JP6509967B2 - 抗T.cruzi抗体及び使用方法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年12月27日に出願された米国特許出願61/017,071号(参照により、その内容は本明細書に組み込まれる。)の利益を主張する。
本開示は、トリパノソーマ(スキゾトリパナム(Schizotrypanum))クルーズ抗原を検出又は定量するための方法、アッセイ及びキットに関する。
(b)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはPep2であり、並びにさらに、前記抗体は、約1.0×106M−1s−1から約8.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約6.0×10−3s−1から約4.0×10−2s−1の間の解離速度定数(kd)及び約7.5×10−10Mから約4.0×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(c)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP10であり、並びにさらに、前記抗体は、(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(d)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP3であり、並びにさらに、前記抗体は、約2.0×105M−1s−1から約6.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約2.0×10−5s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び約3.3×10−12Mから約4.0×10−9Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);並びに
(e)(a)から(d)の任意の組み合わせ。
(b)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはPep2であり、並びにさらに、前記抗体は、約1.0×106M−1s−1から約8.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約6.0×10−3s−1から約4.0×10−2s−1の間の解離速度定数(kd)及び約7.5×10−10Mから約4.0×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(c)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP10であり、並びにさらに、前記抗体は、(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(d)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP3であり、並びにさらに、前記抗体は、約2.0×105M−1s−1から約6.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約2.0×10−5s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び約3.3×10−12Mから約4.0×10−9Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);並びに
(e)(a)から(d)の任意の組み合わせ。
本明細書に使用されているように、文脈上明確に反対の記述がなければ、単数形「a」、「an」及び「the」には、複数表記が含まれる。本明細書での数的範囲の引用に関して、その間に介在する各数字は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲6から9の場合、6及び9に加えて、数字7及び8が想定され、範囲6.0から7.0の場合、数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及び7.0が明示的に想定される。
本明細書において使用される「約」という用語は、表記されている値からのおよそ+/−10%の変動を表す。このような変動は、具体的に参照されているかどうかに関わらず、本明細書に提供されている何れの所定の値にも常に含まれることを理解すべきである。
本明細書において使用される「抗体」(Ab)という用語は、TCAに対して誘導された単一の抗体(抗TCA抗体)、ポリエピトープ特異性を有する抗TCA抗体組成物、一本鎖抗TCA抗体及び抗TCA抗体の断片を含む。「モノクローナル抗体」(mAb)は、実質的に均質な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する各抗体は、微量に存在する可能性がある天然の変異を除けば同一である。典型的な抗体には、ポリクローナル(pAb)、モノクローナル(mAb)、ヒト化、二重特異的(bsAb)、ヘテロ連結物抗体及び二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig(R))及び二重可変ドメイン免疫グロブリンの誘導体(三重可変ドメインなど)が含まれる(二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその作製方法は、Wu, C, et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290−1297(2007)及びWO2001/058956(これらの各々の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。)に記載されている。)。
本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、完全状態の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む完全状態の抗体の一部を表し、前記一部は完全状態の抗体のFc領域の定常重鎖ドメイン(すなわち、抗体イソタイプに応じて、CH2、CH3及びCH4)を含まない。抗体断片の例には、Fab断片、Fab’断片、Fab’−SH断片、F(ab’)2断片、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖Fv(scFv)分子、軽鎖可変ドメインを1つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの3つのCDRを含有する一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を1つだけ含有する一本鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の3つのCDRを含有する一本鎖ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「二重機能性抗体」という用語は、ある抗原性部位に対して特異性を有する第一のアーム及び異なる抗原性部位に対して特異性を有する第二のアームを含む抗体をあらわす。すなわち、二重機能性抗体は二重の特異性を有する。
「生物学的試料」という用語には、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体が含まれる。対象から得られる生物学的試料は、ポリペプチド分子を含有する。生物学的試料の例には、全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹腔液、膣液、月経血、羊水及び精液が含まれる。インビトロ及びインビボで生物学的試料中のTCAを検出するために、検出方法を使用することができる。TCAを検出するためのインビトロ技術には、酵素連結免疫吸着検定法(ELISA)、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が含まれる。さらに、TCAを検出するためのインビボ技術には、標識された抗TCA抗体を対象中に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び位置を標準的な画像化技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「kon」又は「ka」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示す値を表す。
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「koff」又は「kd」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原からの抗体の解離速度又はAb−Ag複合体が経時的に遊離の抗体及び抗原へ分離することを示す値を表す。
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を用いることによって、平衡状態にある生理的緩衝液中で試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。BIAcore(R)(生物分子相互作用分析)アッセイなどの他の実験的アプローチ及び装置(例えば、BIAcore International ABから入手可能な装置、GE Healthcare company、Uppsala,Sweden)を使用することが可能である。さらに、Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)から入手可能なKinExA(R)(Kinetic Exclusion Assay)アッセイも使用することが可能である。
本明細書において使用される「キメラ抗体」(又は「cAb」)という用語は、別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結されたある宿主種由来の抗体の重及び軽鎖可変領域の全部又は一部を含むポリペプチドを表す。
「対応している」又は「対応する」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部又は一部と同一であることを表す。「〜に相補的」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の相補的な鎖の全部又は一部と同一であることを表すために、本明細書において使用される。例として、核酸配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。
