JP6450680B2

JP6450680B2 - 高靱性シルク繊維を作製する方法

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Publication number: JP6450680B2
Application number: JP2015530390A
Authority: JP
Inventors: シャイベル，トマス; ライマー，アクセル; レーマー，リン; アイゾルト，ルーカス; ハイデブレヒト，アニエラ; ジェファーズ，マーサ
Original assignee: アーエムシルクゲーエムベーハー
Priority date: 2012-09-06
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2019-01-09
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: US20190062557A1; WO2014037453A1; US11248120B2; JP2015532690A; US10072152B2; US20150284565A1; EP2892916A1; EP2892916B1

Description

本発明は、高靱性繊維を作製するのに適したシルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する方法と、このようにして作製されたシルクタンパク質紡糸ドープ溶液と、該シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を用いて繊維を作製する方法とに関するものである。

シルクは、カイコガ及びカイコ（鱗翅目）、ハナバチ、カリバチ及びアリ（膜翅目）、並びにクモ（節足動物）等の多様な種から自然に作られる素晴らしい素材である。それぞれの種のシルクは独自の特性群を備えている。

例えばカイコガ（ボンビックス・モリ（Bombyx mori））のシルクは、その軽量さ、柔らかい手触り、及び豪華な見た目からファッション用の布地として理想的に適している。他の種のシルク、特にスパイダーシルクは更に高い靭性及び引張強度、並びにより良好な耐薬品性、すなわち産業上非常に興味深い特性を備えているが、これまでに市販されてはいない。クモは様々な種類のシルクを産生することができ、それらは全て自然が要求する特定要件に完全に適合するものである。円網を張るクモ（Orb-web-spinning spiders）は、自然界において類を見ない機械的特性を備えることで、現代技術によって作製された多くの合成繊維を圧倒するシルク繊維を産生する（非特許文献1）。

クモの網は、いくつかの特殊なタイプのシルク繊維間の相互作用により、例えば捕食の衝撃により生じる強い変形に耐えることができる。ドラグライン（又は大瓶状腺）シルクは網の枠糸及び縦糸を構築するものであり、脱出の際のクモの命綱としての働きがある。より弾性のある鞭状腺（Flagelliform）シルクは網の横糸（capture spiral）を構成する。他のシルクは、再生に又はとりわけ接着物質として関与するものである（非特許文献1）。

クモは水溶液、周囲温度を用いて、低いエネルギー消費を伴う環境に優しい条件下で高性能ポリマー材料を産生することが可能である。しかしながら、単純に見える自然の糸形成及び網構築プロセスに関する複雑な機構は、未だ理解されておらず、そのため容易には再現することができない。

実験室規模でこの紡糸プロセスを模倣する試みが数多く為されており、大きな進歩を遂げているが、依然天然のドラグライン繊維の機械的特性は類を見ないものである。

商用繊維を生産するには、自然のシルク紡糸プロセスを模倣するか、又は全く新しい紡糸プロセスを開発しなければならない。商業的に実現可能とするには、いずれのプロセスもコスト効率が高く、環境に優しいものにしなければならない。

合成シルク繊維の機械的特性に関するデータは文献にはほとんど見ることができない。ほとんどの紡糸プロセスでは、機械的特性を適切に測定することができないような脆弱な繊維しか作製されないか、又は得られる繊維は乾燥若しくは保管の際に性能を喪失する（lose）。

しかしながらこれらの研究により、シルクタンパク質を紡糸するのに鍵となる有用な手掛かりがいくつか得られている。例えば、Xia et al. (2010)（非特許文献2）の報告によると、より高分子量のタンパク質からより安定な繊維が作製される。非特許文献2では、ネフィラ・クラビペス（Nephila clavipes：アメリカジョロウグモ）のクモに由来する組換えタンパク質を生成し、天然のシルクに近い機械的特性を示す繊維へと紡糸した。しかしながら、このような靭性は超高分子量のタンパク質でしか得られなかった。分子量がほぼ300 kDaの組換えスパイダーシルクタンパク質については、141 MJ/m³という靭性を呈する繊維が得られた。より低い分子量では、靭性は天然シルクにははるかに及ばなかった。これらの影響は、報告にあるように特に水性系においてタンパク質を高濃度に保持することが難しいためであり得る。

いくつかの因子の正しい組合せが、紡糸繊維の機械的特性を大きく改善させると考えられている。しかしながら、様々な有望なアプローチがあるにも関わらず、天然ドラグライン繊維の機械的特性は今までに再現されてはいない。

本発明の発明者らは驚くべきことに、スパイダーシルクポリペプチド等の自己集合ポリペプチドのためのシルクタンパク質紡糸ドープ水溶液を作製する方法を見つけた。このドープ液の紡糸により、靱性が非常に高い繊維が得られ、その靭性は分子量とともに増大する傾向にはあるが、あらゆる分子量においてXia et. al（非特許文献2）により開示された方法に従って作製されたシルク繊維の靭性より優れている。このため本発明の方法は溶液中での特有のシルクタンパク質の形成を初めて可能にし、これまでに報告されたものよりもはるかに良好な靭性を備える繊維がもたらされる。

Slotta et al. (2012)Chemical engineering process 108, 34-49 PNAS 107: 14059-14063

第1の態様では、本発明は、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する方法であって、
（a）少なくとも1つのシルクタンパク質と、シルクタンパク質変性濃度のタンパク質変性剤又はタンパク質変性剤の混合物とを含む水溶液を準備する工程であって、該溶液中の該シルクタンパク質の総濃度が20% w/v未満である、工程と、
（b）タンパク質変性剤の濃度を8分の1〜14分の1に低下させる工程と、
（c）タンパク質変性剤の濃度を1.5分の1〜3分の1に低下させる工程と、
（d）溶液中のシルクタンパク質を工程（a）における該シルクタンパク質の濃度に比べて少なくとも1.5倍濃縮して、少なくとも10% w/vの濃度にすることにより、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する工程と、
を含む、方法に関する。

第2の態様では、本発明は、繊維を作製する方法であって、
（a）本発明の方法により作製可能なシルク紡糸ドープ溶液を準備する工程と、
（b）シルクタンパク質紡糸ドープ溶液からの引き抜き又は該シルクタンパク質紡糸ドープ溶液の押し出し又はそれらの組合せにより繊維を作製する工程と、
を含む、方法に関する。

第3の態様では、本発明は、本発明の方法により作製可能な紡糸ドープ溶液に関する。

第4の態様では、本発明は、本発明の方法により作製可能な繊維に関する。

第5の態様では、本発明は、少なくとも1つのシルクタンパク質を含む繊維であって、該繊維の材料の少なくとも10重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であり、該シルクタンパク質のモノマー（複数の場合もあり）の分子量が20 kDa〜600 kDaの範囲であり、該繊維の靭性（MJ/m³）が、該シルクタンパク質の分子量が少なくとも最大300kDaである場合、該シルクタンパク質の分子量（kDa単位）と少なくとも1.0の因数との積であり、分子量が300 kDaを超えるタンパク質の場合、少なくとも300 MJ/m³である、繊維に関する。

本発明を下記に詳細に説明する前に、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬は変更することができるため、本発明がこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することを目的とするものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。他に定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPACRecommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995）, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載のように定義される。

いくつかの文献が本明細書の文章全体を通して引用される。本明細書に引用される各々の文献（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書、GenBankアクセッション番号配列寄託等の全てを含む）は、上記又は下記を問わず、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本明細書中のいずれの記載も、本発明が先行発明のためにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。

下記で本発明の要素を記載する。これらの要素は特定の実施形態とともに挙げられているが、更なる実施形態を作成するのに、これらの要素をどのような方法及びどのような数でも組み合わせることができることを理解されたい。多様に記載された実施例及び好ましい実施形態は、本発明を例示的に記載された実施形態のみに限定するものとは解釈されない。本明細書は例示的に記載された実施形態と、あらゆる数の開示された及び／又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を支持及び包含するものであると理解されたい。さらに文脈上他に指定のない限り、本明細書において記載された全ての要素のあらゆる並び替え（permutations）及び組合せが本出願の明細書により開示されていると見なされる。

本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」という語は（the word "comprise", and variations such as"comprises" and "comprising"）、提示の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するものと理解される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形（thesingular forms "a," "an," and "the"）は、文脈上他に明確に示されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

2つ以上のポリペプチドにおける残基が、該残基がポリペプチド構造において類似の位置を占有している場合、互いに「対応している」といえる。2つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造的類似性に基づきポリペプチド配列をアラインメントすることにより決定することができることが当該技術分野において知られている。このようなアラインメントツールは、当業者に知られており、例えばワールドワイドウェブ、例えばClustalW（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はAlign（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）にて、標準的な設定、好ましくはAlign EMBOSSの場合、needle、Matrix: Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5を用いて得ることができる。

他に指定のない限り、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書において区別なく使用され、長さ又は翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。

「繊維」という用語は連続フィラメントであるか又は別々に伸びたシルクタンパク質を含む材料群を表す。

「靭性」という用語はMJ/m³を測定単位とする繊維の特性を表す。繊維の靭性の測定方法は当該技術分野において知られている。靭性は例えば記載のように測定することができる。

上述のように、本発明の発明者らは驚くべきことに、変性シルクタンパク質溶液が、制御された固有の段階的な形で再生されるとともに適切に濃縮される場合に、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液をもたらし、該溶液中においてタンパク質が、可溶化したシルクタンパク質の集合体が繊維を形成するのを促す状態にあると考えられることを見出した。このことは、本発明者らが本発明の方法により作製されたシルクタンパク質紡糸ドープ溶液を用いた場合にのみ、これまでにない靭性のシルク繊維の作製に成功したという事実により裏付けられる。したがって、第1の態様では、本発明は、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する方法であって、
（a）少なくとも1つのシルクタンパク質と、シルクタンパク質変性濃度のタンパク質変性剤又はタンパク質変性剤の混合物とを含む水溶液を準備する工程であって、該溶液中の該シルクタンパク質の総濃度が20% w/v未満である、工程と、
（b）タンパク質変性剤の濃度を8分の1〜14分の1に低下させる工程と、
（c）タンパク質変性剤の濃度を1.5分の1〜3分の1に低下させる工程と、
（d）溶液中のシルクタンパク質を工程（a）における該シルクタンパク質の濃度に比べて少なくとも1.5倍濃縮して、少なくとも10% w/vの濃度にすることにより、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する工程と、
を含む、方法を提供する。

