JP6391582B2 - 治療剤の送達方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、細胞由来の小胞を介した潜在的治療剤の送達に関する。

発明の背景
癌は、全世界で死因の第1位となっている。世界保健機関（WHO）によると、2008年には様々な癌を原因とする死亡例が760万例であった（全死亡例の約13％）。この数は増え続けると予測されており、2030年には全世界で1310万の死亡をもたらすと推定される[GLOBOCAN 2008 (IARC) Section of Cancer Information (11/11/2012)]（非特許文献1）。

皮膚癌に起因する死亡例の大多数の原因が悪性黒色腫であり、これは若年成人における最も一般的な悪性腫瘍である。黒色腫が転移性である場合、予後は不良であり、治療選択肢はほとんど無い。ブドウ膜黒色腫は皮膚黒色腫とは異なる臨床特性を有しており、主に肝臓に広がることが多い。ブドウ膜黒色腫に関しては、患者のおよそ2人に1人が、原発眼腫瘍の治療後15年以内に転移を発症すると提唱されてきた。肝転移の診断後の平均生存期間は8〜10ヶ月であり、肝転移を有するブドウ膜黒色腫患者における2年間の死亡率は92％である。1つの治療選択肢は、温熱療法およびメルファランを用いた肝臓の局所灌流である。しかしながらこのアプローチは非常に侵襲性が高く、外科手術による合併症のリスクを伴う。大多数の症例で寛解が認められているとはいえ、生存期間が僅かに延長されるに過ぎない。

皮膚黒色腫とブドウ膜黒色腫は、毎年何百万もの人々の命を奪う癌のうちの2つの例にすぎない。このように、癌の治療は現代医学が直面している主要な課題の一つである。

概して、現代の抗癌治療の戦略には、外科手術、放射線療法、細胞毒性薬（化学療法）、およびホルモン薬が含まれる。化学療法剤の欠点とはこれらが非選択的でありかつ有害な副作用を引き起こすことであり、これによって事実上、投与量および従って治療効果もまた制限される。改善された、より選択的な癌療法が必要である。

点変異癌遺伝子を直接標的とした医薬の希少例はベムラフェニブであり、これは皮膚黒色腫において一般的であるBRAF^V600E変異を特異的に標的とし、化学療法と比べてオフターゲット効果が比較的小さい。しかしながらこの治療は、転移性黒色腫においては数ヶ月の延命しかせず、かつ、この特定の変異を有する黒色腫にしか効かない。したがって、下流のシグナル伝達分子を標的とすることが、見込みがあり得る。しかしこの下流の標的は酵素活性を有しておらず、低分子を用いる治療は、それらの三次構造のために不可能であることが多い。さらに、低分子インヒビターは身体全体に分散する可能性があるので、そのような下流の分子に依存している健常細胞における全身的な副作用も引き起こすと考えられる。

過去10年間にわたって、遺伝子療法が注目を集めており、将来的には遺伝子療法が、癌を含む多くの疾患に適用され得ると考えられている。

最も一般的な形の遺伝子療法には、変異遺伝子と置き換わるために、機能的な治療遺伝子をコードするDNAを使用することが含まれる。他のタイプの遺伝子療法には、変異を直接矯正すること、または（天然のヒト遺伝子ではなく）治療タンパク薬をコードするDNAを用いて治療を提供することが含まれる。例えば感染症または癌に対する遺伝子療法においてRNAiと称されるRNA干渉を活用することが可能であり得ることも、示唆されている。

RNAiとは、1990年代後半以降に知られてきた、遺伝子ノックアウトを達成するための研究ツールとして主に使用されている、多くの真核細胞で起こる遺伝子調節機構である。

しかし、RNAiベースの治療剤および他の遺伝子療法用途の開発に関する大きな課題は、治療剤（例えばRNA分子）の送達である。ウィルスベクターは有効であり得るが、安全上の懸念を生じ、かつ患者の免疫系により急速に排除される可能性があり、これによってその効果は低下する。