本明細書において使用される「誘導化された抗体」という用語は、別の機能的分子に誘導化された又は連結された抗体又は抗体の一部を表す。例えば、抗体又は抗体断片は、化学的カップリング、遺伝的融合又は非共有会合などによって、別の抗体、検出可能な因子、細胞毒性因子、薬剤及び抗体又は抗体の一部の別の分子(ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど)との会合を媒介することができるポリペプチドなどの1つ以上の分子に機能的に連結され得る。誘導化された抗体の1つの種類は、2つ以上の抗体を架橋することによって産生される。適切な架橋剤には、ヘテロ二機能性(例えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)又はホモ二機能性(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)であるものが含まれる。このようなリンカーは、Pierce Chemical Company(Rockford, IL)から入手することができる。
本明細書において使用される「検出可能な標識」という用語には、直接又は間接的に検出することが可能な分子又は部分が含まれる。さらに、これらの因子は抗体で誘導化することが可能であり、蛍光性化合物が含まれる。標識のクラスには、蛍光性、発光性、生物発光性及び放射性物質、酵素及び補欠分子族が含まれる。有用な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エコーリン及び125I、131I、35S又は3Hが含まれる。
T.cruziタンパク質の領域に関して本明細書において使用される「診断的に適切な」という用語は、その検出が、単独で又はシャーガスの他の診断的に適切な領域と組み合わせて、T.cruziの検出を可能とするタンパク質の領域を表す。診断的に適切な領域の例には、本分野において公知の免疫優性領域及び本明細書に記載されているような領域が含まれる。
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され及びその特異的な結合対上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子及び特異的結合対は、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原(糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など(但し、これらに限定されない。))又は多糖であり得、その特異的結合対は抗体であり得る(但し、これらに限定されない。)。典型的には、エピトープは、より大きな抗原性断片(すなわち、抗体を結合することができる領域又は断片)内に含有され、特異的結合対に接触することが知られている正確な残基を表す。抗原性断片は2以上のエピトープを含有することが可能である。
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、可変領域の一部が非ヒト種由来の対応する配列によって可変領域の一部が置換されており及び修飾された可変領域がヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されている、ヒト抗体の修飾された可変領域を含むポリペプチドを表す。一実施形態において、可変領域の一部は相補性決定領域(CDR)の全部又は一部である。この用語は、ハイブリッド抗体が所望の生物活性(すなわち、T.cruzi抗原性タンパク質を特異的に結合する能力)を示す限り、起源となる種、タンパク質の種類、免疫グロブリンクラス又はサブクラスの指定に関わらず、非ヒト抗体の可変領域又は1つ若しくはそれ以上のCDRを異種タンパク質とスプライシングすることによって産生されたハイブリッド抗体も含まれる。
「単離された」又は「精製された」という用語は、分子を参照する場合、同定されており、その天然環境の成分から分離及び/又は回収されている分子を表す。その天然環境のきょう雑成分は、診断又は治療的使用を妨害する物質である。「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又は本明細書において使用されている生物学的に活性な断片(Fab断片など)は、その環境の成分から分離及び/又は回収されているポリペプチド又は生物学的に活性な断片を表す。きょう雑成分には、ポリペプチドに関する診断的使用を通例妨害する物質が含まれ、酵素、ホルモン及び他のポリペプチド性又は非ポリペプチド性物質が含まれ得る。実質的に単離するために、調製物は、きょう雑物質の乾燥重量の約30%未満(すなわち、約0.01%から約30%)、通常、約20%未満(すなわち、約0.01%から約20%)、約10%未満(すなわち、約0.01%から約10%)、より頻繁には、約5%未満(すなわち、約0.01%から約5%)のきょう雑物質を有する。単離され、組換え的に産生されたTCA、VL若しくはVH又は生物学的に活性な部分は、望ましくは、培地を実質的に含まない。すなわち、培地は、TCA、VL又はVH調製物の容量の約20%、約10%又は約5%未満を占める。従って、本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を表す。しかしながら、T.cruziエピトープを特異的に結合する単離された抗体は、例えば、シャーガスポリペプチドTcf及びFP6上に見出されるPep2エピトープを結合する抗体など、他のT.cruzi抗原に対する交叉反応性を有することができる。
本明細書において記載されるように、イムノアッセイは、例えば、較正用物質、対照及び感度パネルを含む(但し、これらに限定されない。)「品質管理試薬」を取り込む。「較正用物質」又は「標準」は、抗体濃度を内挿するための較正(標準)曲線を確立するために、通例使用される(例えば、1つ以上又は種々の)場合によって、正/負のカットオフに近い単一の較正用物質を使用することができる。「感度」パネルを構成するために、複数の較正用物質(すなわち、2以上の較正用物質又は較正用物質の変動量)を合わせて使用することができる。「陽性対照」はアッセイ性能特性を確立するために使用され、試薬(例えば、抗原)の完全性の有用な指標である。
本明細書において使用される「組換え抗体」という用語は、組換え技術によって、1つ以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を適切な発現ベクター中にクローニングし、続いて、適切な宿主細胞中で抗体を発現させることを含む1つ以上の工程によって調製された抗体を表す。従って、この用語には、モノクローナル抗体である組換え的に作製された抗体、モノクローナル抗体の断片を含む抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体(完全又は部分的にヒト化)、抗体断片から形成された多重特異的又は多価構造(二重可変ドメイン免疫グロブリン、DVD−Ig(R)と名付けられた四価IgG様分子を含む。)及び二重機能性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される、特異的な結合対(例えば、抗原及び抗体)の要素間での相互作用に関する「特異的な」又は「特異性」は、相互作用の選択的反応性を表す。「〜に特異的に結合する」という用語及びその類似語は、T.cruziタンパク質に特異的に結合し、他の物体には特異的に結合しない抗体の能力を表す。T.cruziタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断用イムノアッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(「RIA」)及び酵素連結免疫吸着アッセイ(「ELISA」)(例えば、Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332−336 (1989)参照)、BIAcore(R)(biomolecular interaction analysis、BIAcore International AB, Uppsala, Swedenから入手可能)、KinExA(R)(Kinetic Exclusion Assay、Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)から入手可能)又は当業者に公知の他の技術によって同定され得る。
核酸又はアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一の」という用語は、例えば、以下に記載されている方法を用いて、最適に並置された場合に、その核酸又はアミノ酸配列が所定の別の核酸又はアミノ酸配列(又は「参照配列」)と少なくとも約70%(例えば、約70%から約100%)、少なくとも約75%(例えば、約75%から約100%)、少なくとも約80%(例えば、約80%から約100%)、少なくとも約85%(例えば、約85%から約100%)、少なくとも約90%(例えば、約90%から約100%)、少なくとも約95%(例えば、約95%から約100%)、少なくとも約96%(例えば、約96%から約100%)、少なくとも約97%(例えば、約97%から約100%)、少なくとも約98%(例えば、約98%から約100%)又は少なくとも約99%(例えば、約99%から約100%)の配列同一性を有することを表す。「実質的な同一性」は、完全長配列、エピトープ又は免疫原性ペプチド、機能的ドメイン、コード及び/又は制御配列、エキソン、イントロン、プロモーター及びゲノム配列など、配列の様々な種類及び長さを表すために使用することができる。2つのアミノ酸又は核酸配列間の%同一性は、当業者の技術水準の範囲に属する様々な方法で、例えば、Smith Waterman Alignment(Smith, T. F. and M. S. Waterman(1981) J MolBiol 147:195−7);GeneMatcher PlusTMに取り込まれているような“BestFit”(Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics,482−489(1981))、Schwarz and Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M. O., Ed pp353−358;BLAST program(Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S.F.,W.Gish, et al.(1990) J MolBiol215:403−10)並びにBLAST−2、BLAST−P、BLAST−N、BLAST−X、WU−BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2、CLUSTAL及びMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどのこれらの変形などの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて測定することができる。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大の並置を達成するために必要とされるアルゴリズムなど、並置を測定するための適切なパラメータを決定することが可能である。一般に、アミノ酸配列に関して、比較配列の長さは少なくとも約10アミノ酸である。当業者は、実際の長さが比較されている配列の全長に依存すること、及び少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約110、少なくとも約120、少なくとも約130、少なくとも約140、少なくとも約150、少なくとも約200、少なくとも約250、少なくとも約300若しくは少なくとも約350アミノ酸であり得、又はアミノ酸配列の完全長であり得ることを理解する。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも約25ヌクレオチドであるが、少なくとも約50、少なくとも約100、少なくとも約125、少なくとも約150、少なくとも約200、少なくとも約250、少なくとも約300、少なくとも約350、少なくとも約400、少なくとも約450、少なくとも約500、少なくとも約550、少なくとも約600、少なくとも約650、少なくとも約700、少なくとも約800、少なくとも約900若しくは少なくとも約1000であり得、又は核酸配列の完全長であり得る。