カイコ（例えばボンビックス・モリ）若しくはクモのシルク繊維において自然に生じるようなシルクタンパク質、又は組換えにより生成されるシルクタンパク質を使用することが可能であり、組換えにより生成されるタンパク質は、例えば細菌細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（S. pombe：分裂酵母）、又は昆虫細胞、例えばSf9細胞若しくはHi5細胞を含む好適な宿主系において生成することができる。本発明の方法に使用されるシルクタンパク質は、スパイダーシルクタンパク質、昆虫シルクタンパク質若しくはムッセル・ビスサス（mussel byssus）シルクタンパク質、又はそれらの変異体とすることができ、シルクタンパク質はスパイダーシルクタンパク質であるのが好ましい。2つ以上のシルクタンパク質の混合物を使用することも企図される。代替的には、他のポリマー及び／又は繊維成分を工程（a）、工程（b）、工程（c）及び／又は工程（d）の水溶液に添加することが可能である。このようなポリマーの例としては、ポリアミド、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート（polyacrylate）、ポリアラミド、ポリ乳酸（PLA）、ポリプロピレン、ポリラクテート（polylactate）、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、キサンタン、セルロース、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、ケラチン、綿、羊毛、又はそれらの混合物、及びそれらから作られた繊維が挙げられる。

別のポリマーをシルクタンパク質（複数の場合もあり）に添加する実施形態において、他のポリマーも工程（a）、工程（b）、工程（c）又は工程（d）の水溶液に可溶性であることが好ましい。シルクタンパク質紡糸ドープ溶液における繊維を形成する材料の少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%又は100重量%がシルクタンパク質であることがより好ましい。

別のポリマーをシルクタンパク質（複数の場合もあり）に添加する実施形態において、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液が、少なくとも5重量%、少なくとも10重量%、少なくとも15重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%若しくは少なくとも50重量%、及び／又は50重量%未満、40重量%未満、30重量%未満、20重量%未満若しくは10重量%未満の他のポリマーを含むことが好ましい。そのため、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液における他のタンパク質の含有量は5重量%〜50重量%、5重量%〜30重量%、又は5重量%〜20重量%の範囲であることが特に好ましい。

スパイダーシルクタンパク質は、好ましくは円網を張るクモのドラグラインポリペプチド等の大瓶状腺シルクポリペプチド、小瓶状腺シルクポリペプチド、又は鞭状腺シルクポリペプチドであるのが好ましい。

好ましい円網を張るクモは、アラネウス・ディアデマツス（Araneus diadematus：ニワオニグモ）、ジョロウグモ属の一種、詳細にはネフィラ・クラビペス、ネフィラ・セネガレンシス（Nephila senegalensis：アフリカジョロウグモ）及びネフィラ・エデュリス（Nephila edulis：ショクヨウジョロウグモ）、並びにラトロデクツス・ヘスペルス（Latrodectus hesperus：クロゴケグモ）を含む。好ましい昆虫は、鱗翅目、詳細にはボンビックス・モリ等のカイコガ科、又は膜翅目、詳細にはアントフィラ（Anthophila：ハナバチ）等のミツバチ上科の昆虫を含む。

例えばサイズを縮小し、アミノ酸組成を最適化することにより、異種宿主における発現及び繊維を形成する特性に合わせて最適化されたこのような自然発生的なシルクタンパク質の変異体を使用することが好ましい。このような変異体は自然発生的な反復単位を含むことを特徴とするのが好ましい。さらにこのようなシルクタンパク質又はその変異体は自己集合性であることが好ましい。自己集合性タンパク質には、秩序だったマクロ構造、例えばフィブリル又は繊維を形成する能力がある。これに対して、タンパク質の凝集は一般に、無秩序な非晶質構造を形成する。自己集合能は、例えば光散乱及びX線回折の測定により評価することができる。当業者はタンパク質凝集体と集合化タンパク質の秩序だった構造とを識別する方法に精通している。そのため、自己集合することが可能な天然タンパク質の変異体を同定しようと試みる当業者には、下記により詳細に記載される境界内においてタンパク質に1つ又は複数の変異、例えば欠失、突然変異又は付加を導入し、形成される構造が、光散乱及びX線により求められるような自己集合プロセスにより引き起こされる配向特性及び秩序化特性を備えているかを調べることが必要とされる。これらの測定はシルクタンパク質ドープ溶液から引き抜いた繊維で行うのが好ましく、該溶液は下記でより詳細に記載されるように作製することができる。

シルクタンパク質又はその変異体が、少なくとも20 kDaの分子量を有し、各々:
（a）GPGXX（配列番号3）（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される）、
（b）GGX（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択される）、及び、
（c）A_x（ここで、xは5〜10の整数である）、
からなる群から選択される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む少なくとも2つの反復単位を含むことが好ましい。

「反復単位」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列において、自然発生的なシルクポリペプチド（例えばMaSpI、ADF-3、ADF-4又はFlag）内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフ（例えばAAAAAA（配列番号13）又はGPGQQ（配列番号4））を含むか若しくはそれからなる領域（すなわち同一のアミノ酸配列）、又はそれらと実質的に類似するアミノ酸配列（すなわち変異アミノ酸配列）に対応する領域を表す。これに関連して、「実質的に類似する」は、好ましくはそれぞれの基準となる自然発生的なアミノ酸配列の全長に対する少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は更には99.9%のアミノ酸同一性の程度を意味する。

自然発生的なシルクポリペプチド内において対応するアミノ酸配列と「実質的に類似する」アミノ酸配列を有する「反復単位」（すなわち野生型反復単位）はその機能的特性に関しても類似している。例えば「実質的に類似する反復単位」を含むシルクポリペプチドにも繊維を形成する能力がある。当業者であれば、実験の項に記載されるようなシルクタンパク質紡糸ドープ溶液を作製する方法及びこのような紡糸ドープ液を用いて繊維を形成する方法の記載に従って、「実質的に類似する反復単位」を含むシルクポリペプチドも繊維を形成することが可能であるかを容易に評価することができる。

自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列と「同一の」アミノ酸配列を有する「反復単位」は例えば、MaSp I（配列番号43）、MaSp II（配列番号44）、ADF-3（配列番号1）及び／又はADF-4（配列番号2）の1つ又は複数のペプチドモチーフに対応するシルクポリペプチドの一部とすることができる。自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ酸配列と「実質的に類似する」アミノ酸配列を有する「反復単位」は例えば、MaSpI（配列番号43）、MaSpII（配列番号44）、ADF-3（配列番号1）及び／又はADF-4（配列番号2）の1つ又は複数のペプチドモチーフに対応するが、特定のアミノ酸位置（複数の場合もあり）に1つ又は複数のアミノ酸置換を有するシルクポリペプチドの一部とすることができる。

本明細書で使用される場合、「反復単位」という用語には、自然発生的なシルクポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に存在すると一般的に考えられている非反復の親水性アミノ酸ドメインは含まれない。

本明細書で使用される場合、「反復単位」という用語は好ましくは、3アミノ酸〜200アミノ酸又は5アミノ酸〜150アミノ酸の長さ、好ましくは10アミノ酸〜100アミノ酸の長さ又は15アミノ酸〜80アミノ酸の長さ、より好ましくは18アミノ酸〜60アミノ酸又は20アミノ酸〜40アミノ酸の長さのアミノ酸配列を表す。例えば、本発明による反復単位は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、又は200アミノ酸の長さを有することができる。本発明による反復単位は、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、24、27、28、30、34、35、又は39個のアミノ酸からなるのがより好ましい。特に好ましい実施形態では、シルクタンパク質は、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは100%の1つの同一な反復単位の複数のコピー（例えばA₂、Q₆、又はC₁₆（ここでの2、6、又は16の数字は反復単位の数を表す））又は2つ以上の異なる反復単位の複数のコピー（例えば(AQ)₂₄又は(AQ)₁₂C₁₆）を含むか又はそれらからなる。上記シルクポリペプチドは、上記タンパク質の検出又は精製を容易にするために人工タグ（例えばT7タグ又はHisタグ）を加えることにより更に修飾することができる。

シルクポリペプチドの反復単位は、当業者に既知の自然発生的なシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる任意の領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものとすることができる。シルクポリペプチドの反復単位は、節足動物シルクポリペプチド、より好ましくはスパイダーシルクポリペプチド又は昆虫シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるのが好ましい。シルクポリペプチドの反復単位は、イガイシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものとすることもできる。

スパイダーシルク反復単位は、ドラグラインシルクポリペプチド等の自然発生的な大瓶状腺シルクポリペプチド（MaSp）、小瓶状腺シルクポリペプチド（MiSp）、又は鞭状腺（FLAG）シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなることが好ましい。反復単位は、自然発生的なドラグラインシルクポリペプチド又は鞭状腺シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるのが最も好ましい。

さらに昆虫シルク反復単位は、鱗翅目の昆虫の自然発生的なシルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなることが好ましい。より好ましくは、昆虫シルク反復単位は、カイコガ科の昆虫の、最も好ましくはボンビックス・モリの自然発生的な昆虫シルクポリペプチド内で繰り返し生じる少なくとも1つのペプチドモチーフを含むか又はそれからなる領域のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

本明細書で使用される場合、「コンセンサス配列」という用語は、或る特定の位置に高頻度で生じるアミノ酸（例えば「G」）を含有するアミノ酸配列を表すものであり、ここでは更に決定されていない他のアミノ酸は置換子（place holder）「X」で置き換えられている。

シルクタンパク質は、2個〜100個の反復単位、すなわち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、又はそれ以上の反復単位を含むのが好ましい。シルクタンパク質における反復単位同士は同じであっても又は異なっていてもよい。同じ反復単位を1つのシルクタンパク質において、少なくとも2回、好ましくは3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、21回、22回、23回、又は24回用いることが好ましい。反復単位の長さが増大すると、得られる繊維の靭性が増大することが確認されている。したがって、シルクタンパク質のモノマーの分子量は、10 kDa〜600 kDa、すなわち少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100 kDa、又は600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160若しくは150 kDa未満であるのが好ましい。そのためこの分子量は、40 kDa〜300 kDa、より好ましくは40 kDa〜200 kDa、より好ましくは60 kDa〜200 kDa、より好ましくは80 kDa〜180 kDa、更により好ましくは100 kDa〜150 kDaの範囲であることが特に好ましい。

シルクタンパク質が反復単位のみからなる場合、シルクタンパク質の分子量は上記に概説されるとおりとなる。シルクタンパク質が更なるアミノ酸配列、例えば非反復単位及び／又は反復単位に介在する配列、例えばリンカーを含む場合、シルクタンパク質の分子量は大きくなる。シルクタンパク質内の反復単位の分子量の場合と同様に、シルクタンパク質の全体の分子量により、得られる繊維の靭性が改善されることが見出されている。したがって、更なるアミノ酸配列、好ましくは1個若しくは複数の非反復単位及び／又は反復単位に介在する配列を含むシルクタンパク質のモノマーの分子量は、20 kDa〜600 kDa, すなわち少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100 kDa、又は600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160若しくは150 kDa未満であることが好ましい。そのためこの分子量は、40 kDa〜300 kDa、より好ましくは40 kDa〜200 kDa、より好ましくは60 kDa〜200 kDa、より好ましくは80 kDa〜180 kDa、更により好ましくは100 kDa〜150 kDaの範囲であることが特に好ましい。

