節に入るように特化した血管）にみられる。もう１つはＣＣＬ１９で、これはリンパ節のＴ細胞域（Ｔ細胞がＢ細胞とは分かれて集合している部位）に存在するとされている。ＢＬＲ２；ＣＤ１９７；ＣＤｗ１９７；ＣＭＫＢＲ７；ＥＢＩ１などとも呼ばれることがある。ヒトＣＣＲ７の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００１８３８（配列番号５）およびＮＰ＿００１８２９（配列番号６）に開示されており、マウスの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＭ＿００７７１９およびＮＰ＿０３１７４５に開示されており、本明細書でもこれらの情報を援用する。ＣＣＲ７としては、ＯＭＩＭ：６００２４２とのアクセッション番号で同定されうる。本明細書の目的で使用される場合は、「ＣＣＲ７」は、特定の配列番号またはアクセッション番号に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
ＣＣＲ７の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＲ７の有する活性をいう。
ＣＣＲ７のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、であり得る。ここで、生物学的活性とは、代表的に、ＣＣＲ７の有する活性をいう。
このほかにも、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子は存在し、例えば、以下を挙げることができる：
（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ８Ｔ細胞および他のＴ細胞。
これらはいずれも、当該分野で公知の手法を用いて同定することができる。そのような手法として参考にできる文献として本明細書において他に言及した文献等を挙げることができる。
本発明の関連において、「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合する物質」または「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の相互作用分子」は、少なくとも一時的にＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合し、そして好ましくは、結合したことを表示しうる（例えば標識されるか標識可能な状態である）、分子または物質である。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に結合する物質はＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の阻害剤であってもよく、その例としては、抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、低分子量分子（ＬＭＷ）、結合性ペプチド、アプタマー、リボザイムおよびペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）等を挙げることができ、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対して向けられる、特にＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の活性部位に対して指向される、結合性タンパク質または結合性ペプチド、並びにＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の遺伝子（核酸）に対して指向される核酸も含まれる。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対する核酸は、例えばＣＣＬ２１遺伝子の発現またはＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）の活性を阻害する、二本鎖または一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはその修飾物または誘導体を指し、そして限定なしに、アンチセンス核酸、アプタマー、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）およびリボザイムを含む。本明細書において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）について「結合性タンパク質」または「結合性ペプチド」とは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合する種類のタンパク質またはペプチドを指し、そしてＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）に対して指向されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、抗体フラグメントおよびタンパク質骨格を含むがこれらに限定されない。
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−０−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−０−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本発明の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．２８（２０１３．４．２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
本発明の一実施形態において「数個」は、例えば、１０、８、６、５、４、３、または２個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。１または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Ｍａｒｋｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８４ Ｓｅｐ；８１（１８）：５６６２−５６６６．、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８２ Ｏｃｔ ２５；１０（２０）：６４８７−６５００．、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８４ Ｊｕｎ２９；２２４（４６５６）：１４３１−１４３３．）。欠失等がなされた抗体は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、または抗体ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，ＬＴＤ．）を使用できる。欠失等を導入した変異型抗体から、野生型と同様の活性のある抗体を選択することは、ＦＡＣＳ解析やＥＬＩＳＡ等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
本発明の一実施形態において「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。（１）洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる（例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、または（３）２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベーションし、次に約３７−５０℃で１×ＳＳＣでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は５０％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、５、１５、３０、６０、もしくは１２０分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はＡｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ１：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｖｏｌ．１、７．４２−７．４５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０°Ｃでの、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２°Ｃでの約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０°Ｃ、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本発明において使用されるポリペプチドには、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸あるいは部分とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７）において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドあるいは部分と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいい、複合分子にあっては対応する部分（例えば、ヘパラン硫酸等）をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ−Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。このような対応する領域またはドメインは、本発明において複合分子を設計する場合に有用である。
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒトのＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７は、それぞれ、他の動物（特に哺乳動物）において、対応するＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）は、配列番号１、３、５または配列番号２、４、６等の配列をクエリ配列として用いてその動物の配列を含むデータベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントは、例えば、全長のものがマーカーまたは標的分子として機能する場合、そのフラグメント自体もまたマーカーまたは標的分子としての機能を有する限り、本発明の範囲内に入ることが理解される。
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活
性は、その二分子の間の結合およびそれによって生じる生物学的変化であり得、そして、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。従って、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍＲＮＡを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のｍＲＮＡの量、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質の量、そしてＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現レベルを知ることができる。このような測定値はコンパニオン診断において使用し得る。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のｍＲＮＡやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等」またはその抗体の機能的等価物は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体ではないが、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体またはこのＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体自体またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本発明において、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索として
は、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本発明の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜９個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
本明細書において「阻害剤」とは、対象となる実体（例えば、レセプターまたは細胞）に対してそのレセプターまたは細胞の生物学的作用を阻害する物質または因子をいい、抑制剤等ともいう。本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の阻害剤としては、対象となるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を発現する細胞等の機能を一時的または永久に低下または消失させることができる因子である。このような因子には、抗体、その抗原結合フラグメント、それらの誘導体、機能的等価物、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ因子等の核酸の形態のもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本明細書において「アゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用を発現またはそれを増強する物質をいう。天然のアゴニスト（リガンドとも称される）のほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。
本明細書において「アンタゴニスト」とは、対象となる実体（例えば、レセプター）に対してそのレセプターの生物学的作用の発現を抑制または阻害する物質をいう。天然のアンタゴニストのほか、合成されたものや改変されたもの等を挙げることができる。アゴニスト（またはリガンド）と競合的に抑制または阻害するもののほか、非競合的に抑制または阻害するもの等がある。アゴニストを改変することによっても得られうる。生理現象を抑制または阻害することから、アンタゴニストは阻害剤（抑制剤）または阻害（抑制）（する）因子の概念に包含されうる。したがって、本明細書においては実質的にアンタゴニストは「阻害剤」と同義で用いられる。
本発明の一実施形態において「抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等」は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に結合性を有する抗体を含む。この抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の生産方法は特に限定されないが、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を哺乳類または鳥類に免疫することによって生産してもよい。
また、「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対する抗体（抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等）、または、そのフラグメント」の「機能的等価物」は、例えば、抗体の場合、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の結合活性、必要であれば抑制活性を有する抗体自体およびそのフラグメント自体のほか、キメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二重特異性またはオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、単鎖抗体、ｓｃＦＶ、ダイアボディー、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ（Ｆｖ）２）、ｓｃＦｖ−Ｆｃなども包含されることが理解される。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、悪性腫瘍の増殖が特に強く抑制される観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の特定のエピトープに特異的に結合する抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等であることが好ましい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体であれば、ポリクローナル抗体に比べて、効率的にＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対して作用させることができる。抗ＣＣＬ２１モノクローナル抗体、抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体、抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体等を効率的に生産する観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等をニワトリに免疫することが好ましい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の抗体クラスは特に限定されないが、例えばＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＹであってもよい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、抗原結合活性を有する抗体フラグメント（以下、「抗原結合性フラグメント」と称することもある）であっても良い。この場合、安定性または抗体の生産効率が上昇する等の効果がある。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、融合タンパク質であってもよい。この融合タンパク質は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等のＮまたはＣ末端に、ポリペプチドまたはオリゴペプチドが結合したものであってもよい。ここで、オリゴペプチドは、Ｈｉｓタグであってもよい。また融合タンパク質は、マウス、ヒト、またはニワトリの抗体部分配列を融合したものであってもよい。それらのような融合タンパク質も、本実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の一形態に含まれる。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、例えば、精製ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞、またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体であってもよい。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、精製ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞またはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等含有脂質膜で生物を免疫する工程を経て得られる抗体の、ＣＤＲセットを有する抗体であってもよい。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞を免疫に使用することが好ましい。ＣＤＲセットとは、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、並びに、軽鎖ＣＤＲ１、２、および３のセットである。
本発明の一実施形態において「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現細胞」は、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入後、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を発現させることによって得てもよい。ここでＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態において「ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等含有脂質膜」は、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等と脂質二重膜を混合することによって得てもよい。ここでＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のフラグメントを含む。また本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、抗原をニワトリに免疫する工程を経て得られる抗体、またはその抗体のＣＤＲセットを有する抗体が好ましい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、目的を達成する限り、どのような結合力を有していてもよく、例えば、少なくとも１．０×１０６以上、２．０×１０６以上、５．０×１０６以上、１．０×１０７以上を挙げることができるがこれらに限定されず、通常は、ＫＤ値が、１．０×１０７以上であってもよい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を有していてもよい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の野生型または変異型に結合する抗体であってもよい。変異型とは、個体間のＤＮＡ配列の差異に起因するものを含む。野生型または変異型のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のアミノ酸配列は、配列番号２、４、６等に示すアミノ酸配列に対し、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有している。
本明細書において「抗体」は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる分子またはその集団を含む。また抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、様々な形態で存在することができ、例えば、全長抗体（Ｆａｂ領域とＦｃ領域を有する抗体）、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、多価特異的抗体（例えば、二価特異的抗体）、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド、キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ抗体、ニワトリ−ヒトキメラ抗体等）、マウス抗体、ニワトリ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはそれらの同等物（または等価物）からなる群から選ばれる１種以上の形態であってもよい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本発明で用いられる抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のタンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。また抗体は、抗体修飾物または抗体非修飾物を含む。抗体修飾物は、抗体と、例えばポリエチレングリコール等の各種分子が結合していてもよい。抗体修飾物は、抗体に公知の手法を用いて化学的な修飾を施すことによって得ることができる。
本発明の一実施形態において「ポリクローナル抗体」は、例えば、抗原に特異的なポリクローナル抗体の産生を誘導するために、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、サル等）、鳥類等に、目的の抗原を含む免疫原を投与することによって生成することが可能である。免疫原の投与は、１つ以上の免疫剤、および所望の場合にはアジュバントの注入をしてもよい。アジュバントは、免疫応答を増加させるために使用されることもあり、フロイントアジュバント（完全または不完全）、ミネラルゲル（水酸化アルミニウム等）、または界面活性物質（リゾレシチン等）等を含んでいてもよい。免疫プロトコールは、当該技術分野で公知であり、選択する宿主生物に合わせて、免疫応答を誘発する任意の方法によって実施される場合がある（タンパク質実験ハンドブック，羊土社（２００３）：８６−９１．）。