健常細胞の機能にとっても重要な遺伝子または遺伝子産物が標的である場合、送達様式は特に重要である。したがって、薬物を集中して罹患細胞に特異的に送達することで、全身的副作用および他の細胞における副作用を低減する可能性がある。

それ故、癌を含む疾患に関与する遺伝子およびタンパク質のターゲティング成功を阻む障害の1つが、治療剤を標的に送達する安全かつ有効な方法の開発である。

GLOBOCAN 2008 (IARC) Section of Cancer Information (11/11/2012)

本発明の目的の1つは、既存の技術の欠点を少なくとも部分的に克服すること、および、治療剤、特にオリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する手段を提供することである。

第一の局面において、以下の工程を含む、癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を作製する方法により、これらおよび他の目標が達成される：
(a) ヒト癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物を阻害することができる核酸をコードするDNA配列を、哺乳動物細胞に導入する工程；
(b) オリゴヌクレオチドインヒビターの発現を可能にする条件下で、該細胞を維持する工程；および
(c) 該細胞から、該オリゴヌクレオチドインヒビターを含むナノ小胞を入手する工程。

ナノ小胞を入手する工程は、天然に放出された細胞外小胞を細胞培養物から単離すること、ならびに/または、マイクロフィルターおよび/もしくはナノフィルターを通じた細胞の押し出しによってナノ小胞を作製することを含んでもよい。

本明細書において使用される「癌遺伝子」とは、癌を引き起こす可能性のある遺伝子を指す。癌細胞において癌遺伝子は、変異しているか、高レベルで発現している（上方制御または増幅されている）ことが多い。「癌原遺伝子」とは、変異または発現増大によって癌遺伝子になる可能性がある遺伝子を指す。公知の癌原遺伝子の例には、RAS、WNT、MYC、ERK、およびTRKが含まれる。

本明細書において使用される「ナノ小胞」とは、ナノメートル範囲の、典型的には500nm未満のサイズを有する、細胞由来の小胞を指す。「細胞由来の小胞」には、細胞から天然に放出された細胞外小胞またはエキソソーム、ならびに、本明細書に記載のように、マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって細胞から作製された小胞が含まれる。連続押し出しによって細胞から作製されたナノ小胞は「人工ナノ小胞」とも称され得るが、この文脈における「人工」とは、（例えばエキソソームとは対照的に）係るナノ小胞が細胞により天然に放出されたものではないことのみを意味していることに注目されたい。したがってこの文脈における「人工」とは、係るナノ小胞が合成であることを示唆するものではなく；これらはなお細胞由来であり、かつナノ小胞の起源である細胞（「プロデューサー細胞」）と同じ成分で構成されている。

本明細書において使用される「阻害する」とは、機能的遺伝子産物（例えばタンパク質）をもたらす遺伝子の発現が、例えば転写の阻害、mRNA変性、またはタンパク質へのmRNA翻訳の阻害によって、低減されることを意味する。本発明の文脈において、「阻害」は完全なものである必要はなく；部分的阻害または抑制または下方制御もまた、所望の効果を提供しうる。

本明細書において使用される「オリゴヌクレオチドインヒビター」とは、インヒビターである、すなわち標的分子を阻害することができるオリゴヌクレオチドを指す。これはまた、「オリゴヌクレオチドインヒビター」とも称される。

