JP6443442B2 - 糖液の処理方法、処理糖液の製造方法、有機化合物の製造方法、および微生物の培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、糖類を含む溶液（糖液）の処理方法、および該処理方法により得られる処理糖液に関する。また処理糖液の製造方法、前記処理糖液を用いた有機化合物の製造方法、および微生物の培養方法に関する。

糖類を原料とした有機化合物の発酵生産プロセスは、広く利用されており、また前記各プロセスを経て得られた生産物は、種々の工業原料として利用されている。
これら発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの原料として使用される糖として、現在はサトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデなどの可食原料に由来するものが挙げられる。

しかしこれらの可食原料由来の糖は、今後の世界人口増加による可食原料価格の高騰、および天候不順や気候変動による可食原料の供給不足といった懸念がある。また食料不足の際に、可食原料を食用用途と競合して工業原料に利用することに対する倫理上の批判等の懸念もある。そこで、非可食原料や、不純物を含有する、より低純度の糖類などから、効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵生産原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。

非可食原料から糖液を得る方法としては、非可食原料中のセルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法（特許文献１）や、非可食原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応により加水分解する方法（特許文献２）、または亜臨界や超臨界水による加水分解方法等が挙げられる。

しかし、これらの手法を用いた場合、非可食原料中のセルロース、ヘミセルロースが加水分解され、グルコースやキシロースといった糖が得られると共に、これらの糖の分解反応も進行する。糖の分解反応により、副生成物として、糖類以外のカルボニル化合物が生成し、具体的には例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、グリコールアルデヒド、シリンガアルデヒド、蟻酸等のアルデヒド化合物や、ジヒドロキシアセトンやベンゾキノン等のケトン化合物などのカルボニル化合物が生成する。

糖類以外のカルボニル化合物のうち、フルフラールやヒドロキシメチルフルフラール等のアルデヒド化合物等は、微生物を利用した発酵生産プロセスでは、反応を阻害する性質を有し、具体的には微生物の増殖阻害や発酵生産阻害を引き起こし、発酵生産の収率が低下させる。そのため、これらの化合物は、発酵阻害物質と呼ばれ、非可食原料の糖液を発酵原料として利用する際の大きな課題となる。

これに対し、生成したフルフラール等の発酵阻害物質の除去方法が検討され、例えば活性炭等の各種吸着剤等を用いて吸着除去する方法が提案されている（例えば特許文献３、非特許文献１）。しかし吸着による方法は、選択的に発酵阻害物質だけを除去することは困難であり、また糖類の吸着による糖濃度の低下や、吸着剤の生産や再生にコストがかかるといった問題がある。発酵阻害物質を除去する別の方法として、次亜硫酸ナトリウム等の還元剤を用いた還元除去方法（非特許文献２〜４、特許文献４）や、合成樹脂を用いた除去方法（特許文献５）等が提案されている。

日本国特表平１１−５０６９３４号公報 日本国特開２００１−９５５９４号公報 日本国特開２００５−２７００５６号公報 国際公開第２０１１／０８０１２９号 日本国特開２０１１−７８３２７号公報

Biotechnology Letters vol.5 No.3, P175, 1983 Biotechnology and Bioengineering, vol.108, No11, P2592, 2011 Cavka A et al.,Bioresource Technology, vol.102, P1254, 2011 Bioresource Technology, vol.102, P1254, 2011

還元剤を用いた前記還元除去方法は、発酵阻害物質の除去能力が高く、特に他の方法では除去困難な水溶性アルデヒドを含む各種アルデヒド化合物全般の除去が可能であるため有効な方法である。
一方、糖液は発酵生産プロセスに供する前に、目的以外の反応を引き起こす微生物を殺滅もしくは除去するため、通常、滅菌処理を行なう。特に非可食原料から得られた糖液は、微生物の生育に必要な栄養素が多く含有されている場合が多いため、滅菌処理なしで発酵生産プロセスに供した場合、目的生成物の収率の著しい低下を招く場合があるため、滅菌処理を行なうことが好ましいとされている。

そして一般的に行われ、簡便で効率のよい滅菌処理方法としては、通常、糖液を加熱する加熱滅菌処理が行われる。
ところが、前記糖液に対し、前記還元剤処理と加熱滅菌処理とを併用した場合、目的生成物の収率が向上せず、各処理方法により期待される効果が発揮されないことがある。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、糖類を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス及び化学変換プロセスに供され、生産効率に優れ、かつ、プロセス設計を容易にすることができる糖液の処理方法、および該方法により得られる糖液を用いた有機化合物の製造方法を提供することを第１の課題とする。

また、非可食原料から得られた糖液に含まれるアルデヒド化合物が強い発酵阻害の原因となることに加えて、非可食原料から得られた糖液から化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する場合、糖類以外のカルボニル化合物を糖液中に含有するため、生成物が着色するといった問題があった。そのため、糖液中に含まれる、糖類以外のカルボニル化合物の含有量は極力減らすことが望まれる。

しかし、木質系炭化物や活性炭を用いた除去方法では、選択的に糖類以外のカルボニル化合物だけを除去することは困難であり、また糖類の吸着による糖濃度の低下や、木質系炭化物や活性炭の生産や再生にコストがかかるといった問題もある。また、合成樹脂剤を用いた除去方法では、クロマトグラフ方式での除去となるため、プロセス設計に制約が生じる問題がある。
そしてこれらの除去方法では、上記アルデヒド化合物のうち、グリコールアルデヒド等の水溶性のアルデヒド化合物の除去が困難であり、糖液中の、糖以外のカルボニル化合物の含有量が下がらないという問題がある。

還元剤を用いてアルデヒド化合物を還元除去する方法は、水溶性アルデヒド化合物を含むアルデヒド化合物全般の除去が可能である。しかし、この方法は還元剤として亜硫酸類や次亜硫酸類等の金属塩を用いるため、アルデヒド化合物の還元除去後、糖液中の金属塩の含有量が増加する。特に非可食原料の糖液中には、通常金属塩が元来多く含まれるため、前記の還元除去により金属塩の含有量がさらに増加する。そのためこれら金属塩由来の金属が、後続する発酵プロセスや発酵液精製プロセス等に混入するため、発酵生成物を蒸留精製するにあたって金属量を低減することが求められる場合には、プロセス全体において金属塩除去の負荷が上がるといった問題があった。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、糖類を原料として各種の有機化合物を製造する際に、化学品の発酵生産プロセス並びに化学変換プロセスに供される糖液中の糖類以外のカルボニル化合物を十分に除去し、生産効率に優れ、プロセス設計を容易にすることができる糖液の精製方法、および該方法により得られる糖液を用いた有機化合物の製造方法を提供することを第２の課題とする。

発明者らの検討の結果、一定の手順での滅菌処理と還元剤処理とを組み合わせることにより、上記第１の課題が解決できることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明の第１の要旨は、下記の糖液の処理方法、処理糖液の製造方法、処理糖液、有機化合物の製造方法、培養方法に存する。
［１−１］糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）の処理方法であって、該糖液を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程と、前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程と、を含む糖液の処理方法。
［１−２］単糖および／または二糖を主成分とする糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）の処理方法であって、該糖液を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程と、前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程と、を含む糖液の処理方法。
［１−３］前記還元処理工程における前記糖液のｐＨが、２以上、８以下である上記［１−１］または［１−２］に記載の糖液の処理方法。
［１−４］前記還元処理工程における前記糖液の温度が、２０℃以上、７０℃以下である上記［１−１］〜［１−３］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［１−５］前記還元剤が亜硫酸化合物、次亜硫酸化合物及びチオ硫酸化合物から選ばれる少なくとも１つである上記［１−１］〜［１−４］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［１−６］前記還元剤の使用量が、前記糖液に含まれる糖の質量に対して、０．０５質量％以上、２．０質量％以下である上記［１−１］〜［１−５］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［１−７］前記加熱処理工程における前記糖液の加熱時間が１分以上、２０時間以下である上記［１−１］〜［１−６］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［１−８］糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）を処理して処理糖液を製造する方法であって、前記処理方法が上記［１−１］〜［１−７］のいずれか１に記載の糖液の処理方法である、処理糖液の製造方法。
［１−９］上記［１−１］〜［１−７］のいずれか１に記載の糖液の処理方法で処理して得られる処理糖液または上記［１−８］に記載の製造方法により得られる処理糖液。
［１−１０］糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程、
前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程、および
前記還元処理工程を経た糖液を含有する有機原料に有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程を含む有機化合物の製造方法。
［１−１１］上記［１−９］に記載の処理糖液を含有する有機原料に、有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程を有する有機化合物の製造方法。
［１−１２］有機物生産能力を有する微生物の培養方法であって、上記［１−９］に記載の処理糖液を炭素源として用いる微生物の培養方法。

本発明者らは、上記第２の課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖液に、特定の範囲の酸化数を有する硫黄と、アンモニウムイオンとを含む還元剤を作用させ、該糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物を還元する処理を行うことで、上記第２の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明の第２の要旨は、下記の糖液の処理方法、処理糖液の製造方法、還元処理糖液、有機化合物の製造方法、培養方法に存する。
［２−１］還元剤を用いた糖液の処理方法であって、前記還元剤がイオン化合物であり、該イオン化合物が、−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンと、アンモニウムイオンとを含み、かつ、前記還元剤が、前記糖液に含まれる糖類以外のカルボニル化合物を還元することを特徴とする糖液の処理方法。
［２−２］前記アニオンが、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、次亜硫酸イオン、チオ硫酸イオン、及び硫化物イオンから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする上記［２−１］に記載の糖液の処理方法。
［２−３］前記糖類以外のカルボニル化合物に対する前記還元剤のモル比が、０．０５以上、２．０以下である上記［２−１］又は［２−２］に記載の糖液の処理方法。
［２−４］前記糖類が、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖類である上記［２−１］〜［２−３］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［２−５］前記糖液が、非可食原料由来の糖液である上記［２−１］〜［２−４］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［２−６］前記カルボニル化合物が、アルデヒド化合物およびケトン化合物から選ばれる少なくとも１つである上記［２−１］〜［２−５］のいずれか１に記載の糖液の処理方法。
［２−７］還元剤を用いて糖液を処理する処理糖液の製造方法であって、
前記還元剤がイオン化合物であり、
該イオン化合物が、−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンと、アンモニウムイオンとを含み、
かつ、前記還元剤が、前記糖液に含まれる糖類以外のカルボニル化合物を還元する処理糖液の製造方法。

［２−８］上記［２−１］〜［２−６］のいずれか１に記載の糖液の処理方法で処理して得られる還元処理糖液または上記［２−７］に記載の製造方法により得られる還元処理糖液。
［２−９］反応液中で、上記［２−８］に記載の還元処理糖液を含有する有機原料に有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下「有機物生産工程」という。）を有する有機化合物の製造方法。
［２−１０］前記有機化合物がアルコール類、アミン類、カルボン酸類、およびフェノール類から選ばれる少なくとも１つである上記［２−９］に記載の有機化合物の製造方法。
［２−１１］前記有機化合物が、炭素数２〜１０の脂肪族アルコールである上記［２−９］又は［２−１０］に記載の有機化合物の製造方法。
［２−１２］前記有機化合物が、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸である上記［２−９］又は［２−１０］に記載の有機化合物の製造方法。
［２−１３］有機物生産能力を有する微生物の培養方法であって、上記［２−８］に記載の還元処理糖液を炭素源として用いる微生物の培養方法。

本発明の第１の糖液の処理方法によれば、滅菌状態を維持しつつ、糖類以外のカルボニル化合物の含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、目的とする有機化合物の収率を向上させることができる。
また本発明の第１の処理糖液であれば、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させることができる。
また、本発明の第１の有機化合物の製造方法であれば、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の第１の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける糖類以外のカルボニル化合物等の含有量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、発酵生産性を向上させることができる。

本発明の第２の糖液の処理方法によれば、糖液中の金属含有量を増加させることなく、糖類以外のカルボニル化合物の含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、目的とする有機化合物の収率を向上させることができる。また、糖液の処理で金属含有量を増加させないことに加え、熱分解などで還元剤として用いたイオン化合物を分解して、金属塩を除去する工程の負荷を軽減することができる。
また本発明の第２の還元処理糖液であれば、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させ、また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。
また、本発明の第２の有機化合物の製造方法であれば、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明の第２の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける糖類以外のカルボニル化合物含有量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、発酵生産性を向上させることができる。

以下、本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内であれば種々に変更して実施することができる。また、以下において「有機化合物」と「有機物」は同一のものを指す。

≪発明１≫
以下、本発明１の糖液の処理方法、処理糖液の製造方法、処理糖液、有機化合物の製造方法、培養方法について詳述する。

＜第１−１の発明：糖液の処理方法＞
本発明の第１−１の発明は、糖類を含有する液（以下、「糖液」。）を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する工程（加熱処理工程）と、前記加熱した糖液に還元剤を作用させる工程（還元処理工程）とを含むことを特徴とする。

第１−１の発明における糖液、並びに後述する第１−２の発明、第１−３の発明、および第１−４の発明（第１−１ないし第１−４の発明をまとめて「本発明１」ということがある。）で用いられる「糖液」とは、糖類を含有する液を意味し、好ましくは糖類を含有する水溶液である。以下、糖液中に含まれる糖類から順に説明する。

（糖類）
本発明１で用いる糖液に含まれる糖類は、特に限定はされず、いわゆる糖類一般を用いることができるが、微生物が炭素源として活用することができる糖が好ましい。具体的にはグリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；等が挙げられる。