本発明の一実施形態において「モノクローナル抗体」は、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に単一のエピトープに対応する抗体である場合を含む。または、集団を構成する個々の抗体が、少量自然に生じることが可能な突然変異を有する抗体を除いて、実質的に同一である抗体であってもよい。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、異なるエピトープに対応する異なる抗体を典型的に含むような、通常のポリクローナル抗体とは異なる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成できる点で有用である。「モノクローナル」という形容は、実質的に均一な抗体集団から得られるという特徴を示していてもよいが、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、モノクローナル抗体は、″Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ７；２５６（５５１７）：４９５−４９７．″に掲載されているようなハイブリドーマ法と同様の方法によって作製してもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え法と同様の方法によって作製してもよい。または、モノクローナル抗体は、″Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９１ Ａｕｇ １５；３５２（６３３６）：６２４−６２８．″、または″Ｍａｒｋｓｅｔ ａｌ．，ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９１ Ｄｅｃ ５；２２２（３）：５８１−５９７．″に記載されているような技術と同様の方法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。または、″タンパク質実験ハンドブック，羊土社（２００３）：９２−９６．″に掲載されている方法でよって作製してもよい。
抗体の大量生産については、当該分野で公知の任意の手法を用いることができるが、例えば、代表的な抗体の大量生産系の構築および抗体製造としては、以下を例示することができる。すなわち、ＣＨＯ細胞にＨ鎖抗体発現ベクターおよびＬ鎖抗体発現ベクターをトランスフェクションし、選択試薬であるＧ４１８およびＺｅｏｃｉｎを用いて培養を行い、限界希釈法によるクローニングを行う。クローニング後、安定的に抗体を発現しているクローンをＥＬＩＳＡ法により選択する。選択したＣＨＯ細胞を用いて拡大培養し、抗体を含む培養上清を回収する。回収した培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡもしくはＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ精製により抗体を精製することができる。
本発明の一実施形態において「Ｆｖ抗体」は、抗原認識部位を含む抗体である。この領域は、非共有結合による１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成することができる。
本発明の一実施形態において「Ｆａｂ抗体」は、例えば、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体が一部のジスルフィド結合を介して結合した抗体である。Ｆａｂは、例えば、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を、タンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
本発明の一実施形態において「Ｆ（ａｂ’）２抗体」は、例えば、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られるフラグメントのうち、Ｆａｂに相当する部位を２つ含む抗体である。Ｆ（ａｂ’）２は、例えば、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域を含む本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を、タンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。また、例えば、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで、作製することができる。
本発明の一実施形態において「Ｆａｂ’抗体」は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断して得られる抗体である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
本発明の一実施形態において「ｓｃＦｖ抗体」は、ＶＨとＶＬとが適当なペプチドリンカーを介して連結した抗体である。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ＶＨ−ペプチドリンカー−ＶＬをコードするポリヌクレオチドを構築し、そのポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
本発明の一実施形態において「ｄｉａｂｏｄｙ」は、二価の抗原結合活性を有する抗体である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。ｄｉａｂｏｄｙは、例えば、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、得られたポリヌクレオチドをベクターに組み込み、発現用の細胞を用いて生産できる。
本発明の一実施形態において「ｄｓＦｖ」は、ＶＨおよびＶＬ中にシステイン残基を導入したポリペプチドを、上記システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた抗体である。システイン残基に導入する位置はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｒｅｉｔｅｒｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９４ Ｍａｙ；７（５）：６９７−７０４．）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明の一実施形態において「抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド」は、抗体のＶＨ、ＶＬ、またはそれらのＣＤＲ１、２、もしくは３を含んで構成される抗体である。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
上記のＦｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆａｂ’抗体、ｓｃＦｖ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ抗体、抗原結合性を有するペプチドまたはポリペプチド（以下、「Ｆｖ抗体等」と称することもある）の生産方法は特に限定しない。例えば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等におけるＦｖ抗体等の領域をコードするＤＮＡを発現用ベクターに組み込み、発現用細胞を用いて生産できる。または、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢＯＣ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって生産してもよい。なお本発明の一実施形態に係る抗原結合性フラグメントは、上記Ｆｖ抗体等の１種以上であってもよい。
本発明の一実施形態において「キメラ抗体」は、例えば、異種生物間における抗体の可変領域と、抗体の定常領域とを連結したもので、遺伝子組換え技術によって構築できる。マウス−ヒトキメラ抗体は、例えば、″Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４Ｆｅｂ １；９１（３）：９６９−９７３．″に記載の方法で作製できる。マウス−ヒトキメラ抗体を作製するための基本的な方法は、例えば、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体定常領域をコードする配列に連結する。または、クローン化されたｃＤＮＡに存在するマウスリーダー配列および可変領域配列をヒト抗体定常領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結してもよい。ヒト抗体定常領域のフラグメントは、任意のヒト抗体のＨ鎖定常領域およびヒト抗体のＬ鎖定常領域のものとすることができ、例えばヒトＨ鎖のものについてはＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４を、Ｌ鎖のものについてはＣλまたはＣκを各々挙げることができる。
本発明の一実施形態において「ヒト化抗体」は、例えば、非ヒト種由来の１つ以上のＣＤＲ、およびヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）、さらにヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有し、所望の抗原に結合する抗体である。抗体のヒト化は、当該技術分野で既知の種々の手法を使用して実施可能である（Ａｌｍａｇｒｏｅｔ ａｌ．，ＦＲｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００８ Ｊａｎ １；１３：１６１９−１６３３．）。例えば、ＣＤＲグラフティング（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９ Ｊｕｎ １；９３（１１）：３９２２−３９３０．）、Ｒｅ−ｓｕｒｆａｃｉｎｇ（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９４ Ｆｅｂ１；９１（３）：９６９−９７３．）、またはＦＲシャッフル（Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ａｐｒ；４４（１１）：３０４９−３０６０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊａｎ ２２．）などが挙げられる。抗原結合を改変するために（好ましくは改善するために）、ヒトＦＲ領域のアミノ酸残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。このＦＲ置換は、当該技術分野で周知の方法によって実施可能である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８８ Ｍａｒ ２４；３３２（６１６２）：３２３−３２７．）。例えば、ＣＤＲとＦＲ残基の相互作用のモデリングによって抗原結合に重要なＦＲ残基を同定してもよい。または、配列比較によって、特定の位置で異常なＦＲ残基を同定してもよい。
本発明の一実施形態において「ヒト抗体」は、例えば、抗体を構成する重鎖の可変領域および定常領域、軽鎖の可変領域および定常領域を含む領域が、ヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体である。主な作製方法としてはヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法、ファージディスプレイ法などがある。ヒト抗体作製用トランスジェニックマウス法では、内因性Ｉｇをノックアウトしたマウスに機能的なヒトのＩｇ遺伝子を導入すれば、マウス抗体の代わりに多様な抗原結合能を持つヒト抗体が産生される。さらにこのマウスを免疫すればヒトモノクローナル抗体を従来のハイブリドーマ法で得ることが可能である。例えば、″Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１３（１）：６５−９３．″に記載の方法で作製できる。ファージディスプレイ法は、典型的には大腸菌ウイルスの一つであるＭ１３やＴ７などの繊維状ファージのコートタンパク質（ｇ３ｐ、ｇ１０ｐ等）のＮ末端側にファージの感染性を失わないよう外来遺伝子を融合タンパク質として発現させるシステムである。例えば、″Ｖａｕｇｈａｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６Ｍａｒ；１４（３）：３０９−３１４．″に記載の方法で作製できる。
また抗体は、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９ Ｊｕｎ １；９３（１１）：３９２２−３９３０．）によって任意の抗体に本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲをグラフティングすることで作製してもよい。または、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲをコードするＤＮＡと、公知のヒトまたはヒト以外の生物由来の抗体の、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを除く領域をコードするＤＮＡとを、当該技術分野で公知の方法に従ってベクターに連結後、公知の細胞を使用して発現させることによって得ることができる。このとき、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等の標的抗原への作用効率を上げるために、当該分野で公知の方法（例えば、抗体のアミノ酸残基をランダムに変異させ、反応性の高いものをスクリーニングする方法、またはファージディスプレイ法等）を用いて、重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを除く領域を最適化してもよい。また、例えば、ＦＲシャッフル（Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ａｐｒ；４４（１１）：３０４９−３０６０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊａｎ ２２．）、またはバーニヤゾーンのアミノ酸残基またはパッケージング残基を置換する方法（特開２００６−２４１０２６、またはＦｏｏｔｅｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｍａｒ ２０；２２４（２）：４８７−４９９．）を用いて、ＦＲ領域を最適化してもよい。
本発明の一実施形態において「重鎖」は、典型的には、全長抗体の主な構成要素である。重鎖は、通常、軽鎖とジスルフィド結合および非共有結合によって結合している。重鎖のＮ末端側のドメインには、同種の同一クラスの抗体でもアミノ酸配列が一定しない可変領域（ＶＨ）と呼ばれる領域が存在し、一般的に、ＶＨが抗原に対する特異性、親和性に大きく寄与していることが知られている。例えば、″Ｒｅｉｔｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｊｕｌ １６；２９０（３）：６８５−９８．″にはＶＨのみの分子を作製したところ、抗原と特異的に、高い親和性で結合したことが記載されている。さらに、″Ｗｏｌｆｓｏｎ Ｗ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｄｅｃ；１３（１２）：１２４３−１２４４．″には、ラクダの抗体の中には、軽鎖を持たない重鎖のみの抗体が存在していることが記載されている。
本発明の一実施形態において「ＣＤＲ（相補性決定領域）」は、抗体において、実際に抗原に接触して結合部位を形成している領域である。一般的にＣＤＲは、抗体のＦｖ（可変領域：重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む）上に位置している。また一般的にＣＤＲは、５〜３０アミノ酸残基程度からなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が存在する。そして、特に重鎖のＣＤＲが抗体の抗原への結合に寄与していることが知られている。またＣＤＲの中でも、ＣＤＲ３が抗体の抗原への結合における寄与が最も高いことが知られている。例えば、″Ｗｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ Ｖｏｌｕｍｅ ３５６，Ｉｓｓｕｅ１，２７ Ａｐｒｉｌ２００７，Ｐａｇｅｓ １２４−１２８″には、重鎖ＣＤＲ３を改変させることで抗体の結合能を上昇させたことが記載されている。ＣＤＲ以外のＦｖ領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなり、抗体間で比較的よく保存されている（Ｋａｂａｔｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳＤｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄＨｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３．）。即ち、抗体の反応性を特徴付ける要因はＣＤＲにあり、特に重鎖ＣＤＲにあるといえる。
ＣＤＲの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されている。例えば、Ｋａｂａｔの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ ＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａの定義（Ｃｈｏｔｈｉａｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７；１９６：９０１−９１７）を採用してもよい。本発明の一実施形態においては、Ｋａｂａｔの定義を好適な例として採用するが、必ずしもこれに限定されない。また、場合によっては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の折衷案である、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＭａｒｔｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９；８６：９２６８−９２７２）がある。このようなＣＤＲの情報を用いて、本発明に使用されうる変異体を生産することができる。このような抗体の変異体では、もとの抗体のフレームワークに１または数個（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個）の置換、付加もしくは欠失を含むが、該ＣＤＲには変異を含まないように生産することができる。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。本発明の抗体は、エピトープが同じであれば、他の配列を有する抗体であっても同様に利用することができることが理解される。
本明細書において使用される抗体は、擬陽性が減じられる限り、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識することができる手段をいう。
本明細書において「マーカー（物質または遺伝子）」とは、ある状態（例えば、脳マラリアの疾患状態、障害状態、あるいは悪性状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子、遺伝子産物、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、脳マラリア等の疾患の状態）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「発現産物」（遺伝子産物ともいう）とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、脳マラリアへの関連が示されていない遺伝子産物（ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等）が脳マラリアの指標として使用可能であることが見出された。
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、血清等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態（例えば、脳マラリア）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
本明細書において「検出薬（剤）」または「検査薬（剤）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる薬剤をいう。
本明細書において「診断薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う１つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいい、本発明が提供するような阻害剤（例えば、抗体）をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される１つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、脳マラリア）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、脳マラリア等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、脳マラリア等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。本発明の検出、検査および診断は、このような相互作用を利用して実現することができる。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つの物質の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
従って、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に」相互作用する（または結合する）「因子」（または、薬剤、検出剤等）とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含む試料中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用する（または結合する）ことをいう。物質または因子について特異的な相互作用（または結合）としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の反応、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に」相互作用する（または結合する）ことには、抗体と、その抗原との間の相互作用（または結合）が包含される。このような特異的な相互作用または結合の反応を利用することにより、試料中の対象物の検出または定量を行うことができる。
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、検出剤、検査剤または診断剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、ＮａｔＧｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−５３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞、組織などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ等が発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。あるマーカーの発現量を測定することによって、マーカーに基づく種々の検出または診断を行うことができる。
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。減少のうち「消失」した場合は、活性、発現産物等が検出限界未満になることをいい、特に「消失」ということがある。本明細書では、「消失」は「減少」または「抑制」に包含される。
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出、検査または診断の手段としてもちいられる。
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。リガンドを標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭ Ｆｌｕｏｒが望ましい。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５の組み合わせ等を挙げることができる。核酸を標識する場合は、その塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
本明細書において使用される場合、「タグ」とは、受容体−リガンドのような特異的認識機構により分子を選別するための物質、より具体的には、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいい、「標識」の範疇に含まれうる。よって、例えば、タグが結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。このようなタグまたは標識は、当該分野で周知である。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなど
