JP6599859B2 - ヒト化抗カリクレイン−２抗体 - Google Patents

Description

本発明は一般に、治療および診断薬剤ならびに方法の分野、特に前立腺癌の分野に関する。

前立腺癌は、現在のところ男性の癌の最も一般的な形態である。前立腺は、男性にあるクルミサイズの腺であり、精液の成分である液体を産生する。前立腺は２つもしくはそれ以上の葉、または断片を有し、組織の外層によって囲まれている。前立腺は、直腸の前の膀胱直下に位置し、尿道を取り囲んでいる。

前立腺癌の発生は、ヨーロッパの北西部および米国において最も高い。腫瘍の成長は、通常長期間の間に起こる過程である。前立腺癌は通常、穏やかな形態の癌である。実際のところ、前立腺癌と診断された男性の大多数は生存し、回復し、少数の男性だけが、初期段階において転移する悪性形態の前立腺癌になる。この悪性形態の前立腺癌は、癌が被膜外組織に広がる前の、初期段階で診断される場合にだけ治療可能である。

今日、前立腺癌の診断およびモニターは、患者血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の濃度を測定することによって一般に実行される。異なる時点で実行した数回の連続的な測定において、ＰＳＡの濃度が著しく高い場合、前立腺癌の可能性があると判定される。この時点で、生検を実行して、前立腺癌を確認することができる。

ＰＳＡ（別名カリクレインＩＩＩ）は、２３７アミノ酸の一本鎖からなるタンパク質であり、前立腺の分泌細胞において産生される。これらの分泌細胞は、前立腺全体に見ることができる。ＰＳＡは、前立腺癌に関してしっかりと確立され、良く研究されているマーカーである。健康細胞との比較により、ＰＳＡの産生は、悪性細胞においてより低く、過形成細胞においてより高い。実際にＰＳＡの濃度が前立腺癌を患っている男性の血液中でより高いことは、むしろ矛盾している。しかしながら、１つの説明は、悪性細胞が劣化した細胞構造を有し、したがってＰＳＡに対してより透過性であるということである。

前立腺癌の療法の標的として適している別の重要なセリンプロテアーゼは、ヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）である。ｈＫ２をコードしている遺伝子は、ＰＳＡをコードしている遺伝子と共に第１９染色体に位置する。ｈＫ２は、前立腺組織において、まさにＰＳＡのように主に発現する。前立腺において、ＰＳＡは、不活性な前形態として存在し、ｈＫ２のペプチダーゼ作用によって活性化される。ｈＫ２に関する免疫組織化学的研究は、ｈＫ２が分化のレベルと関連して発現することが示されている。これは、ｈＫ２が、前立腺癌の状態の組織など低分化の組織においてより高い産生量で、および別の一般的な前立腺の問題である前立腺肥大症（ＢＰＨ）の状態の組織など高分化の組織においてより低い産生量で発現することを意味する。

今日の前立腺癌の療法は、手術（例えば、根治的前立腺切除）、放射線療法（近接照射療法および外照射療法を含む）、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、化学療法、経口化学療法薬、凍結手術（腫瘍を凍らせる）、ホルモン療法（抗アンドロゲン療法など）、去勢または前述の組合せである。

これらの療法の大部分（手術および外照射療法）は、しかしながら原発腫瘍および大きい転移の治療にしか（または主に）有用でない。化学療法は、播種性の癌に使用されるが、これらの患者の大部分の場合、緩和効果および／または生存期間の延長である。したがって、播種性悪性疾患、特に微小転移巣の場合、相当な改善を達成するには他のまたは相補的な治療様式が必要である。

抗体およびフラグメントなど標的化分子を使用する免疫療法または放射免疫療法などの療法は、播種性疾患の療法の可能性を与える。

したがって、前立腺癌を治療および診断するための新たな治療薬剤ならびに方法が必要とされている。

したがって、本発明は、上で定義した１つもしくはそれ以上の、当技術分野における不十分な点ならびに不都合を単独でまたは任意の組合せで緩和、軽減もしくは除去することを模索し、添付の特許請求の範囲による治療薬剤および方法を提供することによって少なくとも上述の問題を解決する。

本発明の第１の態様は、ヒトカリクレイン−２（ｈK２）に対する結合特異性を持つ抗体ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１および配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲＨ１： ＳＤＹＡＷＮ 配列番号１
ＣＤＲＨ２： ＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳ 配列番号２
ＣＤＲＨ３： ＧＹＹＹＧＳＧＦ 配列番号３
ならびに／または
（ｂ）配列番号４および配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１： ＫＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨ 配列番号４
ＣＤＲＬ２： ＡＡＳＮＲＥＳ 配列番号５
ＣＤＲＬ３： ＱＱＴＲＫＶＰＹＴ 配列番号６
を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、１つまたはそれ以上のヒト抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列を含む、抗体ポリペプチドを提供する。

上記の６つのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔら、（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（その開示を参照によって本明細書に組み入れる）にしたがって定義されるように、本発明の抗体ポリペプチドの相補性決定領域（ＣＤＲ）を表す。

「抗体ポリペプチド」には、実質的に完全な抗体分子、一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびに抗原結合フラグメントおよびその誘導体を含める。

本明細書では用語「アミノ酸」は、遺伝的にコードされている標準的な２０アミノ酸およびそれに対応する「Ｄ」体（天然の「Ｌ」体と比較する）の立体異性体、ω−アミノ酸、他の天然に存在するアミノ酸、非正規なアミノ酸（例えばα、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸等）ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸を含む（下記参照）。

「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」のようにアミノ酸が具体的に挙げられている場合、明確に記述されない限り、その用語は、Ｌ−アラニンとＤ−アラニンの両方のことを指す。ポリペプチドによって望ましい機能特性が保持される限り、他の非正規なアミノ酸も、本発明のポリペプチドに適切な成分になることができる。示したペプチドについて、コードされた各アミノ酸残基は、必要に応じて、一文字指定によって表され、従来のアミノ酸の慣用名に対応する。

一実施形態において、本明細書に定義したポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むまたはそれからなる。

本発明の抗体ポリペプチドは、ｈＫ２に対する特異性を呈する。

典型的なｈＫ２配列は、以下のワールドワイドウェブアドレス：
ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｐｒｏｔｅｉｎ？ｇ＝ＥＮＳＧ０００００１６７７５１；ｒ＝１９：５１３７６６８９−５１３８３８２２；ｔ＝ＥＮＳＴ０００００３２５３２１
で見ることができるアンサンブルデータベースにあるように、転写産物：ＫＬＫ２−２０１（ＥＮＳＴ０００００３２５３２１）、遺伝子産物ＥＮＳＧ０００００１６７７５１と記述され、以下の配列：
ＭＷＤＬＶＬＳＩＡＬ ＳＶＧＣＴＧＡＶＰＬ ＩＱＳＲＩＶＧＧＷＥ ＣＥＫＨＳＱＰＷＱＶ ＡＶＹＳＨＧＷＡＨＣ ＧＧＶＬＶＨＰＱＷＶ ＬＴＡＡＨＣＬＫＫＮ ＳＱＶＷＬＧＲＨＮＬ ＦＥＰＥＤＴＧＱＲＶ ＰＶＳＨＳＦＰＨＰＬ ＹＮＭＳＬＬＫＨＱＳ ＬＲＰＤＥＤＳＳＨＤ ＬＭＬＬＲＬＳＥＰＡ ＫＩＴＤＶＶＫＶＬＧ ＬＰＴＱＥＰＡＬＧＴ ＴＣＹＡＳＧＷＧＳＩ ＥＰＥＥＦＬＲＰＲＳ ＬＱＣＶＳＬＨＬＬＳ ＮＤＭＣＡＲＡＹＳＥ ＫＶＴＥＦＭＬＣＡＧ ＬＷＴＧＧＫＤＴＣＧ ＧＤＳＧＧＰＬＶＣＮ ＧＶＬＱＧＩＴＳＷＧ ＰＥＰＣＡＬＰＥＫＰ ＡＶＹＴＫＶＶＨＹＲ ＫＷＩＫＤＴＩＡＡＮＰ
［配列番号７］
を有する（成熟した、活性なｈＫ２タンパク質の配列に下線を施し、その配列は、Ｎ末端においてシグナルペプチドおよびプロペプチド配列が前にある）。

精漿に見られるｈＫ２の大部分は、不活性であり、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）と複合体形成している。ｈＫ２が、他の細胞外プロテアーゼインヒビターと複合体を形成することも考えられる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、ｈＫ２がα２−抗プラスミン（α２−ＡＰ）、ＡＣＴ、ＡＭＧ、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、Ｃ１不活化因子およびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）に結合できることを示す。

一実施形態において、抗体ポリペプチドは、複合型のｈＫ２アイソフォームと比較して、遊離（すなわち、非複合型）ｈＫ２アイソフォームに対する特異性を有する。遊離ｈＫ２アイソフォームに対する特異性がある結合部分は、遊離ｈＫ２アイソフォーム上で露出しているが、複合型ｈＫ２アイソフォーム上で露出していないエピトープに対する結合特異性を有し、これは直鎖状またはコンフォメーションを有する（すなわち、非直鎖状）エピトープであることがある。例えば、抗体ポリペプチドは、遊離ｈＫ２においては露出しているが、ｈＫ２がＰＣＩと複合体形成している場合に精液に存在する形態のような複合型アイソフォームにおいては露出していない、ｈＫ２の触媒溝の一部である１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに対する特異性を有していてよい。ｈＫ２のエピトープマッピングについては、Ｖａｉｓａｎｅｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：９、１６０７〜１６１７頁（２００４年）に記述され、その開示を参照によって本明細書に組み入れる。

ｈＫ２タンパク質のさらなる例は、以下の受託番号によって同定される：
（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ０８２７７．１；
（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ０８２７５．１；および
（ｃ）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ２０１５１．１

組換えｈＫ２の産生については、Ｌｏｖｇｒｅｎら、１９９９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６：１０５０〜５頁に記述される（その開示を参照によって本明細書に組み入れる）。

「特異性」とは、抗体ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏ、すなわち人体においてｈＫ２が存在する生理的条件下で、ｈＫ２に結合可能であることを意味する。好ましくは、抗体ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで他のどんなタンパク質にも結合しない。

そのような結合特異性は、ｈＫ２を発現するトランスフェクトした細胞を使用するＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーのような当技術分野において周知の方法によって決定することができる。有利なことに、抗体ポリペプチドは、ｈＫ２に選択的に結合することが可能であり、すなわち、その抗体は別のタンパク質（特に、前立腺特異抗原またはＰＳＡのような他のカリクレイン）よりｈＫ２に少なくとも１０倍強く結合する。好ましくは、抗原ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＳＡに結合しない。

ｈＫ２に対する特異性を持つマウス抗体は、当業者に公知である。例えば、Ｖａｉｓａｎｅｎら、２００４年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（９）：１６０７〜１６１７頁は、マウスにおけるｈＫ２に対する特異性を持つモノクローナル抗体の産生について記述している（その開示を参照によって本明細書に組み入れる）。「１１Ｂ６」および「７Ｄ７」と称される２つの抗体は、ｈＫ２に対して選択的であると述べられる。

マウス抗体１１Ｂ６の重鎖および軽鎖成分のアミノ酸配列は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２６７５（ＷＯ２０１３／０６１０８３；その開示全体を参照によって本明細書に組み入れる）に開示され；特に、その中の配列番号４および５を参照のこと。

本発明の抗体ポリペプチドは、１１Ｂ６抗体の選択されたヒト化バージョンに基づき、それは予想外の好ましい特性を呈する。

特に、本発明のヒト化抗体は、ＣＤＲ配列が得られたマウス親１１Ｂ６抗体（ｍ１１Ｂ６）と比較して治療可能比の増強を呈する（実施例６を参照のこと）。

「治療可能比の増強」とは、本発明の抗体ポリペプチド（１１Ｂ６抗体のヒト化形態）が、前立腺腫瘍の患者に投与される場合に、マウス親１１Ｂ６抗体（同じ放射活性および投与ルートで比較する）より高い比の腫瘍吸収線量対（健常）骨髄吸収線量が得られることを意味する。腫瘍対骨髄の吸収線量の比は、実施例６に記述される方法を使用して算出できる。

本発明の抗体の予想外に良好な治療プロファイルは、より高い放射線量（吸収線量）を使用することを可能にし、健康な組織および臓器に対する副作用または「副次的損傷」を増加させることなく、前立腺癌の治療においてより大きな効能をもたらす。

ヒト化（再構築またはＣＤＲ移植とも称する）は、異種供給源由来（一般に、マウスなど齧歯動物由来）モノクローナル抗体の免疫原性を減少させ、ヒト免疫系の活性化を改善するための技術である（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、２００８年、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：１６１９〜１６３３頁による総説を参照のこと；その開示を参照によって本明細書に組み入れる）。いくつものヒト化モノクローナル抗体が臨床試験中であり、いくつかは薬物として使用される承認を得ている。分子生物学の技術を使用して操作したモノクローナル抗体を産生する技法は比較的直接的であるが、ヒトフレームワークへの齧歯目の相補性決定領域（ＣＤＲ）の単純な移植では、起源モノクローナル抗体の結合親和性および特異性を必ずしも再構成しない。抗体をヒト化するためには、ヒト化抗体の設計は、起源分子の機能を再生させるにあたって重要な工程である。

ヒト化抗体の設計は、使用しようとするＣＤＲの範囲および使用しようとするヒトフレームワークを含めたいくつかの鍵となる選択肢を含む。しかし、親抗体の特異性を保持するためには、ヒトフレームワーク領域に齧歯目ｍＡｂ由来残基を１つまたはそれ以上置換する（いわゆる復帰突然変異）ことも重要になる。必要な復帰突然変異の位置を同定するには、詳細な配列／構造分析を必要とする。近年では、ファージライブラリを使用して、選んだ位置でアミノ酸を変化させてきた。同様に、齧歯目のＣＤＲを移植するのに最適なヒトフレームワークを選ぶために、多くの手法が使用されてきた。初期の実験は、齧歯目のモノクローナル抗体に対する配列同一性に関係なく、よく特徴づけられたヒトモノクローナル抗体の限られたサブセット（しばしば構造が利用可能であった）を使用した（いわゆる固定フレームワーク手法）。いくつかのグループは、齧歯目の可変領域に対して高いアミノ酸配列同一性（相同性マッチングまたはベストフィット）を持つ可変領域を使用し；他のグループは共通のまたは生殖細胞系配列を使用し、一方でさらに他のグループは、異なるいくつかのヒトモノクローナル抗体から各軽鎖もしくは重鎖可変領域のフレームワーク配列のフラグメントを選択する。齧歯目の表面残基をヒトモノクローナル抗体に見られる最も一般的な残基と置きかえる（「再表面化（resurfacing）」または「化粧張り（veneering）」）および異なる定義のＣＤＲの範囲を使用するヒト化の手法も開発されている。