本発明１で用いる糖液は、上記の糖類１種類を単独で含有していてもよいし、２種類以上を含有していてもよい。
本発明１で用いる糖液は、上記のうち単糖および／または二糖を主成分とすることが好ましい。すなわち、本発明１で用いられる糖液とは、単糖および／または二糖を主成分とする糖類を含有する液であることが好ましい。ここで、「主成分とする」とは、糖液に含まれる糖類の総量のうち５０ｍｏｌ％以上であることを意味し、好ましくは７０ｍｏｌ％以上、より好ましくは８０ｍｏｌ％以上、さらに好ましくは９０ｍｏｌ％以上であり、上限は１００ｍｏｌ％である。

本発明１で用いる糖類のうち、炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖類が好ましい。炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む糖とは、炭素数３以上７以下の単糖、および炭素数３以上７以下の単糖を構成成分として含む二糖類や多糖類を指す。中でも、ヘキソース、ペントース、およびこれらを構成成分とする二糖類がより好ましい。これらは自然界、植物の構成成分となっていることから豊富に存在し、原料の入手が容易であるためである。

上記ヘキソースとしては、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースが好ましく、グルコースがより好ましい。ペントースとしてはキシロース、アラビノースが好ましく、キシロースがより好ましい。二糖類としてはスクロースが好ましい。グルコース、キシロース、スクロースは、自然界、植物の主な構成成分となっているため、原料の入手が容易である点が挙げられる。

（糖液の由来、製法）
本発明１で用いる糖液の製造方法は、特に限定はされないが、例えば上記の糖類の１種類以上を水に溶解して製造する方法や、上記の糖類を構成成分として含む原料（以下、「糖原料」ということがある。）を、その構成単位である糖類まで分解して製造する方法が挙げられる。糖原料は、特に限定されないが、具体的には、セルロース、ヘミセルロース、デンプン等の多糖類や、多糖類を構成成分とする植物等が挙げられる。また澱粉糖化液または糖蜜なども使用され、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液が挙げられる。

前記糖原料は、食用にできるか否かの観点で、「可食原料」と「非可食原料」に分類することができる。
可食原料としては、サトウキビ、デンプン、テンサイ、とうもろこし、いも、キャッサバ、サトウカエデ等が挙げられる。
非可食原料としては、具体的には、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、米ぬか、樹木、木材、植物油カス、ササ、タケ、パルプ類、古紙、食品廃棄物、水産物残渣、家畜廃棄物等が挙げられる。

このうち、非可食原料は、可食原料と異なり、食用用途と競合せず、また通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定的な供給、資源の有効利用が図れる点で好ましい。
前記糖原料から糖類を得る方法は、特に限定されないが、例えばデンプン水溶液に希硫酸を加えて加水分解する方法、デンプン水溶液に種々の酵素を用いて、酵素分解して製造する方法、セルロースやヘミセルロースを、濃硫酸を用いてグルコースに代表されるヘキソースや、キシロースに代表されるペントースといった単糖まで加水分解する方法、糖原料の反応性を向上させる前処理を施した後に、酵素反応、亜臨界水、超臨界水等により加水分解する方法等が挙げられる。また、砂糖の製造工程で発生する糖蜜から砂糖を回収した後に残る廃糖蜜も糖液として使用可能である。

本発明で用いる糖液は、上述の方法で、糖原料に含まれる多糖類を加水分解して得られた糖液であることが好ましい。このようにして得られた糖液に含まれる糖液は、単糖および／または二糖を主成分とすることが好ましく、単糖を主成分とすることがより好ましい。
本発明１で用いる糖液は、一部、多糖やオリゴ糖などが分解せずに残存して含まれている場合もある。

本発明１における糖液中に含まれる糖類の濃度は、糖液の由来や、含有する糖の種類等によって大きく変動し、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮すると、糖類が単糖および／または二糖を主成分とする場合は、例えば、単糖および二糖からなる糖類の合計濃度で、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上、通常６０質量％以下が好ましく、好ましくは５０質量％以下である。

本発明１で用いる糖液は、上記糖類を含有する液であり、好ましくは水溶液であり、水と糖類以外に他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、特に限定されないが、例えば糖原料から単糖および／または二糖を主成分とする糖類を得た際に生じる、糖類以外の副生成物や不純物を含んでいてもよい。具体的には、後述する糖類以外のカルボニル化合物、脂肪族共役アルコール等のアルコール化合物；リグニン由来のフェノール化合物；や、アルカリ金属塩等のアルカリ金属化合物；アルカリ土類金属塩等のアルカリ土類金属化合物；窒素化合物、硫黄化合物、ハロゲン化合物、硫酸イオン等が挙げられる。

なお、本発明１で用いる糖液は、上述した糖類を含有する液であれば特に制限はないが、リグニン由来等の固形分に関しては、濾過や吸着等を用いて除去することが好ましい。また、本発明１で用いられる糖液は、使用する目的に応じて水で希釈して糖濃度を下げて用いたり、糖類の追添加や濃縮により糖濃度を高めて用いたりすることができる。

（糖類以外のカルボニル化合物）
本発明１で用いる糖液には、糖液を製造する工程および保管した際に生成する、糖類以外のカルボニル化合物が通常含まれている。カルボニル化合物としては、構造内にカルボニル基を有するものであれば特に限定はされず、脂肪族カルボニル化合物でも、芳香族基を有するものであってもよい。好ましくは炭素数１以上、好ましくは炭素数２０以下、より好ましくは炭素数１６以下、さらに好ましくは炭素数１２以下のカルボニル化合物である。上記範囲のカルボニル化合物は水溶性が比較的高く、糖液、特に糖を含む水溶液中に含まれることが多いためである。このようなカルボニル化合物の具体例としては、例えばフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、蟻酸、グリコールアルデヒド、グリオキサール、ヒドロキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、バニリン、イソバニリン、オルトバニリン、コニフェニルアルデヒド等のアルデヒド化合物；１，４−ベンゾキノン等のケトン化合物；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル等の不飽和エステル化合物、好ましくは不飽和共役エステル化合物；等が挙げられる。これらの化合物は、後述する第１−３の発明および第１−４の発明において、強い発酵阻害を発現することがある。

上記のアルデヒド化合物のうち、グリコールアルデヒドやグリオキサール等は、水溶性のアルデヒド化合物であり、物理吸着等での除去が困難であるため、これらを多く含む糖液を用いる場合に、本発明１の方法は特に有用である。
なお以下で糖液中の糖類以外のカルボニル化合物を、単に「カルボニル化合物」ということがある。

本発明者らは、前記糖類以外のカルボニル化合物が、糖液を原料とした有用化合物を発酵生産する工程において、有用化合物の生産量、蓄積量、および生産速度の低下減少を引き起こすことを見出した。なお以下で、前記のような作用を及ぼす物質を総称し、「発酵阻害物質」という。また前記発酵阻害物質を含有した糖液は、微生物の培養工程において、増殖量や増殖速度の低下が起こる。

（加熱処理工程）
本発明１の第１−１の発明は、糖液を加熱する工程（加熱処理工程）と、前記工程で加熱した糖液に還元剤を作用させる工程（還元処理工程）とを含む。以下、前記各工程について述べる。
前記加熱処理工程は、通常、本発明１で得られる糖液を発酵生産プロセスに用いた際、その目的以外の反応を引き起こす微生物等を殺滅または除去するため、すなわち滅菌処理を行なうための工程である。加熱処理工程は、特定の加熱温度で糖液を保持することで実施する。

前記加熱処理工程の加熱温度は、１００℃以上、１８０℃以下である。下限として好ましくは１１０℃以上、より好ましくは１１５℃以上であり、上限として好ましくは１６０℃以下であり、より好ましくは１５０℃以下であり、さらに好ましくは１４０℃以下である。前記範囲内の温度で加熱することにより、滅菌効果を十分に得ることができ、かつ加熱による糖の分解を抑制し、発酵阻害物質の増加を抑制できるためである。また前記範囲内であれば、滅菌処理の効果が十分に得られる加熱温度を適宜選択することができる。特に、上限値以下とすることで、糖液に含まれる単糖および二糖が分解されてヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）やカルボン酸等に変換されてしまうことがないため、好ましい。
加熱条件は滅菌処理の効果が十分に得ることができれば特に制限されず、単一の温度で加熱しても複数の温度で加熱してもよく、複数の温度で加熱する場合の各温度間の高低や温度勾配は任意である。

また、加熱処理を行う前に、糖液のｐＨを調整することが好ましい。好ましいｐＨの範囲は６〜８であり、適宜、塩酸や硫酸等の酸やアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加して上記範囲に調整することが好ましい。上記範囲であれば、糖の分解が促進されず糖濃度を維持することができる点で好ましい。
前記加熱処理工程の処理時間は、前記滅菌処理の効果が得られれば、特に制限はされないが、通常１分以上、好ましくは３分以上、より好ましくは５分以上であり、通常２０時間以下、好ましくは５時間以下、より好ましくは１時間以下である。前記範囲内であれば、十分な滅菌処理の効果が得られるためである。前記処理時間は、前記滅菌処理の効果が十分に得られる条件を適宜選択することができる。

糖液を加熱する手段は、前記の加熱温度に加熱できれば特に限定されず、糖液の処理量や組成に応じ適宜選択することができる。具体的には、タンク等を使用して糖液を回分式で加熱する方法や、連続殺菌器等を使用して糖液を通液しながら連続式で加熱する方法がある。また、加熱の方法としては、熱媒体、例えば蒸気をタンクや連続殺菌器等の装置内に直接導入して糖液を加熱する方法や、装置内に備えた熱交換器を使用して熱媒体、例えば蒸気などと間接的に接触させることで糖液を加熱する方法などがある。このうち大量処理をする際には連続式で加熱する方法が処理の効率が良い点で好ましい。

前述の通り、加熱工程に供する糖液は、糖原料に含まれる多糖類を加水分解して得られたものであることが好ましいが、これは、加熱工程に続けて還元処理工程を行うことが好ましいからである。本発明者らの検討に拠れば、加熱工程を行った後に、多糖類を加水分解する工程や長期保管などを行うと、加熱工程によりなし得た原料の滅菌状態を十分に保つことができず、結果として、目的の微生物による有機化合物の発酵生産効率が低下してしまうことが明らかとなった。これは、保管状態でｐＨ等の調整を行って滅菌状態を維持する工夫を行ったとしても十分でないことが分かっている。そのため、加熱工程と還元処理工程は続けて行うことが好ましい。例えば、加熱工程後、１〜２日以内に還元処理工程を実施することが好ましい。

（還元処理工程）
前記還元処理工程は、前記加熱処理工程を経た糖液に、還元剤を作用させることで、通常、糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物の含有量を低減させることを目的とする工程である。
前記還元処理工程を経ることで、糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物は、通常、前記カルボニル化合物よりも発酵阻害の小さな物質に変換されると推定される。具体的には、前記カルボニル化合物と、後述する還元剤との反応付加物（以下、「還元処理体」ということがある）が形成されていると推定される。

具体的な還元処理体としては、例えば、アルデヒド化合物を、還元剤として亜硫酸塩や次亜硫酸塩を用いて前記還元処理工程に供した場合、α−ヒドロキシスルホン酸塩に変換されているものと推定される。
前記糖液を、前記加熱処理工程及び前記還元処理工程に供することで、前記糖液を滅菌し、かつ糖液中の発酵阻害物質を低減することができ、有機化合物の発酵生産プロセス、及び微生物の培養工程で増殖速度や増殖量を低減させることなく、発酵プロセスを実施することができる。

前記還元処理工程で使用する還元剤は、前記カルボニル化合物の含有量を低減することができる限りにおいて特に限定はされないが、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸カルシウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水等の亜硫酸化合物；次硫酸ナトリウム、次亜硫酸カリウム、次亜硫酸カルシウム、次亜硫酸アンモニウム等の次亜硫酸化合物；チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸カルシウム、チオ硫酸アンモニウム等のチオ硫酸化合物；硫化ナトリウム、硫化カリウム、硫化カルシウム、硫化アンモニウム等の硫化物；アスコルビン酸、システイン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の還元性を有する有機物；等が挙げられる。

これらの中でも、入手及び取扱いが容易の観点で亜硫酸化合物、次亜硫酸化合物及びチオ硫酸化合物が好ましい。
前記還元剤は、本発明１の効果を妨げない限り、１種類を用いても、２種類以上の還元剤を組み合わせて用いてもよく、その際に使用する比率も限定されない。
前記還元処理の条件は、加熱処理工程の後に還元処理工程が行われ、前記加熱処理にて滅菌処理された状態を維持しながら、糖液中の前記カルボニル化合物の含有量を低減することができる限りにおいて、特に限定されない。

カルボニル化合物等の発酵阻害物質は、還元剤と反応付加物、すなわち還元処理体を形成することで糖液から除去されると考えられる。ところが前記還元処理体は、高温条件下で不安定であるため、糖液の滅菌処理を行う際の加熱条件での分解等が起こると考えられる。
本願発明の製造方法により、滅菌状態を維持しつつ、発酵阻害をもたらすカルボニル化合物を除去することができるため、糖液、好ましくは非可食由来のカルボニル化合物を多く含む糖液からでも、有機化合物を効率よく製造することが可能になるものと考えられる。