が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマーカーまたはマーカーの検出剤、検査剤、診断剤（プライマーまたはプローブ等であり得る）にはこのようなタグを結合させてもよい。
本明細書において「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。
本明細書において「インビトロ」（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
本明細書において「エキソビボ」とは、ある処置について、体外で行われるがその後体内に戻されることが意図される場合、一連の動作をエキソビボという。本発明においても、生体内にある細胞を本発明の薬剤で処置して再度患者に戻すような実施形態を想定することができる。
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
（嗅球の状態に基づく脳マラリアの診断）
１つの局面において、本発明は、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を脳マラリアの指標とする方法を提供する。あるいは、本発明は、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を判定する工程を包含する、脳マラリアの診断方法を提供する。ここで、被験体の嗅球が異常であることは、該被験体が脳マラリアに罹患していることの指標であることが本発明において見出された。このような診断は、脳マラリアの他の症状が出る前に見出すことができることから、脳マラリアの早期診断を可能にするものとして注目されるべきである。すなわち、被験体の嗅球の異常は、脳マラリアの罹患早期の指標といえる。また、嗅球の状態の判定は、種々の手法で行うことが可能であり、脳マラリアの早期診断、および本発明が初めて提供するもののような脳マラリアの予防または治療薬を投与することで、脳マラリアの本格的な処置を可能にするという点でも注目される。
１つの実施形態において、本発明が判定する被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明の診断方法は、嗅覚異常、細胞検査および嗅球の診断画像等から選択される少なくとも１つを行う工程を包含し、その結果によって、被験体の嗅球（ＯＬＦ）の状態を判定することができ、それによって、脳マラリアの罹患早期の指標とすることができる。
本明細書において、嗅覚は、食品に対する反応、芳香剤に対する反応、（他の可能な試験をご列挙ください）等があり、嗅覚測定法としては、例えば、各種におい物質に対する基準嗅覚検査、アリナミンなどを用いる静脈的嗅覚検査、ＡＳＴＭ注射器法，無臭室法，セントメータ法，食塩水平衡法，三点比較式臭袋法などによって試験することができる。
本明細書において、嗅球の診断画像は核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって得られたものであり得るが、これに限定されない。本発明が使用する「超高磁場」の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）としては、現在臨床用として使用されている３テスラ（Ｔ）の磁場またはそれを超える高い磁場、例えば、少なくとも３テスラ以上、少なくとも４テスラ以上、少なくとも５テスラ以上、少なくとも６テスラ以上、少なくとも７テスラ以上、少なくとも８テスラ以上、少なくとも９テスラ以上、少なくとも１０テスラ以上、少なくとも１１テスラ以上、少なくとも１２テスラ以上でのＭＲＩを挙げることができる。実施例では、１１．７テスラのものが使用され、嗅球の状態を判定することができている。
本発明の判定において、診断画像において、スポットが観察されることは脳マラリアの指標である。このようなスポットは、嗅球に異常があることが示されるものであり、脳マラリアの感染の指標であることが本発明において明らかになった。
本発明では、嗅球の状態は、細胞検査によって判定してもよく、そのような判定は、染色（例えば、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色）または免疫組織化学法で検査される。
１つの局面では、本発明は、嗅球の状態を測定する手段を含む、脳マラリアの検出または診断のための装置を提供する。このような装置は、上記方法を実現するものであれば、どのようなものでもよいことが理解される。
１つの実施形態では、本発明の装置において用いられる手段は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）手段である。好ましくは、本発明において用いられるＭＲＩは、超高磁場ＭＲＩである。通常のＭＲＩでは、嗅球の異常をとらえることができなかったが、本発明では、超高磁場のＭＲＩを用いることによって、はじめて、嗅球の異常を脳マラリアとの関係を解明することができた。したがって、本発明は、超高磁場によるＭＲＩを用いるという点でも顕著性を示すといえる。
（ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系に基づく治療剤）
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤、予防薬または治療薬、予防または治療のための医薬もしくは医薬組成物（これらの用語は、本明細書において特に断らない限り相互に交換可能に使用され同じ対象を指す。）を提供する。あるいは、本発明は、脳マラリアの予防または治療のための、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤を提供する。この治療または予防薬または特定の治療または予防用の阻害剤を用いれば、脳マラリアを治療または予防することができる。またこの予防または治療薬は、これまで治療・予防法がなかった脳マラリアに初めて予防および治療薬を提供するという点で優れており、好ましい実施形態で使用される場合は抗体を使用するため、安全性の観点から優れている。
１つの実施形態では、本発明が使用するＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７、ならびにこれらをコードする核酸からなる群より選択される少なくとも１つ因子の阻害剤を含む。
より特定した実施形態では、本発明の阻害剤は、低分子化合物、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物を少なくとも１種含む。これらは、２種以上使用してもよい。
好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも１種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。より好ましい実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも２種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。理論に束縛されることを望まないが、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系のうちの２か所以上で阻害効果を発揮させることによって脳マラリアのより顕著な効果がおいて示されており、より効果を望む場合には２種類以上の因子の阻害が好ましいと想定される。
さらに別の実施形態では、本発明で使用される阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体の３種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、重鎖ＣＤＲ１、２、および３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列のセットを含み、さらに、重鎖ＦＲ１、２、３、４、軽鎖ＦＲ１、２、３、および４のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、あるいはすべてのフレームワークが特定されたもののいずれかのものと同一または実質的に同一あるいは保存的置換を除き同一であるものであり得る。１種以上の抗体であってもよい。また本発明の別の実施形態は、上に列挙した重鎖ＦＲ１、２、３、および４のアミノ酸配列のセットのうち、少なくとも１つのセットを含む抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等である。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等は、ｓｃＦｖの形態であってもよく、その場合、重鎖と軽鎖間のリンカーは、重鎖と軽鎖との間のアミノ酸配列を有していてもよい。上に列挙したアミノ酸配列は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等が所望の効果を有する限り、（ｉ）上記のアミノ酸配列において、１または数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加しているアミノ酸配列、（ｉｉ）上記のアミノ酸配列に対して、９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉｉ）上記のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列、からなる群から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列であってもよい。
本発明の一実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に導入することによって、形質転換体を作成できる。この形質転換体を用いれば、本発明の実施形態に係る抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ７抗体等を作製できる。形質転換体は、ヒトまたはヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等）の細胞であってもよい。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、サル細胞ＣＯＳ−７などが挙げられる。または、形質転換体はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌、酵母等であってもよい。
上記のベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ−Ｂｌｕｅ）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１−１１、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ）、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、または抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。
上記のポリヌクレオチドまたはベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスによる方法、レトロウイルスによる方法、またはマイクロインジェクションなどを使用できる（改訂第４版 新 遺伝子工学ハンドブック，羊土社（２００３）：１５２−１７９．）。抗体の細胞を用いた生産方法としては、例えば、″タンパク質実験ハンドブック，羊土社（２００３）：１２８−１４２．″に記載の方法を使用できる。抗体の精製においては、例えば、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、プロテインＡ、プロテインＧ、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、またはレクチンクロマトグラフィーなどを用いることができる（タンパク質実験ハンドブック，羊土社（２００３）：２７−５２．）。
別の実施形態では、前記ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の阻害剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物である。抗体は、全長配列のＣＤＲを含む任意の配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは、特定の配列の可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、そのフレームワーク領域において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、もしくは、２０個、またはそれ以上の置換、不可、もしくは、欠失を含む抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の製造等については、本明細書の他の箇所に記載された実施形態および／または当該分野で公知の手法を用いることができる。なお、本発明の治療または予防の目的では、このような抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物は、好ましくは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の下流の阻害活性を有することが好ましい。
本発明を実施するために、本発明の核酸形態の抑制剤としてはアンチセンス活性を指標に核酸を選択することができる。ここで、「アンチセンス活性」とは、標的となる遺伝子の発現を特異的に抑制または減少させることができる活性をいう。より具体的には細胞内に導入したあるヌクレオチド配列に依存して、その配列と相補的なヌクレオチド配列領域をもつ遺伝子のｍＲＮＡ量を特異的に低下させることで、タンパク発現量を減少させ得る活性をいう。手法としては、標的となる遺伝子からつくられるｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子を直接的に細胞に導入する方法と、細胞内に目的遺伝子と相補的なＲＮＡを発現させ得る構築ベクターを導入する方法に大別される。
アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２１の連続するヌクレオチド長の、２２の連続するヌクレオチド長の、２３の連続するヌクレオチド長の、２４の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加および／または欠失を有するものもまた含まれる。したがって、本明細書において、アンチセンス活性には、遺伝子の発現量の減少が含まれるがそれらに限定されない。
一般的なアンチセンス技術については、教科書に記載されている（Ｍｕｒｒａｙ，ＪＡＨ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，１９９２）。さらに最新の研究でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象が明らかになり、アンチセンス技術の発展をもたらした。
本明細書において「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、当該分野で一般に知られており、ＲＮＡｉを引き起こす因子によって媒介される、細胞における遺伝子発現を阻害または下方制御する生物学的プロセスである。例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において「ＲＮＡｉ」はまた、場合によっては、「ＲＮＡｉを引き起こす因子」、「ＲＮＡｉを起こす因子」、「ＲＮＡｉ因子」などと同義に用いられ得る。ＲＮＡｉについては、例えば、Ｚａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；Ｖａｕｇｈｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ他、国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他、国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他、国際公開第００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際公開第９９／０７４０９号およびＬｉ他、国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ａｎｄＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照。）。また、本明細書では、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、エピジェネティクスなどの配列特異的ＲＮＡ干渉の記述に用いられる他の用語と同義のものを示すものとして理解される。本明細書では、「ＲＮＡｉを起こす因子」は「ＲＮＡｉ」を起こす限りどのようなものであってもよい。
本明細書では「ＲＮＡｉを起こす因子」としては、「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」等が挙げられ、これらの用語は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することができる任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールも表し得る。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む二本鎖核酸分子であり得る。
本発明で代表的に用いられる「ｓｉＲＮＡ」は、短い長さ、通常、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
本発明において、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉを起こす因子では、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、一方の鎖がセンス鎖であり、他方がアンチセンス鎖である、２個の別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的である（すなわち、アンチセンス鎖とセンス鎖が二本鎖または二本鎖構造を形成するなど、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ここで、例えば、二本鎖領域は、約１５から約３０、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対でありうるが、これらより長くてもよい。アンチセンス鎖は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、その分子の約１５から約２５個またはそれを超えるヌクレオチドは、標的核酸またはその一部に相補的である）。あるいは、これらの分子は、単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、これらの分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸リンカーまたは非核酸リンカーによって連結されている。これらの分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を有するセンス領域を含む。これらの分子は、２個以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む軸（ｓｔｅｍ）とを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチドであり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列、および標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含み、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介し得る活性な分子を生成し得る。これらの因子は、標的核酸分子中のヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得る（例えば、これらの因子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列がこれらの因子内に存在する必要がない。）。一本鎖ポリヌクレオチドは、５’リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８参照）、５’，３’−二リン酸などの末端リン酸基を更に含み得る。ある実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含む。ここで、センス領域とアンチセンス領域は、当該分野で公知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合しており、またはイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および／またはスタッキング相互作用によって交互に非共有結合している。ある実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態においては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、ＲＮＡのみを含む分子に必ずしも限定されず、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある実施形態においては、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、２’ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いていてもよいく。ある実施形態において、本発明はＲＮＡｉを媒介するのに２’ヒドロキシル基を有するヌクレオチドの存在が不要である低分子干渉核酸でありうる。したがって、本発明が低分子干渉核酸分子である場合は、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを維持するのにＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤内のリボヌクレオチドの存在が不要である場合は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、結合したリンカー、または他の結合若しくは会合した基、部分若しくは鎖を有し得る。場合によっては、本発明のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等を阻害する因子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０または５０％においてリボヌクレオチドを含み得る。本明細書ではＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の抑制剤は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介し得る核酸分子、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）であってもよい。
本明細書においてＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
あるいは、本発明において用いられるＲＮＡｉとしては、例えば、短い逆向きの相補的配列（例えば、１５ｂｐ以上であり、例えば、２４ｂｐなど）のペアが挙げられるがそれらに限定されない。
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものを、ＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法等の任意の適切な方法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明において有用である。
本発明の一実施形態は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等に対するＲＮＡｉ分子、またはそのＲＮＡｉ分子をコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性脳マラリアの治療薬である。このＲＮＡｉ分子、またはそのＲＮＡｉ分子をコードするポリヌクレオチドを用いれば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性脳マラリア細胞の増殖を抑制することができる。本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、１０以上のヌクレオチドを有する、ヌクレオチドが直鎖状に重合した高分子化合物であってもよい。
本発明の一実施形態において「ＲＮＡｉ分子」は、ＲＮＡｉ作用を有するＲＮＡ鎖であり、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはＲＮＡｉ作用を有するｓｍａｌｌＲＮＡ等を挙げることができる。
本発明の一実施形態において「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、短鎖もしくは長鎖の１もしくは２本鎖ＲＮＡ、またはそれらの修飾物等の１つ以上によって、標的遺伝子もしくはｍＲＮＡ等の機能が抑制、またはサイレンシングされる現象を含む。