しかしながら、抗体ヒト化の大規模研究にもかかわらず、いくつかの齧歯目モノクローナル抗体は、ヒト化が困難であることが判明した。

本発明の抗体ポリペプチドの開発は、フレームワーク領域だけでなくいくつかのＣＤＲにおいても復帰突然変異を必要とした（下記の実施例１を参照のこと）。したがって、配列番号１〜６で上に表される６つのＣＤＲ配列は、マウス抗ｈＫ２抗体１１Ｂ６から得られるが、マウス親抗体と比較してＣＤＲＨ２（配列番号２）およびＣＤＲＬ１（配列番号４）に突然変異を含有する。ＣＤＲ中のこれらの突然変異は、１１Ｂ６のヒト化バージョンにおける最適な特異性および安定性を得るために作製された。

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、０．１×１０^−９Ｍより大きいＫ_ＤでｈＫ２に結合する。

相互作用（抗体とリガンドとの相互作用など）の全体的な親和性（Ｋ_Ｄ）ならびに会合速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）を測定する方法は、当業者に周知である。典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏの方法については、下記の実施例３に記述される。フローサイトメトリーに基づく方法を使用することも考えられる（Ｓｋｌａｒら、２００２年、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ、３１：９７〜１１９頁；その開示を参照によって本明細書に組み入れる）。

有利には、本発明の抗体ポリペプチドは、ｈＫ２に対する１．０×１０^−１０Ｍ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）、例えば９．０ｘ１０^−１１Ｍ、８．０ｘ１０^−１１Ｍ、７．０ｘ１０^−１１Ｍ、６．０ｘ１０^−１１Ｍ、５．０ｘ１０^−１１Ｍ、４．０ｘ１０^−１１Ｍ、３．０ｘ１０^−１１Ｍ、２．０ｘ１０^−１１Ｍ未満または１．０ｘ１０^−１１Ｍ未満のＫ_Ｄを有する。

本発明の抗体ポリペプチドが、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびに抗原結合フラグメントおよびその誘導体を構成できることは、当技術に熟達した者には認識されよう。

一実施形態において、抗体ポリペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ分子のような完全（すなわちすべて揃った）抗体を含むまたはそれからなる。

有利には、抗体ポリペプチドは、完全なＩｇＧ分子または抗原結合フラグメントもしくはその誘導体を含むまたはそれからなる。

ＩｇＧ分子は、任意の公知のサブタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってもよい。

抗体の「抗原結合フラグメントおよび誘導体」には、Ｆｖフラグメント（例えば一本鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント［例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）_２フラグメント］およびドメイン抗体（例えば単一Ｖ_Ｈ可変ドメインまたはＶ_Ｌ可変ドメイン）を含める。

例えば、抗体ポリペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントを含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。

本発明の抗体ポリペプチドをさらに特徴づけている特徴は、重鎖および軽鎖可変領域における１つまたはそれ以上のヒト抗体に由来するフレームワークアミノ酸配列の存在である。

「フレームワーク配列」には、ＣＤＲ以外の重鎖および軽鎖可変ドメインの領域を含める。
一般に、各可変ドメインは、４つのフレームワーク領域を含むことになり、ＦＲ１〜ＦＲ４と称され、その中にＣＤＲ配列が位置する：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４

フレームワーク領域のアミノ酸配列は、完全にヒトの配列であっても、または１つもしくはそれ以上の復帰突然変異を含有していてもよい（すなわち、ヒトフレームワークに存在するアミノ酸配列を、ＣＤＲが由来する齧歯目の可変ドメイン内の対応する位置に見られるアミノ酸で置換することができる）ことはいうまでもない。結果的に、本発明の抗体ポリペプチドの重鎖ならびに／または軽鎖可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／もしくはＦＲ４の配列は、天然には存在しない配列であることがある。

一実施形態において、抗体ポリペプチドのフレームワーク配列は、１つまたはそれ以上のヒト抗体に由来するフレームワーク領域と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を共有する。したがって、抗体ポリペプチドは、ヒト抗体のＦＲ１領域と少なくとも７０％の配列同一性を共有する重鎖ＦＲ１領域を含むことができる。しかしながら、抗体ポリペプチドの重鎖および軽鎖が、異なるヒト抗体のフレームワーク領域と配列同一性を共有できることはいうまでもない。

パーセント同一性は、例えば、Ｅｘｐａｓｙ機関サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．oｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）にあるＬＡＬＩＧＮプログラム［ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１年）１２：３３７〜３５７頁］により、パラメータとしてグローバルアラインメントオプション、スコア行列ＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップペナルティ−１４、延長ギャップペナルティ−４を使用して決定することができる。別法として、２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、適切なコンピュータプログラム、例えばウィスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定することができ、パーセント同一性が、配列が最適に整列されたポリペプチドに対して算出されることはいうまでもない。

別法として整列化は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０頁に記載される、参照によって本明細書に組み入れる）を使用して実施することができる。使用したパラメータは、以下の通りである：
・高速ペアワイズ整列化パラメータ：Ｋ組（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコア法：ｘパーセント。
・多重整列化パラメータ：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
・スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ。

別法として、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、局所配列整列化を決定することができる。

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドの重鎖可変ドメインのフレームワーク配列は、ヒト免疫グロブリンＶＨ４遺伝子ファミリーにコードされている。

例えば、フレームワーク配列は、少なくとも一部にはＶＨ４−２８生殖細胞遺伝子にコードされている（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３はＶＨ４−２８にコードされ、ＦＲ４はＪＨ１にコードされている）。

したがって、一実施形態において、抗体ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖可変領域を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＭＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
［配列番号８］

一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドの軽鎖可変ドメインのフレームワーク配列は、ヒト免疫グロブリンκＶ４遺伝子ファミリーにコードされている。

例えば、フレームワーク配列は、少なくとも一部にはＩｇｋＶ４−Ｂ３生殖細胞遺伝子にコードされている（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３はＩｇｋＶ４−Ｂ３にコードされ、ＦＲ４はＪＫ２にコードされている）。

したがって、一実施形態において、抗体ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖可変領域を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい：ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴ ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
［配列番号９］

「少なくとも一部」には、フレームワーク配列が、参照遺伝子にコードされる少なくとも１０個の連続するアミノ酸、例えば少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含むことを含める。１つまたはそれ以上だがすべてではないＦＲ領域が、参照遺伝子にコードされる（例えば、ＦＲ１およびＦＲ２が参照遺伝子にコードされるが、ＦＲ３はコードされない）ことも含める。

好ましい実施形態において、抗体ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖可変領域、および配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖可変領域を含む。

場合により、本発明の抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域またはその一部をさらに含む。

一実施形態において、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖など）のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む。したがって、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ１重鎖由来の定常領域の一部または全部を含むことができる。例えば、抗体ポリペプチドは、ＣＨ１およびＣＬ定常領域を含むＦａｂフラグメントであってもよい。

一実施形態において、抗体ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域を含むことができる。Ｆｃ部分が、ＩｇＧ抗体に由来する、または異なるクラスの抗体（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなど）に由来することは、当業者には認識されよう。一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体に由来する。

Ｆｃ領域は、天然に存在する（例えば内生的に産生される抗体の一部）ものであっても、または人工的（例えば、天然に存在するＦｃ領域と比較して１つもしくはそれ以上の点突然変異および／またはＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分に修飾を含む）なものであってもよい。ＦｃＲに結合する能力を改善する点突然変異を持つＦｃ領域は、例えば血清半減期を改変することにより、またはＡＤＣＣおよびＣＤＣに関係するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対する結合を変化させる（すなわち、増強または減少させる）ことにより有利になることがある。

有利なことに、抗体ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、またはその一部を含むことができる：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
［配列番号１０］

場合により、本発明の抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域またはその一部をさらに含む。

一実施形態において、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ軽鎖のＣＬ領域（κまたはλ軽鎖など）を含む。

例えば、抗体ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列、またはその一部を含むことができる：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
［配列番号１１］

有利には、抗体ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖定常領域、および配列番号１１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖定常領域を含む。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖（可変領域は太字体およびＣＤＲ配列は囲んだイタリックである）

および／または

（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖（可変領域は太字体およびＣＤＲ配列は囲んだイタリックである）

を含む。

例えば、抗体ポリペプチドは、配列番号１２の重鎖２つおよび配列番号１３の軽鎖２つを含んでいるかまたはそれからなっていてもよく、それらはジスルフィド架橋によって互いに繋がれて、典型的なＩｇＧ抗体構造を形成する。

本発明の抗体ポリペプチドは、修飾または誘導体化した１つまたはそれ以上のアミノ酸を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。

１つまたはそれ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能性側基との反応によって達成することができる。そのような誘導体化した分子には、例えば、遊離アミノ基を誘導体化したアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子がある。遊離カルボキシ基は誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルならびにヒドラジドを形成することができる。遊離水酸基は誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも化学誘導体に含める。例えば：４−ヒドロキシプロリンをプロリンと置換できる；５−ヒドロキシリシンをリジンと置換できる；３−メチルヒスチジンをヒスチジンと置換できる；ホモセリンをセリンおよびオルニチンをリジンと置換できる。必要な活性が維持される限り、誘導体は１つもしくはそれ以上の付加または欠失を含有するペプチドも含む。他に含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えばアセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えばアンモニアまたはメチルアミンによる）、などの末端修飾である。

ペプチド模倣体化合物も有用であることは、当技術に熟達した者にはさらに認識されよう。用語「ペプチド模倣体」とは、治療薬剤として特定のペプチドのコンフォメーションおよび所望の特徴を模倣する化合物のことを指す。

例えば、前記ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）で繋がれている分子だけでなくペプチド結合が逆転している分子も含む。そのようなレトロインベルソ（retro-inverso）ペプチド模倣体は、例えばＭｅｚｉｅｒｅら（１９９７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９、３２３０〜３２３７頁に記述されるそれなど当技術分野において公知の方法を使用して作ることができ、これは参照によって本明細書に組み入れてある。この手法は、側鎖の向きは変えない骨格の変化を含む偽ペプチドを製作する工程を含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含有するレトロインバース（Retro-inverse）ペプチドは、タンパク質分解に対し、より一層抵抗性である。別法として、前記ポリペプチドは、ペプチド模倣体化合物であってもよく、アミノ酸残基の１つまたはそれ以上は、従来のアミド結合の場所において−ｙ（ＣＨ_２ＮＨ）−結合によって連結されている。

さらに別法として、アミノ酸残基の炭素原子間に間隔を保持する適切なリンカー部分が使用される場合、ペプチド結合は全く不要になり；ペプチド結合と実質的に同じ荷電分布および実質的に同じ平面性を有することは、リンカー部分にとって有利になる。

エキソタンパク質分解性消化に対する感受性を減少させるために、前記ポリペプチドは、好都合には、そのＮまたはＣ末端をブロックできることはいうまでもない。

Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸のような様々なコードされていないまたは修飾したアミノ酸を使用して、哺乳動物のペプチドも修飾した。加えて、推定される生理活性型コンフォメーションを、環化などの共有結合修飾によってまたはラクタムもしくは他の型の架橋の組み込みによって安定化することができ、例えば、Ｖｅｂｅｒら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：２６３６頁およびＴｈｕｒｓｅｌｌら、１９８３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６頁を参照のこと、参照によって本明細書に組み入れる。

本発明の抗体ポリペプチドを官能部分で拡張して、例えばｉｎ ｖｉｖｏ造影剤または治療薬剤として目的とする使用を容易にできることは、当技術に熟達した者には認識されよう。

したがって、一実施形態において、抗体ポリペプチドは、直接または間接的に治療部分に連結されている。

任意の適切な治療部分を使用できる。適切な治療部分は、前立腺癌細胞の成長を減少または阻害する、特に死滅させることが可能なものである。例えば、治療薬剤は細胞障害性部分であってもよい。細胞障害性部分は、１つまたはそれ以上の放射性同位元素を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。例えば、１つまたはそれ以上の放射性同位元素は、β放射体、オージェ放射体、転換電子放射体、α放射体、および低光子エネルギー放射体からなる群からそれぞれ独立に選択できる。１つまたはそれ以上の放射性同位元素は、薬剤付近において高い吸収線量を生じる局所的吸収エネルギーの放射パターンをそれぞれ独立に有することが望ましい。典型的な放射性同位元素は、^９０Ｙ、^３２Ｐ、^１８６Ｒｅ／^１８８Ｒｅのような長距離β放射体；^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^６７Ｃｕ、^１６１Ｔｂ、^１０５Ｒｈのような中距離β放射体；^１６６Ｈｏ、^７６Ａｓ／^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^１５３Ｓｍ；^４５Ｃａまたは^３５Ｓのような低エネルギーβ放射体；^５１Ｃｒ、^６７Ｇａ、^９９Ｔｃ^ｍ、^１１１Ｉｎ、^１１４ｍＩｎ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^２０１Ｔのような転換またはオージェ放射体；ならびに^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ａｃ、^２２５Ａｃ、^２１２Ｐｂ、^２５５Ｆｍ、^２２３Ｒａ、^１４９Ｔｂおよび^２２１Ａｔのようなα放射体を含むことができる。他の放射性核種が利用可能であり、療法に使用可能になる。

別の実施形態において、治療部分または細胞障害性部分が、ＷＯ２００６／０８７３７４Ａ１、特に１１頁７〜１５行において「トレーサ」として開示されている部分でないことが望ましい。

好ましい一実施形態において、抗体ポリペプチドは、放射性同位元素^１７７Ｌｕに連結されている（そうでない場合は標識される）。

別法として、治療部分は、１つまたはそれ以上の治療薬（細胞毒など）、例えば、細胞増殖抑制薬；抗アンドロゲン薬；コルチゾンおよびその誘導体；ホスホン酸塩；テストステロン−５−α−レダクターゼインヒビター；ホウ素付加物（boron addend）；サイトカイン；タプシガルジンおよびその代謝産物；毒素（サポリンまたはカリケアマイシンなど）；化学療法剤（代謝拮抗物質など）；または前立腺癌の治療に有用な他の任意の治療または細胞障害性薬を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。

典型的な治療／細胞障害性薬は、例えば：
・細胞増殖抑止剤、特に、用量規制副作用があるシクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、ロムスチン、タキサン、エストラムスチンリン酸および他のナイトロジェンマスタード、抗生物質（ドキソルビシン、カリケアマイシンおよびエスペラミシンを含む）、ビンカアルカロイド、アジリジン、白金含有化合物、エンドスタチン、アルキルスルホン酸塩、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、酵素、置換された尿素、メチルヒドラジン誘導体、ダウノルビシン、両親媒性アミンを含むがそれだけに限らない細胞増殖抑止剤
・フルタミドおよびビカルタミドならびにその代謝産物のような抗アンドロゲン；
・コルチゾンおよびその誘導体；
・ジホスホン酸塩およびビスホスホネートのようなホスホン酸塩；
・テストステロン−５−α−レダクターゼインヒビター；
・ホウ素付加物；
・サイトカイン；
・タプシガルジンおよびその代謝産物；
・前立腺癌の治療に使用される他の薬剤
を含むことができる。

別法として、細胞障害性部分は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導オージェ電子線療法、シンクロトロン照射療法または低エネルギーＸ線光子活性化療法のような活性化療法における使用に適する１つまたはそれ以上の部分を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。

例えば、本発明の抗体ポリペプチドにより、いわゆる光活性化放射線療法（ＰＡＴ）に主に集中している放射線療法を向上させるためにシンクロトロン放射（または、低エネルギーＸ線）を使用する可能性が生まれ、それらにおいて外部Ｘ線照射からの局所エネルギー蓄積は、予め投与した高Ｚ腫瘍標的化薬剤（ｈｉｇｈ−Ｚ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）との相互作用によって癌組織において増強される。