より多くのナノ小胞産生細胞を培養することによってナノ小胞の作製を容易にスケールアップすることができ、かつ、適切な時点で、例えば細胞が最適レベルのターゲティング分子を発現している時にナノ小胞を大量に作製することができるので、本発明の方法は、特に合成リポソームなどの合成送達ビヒクルの使用と比較して有利である。さらに、本発明によって得られたナノ小胞、特にプロデューサー細胞の連続押し出しによって得られたナノ小胞は、比較的高濃度の（ロード能力が比較的高い）インヒビターオリゴヌクレオチドを含み得、かつ、siRNAなどのインヒビターオリゴヌクレオチドをロードするのが比較的容易であり得る。さらに、例えば表面でターゲティング分子を発現させることにより、ナノ小胞の様々な改変が可能となり、または少なくとも大幅に簡略化される。ナノ小胞産生細胞の培養物は通常の細胞培養によってスケールアップすることができ、かつ凍結させることができ、これにより細胞の保存寿命に関連する廃棄物が減少するので、本発明の方法は費用対効果も大きい。

本発明の態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターである。転写因子を標的とすることにより、多くの異なる悪性腫瘍を1種類のインヒビターで抑制することができる。好ましくは、インヒビターオリゴヌクレオチドは、ヒトMYC遺伝子もしくは遺伝子産物に対する、好ましくはc-Myc遺伝子もしくは遺伝子産物に対するインヒビターであり得、またはE2F遺伝子ファミリーのメンバーもしくはそれらの遺伝子産物に対するインヒビターであり得る。他の態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、酵素活性を欠いたヒト細胞情報伝達分子、例えばRasファミリーのメンバーに対するインヒビターであり得る。

本発明の態様において、オリゴヌクレオチドはRNA、好ましくはRNAi分子であってもよい。RNAi分子は、shRNA、siRNA、miRNA、piRNA、nasiRNA、もしくはアンチセンスRNA、または、RNAi能力を有する任意のその他の分子からなる群より選択され得る。

本発明の態様において、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列は、SEQ ID NO: 1〜92およびSEQ ID NO: 185〜218からなる群より選択される、好ましくはSEQ ID NO: 1〜32、SEQ ID NO: 33〜67、およびSEQ ID NO: 185〜218からなる群より選択される、より好ましくはSEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196の中から選択される、DNA配列であり得る。

本発明の態様において、細胞は、細胞表面でターゲティング分子を発現してもよい。

本明細書において使用される「ターゲティング分子」とは、別の分子（「標的分子」）に特異的に結合することができる分子を意味する。したがって、ターゲティング分子を用いて、標的分子を提示している癌細胞などのある実体に対するターゲティング分子をその表面に提示している例えば細胞または小胞を特異的に局在化させることができる。

ターゲティング分子は、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に特異的に結合するリガンドであり得る。ナノ小胞産生細胞において表面ターゲティング分子を発現させることにより、該細胞から得られたナノ小胞の組織特異的ターゲティングが提供される。ターゲティング分子を発現するプロデューサー細胞を作製する利点とは、該細胞が、ターゲティング受容体との相互作用においてより効果的であり得る膜結合分子を産生することであり、これに対してリポソーム操作によるターゲティングは効果が無いことが多い。

本方法は任意で、細胞表面で発現されるターゲティング分子をコードするDNA配列を、工程 (a) の前または工程 (a) と同時に導入する工程を含み得る。

本発明の態様において、細胞は少なくとも2つの異なるターゲティング分子を発現し得、これによりさらにターゲティング特異性を増大させ得るか、または別の方法で癌細胞に対する細胞および/またはナノ小胞のターゲティングを改善し得る。

適切なターゲティング分子の例には、上皮増殖因子（EGF）、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）、または、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に指向する抗体の可変領域もしくは該抗体のfab断片が含まれる。

本発明の態様において、細胞はヒト細胞であり、癌遺伝子または癌原遺伝子はヒト癌遺伝子または癌原遺伝子である。そのような態様において、ある遺伝子を含む遺伝子構築物をヒト細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができ、該遺伝子の遺伝子産物が、該ヒト細胞によって天然に発現されるヒト癌遺伝子または癌原遺伝子と機能的に置き換わる。例えば、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子はMYC遺伝子ファミリーの1つのメンバーであり得、遺伝子構築物はMYC遺伝子ファミリーの別のメンバーを含み得る。