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、BIACORE(R)システム(Biacore(GE Healthcare)(Johnsson, B., et al.1991.Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran−modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.Anal Biochem.198:268−77;Johnsson, B., et al.1995.Comparison of methods for immobilization to carboxymethyl dextran sensor surfaces by analysis of the specific activity of monoclonal antibodies.J Mol Recognit.8:125−31; Jonsson, U., et al.1993.Introducing a biosensor based technology for real−time biospecific interaction analysis.Ann Biol CUn (Paris)51:19−26)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム二重特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象を表す。
本明細書で使用される「TCA」という略号は、「T.cruzi抗原」を意味する。FP3、Pep2、TcF、FP6及びFP10はTCAを表し、以下でさらに定義されている。他の略号は導入されるごとに定義されている。
本開示は、とりわけ、新規抗体、これらの抗体を産生する細胞株及びこれらの抗体を作製する方法を提供する。これらの抗体は、様々なT.cruzi抗原(TCA)を結合し、FP3、Pep2(TcF、FP6)及びFP10ポリペプチド中に含有されているものが含まれ、マウスmAb、二重可変ドメイン免疫グロブリン(CDVD−Ig(R))などのmAbとして、又はマウス−ヒト(Mu−Hu)キメラなどのキメラ抗体として使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイ中の陽性対照として有用である。さらに、抗体は、TCAを保有するT.cruziポリペプチドを精製するために使用することができる。本開示の抗体及び細胞株の例が、以下の表1に挙げられている。
(a)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合し(T.cruziポリペプチドはFRAであり、並びにさらに、前記抗体は、約7.0×105M−1s−1から約7.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約4.0×10−3s−1から約3.0×10−1s−1の間の解離速度定数(kd)及び約5.7×10−10Mから約4.3×10−7Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(b)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはPep2であり、並びにさらに、前記抗体は、約1.0×106M−1s−1から約8.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約6.0×10−3s−1から約4.0×10−2s−1の間の解離速度定数(kd)及び約7.5×10−10Mから約4.0×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(c)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP10であり、並びにさらに、前記抗体は、(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);
(d)T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体(T.cruziポリペプチドはFP3であり、並びにさらに、前記抗体は、約2.0×105M−1s−1から約6.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約2.0×10−5s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び約3.3×10−12Mから約4.0×10−9Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する。);並びに
(e)(a)から(d)の任意の組み合わせ。
本開示の免疫診断用試薬は、本明細書に記載されている1つ以上の抗体を含む(例えば、本明細書中のB及びE節を参照。)。例えば、免疫診断用試薬を含む抗体には、組換え抗体が含まれ得、ここでも、組換え抗体にはT.cruziタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する組換えキメラ抗体が含まれる。従って、一実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、T.cruziタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一の抗体を含む。別の実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、T.cruziタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一のキメラ抗体を含む。他の実施形態において、免疫診断用試薬は、各々がT.cruziタンパク質の診断的に適切な領域(例えば、同じ領域又は異なる領域)を特異的に結合することができる1つ以上の組換え抗体(組換えキメラ抗体など)を含み得る複数の抗体を含む。複数のキメラ抗体の1つ以上は、同じT.cruziタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することが可能であり得る。あるいは、キメラ抗体の複数の各々は、異なるT.cruziタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる。
T.cruziは、複雑な生活環を有する複雑な生物である。しかしながら、寄生生物の診断的検出のために有用である重要な抗原が同定されている。
本開示の組換え抗体は、T.cruzi抗原性タンパク質に特異的に結合することができる固有の抗体のVH及び/又はVLドメインに由来する抗原結合領域を含む。組換え抗体は、例えば、組換え的に産生されるモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異的、二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig(R))又は抗体断片から形成された多価構造又は二重機能的抗体であり得る。
(a)T.cruziポリペプチドがFRAであり、並びにさらに、前記抗体が約7.0×105M−1s−1から約7.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約4.0×10−3s−1から約3.0×10−1s−1の間の解離速度定数(kd)及び約5.7×10−10Mから約4.3×10−7Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する、T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体;
(b)T.cruziポリペプチドがPep2であり、並びにさらに、前記抗体が約1.0×106M−1s−1から約8.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約6.0×10−3s−1から約4.0×10−2s−1の間の解離速度定数(kd)及び約7.5×10−10Mから約4.0×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する、T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体;
(c)T.cruziポリペプチドがFP10であり、並びにさらに、前記抗体が(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する、T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体;
(d)T.cruziポリペプチドがFP3であり、並びにさらに、前記抗体が約2.0×105M−1s−1から約6.0×106M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、約2.0×10−5s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び約3.3×10−12Mから約4.0×10−9Mの間の平衡解離定数(KD)からなる群から選択される少なくとも1つの結合定数を有する、T.cruziポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体;並びに