ＲＮＡｉ分子のデザインには、例えば、ｓｉＤｉｒｅｃｔ２．０（Ｎａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９ Ｎｏｖ ３０；１０：３９２．）等を使用できる。また、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）に委託してもよい。ＲＮＡｉ作用の確認は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるＲＮＡ鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）から購入することができる。
本発明の一実施形態において「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導可能なＲＮＡ鎖を含む。一般的にｓｉＲＮＡの２本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がＲＩＳＣに取り込まれる。ＲＩＳＣに取り込まれたガイド鎖は、標的ＲＮＡを認識するために使われる。ＲＮＡｉ研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。上記ガイド鎖は１５塩基以上のＲＮＡから構成されていてもよい。１５塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、そのガイド鎖は４０塩基以下のＲＮＡから構成されていてもよい。４０塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。
本発明の一実施形態において「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な１本鎖のＲＮＡ鎖を含む。典型的には、ｓｈＲＮＡは細胞内でＤｉｃｅｒによって切断され、ｓｉＲＮＡが切り出される。このｓｉＲＮＡによって標的ＲＮＡの切断が生じることが知られている。上記ｓｈＲＮＡは３５以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。３５以上であれば、ｓｈＲＮＡに特有のヘアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記ｓｈＲＮＡは１００塩基以下のＲＮＡから構成されていてもよい。１００塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にｓｈＲＮＡと構造および機能が類似しているｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの多くが、１００ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、ｓｈＲＮＡの長さは必ずしも１００塩基以下でなくても、ｓｈＲＮＡとして機能できると考えられる。
本発明の一実施形態において「ｍｉＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡと類似の機能を有しているＲＮＡ鎖を含み、標的ＲＮＡ鎖の翻訳抑制や分解をすることが知られている。ｍｉＲＮＡとｓｉＲＮＡとの違いは、一般的に生成経路と、詳細なメカニズムにある。
本発明の一実施形態において「ｓｍａｌｌ ＲＮＡ」とは、比較的小さいＲＮＡ鎖をいい、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、１または２本鎖の低分子ＲＮＡなどを挙げることができる。
上記ＲＮＡｉ分子は、５’末端または３’末端に１〜５塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この場合、ＲＮＡｉの効率が上昇すると考えられる。この数は、例えば、５、４、３、２、または１塩基であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。また上記ＲＮＡｉ分子が２本鎖のとき、各ＲＮＡ鎖間にミスマッチＲＮＡが存在していてもよい。その数は、例えば、１、２、３、４、５、または１０個以下であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。また上記ＲＮＡｉ分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、１０、８、６、５、４、または３塩基であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。塩基配列は、所望の効果を有する限り、１または複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加していてもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が５’末端、右側が３’末端である。
上記ＲＮＡｉ分子の長さは、例えば、１５、１８、２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、または４００塩基であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。この数は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等陽性悪性腫瘍に対する治療効果を高める観点からは、１５以上、または１００以下が好ましい。
本発明の一実施形態において「ＲＮＡ鎖」は、ＲＮＡまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。また本発明の一実施形態において「ＤＮＡ鎖」は、ＤＮＡまたはその等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。このＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、１本鎖または複数本鎖（例えば、２本鎖）の形態のＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖を含む。ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、細胞取込促進物質（例えば、ＰＥＧまたはその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、またはリンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）等と結合していてもよい。ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、核酸合成装置を用いて合成可能である。その他、受託会社（例えば、インビトロジェン社等）から購入することもできる。生体内のＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、塩または溶媒和物を形成することがある。また、生体内のＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、化学修飾を受けることがある。ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖の用語は、例えば、塩もしくは溶媒和物を形成しているＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖、または化学修飾を受けているＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖等を含む。またＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖は、ＲＮＡ鎖のアナログ、またはＤＮＡ鎖のアナログであってもよい。
上記ＲＮＡｉ分子は、安定的にＲＮＡｉ作用を発揮する観点からは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のｍＲＮＡの塩基配列の一部に対して、相補的な塩基配列を含むことが好ましい。上記「一部」は、例えば、５、１０、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、または５０塩基以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。
本発明の一実施形態において「タンパク質の発現を阻害すること」は、例えば、遺伝子からｍＲＮＡへの転写機構を阻害、またはｍＲＮＡからタンパク質への翻訳機構を阻害することを含む。また、例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の分解を誘導することによって、結果的にタンパク質量を減少させることを含む。本発明の一実施形態において「タンパク質の機能を阻害すること」は、タンパク質に構造変化を生じさせ、タンパク質の活性を低下させることを含む。また、例えば、遺伝子の発現を阻害した結果、ｍＲＮＡまたはタンパク質の生成量が低下することを含む。
本発明の一実施形態において「発現が阻害されている状態」は、発現量が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。発現量はｍＲＮＡ量、またはタンパク質量を指標としてもよい。本発明の一実施形態において「有意に」は、例えば統計学的有意差をスチューデントのｔ検定（片側または両側）を使用して評価し、ｐ＜０．０５であるときを含んでいてもよい。または、実質的に差異が生じている状態を含む。本発明の一実施形態において「機能が阻害されている状態」は、活性が、正常時に比べて有意に減少している状態を含む。
別の局面において、本発明は、有効量のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子の阻害剤またはこれを含む組成物または医薬（治療薬または予防薬）を、必要とする被験者に投与することを含む、該被験者の脳マラリアを予防または治療するための方法を提供する。これまでは、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系が脳マラリアの予防または治療に適用され得ることは知られておらず、有効量についても、当然知られるところではなかった。他方、本発明では、本明細書において得られた知見に基づき、使用される阻害剤に応じて有効量を当業者が選択することができる。
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。抗体またはポリヌクレオチドを投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液）、安定剤等を配合してもよい。
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、Ｊ．Ｈｏｎｉｇｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｐ６５０（１９５３）を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、ＰＥＧもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位（例えば、食道）に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明が脳（例えば、嗅球）領域で使用される場合、さらに、脳（例えば、嗅球）に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
治療剤が核酸である特定の態様において、適切な核酸発現ベクターの一部として該核酸を構築し、そして細胞内に存在するように投与することによって、核酸をｉｎ ｖｉｖｏ投与して、コードされるタンパク質の発現を促進することも可能であり、これは、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、または直接注射によって、または微小粒子銃の使用によって、または核酸を脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られるタグ配列に連結した核酸を投与することによって、実行可能である。あるいは、核酸治療剤を細胞内に導入し、そして発現のため、宿主細胞ＤＮＡ内に相同組換えによって取り込ませることも可能である。
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の１種以上）を含む。また患者または被験体は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等の発現が異常であると判断または診断された患者または被験体であってもよい。このとき、判断または診断は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のタンパク質レベルを検出することにより行われることが好ましい。
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
本発明のキットはまた、本発明の組成物、治療剤、予防剤または医薬として使用するタンパク質をコードする発現ベクターも含有することも可能であり、このタンパク質は、発現された後、生物学的に活性な複合体を形成するため、再構成されることも可能である。このようなキットは、好ましくはまた、必要な緩衝剤および試薬も含有する。場合によって、このような容器に付随して、キット使用のための指示書（添付文書）、並びに／あるいは医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
特定の実施形態において、本発明の核酸を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、核酸の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
（ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系に基づく脳マラリアの診断）
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子を含む、脳マラリアのマーカーを提供する。あるいは、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかまたはその発現産物に結合する物質を用いる、脳マラリアを識別または診断する方法を提供する。ここでは、対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現が正常検体のものに比べて上昇している場合、該対象検体は脳マラリアを有すると診断される。このような診断は、以下に説明するような結合剤ないし検出剤を用いて行うことができる。したがって、本発明の方法は、対象検体のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子のいずれかの発現を調べる工程を包含し、その結果によって、脳マラリアの罹患の指標とすることができる。
このＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系は、本明細書の他の箇所で説明されるように、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７を経路とするシグナルの伝達経路をいい、脳マラリアの発症メカニズムのことをいい、その模式図は図７に示される。「ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系」の因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７のほか、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン；ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９、ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）および他の樹状細胞、ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞（ヒトの場合ＣＤ８Ｔ細胞）および他のＴ細胞などもこの因子として考慮することができる。
典型的な実施形態としては、本発明で使用されるＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つを含む。ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７の各因子については、脳マラリアとの関連が知られておらず、本発明は、このゆな経路および各々の因子を脳マラリアの診断または検出の指標として使用することができることを初めて提供する。
別の実施形態では、本発明において使用されるＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに加えて、或いはそれと代替的に以下：
（１）ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、およびＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）からなる群より選択される少なくとも１つの炎症性サイトカイン、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つ；
（２）ＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９
（３）ＣＤ８α樹状細胞および他の樹状細胞；ならびに
（４）ＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞（ヒトの場合ＣＤ８Ｔ細胞）および他のＴ細胞
からなる群より選択される、少なくとも１つの因子を含む。
より詳細な実施形態では、本発明の検出または診断は、以下：
（Ａ）嗅球におけるＣＣＬ２１および／またはＣＣＬ１９の発現上昇；
（Ｂ）皮質におけるＩＦＮ−γの発現上昇；
（Ｃ）前記ＣＤ８α樹状細胞は、ＣＣＲ７依存的にプライミングされるものが観察されること；および／または
（Ｄ）脳または脾臓においてＣＤ１１ｃ＋ ＣＤ８Ｔ細胞が観察されることを脳マラリアの発症の指標とすることができるがこれらに限定されない。
前記脳マラリアは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからなる群より選択されるマラリア原虫に対応するヒトマラリア原虫によって生じる。
１つの特定の実施形態では、本発明が対象とする脳マラリアはげっ歯類または霊長類のものを包含する。
特定の実施形態では、本発明は、本発明が使用するＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子は、配列番号１、３、５等に記載の核酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物または配列番号２、４、６等に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントもしくはその等価物を含む。
特定の実施形態では、本発明のマーカーは
（１）ＣＣＬ２１タンパク質またはこれをコードする核酸；
（２）ＣＸＣＲ３またはこれをコードする核酸；および／または
（３）ＣＣＲ７タンパク質またはこれをコードする核酸
を含む。
別の局面では、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の少なくとも１つの因子、ならびにそれらをコードする核酸、その発現産物およびその由来物からなる群より選択される少なくとも１つに結合する物質を含む、脳マラリアの検出剤または診断剤を提供する。ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系が脳マラリアに関連していることは本発明において初めて見出されたものであり、これを利用した検出、検査、または診断も本発明によって初めて実現された。
本発明において、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の異常（発現増加等）は、脳マラリアの指標となることが見出された。従って、本発明によれば、対象となる被験者またはそれに由来する試料（例えば、細胞試料、脳髄液、血清等）においてＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することにより、脳マラリアを検出または選択することができる。また、従って、本発明のマーカーの減少、抑制、増加または活性化等の調節能力を指標に、脳マラリア治療を行う薬剤を検出、スクリーニングすることができることが理解される。
別の局面において、本発明は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合または相互作用する物質を含む、脳マラリアを識別するための検出剤、検査剤または診断剤を提供する。このような検出、検査または診断のためには、物質の結合は、特異的であることが好ましい。
このような検出剤、検査剤または診断剤は、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合または相互作用することができる限り、どのような物質を利用してもよいが、例えば、その代表的な例として、これらの因子の抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、あるいはこれらの因子をコードする核酸、特にＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を増幅し得る核酸プライマーもしくはＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子に結合もしくは相互作用し得るプローブを挙げることができるが、それらに限定されない。
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出キット、検査キットまたは診断キットとして利用することができる。
１つの実施形態では、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、検出、検査または診断可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。
本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、プローブおよびプライマーの形態を採ることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子と特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書に記載されるように、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現は脳マラリアの指標であり、指標として有用である。従って、本発明によるプローブおよびプライマーは、脳マラリアを識別するために用いることができる。本発明のプローブおよびプライマーは、１つの実施形態では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することができればよく、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指す。二本鎖ｃＤＮＡも組織ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用可能であることが知られており、本発明のプローブおよびプライマーにはそのような二本鎖ｃＤＮＡも含まれる。組織中のＲＮＡの検出において特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、ＲＮＡプローブ（リボプローブ）を挙げることができる。
特定の実施形態において、本発明はプライマーの形態をとることができる。通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
特定の実施形態において、本発明によるプライマーは、二種以上の該プライマーからなる、プライマーセットとしても使用することができる。特定の実施形態において、本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を利用して目的遺伝子を検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
本発明によるプライマーセットはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質のヌクレオチド配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明である。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマー（プライマーペア）の一方がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子等目的のタンパク質の二本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。本発明のプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、例えば、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７））に従って実施することができる。