本発明の態様において、細胞にN-MycまたはL-Myc遺伝子を含む構築物をトランスフェクトまたは形質導入して、N-MycまたはL-Mycを過剰発現させることができる。

本発明の態様において、上記方法の工程 (a) は、ヒトc-Mycを阻害できるオリゴヌクレオチドをコードする、動作可能なように誘導性プロモーターに連結されたDNA配列を含む遺伝子構築物を導入することを含んでよく、工程 (b) は、該誘導性プロモーターの活性化により発現を誘導することを含んでよい。

本発明によるナノ小胞を作製する方法は、インビトロでもエクスビボでも実施され得る。

別の局面において、本発明は、上記の方法によって作製された、単離されたナノ小胞を提供する。

本明細書において使用される「単離されたナノ小胞」とは、プロデューサー細胞から少なくとも分離されたナノ小胞、典型的には、プロデューサー細胞培養物から、または後述のマイクロフィルターもしくはナノフィルターを通じた連続押し出しによって人工ナノ小胞を作製した場合に得られる最初の濾液から分離された、ナノ小胞を指す。単離されたナノ小胞は典型的に培地または組成物に包含され、かつ、例えば遠心分離および/または濾過によって例えば細胞片または細胞由来の他の成分を除去するための1つまたは複数の単離または精製工程に供されていてもよい。

本明細書は「ナノ小胞」と表現しているが、係る用語は複数のナノ小胞も包含することが、理解される。

さらなる局面において、本発明は、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対する、好ましくはヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含む、単離されたナノ小胞を提供する。特に、該癌遺伝子または癌原遺伝子はMYC遺伝子ファミリーのメンバーであり得、より好ましくはヒトc-Mycをコードする遺伝子であり得る。あるいは、該癌遺伝子または癌原遺伝子はE2F遺伝子ファミリーのメンバーであり得、より好ましくはヒトE2f1、E2f2、またはE2f3をコードするヒト遺伝子であり得る。別の例として、該癌遺伝子または癌原遺伝子はRAS遺伝子ファミリーのメンバーであり得、より好ましくはヒトH-Ras、N-Ras、またはK-Rasをコードするヒト遺伝子であり得る。

本発明の態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドはRNA、好ましくはRNAi分子であってもよい。RNAi分子は、shRNA、siRNA、miRNA、piRNA、nasiRNA、もしくはアンチセンスRNA、または、RNAi能力を有する任意のその他の分子からなる群より選択される。いくつかの態様において、RNAは、SEQ ID NO: 93〜184からなる群より選択される配列を含む、好ましくはSEQ ID NO: 93〜124（mycを標的とする）および125〜159（E2fを標的とする）からなる群より選択される配列を含む、例えばSEQ ID NO: 93〜102（c-mycを標的とする）の中から選択される配列を含む、shRNAまたはsiRNAであり得る。

しかしながら、オリゴヌクレオチドはDNA、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）であってもよい。

さらなる局面において、本発明は、ある遺伝子を含む遺伝子構築物をトランスフェクトまたは形質導入したヒト細胞であって、該遺伝子の遺伝子産物が、該ヒト細胞によって天然に発現されるヒト癌遺伝子または癌原遺伝子と機能的に置き換わる、ヒト細胞を提供する。したがって、インヒビターオリゴヌクレオチドによって阻害されることが意図される遺伝子の正常な非病原性発現に非依存的であるようにプロデューサー細胞を改変してもよい。結果として、プロデューサー細胞の成長および生存は、インヒビターオリゴヌクレオチドの生成による影響を受けない。特に、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子はMYC遺伝子ファミリーの1つのメンバーであり得、細胞に導入される遺伝子構築物はMYC遺伝子ファミリーの別のメンバーであり得る。例えば、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子はc-Mycであり得、遺伝子構築物はN-MycまたはL-Mycをコードする遺伝子を含み得る。