(e)(a)から(d)の任意の組み合わせ。別の実施形態において、場合によって、組換え抗体は、マウスモノクローナル抗体の特異性及び親和性を保持し、並びにヒト免疫グロブリンを測定するイムノアッセイフォーマットにおいて反応するキメラ抗体である。場合によって、マウス−ヒトキメラ抗体は、FP3、FP6、FP10又はFRA抗原に対して誘導される。場合によって、このようなキメラ抗体は、Abbott LaboratoriesのAxSYM(R)、ARCHITECT(R)及びPRISM(R)プラットフォームなどの(但し、これらに限定されない。)既存のイムノアッセイフォーマットにおいて反応する。
ポリクローナル抗体は、免疫原及び所望であれば、アジュバントの1つ以上の注射によって、哺乳動物宿主中に産生され得る。典型的には、免疫原(及びアジュバント)は、複数の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物中に注射される。免疫原は、TCA又はTCA融合ポリペプチドを含むことができる。アジュバントの例には、フロイントの完全及びモノホスホリルリピドA合成トレハロースジコリノミコラート(MPL−TDM)が含まれる。免疫応答を向上させるために、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシン阻害剤など、宿主中において免疫原性であるポリペプチドに免疫原を連結することができる。抗体産生のためのプロトコールは周知である(Ausubel et al, 1987; Harlow, E., and D. Lane.1988.Antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.726 pp; Harlow, E., and D. Lane.1999.Using antibodies:A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory PRess, Cold Spring Harbor, New York)。あるいは、pAbは、IgY分子を産生するニワトリ中で作製することができる(Schade, R., et al.1996.The production of avian (egg yolk) antibodies:IgY.The report and recommendations of ECVAM workshop.Alternatives to Laboratory Animals (ATLA).24:925−934)。
本開示の組換え抗体は、例えば、ヒト又は非ヒト動物(げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、霊長類又はニワトリなど)によって産生されたモノクローナル抗体由来の抗原結合ドメイン配列(例えば、VH及び/若しくはVL配列又はその一部)を含むことができる。あるいは、所望の結合活性を有する抗原結合ドメインは、バクテリオファージ、細菌若しくは酵母の表面上でラムダファージ中に発現されたコンビナトリアルライブラリーの使用を通じて選択され、又は標準的な技術を用いて、他の生物学的(例えば、レトロウイルス又はポリソーム)若しくは非生物系上でのディスプレイによってスクリーニングすることができる(例えば、Marks, J. D. et. al, J. Mol.Biol.222:581−597 (1991); Barbas, C. F. Ill et. al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4457−4461 (1992)参照)。ライブラリーは、免疫化された又は免疫化されていない宿主から単離された固有の抗原結合ドメイン、合成もしくは半合成の抗原結合ドメイン又は修飾された抗原結合ドメインから構成され得る。
本開示の一実施形態において、組換え抗体は、目的のT.cruziに結合するモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。
一価抗体は互いに架橋しない。1つの方法は、Ig軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。一般にFc領域中の何れかの点での重鎖末端切断は、重鎖架橋を妨げる。あるいは、適切なシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換され又は欠失され、ジスルフィド結合による架橋を妨げる。インビトロ法は、一価抗体を調製するのにも適している。抗体は、Fabなどの断片を作製するために消化することができる(Harlow and Lane,1988,上記;Harlow and Lane,1999,上記)。
TCAを結合する非ヒト抗体のヒト化された形態は、非ヒトIgに由来する最小配列を含有するキメラIg、Ig鎖又は断片(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2又は抗体の他の抗原結合配列など)である。
二重特異的モノクローナル抗体は、少なくとも2つの異なる抗原を結合する。例えば、結合特異性はTCAであり、その他は選択した任意の抗原に対する。
組換え抗体が標的T.cruzi抗原に特異的に結合する能力は、標準的な免疫学的技術によって評価することができる(例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan, J.E., et al.(ed.), J. Wiley & Sons, New York, NY参照)。例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素イムノアッセイ(EIA又はELISA)による。本開示の一実施形態において、組換え抗体は、抗原結合ドメインが由来するモノクローナル抗体と実質的に同じ特異性を示す。
本開示の組換え抗体は、例えば、T.cruziを検出するための診断試薬として、及び/又は伝統的な血漿又は血清の代わりに、T.cruzi抗体を検出するためのアッセイ若しくはキットにおける標準化試薬、陽性対照試薬若しくは較正物質試薬として使用するのに適している。標準化試薬は、例えば、抗体濃度を内挿するための標準曲線を確立するために使用することができる。陽性対照は、アッセイ性能特性を確立し、並びに/又はアッセイにおいて使用される抗原の完全性を定量及びモニターするために使用することができる。本開示は、複数の組換え抗体(各組換え抗体は、標準化された抗体感度パネルとして、異なるT.cruzi抗原に特異的に結合することができる。)の使用も提供する。このような感度パネルは、例えば、アッセイ性能特性を確立するために、並びに/又はアッセイにおいて使用される抗原の完全性を定量及びモニターするために、T.cruzi抗体検出キットの品質管理のために、伝統的な血漿又は血清の代わりに使用され得る。本開示は、T.cruzi感染の治療又は予防における組換え抗体の使用も想定する。
本開示は、本開示の1つ以上の組換え抗体を含む治療用、診断用及び品質管理キットをさらに提供する。
キット(又はその成分)並びに本明細書中に記載されている成分及び方法を用いるアッセイによって、検査試料中のT.cruzi抗原の存在又は濃度を測定、検出する方法は、例えば、米国特許第5,089,424号及び同第5,006,309号に記載されているように、並びに、例えば、ARCHITECT(R)としてAbbott Laboratories(Abbott Park, IL)によって市販されているように、様々な自動化及び半自動化されたシステム(固相が微粒子を含むシステムを含む。)で使用するために改変することができる。
この実施例では、シャーガスFP3組換え抗原を認識及び結合するmAbを産生するハイブリドーマ細胞を作製した。FP3組換え抗原(配列番号2)でマウスを免疫化し、抗FP3抗体を産生するマウスを安楽死させ、脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合し、mAb抗FP3ハイブリドーマ細胞株を単離した。得られた細胞株HBFP3を作製した。
シャーガスFP3抗原細胞株は、イリノイ州レイク郡の種子銀行に対して、アイオワ大学のLouis Kirchoff博士の研究室から頂いた。T7プロモーターの調節下で、pET発現ベクター中にこの抗原をコードするcDNA配列(配列番号1)をクローニングし、適切なイー・コリ宿主細胞[BLR(DE3)pLysS又はBL21(DE3)]中で発現させた。T7RNAポリメラーゼは、宿主細菌ゲノム中に挿入されたλDE3溶原菌によってコードされ、lacUV5プロモーターの制御下にあった。T7RNAポリメラーゼ発現を誘導するために、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を細胞に添加し、T7RNAポリメラーゼはT7プロモーターに結合され、クローニングされた遺伝子の発現をもたらした。単一のコロニーを単離するために、形質転換された細胞のプレートを画線し、細胞銀行を調製した。続いて、イー・コリを増殖させ、精製のために細胞ペーストを調製した。
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスFP4組換え抗原(標的FP3配列を含有する。)で2回及び精製されたシャーガスFP3組換え抗原で1回、RBf/dnJ雌マウス(全てのマウスは、Jackson Laboratories;Bar Harbor,ME)から入手した。)を免疫化した。0.9%塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。0週及び3週目で、(標的FP3配列を含有する)FP4の追加免疫20μgをマウスに投与した。6週目に、FP3の追加免疫10μgをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の2回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から2週後に、特異的な抗T.cruzi力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス#241が選択された。融合の3日前に、FP3組換え抗原5μgの前融合強化投与をマウス#241に投与した。