繰返し（ペプチド）モチーフGPGXX（配列番号3）及びGGX、すなわちグリシンリッチモチーフは、シルクポリペプチド、ひいては該モチーフを含有するシルクタンパク質から作られた糸に柔軟性を与える。詳細には、繰返しGPGXX（配列番号3）モチーフは、β−ターンスパイラル構造を形成し、シルクポリペプチドに弾性を与える。大瓶状腺シルクポリペプチド及び鞭状腺シルクポリペプチドはともにGPGXX（配列番号3）モチーフを含む。繰返しGGXモチーフは1つのターン当たり3つのアミノ酸を有するヘリカル構造に関連付けられ、ほとんどのスパイダーシルクに見られる。GGXモチーフはシルクに更なる弾性を与えることができる。繰返しポリアラニンA_x（ペプチド）モチーフはシルクポリペプチドに強度を与える結晶性β−シート構造を形成する（国際公開第03/057727号）。GGRPSDTYG（配列番号18）及びGGRPSSSYG（配列番号19）（ペプチド）モチーフはレジリンから選択されている（国際公開第08/155304号）。レジリンはほとんどの節足動物（節足動物門）に見られる弾性タンパク質である。レジリンはクチクラ層（cuticle）の特定領域に位置しており、低剛性及び高強度を与える（Elvin etal., Nature (473): 999-1002, 2005）。

好ましい反復単位は、1つのA_x（ここでxは5〜10の整数、すなわち5、6、7、8、9、又は10、好ましくは8である）と、1つのGPGXX（配列番号3）（ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P、及びQから選択され、より好ましくはそれぞれQである）とを含む。別の好ましい反復単位は、少なくとも2個、3個、又は4個、好ましくは少なくとも4個のコンセンサス配列GPGXX（配列番号3）（ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P、及びQから選択される）を含むか又はそれからなる。XはそれぞれQであるのが好ましい。

そのため本発明の好ましい実施形態では、シルクポリペプチドは、GPGAS（配列番号5）、GPGSG（配列番号6）、GPGGY（配列番号7）、GPGGP（配列番号8）、GPGGA（配列番号9）、GPGQQ（配列番号4）、GPGGG（配列番号10）、GPGQG（配列番号40）、及びGPGGS（配列番号11）からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、又は9個）、好ましくは1個含む複数の反復単位を含むか又はそれらからなる。本発明の更に好ましい実施形態では、シルクポリペプチドは、GGY、GGP、GGA、GGR、GGS、GGT、GGN、及びGGQからなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、又は8個）、好ましくは1個含む複数の反復単位を含むか又はそれらからなる。本発明の更に好ましい実施形態では、シルクポリペプチドは、AAAAA（配列番号12）、AAAAAA（配列番号13）、AAAAAAA（配列番号14）、AAAAAAAA（配列番号15）、AAAAAAAAA（配列番号16）、及びAAAAAAAAAA（配列番号17）からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、又は6個）、好ましくは1個含む複数の反復単位を含むか又はそれらからなる。

本発明の別の好ましい実施形態では、シルクポリペプチドは、GPGAS（配列番号5）、GPGSG（配列番号6）、GPGGY（配列番号7）、GPGGP（配列番号8）、GPGGA（配列番号9）、GPGQQ（配列番号4）、GPGGG（配列番号10）、GPGQG（配列番号40）、GPGGS（配列番号11）、GGY、GGP、GGA、GGR、GGS、GGT、GGN、GGQ、AAAAA（配列番号12）、AAAAAA（配列番号13）、AAAAAAA（配列番号14）、AAAAAAAA（配列番号15）、AAAAAAAAA（配列番号16）、AAAAAAAAAA（配列番号17）、GGRPSDTYG（配列番号18）、及びGGRPSSSYG（配列番号19）からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ少なくとも1個（例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、又は25個）、好ましくは1個含む複数の反復単位を含むか又はそれらからなる。

最も好ましくは、シルクポリペプチドは、下記のものを含むか又はそれからなる反復単位を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる：
i）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGAS（配列番号5）、AAAAAA（配列番号13）、GGY、及びGPGSG（配列番号6）、
ii）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA（配列番号15）、GPGGY（配列番号7）、GPGGY（配列番号7）、及びGPGGP（配列番号8）、
iii）アミノ酸配列としてのGPGQQ（配列番号4）、GPGQQ（配列番号4）、GPGQQ（配列番号4）、及びGPGQQ（配列番号4）、
iv）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGGA（配列番号9）、GGP、GPGGA（配列番号9）、GGP、GPGGA（配列番号9）、及びGGP、
v）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA（配列番号15）、GPGQG（配列番号40）、及びGGR、
vi）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのAAAAAAAA（配列番号15）、GPGGG（配列番号10）、GGR、GGN、及びGGR、
vii）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGGA、GGA、GGA、GGS、GGA、及びGGS、及び／又は、
viii）アミノ酸配列としての好ましくは下記順番でのGPGGA（配列番号9）、GPGGY（配列番号7）、GPGGS（配列番号11）、GPGGY（配列番号7）、GPGGS（配列番号11）、及びGPGGY（配列番号7）。

このため好ましい実施形態では、シルクポリペプチドの反復単位は、モジュールA:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ（配列番号20）、モジュールC:GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP（配列番号21）、モジュールQ:GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ（配列番号22）、モジュールS:PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG（配列番号25）、モジュールR:SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG（配列番号26）、又はそれらの変異体からなる。

シルクタンパク質は、これらのモジュールの1つだけ又はそれらの組合せの複合リピートを含むことができる。好ましい組合せは下記のような特徴を有する（反復単位はN末端からC末端の順に並んでいる）:XY（ここでX及びYは独立して、A、C、Q、R及びS、又はそれらの変異体から選択され、互いに異なるものである、すなわちXとYとが同時にCとはならない）。互いに組み合わせられた好ましい組合せは、CA、AC、CQ、QC、CS、SC、CR、RC、SR、RS、AQ、QA、AS、SA、AR、RA、QS、SQ、QR、RQ、SR、及びRSである。更に好ましい組合せでは、3つの反復単位ブロックが形成され、下記の構成スキームに従うものである:XYZ（ここでX及びYは独立して、A、C、Q、R及びS、又はそれらの変異体から選択され、互いに異なるものであり、Zは独立してA、C、Q、R及びS、又はそれらの変異体から選択され、好ましくはXと同一である）。互いに組み合わせられた好ましい組合せは、CAA、CAC、CAQ、CAR、CAS、ACA、ACC、ACQ、ACR、ACS、CQA、CQC、CQQ、CQR、CQS、QCA、QCC、QCQ、QCR、QCS、CSA；CSC、CSQ、CSR、CSS、SCA、SCC、SCQ、SCR、SCS、CRA、CRC、CRQ、CRR、CRS、RCA、RCC、RCQ、RCR、RCS、SRA、SRC、SRQ、SRR、SRS、RSA、RSC、RSQ、RSR、RSS、AQA、AQC、AQQ、AQR、AQS、QAA、QAC、QAQ、QAR、QAS、ASA；ASC、ASQ、ASR、ASS、SAA、SAC、SAQ、SAR、SAS、ARA、ARC、ARQ、ARR；ARS、RAA、RAC、RAQ、RAR、RAS、QSA、QSC、QSQ、QSR、QSS、SQA、SQC、SQQ、SQR、SQS、QRA、QRC、QRQ、QRR、QRS、RQA、RQC、RQQ、RQR、RQS、SRA、SRC、SRQ、SRE、SRS、RSA、RSC、RSQ、RSR、及びRSSである。それぞれの場合で反復単位の1つを、それぞれ示された反復単位の変異体とすることが可能であることに留意されたい。したがって、本発明の方法に使用されるシルクタンパク質に含まれる好ましい反復単位は、一般構造X_m、XY_n、又はXYZ_o（ここで、mは4〜100、すなわち4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、又はそれ以上であり、nは2〜60、すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60であり、oは2〜40、すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、及び40である）に従うものである。

「互いに組み合わせられた」又は「互いに連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、モジュール（反復単位）が互いに直接組み合わされているか若しくは連結されていることを意味するか、又はモジュール（反復単位）が1つ若しくは複数のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わされているか若しくは連結されていることを意味する。そのため一実施形態において、シルクポリペプチドに含まれるモジュール（反復単位）は互いに直接組み合わされているか又は連結されている。別の実施形態では、シルクポリペプチドに含まれるモジュール（反復単位）は1つ又は複数のスペーサーアミノ酸を介して、好ましくは1個〜25個又は1個〜20個のスペーサーアミノ酸を介して、より好ましくは1個〜15個又は1個〜10個のスペーサーアミノ酸を介して、最も好ましくは1個〜5個のスペーサーアミノ酸を介して、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、又は25個のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わされているか又は連結されている。上記スペーサーアミノ酸はタンパク質における自然発生的な任意のアミノ酸とすることができる。上記スペーサーアミノ酸はプロリンではないのが好ましい。スペーサーアミノ酸は帯電基（複数の場合もあり）を含有することが好ましい。帯電基（複数の場合もあり）を含有するスペーサーアミノ酸は独立して、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン及びリジンからなる群から選択されるのが好ましい。上記スペーサーアミノ酸は、シルクポリペプチドの繊維を形成する能力にマイナスの影響を与えないアミノ酸とすべきである。さらに上記スペーサーアミノ酸は、立体障害を引き起こさないアミノ酸、例えばリジン及びシステイン等のサイズの小さいアミノ酸とすべきである。より好ましい実施形態では、シルクポリペプチドは、互いに直接組み合わされているモジュールと、1個〜25個又は1個〜20個のスペーサーアミノ酸を介して、より好ましくは1個〜15個又は1個〜10個のスペーサーアミノ酸を介して、最も好ましくは1個〜5個のスペーサーアミノ酸を介して、例えば2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、又は25個のスペーサーアミノ酸を介して互いに組み合わされているモジュールとを含む。

モジュールA、C、Q、S、又はR変異体は、基準となる（野生型）モジュールA、C、Q、S、又はRとは異なるものであり、基準となるモジュールからアミノ酸配列における最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又は15個のアミノ酸の変化（すなわち置換、付加、挿入、欠失、N末端切断及び／又はC末端切断）により誘導される。このようなモジュール変異体は、代替的に又は付加的に変異体の誘導元である基準となる（野生型）モジュールに対する或る程度の配列同一性を特徴とすることができる。そのため、モジュールA、C、Q、S、又はR変異体は、上記のそれぞれの基準となる（野生型）モジュールA、C、Q、S、又はRに対する少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は更には99.9%の配列同一性を有する。配列同一性は、少なくとも10、15、18、20、24、27、28、30、34、35、又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチに対するもの、好ましくはそれぞれの基準となる（野生型）モジュールA、C、Q、S、又はRの全長に対するものであるのが好ましい。

配列同一性は、それぞれの基準となる（野生型）モジュールA、C、Q、S、又はRの全長に対して少なくとも80%、全長に対して少なくとも85%、全長に対して少なくとも90%、全長に対して少なくとも95%、全長に対して少なくとも98%、又は全長に対して少なくとも99%であることが特に好ましい。配列同一性は、それぞれの基準となる（野生型）モジュールA、C、Q、S又はRの少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも80%、少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも85%、少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも90%、少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも95%、少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも98%、又は少なくとも10、15、18、20、24、28若しくは30アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも99%であることが更に特に好ましい。