本発明の態様において、ヒト細胞は、該癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列をさらに含み得る。

さらなる局面において、本発明は、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対する、好ましくはヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトしたヒト細胞であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、ヒト細胞を提供する。

ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を含むヒト細胞は、SEQ ID NO: 1〜92およびSEQ ID NO: 185〜218からなる群より選択される、好ましくはSEQ ID NO: 1〜32、SEQ ID NO: 33〜67、およびSEQ ID NO: 185〜218からなる群より選択される、より好ましくはSEQ ID NO: 1〜9およびSEQ ID NO: 185〜196の中から選択される、DNA配列を含み得る。

本発明の態様において、ヒト細胞は幹細胞であってもよく、好ましくは胚性幹細胞または間葉系幹細胞であってもよい。

別の局面において、本発明は、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトした非ヒト哺乳動物細胞を提供する。

本発明を、例えば治療のための、インビトロまたはインビボにおける細胞への治療剤の送達のために、使用することができる。したがって、別の局面において、本発明は、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを細胞に送達する方法であって、該細胞をヒト細胞または上記のナノ小胞と接触させる工程を含む、方法を提供する。

複数の態様において、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをインビボにおいて癌細胞に送達する方法は、以下の工程を含む：
(a) 該癌細胞を有する患者に、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトした細胞を投与する工程であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、工程；および
(b) 該誘導性プロモーターを活性化させる物質の投与によってインヒビターオリゴヌクレオチドの発現を誘導する工程。

したがって、本明細書に記載のナノ小胞を癌の治療のために使用することができる。

さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載のナノ小胞および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。組成物および/またはナノ小胞は、特に癌の治療のための医薬としての用途を有し得る。治療対象となる癌は、悪性黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、消化器癌、脳癌、肺癌、上咽頭癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、子宮頸癌、前立腺癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、鼻NK T細胞リンパ腫、肉腫、白血病、神経内分泌癌、midline carcinoma、神経芽細胞腫、および頭頸部の癌からなる群より選択され得る。
[本発明1001]
以下の工程を含む、癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を作製する方法：
(a) ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を、哺乳動物細胞に導入する工程；
(b) 該細胞に該インヒビターオリゴヌクレオチドを発現させる条件下で、該細胞を維持する工程；および
(c) 該細胞から、該インヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を入手する工程。
[本発明1002]
前記インヒビターオリゴヌクレオチドが、ヒトMYC遺伝子または遺伝子産物に対する、好ましくはc-Myc遺伝子または遺伝子産物に対するインヒビターである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記オリゴヌクレオチドがRNA、好ましくはRNAi分子である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードする前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択されるDNA配列である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記細胞が、細胞表面でターゲティング分子を発現する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
工程 (a) の前または工程 (a) と同時に、該細胞表面で発現されるターゲティング分子をコードするDNA配列を導入する工程を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ターゲティング分子が、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に特異的に結合するリガンドである、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
前記ターゲティング分子が、上皮増殖因子（EGF）、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）、または、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に指向する抗体の可変領域もしくは該抗体のfab断片である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記細胞がヒト細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記細胞に、N-MycまたはL-Myc遺伝子を含む構築物がトランスフェクトまたは形質導入され、該細胞がN-MycまたはL-Mycを過剰発現する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
工程 (a) が、動作可能なように誘導性プロモーターに連結された、ヒトc-Mycを阻害できるオリゴヌクレオチドをコードする前記DNA配列を含む遺伝子構築物を導入することを含み、工程 (b) が、該誘導性プロモーターの活性化により発現を誘導することを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
インビトロまたはエクスビボで実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記本発明のいずれかの方法によって作製される、単離されたナノ小胞。
[本発明1014]
ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含む、単離されたナノ小胞。
[本発明1015]
前記癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子および遺伝子産物のファミリーのメンバーであり、より好ましくはヒトc-Mycまたはヒトc-Mycをコードする遺伝子である、本発明1013または1014の単離されたナノ小胞。
[本発明1016]
前記癌遺伝子または癌原遺伝子が、E2F遺伝子または遺伝子産物のファミリーのメンバーであり、より好ましくはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3またはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3をコードするヒト遺伝子である、本発明1013または1014の単離されたナノ小胞。
[本発明1017]
前記オリゴヌクレオチドがRNA、好ましくはRNAi分子である、本発明1013〜1016のいずれかの単離されたナノ小胞。
[本発明1018]
前記RNAが、SEQ ID NO: 93〜102からなる群より選択される配列を含むshRNAまたはsiRNAである、本発明1017の単離されたナノ小胞。
[本発明1019]
マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製された人工ナノ小胞である、本発明1014の単離されたナノ小胞。
[本発明1020]
遺伝子を含む遺伝子構築物をトランスフェクトまたは形質導入したヒト細胞であって、該遺伝子の遺伝子産物が、該ヒト細胞によって天然に発現されるヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子と機能的に置き換わり、該細胞が、該ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列をさらに含む、ヒト細胞。
[本発明1021]
前記ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子ファミリーの1つのメンバーによってコードされ、前記遺伝子構築物が、MYC遺伝子ファミリーの別のメンバーを含む、本発明1020のヒト細胞。
[本発明1022]
ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子に対する、好ましくはヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトしたヒト細胞であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、ヒト細胞。
[本発明1023]
前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択される、本発明1020または1022のヒト細胞。
[本発明1024]
幹細胞、好ましくは胚性幹細胞または間葉系幹細胞である、本発明1020〜1023のいずれかのヒト細胞。
[本発明1025]
本発明1013〜1019のいずれかのナノ小胞と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。