なお前記糖液中に含まれる糖類もアルデヒド基等のカルボニル基を有しているため、前記カルボニル化合物と同様、前記還元剤と反応する。すなわち糖と、前記還元剤の反応生成物が生成することがあるが、後述する有機化合物を発酵生産する工程や、微生物の培養工程において問題がない限りは、前記還元処理条件は限定されない。そのため糖類以外のカルボニル化合物の含有量が低減でき、かつグルコースやキシロースなどの糖類が本発明１の還元剤と反応しにくい、選択的な反応条件を選択することが好ましい。

本発明１の還元処理工程の処理温度は、特に限定されないが、通常２０℃以上、１００℃以下、好ましくは８０℃以下、更に好ましくは７０℃以下である。前記還元処理工程を前記温度範囲内で行うことにより、還元剤や還元処理体の分解が抑制でき、糖類を還元剤と反応させることなく、発酵阻害物質である糖類以外のカルボニル化合物の含有量を低減することが可能となる。

前記還元処理工程における前記糖液のｐＨは、特に限定されないが、前記還元剤や前記還元処理体の分解が抑制でき、前記カルボニル化合物等の発酵阻害物質の含有量を低減させる観点から、通常２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、通常８以下、好ましくは７以下である。前記加熱処理終了後にｐＨは酸性、具体的にはｐＨ＝３〜６程度を呈することがある。その際、適宜、塩酸や硫酸等の酸やアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加してｐＨを調整してもよいが、上記範囲であれば還元剤の分解が促進されず、還元処理が効率よく行われる点で好ましい。

前記還元処理工程で使用する還元剤の量は、糖液中の発酵阻害物質濃度、具体的には前記カルボニル化合物の濃度、使用する還元剤の種類、反応温度、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害物質の除去効率、糖と還元剤の反応抑制、未反応の還元剤量低減など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されない。
還元剤の使用量は、通常、前記糖液中に含まれる糖の質量に対して、０．０５質量％以上、好ましくは、０．１質量％以上であり、通常２．０質量％以下であり、好ましくは１．５質量％以下である。

前記還元処理工程の処理時間は、糖液中の前記発酵阻害物質の含有量及び濃度、具体的には前記カルボニル化合物の濃度、使用する還元剤の種類、反応温度、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害物質の除去効率、糖と還元剤の反応抑制など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されるものではない。
具体的には、還元剤を加えて、前記糖液の温度が、前記処理温度になってから、通常、１分以上であり、好ましくは１０分以上、より好ましくは３０分以上である。上限は、発酵阻害物質が十分に除去されれば特に制限されないが、通常４８時間以下、好ましくは２４時間以下、より好ましくは１０時間以下である。

処理時間が前記範囲内であることにより、前記カルボニル化合物等の発酵阻害物質の含有量を十分に低減させることができ、また糖と還元剤の反応生成物の生成も抑制できる。
前記還元処理工程では、溶媒を使用することができ、その種類は特に限定されるものではないが、通常は水が使用される。また有機溶媒を共溶媒として使用してもよいが、水相に有機溶媒が混入することで発酵阻害を引き起こす可能性があるため、発酵生産や微生物の培養工程に供する際に有機溶媒を分離する工程が必要となるため、糖液は水溶液のまま還元処理工程に供することが望ましい。

＜第１−２の発明：処理糖液＞
前記第１−１の発明における加熱処理及び還元処理によって、糖液は滅菌され、かつ糖液に含有される糖類以外のカルボニル化合物の含有量が、低減されるため、得られる糖液中の前記カルボニル化合物の濃度は、通常、最初の糖液中の濃度より低い。なお、前記加熱処理工程及び還元処理工程に供した後の糖液を、以下「処理糖液」ということがある。

前記カルボニル化合物を、本発明１の還元剤と作用させることにより、後述する発酵プロセスにおいて、微生物の増殖や有用化合物の発酵生産の効率を向上させることができる。
第１−２の発明の処理糖液は、前記カルボニル化合物と還元剤の反応生成物を含んでいてもよく、具体的には、前記カルボニル化合物がアルデヒド化合物である場合、対応するα−ヒドロキシスルホン酸塩等を含んでいてもよい。
また、第１−２の発明の処理糖液は、必要に応じて、適宜、イオン交換樹脂、活性炭、合成樹脂、水素添加等の手法でさらに処理しても構わない。

＜第１−３の発明：有機化合物の製造方法＞
前記第１−２の発明の処理糖液は、有機物生産能力を有する微生物を作用させることにより、各種の有機化合物を製造することができる。

（有機物生産能力を有する微生物）
第１−３の発明で用いる微生物は、有機物生産能力を有する微生物であれば、特に限定はされない。
なお第１−３の発明における「有機物生産能力を有する微生物」とは、該微生物を培地中で培養したときに、該培地中に有機物を生成蓄積することができる微生物をいう。

（有機化合物）
微生物が生産する有機化合物としては、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機化合物であれば限定されないが、具体的には、エタノール、プロパノール、ブタノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール等のアルコール類；１，５−ペンタメチレンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミン等のアミン類；酢酸、酪酸、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、シス−アコニット酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソイソ吉草酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸、レブリン酸、キナ酸、シキミ酸、アクリル酸、メタクリル等のカルボン酸類；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン等のアミノ酸類；フェノール、カテコール、ハイドロキノン等のフェノール類；安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族カルボン酸類；イノシン、グアノシン等のヌクレオシド類、イノシン酸、グアニル酸等のヌクレオチド；イソブチレン、イソプレン、ブタジエン等の不飽和炭化水素化合物等が挙げられる。

これらの中でも、発酵生産として公知の方法を採用でき、かつ、樹脂原料として使用可能であることから、アルコール類、アミン類、カルボン酸類、フェノール類が好ましく、炭素数２〜１０の脂肪族アルコール類や、炭素数２〜１０の脂肪族カルボン酸類がより好ましい。中でも、発酵生産性の観点から、エタノール、ブタンジオール、コハク酸がさらに好ましい。

（微生物）
第１−３の発明で用いる微生物は、有機物生産能力を有する微生物であれば特に限定されないが、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選択される微生物であることが好ましい。

その中でも、コリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、マンヘミア（Mannheimia）属細菌、バスフィア（Basfia）属細菌、ザイモバクター（Zymobacter）属細菌、糸状菌、および酵母菌からなる群より選ばれる少なくとも１つが好ましく、より好ましくはコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。

上記コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌、アースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に分類される細菌である。

第１−３の発明で使用可能なコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、およびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl W, Ehrmann M, Ludwig W, Schleifer KH, Int J Syst Bacteriol., 1991, Vol.41, p255-260）、本発明１においては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、およびその変異株ＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株およびＭＪ−２３３ ＡＢ−４１株と同一の株とする。

上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。

第１−３の発明で使用可能な大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等が挙げられる。また、第１−３の発明で使用可能なアナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌としては、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセン（Anaerobiospirillum succiniciproducens）等が挙げられる。
また、第１−３の発明に使用可能なアクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス（Actinobacillus succinogenes）等が挙げられる。また第１−３の発明に使用可能なマンヘミア（Mannheimia）属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Mannheimia succiniciproducens）等が挙げられる。

また第１−３の発明で使用可能なバスフィア（Basfia)属細菌としては、バスフィア・サクシニシプロデュセン（Basfia succiniciproducens）等が挙げられる。また、第１−３の発明で使用可能なザイモモナス（Zymomonas）属細菌としては、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等が挙げられる。また、第１−３の発明で使用可能なザイモバクター（Zymobacter）属細菌としては、ザイモバクター・パルメ（Zymobacter palmae）等が挙げられる。

また第１−３の発明で使用可能な糸状菌としては、Aspergillus属、Penicillium属、Rhizopus属等が挙げられる。このうち、Aspergillus属では、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）等が挙げられ、Penicillium属では、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Penicillium simplicissimum）等が挙げられる。また、Rhizopus属では、リゾパス・オリゼー（Rhizopus oryzae）等が挙げられる。

また、第１−３の発明で使用可能な酵母菌としては、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）が挙げられる。
上記サッカロミセス属（Saccharomyces）としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、サッカロミセス・バイアヌス（Saccharomyces bayanus）等が挙げられる。また、上記シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等が挙げられる。また、上記カンジダ属（Candida）としては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）等が挙げられる。また、上記ピキア属（Pichia）としては、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等が挙げられる。

また上記クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）としては、クルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイウェロマイセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermotolerans）等が挙げられる。また上記ヤロウィア属（Yarrowia）としては、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）等が挙げられる。また上記チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）としては、チゴサッカロミセス・バイリイ（Zygosaccharomyces bailii）、チゴサッカロミセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）等が挙げられる。

上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また上記微生物は、本来的に有機物生産能力を有する微生物であるが、育種により有機物生産能力を付与したものであってもよい。

育種により有機物生産能力を付与する手段としては、変異処理や遺伝子組換え処理などが挙げられ、有機物生合成経路における酵素遺伝子の発現強化や副生物生合成経路における酵素遺伝子の発現低減など、公知の方法を採用することができる。例えば、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。エタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコール生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やアルコールデヒドロゲナーゼ活性を増強するような手段などが挙げられる。

上記ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ＬＤＨという）活性を低減させるような改変方法としては、特に限定はされないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＬＤＨ活性が低減した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＬＤＨをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、染色体上のｌｄｈ遺伝子の破壊や、プロモーターやシャインダルガルノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変等により達成される。

ＬＤＨ活性が低減した株の具体的な作製方法としては、染色体への相同組換えによる方法（日本国特開平１１−２０６３８５号公報等参照）や、ｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Schafer A, Tauch A, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A, Gene 1994 Vol.145(1), p69-73）等が挙げられる。
上記ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣとも呼ぶ）活性が増強するような改変方法としては、特に限定されないが、上述した微生物を親株として用い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＰＣ活性が増強した株を選択することによってそれぞれ得ることができる。また、ＰＣをコードする遺伝子を用いて改変してもよい。具体的には、ｐｃ遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、プラスミドを用いたり、公知の相同組換え法によって染色体上で多コピー化させたりすることなどによって達成できる。なお、ＰＣ活性の増強は、染色体上またはプラスミド上でｐｃ遺伝子のプロモーターへの変異導入、より強力なプロモーターへの置換などによって高発現化させることによっても達成できる。

ＰＣ活性の増強に用いるｐｃ遺伝子としては、ＰＣ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。さらに、コリネ型細菌以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｐｃ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｐｃ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＰＣ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

上記のようにして単離されたＰＣをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＰＣ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＰＣ活性増強株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＰＣをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＰＣ活性増強株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。

染色体上またはプラスミド上にＰＣ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｐｃ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。

本発明１において用いられる微生物に、育種によりアルコール生産能を付与する場合としては、カルボン酸生産能を付与する場合と同様の方法で、ＬＤＨ活性を低減するよう改変された微生物を利用することができる。
上記アルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＡＤＨとも呼ぶ）活性が増強するように改変された微生物は、上述のＰＣ活性を増強する方法と同様にして作製することができる。

ＡＤＨ活性の増強に用いるａｄｈ遺伝子としては、ＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のａｄｈＢ遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のａｄｈＥ２遺伝子を挙げることができる。さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

なお、本発明１に用いる微生物は、有機物生産能力を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
第１−３の発明で用いる微生物は、有機物生産能力を有し、且つペントース利用能を有する微生物であってもよく、ペントース利用能を有する微生物が好ましい。本発明１において、「ペントース利用能」とは、該微生物がペントースを炭素源として利用し、増殖または有機物生産することができることをいう。

微生物が炭素源として利用するペントースとしては、炭素源として利用可能であれば特に限定されない。具体例としては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソース等のアルドペントース類、リブロース、キシルロース等のケトペントース等が挙げられる。これらの中でも、アルドペントース類が好ましく、非可食原料として利用されるヘミセルロース系バイオマスに含まれるキシロース、アラビノースがより好ましい。中でも、ヘミセルロース系バイオマス中の含有量が多いキシロースが特に好ましい。

ここで、ペントース利用能を有する微生物は、本来的にペントース利用能を有する微生物であってもよいし、育種によりペントース利用能を付与したものでもよい。
育種によりペントース利用能を付与する手段としては、遺伝子組換え処理などが挙げられ、ペントース代謝経路の酵素遺伝子を導入など公知の方法を採用することができる。例えば、キシロース利用能を付与する場合は、後述するようなキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入する方法、またはキシロースリダクターゼ遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。アラビノース利用能を付与する場合は、後述するようなアラビノースイソメラーゼ遺伝子およびリブロキナーゼ遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ遺伝子を導入する方法などが挙げられる。

以下、育種によりペントース利用能を付与する具体例として、キシロース利用能の付与に関する改変例とアラビノース利用能の付与に関する改変例について説明する。
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースイソメラーゼ（以下、ＸｙｌＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。

ここで、「ＸｙｌＡ活性」とは、キシロースを異性化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．５）をいう。ＸｙｌＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＧａｏらの方法（Gao Q, Zhang M, McMillan JD, Kompala DS, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, Vol.98(100), p341-55）により、ＸｙｌＡ活性を測定することによって確認することができる。

ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株の具体的な作製方法としては、ｘｙｌＡ遺伝子のプラスミドによる導入や、公知の相同組換え法による染色体上への導入などによって達成できる。
ＸｙｌＡ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＡ遺伝子としては、ＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来の遺伝子を挙げることができる。

さらに、大腸菌以外の細菌または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

上記のようにして単離されたＸｙｌＡをコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能に挿入することにより、ＸｙｌＡ発現ベクターが提供される。この発現ベクターで形質転換することにより、ＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡにＸｙｌＡをコードするＤＮＡを発現可能に組み込むことによってもＸｙｌＡ活性が付与または増強された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。