Galfreらに記載されているポリエチレングリコール(PEG)によって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した(Galfre, G., et al.1977.Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.Nature.266:550−2)。融合前の追加免疫から3日後に、RBf/dnJマウス#241を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からB細胞を灌流し、洗浄し、SP2/0骨髄腫細胞の等しい数の中に再懸濁した(ATCC寄託CRL−1581)。全細胞を沈降させ、ポリエチレングリコール(PEG)1mLを用いて融合を行い、HATが補充された、10%ウシ胎児血清(FBS;Hyclone;Logan,UT)を加えたGIBCO(R)ハイブリドーマ無血清培地(H−SFM;Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中において37℃で培養した。96ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する37℃の温置装置中で温置した。マイクロタイター酵素イムノアッセイ(EIA)中での抗T.cruziFP3反応性に関して、10から14日後に、ハイブリッドを検査した。結果は、ハイブリッド12−392が抗FP3特異的抗体を分泌することを示した。
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ12−392を選択した。細胞を懸濁し、次いで、10%FBSを加えたH−SFM20mL中に、104、105及び106系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物0.2mLを加えた96ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、37℃で10から14日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗FP3マイクロタイターEIA中で上清を検査し、クローン12−392−150の選択をもたらした。
免疫原源
動物の免疫化のために使用した精製されたTcF組換え抗原(PEP2配列を含有する。)は、Corixa Corporation(Seattle,WA)から入手した。
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスTcF組換え抗原を用いて、RBf/dnJ雌マウスを3回免疫化した。0.9%塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。0、6及び12週目に、TcFの追加免疫20μgをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の2回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から2週後に、特異的な抗T.cruzi力価検査のために血清試料を採取し、これにより、融合実験のためにマウス#115が選択された。融合の3日前に、TcF組換え抗原10μg及びTcFPep2ペプチド10μgの前融合追加免疫をマウス#115に投与した。
Galfreら(Galfre et al.,1977)に記載されているPEGによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から3日後に、RBf/dnJマウス#115を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からB細胞を灌流し、洗浄し、SP2/0骨髄腫細胞(ATTC寄託CRL−1581)の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、PEG1mLを用いて融合を行い、HATが補充された、10%FBS(Hyclone;Logan,UT)を加えたGIBCO(R)H−SFM(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中において37℃で培養した。96ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する37℃の温置装置中で温置した。マイクロタイターEIA中での抗T.cruziPep2反応性に関して、10から14日後に、ハイブリッドを検査した。結果は、ハイブリッド9−638が抗Pep2特異的抗体を分泌することを示した。
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ9−638を選択した。細胞を懸濁し、次いで、10%FBSを加えたH−SFM20mL中に、104、105及び106系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物0.2mLを加えた96ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、37℃で10から14日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗Pep2マイクロタイターEIA中で上清を検査し、クローン9−638−132を選択した。
免疫原源
シャーガスFP10抗原(配列番号6)細胞株は、レイク郡の種子銀行のために、アイオワ大学のLouis Kirchof博士の研究室から入手した。この抗原をコードするcDNA配列(配列番号5)をpET発現ベクター中にクローニングし、細胞を処理し、実施例1に概説されているように組換え抗原を精製した。
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスFP10組換え抗原を用いて、RBf/dnJ雌マウスを3回免疫化した。0.9%塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。0、3、及び6週目に、追加免疫20μgをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の2回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から2週後に、特異的な抗T.cruzi力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス#230を選択した。融合の3日前に、FP10組換え抗原25μg及びFP10組換え抗原のL−ドメインに相当する14アミノ酸の合成ペプチド25μgからなる前融合追加免疫をマウス#230に投与した。
Galfreら(Galfre et al.,1977)に記載されているPEGによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から3日後に、RBf/dnJマウス#230を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からB細胞を灌流し、洗浄し、SP2/0骨髄腫細胞(ATTC寄託CRL−1581)の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、PEG1mLを用いて融合を行い、HATが補充された、10%FBS(Hyclone;Logan,UT)を加えたGIBCO(R)H−SFM(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中において37℃で培養した。96ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する37℃の温置装置中で温置した。EIA中での抗T.cruziFP10反応性に関して、10から14日後に、得られたハイブリドーマを検査した。10−745として知られる抗アール・クルーズFP10mAbを分泌するハイブリドーマを選択した。
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ10−745を選択した。細胞を懸濁し、次いで、10%FBSを加えたH−SFM20mL中に、104、105及び106系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物0.2mLを加えた96ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、37℃で10から14日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗FP10マイクロタイターEIA中で上清を検査し、クローン10−745−140の選択をもたらした。
免疫原源
FP6ポリペプチド中に含まれるFRA領域(配列番号8)を含有するT.cruzi抗原細胞株は、レイク郡の種子銀行のために、アイオワ大学のLouis Kirchoff博士の研究室から入手した。この抗原をコードするcDNA配列(配列番号7)をpET発現ベクター中にクローニングし、細胞を処理し、実施例1に概説されているように組換え抗原を精製した。
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガス組換え抗原FP6を用いて、BALB/c雌マウスを3回免疫化した。0.9%塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。0、4及び10週目に、追加免疫10μgをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の2回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から2週後に、特異的な抗T.cruzi力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス#1907を選択した。融合の3日前に、組換え抗原25μg及び組換え抗原のFRA−ドメインに相当する合成ペプチド25μgからなる前融合追加免疫をマウス#1907に投与した。
Galfreら(Galfre et al.,1977)に記載されているPEGによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から3日後に、BALB/cマウス#1907を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からB細胞を灌流し、洗浄し、SP2/0骨髄腫細胞(ATTC寄託CRL−1581)の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、PEG1mLを用いて融合を行い、HATが補充された、10%FBS(Hyclone;Logan,UT)を加えたGIBCO(R)H−SFM(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中において37℃で培養した。96ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する37℃の温置装置中で温置した。EIA中での抗T.cruziFRAドメインの反応性に関して、10から14日後に、得られたハイブリドーマを検査した。8−367として知られる抗T.cruziFRAドメインmAbを分泌するハイブリドーマを選択した。