発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞を含む細胞に起因するナノ小胞が、重要な細胞機能を標的とする潜在的な治療用インヒビター分子の送達のためのビヒクルとして使用可能であり、先行技術の送達技術と比較して、その効果が増大し有害な副作用のリスクが低下しているという認識に基づくものである。

特に本発明者らは、癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの対応する遺伝子産物の、例えば癌遺伝子もしくは癌原遺伝子の転写因子および/または癌遺伝子もしくは癌原遺伝子のシグナル伝達分子の産生または機能性を選択的に阻害または抑制し得る核酸の送達のための、本明細書に記載の細胞および/または小胞の使用を提唱する。癌遺伝子または癌原遺伝子は変異していない癌遺伝子であってもよい。

特に関心対象となる癌遺伝子または癌原遺伝子の1つのファミリーは、MYC、MYCN、およびMYCLからなるMYC遺伝子ファミリーである。MYC遺伝子ファミリーはそれぞれ、3つの異なる転写因子である、（MYCがコードする)c-Myc、（MYCNがコードする)N-Myc、および（MYCLがコードする)L-Mycをコードし、これらは悪性疾患において極めて重要である広範な遺伝子および細胞プロセスを調節する。しかし、MYC遺伝子ファミリーは正常な細胞増殖においても活性である。

c-Mycをコードする遺伝子MYCは、ヒトゲノムにおいて第8染色体上に位置する。Mycタンパク質は、Enhancer Box配列（E-box）の結合を介して、かつ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）の補充すなわちクロマチン構造の調節によっても、作用する。Mycは全ヒト遺伝子の15％の発現を調節すると考えられている。

c-MycおよびN-Mycは、（MAPK/ERK経路を通じて）Wnt、Shh、およびEGFなどの分裂促進シグナルの下流に存在する。これらの経路は、APC（Wnt経路）、PATCHED（Shh経路）、およびEGFR、BRAF、RAS、PTEN（EGF経路）などの遺伝子の変異によって活性化されることが多いので、c-MycまたはN-Mycは癌細胞内で誘導される。