染色体上またはプラスミド上にＸｙｌＡ遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、ｘｙｌＡ遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。

また、キシロース利用能の付与においては、ＸｙｌＡ活性の付与または増強に加えて、キシルロキナーゼ（以下、ＸｙｌＢとも呼ぶ）活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。
ここで、「ＸｙｌＢ活性」とは、キシルロースをリン酸化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１７）をいう。ＸｙｌＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＥｌｉａｓｓｏｎらの方法（Eliasson A, Boles E, Johansson B, Otensterberg M, Thevelein JM, Spencer-Martins I, Juhnke H, Hahn-Hatengerdal B, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, Vol.53, p376-82）により、ＸｙｌＢ活性を測定することによって確認することができる。

ＸｙｌＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。
ＸｙｌＢ活性の付与または増強に用いるｘｙｌＢ遺伝子としては、ＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。

さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｙｌＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸｙｌＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

ＸｙｌＡ活性およびＸｙｌＢ活性を付与または増強する場合、導入するｘｙｌＡ遺伝子とｘｙｌＢ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。
キシロース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にキシロースリダクターゼ（以下、ＸＲとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（以下、ＸＤＨとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることもできる。

ここで、「ＸＲ活性」とは、キシロースを還元してキシリトールを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．２１）をいう。ＸＲ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＳａｓａｋｉらの方法（Sasaki M, Jojima T, Inui M, Yukawa H, Appl Microbiol Biotechnol., 2010, Vol.86(4), p1057-66）により、ＸＲ活性を測定することによって確認することができる。

ＸＲ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＲ活性の付与または増強に用いるｘｒ遺伝子としては、ＸＲ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ１遺伝子を挙げることができる。
さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｒ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＲ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

次に、「ＸＤＨ活性」とは、キシリトールを脱水素化してキシルロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：１．１．１．９）をいう。ＸＤＨ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＲｉｚｚｉらの方法（Rizzi M, Harwart K, Erlemann P, Bui-Thahn NA, Dellweg H, J Ferment Bioeng., 1989, Vol.67, p20-24）により、ＸＤＨ活性を測定することによって確認することができる。

ＸＤＨ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＸＤＨ活性の付与または増強に用いるｘｄｈ遺伝子としては、ＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）由来のＸＹＬ２遺伝子を挙げることができる。

さらに、上記以外の微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のｘｄｈ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＸＤＨ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

また、キシロース利用能の付与においては、ＸＤＨ活性およびＸＲ活性の付与または増強に加えて、ＸｙｌＢ活性を付与または増強するように改変された微生物であってもよい。ＸｙｌＢ活性の付与または増強に関しては上述の通りである。
アラビノース利用能を付与された微生物は、上述した微生物を親株として用い、該親株にアラビノースイソメラーゼ（以下、ＡｒａＡとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロキナーゼ（以下、ＡｒａＢとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子およびリブロース５リン酸エピメラーゼ（以下、ＡｒａＤとも呼ぶ）活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。

ここで、「ＡｒａＡ活性」とは、アラビノースを異性化してリブロースを生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．３．１．４）をいう。ＡｒａＡ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＰａｔｒｉｃｋらの方法（Patrick JW, Lee N, J. Biol. Chem., 1968, Vol.243, p4312-19）により、ＡｒａＡ活性を測定することによって確認することができる。

ＡｒａＡ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＡ活性の付与または増強に用いるａｒａＡ遺伝子としては、ＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。

さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＡ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＡ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＡ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

次に、「ＡｒａＢ活性」とは、リブロースをリン酸化してリブロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：２．７．１．１６）をいう。ＡｒａＢ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＬｅｅらの方法（Lee N, Englesberg E, Proc. Natl. Acad. Sci., 1962, Vol.48, p335-48）により、ＡｒａＢ活性を測定することによって確認することができる。

ＡｒａＢ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＢ活性の付与または増強に用いるａｒａＢ遺伝子としては、ＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。

さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＢ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＢ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＢ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

さらに、「ＡｒａＤ活性」とは、リブロース５リン酸を異性化してキシルロース５リン酸を生成する反応を触媒する活性（ＥＣ：５．１．３．４）をいう。ＡｒａＤ活性が付与または増強されたことは、公知の方法、例えばＤｅａｎｄａらの方法（Deanda K, Zhang M, Eddy C, Picataggio S, Appl Environ Microbiol., 1996, Vol.62(12), p4465-70）により、ＡｒａＤ活性を測定することによって確認することができる。

ＡｒａＤ活性が付与または増強された株は、上述のＸｙｌＡ活性を付与または増強する方法と同様にして作製することができる。ＡｒａＤ活性の付与または増強に用いるａｒａＤ遺伝子としては、ＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の遺伝子を挙げることができる。

さらに、上記以外の細菌、または他の微生物、動植物由来のａｒａＤ遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のａｒａＤ遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、ホモロジー等に基づいてＡｒａＤ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、そのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。

ＡｒａＡ活性およびＡｒａＢ活性およびＡｒａＤ活性を付与または増強する場合、導入するａｒａＡ遺伝子、ａｒａＢ遺伝子、およびａｒａＤ遺伝子は同じ遺伝子座上に存在していてもよく、それぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つまたは３つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、それぞれの遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。

なお、第１−３の発明に用いる微生物は、ペントース利用能を付与するための改変のうちの２種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
また、第１−３の発明に用いる微生物は、有機物生産能力を付与するための改変とペントース利用能を付与するための改変を組み合わせて得られる微生物であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。

（有機物生産工程）
第１−３の発明は、本発明１−２の処理糖液を含有する有機原料に、後述する水性媒体中で、有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下、有機物生産工程、ということがある）を含むものである。中でも、処理糖液を含有する有機原料に前記微生物を作用させることにより有機化合物を生成させ、これを回収することが好ましい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。なお「水性媒体」とは、水、または水を主成分とする水溶液及びゲル（寒天）等と、糖液を含有する有機原料と、有機物生産能力を有する微生物、並びに有機原料中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物の還元剤付加物のほか、微生物の培養に必要な成分を含む液体を意味し、溶解していない液体・固体が分散したものも含まれる。

第１−３の発明で前記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。すなわち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物に有機化合物を生産させてもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができるが、このときに使用する有機原料としては、処理糖液を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。

なお、種培養または本培養した微生物を水性媒体中で増殖させながら、処理糖液を含有する有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、処理糖液を含有する有機原料を含む水性媒体中で有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよい。
また、第１−３の発明において用いられる微生物としては、上記微生物のほか、微生物の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。

第１−３の発明では処理糖液を含有する有機原料を使用するが、必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。有機化合物製造方法において使用する処理糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して有機化合物を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。

また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液または糖蜜なども処理糖液以外の有機原料として使用することができ、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機化合物の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、水性媒体に対して、通常５０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常３００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。また、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。

（水性媒体）
第１−３の発明において用いられる「水性媒体」は特に限定されず、は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、第１−３の発明で用いる微生物が資化して有機化合物を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、前記水性媒体には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。

また、前記水性媒体は、例えば上述した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガス（炭酸ガス）から選ばれる少なくとも１つを含有することが好ましい。炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムなどから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸またはこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。

前記水性媒体中における炭酸イオンまたは重炭酸イオンの濃度は、通常１ｍＭ以上、好ましくは２ｍＭ以上、さらに好ましくは３ｍＭ以上であり、また、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下である。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、水性媒体１Ｌ当たり通常５０ｍｇ以上、好ましくは１００ｍｇ以上、さらに好ましくは１５０ｍｇ以上の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましく、一方、水性媒体１Ｌ当たり通常２５ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下、さらに好ましくは１０ｇ以下の二酸化炭素ガスを含有させることが好ましい。

前記水性媒体のｐＨは、用いる微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整されることが好ましい。具体的には、コリネ型細菌を用いる場合には、水性媒体のｐＨを、通常５．５以上、好ましくは６以上、より好ましくは６．６以上、さらに好ましくは７．１以上であり、一方、通常１０以下、好ましくは９．５以下、より好ましくは９．０以下とすることが好ましい。

前記水性媒体のｐＨは、生産される有機化合物が酸性物質である場合には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア（水酸化アンモニウム）、またはそれらの混合物等を添加することによって調整することができる。生産される有機化合物が塩基性物質である場合には、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給することによって調整することができる。

（有機物生産工程の反応条件）
第１−３の発明で用いる微生物の菌体量は、特に限定されないが、湿菌体質量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
第１−３の発明における有機物生産工程の反応時間は、特に限定はされないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常１６８時間以下、好ましくは７２時間以下である。

第１−３の発明における有機物生産工程の反応温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行ってもよいが、生育至適温度より高い温度で行うことが有利であり、通常生育至適温度より２℃以上、好ましくは７℃以上、より好ましくは１５℃以上、さらに好ましくは２０℃以上高い温度で行う。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常３５℃以上、好ましくは３７℃以上、さらに好ましくは３９℃以上であり、一方、通常４５℃以下、好ましくは４３℃以下、さらに好ましくは４１℃以下である。有機化合物生産反応の間、常に３５℃〜４５℃の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。

第１−３の発明における有機物生産工程は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行なうことが好ましい。ここでいう嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
第１−３の発明における有機物生産工程は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応または連続反応のいずれにも適用することができる。

（その他の工程）
第１−３の発明は、上記の有機物生産工程により有機化合物が生成し、水性媒体中に蓄積させることができる。前記有機物生産工程で蓄積させた有機化合物は、常法に従って、前記水性媒体より回収する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には、例えば、蓄積させた有機化合物がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸等のカルボン酸である場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、回収することができる。

また第１−３の発明においては、前記の精製する工程で得られたものを精製する工程をさらに含んでいてもよい。具体的には前記水性媒体から回収した溶液を結晶化（晶析）またはカラムクロマトグラフィーにより精製して、カルボン酸を得ることができる。蓄積させた有機化合物がエタノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールである場合には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、蒸留等で濃縮し、その溶液を膜脱水するなどして、アルコールを精製することができる。

＜第１−４の発明：微生物の培養方法＞
第１−４の発明の培養方法は、本発明１−２の処理糖液を含有する有機原料を炭素源として用いて、有機物生産能力を有する微生物を培養させる。本発明１−４の培養方法によって得られた微生物は、その後、有機原料に作用させることによって有機化合物を生成させ、これを回収することができる。このときの有機原料としては、前記処理糖液を用いてもよいし、処理糖液中にその他の有機原料を含んでいてもよい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。

第１−４の発明の培養方法では、処理糖液を含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、処理糖液を含む液体培地で培養してもよい。後述する種培養や本培養を行なうことで、有機化合物生産反応に供する前記微生物を増殖させることができる。

（種培養）
種培養は、本培養に供する前記微生物の菌体を調製するために行なうものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。さらに、必要に応じて、前記培地に炭素源として処理糖液を添加してもよいし、グルコース等の有機原料を添加してもよい。

種培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。一般的な生育至適温度とは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。

種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。一般的な生育至適ｐＨとは、有機化合物の生産に用いられる条件において最も生育速度が速いｐＨのことを言う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。
また、種培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気や攪拌等により、酸素を供給することが好ましい。

種培養後の菌体は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。

（本培養）
本培養は、後述する有機化合物生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。

本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。

また、本培養においては、炭素源として処理糖液を含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。本培養において使用する処理糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロース、またはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。

これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、２種類以上を任意の組み合わせで添加してもよい。
前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常１〜１００ｇ／Ｌ、好ましくは５〜５０ｇ／Ｌの範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。

また、本培養は、一般的な生育至適温度で行なうことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２５℃〜４０℃であり、３０℃〜３７℃が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常２５℃〜３５℃であり、２８℃〜３３℃がより好ましく、約３０℃が特に好ましい。
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行なうことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ４〜１０であり、ｐＨ６〜８が好ましい。コリネ型細菌の場合は、通常ｐＨ６〜９であり、ｐＨ６．５〜８．５が好ましい。

また、本培養の培養時間は、一定量の菌体が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気や攪拌等により、酸素を供給することが好ましい。
また、本培養においては、より有機化合物の製造に適した菌体の調製方法として、日本国特開２００８−２５９４５１号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。

本培養後の菌体は、前述の有機化合物生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって菌体を回収した後に用いてもよい。

≪発明２≫
以下、本発明２の糖液の処理方法、処理糖液の製造方法、還元処理糖液、有機化合物の製造方法、培養方法について詳述する。

＜第２−１の発明：糖液の処理方法＞
本発明２の第２−１の発明は、糖液を、−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンと、アンモニウムイオンとを含むイオン化合物を還元剤として還元処理に供し、該糖液中の糖類以外のカルボニル化合物を還元することを特徴とする。
第２−１の発明における糖液、並びに後述する第２−２の発明、第２−３の発明、および第２−４の発明（第２−１ないし第２−４の発明をまとめて「本発明２」ということがある。）で用いられる「糖液」とは、糖類を含有する水溶液をいう。また第２−１の発明に−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンと、アンモニウムイオンとを含むイオン化合物を「本発明２の還元剤」ということがある。以下、糖液中に含まれる糖類から順に説明する。

（糖類）
本発明２で用いる糖液に含まれる糖類は、特に限定はされず、いわゆる糖類一般を用いることができる。具体的には、前述の＜第１−１の発明＞の項で説明した（糖類）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。