特定の実施形態において、本発明は「プローブ」の形態をとることができる。通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列（例えば、配列番号１）と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
１つの実施形態において、本発明の検出剤は、標識されたものでありうる。あるいは、本発明の検出剤、検査剤または診断剤は、タグを結合させたものであってもよい。本発明で使用される標識またはタグは、本明細書において説明された任意の形態をとることができる。
１つの局面において、本発明は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするための方法、あるいは脳マラリアを検出、検査または診断する方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明の方法では、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を、脳マラリアを識別する指標とするために、例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡを生体内で検出する工程を行って実施することができる。例えば、その際に、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡに結合する物質を含む検出剤、検査剤または診断剤を用いることができる。そのような検出剤、検査剤または診断剤は、本明細書において記載されており、その記載を元に、必要に応じて当該分野で公知の技術を用いて当業者が本発明の方法を実施することができることが理解される。
本発明の方法は、本発明の検出剤、検査剤または診断剤を目的とする試料に接触させ、その試料中に目的とする対象であるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡがあるかどうか、あるいはそのレベルまたは量を測定する。
本発明において「接触」は、複数の物質の間の相互作用または結合が生じるようにその複数の物質を配置することであり、本発明では、検出剤、検査剤、診断剤として機能し得る物質（たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のマーカーまたはそれを含む試料に対して物理的に近接させることによって達成することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在させることができる。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。具体的なＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡを検出する方法は、試料（例えば、血清等）におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡを検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。ここで、試料として使用されるものとしては、発現産物を含むと考えられる試料であればよく、例えば、血清を用いることができる。血清は慣用の方法により取得することができる。
特定の実施形態では、本発明による検出、検査または診断は、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡ、またはそれから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を直接または間接的に検出することにより細胞試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、特にＳｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）、”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ ｅｄ．”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）、条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ ２．１０）を参照しうる。
ハイブリダイゼーション法を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現産物、例えば、ｍＲＮＡの検出は、例えば、：（ａ）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程により実施することができる。工程（ａ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射能活性（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、および３５Ｓ）、蛍光（例えば、ＦＩＴＣ、ユーロピウム）、化学発色のような酵素反応（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）等を利用した標識が挙げられる。ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体が検出された試料は、被験者の組織がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。
本発明による検出、検査または診断の別の実施形態によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。
核酸増幅法を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、（ｉ）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および（ｉｉ）形成された増幅産物を検出する工程により実施することができる。
工程（ｉ）において、目的の被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。増幅産物の検出は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法を用いて実施できる。この試料中に増幅産物が検出されることは、被験者の組織がＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現していることを示すので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。
本発明による検出の別の実施形態によれば、本発明による抗体と試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより試料におけるＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出、検査またはこれを用いて診断することができる。
抗原抗体反応を利用したＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現の検出は、例えば、（Ｉ）被験細胞試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程；および（ＩＩ）抗原抗体複合体を測定する工程により実施することができる。抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、血清中のＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。抗原抗体複合体が検出される試料は、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を発現している細胞を含むので、該試料が由来する被験者について、脳マラリアの可能性が高いと判定することができる。
前記の各検出工程は１回のみならず、同工程を繰り返しあるいは組み合わせて行うことにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。従って、このような実施形態を採用した場合、本発明による検出、検査または診断方法によれば、前記の工程を２回以上行うことにより、脳マラリアの診断をより高精度に行うことができる。
また、他のマーカー遺伝子、好ましくはＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の増殖マーカー遺伝子（例えば、既知のマーカーであるＳＣＣまたはＣＥＡ等）あるいはこれらの因子を併用することにより、脳マラリアの診断精度を高めていくことができる。
本発明の診断薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
１つの実施形態では、質量分析によってマーカーの濃度を測定することができる。この場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。さらに、２台の質量分析計を用いたＭＳ／ＭＳによれば、より正確にマーカーの濃度を測定することができる。
電気泳動によりマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカーを分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカーに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカーの分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウェスタンブロッティングを行って膜上のマーカーの量を測定することもできる。
クロマトグラフィーによってマーカーの濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカーを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカーの濃度を測定することができる。
１つの局面において、本発明によれば、本発明による検出、検査および／または診断のための方法を実施するための検出、検査および／または診断のためのキットが提供される。このキットは、本発明の検出剤、検査剤および／または診断剤を含む。その実施形態としては、本明細書において記載された任意の実施形態を単独または組み合わせ用いることができる。
１つの実施形態では、本発明による検出キットとしては、本発明による実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプローブを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。このプローブは、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法によりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第一の態様の検出方法は、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子（例えば、ＳＣＣ、ＣＥＡ等）の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を更に検出する。
別の実施形態において、本発明による検出用キットとしては、本発明による別の実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出するためのキットであって、本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この検出用キットは核酸増幅法によりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。従って第二の態様の検出方法は、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
本発明によるこの実施形態の検出キットは、精度の高い検出を行うために、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカー遺伝子の発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体を更に含んでいてもよい。これらのプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットはハイブリッド形成法、核酸増幅法、抗原抗体反応法のいずれかの方法により、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子以外の脳マラリアのマーカーの発現を更に検出する。
さらなる実施形態において、本発明による検出キットとしては、本発明によるさらなる実施形態の検出を実施するための検出キットが挙げられ、具体的には、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子のタンパク質を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。この抗体は、標識したものであってもよい。この検出用キットは抗原抗体反応を検出することによりＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子の発現を検出する。この実施形態の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
これらのキット、組成物またはシステムは、本発明のマーカー（例えば、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子を同定することができる限り、任意の被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段を用いることができることが理解され得る。従って、本明細書において具体的に記載された因子または手段のみならず、当該分野において公知の任意の等価の因子または手段を用いることができることが理解される。
１つの実施形態では、本発明において使用される因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され、好ましくは、因子は、タンパク質または複合分子（例えば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）である。好ましくは、因子は、抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）である。このような因子は、標識されるか、または標識可能であることが好ましい。なぜなら、診断することが容易となるからである。
本発明の好ましい実施形態において、使用される手段は、質量分析装置、核磁気共鳴測定装置、Ｘ線解析装置、ＳＰＲ、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー）、免疫学的手段（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ））、生化学的手段（例えば、ｐＩ電気泳動、サザンブロッティング、二次元電気泳動）、電気泳動機器、化学的分析機器、蛍光二次元ディファレンシャル電気泳動法（２ＤＥ−ＤＩＧＥ）、同位体標識法（ＩＣＡＴ）、タンデムアフィニティ精製法（ＴＡＰ法）、物理学的手段、レーザーマイクロダイセクションおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のシステムまたはキットは、さらに、マーカーの標準を含む。このような標準は、マーカーの検出手段（該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段など）が正常に機能しているかどうかを確認するために用いることが好ましい。
好ましい実施形態では、本発明では、対象となる試料を精製する手段をさらに備え得る。このような精製手段としては、例えば、クロマトグラフィーなどを挙げることができる。精製することによって、診断の精度を上げることができることから、好ましい実施形態において使用され得るが、これは必須ではない。
１つの実施形態では、本発明において使用される因子または手段は、本発明のマーカーの定量をする能力を有する。このような定量は、標準曲線を描いたときに、検量線がきちんと描ける手段または因子であるものがよい。好ましくは、例えば、抗体、質量分析、クロマトグラフィー分析などを挙げることができる。従って、ある実施形態では、本発明のシステムは、マーカーの定量を行うための定量手段をさらに備える。
１つの実施形態では、定量手段は、標準曲線と測定結果とを比較して前記マーカーが正常値の範囲内かどうかを判定する判定手段を含む。このような判定手段は、コンピュータを用いて実現することができる。
１つの実施形態では、本発明のキットまたはシステムは、マーカーまたはマーカーに特異的に相互作用する因子を含む組成物を含む。
１つの局面において、本発明は、被験体由来の試料中のマーカー、該マーカーに特異的に相互作用する因子、または該マーカーを選択的に認識する手段の、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態の予測診断、事前診断、予測、検出または診断するための医薬の製造における、使用を提供する。ここで、試料の取得は、どのような手段で行ってもよい。通常、医師以外の担当者が測定に従事する場合は、何らかの形で医師が取得したものであり得る。測定結果から、増殖能のレベルまたは分化状態、またはそれに関する疾患、障害または状態またはその可能性があるかどうかの決定は、正常値と比べて、各々のマーカーに比較して異常であるかどうかを判定することによって実施することができる。本発明の方法において、使用されるマーカーなどは、本明細書の他の場所において記載される任意の１または複数の特徴を矛盾することがない限り有していても良いことが理解される。本発明の検出または診断において、マーカーの濃度を測定する方法は、そのマーカーの濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
本発明の検出または診断における好ましい実施形態の一つは、マーカーを担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカーの濃度を測定することである。すなわち、マーカーに対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカーを担体上に捕捉する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカーの濃度を測定することができる。
１つの実施形態においてマーカーの測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカーに特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカーの濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
一方、１つの実施形態において、マーカーの測定方法に質量分析を用いる場合は、抗体の他、イオン結合や疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉することもできる。イオン結合や疎水性相互作用は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がなく、マーカー以外の物質も捕捉されるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を使用したプロテインチップを用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間質量分析（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（本明細書中「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行えば、マーカーの濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、金属イオン基板が好ましく用いられる。
イオン結合によってマーカーを担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陰イオン交換体、陽イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体のいずれも用いることができる。例えば、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。一方、疎水性相互作用によってマーカーを担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。さらに、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋等の金属イオンを固定化した担体にマーカーを捕捉することもできる。
１つの実施形態において、用いる担体の例としては、ビーズ、マイクロタイタープレート、樹脂等の公知のものを使用することができる。特に、ビーズとマイクロタイタープレートは、イムノアッセイにおいて従来から用いられており、測定系の構築が容易である。一方、基板のような、平面部分を有する担体を用いることもできる。この場合は、平面部分の一部にマーカーに対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基盤としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカーに特異的な抗体を固定化した担体が挙げられる。
本発明による検出、検査または診断方法は、脳マラリアの予防または治療に有効な物質のスクリーニングに適用することができる。すなわち、被験物質をＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ７等のＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系の因子またはそれをコードする核酸分子に対する結合または相互作用を指標に、有効な物質をスクリーニングすることができる。使用されうる被験物質としては、合成低分子化合物、タンパク質、合成ペプチド、精製または部分精製ポリペプチド、抗体、細菌放出物質（細菌代謝産物を含む）、核酸（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡｉ等）等が挙げられ、好ましくは、化合物もしくはその塩またはそれらの溶媒和物（例えば、水和物）であるが、これらに限定されるものではない。被験物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。本発明によるスクリーニング法により特定された物質は、脳マラリアの治療または予防に有効な物質として用いることができる。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、必要な場合、医薬基盤研究所において規定される基準を遵守し、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
（材料および方法）
Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）
２種類の異なるＰｂＡ系統を使用した。これらのＰｂＡ系統の詳細（ＧＦＰ有、無）については、以前に記載されている（Ｃｏｂａｎ，Ｃ．ら（２００７）．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９，６７−７９．；Ｉｓｈｉｎｏ，Ｔ．ら（２００６）．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５９，１１７５−１１８４．；Ｚｈａｏ，Ｈ．ら（２０１２）．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １２，７０５−７１６．）。
動物および抗体によるインビボケモカインブロッキング
マウス
年齢と性別をマッチさせたＣ５７ＢＬ／６（ＣＬＥＡ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）または同腹仔マウス（Ｃｃｒ７＋／−）を野生型（ＷＴ）群として使用した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＣｃｒ７−／−マウスは、Ｍ．ＭｉｙａｓａｋａおよびＭ．Ｈ．Ｊａｎｇ（大阪大学）によって提供され、以前に記載されたとおりに作製された（Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｒ．ら（１９９９）．Ｃｅｌｌ ９９，２３−３３．）。Ｂａｔｆ３−／−マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配させて、＋／−表現型を作製した。
野生型マウスに、ＰｂＡ感染の開始から３日間、エンドトキシンフリーの抗ＣＣＬ２１抗体またはアイソタイプコントロール（毎日マウス１匹あたり５０μｇ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を毎日静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。あるいは、感染後４日目および５日目に２回、抗ＣＸＣＲ３抗体（ＬＥＡＦ精製抗マウスＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３），マウス１匹あたり１００μｇ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を注射した。組み合わせ治療は、感染後４日目に抗ＣＸＣＲ３および抗ＣＣＬ２１抗体混合物を用いて行い、感染後５日目に抗ＣＣＬ２１抗体の注射を繰り返した。