モジュールA、C、Q、S、又はRのフラグメント（又は欠失変異体）は、そのN末端及び／又はそのC末端に最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15アミノ酸の欠失を有するのが好ましい。欠失は内在性のものであってもよい。

さらに、モジュールA、C、Q、S、又はR変異体又はフラグメントは、該変異体又はフラグメントの元となるアミノ酸配列に対する修飾がシルクポリペプチドの自己集合能にマイナスの影響を与えない場合にのみ、本発明の文脈中においてモジュールA、C、Q、S、又はR変異体又はフラグメントと見なされる。当業者であれば、例えば光散乱及び／又はX線回折の測定によりシルクポリペプチドが自己集合するかを容易に評価することができる。

反復単位は独立して、モジュールA^C（配列番号29）、モジュールA^K（配列番号30）、モジュールC^C（配列番号31）、モジュールC^K1（配列番号32）、モジュールC^K2（配列番号33）、又はモジュールC^KC（配列番号34）から選択されることがより好ましい。モジュールA^C（配列番号29）、A^K（配列番号30）、C^C（配列番号31）、C^K1（配列番号32）、C^K2（配列番号33）及びC^KC（配列番号34）は、アラネウス・ディアデマツスのクモのADF-3のアミノ酸配列に基づくモジュールA及びアラネウス・ディアデマツスのクモのADF-4のアミノ酸配列に基づくモジュールCの変異体である（国際公開第2007/025719号）。モジュールA^C（配列番号29）では、21位のアミノ酸S（セリン）がアミノ酸C（システイン）に置き換わっており、モジュールA^K（配列番号30）では、21位のアミノ酸Sがアミノ酸K（リジン）に置き換わっており、モジュールC^C（配列番号31）では、25位のアミノ酸Sが25位のアミノ酸Cに置き換わっており、モジュールC^K1（配列番号32）では、25位のアミノ酸Sがアミノ酸Kに置き換わっており、モジュールC^K2（配列番号33）では、20位のアミノ酸E（グルタミン酸）がアミノ酸Kに置き換わっており、モジュールC^KC（配列番号34）では、20位のアミノ酸Eがアミノ酸Kに置き換わっているとともに、25位のアミノ酸Sがアミノ酸Cに置き換わっている（国際公開第2007/025719号）。そのためより好ましい実施形態では、シルクポリペプチドにおける反復単位は、モジュールA^C:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGCGQQ（配列番号29）、モジュールA^K:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGKGQQ（配列番号30）、モジュールC^C:GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPCGPGGYGPGGP（配列番号31）、モジュールC^K1:GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPKGPGGYGPGGP（配列番号32）、モジュールC^K2:GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP（配列番号33）、又はモジュールC^KC:GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPCGPGGYGPGGP（配列番号34）からなる。

非反復単位がシルクタンパク質に含まれる場合、得られる繊維の靭性を改善することができることが確認されている。そのため、同じ分子量であれば、非反復単位を含むシルクタンパク質（複数の場合もあり）を含むシルクタンパク質溶液から作製された繊維は、非反復単位を含まないシルクタンパク質を含むシルクタンパク質溶液から作製された繊維よりも高い靭性を備えると考えられる。しかしながら、非反復単位を含まないシルクタンパク質の分子量を増大させれば、繊維の同程度の靭性が実現する。そのため1つ又は複数の非反復単位を含まないシルクタンパク質を含む繊維はより高い分子量を有することが好ましい。この分子量を、シルク分子における反復単位の数を増やすことにより増大させるのが好ましい。非反復単位を含まないシルクタンパク質は、少なくとも1つの非反復単位を含むタンパク質に比べて少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、より好ましくは少なくとも5つ、更により好ましくは少なくとも6つの更なる反復単位を有することが好ましい。

ほとんどの自然発生的なスパイダーシルクタンパク質は、少なくとも1つの非反復単位も含む。そのため、本発明の方法に使用されるシルクタンパク質は少なくとも1つの非反復（NR）単位を含むのが好ましい。非反復単位はシルクタンパク質においてN末端、C末端又はN末端及びC末端に位置するのが好ましい。本発明の文脈中において、「非反復（NR）単位」という用語は、明確な反復パターンを示さない、自然発生的なシルクポリペプチドに存在するアミノ酸の領域（非反復単位又はNR単位）を表す。NR単位は溶液中で規定の三次構造を有するタンパク質ドメインである。非反復単位は、帯電アミノ酸、例えばGlu、Asp、Lys、又はArgを含むのが好ましく、それにより非反復単位を含む2つのタンパク質間で塩架橋の形成が可能となる。その上、非反復単位は1つ又は複数のCys残基を含むことが多く、それにより非反復単位を含む2つのタンパク質間で共有結合的な分子間のCys-Cys架橋の形成が可能となる。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、Cys-Cys架橋により形成されるシルクタンパク質のダイマーが、シルクタンパク質の繊維への集合化を促すと考えている。非反復単位は、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、より好ましくは少なくとも100アミノ酸を含むのが好ましい。特に好ましい範囲は100アミノ酸〜200アミノ酸である。これらの反復単位は少なくとも1つのCys残基を含むのが好ましい。

非反復単位のアミノ酸配列は、自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはADF-3（配列番号1）又はADF-4（配列番号2）の非反復アミノ酸配列、又はそれと実質的に類似するアミノ酸配列に相当するものである。非反復単位のアミノ酸配列はクロゴケグモの非反復アミノ酸配列に相当するものとすることもできる。非反復単位のアミノ酸配列は、自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはADF-3（配列番号1）若しくはADF-4（配列番号2）の非反復カルボキシル末端アミノ酸配列、又はそれと実質的に類似するアミノ酸配列に相当するものであるのがより好ましい。非反復単位のアミノ酸配列は、シルクタンパク質、好ましくはスパイダーシルクタンパク質、更により好ましくはアミノ酸513〜636を含むADF-3（配列番号1）若しくはアミノ酸302〜410を含むADF-4（配列番号2）の非反復カルボキシル末端アミノ酸配列、又はそれと実質的に類似するアミノ酸配列に相当するものであるのが更により好ましい。

上記の教示に基づき配列比較により、当業者は、シルクタンパク質、とりわけ本発明の方法への使用に適したスパイダーシルクタンパク質における更なる非反復単位を同定することが可能である。

これに関連して、「実質的に類似する」は、好ましくは20、30、40、50、60、70、80、又はそれ以上のアミノ酸に対する、より好ましくは自然発生的なドラグラインポリペプチド、好ましくはADF-3（配列番号1）又はADF-4（配列番号2）のそれぞれの基準となる非反復（カルボキシル末端）アミノ酸配列の全長に対する少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は更には99.9%のアミノ酸同一性の程度を意味する。自然発生的なドラグラインポリペプチド（すなわち野生型非反復（カルボキシル末端）単位）、好ましくはADF-3（配列番号1）又はADF-4（配列番号2）内の対応する非反復（カルボキシル末端）アミノ酸配列と「実質的に類似する」アミノ酸配列を有する「非反復単位」はその機能的特性に関しても類似している。例えば、「実質的に類似する非反復単位」を含むシルクポリペプチドにも繊維を形成する能力がある。当業者であれば、例えば光散乱及びX線回折の測定により、「実質的に類似する非反復単位」を含むシルクポリペプチドが自己集合することができるかを容易に評価することができる。

非反復（NR）単位はNR3（配列番号41）、NR4（配列番号42）、NR5（配列番号45）若しくはNR6（配列番号46）、又はそれらの変異体であるのが最も好ましい。NR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位変異体は、基準となるNR3（配列番号41）、NR4（配列番号42）、NR5（配列番号45）又はNR6（配列番号46）非反復単位とは異なるものであり、基準となる非反復単位からアミノ酸配列における最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、又は30個のアミノ酸の変化（すなわち置換、挿入、欠失、N末端切断及び／又はC末端切断）により誘導される。このようなNR3、NR4、NR5、又はNR6単位変異体は、代替的に又は付加的に変異体の誘導元である基準となるNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位に対する或る程度の配列同一性を特徴とすることができる。そのため、NR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位変異体は、上記のそれぞれの基準となるNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位に対する少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は更には99.9%の配列同一性を有する。配列同一性は、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、又はそれ以上のアミノ酸の連続ストレッチに対するもの、好ましくはそれぞれの基準となるNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位の全長に対するものであるのが好ましい。

配列同一性は、それぞれの基準となるNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位の全長に対して少なくとも80%、全長に対して少なくとも85%、全長に対して少なくとも90%、全長に対して少なくとも95%、全長に対して少なくとも98%、又は全長に対して少なくとも99%であることが特に好ましい。配列同一性は、それぞれの基準となるNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位の少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも80%、少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも85%、少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも90%、少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも95%、少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも98%、又は少なくとも20、30、40、50、60、70若しくは80アミノ酸の連続ストレッチに対して少なくとも99%であることが更に特に好ましい。

NR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位のフラグメント（又は欠失変異体）は、そのN末端及び／又はそのC末端に最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55又は60アミノ酸の欠失を有するのが好ましい。欠失は内在性のものであってもよい。

さらに、NR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位変異体又はフラグメントは、該変異体又はフラグメントの元となるアミノ酸配列に対する修飾がシルクポリペプチドの自己集合能にマイナスの影響を与えない場合にのみ、本発明の文脈中においてNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位変異体又はフラグメントと見なされる。当業者であれば、例えば光散乱及び／又はX線回折の測定によりNR3、NR4、NR5、又はNR6非反復単位変異体又はフラグメントを含むシルクポリペプチドが自己集合するかを容易に評価することができる。

本発明の方法に使用されるシルクタンパク質は、ADF-3（配列番号1）、ADF-4（配列番号2）、MaSp I（配列番号43）若しくはMaSp II（配列番号44）、若しくはそれらの変異体、又は(C)_m、(C)_mNR_z、NR_z(C)_m、NR_z(C)_mNR_z、(AQ)_n、(AQ)_nNR_z、NR_z(AQ)_n、NR_z(AQ)_nNR_z、(QAQ)_o、NR_z(QAQ)_o、(QAQ)_oNR_z（ここで、mは4〜64の整数、すなわち4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、又は64であり、nは10〜40の整数、すなわち10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40であり、oは8〜40の整数、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40であり、zは1〜3の整数、すなわち1、2、又は3であり、NRはそれぞれ独立して非反復単位、好ましくはNR3、NR4、NR5若しくはNR6非反復単位、又はそれらの変異体である）からなる群から選択されることが特に好ましい。