ＰＡＴ治療法は、グルノーブルにあるヨーロッパ放射光施設（ＥＳＲＦ）のＩＤ１７生医学的ビームラインによって提供されるような、および新しいスウェーデンシンクロトロン施設、Ｍａｘ−ＩＶのような他の施設で将来的に利用可能になると予想されるようなシンクロトロン供給源からの単色のＸ線を利用する。

さらなる治療法候補となる、「誘導オージェ電子腫瘍療法」の研究は、ランドにできる予定のヨーロッパ核破砕中性子源（ＥＳＳ）、および願わくは医学的実験ステーションである。反応器で生成された熱および半熱中性子は、ホウ素中性子捕捉療法、ＢＮＣＴ、誘導α粒子を用いる臨床前実験および脳腫瘍治療の両方ならびに高い局所的吸収エネルギーを与える反跳核（^７Ｌ）に長い間使用されてきた。類似の手法は、中性子および中性子に対して高い断面積を持つ安定原子核で標識された適切な腫瘍標的化分子を使用することである。抗体またはペプチドを、例えば安定なガドリニウム（^１５７Ｇｄ）で標識することができ、この抗体またはペプチドは、Ｇｄ−核によって捕捉される中性子の標的分子として作用し得る。これが、いわゆるガドリニウム中性子捕捉療法（ＧｄＮＣＴ）である。モンテカルロ技術により、腫瘍および周囲の組織における線量分布は、それがγ−光子、中性子、核反跳、ならびに特性Ｘ線、ガドリニウムまたは他の潜在的元素由来の内部転換およびオージェ電子に起因するものとして算出される。

前述のとおり、治療部分（放射性同位元素、細胞障害性部分などのような）を、結合部分（抗体またはそのフラグメントのような）に直接または間接的に連結することができる。適切なリンカーは当業者に公知であり、例えば、補欠分子族、非フェノール性リンカー（Ｎ−スクシンイミジルベンゾアートの誘導体；ドデカボラート）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体のような大環状と非環式キレート化剤両方のキレート化部分、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７三酢酸の誘導体（ＮＯＴＡ）、および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］−ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−（Ｓ）−（４−イソチオシアナトベンジル）−３，６，９三酢酸（ＰＣＴＡ）の誘導体、５−Ｓ−（４−アミノベンジル）−１−オキサ−４，７，１０トリアザシクロドデカン−４，７，１０トリス（酢酸）（ＤＯ３Ａ）の誘導体ならびに他のキレート化部分がある。そのようなリンカーの使用は、薬剤が、リンカーを介して治療部分である放射性同位元素に連結された結合部分として抗体またはそのフラグメントを含むまたはそれからなる状況で、特に適切な可能性がある。

好ましい一つのリンカーは、例えば^１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されているＤＴＰＡである。

さらなる好ましいリンカーは、例えば^８９Ｚｒ−ＤＦＯ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されているデフェロキサミン、ＤＦＯである。

場合により、本発明の抗体ポリペプチドは、検出可能な部分をさらに含む（または含まない）ことができる。例えば、検出可能な部分は、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ，^８９Ｚｒ、^１２３Ｉおよび^２０１Ｔｌからなる群から選択される放射性同位元素のような放射性同位元素を含んでいるかまたはそれからなっていてもよい。場合により、薬剤は、^８６Ｙ／^９０Ｙまたは^１２４Ｉ／^２１１Ａｔのような一対の検出可能なおよび細胞障害性の放射性核種を含むことができる。別法として、薬剤は、検出可能な部分として、さらに細胞障害性部分として集学的方式で同時に作用していわゆる「集学的診断治療法（theragnostics）」を提供することが可能な放射性同位元素を含むことができる。したがって、結合部分を、放射性核種または化学療法剤のような細胞障害性薬を使用する治療能力と共に多重画像診断（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学的、または超音波）の能力を有するナノ粒子とカップリングさせることができる。高周波交番磁界、およびこれに付随する超音波画像診断を使用する温熱療法による治療の可能性も、本発明に含まれる。

別法として、検出可能な部分は、常磁性同位元素を含んでいるかまたはそれからなっていてもよく、このような常磁性同位元素は、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｃｒおよび^５６Ｆｅからなる群から選択される。

抗体ポリペプチドが検出可能な部分を含む場合に、次いで、検出可能な部分は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学または超音波画像診断のような画像診断技術によって検出可能である。

治療および検出可能な部分は、当技術分野において周知の方法を使用して抗体ポリペプチドとコンジュゲート、さもなければ組み合わせることができる｛例えば、既存の免疫複合体療法、ゲムツズマブオゾガミシン［商品名：Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）］は、細胞毒素カリケアマイシンに連結されたモノクローナル抗体を含む｝。

さらなる実施形態において、抗体ポリペプチド分子の集団を含む製剤の形態で本発明の抗体ポリペプチドを使用して、前立腺癌を治療する。１選択肢において、集団中の抗体ポリペプチド分子のすべて（または重量で９０％、９５％、９９％、９９．９％以上より多いような実質的にすべて）は、同じ治療部分を含む。別の選択肢において、集団は、異なる治療部分を持つ他の薬剤の混合物を含む。この選択肢は、化学療法剤、ホルモン療法剤または他の療法の組合せのような様々な薬剤を使用する標的化放射性核種療法の効果を増強する可能性を与えることになり、この療法において標的化薬剤は腫瘍関連抗原へ治療効果がある放射性核種を送達するだけでなく、同時に細胞内シグナル伝達カスケードを変化させる（例えば、始動させるまたは遮断する）ことにより標的した腫瘍細胞を放射線増感する。この選択肢は、大きな腫瘍、微小転移巣ならびに単一腫瘍細胞の併用治療のために、細胞毒性薬剤の混合物、例えば、α放射体と異なる範囲のβ放射体のカクテル、または異なる範囲を持つ放射性核種のカクテルを使用する前立腺癌の治療、ＬＥＴ（線エネルギー付与）およびＲＢＥ（生物学的効果比）にも有用である。一実施形態において、大きな腫瘍を治療するには長距離放射体を、微小転移巣、および単一腫瘍細胞のようなより小さい腫瘍を治療するには短距離放射体を使用することができる。

場合により、本発明の抗体ポリペプチドは、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるための部分をさらに含むことも（または含まないことも）できる。薬剤のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるための典型的な部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸およびデキストランがある。特にＰＥＧが検討される。

本発明のポリペプチドを、例えば冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却によって、または超臨界二酸化炭素からの粒子形成（沈殿）の使用によって凍結乾燥して保管し、使用前に適切な担体に再溶解できることはいうまでもない。任意の適切な凍結乾燥方法（例えば、冷凍乾燥、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）および／または再溶解技術を利用することができる。凍結乾燥および再溶解は様々な程度の活性消失をもたらすことがあり、その使用レベルを上方へ調整して、補正しなければならないことは、当技術に熟達した者には認識されよう。好ましくは、凍結乾燥した（冷凍乾燥した）ポリペプチドは、再水和した場合に、その（凍結乾燥前の）活性を約１％しか、または再水和した場合に、その（凍結乾燥前の）活性を約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％しか、もしくは約５０％しか失わない。

本発明のポリペプチドを産生するための方法は、当業者に周知である。好都合には、ポリペプチドは、組換えポリペプチドであるまたはそれを含む。原核または真核生物宿主細胞における発現など、そのような組換えポリペプチドを産生するための適切な方法は当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと、文書内の関連する開示を参照によって本明細書に組み入れる）。

本発明の抗体ポリペプチドは、ウサギ網状赤血球溶解物または小麦麦芽溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａから利用可能である）のような市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して産生することもできる。好ましくは、翻訳系はウサギ網状赤血球溶解物である。好都合には、翻訳系を、ＴＮＴ転写翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような転写系とカップリングさせることができる。この系には、翻訳と同じ反応においてコードしているＤＮＡポリヌクレオチドから適切なｍＲＮＡ転写産物を産生するという長所がある。

別法として本発明のポリペプチドを、例えば周知の液相または固相合成技術（ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成など）を使用して人工的に合成できることは当技術に熟達した者には認識されよう。

本発明の第２の態様は、本発明の抗体ポリペプチド、またはそのポリペプチド鎖成分をコードする単離された核酸分子を提供する。「核酸分子」には、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたは相補ＤＮＡ）およびｍＲＮＡ分子を含め、それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。

一実施形態において、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。

核酸分子は、特定の宿主細胞における抗体ポリペプチドの発現、例えばヒト細胞における発現のためにコドンを最適化できることは、当技術に熟達した者には認識されよう［例えば、Ａｎｇｏｖ、２０１１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６（６）：６５０〜６５９頁を参照のこと］。

好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、
（ａ）配列番号１４のヌクレオチド配列

および／または

（ｂ）配列番号１５のヌクレオチド配列

を含む。

以下も、本発明の範囲に含まれる：
（ａ）本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に記載の核酸分子を含むベクター（発現ベクターなど）を提供する；
（ｂ）本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様に記載の核酸分子を含む宿主細胞（哺乳動物細胞、例えばヒト細胞など）または本発明の第３の態様に記載のベクターを提供する；および
（ｃ）本発明の第５の態様は、前記ポリペプチドが発現される条件下で本発明の第４の態様に記載の宿主細胞の集団を培養する工程と、そこからポリペプチドを単離する工程とを含む、本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドを製作する方法を提供する。

本発明の第６の態様は、医薬として有効な量の本発明の第１の態様の抗体ポリペプチドおよび薬学的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

ＥＤＴＡ、クエン酸、ＥＧＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤を含めた追加の化合物を、医薬組成物に含めることもできる。

医薬組成物は、十分に保存に安定しており、ヒトおよび動物への投与に適切である当業者に公知の方式で調製することができる。例えば、医薬組成物は、例えば冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却によって、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって凍結乾燥することができる。

「薬学的に許容できる」は、本発明の薬剤のカリクレインタンパク質結合活性の効果を低下させない非毒性材料を意味する。そのような薬学的に許容できる緩衝液、担体または賦形剤は、当業技術分野において周知である［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０年）およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａ．Ｋｉｂｂｅ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照のこと、その開示を参照によって本明細書に組み入れる］。

用語「緩衝液」は、ｐＨを安定させる目的で酸塩基混合物を含有する水溶液を意味するものとする。緩衝液の例は、Ｔｒｉｚｍａ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳである。

用語「希釈剤」は、医薬製剤において薬剤を希釈する目的の水性または非水性溶液を意味するものとする。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油など）のうち１つもしくはそれ以上であってもよい。

用語「アジュバント」は、本発明の薬剤の生物学的作用を増加させるために製剤に添加される任意の化合物を意味するものとする。アジュバントは、異なる陰イオン、例えば、それだけには限らないがフッ化物、クロリド、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸、亜硫酸、水酸化物、リン酸、炭酸、乳酸、グリコール酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、および異なるアシル組成物の酢酸を伴う亜鉛、銅または銀塩のうち１つまたはそれ以上であってもよい。アジュバントは、陽イオンセルロースエーテル、陽イオンセルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、陽イオンデンドリマーのような陽イオンポリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）のような陽イオン合成ポリマー、ならびにポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニンのような陽イオンポリペプチド、およびこれらのアミノ酸を含有するペプチドであることもできる。

賦形剤は、１つまたはそれ以上の炭水化物、ポリマー、脂質および鉱物であってもよい。炭水化物の例には、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンがあり、それらは、例えば凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される。ポリマーの例は、澱粉、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／異なる程度の加水分解のポリ酢酸ビニル、ならびにポリビニルピロリドン、分子量が異なるこれらのすべてであり、それらは、例えば、粘性制御、生物接着を達成する、または化学的およびタンパク質分解から脂質を保護するために組成物に添加される。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノ、ジおよびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、アシル鎖長および飽和が異なるこれらのすべて、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵ならびに大豆レシチンであり、それらは、ポリマーと類似の理由のために組成物に添加される。鉱物の例はタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、それらは、蓄液の減少または有利な色素特性のような利点を得るために組成物に添加される。

本発明の抗体ポリペプチドを、その送達を適切にするために、当業者に公知の任意の型の医薬組成物に製剤化することができる。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、抗体ポリペプチドが、薬学的に許容できる他の担体に加えて、脂質のような両親媒性薬剤と組み合わされているリポソームの形態であってもよく、このリポソームはミセル、不溶性単分子層および液晶として凝集形態で存在する。リポソーム製剤用の適切な脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などがあるが、これに限定されない。適切な脂質には、血流循環時間を延長するために極性頭部基をポリ（エチレングリコール）で修飾した上記の脂質もある。そのようなリポソームの製剤の調製については、参照によって本明細書にその開示を組み入れる例えば米国特許第４，２３５，８７１号に見ることができる。

本発明の医薬組成物は、生分解性微小球の形態であることもできる。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡ（ＰＬＧＡ）またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）とのコポリマー、およびポリ無水物のような脂肪族ポリエステルが、微小球の産生において生分解性ポリマーとして広く使用されてきた。そのような微小球の調製については、米国特許第５，８５１，４５１号および欧州特許第０ ２１３ ３０３号に見ることができ、その開示を参照によって本明細書に組み入れる。

さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、澱粉、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホナート、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、ポリビニルアルコール／異なる程度の加水分解のポリ酢酸ビニル、ならびにポリビニルピロリドンなどのポリマーが、薬剤を含有する溶液を厚くするために使用される。ポリマーは、ゼラチンまたはコラーゲンを含むこともできる。

別法として、抗体ポリペプチドを、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールもしくは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油など）、トラガカントゴム、および／または様々な緩衝液に単に溶解することができる。

本発明の医薬組成物は、活性な抗体ポリペプチドの作用を強化するためにイオンおよび定義済みｐＨを含むことができることはいうまでもない。加えて、組成物を、滅菌のような従来の製薬工程に供することができおよび／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、充填材等のような従来のアジュバントを含有することができる。

本発明に記載の医薬組成物は、当業技術者に公知の任意の適切な経路によって投与することができる。したがって、考えられる投与経路には、非経口（静脈、皮下、筋肉内）、局所、眼、経鼻、肺、口腔、経口、非経口、および直腸がある。移植片からの投与も考えられる。投与される薬剤の潜在的に高い細胞障害性のため、輸注が望ましい経路であることがある。

一実施形態において、医薬組成物は、非経口的、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹膜内、くも膜下腔内、脳室内、大槽内、頭蓋内、筋肉内にもしくは皮下に投与され、またはそれらは輸注技術によって投与することができる。それらは、好都合には、他の物質、例えば、血液と等張な溶液を作るのに十分な塩またはグルコースを含有していてもよい無菌水溶液の形態で使用される。必要に応じて、水溶液は、適切に緩衝されるべきである（例えば、ｐＨ３〜９に）。無菌状態下での適切な非経口製剤の調製は、当業技術者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。

非経口投与に適している製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液がある。製剤は、単位服用量または多回投与用容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液状担体、例えば注射用蒸留水を添加するだけで十分な、冷凍乾燥した（凍結乾燥した）条件で保管することができる。即時の注射溶液および懸濁液は、前に記述したたぐいの無菌の散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。