サル
体重５ｋｇの雌性ニホンザル（Ｍａｃａｃａｆｕｓｃａｔａ）に、以前に記載されたように、１×１０９の凍結Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染赤血球（ＣＤＣ系統）をｉ．ｖ．接種し、毎日追跡した（Ｋａｗａｉ，Ｓ．およびＳｕｇｉｙａｍａ，Ｍ．（２０１０）．Ａｃｔａ Ｔｒｏｐ １１４，１５２−１５６．）。サルが重篤なマラリアの症状を示し、意識不明となった感染後１４日目の終わりに、ケタミン−ＨＣｌ（１５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔をかけた後に検死解剖を行った。コントロールとして、Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉｉを感染させたニホンザル１頭と、非感染コントロールとしてのカニクイザル１頭を用いた。
全てのマウスおよびサルの実験は、独立行政法人 医薬基盤研究所および大阪大学のガイドライン、ならびに、日本実験動物学会公認の実験動物の使用に関する指針に従って行った。
ＭＲＩ脳イメージング
マウス頭部のＭＲＩイメージングは、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩスキャナ（ＡＶＡＮＣＥ−ＩＩ ５００ ＷＢ；Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ）を用いて行った。ナイーブなマウスを、ＭＲＩ処理手順の間に１．０〜１．５％イソフルランで麻酔することにより、生体からの最初の像と、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定した死亡マウスからの像とを比較した。この比較から、両者に有意な差がないことが示唆された（図１Ｅ）。それゆえ、この後の実験においては、深麻酔をかけた感染マウスを、ＰＦＡ中で固定し、ＭＲＩによって可視化した。以下のパラメーターでＴ２＊強調画像（ＦＬＡＳＨシーケンス）および拡散強調画像（ＤＷＩ；スピンエコーシーケンス）を用いて出血を検出した：１）Ｔ２＊強調細密画像：視野，１５ｍｍ×１５ｍｍ；マトリックスサイズ，５１２×５１２；スライス厚，０．３ｍｍ；繰り返し時間，４５０ｍｓ；エコー時間，６．０ｍｓ；平均，６４；スキャン時間，４時間５分。２）Ｔ２＊強調通常画像：視野，２０ｍｍ×２０ｍｍ；マトリックスサイズ，２５６×２５６；スライス厚，０．５ｍｍ；繰り返し時間，４００ｍｓ；エコー時間，６．０ｍｓ；平均，１６；スキャン時間，２７分。３）ＤＷＩ：視野，１５ｍｍ×１５ｍｍ；マトリックスサイズ，５１２×５１２；スライス厚，０．３ｍｍ；繰り返し時間，６０００ｍｓ；エコー時間，２１．０ｍｓ；ｂ値，１０００ｓ／ｍｍ２；平均，９；スキャン時間，７時間４１分。
薄型頭蓋外科手術および多光子イメージング
生体マウス内のＯＬＦを可視化するために、マウスを、ケタミン（０．１３ｍｇ／ｇ）およびキシラジン（０．０１ｍｇ／ｇ）の筋肉内注射により絶えず麻酔しながら、以前に記載された外科的「薄型頭蓋（ｔｈｉｎｎｅｄ−ｓｋｕｌｌ）」技術をＯＬＦ領域用に改良した（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら、（２０１１）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１，１１５８７−１１５９６．；Ｗａｋｅ，Ｈ．ら（２００９）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２９，３９７４−３９８０．）。簡単に述べると、定位固定ステージ上にイヤーバーを用いてマウスの頭部を固定した。双眼実体顕微鏡下で、高速ドリル（Ｍｉｎｉｍｏ，ミニター株式会社）および手術用メスを用いて、ＯＬＦ上の頭蓋を注意深く薄く（約２０〜３０μｍ）した。その領域上の頭蓋に金属リングを取り付け、実験の間、薄くした領域を湿った状態に維持した。イメージングは、１〜２．５倍のデジタルズームにて、水浸対物レンズ（ＸＬＰＬＮ２５ＸＷＭＰ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた顕微鏡（ＦＶ１０００ＭＰＥ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて行った。ＯＬＦの血管構造をテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）−デキストラン（５ｍｇ／マウス）（Ｔ１２８７，Ｓｉｇｍａ）を静脈内注射することにより可視化し、Ｔ細胞を、ブリリアントバイオレット４２１を結合させたＴＣＲ−β（Ｈ５７−５９７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１０μｇ、またはＣＤ８α（５３−６．７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）５μｇにより標識した。チタンサファイアレーザー（ＭａｉＴａｉ Ｈｐ，Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ）をＴ細胞および血管用に８００ｎｍの励起波長にチューニングし、そして、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）をＧＦＰ−ＰｂＡ用に９５０ｎｍの励起波長にチューニングした。３０〜８０のｚ平面を含む蛍光画像スタックを連続的に繰り返し取得することによって、小さなＯＬＦ領域のコマ撮りイメージング［１．１０９５秒あたり５０７．９３４μｍ（ｘ），５０７．９３４μｍ（ｙ），５μｍ（ｚ）］を行った（１つのスタック画像の取得には、取得するｚ平面の数に応じて約４０〜９０秒を要する）。典型的なイメージングの深さは、軟膜表面から８０〜１５０μｍであり、これは、糸球層に対応していた（図２Ａ〜Ｂ）（Ｃｈａｉｇｎｅａｕ，Ｅ．ら、（２００３）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ １００，１３０８１−１３０８６．）。ケタミンおよびキシラジンの混合物の断続的な筋肉内注射は、動物を１〜２時間にわたりモニタリングすることを可能にした。各マウスについて１回だけイメージングを行った。全てのイメージングデータは、Ｖｅｌｏｃｉｔｙソフトウェアを用いて処理および分析した。
血管直径の測定
糸球に近い深部層における血管の直径を、Ｚ像スタックの取得し、これを二次元画像へと投影することによって測定した。次いで、血管の内径を、以前に記載されたとおりに測定した（Ｃｈａｉｇｎｅａｕ，Ｅ．ら、（２００３）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ １００，１３０８１−１３０８６．）。
ＢＢＢ透過性の評価
示す時点において、マウスに、１％エバンスブルー染料（Ｓｉｇｍａ）２００μｌをｉ．ｖ．注射した。２時間後にマウスを屠殺し、脳を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、そして、解剖顕微鏡下で脳の像を撮影した。
定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析
脳サンプルをホモジナイズし、総ＲＮＡを単離し、そして、ｑ−ＰＣＲを以前に記載されたとおりに実施した（Ｚｈａｏ，Ｈ．ら（２０１２）．Ｃｅｌｌ ＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ １２，７０５−７１６．）。マラリア感染を、ＰｂＡ １８Ｓ ｒＲＮＡに特異的なプライマーを用いて定量した。全てのプライマーは、Ａｓｓａｙｓ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。
食料埋設試験
食料埋設試験を、以前に記載されたとおりに実施した（Ｙａｎｇ，Ｍ．およびＣｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．（２００９）．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｕｎｉｔ ８ ２４．）。簡単に述べると、マウスを、１８時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ１ｃｍ下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。１５分が経過してもマウスが埋設された食料を見つけられなかった場合、試験を中止し、その時間を９００秒（潜伏スコア，＞＞＞）として記録した。
組織学
脳を摘出し、以前に報告されたとおりに免疫組織化学（ＩＨＣ）のために調製した（Ｚｈａｏ，Ｈ．ら（２０１２）．Ｃｅｌｌ ＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ １２，７０５−７１６．）。以下の抗体を使用した：抗マウスＴＥＲ１１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＺＯ−１抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＣＬ２１抗体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＰＥＣＡＭ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＧＦＡＰ抗体（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）。切片は、蛍光またはＬＳＭ ７８０共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
温度のモニタリング
継続的な発熱を記録するために、内製のサーマルモニタリングシステムを備えたマウスのケージを開発した（Ａｏｓｈｉら、論文投稿準備中、特開２０１２−２３１７２５参照）。ケージは、１２時間−１２時間の明暗サイクルを持ち、そして、食料および水への自由なアクセスが可能な、環境温度が３０℃に制御されたインキュベーターのように調製した。マウスの背の毛を電気バリカンで取り除き、背の皮膚温度を、インキュベーターの内側に備え付けたＦＬＩＲ ｂ６０サーマルカメラによって１分間隔で連続的に記録し、そして、データを、ＱｕｉｃｋＰｌｏｔソフトウェア（ＦＬＩＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）により分析した。
フローサイトメトリー分析
脾臓および脳の細胞を、以前に記載されたとおりに精製した（Ｃｏｂａｎ，Ｃ．ら（２００７）．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９，６７−７９．；Ｚｈａｏ，Ｈ．ら（２０１２）．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １２，７０５−７１６．）。細胞表面を、ＡＰＣ−ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＰＥ−ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５−ＣＤ８α（５３−６．７）、ＰＥ Ｃｙ７−ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＡＰＣ Ｃｙ７−ＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）、ＡＰＣ−ＣＣＲ７（４Ｂ１２）、ＡＰＣ−ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＰＥ ＣＹ７−ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）およびＡＰＣ Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）で染色した。これらの抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。サンプルを、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上に取り込み、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。細胞内ＩＦＮγ染色には、脾細胞をブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）の存在下で２時間インキュベートし、細胞を回収して、細胞内染色プロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってＩＦＮγで染色した。
トランスウェル移動アッセイ
４８ウェルのトランスウェルプレート（５μｍ孔径，Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）を、以前に記載されたとおりに、化学走性アッセイに使用した（Ｒａｐｐｅｒｔ，Ａ．ら、（２００２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８，３２２１−３２２６．）。簡単に述べると、無血清ＤＭＥＭ中に指定した濃度で希釈した組換えタンパク質ＣＣＬ２１および／または抗ＣＣＬ２１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、下側の区画に充填した。感染後６日目の感染動物由来の、Ｂ細胞およびＣＤ１１ｂ＋細胞およびＣＤ４＋細胞を枯渇させた後に濃縮された脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞を、上側のウェルに三連で加え（５×１０６／ウェル）、３７℃にて２時間無血清ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。リンパ球に対する強力な化学走性リガンドであるヒトＳＤＦ−１α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）をポジティブコントロールとして使用した。ＣＤ１１ｃ＋ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の移動率を、フローサイトメーターにより全細胞をカウントすることによって計算した。ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール群の移動に対して標準化し、コントロールに対する割合（％）として表した。
血清サイトカイン
感染後５日目に採血を行い、マウスＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によってサイトカインおよびケモカインの検出を行った。
養子免疫実験
ＰｂＡＮＫＡ感染後５日目のＲａｇ２−／−マウスから総脾細胞を調製し、脾臓ＣＤ８α＋ＤＣを濃縮した。簡単に述べると、抗マウスＣＤ１１ｂマイクロビーズ（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＤ１１ｂ−集団をネガティブ選択し、その後、ＣＤ４＋集団を除去した（Ｌ３Ｔ４，ＭＡＣＳ）。残った濃縮ＣＤ８α＋ＤＣ（２０×１０６細胞）を、０日目にＰｂＡ感染の２時間前にレシピエントマウスにｉ．ｖ．注入した。ポジティブ選択したＣＤ８α＋ＤＣ細胞集団の純度および表現型は、養子免疫の前にフローサイトメトリーにより評価し、典型的には、９５％超の純度であることが分かった（図６Ｉ）。
統計解析
２群間の差は、両側対応無しのＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（Ｐｒｉｓｍソフトウェア）のいずれかを用いて統計的有意差について解析した。生存曲線については、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
（実施例１：脳マラリアと嗅球の関係性の解明）
実施例１では、マウスモデルを用いて、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を行った。
（超高磁場ＭＲＩイメージング）
本実施例ではまず、超高磁場ＭＲＩイメージングは嗅球をＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＡＮＫＡ寄生虫より引き起こされる脳マラリア中の脳における微小出血の場所として同定した。
マウスの脳内の変化を研究し、ＥＣＭに関連する病理を可視化するために、本発明者らは、超高磁場１１．７Ｔ ＭＲＩ（Ｍｏｒｉ，Ｙ．ら（２０１１）．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ ＭｅｄＳｃｉ １０，２１９−２２７．）を行った。方向感覚の喪失や麻痺といった特定のＥＣＭ症状が始まったＰｂＡ感染から６日後に、１１．７Ｔ ＭＲＩは、両側のＯＬＦにおいて暗いはっきりとしたスポットを示し（図１Ａの冠状断面および図１Ｅ）、大脳または小脳を含む脳の他の部分はこのようなスポットを示さなかった（図１Ａの矢状断面）。拡散強調画像（ＤＷＩ）を取得すると、ＯＬＦ領域の細部がより明らかとなり、これは、組織学的な詳細と顕著に類似しており、低密度の領域がヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色による出血部位と対応していた（図１Ｂおよび１Ｃ）。本発明者らはまた、免疫組織化学（ＩＨＣ）により、出血（ＴＥＲ１１９＋赤血球）とＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫がＯＬＦの同じ領域に存在し、その領域が顆粒細胞層（ＧＧＬ）と同じくらい深部であったことを確認した（図１Ｄ）。本発明者らは、より早い時点のＯＬＦ内のＭＲＩを追加で行ったが、感染後６日目よりも前には変化は検出されなかった（図１Ｆ）。さらに、症状発症後のいくつかのＭＲＩ画像は、おそらく進行性の疾患状態を引き起こしているＯＬＦにおいて、異なる程度の微小出血の重症度を示した（図３Ｈ、Ｉ）。これに対し、ＯＬＦにおいて重度の出血が生じていても、ＭＲＩでは脳の他の部分における微小出血の明らかな証拠は見られなかった（図３Ｈ、Ｉ）。加えて、致死性の寄生虫Ｐ．ｙｏｅｌｉｉＬ（ＰｙＬ）に感染したマウスは、ＭＲＩではそのＯＬＦにおける微小出血が検出されなかった（図３Ｈ、Ｉ）。それゆえ、より低磁場のＭＲＩではなく、本発明者らの超高磁場ＭＲＩセッティングが、嗅球を、ＰｂＡ感染の間に攻撃されやすく、脳の他の部分と比較して出血が起こりやすい領域として同定することを可能にしたと考えるのが合理的である。
（ＯＬＦの柵状微小血管内の寄生虫の生体内多光子イメージング）
本発明者らは次に、ＢＢＢ崩壊の潜在的な関与を含めて、ＥＣＭの間にＯＬＦ領域からの出血が何故、そして、どのようにして生じるかを調べた。ＯＬＦは、高密度でかつ様々な方向（放射状および接線方向）を向いた柵状の微小血管構造から構成される。このような複雑な血管構造は、神経細胞およびグリア細胞と一緒に糸球内でシナプス性の相互作用を行い、組織内での神経細胞移動のための適切な足場環境として機能し得る（Ｂｏｖｅｔｔｉ，Ｓ．ら（２００７）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７，５９７６−５９８０．；Ｄａｎｉｅｌｙａｎ，Ｌ．ら（２００９）．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８８，３１５−３２４．）。このＯＬＦの独特な血管構造が、ＰｂＡ感染赤血球ならびに感染に関連する事象のための「脆弱な」スポットとなり得るかどうかを調べるために、ＯＬＦを生体内ＭＰ顕微鏡により可視化した。ＧＬ程度に深い（約１５０μｍ）ＯＬＦ毛細管が可視化され得るＯＬＦのＭＰイメージングは、これまでに、げっ歯類を用いて実施されている（Ｃｈａｉｇｎｅａｕ，Ｅ．ら、（２００３）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１００，１３０８１−１３０８６．；Ｐｅｔｚｏｌｄ，Ｇ．Ｃ．ら、（２００８）．Ｎｅｕｒｏｎ ５８，８９７−９１０．；Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら、（２０１１）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１，１１５８７−１１５９６．）（図２Ａ）。本発明者らは、以前に記載されたとおり（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら、上掲）にマウスの背部ＯＬＦの上で薄型頭蓋外科手術を行い、組織をインタクトなまま維持した。ＯＬＦ血管の生体画像は、この領域が解剖学的に複雑な毛細管構造（直径＜５μｍ）を有しており（Ｐｅｔｚｏｌｄ，ら、上掲）、感染から５日後に、ＰｂＡ寄生虫内で発現されるＧＦＰシグナルとして示される、循環ｉＲＢＣの付着／閉塞に適していることを示した（図２Ｂ、また動画Ｓ１（本明細書では示さない）でも確認している）。動画Ｓ１では、生体内多光子顕微鏡によって可視化したマウスの嗅球を確認した。マウスにＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させた。感染後５日目、マウスは目に見えるＥＣＭの症状を示さなかったが、血管を赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識し、図２Ａに示されるように、３０分間にわたって像を取得した。一部の寄生虫が減速し、血管に付着しているのが観察された。撮影した動画は５つあったが、感染後５日目の５匹のマウスにおいて同様であった。この動画Ｓ１に見られるように、一部のＧＦＰ標識された寄生虫の速度は低減および／または停止され、最終的には閉塞を引き起こした。これは、脳の他の部分と比較して、感染後６日目のＯＬＦにおいて１８Ｓ ｒＲＮＡレベルならびにＴ細胞の蓄積によって測定される寄生虫負荷量が有意により高かったことと一致していた（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＯＬＦが、おそらくはその柵状の毛細管構造に起因して、ＥＣＭ発病に特有の領域となり、それによって、循環ｉＲＢＣが減速し、付着し、そして／または、隔離され得、最終的には出血へと至ることを示唆している。
（ＯＬＦ内の血管を介したＣＤ８ Ｔ細胞の往来）
脳内のＣＤ８ Ｔ細胞の血管内蓄積は、ＥＣＭの発病において重要な役割を有することが示された（Ｂｅｌｎｏｕｅ，Ｅ．ら（２００２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，６３６９−６３７５．；Ｍｉｙａｋｏｄａ，Ｍ．ら、（２００８）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１，１４２０−１４２８．）。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞の補充が、ＯＬＦの生体内ＭＰイメージングによって、観察され得るかどうか、そして／または、ＰｂＡ感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのＯＬＦにおける標識ＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＦＰ発現ＰｂＡ寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐毛細管において生じていることをはっきりと示した（図２Ｄ、動画Ｓ２でも確認している（本明細書では示さない））。動画Ｓ２では、嗅球毛細管における新たな微小出血部位を示す、ＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させたマウスの代表的な３Ｄ像を撮影した。感染マウスを、感染後６日目に約１時間、生体内多光子顕微鏡によって可視化した。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＣＤ８α抗体で標識したＣＤ８ Ｔ細胞。一部の赤色領域は、血管の完全性が失われた既に出血した領域を示している；Ｔ細胞は組織中をクロールしている。中心部の血管の完全性の突然の喪失は新たな出血が示された。動画Ｓ２に見られるように、微小出血の発生中に、赤色のデキストラン標識された毛細管が変更された（赤色色素がほとんど組織内に放出された）。重要なことには、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＥＣＭの発症中、血管内を前後に「クロール」し、数が増加することが分かり（図２Ｄ、動画Ｓ２、Ｓ３およびＳ４（本明細書では示さない）でも確認している）、一部は、出血領域周囲に付着することが分かった（動画Ｓ２（本明細書では示さない））。これらのＯＬＦ内でのＣＤ８ Ｔ細胞の挙動は、ＥＣＭの末期における不安定な血流に受動的に従い得るが、比較的大きな血管（１０μｍ前後）における感染後５日目に本願発明者らが構築した３Ｄ動画は、ＣＤ８ Ｔ細胞が、血管に付着し、血管壁に沿って活発にクロールしている様子をはっきりと示した（動画Ｓ３（本明細書では示さない））。動画３Ｓでは、Ｔ細胞が嗅球内の微小血管に沿ってクロールする様子が示され、感染後５日目のＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫を感染させたマウスの嗅球の３Ｄ構築した多光子動画が示される。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＴＣＲβ抗体で標識したＴ細胞が示される。Ｔ細胞は、微小血管（直径約１０μｍ）の壁に付着し、壁に沿って移動していることが分かった。これらのＴ細胞によるクロール挙動は、インビボでの抗ＴＣＲβまたは抗ＣＤ８抗体（これらの抗体は、ナイーブな動物のＴ細胞に対して影響を有さなかった）標識に因るものではなかった（動画Ｓ４（本明細書では示さない）、データ示さず）。それどころか、完全に活性化されたＴ細胞は、感染後５日目にＯＬＦ毛細管内に蓄積し始め、クロールの動きによってその数を大いに増加させた（動画Ｓ４（本明細書では示さない））。動画Ｓ４では、Ｔ細胞が活性化され、嗅球毛細管内をクロールする様子を示す、感染後４〜６日目のナイーブマウスおよびＧＦＰ−ＰｂＡ寄生虫感染マウスの嗅球生体内多光子イメージングが示される。赤色、赤色ＴＲＩＴＣ−デキストランで標識した血管；緑色、ＧＦＰを発現するＰｂＡ寄生虫；青色、抗ＴＣＲβ抗体で標識したＴ細胞であるが、これらの動画では、青色チャンネルのみが示される。各動画は約１時間撮影した。青色の円は、血管内で速く流れるＴ細胞を示し、赤色の円は、減速し、血管内をクロールするＴ細胞を示す。ナイーブなマウスにおいてＴ細胞の動きを捉えるのは困難であったが、Ｔ細胞数は感染後の日数と共に増加した。その動きはクロール挙動を示す。まとめると、これらのＯＬＦの生体画像は、クロールするＣＤ８ Ｔ細胞の数の増加とともに、蓄積したｉＲＢＣが、最終的には小さなＯＬＦ毛細血管の微小出血によって血管から出ていくにちがいないことを示す。