上述の式は下記のものの１つにより定義される。式中、
i）(C)_m（ここでは、配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち8個〜64個のCモジュールが互いに組み合わされている）、
ii）(C)_mNR_z（ここでは、配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち8個〜48個のCモジュールが互いに組み合わされており、該Cモジュールは「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位と更に組み合わされている）、
iii）NR_z(C)_m（ここでは、「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位が存在するか（z=1）、又は互いに組み合わされており（z=2又は3）、該非反復（NR）単位（複数の場合もあり）は配列番号21によるアミノ酸配列により表される、「m」個のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールと更に組み合わされている）、
iv）(AQ)_n（ここでは、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜36個のAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされている）、
v）(AQ)_nNR_z（ここでは、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち10個〜40個のAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされており、該AモジュールとQモジュールとの組合せは、「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位と更に組み合わされている）、
vi）NR_z(AQ)_n（ここでは、「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位が存在するか（z=1）、又は互いに組み合わされており（z=2又は3）、該非反復（NR）単位（複数の場合もあり）は、「n」個のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち10個〜40個のAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される）と更に組み合わされている）、
vii）(QAQ)_o（ここでは、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜24個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされている）、
viii）(QAQ)_oNR_z（ここでは、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜16個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される）が互いに組み合わされており、該QモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せは、「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位と更に組み合わされている）、
ix）NR_z(QAQ)_o（ここでは、「z」個の非反復（NR）単位、すなわち1個〜3個の非反復（NR）単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列により表されるNR3、配列番号42によるアミノ酸配列により表されるNR4、配列番号45によるアミノ酸配列により表されるNR5、又は配列番号46によるアミノ酸配列により表されるNR6の非反復（NR）単位が存在するか（z=1）、又は互いに組み合わされており（z=2又は3）、該非反復（NR）単位（複数の場合もあり）は、「o」個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち8個〜40個のQモジュールとAモジュールとQモジュールとの組合せ（ここで、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表される）と更に組み合わされている）。

最も好ましい実施形態では、本発明に使用するシルクタンパク質が、C₈NR4、C₁₆NR4、C₃₂NR4、(AQ)₁₂NR3、(AQ)₂₄NR3、(AQ)₂₄、C₃₂、NR4C₁₆NR4、NR4C₃₂NR4、NR3C₁₆NR3、NR3C₃₂NR3、NR4(AQ)₁₂NR4、NR4(AQ)₂₄NR4、NR3(AQ)₁₂NR3、NR3(AQ)₂₄NR3、(QAQ)₁₆、NR5C₁₆NR4、NR6C₁₆NR4、NR5C₃₂NR4、NR6C₃₂NR4、NR5C₁₆NR3、NR6C₁₆NR3、NR5C₃₂NR3、NR6C₁₆NR3、NR5(AQ)₁₂NR4、NR6(AQ)₁₂NR4、NR5(AQ)₂₄NR4、NR6(AQ)₂₄NR4、NR5(AQ)₁₂NR3、NR6(AQ)₁₂NR3、NR5(AQ)₂₄NR3、NR6(AQ)₂₄NR3である。

変性剤は、シルクタンパク質を実質的にアンフォールディングする、すなわちシルクタンパク質の四次構造、三次構造、好ましくは更に二次構造を破壊する働きがある。これにより、とりわけ組換えにより発現された不溶性シルクタンパク質の可溶化、及び続く変性タンパク質の高靱性の繊維の形成に適した状態への制御移行が可能になる。変性剤が溶液中に「シルクタンパク質変性濃度」で含まれているという表現は、シルクタンパク質がその三次構造、好ましくは更にその二次構造を実質的に喪失する又は喪失する変性剤の濃度を表すと理解されたい。このタンパク質はいわゆるランダムコイル構造で存在するのが好ましい。当業者は所与のシルクタンパク質が上記で概説された意味において溶液中で変性しているかを評価する様々な方法に精通している。これらの方法としては、とりわけタンパク質核磁気共鳴分光法（タンパク質NMR）及び円偏光二色性分光法（CD）が挙げられる。また所与の変性剤についての「シルクタンパク質変性濃度」は、pH、温度、及び他の塩、例えばバッファーの存在に応じて変わる。変性剤の各々要求される濃度は、過度の負担なく所与の溶液について決定することができる。シルクタンパク質を本発明の方法に要求される程度まで変性するのに必要とされる所与の変性剤の濃度は工程（a）の水溶液における更なる条件によっても変わる。好ましくは、水溶液の温度は4℃〜30℃、より好ましくは15℃〜25℃であり、及び／又はpHはpH 5〜9、好ましくは6〜8である。塩が0.01 M〜1 M、好ましくは0.1 M〜0.5 Mの濃度で存在することも好ましい。そのため各変性剤の濃度は、上記の好ましい条件下においてシルクタンパク質が変性されるように選択するのが好ましい。

グアニジン塩が本発明の方法の工程（a）における変性剤として特に適していることが、本発明者らによって確認されている。工程（a）におけるシルクタンパク質を変性するのに最も好ましい変性剤はチオシアン酸グアニジンである。

グアニジン塩について好ましいタンパク質変性濃度は5 M〜8 Mの範囲である。これらの濃度は、工程（a）で準備される水溶液の温度が4℃〜30℃、より好ましくは15℃〜25℃であり、及び／又はpHがpH 5〜9、好ましくはpH 6〜pH 8であり、及び／又は塩が0.01M〜1 Mの濃度で存在する場合に用いるのが好ましい。

工程（a）で準備される水溶液はpHを適合させるためにバッファーを含むことが好ましい。好適なバッファーとしては、Tris-HCl、Hepes、MOPS、リン酸バッファー、NaHCO₃/Na₂CO₃が挙げられる。バッファーはタンパク質溶液に典型的な濃度で準備される。工程（a）で準備される水溶液に含まれ得る好ましい塩はNaCl及び／又はKClを含む。このような塩の好ましい濃度は0.1 M〜0.5 Mである。

工程（a）で準備される水溶液中のシルクタンパク質の濃度は、工程（d）の結果であるシルクタンパク質紡糸ドープ溶液中の所望の濃度未満となるように選ばれる。上記濃度は4% w/v〜15% w/vの範囲、すなわち4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15% w/v、より好ましくは6% w/v〜12% w/vの範囲であるのが好ましい。

本発明者らは、工程（a）で準備される水溶液に含まれ得るグアニジン塩の濃度を、工程（d）前に、例えば工程（c）後であるが、工程（d）前の更なる透析工程で、又は工程（d）中に少なくとも100分の1に、好ましくは少なくとも200分の1に低下させることが、高靱性の繊維の形成を可能にするシルクタンパク質の状態を得るのに有益であることを確認している。

工程（d）の目的は、スパイダーシルクの濃度を繊維の作製に適した濃度まで上昇させることである。このような濃度は、好ましくは少なくとも10% w/v、より好ましくは少なくとも12% w/v、より好ましくは少なくとも15% w/v、より好ましくは少なくとも20% w/v、より好ましくは少なくとも25% w/vである。工程（b）及び工程（c）での変性剤の除去は工程（d）で継続することができる。

化学シャペロンが工程（a）、工程（b）、及び／又は工程（c）におけるシルクタンパク質水溶液、又は工程（d）において作製される紡糸ドープ溶液に存在することが好ましい。「化学シャペロン」という用語は、本発明の文脈中において、タンパク質のフォールディングを助ける、及び／又はタンパク質の溶解性を増大させる分子を指す。化学シャペロンであるフェニル酪酸ナトリウムは例えば、フォールディング中にタンパク質で形成される疎水性ドメインをマスキングすることにより作用すると考えられる。これらの効果を通して、化学シャペロンは溶液中のタンパク質が凝集する傾向に対抗する（例えばBathaie, B. B. et al. (2011) The Protein J. 30 (7), 480-489)を参照されたい）。本発明の方法に使用することができる好ましい化学シャペロンは、ジメチルスルホキシド（DMSO）、例えばスペルミン若しくはスペルミジンのようなポリアミン、グリセリンのようなポリオール（polyol）、尿素、単糖若しくは二糖、例えばトレハロース、コール酸、フェニル酪酸ナトリウム、又はトリメチルアミンN-オキシドを含む。本発明の目的上、最大1 Mの濃度の尿素を化学シャペロンと定義する。尿素は特に好ましい化学シャペロンであり、1 M未満の濃度で化学シャペロンとして作用する。工程（a）、工程（b）、及び／又は工程（c）におけるシルクタンパク質水溶液、又は工程（d）のシルクタンパク質紡糸ドープ溶液は1 M未満、好ましくは0.25 M〜0.75 Mの濃度で化学シャペロンを含むのが好ましい。化学シャペロンの存在が、高靱性の繊維を形成することが可能なシルクタンパク質の状態を安定化させると考えられるため、化学シャペロンは工程（d）に、また得られるシルクタンパク質紡糸ドープ溶液中に存在することが特に好ましい。

工程（b）、工程（c）及び工程（d）はこの順番で続けて行うことが好ましい。しかしながら、工程（b）及び工程（c）におけるタンパク質変性剤の濃度を低下させるのに用いられる方法に応じて、シルクタンパク質の濃度を同時に上昇させてもよい。シルクタンパク質の濃度は工程（b）及び工程（c）ではあまり上昇させないことが好ましいが、一実施形態では、変性剤の濃度を低下させると同時にシルクタンパク質の濃度を上昇させる。そのため一実施形態では、工程（b）と工程（d）と、及び／又は工程（c）と工程（d）とが同時に行われる。

工程（b）及び／又は工程（c）におけるタンパク質変性剤の濃度の低下は任意の当該技術分野で既知の方法により行うことができる。この低下は透析及び／又は透析濾過により行うのが好ましい。

透析は通例、透析膜の片側にシルクタンパク質を保持するとともに、膜のもう一方の側において透析溶液からシルクタンパク質を分離する規定の分子量カットオフ（off）の透析膜を用いて行う。通例、過剰量の透析溶液を準備する。この溶液は成分、例えば変性剤を、各々の透析工程のエンドポイントとして望ましい濃度で含むこと、例えば変性剤の濃度を8分の1〜14分の1に低下させる場合、透析溶液中の変性剤の濃度が工程（a）で準備される水溶液中の濃度よりも8分の1〜14分の1と低いことが好ましい。したがって、透析により、所望の組成の透析バッファーを与えることでシルクタンパク質を含む水溶液の組成を変えることが可能となる。例えば、変性剤の濃度を低下させながら、pHを変えるか又は塩濃度を上昇させることができる。また通例、透析したシルクタンパク質水溶液の体積変化は少なく変化し（small change）、それにより水溶液中のシルクタンパク質の濃度が上昇する場合がある。この変化は水溶液の添加により補填することができる。透析溶液と類似した又は同一の組成の水溶液を添加することが好ましい。変性剤の濃度について透析溶液と類似した又は同一の水溶液を添加することも可能である。後者のアプローチにより、変性剤、好ましくはグアニジン塩の濃度をより迅速に低下させることが可能となる。