限界希釈クローニングのために、ハイブリッド8−367を選択した。細胞を懸濁し、次いで、10%FBSを加えたH−SFM20mL中に、104、105及び106希釈物を系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物0.2mLを加えた96ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、37℃で10から14日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗FRAマイクロタイターEIA中で上清を検査し、クローン8−367−171を選択した。
この実施例及びその後の実施例は、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞株の作製に関し、以下の全般的なアプローチを採用した。所望のmAbを分泌するハイブリドーマ細胞株(実施例1から4のハイブリドーマなど)を同定した後、これらの細胞からmRNAを単離し、抗体遺伝子配列を同定した。次いで、ヒト抗体定常配列を供給するVL及びVH配列をpBOSベクター中にクローニングし(Mizushima S, Nagata S., “pEF−BOS, a powerful mammalian expression vector.”Nucleic Acids Res.1990 Sep 11;18(17):5322及びUS 2005/0227289(これらのベクターの使用及びベクターそのものに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。)、次いで、得られたキメラ抗体が機能的であることを確認するために、一過性の発現系中に同時形質移入した。確認したら、VL配列をpJV中に、VH配列をpBV中にサブクローニングした。これらのベクターは、次いで、安定なpBJ発現ベクターを構築するために使用された。pJVプラスミドはAbbott Laboratories(Abbott Bioresearch Center,Worcester,MA)から入手し、SV40プロモーター、マウスDHFR遺伝子、エンハンサー、プロモーター及びλstufferを含む。pBVプラスミド(同じく、Abbott Laboratories, Abbott Bioresearch Center, Worcester, MAから入手)は、エンハンサー、プロモーター及びλstufferを含む。次いで、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞をpBJで形質移入し、安定な形質移入体を選択し、分泌された抗体を再び検査した。図1は、ヒト定常領域遺伝子が付加されたベクター中にマウス可変領域遺伝子(抗原結合部分)が転移されているキメラ抗体の模式的な要約を示している。
標準的なmRNA抽出プロトコールに従ってmRNAを精製するために約5×106個の細胞を得るため、H−SFM中でハイブリドーマ細胞株HBFP3(実施例1)を培養した。RT−PCR反応中で、マウスIgプライマーの組(Novagen(EMD Biosciences,Inc.);Madison,WI)とともに、精製されたmRNAをテンプレートとして使用した。陽性PCR産物が、重鎖(H)プライマーB及びC(HB及びHCクローン)から並びに軽鎖(L)プライマーA、B、C及びG(LA、LB、LC及びLGクローン)から観察された。全ての陽性PCR産物をゲル精製し、pCR TOPO2.1TAベクター(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドDNAを精製し、適切な大きさの産物を与える各RT−PCR反応に対して、EcoRI消化によってVH又はVL挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいVH又はVL遺伝子配列を選択した。シャーガスTOPO−TAクローンHB1は正しいVH遺伝子配列を含有し、シャーガスTOPO−TAクローンLG3は正しいVL遺伝子配列を含有した。
TOPOクローンLG3からマウスVL遺伝子を増幅するために、5’プライマー上にNruI部位とともに部分的なκシグナル配列及び3’プライマー上にBsiWI部位を含有するPCRプライマーの対を使用した。さらに、TOPOクローンHB1からマウスVH遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にSalI部位を含有するプライマーの対を使用した。NruI及びBsiWI制限酵素を用いてVLPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCkベクター中に連結した。NruI及びSalI制限酵素を用いてVHPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCglベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスVH又はVL遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス12−392−150VH_pBOS−Hクローン4及びシャーガス12−392−150VL pBOS−Lクローン5は、正しいと思われた。
シャーガス12−392−150VH_pBOS−Hクローン1及びシャーガス12−392−150VL_pBOS−Lクローン4の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔(GENE PULSER(R)、Bio−Rad;Hercules,CA)によってCOS7L細胞中への一過性形質移入のために使用した。3日間、5%CO2温置装置中において、37℃で、形質移入された細胞を温置した。4000rpmでの20分間の遠心によって、COS7L細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインAアフィニティーカラム(POROSA;Applied Biosystems; Foster City, CA)を用いて精製した。活性を確認するために、BIACORE(R)装置(Biacore(GE Healthcare);Piscataway, NJ)上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。
安定な形質移入されたCHO細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス12−392−150VH_pBOS−Hクローン1及びシャーガス12−392−150VL_pBOS−Lクローン4を使用した。まず、pBOSベクターからVH−CH及びVL−CL遺伝子を単離するために、SrfI及びNotIを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、pBV又はpJVベクター中にクローニングした。両ベクターはAbbott Bioresearch Center (Worcester, MA)から取得し、抗体遺伝子の発現に必要とされる制御配列を含有していた。SrfI/NotI制限酵素消化によって、得られたpBV及びpJVクローンを分析し、シャーガス 10−745VH_pBVクローン4及びシャーガス12−392−150_pJVクローン1が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいpBV又はpJVクローンの両方をPacI及びAscIで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のpBJプラスミドを形成するために、VH−CH及びVL−CLを含有する得られたDNA断片を連結する。両抗体遺伝子の存在を確認するために、SrfI/NotI消化によって、pBJクローンをスクリーニングした。シャーガス12−392−150Mu−Hu_pBJクローン4に対するプラスミド地図が、図2に示されている。VH遺伝子及びVL遺伝子含有領域の二本鎖ポリヌクレオチド配列(及び隣接配列)が、図3AからCに示されている。
マウスVH及びVL配列の同定
標準的なmRNA抽出プロトコールに従ってmRNAを精製するための約5×106個の細胞を得るために、H−SFM中でハイブリドーマ細胞株HBPep2(実施例2)を培養した。RT−PCR反応のために、マウスIgプライマーの組(Novagen(EMD Biosciences,Inc.)とともに、精製されたmRNAをテンプレートとして使用した。陽性PCR産物が、重鎖(H)プライマーB及びE(HB及びHEクローン)から並びに軽鎖(L)プライマーB、C、D、E、F及びG(LB、LC、LD、LE、LF及びLGクローン)から観察された。全ての陽性PCR産物をゲル精製し、pCRTOPO2.1TAベクター(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドDNAを精製し、適切な大きさの産物を与える各RT−PCR反応に対して、EcoRI消化によって、VH又はVL挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいVH又はVL遺伝子配列を選択した。シャーガスTOPO−TAクローンHE2は正しいVH遺伝子配列を含有し、シャーガスTOPO−TAクローンLG1は正しいVL遺伝子配列を含有した。
TOPOクローンLG1からマウスVL遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にBsiWI部位を含有するPCRプライマーの対を使用した。さらに、TOPOクローンHE2からマウスVH遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にSalI部位を含有するプライマーの対を使用した。NruI及びBsiWI制限酵素を用いてVLPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCkベクター中に連結した。NruI及びSalI制限酵素を用いてVHPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCg1ベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスVH又はVL遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス9−638VH_pBOS−HクローンA2及びシャーガス9−638VL_pBOS−LクローンB6は、正しいと思われた。