したがって、本発明の医薬組成物は、患者の腫瘍（例えば、内部腫瘍性または周囲腫瘍性）への非経口、例えば、静脈内投与または局所的投与に特に適している。

医薬組成物は、医薬として有効な用量、すなわち治療上有効な吸収線量の治療用放射性核種で患者に投与されることになる。

本発明の抗体ポリペプチドの治療上の使用の文脈において、「医薬として有効な量」、または「有効な量」、または「治療的に有効な」は、本明細書では、所与の症状および投与治療計画に対して治療効果を提供する量のことを指す。これは、必要とされる添加物および希釈剤、すなわち、担体または投与媒体と関連して望ましい治療効果をもたらすために算出された活性物質の所定の量である。さらに、宿主の活動、機能および応答における臨床的に重要な障害を減少および／または予防するのに十分な量を意味するものとする。あるいは、治療上有効な量は、宿主における臨床的に重要な症状に改善をもたらすのに十分である。当業技術者によって認められているように、化合物の量はその比活性によって変わる。適切な投与量は、必要とされる希釈剤と関連して望ましい治療効果をもたらすように算出された所定の量の活性な組成物を含有することができる。本発明の組成物の製造の方法および使用において、治療上有効な量の活性成分が提供される。治療上有効な量は、当業者に周知であるように、年齢、重量、性別、症状、合併症、他の疾患などのような患者特性に基づいて通常の熟練した医療従事者によって決定することができる（下記の実施例８を参照のこと）。医薬として有効な用量の投与は、個別の用量単位または他のいくつかのより小さい用量単位の形態での単回投与、およびまた特定の間隔に再分した用量の複数回投与の両方によって実施することができる。別法として、用量は長期にわたる持続輸注で与えることができる。

本発明の抗体ポリペプチドの診断使用の文脈において、「医薬として有効な量」、または「有効な量」または「診断上有効な」は、本明細書では、ｉｎ ｖｉｖｏ画像診断目的で検出可能なシグナルをもたらす量のことを指す。

本発明の抗体ポリペプチドは、使用する化合物の効能／毒性に応じて様々な濃度で製剤化することができる。製剤は、０．１μＭ〜１ｍＭ、１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭおよび約５００μＭの濃度でポリペプチドを含むことができる。

一般に、ヒト患者における抗体ポリペプチドの治療用量（治療部分の有無にかかわらず）は、１投与につき１００μｇ〜７００ｍｇになる（７０ｋｇの体重に基づく）。例えば、最大治療用量は、１投与につき０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇまたは１〜５ｍｇ／ｋｇもしくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇであってもよい。腫瘍学者／内科医の決定にしたがって、そのような用量を異なる間隔で投与できることはいうまでもなく；例えば、用量は、毎日、週２回、週１回、隔週または毎月投与することができる。

本発明の医薬組成物を、単独でもしくは前立腺癌の治療に使用される他の治療薬剤と併用して、または他の治療抗体、手術（例えば、根治的前立腺切除）、放射性核種療法、近接照射療法、外照射療法、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）、化学療法、経口化学療法薬、凍結手術（腫瘍を凍らせる）、ホルモン療法（抗アンドロゲン療法など）、去勢もしくは前述の組合せのような前立腺癌の治療の他の治療様式で患者を治療する前、後もしくは同時に投与できることは、当技術に熟達した者には認識されよう。

本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドまたは本発明の第６の態様に記載の医薬組成物を、本明細書の記載したのと同じ使用についての説明書と一緒に含むキットを提供する。

本発明の第８の態様は、医学に使用する本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドを提供する。

本発明の第９の態様は、前立腺癌の治療および／または診断に使用する本発明の第１の態様による抗体ポリペプチドを提供する。

本発明の第１０の態様は、対象における前立腺癌の治療の方法であって、対象に本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドを治療上有効な量で投与する工程を含む方法を提供する。

「治療」には、患者の治療的および予防的治療を含める。用語「予防的」は、薬剤もしくはその製剤の使用を包含するために使用され、本明細書に記載の通り、その薬剤は前立腺癌になる可能性、または患者もしくは対象における限局性前立腺癌の拡散、播種もしくは転移を予防するかもしくは減少させるかのいずれかである。用語「予防的」は、本明細書に記載の通り、以前に前立腺癌の治療を受けたことがある患者において前立腺癌の再発を予防するための薬剤、またはその製剤の使用も包含する。

本発明の第１１の態様は、対象における前立腺癌の診断の方法であって、対象に本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドを診断上有効な量で投与する工程を含む方法を提供する。

「診断」には、ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち患者の体内）またはｅｘ ｖｉｖｏ（すなわち患者の身体から摘出した組織または細胞サンプル内）のいずれかにおける前立腺癌細胞の検出を含める。

治療もしくは診断しようとする前立腺癌は、前立腺に限局していることができ、または非限局性（すなわち、播種性）前立腺癌であってもよい。前立腺に限局している前立腺癌は、例えば、ＴＮＭシステム（腫瘍／リンパ節／転移で略記される）にしたがって臨床的Ｔ１またはＴ２癌と分類できるが、非限局性／播種性前立腺癌は、例えば、臨床的Ｔ３またはＴ４癌と分類できる。

治療または診断しようとする前立腺癌は、転移性前立腺癌であってもよい。転移とは、元の位置から体内の他の部位への癌の拡散のことを指す。例えば、治療または診断しようとする転移性前立腺癌は、リンパ系；骨（脊椎、椎骨、骨盤、肋骨を含む）に存在する転移；骨盤、直腸、膀胱、もしくは尿道内転移である。他の一般的でない位置に存在する転移も、本発明により治療することができる。転移は、微小転移巣であってもよい。微小転移巣とは、新しく形成された腫瘍が一般に小さすぎて検出できない、または検出が困難である転移の形態である。例えば、そのような細胞または塊の存在が診断不能であるが存在している、例えばごく微量の播種性疾患であるとしても、本発明は、当業者に単一癌細胞もしくは細胞塊を治療する手段を提供する。

したがって、前立腺癌の先行技術の治療と比較して、本発明によって提供される治療の特に重要な技術的長所は、播種性および／または転移性（微小転移を含めた）前立腺癌の治療における効能の増強であると予想される。

したがって、一実施形態において、本発明は、原発性前立腺腫瘍の転移を予防または治療するための抗体ポリペプチドおよび方法を提供する。

前立腺癌は５０歳を超えた男性、より一般には６０、６５または７０を超えた男性において発症する傾向があり、男性において最も多い型の癌の１つであるが、多くの人は病徴が全く無く、療法を受けず、最終的に他の原因で亡くなる。これは、前立腺の癌がほとんどの場合で成長が遅く、症状がないためであり、症状がある男性は老年なので、彼らは、心臓／循環器病、肺炎、他の無関係の癌または老齢のような前立腺癌とは無関係な原因でしばしば死亡する。前立腺癌の症例の約２／３は成長が遅く、他の１／３はより悪性であり、速く発達する。

したがって、特に若年患者において、より悪性であり、速く発達する形態の癌の管理には、前立腺癌の治療および診断のための有効な方法の開発が特に重要である。したがって、一実施形態において、本発明は、前立腺癌の診断時および／または治療時に９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０歳未満、またはより若い患者の前立腺癌の治療もしくは診断に関する。

前立腺癌である一親等の親族（父親または兄弟）が一人いる男性は、前立腺癌を発症する危険性が２倍であると考えられ、罹患した一親等の親族が２人では、家族の既往なしの男性と比較して５倍大きな危険性があると考えられる。したがって、本発明は、１人、２人、もしくはより多くの親族、特に一親等親族（父親または兄弟など）が前立腺癌であると以前に診断されたことを特徴とする患者の前立腺癌の治療または診断に関することができる。

本発明は、患者の前立腺癌の治療または診断にも関し、治療しようとする前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である。ＣＲＰＣは、１〜３年後にホルモン治療に対して一般に不能性になり、ホルモン療法にもかかわらず成長を再開することによって特徴づけることができる。

本発明の医学的な使用および方法において、一般に抗体ポリペプチドは、患者の身体に注射または注入される。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、次いで抗体ポリペプチドは、標的抗原、ｈＫ２を産生する組織；第一に、前立腺癌細胞およびその転移に結合する。結合と同時に、抗体ポリペプチドは、治療効果を直接及ぼすことができる（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣによってまたは放射性同位元素もしくは他の細胞障害性部分を運ぶことによって細胞死を誘導する）。別法として、結合した抗体ポリペプチドは、診断（画像診断）手段としての機能を果たすことができ、療法の選択肢を導くまたは癌細胞の外科的除去を補助することができる。

本発明の抗体ポリペプチドを、外放射線療法、手術、細胞増殖抑止剤ならびにアンドロゲン治療など他の治療および／または診断薬剤／治療と併用して使用できることは当技術に熟達した者には認識されよう。

前述の説明は、前立腺癌の治療および診断の方法に適用できる本発明の実施形態に重点を置く。しかしながら、本発明が、そのような適用に限定されておらず、術後検査、ならびに放射線、細胞増殖抑止剤およびアンドロゲン治療の間またはその後の検査に有用であることはいうまでもない。

別の実施形態において、放射線ガイド下手術（ＲＧＳ）または画像ガイド下手術（ＩＧＳ）を使用して、手術の間および／またはその前に本発明のトレーサ標識抗体ポリペプチドを同定することができる。したがって、前述の検出可能な部分を含む抗体ポリペプチドを、手術の間および／またはその前に投与することができる。この実施形態において、抗体ポリペプチドは、最初に注入できる。その後、ＲＧＳ／ＩＧＳを使用して、手術の間またはその前に検出可能な部分に感度が高い検出器具でｈＫ２産生組織を同定することができる。検出可能な部分は、例えば、放射線放射または磁気感度が高い検出可能な部分であってもよく；例えば、チェレンコフ放射の放射体および／または制御放射であってもよく；蛍光標識および／または磁気もしくは磁化可能な標識であってもよい。したがって、本発明によるＲＧＳ／ＩＧＳは、例えば、光学、チェレンコフ、制御放射もしくはβ線の検出；放射性核種標識の検出に基づく方法であってもよく、および／または磁力測定を含んでいてもよい。ＲＧＳは、外科医が検出可能な部分によって「マークされた」組織を同定することが可能になる手術技術として、当技術に熟達した者に周知である。

上記の方法によって得られる可視化は、ＳＰＥＣＴ／ＰＥＴ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波（ＵＳ）および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）など他の放射線可視化方法と組み合わせることができる。

したがって、さらなる態様において、本発明は、放射線ガイド下または画像ガイド下手術などの手術の前または間に、前立腺癌である患者への投与によって医学に使用する抗体ポリペプチドも提供する。

本発明のなおさらなる態様は、対象の血液における前立腺腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法であって：
（ａ）試験する対象から血液のサンプルを得る工程と；
（ｂ）場合により、血液サンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程と；
（ｃ）本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドを、血液サンプル中に存在する細胞と接触させる工程と；
（ｄ）抗体ポリペプチドが遊離（すなわち複合体形成していない）ｈＫ２に結合するかどうか（直接または間接的に）決定する工程と
を含み、遊離ｈＫ２に対する抗体ポリペプチドの結合が、対象の血液における前立腺腫瘍細胞の存在を示す、方法を提供する。

したがって、本方法は、血液サンプルが遊離ｈＫ２を含有するかどうか決定するアッセイを実施する工程と；遊離ｈＫ２の存在が対象の血液における前立腺腫瘍細胞の存在を示す工程とを含む。

当技術に熟達した者は、そのようなアッセイを実行する多くの方法があることを理解しよう。例えば、免疫測定法は、均一または、より好ましくは、不均一のいずれかであってもよい。アッセイは、競合的または、より好ましくは、非競合的な形式のいずれかでも実行できる。

不均一な、非競合的アッセイの場合に、典型的な手順は：
（ａ）試験する対象から血液のサンプルを得る工程と；
（ｂ）場合により、血液サンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程と；
（ｃ）本発明の第１の態様に記載の固相固定化抗体ポリペプチドを、血液サンプル中に存在する細胞と接触させる工程と；
（ｄ）洗浄して可溶性成分（固体表面に結合していない）を除去する工程と；
（ｅ）トレーサ、すなわち、レポータ分子／粒子で標識した別の抗ｈＫ２特異的抗体を添加する工程と；
（ｆ）洗浄して結合していないトレーサ抗体を除去する工程と；
（ｇ）トレーサ抗体からのシグナルを検出する工程と
であってもよい。

工程ｂとｃまたはｃとｄの間に、細胞に可溶性ｈＫ２を産生させ、次いでそれを検出することを可能にするためのインキュベーション時間が一般にあるべきである。

本発明の追加の態様は、対象の組織における前立腺腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法であって、
（ａ）試験する対象から組織のサンプル（組織学的なサンプルのような）を得る工程と；
（ｂ）場合により、組織サンプル中に存在する細胞を抽出および／または精製する工程と；
（ｃ）本発明の第１の態様に記載の抗体ポリペプチドを、組織サンプル中に存在する細胞と接触させる工程と；
（ｄ）抗体ポリペプチドが遊離（すなわち複合体形成していない）ｈＫ２に結合するかどうか（直接または間接的に）決定する工程と
を含み、遊離ｈＫ２に対する抗体ポリペプチドの結合が、対象の組織における前立腺腫瘍細胞の存在を示す、方法を提供する。

上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の一実施形態において、工程（ｄ）はＥＬＩＳＡによって実行される。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体抗原相互作用を検出するのに適切な任意のアッセイを使用することができる。

追加の実施形態において、本方法は、サンプルにおける前立腺腫瘍細胞を定量する工程をさらに含む。

上記ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法のさらなる実施形態において、本方法は対象における前立腺癌を診断するためのものである。

単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、請求項および／もしくは明細書において用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」と一緒に使用される場合、「１つ」を意味することができるが、「１つまたはそれ以上の」、「少なくとも１つ」ならびに「１つより１つまたはそれ以上の」の意味とも一致する。

上記の説明ならびに添付の図面と一緒に考えると、これらのおよび他の、本発明の実施形態はよりよく認識され、理解されることになる。しかしながら、上記の説明は、本発明の様々な実施形態ならびにその特定の詳細を多数示すが、実例として与えられるものであり、制限するものではないことは理解されたい。多くの置換、修飾、追加および／または再構成を、本発明の精神を逸脱することなくその範囲内で作ることができ、本発明は、そのような置換、修飾、追加および／または再構成のすべてを含む。

以下の図面は本明細書の部分を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含める。本発明は、これらの図面の１つまたはそれ以上を本明細書に存在する特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解することができる。