別の好ましい実施形態では、変性剤の濃度を透析濾過により、好ましくは接線流濾過（TFF）により低下させる。TFFでは通例、シルクタンパク質を含む溶液がフィルター膜に平行して流れる。膜を通した圧力差により、流体及び濾過性の溶質（その分子量が膜よりも小さいか、又は球状タンパク質等のように働く）がフィルターを通って流れる。透析濾過は不連続透析濾過又は連続透析濾過のいずれか、例えばTFFとすることができる。不連続透析濾過では、溶液が濃縮され、失われた体積が新たな水溶液に置き換わる。水溶液中のシルクタンパク質の濃縮を最小限にするか又は抑えるために、失われた体積が新たな水溶液に連続して置き換わるのが好ましい。連続透析濾過では、溶液の体積は、古いバッファー溶液が除去されると同時に新しいバッファー溶液が流入することにより維持される。どちらの場合でも、水溶液は、除去すべき変性剤、好ましくはグアニジン塩を各工程、すなわち工程（b）、工程（c）及び／又は工程（d）の所望の最終濃度で含むことが好ましい。

工程（b）における変性剤の低下した濃度（reduction of the concentration）は8分の1、9分の1、10分の1、11分の1、12分の1、13分の1又は14分の1であるのが好ましい。そのため、工程（a）で準備される水溶液中の変性剤の濃度が7 Mである場合、工程（b）の終了時の濃度が0.875 M〜0.5Mであることが好ましい。

変性剤の除去中、シルクタンパク質が一部、水溶液中の各々の変性剤濃度を反映する平衡状態に入る。これはいつか必要となるプロセスであり、そのため工程（b）を少なくとも30分、より好ましくは少なくとも1時間、より好ましくは少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも4時間、より好ましくは少なくとも6時間、より好ましくは少なくとも8時間、より好ましくは少なくとも10時間、行うことが好ましい。透析については、平衡状態は、水性のシルクタンパク質サンプルが、指定の期間、透析溶液に接触することにより達成することができる。透析濾過については、平衡状態は、変性剤濃度の各々の低下が指定の期間又は好ましい期間に亘って徐々に達成されるように透析濾過の条件を選ぶことにより達成することができる。

好ましい実施形態では、変性剤の濃度は工程（b）の終了時で0.6 M〜0.4 Mである。詳細には、工程（a）で使用される変性剤がグアニジン塩である場合、グアニジン塩の濃度は工程（b）の終了時に0.6 M〜0.4 M、好ましくは0.5Mへと低下させる。

工程（b）は4℃〜30℃、好ましくは15℃〜25℃の温度で行うことが好ましい。

変性剤を除く水溶液の成分の濃度は、工程（b）中は変えないことが好ましいが、シルクタンパク質の濃度は透析バッファーの組成又は透析濾過の条件に応じて僅かに変わってもよい。

工程（c）における変性剤の低下した濃度は1.5分の1、1.6分の1、1.7分の1、1.8分の1、1.9分の1、2.0分の1、2.1分の1、2.2分の1、2.3分の1、2.4分の1、2.5分の1、2.6分の1、2.7分の1、2.8分の1、2.9分の1（fold）又は3分の1であるのが好ましい。平衡状態に入るのに十分な時間をシルクタンパク質に与えるために、工程（c）は少なくとも30分、より好ましくは少なくとも1時間、より好ましくは少なくとも2時間、より好ましくは少なくとも4時間、より好ましくは少なくとも6時間、より好ましくは少なくとも8時間、より好ましくは少なくとも10時間、行うことが好ましい。

工程（c）は4℃〜30℃、好ましくは15℃〜25℃の温度で行うことが好ましい。

詳細には、工程（a）で使用される変性剤がグアニジン塩である場合、グアニジン塩の濃度は工程（c）の終了時に0.3 M〜0.2 M、好ましくは約0.25Mへと低下させる。

工程（d）における濃縮は、水溶液中のタンパク質の濃度を上昇させるために当該技術分野で既知の任意の方法により達成することができる。特に有用な実施形態では、シルクタンパク質は透析又は濾過により濃縮される。透析は吸湿性ポリマーを含む溶液等の脱水溶液に対して行うのが好ましい。好適な吸湿性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、アミラーゼ及びセリシン、又はそれら2つ以上の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。PEG分子は広範な分子サイズで入手可能であり、PEGの選択は透析に選ばれる膜及び要求される濃縮率により決まる。PEGの分子量は約8000 g/mol〜約10000 g/molであり、濃度は約25%〜約50%であるのが好ましい。いくつかの実施形態では、分離は膜濾過により実施することができ、該膜濾過としては、単回濾過、デッドエンド濾過、正流濾過（DFF）及び交差流濾過、又は接線流濾過（TFF）等の方法が挙げられるが、これらに限定されない。濾過は規定の範囲の粒径の半透膜を用いてサイズに応じて分子を分離する原理に基づくものである。濾過法と膜のタイプとの組合せを分離に使用することができることが当業者に知られている。本発明によると、膜濾過は高分子膜又は無機膜により達成される細胞成分の分離である。当該技術分野内において、キャリア液（carrier liquid）から除去する物質のサイズにより規定される4つの一般的に認められた膜カテゴリーが存在する。膜を通して連続して濾過する方法は、最小粒径から最大粒径の順で逆浸透（RO）、ナノ濾過（NF）、限外濾過（UF）、及びマイクロ濾過（MF）である。上述の膜による濾過は特定の孔径の膜を使用することにより、分子量に応じて分子を分離するものである。例えば、孔径が0.001マイクロメートル未満のRO膜による分離は分子量が200ダルトン未満の分子の分離を目的とする。孔径が0.001マイクロメートル〜0.008マイクロメートル（端点を含む（inclusive））のNF膜による濾過は200 Da〜15 kDa（端点を含む）の分子量の分子の分離を目的とする。30孔径が0.005マイクロメートル〜0.1マイクロメートル（端点を含む）UF膜による濾過は分子量が5 kDa〜300kDa（端点を含む）の分子の分離を目的とする。孔径が0.05マイクロメートル〜3.0マイクロメートル（端点を含む）のマイクロ濾過膜による濾過は分子量が100 kDa〜3000kDa以上の分子の分離を目的とする。膜濾過は膜の孔径により決まる特定の分子量カットオフ（MQWCO）を有する膜を用いることにより、サイズ排除に基づいて他の成分から可溶化シルクタンパク質を分離することができる。公称分画分子量（NMWL）又は公称分子量カットオフ（NMWCO）とも呼ばれるMWCOは、膜による濾過についてのキロダルトンでのサイズ指定である。MWCOは膜により90%保持される分子の分子量と定義される。例えば同じ分子量の分子であっても形状が著しく異なる場合があることから、MWCOは正確な測定基準ではないものの、有用な測定基準であり、フィルター製造業者によって一般的に利用されている。疎水性膜及び親水性膜の両方を使用することができる。このような膜は平板シートとして又は螺旋状に巻かれた構成で使用することができる。中空繊維を使用することもできる。UF膜の組成については、あらゆる潜在的な膜材料を使用することができ、該膜材料としては、再生セルロース、ポリエーテルスルホン（本来備わっている疎水性が変わるように修飾されていても又は修飾されていなくてもよい）、ポリフッ化ビニリデン、並びにセラミック凝集体及び金属酸化物凝集体が挙げられるが、これらに限定されない。多くのポリエーテルスルホンUF膜が0.5〜13のpH範囲及び15℃〜最大85℃の範囲の温度に耐えることができる。MF膜の材料としては、UF膜に使用される全てのものと、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン及びPTFE（TEFLON^{（登録商標）}）とが挙げられる。好ましい実施形態では、TFFはシルクタンパク質の濃縮と、バッファー組成の変更との両方に使用される。そのため好ましい実施形態では、グアニジン塩の濃度が上記で概説されるように低下するとともに、化学シャペロン、好ましくは尿素の濃度が上昇することで、工程（d）で作製されるシルクタンパク質紡糸ドープ液の上記で概説された好ましい化学シャペロン濃度が得られる。

別の好ましい実施形態では、工程（d）におけるシルクタンパク質溶液の濃縮を達成するのに、相分離が使用される。これは、シルクタンパク質水溶液はシルクタンパク質に富んだシルクタンパク質水相とシルクタンパク質が欠乏したシルクタンパク質水相とに分離する傾向があるという本発明者らにより観察された現象に基づくものである。シルクタンパク質に富んだシルクタンパク質水相は、工程（c）により又は工程（a）においてシルクタンパク質変性濃度で存在する変性剤、例えばグアニジン塩を更に除去する任意の除去工程により得られるシルクタンパク質水溶液の入った容器の底に局在する。相分離を起こすために、変性剤除去工程により得られるシルクタンパク質溶液を少なくとも2時間、好ましくは少なくとも4時間、より好ましくは少なくとも8時間、維持することが好ましい。相分離を促進するために、この溶液の揺動（disturbance）を最小限にすることが好ましい。

工程（a）、工程（b）、工程（c）又は工程（d）の少なくとも1つの水溶液は、塩基性アミノ酸、すなわちリジン、アルギニン、又はグルタミン、好ましくはアルギニンを更に含有することができる。塩基性アミノ酸はpH緩衝能と、溶液中のタンパク質を安定化する傾向とを兼ね備える。塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンが1 mM〜1 Mの濃度で含まれることが好ましい。好ましい濃度は10 mM〜250 mMの範囲である。

本発明の第1の態様の好ましい実施形態では、本方法はシルクタンパク質紡糸ドープ溶液から繊維を引き抜くことにより、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を押し出すことにより、又はこれら2つの技術の組合せにより、繊維を作製する工程を更に含む。

「押し出し」は、ダイ／開口部／ノズルの前で圧力を印加することにより、ダイ／開口部／ノズルを通して溶液を押し出すプロセスを意味するものである。「引き抜き」は、ダイ／開口部／ノズルの後ろで圧力を印加することにより、ダイ／開口部／ノズルに溶液を通過させるプロセスを意味するものであり、ここではダイ／開口部の後ろの圧力はダイ／開口部／ノズルの前の圧力を超えている。これは引抜重力、陰圧又はベンチュリノズルの使用により得ることができる。

シルクタンパク質紡糸ドープ液は他のポリマーとともに紡糸することができる。他のポリマーの例としては、ポリマー（例えば、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル）、他の植物及び動物源の繊維及びシルクが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態は10重量%のポリアミドと混ぜ合わせたシルクタンパク質繊維である。更に好ましい実施形態では、シルクタンパク質繊維をポリアミド、ポリアラミド、ポリ乳酸（PLA）、ポリプロピレン、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、ポリラクテート、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、キサンタン、セルロース、天然コラーゲン及び組換えコラーゲン、ケラチン、天然トロポエラスチン及び組換えトロポエラスチン、エラスチン、綿、羊毛、又はそれらの混合物と混ぜ合わせる。得られる繊維におけるこのポリマー（例えばポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル）の含有量は、50重量%未満、より好ましくは40重量%未満（ess than）、30重量%未満、20重量%未満、更により好ましくは15重量%未満であるのが好ましい。代替的には、得られる繊維におけるこのポリマー（例えばポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル）の含有量は、少なくとも5重量%、少なくとも10重量%、少なくとも15重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%若しくは少なくとも50重量%、及び／又は50重量%未満、40重量%未満、30重量%未満、20重量%未満若しくは10重量%未満であることが好ましい。そのため、得られる繊維におけるこのポリマー（例えばポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル）の含有量は、5重量%〜50重量%、5重量%〜30重量%、又は5重量%〜20重量%の範囲であることが特に好ましい。繊維のこのような組合せの作製は、任意の望ましい特徴、例えば見た目、柔軟性、重量、耐久性、撥水性の向上、製造原価の改善のために容易に実践することができ、これらは医療、産業、又は商業的用途の繊維の製造及び作製に一般的に求められ得る。シルクタンパク質繊維を他の繊維タイプとともに更に束ねるか、編むか、又は織ることができる。