（糖液の由来、製法）
本発明２で用いる糖液の製法は、特に限定はされないが、例えば上記の糖類の１種類以上を水に溶解して製造する方法や、上記の糖類を構成成分として含む原料（以下、「糖原料」ということがある。）を、その構成単位である糖類まで分解して製造する方法が挙げられる。具体的には、前述の＜第１−１の発明＞の項で説明した（糖の由来、製法）と同一のものおよび方法が挙げられ、好ましい範囲も同様である。

（糖類以外のカルボニル化合物）
本発明２で用いる糖液には、糖液を製造する工程および保管した際に生成する、糖類以外のカルボニル化合物が通常含まれている。このようなカルボニル化合物の具体例としては、具体的には、前述の＜第１−１の発明＞の項で説明した（糖類以外のカルボニル化合物）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。

本発明者らは、前記糖類以外のカルボニル化合物が、糖液を原料とした有用化合物を発酵生産する工程において、有用化合物の生産量、蓄積量、および生産速度の低下減少を引き起こすことを見出した。なお以下で、前記のような作用を及ぼす物質を総称し、「発酵阻害物質」という。また前記発酵阻害物質を含有した糖液は、微生物の培養工程において、増殖量や増殖速度の低下が起こり、また化学変換プロセスを経て有機化合物を生産する工程において、カルボニル化合物の反応性の高さから生成物の着色を起こすことを見出した。

（還元処理）
第２−１の発明では、上記の糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物を、前記本発明２の還元剤を用いて還元処理する。これにより前記カルボニル化合物は、発酵阻害の小さな物質に変換されることで、その含有量を低減させることができる。なお、第２−１の発明における「還元処理」とは、上記の糖液中に含まれる糖類以外のカルボニル化合物を、前記本発明２の還元剤と反応した物質（以下、「還元処理体」ということがある）に変換する処理をいう。

上記還元処理体として、糖液中の糖以外のカルボニル化合物のカルボニル基と還元剤とが反応していると推定される。例えば、アルデヒド化合物を、還元剤として亜硫酸塩や次亜硫酸塩を用いて還元処理をした場合、α−ヒドロキシスルホン酸塩に変換されているものと推定される。前記カルボニル化合物は、アルデヒド化合物およびケトン化合物から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。これらの化合物は、後述する第２−３の発明および第２−４の発明において、高い発酵阻害性を有することが多いためである。

上記の還元処理に糖液を供することで、有機化合物の発酵生産における阻害効果が低減され、また微生物の培養工程でも増殖速度や増殖量を低減させることなく、糖液の発酵プロセスを実施することができる。また、化学変換プロセスにおいても反応性が高いカルボニル基が変換されることで、生成物の着色等を抑えることができる。

（還元剤）
第２−１の発明における還元処理は、前記本発明２の還元剤の存在下で行なう。本発明２で用いる還元剤は、イオン化合物である。前記イオン化合物は、−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンを含む。また前記イオン化合物は、そのカチオンとしてアンモニウムイオンを含む。
前記のイオン化合物を還元剤として用いることで、糖液中のカルボニル化合物、好ましくは水溶性のアルデヒド化合物の含有量を減少させることができ、後述する発酵生産プロセスでの有機化合物の収率を向上させることができる。また、金属塩を使用しないため、還元剤由来の金属が後段の発酵プロセスや発酵液精製プロセス等に混入せず、金属塩除去の負荷を低減することができる。

前記イオン化合物のアニオンは、−２価、＋２価、＋３価、及び＋４価から選ばれるいずれかの酸化数を有する硫黄を１種以上含有するアニオンである。
ここで、硫黄の酸化数は、還元剤中の電子をある一定の方法で各原子に割り当てた時、硫黄原子がもつ荷電を表す値である。一定の方法は以下記載（ａ）〜（ｅ）の通りであり、本手法を用いることで還元剤中に含まれる硫黄の酸化数は一義的に決定される。（ａ）イオン結合性化合物中の単原子イオンの酸化数はその荷電数に等しい。（ｂ）単体中の原子の酸価数は０とする。（ｃ）共有結合性化合物中では、共有電子対をその共有原子の電気陰性度の大きな原子の方にすべて割り当てた時、各原子に残る荷電数を酸化数とする。（ｄ）化合物内に、同一元素が２つ以上存在する場合は、等分する。（ｅ）水素の酸化数を＋１、酸素の酸化数を−２として求める。

具体的に、酸化数が−２価の硫黄を含むアニオンとして、硫化物イオン等が挙げられる。また酸化数が＋２価の硫黄を含むアニオンとして、チオ硫酸イオン等が挙げられる。また酸化数が＋３価の硫黄を含むアニオンとして、次亜硫酸イオン等が挙げられる。また酸化数が＋４価の硫黄を含むアニオンとして、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン等が挙げられる。
さらに具体的には、亜硫酸イオン、亜硫酸水素イオン、次亜硫酸イオン、チオ硫酸イオン、硫化物イオンから選ばれる少なくとも１つのアニオンが好ましく、入手及び取扱いが容易な観点から、亜流酸イオン、次亜硫酸イオンがより好ましい。
これらのアニオンを含むイオン化合物を用いることで、糖液中のカルボニル化合物の含有量の低減が可能である。

本発明２で用いるイオン化合物は、上記のアニオンとアンモニウムイオンを含むイオン化合物であれば、特に限定はされず、具体的には、ジアンモニウム塩、モノアンモニウム塩等が挙げられる。
具体的なイオン化合物としては、亜硫酸アンモニウム等の亜硫酸塩、亜硫酸水素アンモニウム等の亜硫酸水素塩、次亜硫酸アンモニウム等の次亜硫酸塩、チオ硫酸アンモニウム等のチオ硫酸塩、硫化アンモニウム等の硫化物が挙げられるが、亜硫酸アンモニウム、次亜硫酸アンモニウムが、入手及び取扱いが容易の点で好ましい。

上記の還元剤は、本発明２の効果を妨げない限り、１種類を用いても、２種類以上の還元剤を用いてもよく、使用する比率も制限されない。

（還元処理条件）
第２−１の発明における還元処理の条件は、糖液中の糖類以外のカルボニル化合物の含有量が低減されれば特に限定されない。

糖液中に含まれる糖類もアルデヒド基等を有しており、これらが、前記カルボニル化合物と同様に本発明２の還元剤と反応する。すなわち糖の還元剤の反応生成物が生成しても、後述する有用化合物を発酵生産する工程や、微生物の培養工程において問題がない限りは、還元処理条件は限定されない。そのため糖類以外のカルボニル化合物の含有量が低減でき、かつグルコースやキシロースなどの糖類が本発明２の還元剤と反応しにくい、選択的な反応条件を選択することが好ましい。

第２−１の発明における還元処理の処理温度は特に限定されないが、通常２０℃以上、１００℃以下、好ましくは８０℃以下である。還元処理を前記温度範囲内で行うことにより、還元剤や還元処理体の分解が抑制でき、糖類を還元剤と反応させることなく、発酵阻害成分である糖類以外のカルボニル化合物の含有量を低減することが可能となる。

第２−１の発明における還元処理で使用する還元剤の量は、糖液中の発酵阻害成分濃度、使用する還元剤の種類、反応温度、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害成分の除去効率、糖と還元剤の反応抑制、未反応の還元剤量低減など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されない。
通常、糖液中に含まれる、前記糖類以外のカルボニル化合物の含有量に対する還元剤のモル比で、０．０５以上、好ましくは、０．２以上であり、通常２．０以下であり、好ましくは１．５以下である。

第２−１の発明における還元処理の処理時間は、糖液中の前記カルボニル化合物の含有量及び濃度、使用する還元剤の種類、反応温度、反応様式、糖液の処理量といった諸条件と発酵阻害成分の除去効率、糖と還元剤の反応抑制など所望する反応成績で決定されるものであり、特に限定されるものではない。
反応時間が短いとカルボニル化合物の含有量の低減が十分に進行しない可能性があり、反応時間が長いと糖と還元剤の反応生成物量が増大するなどの問題がある。

第２−１の発明における還元処理には、溶媒を使用することができ、その種類は特に限定されるものではないが、通常は水が使用される。有機溶媒を共溶媒として使用してもよいが、水相に有機溶媒が混入することで発酵阻害を引き起こす可能性があるため、発酵生産や微生物の培養工程に供する際に有機溶媒を分離する工程が必要となるため、糖液は水溶液のまま還元処理することが望ましい。

＜第２−２の発明：還元処理糖液＞
前記第２−１の発明における還元処理によって、糖液に含有される糖類以外のカルボニル化合物の含有量が、低減されるため、得られる糖液中の前記カルボニル化合物の濃度は、通常、最初の糖液中の濃度より低い。なお、上記の還元処理反応に供した後の糖液を、以下「還元処理糖液」ということがある。

前記のカルボニル化合物を、本発明２の還元剤と作用させることにより、後述する発酵プロセスにおいて、微生物の増殖や有用化合物の発酵生産の効率を向上させることができる。

第２−２の発明の還元処理糖液は、前記カルボニル化合物と還元剤の反応生成物を含んでいてもよく、具体的には、前記カルボニル化合物がアルデヒド化合物である場合、対応するα−ヒドロキシスルホン酸塩等を含んでいてもよい。

また、第２−２の発明の還元処理糖液は、必要に応じて、適宜、イオン交換樹脂、活性炭、合成樹脂、水素添加等の手法でさらに処理しても構わない。

＜第２−３の発明：有機化合物の製造方法＞
前記第２−２の発明の還元処理糖液は、有機物生産能力を有する微生物を作用させることにより、各種の有機化合物を製造することができる。

（有機物生産能力を有する微生物）
第２−３の発明で用いる微生物は、有機物生産能力を有する微生物であれば、特に限定はされない。
なお第２−３の発明における「有機物生産能力を有する微生物」とは、該微生物を培地中で培養したときに、該培地中に有機物を生成蓄積することができる微生物をいう。

（有機化合物）
微生物が生産する有機化合物としては、微生物が培地中に生成蓄積することができる有機化合物であれば限定されない。具体的には、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（有機化合物）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。

（微生物）
第２−３の発明で用いる微生物は、有機物生産能力を有する微生物であれば特に限定されない。具体的には、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（微生物）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。

（有機物生産工程）
第２−３の発明は、反応液中で、本発明２−２の還元処理糖液を含有する有機原料に、有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る工程（以下、有機物生産工程、ということがある）を含むものである。中でも、還元処理糖液を含有する有機原料に前記微生物を作用させることにより有機化合物を生成させ、これを回収することが好ましい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。

第２−３の発明で前記微生物を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いても良いが、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。すなわち、前記微生物を予め増殖させておいた上で、前記微生物に有機化合物を生産させてもよい。後述のように種培養や本培養を行なうことで、前記微生物を予め増殖させることができるが、このときに使用する有機原料としては、還元処理糖液を用いてもよいし、その他の有機原料を用いてもよい。

なお、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、還元処理糖液を含有する有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよいし、予め種培養または本培養を行なうことで増殖させた菌体を、還元処理糖液を含有する有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによって有機化合物を製造してもよい。

また、第２−３の発明において用いられる微生物としては、上記微生物のほか、微生物の処理物を使用することもできる。微生物の処理物としては、例えば、微生物の菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、またはその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。

第２−３の発明では還元処理糖液を含有する有機原料を使用するが、必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。有機化合物製造方法において使用する還元処理糖液以外の有機原料としては、前記微生物が資化して有機化合物を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプンまたはセルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、キシリトールまたはリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、スクロースまたはフルクトースが好ましく、特にグルコースまたはスクロースが好ましい。

また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液または糖蜜なども使用され、具体的にはサトウキビ、甜菜またはサトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの有機原料は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。

前記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、有機化合物の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、反応液に対して、通常５０ｇ／Ｌ以上、好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常３００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。また、反応の進行に伴う前記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行ってもよい。

（反応液）
第２−３の発明で用いる反応液は特に限定されず、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、第２−３の発明で用いる微生物が資化して有機化合物を生成させうる窒素源であれば特に限定されない。具体的には、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（水性媒体）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。

また、前記反応液は、例えば上述した有機原料、窒素源、無機塩などのほかに、炭酸イオン、重炭酸イオンおよび二酸化炭素ガス（炭酸ガス）から選ばれる少なくとも１つを含有することが好ましい。具体的には、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（水性媒体）と同一のものが挙げられ、好ましい範囲も同様である。また、炭酸イオンまたは重炭酸イオンの濃度、反応液のｐＨについても前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（水性媒体）と同様の範囲が好ましい。なお、ここでは前述の（水性媒体）の項で説明した事項は「水性媒体」を「反応液」と読み替えて適用できる。

（有機物生産工程の反応条件）
第２−３の発明で用いる微生物の菌体量、反応温度、酸素供給条件、および反応様式は、特に限定されないが、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（有機物生産工程の反応条件）と同様の範囲が好ましい。

（その他の工程）
第２−３の発明は、上記の有機物生産工程により有機化合物が生成し、反応液中に蓄積させることができる。よって、前述の＜第１−３の発明＞の項で説明した（その他の工程）と同様の工程を更に含んでいてもよい。

＜第２−４の発明：微生物の培養方法＞
第２−４の発明の培養方法は、本発明２−２の還元処理糖液を含有する有機原料を炭素源として用いて、有機物生産能力を有する微生物を培養させる。本発明２−４の培養方法によって得られた微生物は、その後、有機原料に作用させることによって有機化合物を生成させ、これを回収することができる。このときの有機原料としては、前記還元処理糖液を用いてもよいし、還元処理糖液中にその他の有機原料を含んでいてもよい。製造し得る有機化合物の種類および好ましい有機化合物の例は上述した通りである。