シャーガス9−638VH_pBOS−HクローンA2及びシャーガス9−638VL pBOS−LクローンB6の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔(GENE PULSER(R)、Bio−Rad、Hercules、CA)によってCOS7L細胞中への一過性形質移入のために使用した。3日間、5%CO2温置装置中において、37℃で、形質移入された細胞を温置した。4000rpmでの20分間の遠心によって、COS7L細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインAアフィニティーカラム(POROSA;Applied Biosystems)を用いて精製した。活性を確認するために、BIACORE(R)装置(Biacore(GE Healthcare);Piscataway, NJ)上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。親和性は、約2.6nMであった。
安定な形質移入されたCHO細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス9−638VH_pBOS−HクローンA2及びシャーガス9−638VL_pBOS−LクローンB6を使用した。まず、pBOSベクターからVH−CH及びVL−CL遺伝子を単離するために、SrfI及びNotIを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、pBV又はpJVbベクター中にクローニングした。SrfI/NotI制限酵素消化によって、得られたpBV及びpJVクローンを分析し、シャーガス9−638VH_pBVクローン10及びシャーガス9−638_pJVクローン10が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいpBV又はpJVクローンの両方をPacI及びAscIで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のpBJプラスミドを形成するために、VH−CH及びVL−CLを含有する得られたDNA断片を連結した。両抗体遺伝子の存在を確認するために、SrfI/NotI消化によって、pBJクローンをスクリーニングした。シャーガス9−638Mu−Hu_pBJクローン2に対するプラスミドマップが図4に示されている。
マウスVH及びVL配列の同定
標準的なmRNA抽出プロトコールに従ってmRNAを精製するための約5×106個の細胞を得るため、H−SFM中でハイブリドーマ細胞株HBFP10(実施例3)を培養した。RT−PCR反応のために、マウスIgプライマーの組(Novagen(EMD Biosciences,Inc.)とともに、精製されたmRNAをテンプレートとして使用した。陽性PCR産物が、重鎖(H)プライマーBから(HBクローン)並びに軽鎖(L)プライマーB、C及びG(LB、LC及びLGクローン)から観察された。全ての陽性PCR産物をゲル精製し、pCRTOPO2.1TAベクター(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドDNAを精製し、適切な大きさの産物を与える各RT−PCR反応に対して、EcoRI消化によって、VH又はVL挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいVH又はVL遺伝子配列を選択した。シャーガスTOPO−TAクローンHB3は正しいVH遺伝子配列を含有し、シャーガスTOPO−TAクローンLG1は正しいVL遺伝子配列を含有した。
TOPOクローンLG1からマウスVL遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にBsiWI部位を含有するPCRプライマーの対を使用した。さらに、TOPOクローンHB3からマウスVH遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にSalI部位を含有するPCRプライマーの対を使用した。NruI及びBsiWI制限酵素を用いてVLPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCkベクター中に連結した。NruI及びSalI制限酵素を用いてVHPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCg1ベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスVH又はVL遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス10−745VH _pBOS−Hクローン4及びシャーガス10−745VL _pBOS−Lクローン5は、正しいと思われた。
シャーガス10−745VH_pBOS−Hクローン4及びシャーガス10−745VL_pBOS−Lクローン5の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔(GENE PULSER(R)、Bio−Rad)によってCOS7L細胞中への一過性形質移入のために使用した。3日間、5%CO2温置装置中において、37℃で、形質移入された細胞を温置した。4000rpmでの20分間の遠心によって、COS7L細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインAアフィニティーカラム(POROSA;Applied Biosystems)を用いて精製した。活性を確認するために、BIACORE(R)装置(Biacore(GE Healthcare))上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。
安定な形質移入されたCHO細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス10−745VH_pBOS−Hクローン4及びシャーガス10−745VL pBOS−Lクローン5を使用した。まず、pBOSベクターからVH−CH及びVL−CL遺伝子を単離するために、SrfI及びNotIを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、pBV又はpJVベクター中にクローニングした。SrfI/NotI制限酵素消化によって、得られたpBV及びpJVクローンを分析し、シャーガス 10−745VH_pBVクローン1及びシャーガス10−745_pJVクローン1が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいpBV又はpJVクローンの両方をPacI及びAscIで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のpBJプラスミドを形成するために、VH−CH及びVL−CLを含有する得られたDNA断片を連結した。両抗体遺伝子の存在を確認するために、SrfI/NotI消化によって、pBJクローンをスクリーニングした。シャーガス10−745Mu−Hu_pBJクローン1に対するプラスミドマップが図5に示されている。
マウスVH及びVL配列の同定
標準的なmRNA抽出プロトコールに従ってmRNAを精製するための約5×106個の細胞を得るために、H−SFM中でハイブリドーマ細胞株HBFRA(実施例4)を培養する。RT−PCR反応のために、マウスIgプライマーの組(Novagen(EMD Biosciences,Inc.)とともに、精製されたmRNAをテンプレートとして使用する。重鎖(H)プライマー及び軽鎖(L)プライマーから、陽性PCR産物が観察される。全ての陽性PCR産物をゲル精製し、pCRTOPO2.1TAベクター(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中にクローニングする。形質転換された細菌細胞からプラスミドDNAを精製し、適切な大きさの産物を与える各RT−PCR反応に対して、EcoRI消化によって、VH又はVL挿入物を確認する。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいVH又はVL遺伝子配列を選択する。
TOPOからマウスVL遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にBsiWI部位を含有するPCRプライマーの対を使用する。さらに、TOPOクローンからマウスVH遺伝子を増幅するために、5’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びNruI部位並びに3’プライマー上にSalI部位を含有するプライマーの対を使用する。NruI及びBsiWI制限酵素を用いてVLPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCkベクター中に連結する。NruI及びSalI制限酵素を用いてVHPCR産物を消化し、同じ酵素で消化されたpBOS−hCg1ベクター中に連結する。それぞれのベクター(シャーガスVH_pBOS−H及びシャーガスVL_pBOS−L)中のシャーガスVH又はVL遺伝子の何れかの存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。
シャーガスVH_pBOS−H及びシャーガスVL_pBOS−Lの内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔(GENE PULSER(R)、Bio−Rad)又は他の形質移入法によってCOS7L細胞中への一過性形質移入のために使用した。約3日間、5%CO2温置装置中において、37℃で、形質移入された細胞を温置する。4000rpmでの20分間の遠心によって、COS7L細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインAアフィニティーカラム(POROSA;Applied Biosystems; Foster City, CA)を用いて精製する。活性を確認するために、例えば、BIACORE(R)装置(Biacore(GE Healthcare)上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイする。
安定な形質移入されたCHO細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガスVH_pBOS−H及びシャーガスVL_pBOS−Lを使用する。まず、pBOSベクターからVH−CH及びVL−CL遺伝子を単離するために、SrfI及びNotIを使用する。次いで、これらの断片を、それぞれ、pBV又はpJVベクター中にクローニングする。SrfI/NotI制限酵素消化によって、得られたpBV及びpJVクローンを分析し、クローンが正しいことを決定するために配列を決定する。第二に、正しいpBV又はpJVクローンの両方をPacI及びAscIで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のpBJプラスミドを形成するために、得られたVH−CH及びVL−CLを含有する得られたDNA断片を連結する。両抗体遺伝子の存在を確認するために、SrfI/NotI消化によって、pBJクローンをスクリーングし、シャーガスMu−Hu_pBJを得た。