押し出し技術の好ましい実施形態では、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を凝固浴槽に直接押し出す。例えば、スピナレット又はダイ／開口部／ノズルを凝固浴槽に漬けることができる。同様に、繊維が形成された後に、例えば引抜ノズルのすぐ後に引き抜いた繊維を凝固浴槽に沈めることが可能である（スピナレット又はダイ／開口部／ノズルは凝固浴槽の上に位置している）。凝固浴槽にはリン酸バッファー及び／又はアルコールが入っているのが好ましい。好ましいアルコールは、直鎖又は分岐のC₁〜C₆モノ又はジ−アルコール、好ましくはエタノール又はイソプロパノールである。凝固浴槽内のアルコール（複数の場合もあり）の濃度は50% w/v〜100% w/v、例えば75%w/v又は90% w/vであるのが好ましい。

本発明者らは、繊維を引き抜き又は押し出し後に伸長する場合に繊維の靭性を大幅に改善することができることを発見している。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、伸長が繊維内のシルクタンパク質分子の整列及びより規則的な分布をもたらし、それにより繊維の特性が改善されると考えられる。繊維は引き抜いた又は押し出した後に伸長することが好ましい。このような伸長は連続又は不連続プロセスにおいて行うことができる。連続プロセスでは、繊維が引張力に曝されることが好ましい。好ましくは、繊維の伸長は引き抜いた又は押し出した時点の繊維の長さに比べて少なくとも2倍であり、好ましくはこの伸長は少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、より好ましくは少なくとも10倍である。好ましくは、このような伸長は凝固溶液の存在下において行う。例えば、繊維は少なくとも一部が凝固溶液に浸かっている。この溶液は本発明の文脈中において延伸溶液とも呼ばれる。この溶液は凝固溶液と同じ組成を有する。

当業者は上記で概説された伸長を達成するのに規定の引張力を印加する様々な方法に精通している。例えば繊維が10 cm/sの速度でスピナレットのノズルから引き抜かれるか又は押し出され、続いて繊維を1m/sの速度で巻き上げる場合、伸長は少なくとも10倍となる。当業者は押し出された繊維を既定の方法で延伸する様々な方法に精通している。例えば、ローラーをノズルの後ろに配置することができ、該ノズルが繊維を1 m/sの速度で引き抜き、次のローラーが2 m/sの速度で動き、続くローラーを更により高速にすることができ、それにより延伸の漸増がもたらされる。繊維を断続的に緩和させることで、延伸と緩和との一連の動きを生じさせることもできる。上記で概説されたように、伸長の倍数は引き抜かれた又は押し出された時点の繊維及び延伸（場合によっては緩和）プロセス終了時の生成物を基に算出される。

伸長中、繊維の断面積が低減する。伸長により、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、60%、少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%の断面積の低減がもたらされることが好ましい。

押し出し時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは5 μm〜200 μmの範囲、より好ましくは20 μm〜150 μmの範囲である。代替的には、押し出し時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは30 μm〜90 μmの範囲、より好ましくは40 μm〜80 μmの範囲であるか、又は押し出し時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは110 μm〜200 μmの範囲、より好ましくは110 μm〜150 μmの範囲である。伸長後の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは1 μm〜100 μmの範囲、より好ましくは1 μm〜50 μmの範囲である。代替的には、伸長後の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは30 μm〜90 μmの範囲、より好ましくは40 μm〜80 μmの範囲である。繊維の厚さ（直径）は均一であるか、又は最大5%、例えば最大1%、2%、3%、4%、若しくは5%の変動率を有することが好ましい。後者の場合、本発明における繊維の厚さ（直径）の言及は繊維の平均厚さ（直径）を表すものである。

第2の態様では、本発明は、繊維を作製する方法であって、
（i）本発明の第1の態様の方法により作製可能なシルク紡糸ドープ溶液を準備する工程と、
（ii）シルクタンパク質紡糸ドープ溶液からの引き抜き又は該シルクタンパク質紡糸ドープ溶液の押し出し又はそれらの組合せにより繊維を作製する工程と、
を含む、方法を提供する。

シルク紡糸ドープ溶液の提供は本発明の第1の態様について記載されたように行うのが好ましい。特に、シルクタンパク質紡糸ドープ溶液を凝固浴槽へと押し出すことが好ましい。

本発明の第1の態様に関して概説されたように、繊維を続く延伸工程において伸長させることも好ましい。

第3の態様では、本発明は本発明の第1の態様の方法により作製可能な紡糸ドープ溶液を提供する。

第4の態様では、本発明は本発明の第1の態様又は第2の態様の方法により作製可能な繊維に関する。この繊維は類似の又は同一の分子量のシルクタンパク質を含む従来技術の繊維の靭性より優れた靭性（MJ/m³単位で測定される）を呈する。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、これが本発明の第1の態様の方法により提供されるシルクタンパク質紡糸ドープ液から繊維が引き抜かれた場合にシルクタンパク質が実現することができる特有の三次元構造によるものであると考えている。繊維の材料の少なくとも10重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるのが好ましい。繊維の材料の少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%又は100重量%がシルクタンパク質であることがより好ましい。

繊維が100重量%のシルクタンパク質を含む場合、これらのタンパク質は自然発生的なシルクタンパク質ではないことが好ましい。

繊維に含まれるシルクタンパク質のモノマー（複数の場合もあり）の分子量は、20 kDa〜600 kDaの範囲、すなわち少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100 kDa、又は600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160若しくは150 kDa未満であることも好ましい。そのため、分子量は40kDa〜300 kDa、より好ましくは40 kDa〜200 kDa、より好ましくは、更により好ましくは100 kDa〜150 kDaの範囲であることが特に好ましい。

シルクタンパク質が、好ましくはNR領域においてジスルフィド結合を介して二量体化する場合、別の実施形態では、タンパク質のダイマーの分子量が20 kDa〜600 kDaの範囲、すなわち少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190若しくは200 kDa、又は600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310若しくは300 kDa未満、最も好ましくは200 kDa〜300 kDaであることが好ましい。好ましくは、繊維の靭性（MJ/m³）は、kDa単位のシルクタンパク質（複数の場合もあり）の分子量と、少なくとも1.0の因数との積である。この関係は少なくとも最大300 kDaのシルクタンパク質（複数の場合もあり）の分子量で得られ、分子量が300kDaを超えるタンパク質の場合は少なくとも300 MJ/m³である。因数は少なくとも1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、又は3.0であるのが好ましい。

シルクタンパク質溶液が2つ以上のシルクタンパク質を含む場合、この算出のためのシルクタンパク質の分子量は、分子量が最小のシルクタンパク質の分子量により決定される。

シルクタンパク質が共有結合、例えば2つのCys残基間のジスルフィド結合により二量体化することが可能な場合、シルクタンパク質溶液に含まれるシルクタンパク質の分子量を算出するために、二量体化していないモノマーの重量を用いる。そのため、分子量が200 kDaのダイマーを含む本発明の繊維の靭性はダイマーを形成するモノマーの分子量、すなわち100 kDaを基に算出される。したがってこの例での繊維の靭性は少なくとも100 MJ/m³である。

繊維は伸長するのが好ましい。伸長は引き抜かれた又は押し出された時点の繊維の長さに比べて少なくとも2倍であり、伸長は少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、より好ましくは少なくとも10倍であることが好ましい。

因数は少なくとも1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、又は3.0であるのが好ましい。

繊維の材料の少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%又は100重量%がシルクタンパク質であることがより好ましい。

本発明の第5の態様による繊維に含まれ得るシルクタンパク質は、好ましい実施形態及び特に好ましい実施形態の全てを含む、本発明の第1の態様の文脈中において適していると記載されているものである。したがって、シルクタンパク質は、2個〜100個の反復単位、すなわち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、又はそれ以上の反復単位を含むことが好ましい。

シルクタンパク質が、各々:
（a）GPGXX（配列番号3）（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される）、
（b）GGX（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれ独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択される）、及び、
（c）A_x（ここで、xは5〜10の整数である）、
からなる群から選択される少なくとも1つのコンセンサス配列を含む少なくとも2つの反復単位を含むことが特に好ましい。

反復単位が独立して、モジュールA（配列番号20）、モジュールC（配列番号21）、モジュールQ（配列番号22）、モジュールS（配列番号25）、モジュールR（配列番号26）、又はそれらの変異体から選択されることが好ましい。

例えばシルクタンパク質は、2個〜100個の反復単位、すなわち少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、又はそれ以上の反復単位を含み、該反復単位は独立して、モジュールA（配列番号20）、モジュールC（配列番号21）、モジュールQ（配列番号22）、モジュールS（配列番号25）、モジュールR（配列番号26）、又はそれらの変異体から選択される。

シルクタンパク質が少なくとも1つの非反復（NR）単位を更に含むことが好ましい。

好ましいNR単位は、NR3（配列番号41）、NR4（配列番号42）、NR5（配列番号45）若しくはNR6（配列番号46）、又はそれらの変異体である。

シルクタンパク質は、ADF-3（配列番号1）、ADF-4（配列番号2）、MaSp I（配列番号43）若しくはMaSp II（配列番号44）、若しくはそれらの変異体、又は(C)_mNR_z、NR_z(C)_m、NR_z(C)_mNR_z、(AQ)_nNR_z、NR_z(AQ)_n、NR_z(AQ)_nNR_z、NR_z(QAQ)_o、(QAQ)_oNR_z（ここでmは10〜64の整数、すなわち10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59若しくは60であり、nは10〜40の整数、すなわち10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39若しくは40であり、oは8〜40の整数、すなわち8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40であり、zは1〜3の整数、すなわち1、2又は3、好ましくは1であり、NRはそれぞれ独立して非反復単位である）からなる群から選択され得る。

シルクタンパク質が、C₈NR4、C₁₆NR4、C₃₂NR4、(AQ)₁₂NR3、(AQ)₂₄NR3、(AQ)₂₄C₃₂、NR4C₁₆NR4、NR4C₃₂NR4、NR3C₁₆NR3、NR3C₃₂NR3、NR4(AQ)₁₂NR4、NR4(AQ)₂₄NR4、NR3(AQ)₁₂NR3、NR3(AQ)₂₄NR3、(QAQ)₁₆、NR5C₁₆NR4、NR6C₁₆NR4、NR5C₃₂NR4、NR6C₃₂NR4、NR5C₁₆NR3、NR6C₁₆NR3、NR5C₃₂NR3、NR6C₁₆NR3、NR5(AQ)₁₂NR4、NR6(AQ)₁₂NR4、NR5(AQ)₂₄NR4、NR6(AQ)₂₄NR4、NR5(AQ)₁₂NR3、NR6(AQ)₁₂NR3、NR5(AQ)₂₄NR3、NR6(AQ)₂₄NR3であることは好ましい。