第２−４の発明の培養方法では、還元処理糖液を含む寒天培地等の固体培地で培養してもよいし、還元処理糖液を含む液体培地で培養してもよい。前述の＜第１−４の発明＞の項で説明した（種培養）の方法で実施することができ、同様の範囲が好ましい。

（本培養）
本培養は、後述する有機化合物生産反応に供する前記微生物菌体を調製するために行なうものであり、主として菌体量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた菌体を用いて本培養を行う。

本培養に用いる培地は、前述の＜第１−４の発明＞の項で説明した（本培養）と同様の範囲が好ましい。

また、本培養においては、炭素源として還元処理糖液を含有する有機原料を使用する。必要に応じて、その他の有機原料を添加してもよい。本培養において使用する還元処理糖液以外の有機原料およびその濃度は、前述の＜第１−４の発明＞の項で説明した（本培養）と同一のものが挙げられ、これと同様の範囲が好ましい。
また、本培養の培養時間、酸素供給条件、菌体の調製方法、有機化合物生産反応への適用は、特に限定されないが、前述の＜第１−４の発明＞の項で説明した（本培養）と同様の範囲が好ましい。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。

＜分析条件＞
（液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析）
以下の製造例、実施例及び比較例の糖液中の各含有成分の存在量は、液相クロマトグラフ（ＬＣ）分析により、絶対検量線法を用いて求めた。分析条件は以下の通りである。

（ＬＣ測定条件１：糖、ギ酸、グリコールアルデヒド（ＧＡＬ）、エタノール、コハク酸の分析条件）
カラム ：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ ８．０ＩＤ×３００ｍｍ（信和化工社製）
カラム温度 ：４０℃、または６０℃
溶離液 ：０．１１質量％過塩素酸溶液 １．０ｍＬ／分
検出方法 ：ＵＶ（２１０ｎｍ）、またはＲＩ
注入量 ：１０μＬ

（ＬＣ測定条件２：フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールの分析条件）
カラム ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０ 長さ１００ｍｍ×４．６ｍｍ、粒子径３μｍ（野村化学社製）
溶離液 ：Ａ液 ０．０５４質量％過塩素酸水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
Ａ液／Ｂ液＝９５／５（体積／体積）からＢ液１００体積％、２０分間でグラジエント分析
流速 ：１．０ｍＬ／分
検出方法 ：ＵＶ（２１０ｎｍ）
注入量 ：５μＬ

（ＬＣ測定条件３：培養上清に含まれる糖の分析条件）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ Ｓｕｇａｒ―Ｄ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎ ４．６ｍｍｌ．Ｄ．×２５０ｍｍ （ナカライテスク社製）
カラム温度：３０℃
溶離液：７５ｖｏｌ％アセトニトリル １．０ｍＬ／分
検出方法：ＲＩ
注入量：１０μＬ

＜実施例１−１〜１−１０、比較例１−１〜１−５＞
（製造例１−１）
非可食原料として、バガスを使用した。まずバガスに硫酸及び水を加えて混合し、バガス混合物を得た。硫酸の添加量は、バガスの乾燥質量に対し２質量％であり、水の添加量は、前記バガス混合物の合計質量に対する含水率が６０質量％となるように調製した。次にドラムミキサー（杉山重工株式会社製）にて前記バガス混合物を２０分間混合、撹拌の後に取り出し、希硫酸処理混合物を得た。前記希硫酸処理混合物を加水分解装置（株式会社ヤスジマ製）にて、蒸気を投入し、１８０℃で１５分間蒸煮処理した。得られた蒸煮処理物の含水率は６４．６質量％であった。前記蒸煮処理物を乾燥質量２００ｇ／Ｌとなるように糖化装置に仕込み、１０Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を添加し、ｐＨを６．０に調整した。そこに糖化酵素として１５ＦＰＵ分のＣＴｅｃ２（ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を添加し、温度５０℃、攪拌速度２００ｒｐｍにて７２時間攪拌しながら、加水分解を行った。その後、遠心分離（１００００ｇ、１０分間）を行い、未分解セルロース及びリグニンを分離除去し、バガス糖化液を作成した。得られたバガス糖化液の組成を表１に示した。
前記バガス糖化液を、遠心分離（８０００×ｇ、１０分間）を行ない、前記バガス糖化液中に含まれる固形分を除き、続いて保留粒子径１μｍの濾紙を用いて濾過し、濾液１を作製した。

（製造例１−２）
４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いて製造例１−１で得た濾液１のｐＨを８に調整し、さらに１２１℃で２０分間加熱して糖化液１−１を作製した。
前述のＬＣ測定条件１および２にて前記糖化液１−１のＬＣ分析を行ったところ、グルコース７．４質量％、フルクトース０．７質量％、キシロース３．６質量％、フルフラール５２４ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４４３ｐｐｍであった。

（実施例１−１）
製造例１−２と同様にして加熱を行って調製した糖化液１−１に、前記糖化液１−１が含有するグルコース、フルクトース、キシロースの合計質量に対して０．６質量％の亜硫酸ナトリウムを４０℃で加えた。
引き続き糖化液１−１を４０℃のまま１時間攪拌し、処理糖液を得た（以下これを、「処理糖液１−１」という。）。前記処理糖液１−１を、前記糖化液１−１と同条件でＬＣ分析を実施し、各成分の存在量を確認したところ、グルコース７．４質量％、フルクトース０．７質量％、キシロース３．６質量％、フルフラール５１３ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４２６ｐｐｍであった。測定結果を表２に示した。

（実施例１−２）
用いる還元剤を亜硫酸水素ナトリウムに変更した以外は、実施例１−１と同様に糖化液１−１を処理し、処理糖液１−２を得た。この処理糖液１−２を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．５質量％、フルクトース０．７質量％、キシロース３．４質量％、フルフラール４７４ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４３１ｐｐｍであった。測定結果を表２に示した。

（実施例１−３）
使用した亜硫酸水素ナトリウムの量をグルコース、フルクトース、キシロースの合計質量に対して０．４質量％に変更した以外は、実施例１−２と同様に糖化液１−１を処理し、処理糖液１−３を得た。この処理糖液１−３を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．８質量％、フルクトース０．６質量％、キシロース３．３質量％、フルフラール４８６ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４３４ｐｐｍであった。測定結果を表２に示した。

（実施例１−４）
還元剤処理時間を２時間に変更した以外は、実施例１−３と同様に糖化液１−１を処理し、処理糖液１−４を得た。この処理糖液１−４を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．６質量％、フルクトース０．７質量％、キシロース３．４質量％、フルフラール５３３ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４５７ｐｐｍであった。測定結果を表２に示した。

（実施例１−５）
用いる還元剤を５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液とし、５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液の量をグルコース、フルクトース、キシロースの合計質量に対して１．１質量％に変更した以外、実施例１−１と同様に糖化液１−１を処理し、処理糖液１−５を得た。この処理糖液１−５を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．６質量％、フルクトース０．７質量％、キシロース３．４質量％、フルフラール４８９ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４４５ｐｐｍであった。結果を表２に示す。

（比較例１−１）
製造例１−１で調製した濾液１に、前記濾液１が含有するグルコース、フルクトース及びキシロースの合計質量に対して０．６質量％の亜硫酸ナトリウムを４０℃で加え、４０℃のまま１時間攪拌した後、２５℃まで冷却した。その後、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、１２１℃で２０分間加熱して処理糖液１−６を作製した。この処理糖液１−６を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．４質量％、フルクトース０．６質量％、キシロース３．６質量％、フルフラール４８７ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４４１ｐｐｍであった。測定結果を表２に示す。

（比較例１−２）
使用した還元剤を亜硫酸水素ナトリウムに変更した以外は、比較例１−１と同様に前記濾液１を処理した後、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、１２１℃で２０分間加熱して処理糖液１−７を作製した。この処理糖液１−７を、実施例１−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．１２質量％、フルクトース０．７５質量％、キシロース３．３１質量％、フルフラール４８２ｐｐｍ、ヒドロキシメチルフルフラール４４５ｐｐｍであった。測定結果を表２に示す。

（製造例１−３）
＜キシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子導入株の作製＞
本発明の第１−３の発明に用いる微生物として、コハク酸を製造する微生物を製造し用いた。
コハク酸を製造する微生物としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を改変して得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨを用いた。

この微生物は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を、ラクテートデヒドロキナーゼ破壊株（ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ）とした後、ピルビン酸カルボキシナーゼ増強株（ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ）とし、さらにキシロースイソメラーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子を導入した株である。

このうちブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株から、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を製造する方法については、日本国特開２０１５−２９４７１号公報に記載の方法に基づき行った。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨから、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨを製造する方法を具体的に示す。

（Ａ）大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９株をＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｇ／Ｌ］１０ｍＬで対数増殖期後期まで培養し、集菌した。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度のリゾチームを含む緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５質量％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合し、遠心分離（１５０００×ｇ、２分間）により回収した沈殿物を７０体積％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡにＴＥ緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。

（Ｂ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロンのクローニング
大腸菌ＪＭ１０９株のｘｙｌＡＢオペロンの取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該オペロン周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ：５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＴＴＴＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＧＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。

鋳型ＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。

増幅産物の確認は、０．９質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．０ｋｂの断片を検出した。得られたｘｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製後、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断した。これによって生じた約２．９ｋｂのＤＮＡ断片は０．９質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｇ／Ｌ］（５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｐａＩにより切断した結果、約２．９ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＸｙｌＡＢ１と命名した。

（Ｃ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入用プラスミドの構築
大腸菌由来ＸｙｌＡＢオペロンをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株（日本国特開２０１５−２９４７１号公報）の染色体上ｌｄｈ遺伝子欠損部位に導入するため、ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株のｌｄｈ遺伝子の取得は、上記製造例１−３の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ：５’−ＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧＧＡＴＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３）および５’−ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡ ＣＣＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号４）を用いたＰＣＲによって行った。

鋳型ＤＮＡ １μＬ、Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２５μＭ ｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。

増幅産物の確認は、０．９質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．１ｋｂの断片を検出した。得られたｌｄｈ遺伝子のＤＮＡ断片はＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてｐＫＭＢ１（日本国特開２００５−９５１６９号公報）のＸｂａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で白色のコロニーを形成したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩにより切断した結果、約２．２ｋｂの挿入断片が確認され、これをｐＫＢ−ＬＤＨ２と命名した。

ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの取得は、プラスミドｐＸｙｌＡＢ１を鋳型とし、合成ＤＮＡ：５’−ＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＴ−３’（配列番号５）および５’−ＣＡＣＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣ−３’（配列番号６）に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲによって行った。
鋳型ＤＮＡ １μＬ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ 各々プライマーを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件は、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で２０秒、７２℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分とした。

増幅産物の確認は、０．７質量％アガロースゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．２ｋｂの断片を検出した。得られたＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンのＤＮＡ断片はＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ）により５’末端をリン酸化した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてｐＫＢ−ＬＤＨ２のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。このようにして得られた組換え大腸菌を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。

この培地上で生育したクローンをＴＢ培地［Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７ｇ／Ｌ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ｇ／Ｌ］（２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む）により液体培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡの挿入断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔおよび塩基配列解読装置３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果得られた塩基配列（ＸｙｌＡＢオペロン）は、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株のゲノム配列と完全に一致し、ＸｙｌＡＢオペロンに変異が入っていないことを確認し、これをｐＸｙｌＡＢ３と命名した。

（Ｄ）キシロースイソメラーゼ−キシルロキナーゼ遺伝子オペロン導入株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＸｙｌＡＢ３を用いて塩化カルシウム法（Journal of Molecular Biology,1970,53,159）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。

ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Res. Microbiol.,1993,144,p181-5）によって行い、得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、および寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。

この培地上に生育した株は、ｐＸｙｌＡＢ３がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｌｄｈ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。

次に、上記相同組換え株を２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０質量％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。
この様にして得られた株の中には、そのｌｄｈ遺伝子欠損部位にｐＸｙｌＡＢ３に由来するＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたものと親株と同じ配列に戻ったものが含まれる。ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたか否かの確認は、ＬＢＧ培地にて培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンの検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＸｙｌＡＢオペロンをＰＣＲ増幅するためのプライマー：５’−ＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号７）および５’−ＣＣＧＣＣＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号８）を用いて分析すると、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入されたクローンでは４，１９６ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターと連結されたＸｙｌＡＢオペロンが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。

（実施例１−６）
＜処理糖液の発酵生産評価＞
（Ａ）種培養
以下の組成の培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］（以下、培地（Ａ）という）１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０質量％グルコース水溶液を６００μＬ添加した。製造例１−３の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で５．２時間振とう培養した。

（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０質量％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記培地（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０２となるように接種し、３０℃で、２２．４時間振とう培養した。

（Ｃ）コハク酸生産反応
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、７分間）により集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：３２０ｍｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１３ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：１３ｍｇ、リン酸（８５質量％）：４１０ｍｇ、水酸化カリウム（４８質量％）：５４０ｍｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように懸濁して菌体溶液を調製した。続いて、実施例１−１で作製した処理糖液１−１：５６ｇ、蒸留水：９ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作成した。基質溶液に炭酸水素アンモニウム：９６０ｍｇ、菌体溶液を加え、嫌気的雰囲気下において４０℃で反応させた。なお、中和剤［アンモニア水（２８質量％）：９７ｇ、炭酸水素アンモニウム：３２ｇ、蒸留水２５０ｍＬに溶解］を加えることでｐＨは７．３に維持した。その結果、前述のＬＣ測定条件１にて培養上清のＬＣ分析を行ったところ、１９．１時間後のコハク酸濃度は３６．９ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１５．２ｇ／Ｌであり、２４．４時間後のコハク酸濃度は３９．１ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１３．３ｇ／Ｌであった。結果を表３に示す。