本発明の典型的なヒト化１１Ｂ６ Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖可変領域の配列を示す図である。 マウスならびにヒト化１１Ｂ６抗体の未変性および還元サンプルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。 チップ上のｈＫ２に対する１１Ｂ６試験抗体の結合の結合段階を示す図である。 １１Ｂ６試験抗体の解離段階を示す図である。 ^１７７Ｌｕ標識ヒト化１１Ｂ６抗体の体内分布を示す図である。 マウスの前立腺腫瘍に対する^１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６の結合を示す典型的なＳＰＥＣＴ画像を示す図である。 腫瘍および骨における^１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６ならびにｍ１１Ｂ６の取り込み率を示す図である。 ^１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６およびｍ１１Ｂ６のグラム当たりの取り込み率の腫瘍対骨の比を示す図である。 ヒト化１１Ｂ６抗体の速度論を示す図である。 マウス１１Ｂ６抗体の速度論を示す図である。 血液からの^１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６およびｍ１１Ｂ６のクリアランスを示す図である。 ^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６による治療の前（上の画像）および後（下の画像）の腫瘍サイズの代表写真である。 ＬＮＣａＰ異種移植における腫瘍サイズに対する^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６の単一放射活性量「Ｄ」を示す図である。 ＬＮＣａＰ異種移植における腫瘍サイズに対する^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６の二重放射活性量「２ｘＤ」を示す図である。 ＬＮＣａＰ異種移植における腫瘍サイズに対する対照治療の効果の概要を示す図である。 単一用量^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６で治療した１匹のＬＮＣａＰ異種移植マウスの（ａ）腫瘍成長データおよび（ｂ）ＳＰＥＣＴ画像を示す図である。 本発明による^１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６抗体を与えた動物の注射後の日数に応じた腫瘍容積を示す図である。治療は、０日目に投与した。以下の出来事：大きい腫瘍容積（直径＞１４ｍｍ）；大きい重量減少（最初の重量と比較して重量減少＞１５％）；一般的な症状に悪影響を及した；またはこれらの３つの指標のすべての組合せが生じた場合、動物を終了させた。（右の数は、各動物のＩＤ番号である） ^１７７Ｌｕ標識非特異的ＩｇＧ「アイソタイプ対照」抗体を与えた動物の注射後の日数に応じた腫瘍容積を示す図である。治療は、０日目に投与した。以下の出来事：大きい腫瘍容積（直径＞１４ｍｍ）；大きい重量減少（最初の重量と比較して重量減少＞１５％）；一般的な症状に悪影響を及した；またはこれらの３つの指標のすべての組合せが生じた場合、動物を終了させた。（右の数は、各動物のＩＤ番号である） ＮａＣｌだけを与えた動物の注射後の日数に応じた腫瘍容積を示す図である。治療は、０日目に投与した。以下の出来事：大きい腫瘍容積（直径＞１４ｍｍ）；大きい重量減少（最初の重量と比較して重量減少＞１５％）；一般的な症状に悪影響を及した；またはこれらの３つの指標のすべての組合せが生じた場合、動物を終了させた。（右の数は、各動物のＩＤ番号である） 図１４に示した３つの処理群のカプランマイアー曲線を示す図である。実線：^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６；破線：１７７Ｌｕ標識非特異的ＩｇＧ「アイソタイプ対照」抗体；点線：ＮａＣｌ。

本発明の特定の実施形態を実証するために以下の実施例を含める。後に続く実施例において開示される技術は、本発明者によって発見された技術が本発明の実践においてよく機能することを表し、したがって、その実践のための特定の様式を構成すると見なせることを、当業者は認識するべきである。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を作り、同様のまたは類似の結果をさらに得られることを、本開示を考慮して当業者は認識するべきである。

ハイブリドーマ細胞系からの１１Ｂ６のクローニング
試薬
モノクローナル抗体１１Ｂ６産生ハイブリドーマ細胞系を使用して、ｍＲＮＡ抽出および抗体産生行い、タンパク質配列決定のためにさらに親和性精製した（Ｖａｉｓａｎｅｎら、２００４年）。

制限酵素、ＦａｓｔＡＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから、プライマーは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＷＯ２５２）およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。ＤＮＡ精製は、Ｑｉａｇｅｎのゲル抽出およびＰＣＲ精製キットで行った。

ｍＲＮＡ摘出およびｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１１Ｂ６ ＭＡｂ産生ハイブリドーマ細胞（５Ｅ６細胞）から抽出し、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成を、説明書にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＨｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ａｒｃｈｉｖｅキットで行った。

ｃＤＮＡからの抗体遺伝子の増幅
精製した１１Ｂ６ ＭＡｂの重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）のＮ末端配列を、ヘルシンキ大学のタンパク質配列決定サービスでエドマン分解によって決定した。軽鎖配列は、ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳ［配列番号１６］、重鎖配列は、ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧ［配列番号１７］であった。アミノ酸のＩＭＧＴデータベース比較により、遺伝子：ＩＧＫＶ３およびＩＧＨＶ３をそれぞれ同定した。フォワードＰＣＲプライマー（縮重）の相補領域を、Ｎ末端アミノ酸をコードしているＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって見出した）に基づいて設計した。重鎖をクローニングするために使用したリバースプライマーは、Ｃ_Ｈ１に結合するように設計した。軽鎖の場合、２つのリバースプライマーを使用し；第１のＰＣＲに使用した方は、Ｃ_Ｌに結合し、第２のＰＣＲに使用したもう一方は、Ｖ_ＬとＣ_Ｌの境界に結合する。すべてのプライマーは、クローニングに必要な制限酵素認識部位も含有していた（後に下線を施した）。

軽鎖フォワードプライマーは、ＳｆｉＩ＿ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳ［配列番号１６］：
（５’−ＴＴＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＹＡＴＨＧＴＲＹＴＶＡＣＮＣＡＲＴＣＴＣＣ−３’；［配列番号１８］）
であり、リバースプライマーは、ＷＯ２５２
（５’−ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３’、ＸｂａＩ；［配列番号１９］）
およびＣｐｏＩ＿ＪＫ２
（５’−ＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＴ−３’；［配列番号２０］）
であった。

重鎖フォワードプライマーは、ＮｏｔＩ＿ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧ［配列番号１７］
（５’−ＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＹＧＴＶＣＡＲＣＴＫＣＡＧＧＡＧＴＣＤＧＧ−３’；［配列番号２１］）
であり、リバースプライマーはａｓＣＨ１＿ＳａｃＩ
（５’−ＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣ−３’；［配列番号２２］）。
であった。

Ｖ_Ｌ＋Ｃ_Ｌフラグメントを、鋳型であるｃＤＮＡ １００ｎｇ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭプライマー ＳｆｉＩ ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳ［配列番号１６］およびＷＯ２５２、１ｘＰｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液ならびに０．６Ｕ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を含有するＰＣＲ反応で増幅した。増幅は、９８℃３０秒間、３０サイクルの９８℃ ７秒間、５０℃ ２０秒間、７２℃ ２０秒間、および最終的な伸張７２℃ １０分間の手順によって行った。ＰＣＲ産物を配列決定し、Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌ境界の配列を解明した後、実際のクローニングのためのＰＣＲを、Ｖ_Ｌ部分だけをクローニングするためのプライマーＳｆｉＩ＿ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳ［配列番号１６］およびＣｐｏＩ＿ＪＫ２以外は上記と同様な反応でｃＤＮＡから再び行った。増幅は、９８℃３０秒間、１０サイクルの９８℃ ７秒間、６０℃ ２０秒間、７２℃ ２０秒間、２５サイクルの９８°Ｃ ７秒間、５６℃ ２０秒間、７２℃ ２０秒間、および最終的な伸張７２℃ １０分間の手順によって行った。

Ｖ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１フラグメントを、プライマーＮｏｔＩ＿ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧ［配列番号１７］およびＣＨ１＿ＳａｃＩ以外はＶ_Ｌと同様の反応で増幅した。増幅手順は、９８℃３０秒間、３０サイクルの９８°Ｃ ７秒間、６４℃ ２０秒間、７２℃ ２０秒間、および最終的な伸張７２℃ １０分間であった。

クローニング
正しいサイズの産物を、分取アガロースゲルから精製した。Ｖ_Ｌを、ＳｆｉＩおよびＣｐｏＩで、Ｖ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１をＳａｃＩおよびＮｏｔＩで消化した。レシピエントベクターｐＡＫ４００ ５４０４ＦＡｂ ｌｃｈ（ｐＡＫ４００から修飾した、Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７年）を、両方の酵素の組合せで別々に消化し、フラグメントをＦａｓｔＡＰで脱リン酸化し、分取ゲルから精製した。

消化した１１Ｂ６ Ｖ_Ｌおよび対応するベクターフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にエレクトロポレーションによって形質転換して、ベクターｐＡＫ４００−１１Ｂ６−ＶＬを作製した。ＳａｃＩ＋ＮｏｔＩ消化したＶ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１およびベクターフラグメントのライゲーション産物を、ｐＡＫ４００−１１Ｂ６−ＶＨ＋ＣＨ１と名付けた。正しいクローンをＤＮＡ配列決定によって確認し、配列を起源タンパク質配列およびデータベース（ＢＬＡＳＴ探索）で見つかる抗体と比較した。

完全な１１Ｂ６ Ｆａｂを構築するために、以前に作られた構築物の両方を、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化した。ベクターｐＡＫ４００−１１Ｂ６−ＶＬを、ベクターｐＡＫ４００−１１Ｂ６−ＶＨ＋ＣＨ１由来Ｖ_Ｈ＋Ｃ_Ｈ１を挿入するレシピエントベクターとして使用した。ライゲーションおよび形質転換を、上記のように行った。構築したｐＡＫ４００ １１Ｂ６ ＦＡｂ ｌｃｈベクターを、制限酵素分析で確認した。

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１１Ｂ６抗体のヒト化
マウス抗ｈＫ２抗体１１Ｂ６の可変ドメインを、ＣＤＲ移植法を使用してヒト化した。この手法において、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、可変重鎖および軽鎖ドメインフレームワークに移植した。ＣＤＲ領域の残基に加えて、フレームワーク領域の特定の重要な位置にある残基を、ヒト様に変えるのではなくマウス様として保持して、移植したＣＤＲループのコンフォメーションがマウス親抗体におけるそのコンフォメーションと可能な限り類似するように維持した。

この説明の全体を通じてＫａｂａｔナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔら、１９９１年）を使用した。

相同性モデリング
マウス１１Ｂ６抗体の相同性モデルを、自動Ｗｅｂ抗体モデリングサーバ（ＶＡＭ；ｈｔｔｐ：／／ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して生成した。モデルを使用して、マウス親抗体と、可変ドメインのヒト化のフレームワークとして使用したヒト免疫グロブリン配列との間で異なる残基の重要性を目で見て検討することによりそれぞれ評価した。

１１Ｂ６ヒト化Ｖ−ドメイン配列の設計
Ｖ_Ｌドメイン設計
マウス１１Ｂ６軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷ配列整列化プログラムを使用して、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列のデータベースと比較した。１１Ｂ６ Ｖ_Ｌは、ヒトＶ_κ４ファミリーの唯一のメンバーであるヒト生殖細胞遺伝子Ｂ３（ＩＧＫＶ４−１＊０１）と最も高い類似性を共有することが判明した。可変ドメイン配列のＣ末端部をコードしているＪ−区分に関しては、ヒトＪ_κ２が、マウス１１Ｂ６の対応する領域と最も類似していることが判明した。

ＩＧＫＪ２の配列と一緒にヒトＢ３遺伝子をフレームワークとして使用して、マウス親抗体１１Ｂ６の軽鎖からＣＤＲループを移植した（図１）。マウス起源の残基（ロイシン）を、ヒト様のメチオニンの代わりにＶ_Ｌの４位に導入した。このバーニヤ帯（Vernier zone）（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２年）残基は、軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ループの真下に位置する。ＣＤＲ−Ｌ２の５４位で、ヒト様アルギニンを、マウス様バリンの代わりに使用した。モデリングによると、この位置にある残基は、抗原と直接的な相互作用を形成しないと思われるが、Ａｒｇ５４は、ヒトフレームワークの６０位で負に荷電したアスパラギン酸と塩橋を形成するようであった。ＣＤＲ−Ｌ１の２４位にある残基は、抗原接触に関係しないと考えられた。結果的に、ヒト様リジンを、マウス様アルギニンの代わりにこの位置に導入した。

Ｖ_Ｈドメイン設計
マウス１１Ｂ６重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのＣｌｕｓｔａｌＷ配列整列化プログラムを使用して、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系配列のデータベースと比較した。１１Ｂ６ Ｖ_Ｈは、ヒトＶ_Ｈ４ファミリーメンバーＶＨ４−２８と最も高い類似性を有することが判明した。可変ドメイン配列のＣ末端部をコードしているＪ−区分に関しては、ヒトＪ_Ｈ１が、マウス１１Ｂ６の対応する領域と最も類似していることが判明した。

Ｊ_Ｈ１の配列と一緒にヒトＶＨ４−２８遺伝子をフレームワークとして使用して、マウス親抗体１１Ｂ６の重鎖からＣＤＲループを移植した（図１）。

マウス様残基アスパラギンおよびトレオニンを、Ｖ_Ｈの２７および３０位にそれぞれ導入した。Ｋａｂａｔ定義（Ｋａｂａｔら、１９９１年；図１）によるＣＤＲ−Ｈ１に属さないにもかかわらず、それらは、Ｃｈｏｔｈｉａ（１９８９年）による定義など他の何らかのＣＤＲ定義手順によりＣＤＲ残基に分類された。残基２７および３０は、ＣＤＲ−Ｈ１の他の部分の構造に影響を及ぼすことができ、抗原との直接接触に関与する可能性があった。７１位にある残基は、ＣＤＲ−Ｈ２のコンフォメーションの維持に重要な役割を果たすことが公知であり（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、１９９０年）、マウス様アルギニンを、ヒト様バリンの代わりにここで使用した。重要なＣＤＲ−Ｈ３ループの前の９４位で、マウス１１Ｂ６由来残基のトレオニンを、ヒトＶＨ４−２８様アルギニンの代わりに導入した。加えて、ＣＤＲ−Ｈ２の６０位にある残基は、抗原接触に関係しないと考えられた。したがって、ヒト様アスパラギンを、マウス様セリンの代わりにこの位置に導入した。

設計したＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインが、ヒトＣ_Ｈ１ならびにヒトＣ_κ定常ドメインにそれぞれ繋がれているＦａｂフラグメントであるヒト化１１Ｂ６をコードする遺伝子を、合成構築物として購入した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＵＳ）。遺伝子を、Ｆａｂカセットのいずれの側にも認識部位を有するＳｆｉＩ制限酵素を使用して、ｐＡＫ４００（Ｋｒｅｂｂｅｒら、１９９７年）から修飾した発現ベクターｐＡＫ４００Ｆａｂにクローニングした。ベクターを、大腸菌ＸＬ−１ ｂｌｕｅ細胞に形質転換して、ヒト化Ｆａｂフラグメントを発現させた。

本発明の典型的なヒト化１１Ｂ６ Ｆａｂフラグメントの重鎖および軽鎖可変領域の配列を、図１に示す。

参照文献
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ｈ１１Ｂ６の発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に２Ｌの懸濁培養に展開した。細胞密度は、トランスフェクションの日に１×１０^６個細胞／ｍＬであった。

重鎖または軽鎖成分をコードするヌクレオチド配列（すなわちそれぞれ配列番号１４および１５）を、哺乳動物細胞における発現のためにコドンを最適化し、合成し、ＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列を含有するプラスミドＤＮＡ（発現ベクター）を、次いでトランスフェクション薬剤と混合し、ＲＴで１０分間インキュベートした。ＤＮＡ−トランスフェクション薬剤混合物を、ゆっくりとフラスコをかきまわしながら、細胞培養にゆっくりと添加した。次いでトランスフェクトした細胞培養を、およそ１３５ｒｐｍで回転させているオービタルシェイカープラットフォーム上で、３７℃、８％ＣＯ_２で７日間インキュベートした。