繊維は伸長するのが好ましい。伸長は引き抜かれた又は押し出された時点の繊維の長さに比べて少なくとも2倍であり、好ましくは伸長が少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、より好ましくは少なくとも10倍であることが好ましい。伸長により繊維の靭性が大きく改善する。

押し出し時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは5 μm〜200 μmの範囲、より好ましくは20 μm〜150 μmの範囲である。代替的には、押し出し時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは30 μm〜90 μmの範囲、より好ましくは40 μm〜80 μmの範囲であるか、又は伸長時の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは110 μm〜200 μmの範囲、より好ましくは110 μm〜150 μmの範囲である。伸長後の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは1 μm〜100 μmの範囲、より好ましくは1 μm〜50 μmの範囲である。代替的には、伸長後の繊維の厚さ（直径）は、好ましくは30 μm〜90 μmの範囲、より好ましくは40 μm〜80 μmの範囲である。繊維の厚さ（直径）は均一であるか、又は最大5%、例えば最大1%、2%、3%、4%、若しくは5%の変動率を有することが好ましい。後者の場合、本発明における繊維の厚さ（直径）の言及は繊維の平均厚さ（直径）を表すものである。

本発明の第4の態様又は第5の態様の繊維は少なくとも1つの更なるポリマーを更に含むことができる。例えば本発明の第4の態様又は第5の態様の繊維は、合成ポリマー及び／又は天然ポリマーを含むことができる。好ましいポリマーは、ポリアミド、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、ポリ乳酸、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、キサンタン、セルロース、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、ケラチン、綿、羊毛、又はそれらの混合物を含む、人工ポリマー及び／又は自然発生的なポリマーを含む。繊維における少なくとも1つの更なるポリマー、例えば合成ポリマー及び／又は天然ポリマーの含有量は、50重量%未満、より好ましくは40重量%未満、30重量%未満、20重量%未満、更により好ましくは15重量%未満であるのが好ましい。代替的には、繊維における少なくとも1つの更なるポリマー、例えば合成ポリマー及び／又は天然ポリマーの含有量は、少なくとも5重量%、少なくとも10重量%、少なくとも15重量%、少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%若しくは少なくとも50重量%、及び／又は50重量%未満、40重量%未満、30重量%未満、20重量%未満若しくは10重量%未満であることが好ましい。そのため、繊維における少なくとも1つの更なるポリマー、例えば合成ポリマー及び／又は天然ポリマーの含有量は、5重量%〜50重量%、5重量%〜30重量%、又は5重量%〜20重量%の範囲であることが特に好ましい。このような繊維の作製は、任意の望ましい特徴、例えば見た目、柔軟性、重量、耐久性、撥水性の向上、製造原価の改善のために容易に実践することができ、これらは医療、産業、又は商業的用途の繊維の製造及び作製に一般的に求められ得る。シルクタンパク質繊維を他の繊維タイプとともに更に束ねるか、編むか、又は織ることができる。

上述のように、繊維の材料の少なくとも20重量%、少なくとも30重量%、少なくとも40重量%、少なくとも50重量%、少なくとも60重量%、少なくとも70重量%、少なくとも80重量%、少なくとも90重量%、少なくとも95重量%又は100重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であることがより好ましい。繊維の材料の少なくとも10重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の90重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも20重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の80重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも30重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の70重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも40重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の60重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも50重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の50重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも60重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の40重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも70重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の30重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも80重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の20重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、繊維の材料の少なくとも90重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の10重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであるか、又は繊維の材料の少なくとも95重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であるとともに、繊維の材料の5重量%以下が別のポリマー、例えば合成若しくは天然ポリマーであることが更により好ましい。

紡糸プロセス：
1.紡糸ドープ液の準備
500 mgの組換えスパイダーシルクタンパク質（C₁₆NR4、C₃₂NR4、(AQ)₁₂NR3、NR5(AQ)₁₂NR3、又は(AQ)₂₄NR3)）を10 mLの6 MのGdmSCN（5%(w/v)）に溶解した。タンパク質を溶解した後、不溶性部分を遠心分離（8500rpm、30分、18℃）により除去した。上清を、下記のバッファーを用いて毎回4時間透析した（MWCO：6 kDa〜8 kDa）：
1）バッファー1：50 mMのNH₄HCO₃（pH 7.8）、500 mMの尿素、500 mMのGdmSCN
2）バッファー2：50 mMのNH₄HCO₃（pH 7.8）、500 mMの尿素、250 mMのGdmSCN
3）バッファー3：50 mM NH₄HCO₃（pH 7.8）、500 mMの尿素

次の工程として、eADF4 Cタンパク質（C₁₆NR4、C₃₂NR4）をeADF3 AQタンパク質（(AQ)₁₂NR3、NR5(AQ)₁₂NR3、(AQ)₂₄NR3）とは別に処理した：
Cタンパク質：15%の濃度に達するまで20%（w/v）のPEG（35 kDa）、500 mMの尿素に対して透析する。ここでの紡糸ドープ液を紡糸に使用することができる。
AQタンパク質：15 mL容のグライナーチューブに移す。このチューブを4℃で一晩保ち、そこで相分離が起こる。濃縮した（下）相（9%(w/v)〜15%(w/v)）を紡糸に使用した。

2.湿式紡糸
紡糸ドープ液を、22Gカニューレを用いて1 mL容のシリンジに移した。充填されたシリンジをシリンジポンプに取り付けた。カニューレをシリンジに対して直角に下方向へと曲げ、そのようにしてカニューレの先端を凝固浴槽に漬ける。

凝固／延伸浴槽：
Cタンパク質：90%のイソプロパノール、10%のH₂O
AQタンパク質：75%のイソプロパノール、25%のH₂O

紡糸ドープ液を5 μL/分の紡糸速度で凝固浴槽に押し出した。凝固した繊維を該浴槽から取り出し、延伸浴槽にて延伸した。凝固浴槽と延伸浴槽とはCタンパク質又はAQタンパク質のそれぞれで同一のものである。延伸後、繊維を延伸浴槽から取り出し、クリーンなペトリ皿に置き、少なくとも2時間開放空気で乾燥した。

3.引張試験
引張試験のために、乾燥した繊維を1 cm片に切断し、これを、プラスチック接着剤を用いてプラスチック枠（ゲージ長：2 mm）上に接着した。接着した繊維片を一晩風乾した。繊維片の直径を、繊維片に亘って均等に分布した三点にて光学顕微鏡（倍率100倍、200倍及び400倍）を用いて求めた。

その後、応力−歪み曲線を30%の相対湿度で0.5 Nのロードセルを用いて引張試験機にて記録した。繊維を、該繊維が破断されるまで0.04 mm/sの速度で伸長した。結果を表1に示す。

表1：様々なスパイダーシルクタンパク質の実験結果。この表に更に、Xia et al.(2010) Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolicallyengineered Escherichia coli results in a strong fiber. PNAS August 10, 2010Vol.107 no.32 14059-14063に記載の4つの組換えスパイダーシルクタンパク質繊維に関する実験データとの比較を示す。

（^*）靭性に関するデータはXia et. al（上記）の図3に基づいて算出された。

Claims

少なくとも1つのシルクタンパク質を含む繊維であって、該繊維の材料の少なくとも10重量%がシルクタンパク質（複数の場合もあり）であり、該シルクタンパク質のモノマー（複数の場合もあり）の分子量が20 kDa〜600 kDaの範囲であり、該繊維の靭性（MJ/m³）が、該シルクタンパク質の分子量が最大300 kDaである場合、該シルクタンパク質の分子量（kDa単位）と少なくとも1.0の因数との積であり、分子量が300 kDaを超えるタンパク質の場合、少なくとも300 MJ/m³であって、
ここで該少なくとも1つのシルクタンパク質は4個〜100個の反復単位を含み、ここで
（i）該反復単位は配列番号21（モジュールC）に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択され、又は
（ii）該反復単位は一般構造XYを有し、ここで
Xは配列番号20（モジュールA）に記載のアミノ酸配列を有する反復単位若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択され、及び
Yは配列番号22（モジュールQ）に記載のアミノ酸配列を有する反復単位若しくは該アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するそれらの変異体から独立して選択される、
繊維。
前記シルクタンパク質が、少なくとも1つの非反復（NR）単位を更に含み、
前記NR単位が、配列番号41に記載のアミノ酸配列を有するNR3、配列番号42に記載のアミノ酸配列を有するNR4、配列番号45に記載のアミノ酸配列を有するNR5、配列番号46に記載のアミノ酸配列を有するNR6、及びそれらのアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有する変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の繊維。
合成ポリマー又は天然ポリマーを更に含み、
前記合成ポリマーが、ポリアミド、ポリカプロラクトン、ポリアクリレート、ポリアラミド、ポリ乳酸（PLA）、ポリプロピレン、ポリラクテート、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、又は
前記天然ポリマーが、キサンタン、セルロース、コラーゲン、トロポエラスチン、エラスチン、ケラチン、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の繊維。
前記シルクタンパク質が(C) _m NR _z 、NR _z (C) _m 、NR _z (C) _m NR _z 、(AQ) _n NR _z 、NR _z (AQ) _n 、及びNR _z (AQ) _n NR _z からなる群から選択され、ここでmは10〜64の整数、nは10〜40の整数、及びzは1〜3の整数であり、NRはそれぞれ独立して非反復単位である、請求項2又は3に記載の繊維。
前記シルクタンパク質がC ₈ NR4、C ₁₆ NR4、C ₃₂ NR4、(AQ) ₁₂ NR3、(AQ) ₂₄ NR3、NR4C ₁₆ NR4、NR4C ₃₂ NR4、NR3C ₁₆ NR3、NR3C ₃₂ NR3、NR4(AQ) ₁₂ NR4、NR4(AQ) ₂₄ NR4、NR3(AQ) ₁₂ NR3、NR3(AQ) ₂₄ NR3、NR5C ₁₆ NR4、NR6C ₁₆ NR4、NR5C ₃₂ NR4、NR6C ₃₂ NR4、NR5C ₁₆ NR3、NR6C ₁₆ NR3、NR5C ₃₂ NR3、NR6C ₁₆ NR3、NR5(AQ) ₁₂ NR4、NR6(AQ) ₁₂ NR4、NR5(AQ) ₂₄ NR4、NR6(AQ) ₂₄ NR4、NR5(AQ) ₁₂ NR3、NR6(AQ) ₁₂ NR3、NR5(AQ) ₂₄ NR3、又はNR6(AQ) ₂₄ NR3である、請求項4に記載の繊維。