（比較例１−３）
コハク酸生産反応において、製造例１−２で作製した糖化液１−１：５６ｇ、蒸留水：９ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１９．１時間後のコハク酸濃度は２７．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１６．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１５．９ｇ／Ｌであり、２４．４時間後のコハク酸濃度は３０．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１１．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１４．５ｇ／Ｌであった。

（比較例１−４）
コハク酸生産反応において、比較例１−１で作製した処理糖液１−６：５６ｇ、蒸留水：９ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１９．１時間後のコハク酸濃度は２９．１ｇ／Ｌ、グルコース濃度は１３．８ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１５．９ｇ／Ｌであり、２４．４時間後のコハク酸濃度は３２．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は９．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１４．８ｇ／Ｌであった。結果を表３に示す。

表３より、実施例１−６の糖液では、１９．１時間経過時点で比較例１−３に対してコハク酸濃度が３６％、比較例１−４に対してコハク酸濃度が２７％それぞれ向上した。また２４．４時間の時点で比較例１−３に対してコハク酸濃度が２９％、比較例１−４に対してコハク酸濃度が２０％それぞれ向上した。
以上の結果より、糖液を加熱した後に還元剤を作用させることで発酵阻害が低減し、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。これは還元剤を作用させた後に加熱した場合には得られない効果である。

（実施例１−７）
コハク酸生産反応において、実施例１−２で作製した処理糖液１−２：５６ｇ、蒸留水：９ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１８．９時間後のコハク酸濃度は３２．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は８．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１４．９ｇ／Ｌであり、２５．１時間後のコハク酸濃度は３６．１ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．２ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１３．６ｇ／Ｌであった。結果を表４に示した。

（比較例１−５）
コハク酸生産反応において、比較例１−２で作製した処理糖液１−７：５８ｇ、蒸留水：７ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１８．９時間後のコハク酸濃度は２３．７ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２４．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１５．０ｇ／Ｌであり、２５．１時間後のコハク酸濃度は２６．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２０．９ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１３．１ｇ／Ｌであった。結果を表４に示した。

表４より、実施例１−７では、１８．９時間経過時点で比較例１−３に対してコハク酸濃度が１８％、比較例１−５に対してコハク酸濃度が３５％それぞれ向上した。また２５．１時間の時点で比較例１−３に対してコハク酸濃度が１９％、比較例１−５に対してコハク酸濃度が３９％それぞれ向上した。
以上の結果より、糖液を加熱した後に還元剤を作用させることで発酵阻害が低減し、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。これは還元剤を作用させた後に加熱した場合には得られない効果である。

（実施例１−８）
コハク酸生産反応において、実施例１−３で作製した処理糖液１−３：５６ｇ、蒸留水：１０ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１８．３時間後のコハク酸濃度は３２．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は７．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１６．１ｇ／Ｌであり、２５．６時間後のコハク酸濃度は３７．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１４．１ｇ／Ｌであった。

（実施例１−９）
コハク酸生産反応において、実施例１−４で作製した処理糖液１−４：５６ｇ、蒸留水：９ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１８．３時間後のコハク酸濃度は３０．９ｇ／Ｌ、グルコース濃度は９．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１６．５ｇ／Ｌであり、２５．６時間後のコハク酸濃度は３６．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１４．７ｇ／Ｌであった。

（実施例１−１０）
コハク酸生産反応において、実施例１−５で作製した処理糖液１−５：５６ｇ、蒸留水：１０ｇ、菌体懸濁液：１ｍＬ、Ｄ−ビオチン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇ、塩酸チアミン水溶液（１００ｍｇ／Ｌ）：１３３ｍｇを混合して、基質溶液を作製したこと以外は、実施例１−６と同様に行った。その結果、実施例１−６と同条件でＬＣ分析したところ、１８．３時間後のコハク酸濃度は３６．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１５．４ｇ／Ｌであり、２５．６時間後のコハク酸濃度は３９．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は０．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１２．８ｇ／Ｌであった。

実施例１−８〜１−１０及び比較例１−３の測定結果を表５に示す。

表５より、実施例１−８の糖液では１８．３時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が１８％向上した。実施例１−９の糖液では１８．３時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が１４％向上した。実施例１−１０の糖液では１８．３時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が３５％向上した。また実施例１−８の糖液では２５．６時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が２３％向上した。実施例１−９の糖液では２５．６時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が１９％向上した。実施例１−１０の糖液では２５．６時間時点で、比較例１−３に対してコハク酸濃度が３０％向上した。

＜実施例１−１１〜１−１４、比較例１−６〜１−１０＞

（製造例１−４）
超純水３６５ｍＬに、グルコース１３５．６１ｇ、フルフラール２．７０ｇ、ギ酸０．１８ｇを溶解させ、糖液を作成した。以下、これを「糖液Ａ」とする。
前記糖液Ａを、前述のＬＣ測定条件１および２にてＬＣ分析を行ったところ、グルコース２６．４質量％、フルフラール６０４２ｐｐｍだった。結果を表６に示す。

（製造例１−５）
製造例１−４で調製した糖液Ａ ４４．０８ｇを１００ｍＬ容のメディウム瓶に入れ、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、１２１℃、２０分で加熱滅菌処理を行った。これを「加熱糖液Ｂ」という。製造例１−４と同様にして加熱糖液ＢのＬＣ分析を実施したところ、グルコース２４．６質量％、フルクトース０．９質量％、フルフラール２８９８ｐｐｍ、ｐＨは２．８１であった。結果を表６に示す。

（実施例１−１１）
製造例１−４で調製した糖液Ａについて、製造例１−５と同様にして加熱滅菌処理を行って加熱糖液Ｂを得た。室温まで冷却した後、加熱前の糖液Ａに含まれるフルフラールに対して１当量の還元剤が作用するように、加熱糖液Ｂ ４４．０１ｇに対して、４９質量％亜硫酸アンモニウム水溶液０．５８５６ｇを加え、４０℃で１時間撹拌し、処理糖液１−８を得た。前述のＬＣ測定条件１および２にて前記処理糖液１−８のＬＣ分析を実施したところ、グルコース２３．６質量％、フルクトース１．９質量％、フルフラール１６５２ｐｐｍであり、ｐＨは３．４０であった。結果を表６に示す。

（実施例１−１２）
製造例１−４で調製した糖液Ａについて、製造例１−５と同様にして加熱滅菌処理を行って加熱糖液Ｂを得た。室温まで冷却した後、加熱前の糖液Ａに含まれるフルフラールに対して０．５当量の還元剤が作用するように、加熱糖液Ｂ ４４．０３ｇに対して、亜硫酸ナトリウム０．１５５８ｇを加え、４０℃で１時間撹拌し、処理糖液１−９を得た。実施例１−１１と同様にして前記処理糖液１−９のＬＣ分析を実施したところ、グルコース２４．４質量％、フルクトース１．４質量％、フルフラール２８９８ｐｐｍであり、ｐＨは２．９６であった。結果を表６に示す。

（比較例１−６）
製造例１−４で調製した糖液Ａを１００ｍＬ容のメディウム瓶に入れ、糖液Ａに含まれるフルフラールに対して１当量の還元剤が作用するように、糖液Ａ ４３．９７ｇに対して、４９質量％亜硫酸アンモニウム水溶液０．５８５８ｇを加え、４０℃で１時間撹拌し、還元処理を実施した。その後、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、１２１℃、２０分で加熱滅菌処理を行った。室温まで冷却し処理糖液１−１０を得た。実施例１−１１と同様にして前記処理糖液１−１０のＬＣ分析を実施したところ、グルコース２４．８質量％、フルクトース１．１質量％、フルフラール２８４５ｐｐｍであり、ｐＨは７．８０であった。結果を表６に示す。

（比較例１−７）
製造例１−４で調製した糖液Ａを１００ｍＬ容のメディウム瓶に入れ、糖液Ａに含まれるフルフラールに対して０．５当量の還元剤が作用するように、糖液Ａ ４４．０２ｇに対して、亜硫酸ナトリウム０．１５６２ｇを加え、４０℃で１時間撹拌し、還元処理を実施した。その後、４８質量％ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨを８に調整し、１２１℃、２０分で加熱滅菌処理を行った。室温まで冷却し処理糖液１−１１を得た。実施例１−１１と同様にして処理糖液１−１１のＬＣ分析を実施したところ、グルコース１９．２質量％、フルクトース６．２質量％、フルフラール３０１５ｐｐｍであり、ｐＨは７．８０であった。結果を表６に示す。

（実施例１−１３）
＜処理糖液のエタノール発酵生産評価＞
（Ａ）種培養
酵母エキス６０ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解し、１２１℃、２０分で加熱滅菌し室温まで冷やした後（以下、培地（Ｂ）という）、２００ｍＬ容の三角フラスコに１０ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した４２．５質量％グルコース水溶液と蒸留水をそれぞれ１２ｍＬと８ｍＬ加えた。ここにサッカロミセス・セレビシエ ＰＥ−２株（ＮＣＹＣ３２３３）を接種し、３０℃で２３．４時間振とう培養した。

（Ｂ）本培養（エタノール発酵生産）
実施例１−１１で調製した処理糖液１−８を２００ｍＬ容フラスコに２０ｍＬ入れ、上記培地（Ｂ）を１０ｍＬ添加した。ここに１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加してｐＨを４．５に調整し、本培養培地を作製した。上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を遠心分離（１０００×ｇ、５分間）により集菌し、菌体湿重量で０．１ｇの菌体を本培養培地に接種、３０℃で振とう培養した。その結果、培養２０時間目のＯＤ（６６０ｎｍ）は４４．８であり、前述のＬＣ測定条件１および３にて培養上清のＬＣ分析を行ったところ、エタノール濃度は７４．５ｇ／Ｌであり、グルコース濃度は１．２ｇ／Ｌ、フルクトース濃度は２．３ｇ／Ｌであった。結果を表７に示す。

（比較例１−８）
エタノール発酵において、製造例１−５で調製した加熱糖液Ｂを使用したこと以外は実施例１−１３と同様に行った。その結果、培養２０時間目のＯＤ（６６０ｎｍ）は１９．７であり、実施例１−１３と同様にしてＬＣ分析を行ったところ、エタノール濃度は２７．８ｇ／Ｌであり、グルコース濃度は１２３．６ｇ／Ｌ、フルクトース濃度は４．４ｇ／Ｌであった。結果を表７および表８に示す。

（比較例１−９）
エタノール発酵において、比較例１−６で調製した処理糖液１−１０を使用したこと以外は実施例１−１３と同様に行った。その結果、培養２０時間目のＯＤ（６６０ｎｍ）は３２．１であり、実施例１−１３と同様にしてＬＣ分析を行ったところ、エタノール濃度は５５．３ｇ／Ｌであり、グルコース濃度は５８．７ｇ／Ｌ、フルクトース濃度は４．１ｇ／Ｌであった。結果を表７に示す。

表７より、実施例１−１３では２０時間経過時点で生育は比較例１−８に対して１２７％、比較例１−９に対しては４０％、それぞれ向上した。また、エタノール濃度は比較例１−８に対して１６８％、比較例１−９に対しては３５％、それぞれ向上した。以上の結果より、糖液を加熱した後に還元剤を作用させることで生育阻害や発酵阻害が低減し、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。これは還元剤を作用させた後に加熱した場合には得られない効果である。

（実施例１−１４）
エタノール発酵において、実施例１−１２で調製した処理糖液１−９を使用したこと以外は実施例１−１３と同様に行った。その結果、培養２０時間目のＯＤ（６６０ｎｍ）は３９．６、エタノール濃度は６８．２ｇ／Ｌであり、グルコース濃度は２２．５ｇ／Ｌ、フルクトース濃度は３．９ｇ／Ｌであった。結果を表８に示す。

（比較例１−１０）
エタノール発酵において、比較例１−７で調製した処理糖液１−１１を使用したこと以外は実施例１−１３と同様に行った。その結果、培養２０時間目のＯＤ（６６０ｎｍ）は２６．７、エタノール濃度は５２．５ｇ／Ｌであり、グルコース濃度は４３．７ｇ／Ｌ、フルクトース濃度は２３．３ｇ／Ｌであった。結果を表８に示す。

表８より、実施例１−１４では２０時間経過時点で生育は比較例１−８に対して１０１％、比較例１−１０に対しては４８％、それぞれ向上した。また、エタノール濃度は比較例１−８に対して１４５％、比較例１−１０に対しては３０％、それぞれ向上した。以上の結果より、糖液を加熱した後に還元剤を作用させることで生育阻害や発酵阻害が低減し、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。これは還元剤を作用させた後に加熱した場合には得られない効果である。

以上の結果より、糖液を加熱したのちに還元剤を作用させることで発酵阻害が低減し、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。

本発明の還元処理を実施するに際し、ＦＲＬを含有するモデル液を用いた場合、２５〜６０℃の温度条件においてＦＲＬ量を低減することができ、該処理糖液を使用することで、有機化合物の生産速度が向上することが明らかとなった。一方、バガス等を用いた実際の糖化液では、現在測定しているＦＲＬやＨＭＦ以外にグリコールアルデヒド、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等の水溶性アルデヒドの含有量が高いことが多く、これらがＦＲＬやＨＭＦよりも優先的に還元剤と反応し低減することで、糖化液を用いた場合にはＦＲＬやＨＭＦの低減幅以上の発酵成績回復が見られていると考えられる。