脳内のＣＤ８ Ｔ細胞の血管内蓄積は、脳マラリアの発病において重要な役割を有することが示された（Ｂｅｌｎｏｕｅ，Ｅ．ら（２００２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，６３６９−６３７５．）。それゆえ、本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞の補充が、ＯＬＦの生体内ＭＰイメージングによって、観察され得るかどうか、そして／または、ＰｂＡ感染後の微小出血と関連し得るかどうか、を検討した。感染マウスのＯＬＦにおける標識ＣＤ８ Ｔ細胞およびＧＦＰ発現ＰｂＡ寄生虫の生体内イメージングは、微小出血が分岐血管において生じていることをはっきりと示した（図２Ｃおよび動画Ｓ２（本明細書では示さない））。重要なことには、ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＯＬＦ血管内の寄生虫を「追跡する」かのように、血管内を前後に行き来することが分かった（図２Ｄおよ動画Ｓ３（本明細書では示さない））。さらに、構築した３Ｄ動画は、ＣＤ８ Ｔ細胞が、血管に付着し、血管壁に沿ってクロールし得ることを示唆した（動画Ｓ４（本明細書では示さない））。まとめると、これらのＯＬＦの生体画像は、ＯＬＦ内に蓄積した寄生虫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって追跡され、小さなＯＬＦ血管の微小出血によって血管から出ていくことを示す。
（嗅覚機能は脳マラリア中に破壊されることの確認）
ｉＲＢＣならびにＣＤ８ Ｔ細胞の蓄積が、ＥＣＭの間に段階的に生じ、ＯＬＦ内の微小出血をもたらすという上記の知見を考慮して、本発明者らは、ＯＬＦが化学感受性のための複雑な生理学的シナプスを形成する嗅覚神経を含んでいるために、ＯＬＦの機能（嗅覚）が影響を受けると仮説を立てた。ＯＬＦの機能を評価するために、本発明者らは、単純な「食料埋設試験」を実施した（Ｙａｎｇ，Ｍ．およびＣｒａｗｌｅｙ，Ｊ．Ｎ．（２００９）．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｕｎｉｔ ８ ２４．）。簡単に述べると、マウスを、１８時間にわたって食料の無い状態にし、続いて、床敷きを含み、ケージのランダムなコーナーに、表面からおよそ１ｃｍ下に食料が埋設された新しいケージに移した。マウスが埋設された食料を見つけるまでの時間を記録した。ＯＬＦ機能は、食料を見つけるまでの時間の遅延によって決定した場合、ＢＡＬＢ／ｃまたはＲａｇ２−／−マウスまたは致死性のＰｙＬ寄生虫に感染したマウスのようなＥＣＭに対して抵抗性の正常なマウス（図３Ｂ）と比較して、早くも感染後４日目には有意に損なわれていた（図３Ａ）。このように、ＯＬＦ機能の喪失は、ＯＬＦ内の出血およびＢＢＢの完全性の潜在的な喪失といったＥＣＭの顕在化の予測を可能にし得る。
ＯＬＦ機能の喪失がＢＢＢの完全性の喪失（ＢＢＢ漏出）と直接相関するかどうかを評価するために、感染後の早い時点（３〜６日目）にマウスにエバンスブルー染料を注射し、脳組織への青色染料の滲出をモニターした。ｉＲＢＣが血管内で減速し停止したＭＰイメージングの観察によれば、脳組織への青色染料の滲出は、早くも感染後５日目にＯＬＦから出現し、一方で、脳全体は感染後６〜７日目に青くなった（図３Ｃ）。ＢＢＢは、密着結合および密着帯−１（ＺＯ−１）のようなタンパク質に起因して拘束性であるので、本発明者らは次に、ＯＬＦにおけるＺＯ−１染色がＢＢＢ漏出と関係するかどうかを調べた。ＺＯ−１は、嗅上皮、嗅覚ニューロン、ならびに、嗅球僧帽細胞層に局在することが示されている（Ｍｉｒａｇａｌｌ，Ｆ．ら、（１９９４）．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ３４１，４３３−４４８．）。感染後６日目に、本発明者らは、ＧＦＰ発現寄生虫の蓄積（ｉＲＢＣ）と一致した、ＯＬＦＭＣＬにおけるＺＯ−１免疫染色の有意な中断を観察し（図３Ｄ）、これは、ＯＬＦの密着結合におけるＺＯ−１発現の中断が、ＥＣＭ中のＢＢＢの完全性の喪失と関連し得ることを示唆している。
（実施例２：脳マラリアとケモカインとの関係）
次に、本実施例では脳マラリアとケモカインとの関係を確認し、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系と脳マラリアとの関係性を解明した。
（脳マラリア中の高熱およびケモカインストームはＯＬＦの機能不全および物理的ダメージと関連する）
本発明者らは次に、ＥＣＭの間のＯＬＦ機能不全に寄与する潜在的な因子を探索した。高熱は、ＢＢＢ機能喪失の促進因子の一つであることが示された（Ｋｉｙａｔｋｉｎ，Ｅ．Ａ．およびＳｈａｒｍａ，Ｈ．Ｓ．（２００９）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １６１，９２６−９３９．）。高熱がマラリア性昏睡状態の重要な症状であることを考慮し、本発明者らは、サーマルカメラを用いてＰｂＡ感染マウスの体温の連続的な測定を可能にする実験システムを開発した。感染マウスの体温の連続的かつ非侵襲性の測定は、高熱の攻撃が、ＥＣＭ症状の発症の２４時間前（ＰｂＡ感染後５日目付近）に始まり、２４時間持続し、その後、熱損により終結し、最終的には次の１２〜２４時間以内に死に至ることを明らかにした（図３、動画Ｓ５（本明細書では示さない））。動画Ｓ５では、サーマルモニターカメラによる、感染／非感染マウスの継続的な発熱の記録がなされた。１０日間にわたってケージを継続的にモニターした。動は３２秒間撮影され、感染後５〜７日目に対応する。非感染のナイーブコントロールマウス（＃１、右上、黄色）、感染マウス（＃２、左上；＃３、右下；＃４、左下）。感染マウス＃４は、最終的には熱を失って早期に死亡し、カメラから消えている。感染マウス＃３は、感染マウス＃４が死亡した翌日に死亡した。動画は、少なくとも１０匹のマウスで撮影したところほぼ同様の様子を示した。
脳マラリアを発症しない免疫不全マウスであるＲａｇ２−／−マウスに感染させると、これらのマウスは、感染の全体を通じて高熱の徴候を示さず、ＯＬＦがインタクトであることがＭＲＩによって確認された（図３Ｆおよび図３Ｉ）。さらに、致死性のＰｙＬまたは非致死性のＰ．ｙｏｅｌｉｉ−ＮＬを感染させたマウスは、感染の間に発熱せず（図３Ｇおよび図５Ｆ〜Ｇ）、感染後５日目の熱の上昇はＰｂＡ特異的であり得ることが示唆された。高熱がＢＢＢの崩壊とその後のＯＬＦ機能不全および出血をトリガーし、そして／または、促進する正確な機構は明らかでないが、データは、高熱がＥＣＭ関連死の２４時間前に生じ、ＯＬＦが機能不全となり、出血が促進された後のＢＢＢ漏出と相関し得ることを示唆する。特筆すべきことは、ＰｂＡ感染後５日目に、全身血清サイトカインレベル（大部分は炎症促進性サイトカイン）が上昇しており、サイトカインストームが高熱を伴うという考えを裏付けている（図５Ｆ〜Ｇ）。
（ＣＣＬ２１は感染の初期段階でＯＬＦにおいて高度に発現される）
本発明者らはさらに、ＰｂＡ感染の初期段階における嗅覚の喪失と関連し得る要因を調べた。ケモカインは、感染または炎症の初期メディエーターであり、次第に、発熱の発生に貢献するものと認識されている（Ｍａｃｈａｄｏ，Ｒ．Ｒ．ら（２００７）．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １１６１，２１−３１．）。一部のケモカインおよびサイトカインは、ＥＣＭの発症において重要な役割を有するので、本発明者らは、ＯＬＦにおいて、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＰ−１０（ＣＸＣＲ３リガンド）、ＭＣＰ−１（ＣＣＲ２リガンド）、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１（ＣＣＲ７リガンド）を含むいくつかのサイトカイン／ケモカインｍＲＮＡの発現レベルを測定した。ＣＣＬ２１およびＣＣＬ１９のｍＲＮＡおよびタンパク質は、ＯＬＦにおいて、早くも感染後３日目に高度に発現されており（図４Ａ〜Ｂ）、ケモカインリガンド、特にＣＣＬ２１の早期発現が、脳への免疫細胞の補充に重要であり得ることが示唆された。
上記の結果から、本発明者らは、ＣＣＲ７が、ＯＬＦを介して脳内にＣＣＲ７発現細胞を補充することによって、ＥＣＭの病理に関与するかどうかを調べることにした。本発明者らは、ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６）および同腹仔のＣｃｒ７＋／−およびＣｃｒ７−／−マウスにＰｂＡを感染させ、その生存を追跡した。Ｃｃｒ７−／−マウスの生存率の有意な増加が生じ、死は最終的には高寄生虫血症によって引き起こされたが、両群間で寄生虫レベルに違いはなかった（図４Ｃ、データ示さず）。Ｃｃｒ７−／−マウスにおけるＯＬＦ機能がインタクトであったかどうかを評価するために、食料埋設試験を実施したところ、ＷＴマウスと比較してインタクトなＯＬＦ機能が観察された（図４Ｄ）。興味深いことに、Ｃｃｒ７−／−マウスでは、ＷＴマウス（２４時間）と比較して、高熱発生の遅延（約４８時間）が生じており（図４Ｅ）、ＭＲＩおよびエバンスブルー染色によって決定した場合、感染後６日目に、ＯＬＦにおける出血の徴候はなかった（図５ＨおよびＩ）。エバンスブルー染色は、８日目以降のＣｃｒ７−／−マウスの脳の約８０％において徐々に生じた（図５ＨおよびＩ）。これらのデータは、ＣＣＲ７がＥＣＭの発病において役割を有しており、ＯＬＦ機能不全、微小出血および高熱にも寄与していることを示唆した。
（ＣＣＲ７の発現はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８α ＤＣ活性化にとって重要であるが、その脳内への移動にとっては重要ではない）
本発明者らは次に、ＥＣＭからのＣｃｒ７−／−マウスの生存率の増加を担う基礎的な機構を調べた。ＣＣＲ７は、ＤＣおよびＴ細胞のような免疫細胞の二次リンパ系器官への移動において重要なケモカイン受容体であるので、本発明者らは、脳内でのＴ細胞の補充を調べた。ＰｂＡ感染後６日目の脳から得た免疫細胞のフローサイトメトリー分析は、脳内のＣＤ８ Ｔ細胞蓄積が、ＷＴマウスと比較して、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて５０％減少することを示した（＊ｐ＜０．０５；図５Ａ）。特筆すべきことに、近年の報告は、脳内に補充されたＣＤ８ Ｔ細胞の中でも、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞が、高度に活性化されており、おそらくはＩＦＮ−γおよびグランザイム−Ｂを産生することによって発病に関与していると示唆した（Ｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら（２０１１）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７９，３９４７−３９５６．）。この報告と一致して、本発明者らは、ＰｂＡ感染したＷＴマウスの脳におけるＣＤ８ Ｔ細胞の大部分がＣＤ１１ｃ＋であり、この集団は、Ｃｃｒ７−／−マウスの感染脳（図５Ａ；＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１）ならびに脾臓（図５Ｂ；＊＊ｐ＜０．０１）においてパーセンテージおよび数が著しく減少していたが、ＷＴマウスとＣｃｒ７−／−マウスの間で、脾臓内のＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージおよび数は同等であったことを見い出した。脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８Ｔ細胞の活性化もまた、同じ細胞集団からのＩＦＮ−γ分泌の減少を伴って、ＣＣＲ７の非存在（ＣＤ４４の発現によって決定）下で損なわれた（図５Ｃ〜Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＣＣＲ７が、ＣＤ８Ｔ細胞のごく特定の部分集団である活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＰｂＡ感染脳内への誘導および／または移動に関与し、そして、ＥＣＭの発病において重要な役割を有し得ることを示唆し得る。このことを確認するために、本発明者らはさらに、ＰｂＡ感染中のＣｃｒ７−／−マウスの脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージの低下が、脾臓における以前のプライミングにおける欠陥によって引き起こされたかどうかを決定した。ＣＤ８α＋ＤＣは、ＣＤ８ Ｔ細胞応答をクロスプライミングし得るので、マウス脳マラリアの発病においてＣＤ８ Ｔ細胞を病気に罹りやすくすることが示唆されている（Ｌｕｎｄｉｅ，Ｒ．Ｊ．ら（２００８）．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，１４５０９−１４５１４．；Ｐｉｖａ，Ｌ．ら（２０１２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９，１１２８−１１３２．）。このことと一致して、本発明者らは、脾臓内にＣＤ８α ＤＣを持たない塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様−３（Ｂａｔｆ３）欠失マウス（Ｈｉｌｄｎｅｒ，Ｋ．ら（２００８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１０９７−１１００．）を用いて、ＰｂＡに感染させたときに、脾臓における活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の数および脳におけるその蓄積は、Ｂａｔｆ３＋／−コントロールと比較してＢａｔｆ３−／−マウスにおいて有意に損なわれていた（図６ＥおよびＦ）。また、Ｂａｔｆ３−／−マウスが生存率の改善を示したことを確認した（図６Ｇ）。他方、Ｃｃｒ７−／−マウスが、ＷＴマウスの脾臓内のものとほぼ同等数のＣＤ８α ＤＣを有したことを考慮し（図６Ｅ）、本発明者らは、ＣＤ８α ＤＣ上の機能的なＣＣＲ７発現がＣＤ８ Ｔ細胞活性化に必要とされるかどうかを理解するための実験を設計した。
（機能的なＣＣＲ７は、脾臓におけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングに必要とされる）
本発明者らは、インタクトなＤＣを有するがＴ／Ｂ細胞を有さない感染Ｒａｇ２−／−マウスからＣＤＲ８α ＤＣを精製した（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ａ．Ｄ．ら（２００２）．Ｂｌｏｏｄ ９９，２０８４−２０９３．）。Ｒａｇ２−／−マウスからの脾臓ＣＤ８α＋ＤＣは、感染後５日目に高レベルのＣＣＲ７を発現したが、ＣＤ８α−ＤＣはこれを発現しなかった（図６ＨおよびＩ）。これらのＤＣを精製するために、ＣＤ８α＋ＤＣをまず、ＣＤ１１ｂ＋ビーズを用いてネガティブ選択によって濃縮し、次いで、ＮＫ細胞、マクロファージおよび顆粒球を除去し、そして、さらなるＣＤ４＋細胞枯渇の後に純粋なＣＤ８α＋ＤＣ集団を得た（９５％超の純度、図６Ｂ）。その後、高度に濃縮したＣＣＲ７＋ＣＤ８α＋ＤＣを、Ｃｃｒ７−／−マウスに養子免疫した。濃縮ＣＤ８α＋ＤＣの養子免疫は、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて、脳内の活性型ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｃｃｒ７−／−マウス起源のもの）の補充を効率的に復活させ、ＥＣＭを加速させた（図５Ｅ）。まとめると、これらの知見は、ＰｂＡ感染中の活性型ＣＤ８α＋ＤＣ上の高レベルでの機能的ＣＣＲ７発現が、おそらくは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８Ｔ細胞とその膨張を活性化することによって、ＥＣＭの発病において重要な役割を有することを示唆する。しかしながら、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞上のＣＣＲ７発現は、脳内へのこれらの病原性細胞の移動には不必要である。
（ＯＬＦ内で発現されるＣＣＬ２１は、星状細胞の活性化と一致しており、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＯＬＦ内への移動にとって重要であり得る）
ＣＣＲ７がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のＯＬＦ内への移動に不必要であるとの知見は、ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミング中のＣＣＬ２１の重要性を意味している。しかしながら、ＣＣＬ２１の発現もまた、３日目から最終段階までＰｂＡ感染したＯＬＦにおいて観察されたので、本発明者らはさらに、ＣＣＬ２１が、ＣＣＲ７以外の代替的なケモカイン受容体相互作用を介してＯＬＦ内へのＣＤ８Ｔ細胞の補充に関してさらなる役割を有し得るという仮説を立てた。ＣＸＣＲ３が、特に小膠細胞および星状細胞においてＣＣＬ２１の代替的ケモカイン受容体となり得ること（Ｒａｐｐｅｒｔ，Ａ．ら、（２００２）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８，３２２１−３２２６．；ｖａｎＷｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｒ．ら（２０１０）．Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ ２４，７６８−７７５．）、そして、ＣＤ８ Ｔ細胞の脳内への移動を担う重要なケモカイン受容体であること（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ，Ｇ．Ｓ．ら（２００８）．ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５，４８１４−４８１９．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｄ．Ｓ．ら（２００７）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８，５７７９−５７８８．；Ｖａｎ ｄｅｎＳｔｅｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら（２００８）．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８，１０８２−１０９５．）を考慮し、本発明者らはさらに、感染したＯＬＦにおけるＣＣＬ２１の局在性および／または供給源を分析した。ＯＬＦ内でＣＣＬ２１を発現する細胞型を扱うことは困難であったが、ＣＣＬ２１染色は、星状細胞がしばしば同時局在化する炎症を起こした血管の内皮に限定されていた（図６Ａ）。星状細胞は、そのエンドフィートを介して血管の変化を監視し、感知する特殊化された細胞であり、ＥＣＭの間には、網膜におけるその再分配が関係付けられている（Ｍｅｄａｎａ，Ｉ．Ｍ．ら、（１９９６）．Ｇｌｉａ １６，５１−６４．）。感染後６日目には、ＯＬＦにおける星状細胞の形態変化（例えば、不十分な分布、厚くより長い突起）が明らかとなり、星状細胞とＰＥＣＡＭ染色との相互関係は、大きく乱されていた（図６Ｂ）。興味深いことに、特にその線維様構造によるＣＣＬ２１染色は、ＯＬＦ内のＣＤ８ Ｔ細胞と密接に相互関係していた（図は示さず、この省略した図ではＣＤ８ Ｔ細胞がＯＬＦ内のＣＣＬ２１と関連する様子が示される。感染後６日目の、ＰｂＡ感染したＷＴマウスからのＯＬＦ切片を、抗ＣＣＬ２１（緑色）および抗ＣＤ８（赤色）抗体で染色した。核をＤＡＰＩ（青色）により可視化した。スケールバーは１０μｍである。）矢印はＣＤ８Ｔ細胞と相互作用するＣＣＬ２１の線維様構造を示す。ＣＣＬ２１とＣＸＣＲ３発現ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞との間に化学走性相互作用が存在するかどうかを検討するために、本発明者らは次に、インビトロトランスウェル移動アッセイを行った。その結果に見られるように、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞はＣＣＬ２１に向かって用量依存性に移動したが、この移動は、抗ＣＣＬ２１抗体によって特異的にブロックされ（図は省略する）、ＣＣＬ２１が、ＥＣＭの間にＣＸＣＲ３にとっての代替的ケモカインリガンドとして機能し得ることを示唆する。省略した図では、増加する濃度（０、０．１、１および２μｇ／ｍｌ）のＣＣＬ２１に応じた、感染したＷＴマウスからの精製脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞の移動を示される。ポジティブコントロールとしてヒトＳＤＦ１−α（８０ｎｇ／ｍｌ）を使用し、（Ｅ）ＣＣＬ２１（１μｇ／ｍｌ）および／または抗ＣＣＬ２１抗体（１および５μｇ／ｍｌ）に対する応答を検討した。移動した細胞を三連のウェルから回収し、フローサイトメーターでカウントし、そして、ケモカイン誘導性の移動を、非刺激のコントロール（灰色の点線）に対して標準化し、非刺激コントロールの移動に対する割合（％）として示し、抗ＣＣＬ２１抗体によって特異的にブロックされることが示された。
（実施例３：脳マラリアの予防及び治療）
次に、ＣＣＬ２１−ＣＸＣＲ３−ＣＣＲ７シグナル伝達系をブロックすることで、脳マラリアが予防および治療することができるのではないかと考え、その例として抗体を用いた実験を行った。
（ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７−ＣＸＣＲ３軸のブロックはＥＣＭ治療のための新規ストラテジーである）
ＣＣＬ２１−ＣＣＲ７−ＣＸＣＲ３軸がＣＤ８α ＤＣ−ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性のＥＣＭ免疫病理において重要な役割を有することを考慮し、本発明者らは、ＣＣＬ２１がＥＣＭの治療のための治療標的として利用されうるかどうかを評価した。感染の最初の３日間の、抗ＣＣＬ２１抗体でのＯＰｂＡ感染マウスのインビボ処置は、アイソタイプコントロールで処置したマウスと比較して、マウスにおける有意に良好な生存につながった（図６Ｆ、＊＊ｐ＜０．０１）。しかしながら、感染後４日目の抗ＣＣＬ２１抗体処置は、ＥＣＭの進行に対して顕著な効果を有さず（データ示さず）、ＥＣＭの後期段階の間のＣＣＬ２１の関与が、他のエフェクター機構の活性化によって損なわれ得ることが示唆された。それゆえ、本発明者らは、ＣＣＲ２１とＣＸＣＲ３の標的化の組み合わせを行った。概念実証として、感染後４日目および５日目における準最適用量の抗体（１００μｇ）によるＣＸＣＲ３のブロッキングは、ＷＴの対応マウスと比較して、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいてＥＣＭからの有意な生存をもたらした（図６Ｄ）。同様に、嗅覚を喪失した日（感染後４日目）の抗ＣＸＣＲ３＋ＣＣＬ２１抗体混合物による組み合わせ抗体治療は、抗ＣＸＣＲ３抗体単独治療よりも良好なＥＣＭからの生存をもたらした（図は示さず）。これらのデータは、ケモカインの組み合わせブロッキングがＥＣＭからの脱出を導き得る新規治療ストラテジーとして活用され得ることを示唆した。省略した図では、組み合わせ抗ケモカイン抗体治療の生存曲線を示が示される。抗ＣＸＣＲ３および抗ＣＣＬ２１抗体の混合物を、嗅覚の喪失が始まった感染後４日目に注射した。抗ＣＣＬ２１抗体注射は５日目にも繰り返した。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により、コントロール 対 抗ＣＸＣＲ３抗体群、そして、コントロール 対 組合せ治療群で＊ｐ＜０．０５（各群ｎ＝５）。その結果、抗ＣＸＣＲ３抗体単独治療よりも良好なＥＣＭからの生存をもたらしたことが示された。
（実施例４：霊長類での確認：脳マラリアと嗅球の関係性）
次に、本実施例では、脳マラリアと嗅球の関係性に関する実験を霊長類で行う。
（嗅球は脳マラリアのサルモデルにおいて標的化される）