またMYCは、転写活性のある染色体位置、例えばBリンパ腫における免疫グロブリン遺伝子座の位置およびTリンパ腫におけるT細胞受容体の位置への染色体転座によっても、活性化され得る。これらの転座は、バーキットリンパ腫やT-急性リンパ性白血病などの様々な血液悪性腫瘍をもたらす。

MYCファミリーメンバーの他の活性化は増幅を介したものであり、これは、肺癌（MYC、MYCN、およびMYCL）、神経芽腫（MYCN）、および乳癌（MYC）を含む、様々な癌において起こる。

その他の遺伝子の発現の改変によって、Myc活性化は数多くの生物学的作用をもたらす。最初に発見されたのは、代謝を刺激する能力であった；例えば、オルニチンデカルボキシラーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写が刺激される。またMycは、（例えば、サイクリン、E2f転写因子の上方制御、およびp21の下方制御によって）細胞増殖を駆動し、かつこれは、細胞成長（リボソームRNAおよびタンパク質の上方制御）、アポトーシス（Bcl-2の下方制御）、分化、および幹細胞自己複製の調節において、非常に重要な役割を有する。

最も一般的なMycタンパク質であるc-Mycの低分子によるターゲティングは、その三次元タンパク質構造が、小さな阻害分子の結合部位として機能しうるポケットを欠いているため、極めて困難であることが証明されている。しかしながら、Mycタンパク質の発現はRNAi分子によって遮断され得ることが、示されている（Wang, H., et al., c-Myc depletion inhibits proliferation of human tumor cells at various stages of the cell cycle. Oncogene, 2008. 27(13): p. 1905-15）。

Mycおよび他の細胞シグナル伝達経路の下流で調節される遺伝子のセットは、E2Fファミリーの転写アクチベーターである。E2F1、E2F2、およびE2F3Aは、サイクリンEおよびCdk2などの細胞周期の進行に関与する遺伝子、DNA複製の構成要素（例えばDNAポリメラーゼ、複製起点結合タンパク質HsOrc1、MCM 5、およびcdc6）およびヌクレオチド生合成の構成要素（チミジンキナーゼおよジヒドロ葉酸レダクターゼ）に関与する遺伝子を刺激する転写因子をコードする。またE2Fファミリーは転写リプレッサー（E2f3bおよびE2f4-8）も含む。

E2fアクチベーターには、RB1遺伝子がコードする網膜芽細胞腫タンパク質pRBが結合する。結合すると、E2fタンパク質は細胞周期の進行を刺激することができない。細胞周期の進行を刺激するために、pRBが、複数部位において細胞依存的キナーゼCdk2、Cdk4、およびCdk6によりリン酸化される。これにより、結合したE2fがpRBから放出され、E2f活性化がもたらされる。RB1遺伝子またはCDKN2A〜CDKN2C遺伝子の喪失を含む多くの理由により、癌細胞はE2f活性の上昇を示す可能性がある。後者は、Ink4タンパク質と総称されるCdkインヒビターp15、p16、およびp18をコードし、これらはCdk4およびCdk6を阻害する。構成的E2f活性を活性化するための他の方法とは、Mycタンパク質によるCDK4、CCND2、およびさらにはE2F1遺伝子の直接遺伝子転写によるもの、または、Cdk4のInk4耐性変異によるものである。

最も一般的なE2fタンパク質であるE2f1の低分子によるターゲティングは、これが転写因子であることおよびしたがって酵素活性部位を欠いていることから、困難である。しかしながら、黒色腫においてE2f1の発現をRNAi分子によって遮断でき、それにより細胞周期停止および老化がもたらされることが示されている。(Verhaegen et al. E2F1 -Dependent Oncogenic Addiction of Melanoma Cells to MDM2 Oncogene. 2012 Feb 16; 31 (7)828-841)

本発明の態様において、インヒビター分子が標的とするシグナル伝達分子は、酵素活性を欠くシグナル伝達分子であり得る。インヒビター分子が標的とするシグナル伝達分子には、細胞内情報伝達に関与する、例えば細胞増殖、分化、および生存を調節する、シグナル伝達分子、例えば、Kras、Hras、およびNrasを含むタンパク質のRasファミリーが含まれ得る。