培地を遠心分離によって回収し、５μｍ、０．６μｍおよび０．２２μｍフィルターシステムで濾過した。

抗体を、プロテインＧクロマトグラフィーによって精製し、緩衝液を、透析によってＰＢＳ ｐＨ７．４と交換し；その後抗体を、限外濾過によって濃縮した。

濃度を、吸光度によって測定した。
ＤＮＡ：軽鎖：ｐ１１Ｂ６ＶＬｈＶ１ｈｋ（４３００ｂｐ）量：０．３５ｍｇ
重鎖：ｐ１１Ｂ６ＶＨｈＶ１ｈＩｇＧ１（４９００ｂｐ）量：０．６ｍｇ

ＤＮＡ量は、最適化しなかった。

トランスフェクション薬剤：独占所有権がある［しかしながら、適切な市販のトランスフェクション薬剤、Ｘｆｅｃｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミンおよびリン酸カルシウムなどをすぐに入手できる］。

全収率：１３．１ｍｇ（約６．５ｍｇ／Ｌ）

ｈ１１Ｂ６の特徴付け：親和性
研究の目的
本研究の目的は、Ｂｉａｃｏｒｅ器械で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用することにより、抗体１１Ｂ６の４つのバリアントと抗原ｈＫ２との結合速度論を精査することであった。

タンパク質サンプル（抗体および抗原）の品質を精査するために、ＳＰＲ実験の前にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。

本研究の実験に適切な条件を見つけるために、予備研究において異なる指標を精査した。

本研究において、多重結合測定を、４つの抗体および抗原について実行した。収集したデータから、結合および解離速度定数（ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ）ならびに解離定数（ＫＤ）を算出し、ここに報告した。

試薬および器械情報
以下の４つの抗体および１つの抗原の溶液を、Ｄｉａｐｒｏｓｔ ＡＢから得た：
・ｍ１１Ｂ６ストック：ａ−ｅｈｋ２１１Ｂ６ １４．１２０１３ ＰＰ、３．４１ｍｇ／ｍＬ：０．９％ ＮａＣｌ、１００μＬ
・ｈ１１Ｂ６ストック：Ｉｎｎｏｖａｇｅｎロット９０４７６．３０ ２０１３−０４−１２、１ｍｇ／ｍＬ：ＰＢＳ ｐＨ７．４、３２０μＬ
・ｈ１１Ｂ６−ＤＴＰＡストック：０．２Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、０．９ｍｇ／ｍＬ、３４０μＬ
・ｈ１１Ｂ６−ＤＦＯストック：０．２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ ５．５、１．６ｍｇ／ｍＬ中に５ｍｇ／ｍＬゲンチシン酸、４００μＬ
・ｈＫ２ストック：２６．６μｇ／ｍＬ ｆｒａｋｔ ２ ｆｒ ７ ＳＬ＋タンパク質ｉｎｈ ５／２−０２ １％ ＢＳＡ

すべてのサンプルを分注し、分析の前に−２０℃冷凍庫に保った。

すべての結合実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００器械で、ＣＭ４チップ上で実行した。チップならびに活性化、固定化、不活性化、結合および再生に必要なすべての試薬を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入し、製造者のガイドラインにしたがって使用した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ａ）実験の説明
Ｄｉａｐｒｏｓｔ ＡＢによって提供される試薬を、製造者のガイドラインにしたがってＮｏｖｅｘ製ＴＲＩＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅ １０〜２０％アクリルアミドゲルに流した。

未変性のおよび還元した２系列のタンパク質サンプルを、標準サンプルと一緒に同じゲルに同時に流した。

未変性系列の各サンプルは、以下を含有していた：タンパク質１〜１．３μｇ、トリス緩衝液ｐＨ８．８、ＳＤＳおよびローディング緩衝液。

還元系列の各サンプルは、以下を含有していた：タンパク質１〜１．３μｇ、トリス緩衝液ｐＨ８．８、ＳＤＳ、ローディング緩衝液および０．０４％体積／体積 β２−メルカプトエタノール（還元薬剤）。

ゲルの染色を、０．７、３．０、６．３に対応する割合の酢酸、エタノールおよび水のクマシーブリリアントブルー溶液で実行した。

ゲルの脱色を、０．７、３．０、６．３に対応する割合の酢酸、エタノールおよび水の溶液で実行した。

（ｂ）結果および結論
結果を、図２に示す。

抗体ならびに抗原サンプルが、高い品質および純度であることが、これらの結果から明白であった。

親和性研究
（ａ）ＣＭ４チップへの抗原の固定化
ＣＭ４−２チップの活性化を、ＥＤＣおよびＮＨＳ混合物を使用するアミンカップリングの製造者のガイドラインにしたがって実行した。

２．９６μｇ／ｍＬ抗原ｈＫ２（１０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液ｐＨ３．８に希釈したｈＫ２のストック溶液）を含有する溶液をＣＭ４−２チップのチャネルｆｃ２〜４上に流して、チップに抗原を固定した。流速：５μＬ／分、容積：２００μＬ。
標的Ｒｕ≦Ｍ_Ｗ／１０ Ｍ_Ｗ（ｈｋ２）＝２５９００Ｄａ 標的Ｒｕ（ｈｋ２）≦２５９０

チャネルｆｃ１を、ブランクとして使用した。

以下の固定化を達成した：
ｆｃ２＝１１０４ＲＵ ｆｃ３＝７３１ＲＵ ｆｃ４＝６８８ＲＵ

活性化および固定化後にすべてのチャネル（ｆｃ１〜４）を、エタノールアミンでブロッキングした。

これらのデータは、２．９６μｇ／ｍＬの抗原を使用して適切な固定化が達成されたことを実証した。

（ｂ）結合段階の精査
異なる５つの濃度の各抗体溶液（ＨＳＰ−緩衝液に希釈したストック溶液）を、３０μＬ／分の速度でＣＭ４−２チップのチャネルｆｃ２〜４上に流した場合、ＣＭ４−２チップに対する４つの抗体の結合段階を４〜５分間追跡した。

各抗体について精査した濃度は：１００、５０、２５、１２．５および６．２５ｎＭであった。

加えて、解離過程を４８０分間追跡した場合、結合データを実験から得た。

全部で、各抗体について１８回の個別の結合実験を実行した。

ブランク、ｆｃ１からのシグナルを、すべてのデータについて減算した。

異なる５つの濃度の抗体のそれぞれについて、ＣＭ−２チップのチャネルｆｃ２における結合段階を図３に示した。

４〜５分後、結合過程のデータにフィッティングできることが判明した。

（ｃ）解離段階の精査
ＣＭ４−２チップのチャネルｆｃ２〜４上に５０ｎＭ抗体溶液を３０μＬ／分の速度で５分間流した後に、解離段階を抗体のそれぞれについて４８０分間追跡した（図４）。

解離速度定数の算出に使用したすべてのデータにおいて、ブランク、ｆｃ１からのシグナルを減算した。

データは、解離過程が非常に遅いことを示した。４つすべての抗体について、チャネルｆｃ４のシグナルはドリフトしており、そのチャネルにおいて解離過程を追跡できなかった。

（ｄ）解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）の推定
解離段階データをフィッティングし、解離速度定数（ｋｏｆｆ）を推定した（表２を参照のこと）。

各抗体について取得した２つの測定に基づくと、試験した抗体の解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）間に有意差がないように見えた。

（ｅ）結合速度定数（ｋ_ｏｎ）の推定
結合速度定数を推定するために、解離速度定数（表２）を、フィッティングした方程式に使用した。

フィッティングしたすべてのデータを使用して、結合速度定数の平均値および各抗体の標準偏差を算出した（表３を参照のこと）。

各抗体について取得した１５〜１８回の測定に基づくと、試験した抗体の結合速度定数（ｋ_ｏｎ）間に有意差がないように見えた。

（ｆ）解離定数（ｋ_Ｄ）の推定
試験した抗体のそれぞれの解離定数（Ｋ_Ｄ）を、表４に示した。

解離定数（Ｋ_Ｄ）は、４つすべての抗体について１０^−１２Ｍの範囲であった。

統計的に有意ではなかったが、ヒト化抗体に対する解離定数は、マウス親抗体のそれより高いように見えた。

Ｋ_Ｄは、ｈ１１Ｂ６−ＤＴＰＡまたはｈ１１Ｂ６−ＤＦＯについて有意に変化しなかったので、ヒト化抗体のコンジュゲーションは、親和性に顕著に影響を及ぼさないように見えた。

概要
・結合過程は、４つすべての抗体について非常に速く、各抗体に対する１５〜１８回の実験に基づくと結合速度定数（ｋ_ｏｎ）は、すべて１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の範囲にあった。
・解離過程は、非常に遅く、ほとんど、Ｂｉａｃｏｒｅの技術的制限の範囲であった。解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）はすべて、各抗体についての２つの実験に基づいて１０^−５ｓ^−１の範囲であった。
・解離定数（Ｋ_Ｄ）は、４つすべての抗体について１０^−１２Ｍの範囲であった。

ｈ１１Ｂ６の特徴付け：凝集
概要
動的光散乱（ＤＬＳ）研究を、ＩｇＧの４つのバリアントで実施して、凝集の傾向を研究した。ＤＬＳの結果は、すべての構築物が合理的なサイズ（球状タンパク質と仮定して２００ｋＤａまたはわずかに２００ｋＤａを超える）を有し、ほとんどまたは全く凝集しないことを示した。

目的
動的光散乱を使用し、４つのＩｇＧ構築物をオリゴマー状態について特徴づけること。インスリンを対照として使用した。

結果
動的光散乱
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７．４）を、０．２２ミクロンフィルターによって濾過した。得られたタンパク質を、ＰＢＳ ｐＨ７．４中に０．１ｍｇ／ｍＬへ希釈した。動的光散乱は、Ｍａｌｖｅｒｎ ＡＰＳ機器を使用して２連のサンプルで、２０℃で測定した。各サンプルを３回測定した。希釈緩衝液を対照として使用して、緩衝液が塵および凝集体を合理的に含まないことを確認した（図１ｃ）。すべてのサンプルを、数分布関数を使用して確実に測定できた。最も豊富な分子種の平均半径を、分子種の多分散とともに算出した。この分子種の平均質量分布も算出した、表５を参照のこと。

インスリン対照（４ｍｇ／ｍＬ ２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ３ＥＤＴＡ）は、平均半径２．８ｎｍを有し、それは約３７ｋＤａであった。溶液中で、インスリンは、約３５ｋＤａの六量体を形成することが公知である。半径５．７ｎｍは、完全な球形を有するタンパク質の場合約２００ｋＤａの分子量に対応する。半径６．１ｎｍは、完全な球形を有するタンパク質の場合約２３０ｋＤａの分子量に対応する。これは、ＩｇＧ分子の１５０ｋＤａの分子量に相当に近く、このことは、大部分のサンプルが主に単量体および／または二量体ＩｇＧ分子からなることを意味する。二量体を除外しない理由は、光散乱が分子形状に基づいて大まかなサイズ推定値を与えるので、単量体と二量体を分離することは困難だが、単量体と大きな凝集体または単量体と六量体（インスリン場合のように）を分離することは容易だからである

結論
動的光散乱は、すべての構築物が合理的なサイズを有し、ほとんどまたはまったく凝集しないことを示した。４つすべての構築物のサイズ分布は、重複していた（データ不掲載）。

ｈ１１Ｂ６の特徴付け：ｉｎ ｖｉｖｏ体内分布
本研究は、^１７７Ｌｕに標識した場合の、マウス１１Ｂ６およびヒト１１Ｂ６のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布を比較した。

材料および方法
材料
^１７７Ｌｕを、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ ＢＶ、Ｐｅｔｔｅｎ、Ｈｏｌｌａｎｄから購入した。

すべての化学物質はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、緩衝液は（特に明記しない限り）分析品質水を使用して研究室内で調製した。

ヒトカリクレイン２に特異的なマウス親抗体ｍ１１Ｂ６を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄから入手した。

ｍ１１Ｂ６重鎖［配列番号２３］：
ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＮＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＲＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＴＹＳＰＳＬＫＳＲＦＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＴＹＦＣＡＴＧＹＹＹＧＳＧＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＳＡＡＱＴＮＳＭＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＥＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＰＳＳＰＲＰＳＥＴＶＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＶＰＲＤＣＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＮＴＮＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ

ｍ１１Ｂ６軽鎖［配列番号２４］：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＦＧＴＳＬＭＨＷＹＲＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＱＰＶＥＥＤＤＦＳＭＹＦＣＱＱＴＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ

ヒト化対応抗体（counterpart antibody）、ｈ１１Ｂ６を、上記実施例２および３に記載の通り産生した（図１を参照のこと）。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究の場合、ｈＫ２（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）およびＤＵ１４５（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を発現している前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰを使用した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清およびＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）で補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞を、加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（緩衝液に０．２５％トリプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ではがした。ＬＮＣａＰ細胞を異種移植する場合、ＢＤ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）製マトリゲルマトリックスを使用した。ＮＭＲＩ−Ｎｕ、（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）およびＢａｌｂ／ｃ−Ｎｕ（研究室内で繁殖させた）マウスに２つの細胞系を植え付けた。

コンジュゲーションおよび放射標識
ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡと１１Ｂ６とのコンジュゲーション：Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−２遠心濾過（２ｍＬ、１００Ｋ）で濃縮する前に、ＰＢＳ中のマウスおよびヒト化１１Ｂ６ ｍＡｂの溶液を、０．０７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ９．２に調整した。次いで、得られたタンパク質溶液を、キレート化剤対抗体の３：１のモル比で、キレート化剤ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｌｉｃｓ、ＵＳＡ）と４０℃でコンジュゲートさせた。４時間後に反応を停止させ、ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ−１１Ｂ６（ＤＴＰＡ−１１Ｂ６）をＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで遊離キレートから分離し、０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．５ ２０ｍＬで平衡化した。コンジュゲートした１１Ｂ６抗体を、酢酸アンモニウム緩衝液１ｍＬで溶出した。

ＤＴＰＡ−１１Ｂ６の放射標識：酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．５中のマウスおよびヒト化ＤＴＰＡ−１１Ｂ６を、所定量の^１７７ＬｕＣｌ_３と混合した。対象当たり０．５
〜０．６ＭＢｑの最終活性を体内分布に使用し、または対象当たり１８〜２０ＭＢｑの最終活性をＳＰＥＣＴ研究に使用した。室温で２時間のインキュベーション後に、標識を停止し、ＮＡＰ−５カラムで精製し、ＰＢＳで平衡化した。

動物実験
すべての動物実験は、実験動物保護に関する国の法令にしたがって実行した。

雄の免疫不全ヌードマウス、ＮＭＲＩ−Ｎｕ、（６〜８週齢）およびＢａｌｂ／ｃ−Ｎｕを、本研究に使用した。すべてのマウスは、左もしくは右横腹部にＬＮＣａＰ細胞またはＤＵ１４５、成長培地１００μＬおよびマトリゲル１００μＬ中に８００００００〜１０００００００個の細胞を異種移植された。