BIAcore2000上の高密度ヤギ抗ヒトIgGFc捕捉バイオセンサーを用いて、速度論/親和性を測定した。まず、10μL/分の流速で5分間、カルボキシメチル−デキストラン6g/L及び6g/LBSAを加えたHBS−EPから構成される走行緩衝液(以下、「走行緩衝液」と称される。)(Fluka)によって、フローセルを平衡化した。次に、それぞれ走行緩衝液中に希釈された組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体、すなわち、9−638−132(TcF及びFP6中のPep2エピトープ)、10−745−140(FP10)及び12−392−150(FP3)を、各フローセル上に注射し、1つのフローセルを参照フローセルとしてブランクとして残し、バイオセンサーによって捕捉した。100μL/分まで緩衝液の流速を増加し、走行緩衝液中の0から100nMまでの様々な濃度の抗原150μLの注入前に、フローセルを10分間洗浄し、続いて、走行緩衝液のみで60から360秒間洗浄した。次いで、100mMH3PO4の33μL注射3回で、抗ヒトIgG捕捉バイオセンサーを再生し、各シャーガス抗原の全ての濃度が2つ組みで検査されるまで上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗原注射に対して結合速度論、会合(ka)及び解離(kd)をモニターし、Scrubber2.0ソフトウェア(BioLogic Software Pty Ltd., Australia)によって、速度論/親和性を測定した。シャーガスTcF抗原内のPep2エピトープとの組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表14に示されている。
BIAcore2000上の高密度抗His4捕捉バイオセンサーを用いて、速度論/親和性を測定した。まず、50μL/分の流速で5分間、1%BSA及び1%Tween20を加えたHBS−EP緩衝液から構成される走行緩衝液(上記実施例9で定義されている。)によって、フローセルを平衡化した。次に、シャーガス抗原(各抗原は、His6タグを含有する。)、すなわち、FP10及びFP3を走行緩衝液中にそれぞれ希釈し、各フローセル上に注入し、1つのフローセルを参照フローセルとしてブランクとして残し、バイオセンサーによって捕捉した。緩衝液流速を100μL/分まで増加させ、走行緩衝液中の0から300nMまでの様々な濃度で、続いて、走行緩衝液単独で、60から360秒間、組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体(すなわち、9−638−132(TcF及びFP6中のPep2エピトープ)、10−745−140(FPlO)及び12−392−150(FP3))のそれぞれの150μLを注射する前に、フローセルを5分間洗浄した。次いで、2.5mMH3PO4が添加されたGentle Ab/Ag Elution Buffer(Pierce)の35μL注射を2回及び5mMH3PO4の25μL注射2回で、抗His4捕捉バイオセンサーを再生し、各キメラ抗シャーガス抗体の全ての濃度が2つ組みで検査されるまで上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗体注射に対して結合速度論、会合(ka)及び解離(kd)をモニターし、Scrubber2.0ソフトウェア(BioLogic Software Pty Ltd., Australia)によって、速度論/親和性を測定した。シャーガスFP10抗原と組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表15に示されている。シャーガスFP3抗原と組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表16に示されている。
BIAcore2000上の高密度ウサギ抗マウスIgG捕捉バイオセンサーを用いて、速度論/親和性を測定した。まず、5μL/分で5分間、1%BSA、1%カルボキシメチル−デキストラン(「走行緩衝液」)(Fluka)及び0.1%Tween20が添加されたHBS−EP緩衝液から構成される走行緩衝液で、フローセルを平衡化した。次に、走行緩衝液中に希釈された各マウス抗シャーガス抗体(すなわち、モノクローナル抗体(mAb)8−367−171(FRA)、9−638−132(TcF及びFP6中のPep2エピトープ)、10−745−140(FP10)及び12−392−150(FP3))を各フローセル上に注射し、バイオセンサーによって捕捉した。60μL/分まで緩衝液の流速を増加し、走行緩衝液中の0から200nMまでの様々な濃度のシャーガス抗原150μLの注入前に、5分間洗浄し、続いて、60から360秒間、走行緩衝液のみで60から360秒間洗浄した。次いで、10μL/分になるように流速を変化させ、次いで、10mMグリシンpH1.7の30μL注入1回で抗マウスIgG捕捉バイオセンサーを再生し、各シャーガス抗原の全ての濃度が2つ組みで検査されるまで、上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗原注射に対して結合速度論、会合(ka)及び解離(kd)をモニターし、Scrubber2.0ソフトウェア(BioLogic Software Pty Ltd., Australia)によって、速度論/親和性を測定した。
Claims (16)
- T.cruzi FP10ポリペプチド(配列番号6)に特異的に結合する1つ以上の抗体を含む免疫診断試薬であって、前記1つ以上の抗体は、以下の(a)〜(c)からなる群から選択される免疫診断試薬、
(a)配列番号18で表されるアミノ酸配列を含むVH領域を有し、かつ
配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むVL領域を有するモノクローナル抗体、
(b)ATCC寄託番号PTA−8140により寄託された細胞株により発現されたキメラ抗体、及び
(c)ATCC寄託番号PTA−8141により寄託された細胞株により発現された抗体。 - 免疫診断試薬が前記抗体の2つ以上を含む、請求項1に記載の免疫診断試薬。
- 1つ以上の抗体のそれぞれが、(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び/又は(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)を有する、請求項1又は2の何れかに記載の免疫診断試薬。
- 配列番号18で表されるアミノ酸配列を含むVH領域及び
配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むVL領域を有する、
モノクローナル抗体を含む請求項1に記載の免疫診断試薬。 - 免疫診断試薬が検出試薬、標準化試薬及び陽性対照試薬からなる群から選択される試薬である、請求項1から4の何れかに記載の免疫診断試薬。
- T.cruziポリペプチドであるFP10(配列番号6)に特異的に結合する抗体であって、該抗体は以下の(a)〜(c)からなる群から選択される抗体、
(a)配列番号18で表されるアミノ酸配列を含むVH領域を有し、かつ
配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むVL領域を有する、モノクローナル抗体、
(b)ATCC寄託番号PTA−8140により寄託された細胞株により発現されたキメラ抗体、及び
(c)ATCC寄託番号PTA−8141により寄託された細胞株により発現された抗体。 - 1つ以上の抗体のそれぞれが、(a)約5.0×104M−1s−1から約3.0×105M−1s−1の間の会合速度定数(ka)、(b)約1.0×10−4s−1から約8.0×10−4s−1の間の解離速度定数(kd)及び/又は(c)約3.3×10−10Mから約1.6×10−8Mの間の平衡解離定数(KD)を有する、請求項6に記載の抗体。
- T.cruziポリペプチドに特異的に結合するキメラ抗体を発現する細胞株であって、前記細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにATCC寄託番号PTA−8140により寄託された細胞株。
- T.cruziポリペプチドに特異的に結合する抗体を発現する細胞株であって、前記細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにATCC寄託番号PTA−8141により寄託された細胞株。
- 請求項1に記載の免疫診断試薬を感度パネルとして使用することを含む、T.cruzi検出アッセイを標準化する方法。
- T.cruziポリペプチドFP10(配列番号6)を検出するための方法であって、
(a)キメラ抗体:抗原複合体の形成を可能とする条件下で、T.cruziポリペプチドFP10(配列番号6)を含有すると疑われる検査試料を請求項1に記載の免疫診断試薬と接触させる工程;及び
(b)前記T.cruziポリペプチドFP10(配列番号6)の存在の指標として形成された何れかのキメラ抗体:抗原複合体を検出する工程
を含む、方法。 - キメラ抗体が検出可能な標識を含む、請求項11の方法。
- 抗体:抗原複合体が二次抗体又はその断片と接触され、前記二次抗体又はその断片が検出可能な標識を含む、請求項11の方法。
- T.cruzi抗体を検出するための方法であって、
a)T.cruzi抗体を含有すると疑われる検査試料を、(a)T.cruzi抗体に対して特異的な1つ以上のT.cruzi抗原及び(b)抗原:抗体複合体の形成を可能とする条件下で、請求項1に記載の免疫診断試薬、
と接触させる工程、及び
b)前記T.cruzi抗原の存在の指標として形成された何れかの抗原:抗体複合体を検出する工程
を含み、免疫診断試薬は、陽性対照又は標準化試薬であるT.cruzi抗体を検出するための方法。 - 請求項1の免疫診断試薬及び使用説明書を含む、T.cruziを検出するための診断キット。
- T.cruziポリペプチドであるFP10(配列番号6)に特異的に結合するモノクローナル抗体の抗原結合部分を含む単離されたポリペプチドであって、
該単離されたポリペプチドは、
配列番号18で表されるアミノ酸配列を含むVH領域及び
配列番号20で表されるアミノ酸配列を含むVL領域を有する、
単離されたポリペプチド。
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