本発明者らは最後に、我々の知見が非ヒト霊長類のＯＬＦのＭＲＩを行うことによって、ヒトにも応用可能であるかどうかを検討する。ニホンザル（Ｍａｃａｃａ ｆｕｓｃａｔａ）のＰ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染は、脳マラリアの霊長類モデルである（Ｋａｗａｉ，Ｓ．およびＳｕｇｉｙａｍａ，Ｍ．（２０１０）．Ａｃｔａ Ｔｒｏｐ １１４，１５２−１５６．）。Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染した赤血球のｉ．ｖ．接種後、サルを毎日追跡し、血液スメアから寄生虫血症レベルをカウントする。寄生虫血症レベルが低く、おそらくは毛細血管内に隔離されており、サルが典型的な症状を示し、昏睡状態となった終わりに、検死解剖を行う。頭蓋を摘出した後、頭部を４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、７Ｔ ＭＲＩを用いて全頭部のイメージングを行う。７ＴＭＲＩは、ＯＬＦ内でいくつかの疑わしい出血スポットを検出すること、および脳の他の部分には出血の徴候を確認することができる。出血スポットの存在を確認するために、ＯＬＦを取り出し、１１．７Ｔ ＭＲＩによるイメージングを行う。超高磁場イメージングは、マウスと同様に、Ｐ．ｃｏａｔｎｅｙｉ感染後のサルのＯＬＦ内で出血が生じることを確認することができる。これに対して、ナイーブなサル、ならびに、重篤なマラリアモデルであるが脳マラリアではないＰ．ｋｎｏｗｌｅｓｉｉ感染サルからのＯＬＦでは低密度な領域は存在しないことを確認することが出来る（Ｗｈｉｔｅ，Ｎ．Ｊ．（２００８）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ４６，１７２−１７３．）。
予備的な実験結果では、サルでもマウスと同様の結果が出ていることが確認されている。
（考察）
脳は、ＢＢＢの破壊、血管漏出、免疫細胞の蓄積（特に、ＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤）といった多数の病理学的事象に起因してＥＣＭ中に重度に機能不全となるが、脳が破壊される正確な位置はあまり理解されていない。本研究において、本発明者らは、マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、ＯＬＦ領域がＥＣＭ中の血管漏出の攻撃を受けやすい場所であることを同定したが、この発見は、超高磁場ＭＲＩを、ＭＰ生体イメージング顕微鏡と組み合わせて用いることによってのみ可能となり得た。本発明者らはさらに、ＥＣＭにおいて昏睡状態の開始前に、初期の症状である嗅覚の喪失が存在することを同定した。１日でも早いマラリア性昏睡の検出が治療の成功率を劇的に増大させ得ることを考慮すると、マラリア感染中のこの以前には気付かれていなかった真に見過ごされていた位置と、嗅覚の喪失の検出は、ＥＣＭの早期の安価でかつ容易な診断を提供し得、昏睡状態とその後の状態が確立する前の早期治療を可能にし得る。ＯＬＦを介したＥＣＭの病理の基礎的機構の探求において、本発明者らは、ＯＬＦの星状細胞から分泌されたＣＣＬ２１が、ＣＸＣＲ３ケモカイン軸を利用することにより、病理学的なＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の脳内への補充において役割を有し得ることを見い出した（図７）。本発明者らはさらに、この新たな理解を、ＥＣＭの初期症状である嗅覚の喪失が顕らかとなった時点で、抗体の組み合わせによりケモカイン−受容体相互作用をブロックすることによる新規治療ストラテジーへと発展させた。
興味深い疑問は、何故ＯＬＦがＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫によって影響を受ける最初の場所なのか、ということである。ＯＬＦは、様々な方向（放射状および接線方向）を向いた高密度の毛細血管から構成され（図２Ａ〜ＢおよびムービーＳ１）、このような構造は、血管を取り囲む星状細胞の細いエンドフィートとの密着結合のネットワークを呈し、ＢＢＢの「ガーディアン」を形作っている。これが血液と神経組織との間の物質の流れを制限するが、これはおそらく、密着結合が星状細胞間で情報を伝達する能力を介するものであり得る（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．およびＳｈｉｐｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．（１９９３）．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ３２８，５０１−５２６．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら、（２０１３）．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔ １８，１２６０１２．；Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｍ．Ｃ．ら（２００９）．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５１６，９４−１０４．）。本研究において、ＯＬＦの神経層（ＯＮＬ）、糸球層（ＧＬ）周囲の血管足場、ならびに、僧帽細胞層（ＭＣＬ）程度の深さが、ＰｂＡ感染赤血球または寄生虫に関連した免疫学的事象による標的とされた。現在、本発明者らは、どの寄生虫または関連する因子がこのことに貢献し得るかを理解していないが、ＥＣＭの間に、ＯＬＦ内の密着結合ネットワーク（ＺＯ−１）が標的とされ、おそらくは破壊されていた可能性がある。末梢の寄生虫負荷量が非常に少ない場合でも、感染後３日目には、ＧＬおよびＭＣＬにおいて豊富な血管周囲の星状細胞エンドフィートが血管の変化を感知する可能性がある（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｓ．およびＳｈｉｐｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．（１９９３）．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ３２８，５０１−５２６．；Ｄｅ Ｓａｉｎｔ Ｊａｎ，Ｄ．およびＷｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｇ．Ｌ．（２００５）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５，２９１７−２９２４．；Ｐｅｔｚｏｌｄ，Ｇ．Ｃ．ら、（２００８）．Ｎｅｕｒｏｎ ５８，８９７−９１０．）。ＥＣＭ発病の際にも、毛細管細静脈および／または細動脈後の脳において同様の事象が報告された（Ｃａｂｒａｌｅｓ，Ｐ．ら、（２０１０）．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １７６，１３０６−１３１５．；Ｎａｃｅｒ，Ａ．ら、（２０１２）．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８，ｅ１００２９８２．）が、ＥＣＭ発病の際に異なる解剖学的構造に異なる役割が存在するかどうかについては、さらなる検討が必要である。
ＯＬＦは、ＯＬＦの神経投射、特に、化学感受性の動的な位置として知られる。ＯＬＦ神経は、鼻粘膜から始まり、篩板を経由して嗅球で終わる。リンパ管や血管がこれらの神経を取り囲み、これらの管を通じて、分子、細胞、そして病原体さえもが、脳の実質へのアクセスを獲得し得る（Ｄａｎｉｅｌｙａｎ，Ｌ．ら（２００９）．Ｅｕｒ Ｊ ＣｅｌｌＢｉｏｌ ８８，３１５−３２４．）。近年の研究は、神経細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）から神経を介して、脳血管に沿ってＯＬＦに向かって移動することを明らかにしており（Ｂｏｖｅｔｔｉ，Ｓ．ら（２００７）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７，５９７６−５９８０．）、ＯＬＦが外的環境とＣＮＳとの間の動的な細胞移動の出入口となり得ることを示唆している。それゆえ、神経変性疾患であるアルツハイマー病やパーキンソン病、そして、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患を罹患する患者が、初期症状としてＯＬＦの機能不全を経験するのは合理的である（Ｍｅｓｈｏｌａｍ，Ｒ．Ｉ．ら（１９９８）．ＡｒｃｈＮｅｕｒｏｌ ５５，８４−９０．；Ｐｅｒｒｉｃｏｎｅ，Ｃ．ら（２０１２）．Ｓｍｅｌｌ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｌｉｎ Ｒｅｖ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２年１２月１３日オンライン版公開，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０１６−０１２−８３４３−ｘ）；Ｔａｌａｍｏ，Ｂ．Ｒ．ら（１９８９）．Ｎａｔｕｒｅ ３３７，７３６−７３９．）。同様に、本発明者らの知見は、ｉＲＢＣが血管の内部を移動したとしても、これらの密集した様々な方向に構造化された毛細血管が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の付着／閉塞に適した環境ともなり、これらの連続した事象が、嗅覚の喪失の理由となり得ることを意味している。
本研究は、ＯＬＦからのＢＢＢ開口に先行して関与し得る因子を同定した。ＢＢＢ漏出に関与する因子の一つは、高熱であり得る。マウス敗血症モデルと同様に、マウスマラリアモデルにおいて体温調節が存在するはずであると推測されるが、現在、マウスマラリアにおいてる熱から起こる反応は報告されていない（Ｌａｍｂ，Ｔ．Ｊ．ら（２００６）．Ｅｘｐｅｒｔ ＲｅｖＭｏｌ Ｍｅｄ ８，１−２２．）。さらに、マウスの脳マラリアは、ヒトの感染とは対照的に、低体温症を引き起こすと考えられる（Ｇｒａｕ，Ｇ．Ｅ．ら（１９９１）．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２１，２２６５−２２６７．）。サーマルカメラを用いることによって、最近開発された新しいが比較的単純な技術（ＡｏｓｈｉおよびＩｓｈｉｉ、論文投稿準備中、特開２０１２−２３１７２５参照）が、熱損や死といった、疾患の最終的な顕在化の２４時間前に、別の発熱期間が生じることを検出した。重要なことに、この発熱期間は、重篤な嗅覚の喪失と相関していた。マウスのサーカディアンリズムが、単一時点における正確な発熱の測定を妨げることを考慮すると、以前の研究が、疾患の最終段階における最終的な熱損しか測定できなかったことは驚くべきことではない。本発明者らは、全身性および局所性のサイトカインおよびケモカインストームが、ヒトの脳マラリアの場合と同様に、マウスにおいて高熱の攻撃を引き起こし得、そしておそらくは、ＢＢＢの完全性の喪失において主要な役割を有したと結論付けた。重要なことに、Ｒａｇ２−／−マウスならびに非致死性および致死性のＰｙ感染において高熱が存在しないことは、発熱がＥＣＭに関連しており、脳マラリアの間のＢＢＢ漏出に関連し得るという本発明者らの知見を確認し得る。しかしながら、ＥＣＭの間に発熱を引き起こすメディエーターとそのＢＢＢ破壊に対する直接的な役割は、現在未知のままである。発熱の機構とそのサイトカイン血症との関連性の科学的な理解は、ＬＰＳのような大部分は細菌性の生成物と、発熱がサイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦαとよく相関することが知られるＬＰＳチャレンジモデルとを用いてしか行われていない（Ｎｅｔｅａ，Ｍ．Ｇ．ら、（２０００）．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３１ Ｓｕｐｐ１５，Ｓ１７８−１８４．）。これに対し、これらとまったく同じサイトカインが上昇し、マラリア性の発熱を引き起こすマウスマラリアにおいて入手可能な明確な情報および直接的な相関性は存在しない。明らかに、この領域にはさらなる検討が必要である。
星状細胞は、血流の調節とＢＢＢの維持に必須の一般的なＣＮＳ駐在細胞である。星状細胞はまた、生理学的状態および病理学的状態の間に広範な種々のケモカインを発現することによって、ＣＮＳの免疫防御においても重要な働きを有する（ｄｅ Ｈａａｓ，Ａ．Ｈ．ら（２００７）．ＭｏｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌ ３６，１３７−１５１．；Ｍｅｄａｎａ，Ｉ．Ｍ．ら、（１９９６）．Ｇｌｉａ １６，５１−６４．）。さらに、星状細胞は、ＣＮＳ損傷および感染に応答してＣＣＬ２１発現を増加させる（Ｌａｌｏｒ，Ｓ．Ｊ．およびＳｅｇａｌ，Ｂ．Ｍ．（２０１０）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２２４，５６−６１．；Ｎｏｏｒ，Ｓ．ら（２０１０）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７８，２２５７−２２６３．）。ＯＬＦ、特に、非常に多数の星状細胞が存在するＧＬにおけるＣＣＬ２１発現の勾配が増加していることから、本発明者らは、Ｃｃｒ７欠失マウスを検討することにした。なぜならば、ＣＣＲ７は、そのリガンドであるＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１との相互作用を介して、ＣＮＳの免疫監視のためのリンパ球の往来を調節しているからである（Ｎｏｏｒ，Ｓ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｈ．（２０１２）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ９，７７．）。加えて、これまでの研究が、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ１のようなケモカイン受容体が、脳内への細胞の移動にとって重要であり得ること（Ｍｉｕ，Ｊ．ら（２００８）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０，１２１７−１２３０．）、そして、ケモカイン／ケモカイン受容体を欠失するマウスにおいて、ＣＣＲ１およびＣＣＲ２がＥＣＭの発病に不必要であったのに対し、ＣＣＲ５とＣＸＣＲ３は、脳マラリアの最中に脳内へのＣＤ８Ｔ細胞の移動を増強したこと（Ｂｅｌｎｏｕｅ，Ｅ．ら（２００３）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ７１，３６４８−３６５１．；Ｂｅｌｎｏｕｅ，Ｅ．ら（２００３）．Ｂｌｏｏｄ １０１，４２５３−４２５９．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｄ．Ｓ．（２０１２）．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８，ｅ１００３０４５．；Ｍｉｕ，Ｊ．ら（２００８）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０，１２１７−１２３０．）を報告している。抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーＣＴＬ応答の誘導および維持におけるＣＣＲ７の役割は、Ｃｃｒ７−／−マウスにおいて徹底的に検討されているが（Ｊｕｎｔ，Ｔ．ら（２００４）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３，６６８４−６６９３．）、ＥＣＭなどの重篤なマラリアモデルにおけるＣＣＲ７の役割はこれまでに検討されていなかった。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染モデルにおいて、ＣＣＲ７は、抗ウイルス性のエフェクターおよびメモリーＣＴＬの移動および増殖の協調にとって重要であった（Ｊｕｎｔ，Ｔ．ら（２００４）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７３，６６８４−６６９３．）。同様に、本発明者らは、ＣＤ１１ｃを発現するエフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の増殖および移動が、ＣＣＲ７の非存在下において、脾臓ならびに脳でひどく損なわれていることを見い出した。しかしながら、Ｒａｇ２−／−マウスからのＣＤ８α ＤＣを用いた本発明者らの詳細な分析からは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖が、脾臓におけるＣＤ８α ＤＣからの抗原性刺激を必要とし、ＣＣＲ７の存在お必要としたと結論付けるに至った。ＣＤ８α ＤＣは、抗原、特に、死細胞からの抗原をＴ細胞に対してクロスプレゼンテーションし得ることが示唆された（Ｓｈｏｒｔｍａｎ，Ｋ．およびＨｅａｔｈ，Ｗ．Ｒ．（２０１０）．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２３４，１８−３１．）。他方で、Ｂａｔｆ３−／−マウスが部分的（約５０％）にしかＥＣＭから逃れることができないことを考慮すると、ＥＣＭの間に、ＢＡＴＦ３、ＢＡＴＦおよびＢＡＴＦ２の組み合わさった作用の結果としてＤＣ発症におけるＢＡＴＦファミリーのメンバー間で代償が生じるのか、あるいは、他のＤＣタイプの間で代償が生じるのかについては、さらなる検討が必要である（Ｅｄｅｌｓｏｎ，Ｂ．Ｔ．ら、（２０１１）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５，２３６−２４８．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔ．Ｌ．ら、（２０１３）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，４９９−５０９．）。それにもかかわらず、これらの結果は、ＰｂＡ感染中のＣＤ８ Ｔ細胞のＣＤ８α ＤＣクロスプライミングが、エフェクターＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導するＣＣＲ７を必要とし、これらのＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞がＯＬＦを介して脳内に移動し、最終的にはＥＣＭを引き起こすことを示した。しかしながら、活性化されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞は、エフェクター期に、ＩＰ−１０およびＣＸＣＲ３のようないくつかのケモカインおよびケモカイン受容体を含む複数の分子を介して脳に移動する。ＣＣＬ２１がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングに関与していることは明らかであるが、感染後３日目という感染早期のＯＬＦにおけるＣＣＬ２１の存在は、Ｔ細胞の移動についての化学走性の裏付けとのその関連性を意味した。本発明者らの仮説の裏付けとして、ＣＸＣＲ３は、特に星状細胞および小膠細胞において、ＣＣＬ２１の代替的ケモカイン受容体として認識されている（ｖａｎ Ｗｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｒ．ら（２０１０）．ＢｒａｉｎＢｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ ２４，７６８−７７５．）。さらに、ＣＣＬ２１が、トキソプラズマ感染後に脳において急速に増加し、Ｔ細胞の移動を裏付けることが示されている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｈ．ら（２００９）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０，３００−３１１．）。それゆえ、ＣＸＣＲ３＋ＣＤ８ Ｔ細胞もまた、ＣＣＬ２１が関与する同様の機構によってＯＬＦに移動し得る可能性がある。本発明者らによるインビトロのトランスウェル移動アッセイは、これらの仮説を裏付けるが、ＯＬＦ機能不全の発症時（４日目）における抗ＣＣＬ２１抗体治療の効果が限られていることから、インビボでＥＣＭのエフェクター期に病理を引き起こす他の機構による代償が示唆され得る。とはいえ、本発明者らは、本明細書において、ＣＣＬ２１のブロッキング、抗ＣＣＬ２１治療、ならびに、ＣＣＲ７−ＣＣＬ２１軸およびＣＸＣＲ３−ＣＣＬ２１軸の妨害の組み合わせという新たな治療アプローチは、ＥＣＭ処置のための新規ストラテジーとして開発され得るという「概念実証」を示す。嗅覚の喪失が、ＥＣＭ症状の新たな早期診断マーカーとなり得、ＰｂＡ感染後早くも４日目には、マウスの治療を可能にし得ることは特筆すべきである。
まとめると、本研究は、ＯＬＦが、マウスおよびサルの両方において、多くの病原菌が脳に侵入するための「弱点」であり、それゆえ、その複雑な毛細管構造がＥＣＭを引き起こすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫の標的となり得ることを実証する。マウスの研究はまた、病原性ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞のような免疫細胞がＯＬＦにおける微小出血を介して脳に侵入すると結論付けた。感染初期のＯＬＦのＧＬにおけるＣＣＬ２１は、病原性ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８ Ｔ細胞の蓄積の基礎的な機構の一つとなり得、ＣＣＬ２１の発現は、ＥＣＭの発症にとってのリスクファクターとなり得る（図７）。これらの結果は、ＯＬＦの機能不全がＥＣＭの発症および早期診断の有用なマーカーであるという証拠を提供する。現在、マウスにおけるこれらの知見がヒトにも適用可能であるかどうかは不明である。特筆すべきことに、「幻嗅」（Ｐｅｒｒｙ，Ｔ．Ｌ．ら、（２００９）．Ｏｐｅｎ Ｍｅｄ ３，ｅ１０−１６．）のように、ヒトにおけるＯＬＦが関与する症状は、マウスのものとは異なり得る。嗅覚の喪失の新たな試験や、改良されたヒトＯＬＦ ＭＲＩイメージング（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、（２０１１）．ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ ３２，６７７−６８１．）のような技術が将来必要とされるのは明らかである。さらに、ＯＬＦ、早期のＢＢＢ漏出および出血の位置は、脳マラリアにとって、ならびに、ヒトにおける自己免疫疾患および炎症性疾患を含む様々な神経免疫学的疾患にとって、有用な治療標的であることが証明され得る（Ｂａｒｒｅｓｉ，Ｍ．ら、（２０１２）．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ３２３，１６−２４．）。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
脳マラリアの診断・検出マーカーおよび脳マラリアの制御技術が提供され、脳マラリアの診断、治療および予防に関連する技術に関与する産業（試薬、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
配列番号１：ＣＣＬ２１の代表的核酸配列
配列番号２：ＣＣＬ２１の代表的アミノ酸配列
配列番号３：ＣＸＣＲ３の代表的核酸配列
配列番号４：ＣＸＣＲ３の代表的アミノ酸配列
配列番号５：ＣＣＲ７の代表的核酸配列
配列番号６：ＣＣＲ７の代表的アミノ酸配列
［配列表］

Claims (6)

  1. ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ７からなる群から選択される少なくとも２つの因子の阻害剤を含む、脳マラリアの予防または治療剤であって、該阻害剤は、抗体またはそのフラグメントもしくは機能的等価物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、それらの薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物、またはその薬学的に受容可能な塩の溶媒和物である、予防または治療剤。
  2. 前記阻害剤は、ＣＣＬ２１タンパク質、ＣＸＣＲ３タンパク質およびＣＣＲ７タンパク質からなる群より選択される因子の阻害剤を含む、請求項１に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
  3. 前記阻害剤は、ＣＣＬ２１タンパク質をコードする核酸、ＣＸＣＲ３タンパク質をコードする核酸およびＣＣＲ７タンパク質をコードする核酸からなる群より選択される因子の阻害剤を含む、請求項１または２に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
  4. 前記阻害剤は、抗体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
  5. 前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体からなる群より選択される少なくとも２種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、請求項１に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
  6. 前記阻害剤は、抗ＣＣＬ２１抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体および抗ＣＣＲ７抗体の３種の抗体、またはそのフラグメントもしくは機能的等価物を含む、請求項１に記載の脳マラリアの予防または治療剤。
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