体内分布研究
体内分布研究を、ｈ１１Ｂ６およびｍ１１Ｂ６の両方で実行した。

６つのマウスの群（ｎ＝４）に、１７７Ｌｕで標識したｈ１１Ｂ６ ２０μｇまたはｍ１１Ｂ６ ２０μｇのいずれかを静脈内注射した。動物を、注射２４時間後、４８時間後および７２時間後に屠殺し、対象の臓器を３インチのＮａＩ（Ｔｌ）検出器を備えた自動化したＮａＩ（Ｔｌ）ウェル−カウンター（１４８０ ＷＩＺＡＲＤ、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で分析した。

１グラム組織当たりの注射した用量のパーセント（％ＩＡ／ｇ）で表す組織取り込み値を：
％ＩＡ／ｇ＝（組織放射活性／注射した放射活性）／臓器重量ｘ１００
として算出し、ここで、ｉｖ注射の場合：
注射した放射活性＝対照注射器における平均放射活性−使用した注射器における放射活性−尾部の放射活性
とした。

解剖後に臓器も計量した。

動力学的データ
時間−％ＩＤ曲線は、直線、ＩＤ（ｔ）＝ｋ＊ｔ＋ｍとして最長４８時間まで表した。第２および第３の時点（それぞれ４８、７２時間）のデータに基づいて、モノ指数曲線［ＩＤ（ｔ）＝ＩＤ（０）ｅ^−λｔ］を、時間間隔［４８、∞］に適用した。しかしながら、ラムダが負の数になる、すなわちＩＤが４８〜７２時間の間で増加している場合、この時間間隔の時間ＩＤ曲線は、代わりに直線としてモデル化され、医薬品は、臓器内に７２時間以降も保持されたと考えられた。時間活性曲線を得るために、物理的半減期を適用した。

注−いくつかの図において、ＩＤを「ＩＡ」と称し；これらの表現を、本明細書において互換的に使用した。

結果
ヒト化^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６の体内分布
^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６の体内分布を、図５に示した。

抗体は、２４時間までにＬＮＣａＰ腫瘍内に迅速に蓄積し、放射活性は７２時間で高いままであった。

最初に、高レベルのｈ１１Ｂ６が、血液および腎臓にあることも明白であり、抗体が身体から除かれるのにつれて４８時間後から減少した。そのような生物動力学は、任意の放射性標識した抗体の静注に必然的で、予想される結果であった。

骨および筋肉など他のすべての臓器は、低レベルの放射活性を示した。

これらのデータは、^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６が、ｉｎ ｖｉｖｏで前立腺癌細胞効果的に標的できることを実証した。

図６は、典型的なＳＰＥＣＴ画像を示し、異種移植したマウス内のＬＮＣａＰ腫瘍細胞に対する^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６の結合は、全く明白であった。

^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６は、予想外に良好な治療可能比を呈する
ヒト化^１７７Ｌｕ−１１Ｂ６の体内分布データとマウス親抗体（^１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６）のそれとの比較により、予想外の有利な差異がみられた。

図７に示すように、注射７２時間後に、ＬＮＣａＰ腫瘍への^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６の取り込みは、^１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６と比較して約２０％まで上昇した。これに伴い、注射７２時間後に、健康な骨への^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６の取り込みは、^１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６と比較して約４０％まで減少した。

図８は、注射２４、４８および７２時間後における腫瘍対健康な骨の抗体取り込みの比として表したデータを示す。７２時間まで、この比は、ヒト化１１Ｂ６抗体について著しく増加した。

線量測定算出
吸収線量の算出により、マウス１１Ｂ６親抗体の速度論と比較した本発明のヒト化抗体のそれにおける差異のより高度な尺度を得られた。

吸収線量を、ＭＩＲＤスキーマ（MIRD-schema）にしたがって算出し、

ここで、

は、供給源臓器における崩壊の総数であり、Ｓは、崩壊の単位当たりの吸収線量である（Ｂｏｌｃｈら、２００９年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：４７７〜４８４頁参照のこと、その開示を参照によって本明細書に組み入れる）。

を、時間放射活性曲線に対する時間積分として算出した。Ｓ因子は、Ｍｏｂｙ−ｐｈａｎｔｏｍを使用するマウス特異的モンテカルロシミュレーションに基づいた（Ｌａｒｓｓｏｎら、２０１１年、Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．５０：９７３〜９８０頁およびＫｅｅｎａｎら、２０１０年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：４７１〜４７６頁を参照のこと）。総吸収線量を得るために、すべての臓器を供給源だけでなく標的供給源と見なした。

異なる組織について算出した吸収線量値を、表６において示した。

表６から見られる通り、腫瘍吸収線量は、ｍ１１Ｂ６の１．２１Ｇｙ／ＭＢｑからｈ１１Ｂ６の２．２Ｇｙ／ＭＢｑに増加した、すなわち８０％増加した。腫瘍対骨髄の吸収線量の比が、ｍ１１Ｂ６の３．９からｈ１１Ｂ６の５．６まで約４０％増加した。本明細書において、ｍ１１Ｂ６と比較したｈ１１Ｂ６の治療効果の増強が示され、腫瘍に対するより高い吸収線量が、より少ない正常臓器毒性で得ることができることを示した。

血液からの抗体クリアランス
ヒト化およびマウス１１Ｂ６抗体の血中レベルの分析を、図１０に示した。

結果は、ｈ１１Ｂ６が、マウス１１Ｂ６抗体よりもわずかに速く血液から除去されることを示唆した。その場合、ヒト化抗体のそのようなクリアランス速度の増強は、安全性の観点からも治療に有用であり、より高い活性の投与を潜在的に可能とし得る。

クリアランス速度の増強は外部画像診断にも有益であり得る

結論
本研究の結果は、以下を実証した：
・ヒト化１１Ｂ６抗体、^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６は、ｉｎ ｖｉｖｏで前立腺腫瘍を効果的に標的する；
・ヒト化１１Ｂ６抗体は、そのマウス親抗体より予想外に良好な治療可能比を呈する（腫瘍における取り込み、対、健康な骨における取り込みの比で決定した）；および
・ヒト化１１Ｂ６抗体は、マウス１１Ｂ６抗体よりもわずかに速く血液から除去される。

まとめると、これらの所見は、前立腺癌の治療（および診断）におけるヒト化１１Ｂ６抗体の治療効果の増強の有力な証拠を提供した。

ヒト化およびマウス抗体は、同じ抗原（すなわち、ヒトカリクレイン２）に標的されるので、腫瘍対健康な骨髄の最新の比において算出された差異は、容易に予測または説明できない（特に、ヒト化抗体が、マウス親抗体と比較して標的ｈＫ２抗原に対してより低い親和性を呈するように見えると想定する場合；実施例４を参照のこと）。

ヒト化およびマウス１１Ｂ６抗体間の健康な骨と比較した腫瘍における相対的な取り込みの差異は、この比較が治療可能比の尺度を提供するので、かなり重要なものであった。より高い値のこの比（ヒト化１１Ｂ６抗体に対して明白であるように）は、より良好な治療抗体であること指標となった。特に、より高い治療可能比は、治療的に放射性標識したｈ１１Ｂ６をより高い吸収線量投与してより良好な治療効果を達成できることを意味した（健康な組織および臓器に対するヒト化抗体の結合が、マウス抗体のより非常に低いので）。より高い比は、診断目的の場合にｈ１１Ｂ６がマウス抗体より良好になることも示した（それは、より低い信号対雑音比と同義なので、転移を含めたより小さい腫瘍の画像診断を可能にする）。

結論として、データは、１１Ｂ６抗体のヒト化によって、前立腺癌治療における早期診断および予想外により高い治療効果の可能性が増すことを実証した。

診断および治療効果の実証
本研究の目的は、非常に有毒な放射性核種を前立腺癌の成長の部位に特異的に送達するための媒体として、ｈＫ２の触媒溝内部のエピトープを特異的に標的するｍＡｂである１１Ｂ６の実用性を確認することであった。概念研究のこの証明において、γ放射も利用する低エネルギーβ粒子である１７７Ｌｕでマウス１１Ｂ６親抗体を標識し、ＳＰＥＣＴ−画像診断を実行可能にした。

材料および方法
材料
^１７７Ｌｕを、Ｍａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ Ｍｅｄｉｃａｌ ＢＶ、Ｐｅｔｔｅｎ、Ｈｏｌｌａｎｄから購入した。Ｃｙｃｌｏｎｅ（商標） Ｓｔｏｒａｇｅ ＰｈｏｓｐｈｏｒシステムならびにＯｐｔｉＱｕａｎｔ（商標）画像分析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＩＴＬＣ（即時薄層クロマトグラフィー）小片（Ｂｉｏｄｅｘ、ＵＳ）の放射活性を測定し、それにより標識速度論および放射化学純度を決定した。すべての化学物質はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、緩衝液は、特に明記しない限り、分析品質水を使用して研究室内で調製した。ｍＡｂ １１Ｂ６は、抗原に対して約１．２ｎＭの親和性を持つヒトカリクレイン２に特異的な抗体である；図１参照のこと（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｒｋｕ 、Ｆｉｎｌａｎｄから入手した）。ｉｎ ｖｉｖｏ研究の場合、ｈＫ２（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を発現している前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰを使用した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清およびＰＥＳＴ（ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）で補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞を、加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（緩衝液に０．２５％トリプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ではがした。

コンジュゲーションおよび放射標識
ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡと１１Ｂ６とのコンジュゲーション：ＰＢＳ中のｍＡｂ １１Ｂ６溶液を、０．０７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ９．２に調整した。サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−２遠心濾過（２ｍＬ、１００Ｋ）で濃縮した。タンパク質溶液を、キレート化剤対抗体の３：１のモル比で、キレート化剤ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｌｉｃｓ、ＵＳＡ）と４０℃でコンジュゲートさせた。４時間後に反応を停止させ、ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ−１１Ｂ６、以後ＤＴＰＡ−１１Ｂ６と呼ぶ、をＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで遊離キレートから分離し、０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ５．５ ２０ｍＬで平衡化した。コンジュゲートした１１Ｂ６および５Ａ１０を、酢酸アンモニウム緩衝液１ｍＬで溶出した。

ＤＴＰＡ−１１Ｂ６の放射標識：酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ５．５中のＤＴＰＡ−１１Ｂ６を、所定量の^１７７ＬｕＣｌ_３と混合した。室温で２時間のインキュベーション後に、標識を停止し、ＮＡＰ−５カラムで精製し、ＰＢＳで平衡化した。標識効率および標識速度論をＩＴＬＣ小片でモニターし、０．２Ｍクエン酸で溶出した。この系において、遊離Ｌｕ−１７７は、溶媒の前の線と共に移動するが、放射性標識したコンジュゲートは元の線に残った。放射活性分布を、定量化ソフトウェアとして、Ｏｐｔｉｑｕａｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で決定した。

動物研究
すべての動物実験は、実験動物保護に関する国の法令にしたがって実行した。動物研究は、地域の動物調査倫理委員会に承認された。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｅｕｒｏｐｅ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入した雄の免疫不全ヌードマウス、ＮＭＲＩ、（６〜８週齢）を、本研究に使用した。

ｈＫ２を発現しているＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の異種移植を、注射当たり約１０＊１０^６個細胞で右側腹部および／または左側腹部に皮下移植した。

ＬＮＣａＰ腫瘍を発症した動物を、群に分け、治療薬剤１７７Ｌｕ−ＤＴＰ−１１Ｂ６または対照のいずれかで注射した、下記の表７を参照のこと：

含まれるすべての動物を、３〜４日間の間隔で連続的に測定し、計量した。

ＳＰＥＣＴを使用する治療薬剤の局在化の精査のために、最初に数匹の動物に、より低い活性（８ＭＢｑ）の^１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−１１Ｂ６を与えた。群８からの１匹のマウスも、ＳＰＥＣＴで研究した。これらの動物は、臓器を摘出し、３インチのＮａＩ（Ｔｌ）検出器付きの自動化したＮａＩ（Ｔｌ）ウェル−カウンター（１４８０ ＷＩＺＡＲＤ、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、これらの組織サンプルにおける放射活性を定量した。

骨髄に対する効果を研究するために、血サンプル（１０μＬ）を定期的に採取した。血液サンプルを、注射後８週間、週２回採集し、白血球数、赤血球数および血小板数をＭｅｄｏｎｉｃ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ−Ｖｅｔ ＣＡ５３０ Ｖｅｔ（Ｂｏｕｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）で分析した。採血時に、動物の重量および健康状態をモニターした。毒性は、体重減少、一般的な症状の低下、および血液学的毒性について動物をモニターすることにより評価した。

腫瘍容積を、測径器で測定した。長さｌ、およびｗならびに厚さｔを測定し、体積を算出した。

療法計画
９０Ｙおよび１７７Ｌｕによる放射免疫療法を受けたラットの骨髄に対する吸収線量と生物学的効果の関係［Ｌａｒｓｓｏｎら、２０１２年、Ｍｅｄ．Ｐｈｙｓ．３９（７）：４４３４〜４３頁を参照のこと］に基づいて、骨髄に対するＬＤ５０が、ほぼ１２Ｇｙ程度になることが推定できた。文献において、ラットおよびマウスの急性照射に対するＬＤ５０は、約９Ｇｙである［例えば、Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ、ＨａｌｌおよびＧｉａｃｃａ（編）、２００６年、第６版を参照のこと］。

次いで、骨髄に対する許容可能な吸収線量を１２Ｇｙと仮定することにより、療法を設計した。次いで、線量測定算出から、この吸収線量に対応する活性を算出した。

対応する用量／活性を対照に使用した。

結果
動物の腫瘍縮小
図１１は、治療後の体積において、マウスのうち１匹の腫瘍（動物の腹部、皮下に見える）がどの程度減少したかを示す。

放射免疫療法結果
図１２は、投与活性（ａ）Ｄ、（ｂ）２ｘＤおよび（ｃ）対照群での研究群の結果を示す（Ｄ＝２６．７ＭＢｑ）。

両方の処理群において、腫瘍容積の減少の明白な傾向があった。腫瘍縮小の開始は、１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６の注射の数日後に、すでに見られた。対照群において、ＮａＩ溶液の注射後に腫瘍容積の増加があった。

図１３（ａ）は、活性Ａを注射した群のマウスのうち１匹の結果を示す。ここでは、１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６の活性Ａを投与した場合、腫瘍は、１日目から６日間まで絶え間なく成長した。治療後に、腫瘍容積の急速な低下を観察した。

ＳＰＥＣＴ研究（注射８日後）において、腫瘍容積は、なおも活性が存在したことが示された；図１３（ｂ）を参照のこと。

結論
典型的な抗体１７７Ｌｕ−ｍ１１Ｂ６を用いる本研究は、前立腺癌腫瘍に対するｈＫ２標的抗体のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果をはっきりと実証した。

前立腺癌異種移植片における本発明の典型的な^１７７Ｌｕ標識ヒト化１１Ｂ６抗体の治療効果
材料および方法
抗体、コンジュゲーションおよび放射標識
抗体：配列番号１２による重鎖および配列番号１３による軽鎖を含む典型的なヒト化モノクローナル抗体１１Ｂ６（ＩｇＧ１／κ、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させた）は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ＡＢ、Ｌｕｎｄ（ＰＢＳ ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍＬ、ロット番号９０４７６．３０）から得た。非特異的ＩｇＧ抗体を、アイソタイプ対照として利用した（マウス血清由来ＩｇＧ抗体、ＳｉｇｍａＩ−８７６５）。