前記カルボニル化合物等の発酵阻害物質は、還元剤と反応付加物を形成することで糖液から除去されると考えられるが、これらの反応付加物は、高温条件下で不安定であり、糖液の滅菌処理を行う際の加熱条件で分解するため、還元処理工程の後に加熱処理を行った場合に比べ、加熱処理工程を還元処理工程の前に行うことが有効であることがわかった。
本願発明の製造方法により、滅菌状態を維持しつつ、前記カルボニル化合物等の発酵阻害物質を除去することができるため、糖液、好ましくは非可食由来のような前記カルボニル化合物等の発酵阻害物質を多く含む糖液からでも、有機化合物を効率よく製造することが可能になるものと考えられる。

＜実施例２−１〜２−１６、比較例２−１＞
（製造例２−１）
超純水４５３ｍＬに、グルコース３９．９８ｇ、キシロース５．０２ｇ、フルフラール０．５１ｇ、グリコールアルデヒドダイマー１．５０ｇ、ギ酸０．２１ｇを溶解させ、糖液を作製した。以下これを「糖液２−１」とする。
前記糖液２−１を、前述のＬＣ測定条件１および２でＬＣ分析を行ったところ、グルコース７．９６質量％、キシロース１．０１質量％、グリコールアルデヒドダイマー３１２０ｐｐｍ、フルフラール８２２ｐｐｍ、ギ酸４００ｐｐｍであり、ｐＨは２．７９だった。

（実施例２−１）
製造例２−１で調製した糖液２−１、６０．０４ｇに対して、糖類以外のカルボニル成分に対して０．０８当量の還元剤が作用するように、５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液０．０７９ｇを４０℃で加えた。４０℃のまま３０分間攪拌し、還元処理糖液を得た（以下これを、「処理糖液２−１」という。）。処理糖液２−１を、前記糖液２−１と同条件でＬＣ分析を実施し、各成分の存在量を確認したところ、グルコース７．９８質量％、キシロース１．０１質量％、グリコールアルデヒドダイマー２７５８ｐｐｍ、フルフラール８１８ｐｐｍ、ギ酸４１６ｐｐｍであり、ｐＨは３．５５だった。結果を表９に示す。

（実施例２−２）
使用した５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液が、糖類以外のカルボニル成分に対して０．２３当量の還元剤が作用するように変更した以外は、実施例２−１と同様の手法で還元処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−２」）を得た。この処理糖液２−２を、実施例２−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．９４質量％、キシロース１．０１質量％、グリコールアルデヒドダイマー２０５７ｐｐｍ、フルフラール８０８ｐｐｍ、ギ酸３９５ｐｐｍであり、ｐＨは６．４９だった。結果を表９に示す。

（実施例２−３）
使用した５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液が、糖類以外のカルボニル成分に対して０．５３当量の還元剤が作用するように変更した以外は、実施例２−１と同様の手法で還元処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−３」）を得た。この処理糖液２−３を、実施例２−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．９４質量％、キシロース１．０１質量％、グリコールアルデヒドダイマー８３１ｐｐｍ、フルフラール７２７ｐｐｍ、ギ酸４０６ｐｐｍであり、ｐＨは７．８５だった。結果を表９に示す。

（実施例２−４）
使用した５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液が、糖類以外のカルボニル成分に対して１．０２当量の還元剤が作用するように変更した以外は、実施例２−１と同様の手法で還元処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−４」）を得た。この処理糖液２−４を、実施例２−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．８４質量％、キシロース１．１２質量％、グリコールアルデヒドダイマー１１２ｐｐｍ、フルフラール２２６ｐｐｍ、ギ酸３６７ｐｐｍであり、ｐＨは７．８２だった。結果を表９に示す。

（実施例２−５）
使用した５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液が、糖類以外のカルボニル成分に対して１．５２当量の還元剤が作用するように変更した以外は、実施例２−１と同様の手法で還元処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−５」）を得た。この処理糖液２−５を実施例２−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．７７質量％、キシロース１．０２質量％、グリコールアルデヒドダイマー３４ｐｐｍ、フルフラール５４８ｐｐｍ、ギ酸３５５ｐｐｍであり、ｐＨは７．６４だった。結果を表９に示す。

（実施例２−６）
使用した５０質量％亜硫酸アンモニウム水溶液が、糖類以外のカルボニル成分に対して２．０５当量の還元剤が作用するように変更した以外は、実施例２−１と同様の手法で還元剤処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−６」）を得た。この処理糖液２−６を実施例２−１と同条件でＬＣ分析したところ、グルコース７．６７質量％、キシロース０．９５質量％、グリコールアルデヒドダイマー２４ｐｐｍ、フルフラール６６０ｐｐｍ、ギ酸３４９ｐｐｍであり、ｐＨは７．５７だった。結果を表９に示す。

（実施例２−７）
処理温度を２５℃に変更した以外は、実施例２−４と同様の手法で還元処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−７」）を得た。この処理糖液２−７をＬＣ分析したところ、グルコース７．８０質量％、キシロース１．１１質量％、グリコールアルデヒドダイマー５８ｐｐｍ、フルフラール４１６ｐｐｍ、ギ酸３９３ｐｐｍであり、ｐＨは７．８５だった。結果を表９に示す。

（実施例２−８）
処理温度を６０℃に変更した以外は、実施例２−４と同様の手法で還元剤処理を実施し、還元処理糖液（以下、「処理糖液２−８」）を得た。この処理糖液２−８をＬＣ分析したところ、グルコース７．８４質量％、キシロース１．０４質量％、グリコールアルデヒドダイマー１８４ｐｐｍ、フルフラール１７４ｐｐｍ、ギ酸４２９ｐｐｍであり、ｐＨは７．７６だった。結果を表９に示す。

表９より、本発明の処理方法により、グリコールアルデヒド、フルフラール、ギ酸等のカルボニル化合物を除去できることがわかった。本発明の還元剤を用いることで、糖類以外のカルボニル化合物を効率よく除去できること、及び本発明の処理方法は広い温度範囲で有効に糖類以外のカルボニル化合物を除去可能であることが明らかとなった。

（製造例２−２）
製造例１−３と同様にしてキシロースイソメラーゼ遺伝子およびキシルロキナーゼ遺伝子導入株を作製した。

（実施例２−９）
＜糖液の発酵生産評価＞
（Ａ）種培養
Ａ培地［尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、蒸留水１，０００ｍＬに溶解］１，０００ｍＬを、１２１℃、２０分間で加熱滅菌し、室温まで冷やした後、２００ｍＬの三角フラスコに１５ｍＬ入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を６００μｌ添加した。製造例２−２の製造例１−３（Ｄ）に対応する工程にて作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＸｙｌＡＢ／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を接種して３０℃で４．８時間振とう培養した。

（Ｂ）本培養
５００ｍＬの三角フラスコに１００ｍＬのＡ培地を入れ、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加した後、上記（Ａ）の種培養で得られた培養液を、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が０．０５となるように接種し、３０℃で、２０．０時間振とう培養した。

（Ｃ）コハク酸生産反応
上記（Ｂ）の本培養で得られた培養液を５，０００×ｇ、７分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁液［硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：１ｇ、蒸留水１０００ｍＬに溶解］にＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が２０になるように懸濁した。続いて、実施例２−１で作製した処理糖液２−１を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製した。５ｍＬ反応器に前記菌体懸濁液０．５ｍＬと、基質溶液０．５ｍＬを混合し、嫌気条件下において４０℃で反応させた。その結果、前述のＬＣ測定条件１および２にて培養上清のＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．６ｇ／Ｌ、グルコース濃度は５．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．９ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（比較例２−１）
コハク酸生産反応において、製造例２−１で作製した糖液２−１を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．１ｇ／Ｌ、グルコース濃度は５．８ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．９ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１０）
コハク酸生産反応において、実施例２−２で作製した処理糖液２−２を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は４．３ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１１）
コハク酸生産反応において、実施例２−３で作製した処理糖液２−３を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．０ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．９ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１２）
コハク酸生産反応において、実施例２−４で作製した処理糖液２−４を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．４ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１３）
コハク酸生産反応において、実施例２−５で作製した処理糖液２−５を２．３ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．７ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は８．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は３．１ｇ／Ｌ、キシロース濃度は１．９ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１４）
コハク酸生産反応において、実施例２−６で作製した処理糖液２−６を２．３ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．７ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は７．４ｇ／Ｌ、グルコース濃度は４．７ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１５）
コハク酸生産反応において、実施例２−７で作製した処理糖液２−７を２．２ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．８ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．２ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．６ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

（実施例２−１６）
コハク酸生産反応において、実施例２−８で作製した処理糖液２−８を２．３ｍＬ、炭酸水素アンモニウムを０．３ｇ、および蒸留水２．７ｍＬを混合して、基質溶液を調製したこと以外は、実施例２−９と同様に行った。その結果、実施例２−９と同様にＬＣ分析を行ったところ、６時間後のコハク酸蓄積濃度は９．３ｇ／Ｌ、グルコース濃度は２．０ｇ／Ｌ、キシロース濃度は２．０ｇ／Ｌであった。結果を表１０に示した。

表１０より、実施例２−１の処理糖液２−１を使用した実施例２−９では、製造例２−１の糖液２−１を使用した比較例２−１に対してコハク酸濃度が６％向上した。
同様に実施例２−２の処理糖液２−２を使用した実施例２−１０では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が１５％向上した。
また実施例２−３の処理糖液２−３を使用した実施例２−１１では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が２７％向上した。
また実施例２−４の処理糖液２−４を使用した実施例２−１２では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が２９％向上した。
また実施例２−５の処理糖液２−５を使用した実施例２−１３では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が１６％向上した。
また実施例２−６の処理糖液２−６を使用した実施例２−１４では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が４％向上した。
本発明の還元剤処理を実施してグリコールアルデヒド等が大幅に除去された糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。
さらに実施例２−７の処理糖液２−７を使用した実施例２−１５では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が２９％向上した。
また実施例２−８の処理糖液２−８を使用した実施例２−１６では、比較例２−１に対してコハク酸濃度が３１％向上した。
本発明の還元処理を実施するに際し２５〜６０℃の温度条件においてグリコールアルデヒド等が大幅に除去することができ、該処理糖液を使用することで、コハク酸生産速度が向上することが明らかとなった。

本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。本出願は２０１４年３月１３日出願の日本特許出願（特願２０１４−０５０７０４）、２０１４年７月１０日出願の日本特許出願（特願２０１４−１４２５６６）、及び２０１４年１２月４日出願の日本特許出願（特願２０１４−２４６１４０）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

本発明１の糖液の処理方法によれば、糖液中の発酵阻害物質の含有量を減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、高い収率で目的とする有機化合物の収率を得ることができる。
また本発明１の処理糖液は、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させることができる。

また、本発明１の有機化合物の製造方法は、比較的簡単な処理により、高い生産効率で所望の有機化合物を製造することができる。
また、本発明１の培養方法であれば、発酵生産プロセスにおける発酵阻害物質量を減少させることができるため、微生物の増殖量と増殖速度を向上させ、もって発酵生産性を向上させることができる。

本発明２の糖類の処理方法によれば、糖液中の糖類以外のカルボニル化合物の含有量を効率的に減少させることができるため、得られる糖液を、微生物を利用した発酵生産プロセスで用いれば、効率よく目的とする有機化合物が得られ、その収率を向上させることができる。
また本発明２の還元処理糖液は、発酵生産による有機化合物の製造における微生物の生産効率を向上させ、また化学変換プロセスに利用した際に生成物である有機化合物の着色を抑制することができる。

Claims (10)

1. 非可食原料由来の糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）の処理方法であって、該糖液を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程と、前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程と、を含む糖液の処理方法。
2. 単糖および／または二糖を主成分とする非可食原料由来の糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）の処理方法であって、該糖液を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程と、前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程と、を含む糖液の処理方法。
3. 前記還元処理工程における前記糖液のｐＨが、２以上、８以下である請求項１または２に記載の糖液の処理方法。
4. 前記還元処理工程における前記糖液の温度が、２０℃以上、７０℃以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖液の処理方法。
5. 前記還元剤が亜硫酸化合物、次亜硫酸化合物及びチオ硫酸化合物から選ばれる少なくとも１つである請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖液の処理方法。
6. 前記還元剤の使用量が、前記糖液に含まれる糖の質量に対して、０．０５質量％以上、２．０質量％以下である請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖液の処理方法。
7. 前記加熱処理工程における前記糖液の加熱時間が１分以上、２０時間以下である請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖液の処理方法。
8. 非可食原料由来の糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）を処理して処理糖液を製造する方法であって、前記処理方法が請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖液の処理方法である、処理糖液の製造方法。
9. 糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱する、加熱処理工程、
   前記加熱処理工程で加熱した前記糖液に還元剤を作用させる、還元処理工程、および
   前記還元処理工程を経た糖液を含有する有機原料に有機物生産能力を有する微生物を作用させて有機化合物を得る、有機物生産工程を含む有機化合物の製造方法。
10. 有機物生産能力を有する微生物の培養方法であって、
    非可食原料由来の糖類を含有する液（以下、「糖液」という。）を１００℃以上１８０℃以下の温度で加熱して加熱された糖液を得、
    前記加熱された糖液に還元剤を作用させて処理糖液を得、
    前記処理糖液を炭素源として用いる微生物の培養方法。