コンジュゲーション：典型的なｈ１１Ｂ６非特異的ＩｇＧ対照抗体を、以下の通りキレート化剤ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｌｉｃｓ、ＵＳＡ）とコンジュゲートした：抗体の溶液を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−２遠心濾過（２ｍＬ、１００Ｋ）で濃縮し、その後に０．０７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してｐＨ９．２に調整した。

モル比およそ３：１（抗体に対するキレート化剤）でのタンパク質溶液へのキレート化剤化合物ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡのカップリングを、以前に記載されている方法と同様に実行した（Ａｌｍｑｖｉｓｔらを参照のこと）。カップリング効率、すなわち抗体当たりの得られたキレート化剤の数は、分光光度法（Ｐｉｐｐｉｎら）によって決定できるが、本研究では分析しなかった。しかしながら、タンパク質への損傷を避けるために、カップリングは、好ましくは、３キレート化剤／抗体を上回るべきでない。キレート化剤をタンパク質に添加し、溶液を、４０℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。

４時間後に反応を停止させ、ＤＴＰＡ−ｈ１１Ｂ６と称するＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ−ｈ１１Ｂ６を、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで遊離キレートから分離し、０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ５．５ ２０ｍＬで平衡化した。コンジュゲートしたｈ１１Ｂ６を、酢酸アンモニウム緩衝液１ｍＬで溶出し、分注したサンプルを−２０℃で保管した。

ＩｇＧ対照抗体のコンジュゲーションを、上記と類似の方法で制御した。

放射標識：コンジュゲートしたｈ１１Ｂ６またはＩｇＧ対照抗体（一般に０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５中に約１μｇ／μＬを２００〜３００μＬ）を、所定量（約２００〜３００ＭＢｑ）の^１７７ＬｕＣｌ_３（ＩＤＢ Ｈｏｌｌａｎｄ）と混合し、１．５〜２時間室温でインキュベートした。インキュベーション後に、標識を停止し、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で平衡化した。標識効率を、即時薄層クロマトグラフィー（Ｂｉｏｄｅｘ、ＵＳＡ）でモニターし、０．２Ｍクエン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶出した。この系において、遊離^１７７Ｌｕは、溶媒の前の線と共に移動するが、放射性標識したコンジュゲートは元の線に残った。放射性分布を、定量化ソフトウェアとしてのＯｐｔｉｑｕａｎｔを使用してＣｙｃｌｏｎｅ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒシステム（両方ともＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製）で決定した。

ＩｇＧ対照抗体の放射標識を、上記と類似の方法で実行した。

療法研究
細胞系：ＬＮＣａＰ（ｈＫ２＋）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。細胞を、加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ_２、３７℃で維持し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ではがした。

すべての動物実験は、実験動物保護に関する国の法令にしたがって、および動物調査倫理委員会の承認とともに行った（Ｌｕｎｄ大学、スウェーデン）。研究室内で繁殖させた雄免疫不全Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（６〜８週齢）を使用した。マウスに、成長培地１００μＬおよびマトリゲル［ＢＤマトリゲル（商標） Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ、フェノールレッド非含有、カタログ番号３５６２３１］１００μＬ中のＬＮＣａＰ細胞をｓ．ｃ．注射（８，０００，０００〜１０，０００，０００個細胞）により右側腹部に異種移植した。少なくとも約３ｍｍの直径を有する腫瘍が確立されているマウスを本研究に含め、以下の表８に記述する３つの群に分けた。動物は、尾静脈にｉ．ｖ．注射した。活性レベル２０ＭＢｑの用量を、ｍ１１Ｂ６による研究に使用し、良好な治療効果を示したので、この量を選択した（実施例７を参照のこと）。

治療効果を、測径器を使用して腫瘍サイズを反復測定することによって判定した。腫瘍容積は、腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定し、次いで０．５×Ｌ×Ｗ×Ｗとして容積Ｖを算出することによって算出した。

また、すべての動物について血液学的（白血球数、赤血球数、血小板数およびヘモグロビン数）および重量測定を繰り返し行って、任意の潜在的血液学的毒性を同定し、動物の一般的な症状をモニターした。放射活性は、血液中に分布し、最終的に血液幹細胞がある骨髄に到達することになるので、放射免疫療法を評価する場合、血液学的毒性をモニターすることが特に重要であった。

１４ｍｍを超える腫瘍長さ／幅、もしくは最初の重量と比較して１５％を超える重量減少を発症した、さもなければ一般的な症状に悪影響を及ぼした、またはこれらの３つの指標のすべての組合せを有したマウスを、倫理ガイドラインにしたがって終了させた。

結果
治療効果の判定
図１４（ａ）に示すように、本発明の典型的なヒト化１１Ｂ６抗体（^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６）の投与は、マウスにおいて腫瘍成長を予防した（試験した動物の１匹を除くすべてにおいて、腫瘍容積の顕著な減少をもたらした）。それに対し、ＩｇＧ対照抗体（図１４ｂを参照のこと）またはＮａＣｌ（図１４ｃを参照のこと）で治療したマウスにおいて、腫瘍は急速に成長し続けた。

図１４に示した個々の動物からのデータを、図１５においてカプランマイアー曲線の形態で要約した。^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６の投与は、実験期間を超えたマウス生存率の著しい増加をもたらし、注射６０日後の実験の終了時に８０％以上の動物がまだ生きていた（２つの対照群における０％生存と比較した）。

血液学的毒性の判定
白血球数、赤血球数、血小板数、ヘモグロビン数および重量の判定は、^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６投与のいかなる毒性効果も表さなかった（データ不掲載）。

考察
本研究の結果、前立腺癌異種移植片モデルにおいて^１７７Ｌｕ−ｈ１１Ｂ６治療のかなりの治療効果が明らかになった。

マウスに投与した活性（２０ＭＢｑ）は、骨髄への吸収線量およそ１０Ｇｙに対応し、これらの動物による忍容性が高かった。２０ＭＢｑのこの低活性でさえ、大きな治療効果が観察された。以前に推定したように、少なくとも６０Ｇｙの腫瘍吸収線量を期待することができた。

血液学的毒性の徴候は全く観察されなかった。

参照文献
Almqvist Y., et al. In vitro and in vivo characterization of 177Lu-huA33: a radio-immunoconjugate against colorectal cancer. Nucl Med Biol. 2006;33:991-998.
Pippin CG et al. Spectrophotometric method for the determination of a bifunctional DTPA ligand in DTPA-monoclonal antibody conjugates. Bioconjug Chem. 1992;3:342-5.

放射性核種療法の線量測定計画および患者における前立腺癌の治療
放射性核種療法（ＲＮＴ）の場合、放射線源は全身に分布し、放射活性は放射性医薬品として全身的に通常投与される。放射活性分布は、異なる組織に経時的に蓄積する放射性医薬品の量で決まり、その量は患者間で異なる（１）。

ＲＮＴ治療は、処方された吸収線量に基づくべきである（２）。次いで、１回目は、トレーサ量の放射性医薬品を使用して前療法研究を実行し、腫瘍および臓器吸収線量を決定するべきである。通常、この情報は、投与した活性単位当たりの臓器吸収線量を記述する要素として、ｍＧｙ／ＭＢｑの単位；Ｄ^Ｐ _Ｔ（臓器）で表される。

次いで治療的投与が類似の条件下である場合、この因子を使用して、投与するのに必要な活性を決定し、それにより所与の臓器、組織または腫瘍へ処方した吸収線量を送達することができる（４、６）。

放射性同標識したｈ１１Ｂ６抗体による前立腺癌治療の場合、前療法研究は、^１１１Ｉｎ−ｈ１１Ｂ６による^１１１Ｉｎ画像診断に基づくべきである。次いで^１７７Ｌｕを治療用放射性核種にしようとする場合、^１１１Ｉｎが定量的（二次元／ＳＰＥＣＴ）画像診断に最も適している。次いで、Ｄ^Ｐ _Ｔ（臓器）を決定する場合、療法は、処方した療法効果を与える療法活性Ａ_Ｔと共に得ることができる。療法の間、活性分布ならびに対応する線量率を画像診断に基づいて算出して、治療の評価に必要な、腫瘍および正常臓器に加えられる実際の療法吸収線量を得るべきである。

治療の結果として骨髄の毒性レベルに達した療法の場合、次いで骨髄支持を計画することが必要であり、骨髄腔に対する線量測定算出に基づいて幹細胞の再注入の時間を決定しなければならない。

したがって、要約すると、以下の治療スキームが計画されるべきである：

前療法線量測定研究
１．１１１Ｉｎ標識ｈ１１Ｂ６（２００〜３００ＭＢｑ）注射
２．採血−第１週に決定した血液および血漿中の活性濃度。
３．１週間にわたる（７回）画像診断（ＳＰＥＣＴ／二次元）
４．ＬｕｎｄａＤｏｓｅスキームに基づく臓器線量測定（３）
５．決定される療法活性は、骨髄（２〜３Ｇｙ）、腎臓（２０〜３０Ｇｙ）および肝臓（１２〜３６Ｇｙ）など放射線感受性臓器に対する特定の吸収線量によって制限された。

内部療法線量測定を含めた療法
１．１７７Ｌｕ標識ｈ１１Ｂ６が投与される（前療法線量測定に基づく）
２．採血−血液および血漿中の活性濃度
３．１週間にわたる（６回）画像診断
４．臓器線量測定＝＞処方された療法吸収線量の確認。

線量測定に関する特別なコメント
累積の活性は、ある期間にわたって所与の領域において起こる崩壊の数である。単位は、Ｂｑ秒またはＢｑ時間である。電離放射線が物質を通り抜けて移動する場合、それは、相互作用しエネルギーを蓄積させる。付与されたエネルギーは、所与の容積におけるすべての蓄積されたエネルギーの合計である。吸収線量は、平均付与エネルギーおよび容積の量の比である。吸収線量の単位は、グレイ（Ｇｙ）であり、１Ｇｙは１Ｊ／ｋｇと同じである。

異なる時間での、組織における活性の値から、蓄積した活性を、積分によって決定し、平均吸収線量を決定することができた。活性測定を、全臓器の線量測定のために二次元画像診断を使用することにより行った。定量的ＳＰＥＣＴ／ＣＴは、ボクセルに基づく方法を使用してより少ない容積での線量測定を可能にした。

活性濃度値の３Ｄ分布から、吸収線量率分布は、水（または骨）中に位置する点線源の周りのエネルギー蓄積パターンについて記述するいわゆる点ドースカーネルまたはボクセルＳ値を使用して算出することができる。この方法は、胴体内の軟部組織などの解剖学的領域は、密度に関し均一であると仮定している。肺の場合のように密度が不均一な身体領域の場合、直接モンテカルロ算出が好ましい。この場合は、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴから得られた活性分布を、モンテカルロ用量計算コードへの入力として使用した。

参照文献
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2. ICRU report nr 67 - Dose Specifications in Nuclear Medicine. Adelstein SJ, DeLuca P, Feinendegen LE, Green L, Howell RW, Humm JL, Strand SE ICRU; 2002
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4. Quantitative imaging for clinical dosimetry.
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5. 177Lu-[DOTA0,Tyr3] octreotate therapy in patients with disseminated neuroendocrine tumors: Analysis of dosimetry with impact on future therapeutic strategy.
Garkavij Michael, Nickel Mattias, Sjogreen-Gleisner Katarina, Ljungberg Michael,
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Claims (24)

1. ヒトカリクレイン−２（ｈＫ２）に対する結合特異性を持つ抗体ポリペプチドであって、前記抗体ポリペプチドは：
   （ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖可変領域；および
   （ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖可変領域；
   を含む、前記抗体ポリペプチド。
2. 完全な抗体、またはＦｖフラグメント、Ｆａｂ様フラグメント、およびドメイン抗体からなる群から選択される抗原結合フラグメント、を含むまたはそれからなる、請求項１に記載の抗体ポリペプチド。
3. 重鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンサブタイプのものである、請求項１または２に記載の抗体ポリペプチド。
4. 軽鎖定常領域をさらに含み、前記軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
5. 配列番号１０のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖定常領域、および／または、配列番号１１のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖定常領域を含む、請求項３または４に記載の抗体ポリペプチド。
6. 配列番号１２のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる重鎖、および／または、配列番号１３のアミノ酸配列を含むもしくはそれからなる軽鎖を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
7. 抗体ポリペプチドが、直接または間接的に治療部分に連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
8. 治療部分は、１つまたはそれ以上の放射性同位元素を含むまたはそれからなる細胞障害
   性部分である、請求項７に記載の抗体ポリペプチド。
9. １つまたはそれ以上の放射性同位元素は、β放射体、オージェ−放射体、転換電子放射体、α放射体および低光子エネルギー放射体からなる群からそれぞれ独立に選択される、請求項８に記載の抗体ポリペプチド。
10. １つもしくはそれ以上の放射性同位元素は、⁹⁰Ｙ、³²Ｐ、¹⁸⁶Ｒｅ／¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁷⁶Ａｓ／⁷⁷Ａｓ、¹⁵³Ｓｍのような長距離β放射体；¹³¹Ｉ、¹⁷⁷Ｌｕ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁶¹Ｔｂのような中距離β放射体；⁴⁵Ｃａまたは³⁵Ｓまたは¹⁴Ｃのような低エネルギーβ放射体；⁵¹Ｃｒ、⁶⁷Ｇａ、⁹⁹Ｔｃ^m、¹¹¹Ｉｎ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、²⁰¹Ｔｌのような転換もしくはオージェ放射体；ならびに²¹²Ｂｉ、²¹³Ｂｉ、²²⁵Ａｃおよび²²¹Ａｔのようなα放射体からなる群からそれぞれ独立に選択される、請求項９に記載の抗体ポリペプチド。
11. 抗体ポリペプチドが、検出可能な部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
12. 検出可能な部分は、放射性同位元素を含むまたはそれからなる、請求項１１に記載の抗体ポリペプチド。
13. 放射性同位元素は、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ，⁸⁹Ｚｒ、¹²³Ｉおよび²⁰¹Ｔｌからなる群から選択される、請求項１２に記載の抗体ポリペプチド。
14. 治療部分および／または検出可能な部分は、連結部分を介して間接的に抗体ポリペプチドに繋がれている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
15. 連結部分は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択されるキレート化剤である、請求項１４に記載の抗体ポリペプチド。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド、またはそのポリペプチド鎖成分をコードする、単離された核酸分子。
17. 配列番号１４および／または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
18. 請求項１６または１７に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
19. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチドおよび薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
20. 医薬における使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
21. 前立腺癌の治療および／またはｉｎ ｖｉｖｏ診断における使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。
22. 治療しようとする前立腺癌は、転移性前立腺癌、場合により微小転移性前立腺癌である
    、請求項２１に記載の抗体ポリペプチド。
23. 治療しようとする転移性前立腺癌は、リンパ系の転移；骨（脊椎、椎骨、骨盤、肋骨を含む）の転移；骨盤、直腸、膀胱、尿道内転移である、請求項２２に記載の抗体ポリペプチド。
24. 治療しようとする前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の抗体ポリペプチド。

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