本発明の態様によると、インヒビター分子を含有するナノ小胞を、インビトロで成長させた動物細胞、典型的にはマウスまたはヒトの細胞などの哺乳動物細胞から、インビトロで作製することができる。ナノ小胞が作製される細胞は、本明細書において「プロデューサー細胞」と称する。本発明の態様において、ナノ小胞は、細胞から天然に放出されたエキソソームおよび他の細胞外小胞、ならびに、マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製された人工小胞を含み得る。本発明の他の態様において、ナノ小胞は、マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製され得る人工ナノ小胞である。フィルターを通じた細胞の押し出しによって細胞が崩壊すること、および、細胞膜および膜画分がプロセス中に再構築されることは、公知である。そのような方法によって作製される小胞の収率は、天然に産生されるエキソソームの収率よりもずっと高い。

本発明の態様において使用される人工ナノ小胞は、マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じたプロデューサー細胞、典型的には哺乳動物細胞の連続押し出しによって、作製され得る。ナノ小胞は、参照により本明細書に組み入れられるUS2012/0177574に記載の方法によって、作製され得る。特に段落[0173]〜[0197]を参照されたい。このように人工的に作製されたナノ小胞は、細胞膜表面分子の位相を含む、脂質二重層構造および膜タンパク質などの、プロデューサー細胞の膜構造を保持している。さらに、ナノ小胞はプロデューサー細胞と同じ細胞質成分を保持している。

本発明の態様によるナノ小胞は、最大500 nmの、例えば最大300 nmの、例えば最大250 nmまたは200 nmのサイズを有し得る。例えば、ナノ小胞は100〜200 nmの範囲のサイズを有し得る。しかし、いくつかの態様において、ナノ小胞は100 nmよりも小さくてよく、例えば少なくとも50 nmまたは少なくとも80 nmであり得る。

本発明の態様において、細胞によって天然に産生され放出されたエキソソームおよび他の小胞、例えば微小胞もまた、インヒビター分子を含有してよく、かつまた任意で、その表面にターゲティング分子を発現させてもよい。

エキソソーム、微小胞、および人工ナノ小胞は複数の類似点を有するが、係る小胞の間には重大な相違点も存在する。エキソソームは、細胞膜の内側への発達を伴う天然プロセスを通じて産生され、多胞体を介して形成される。エキソソームにはRNAを含む非常に特殊な物質がロードされており、これは細胞内容物のランダム選択ではない。さらにエキソソームは非常に緊密な構造を有し、外部のsiRNAをロードするのが非常に困難であることが示されている（Wahlgren et al., Nucleic Acids Res. 2012 Sep 1 ;40(17):e130）。一方微小胞は、エキソソームよりもずっと少ないRNAしか包含しないことが、いくつかの実験において示されている。

マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製された人工ナノ小胞は、該細胞が有さない任意のタンパク質をその表面に包含し、かつ細胞質のランダム選択を包含する。したがって、操作された細胞の細胞膜におけるターゲティング表面分子の過剰発現により、人工ナノ小胞上に該分子の存在がもたらされると考えられる。同様に、細胞内で過剰発現した分子もまた、人工ナノ小胞内部に高濃度で存在すると考えられる。最も重要なことに、人工ナノ小胞の収率は、細胞によって天然に放出されたエキソソームまたは他の細胞外小胞の収率よりも有意に高いと予想される。

本発明の態様において、ナノ小胞内部に含まれるインヒビター分子は核酸であってよく、典型的には、shRNA、siRNA、またはmiRNAなどのRNAi分子、および、典型的にはshRNAまたはsiRNAであってよい。

RNAiと称されるRNA干渉は、多くの真核生物細胞で起こる遺伝子調節機構である。RNAiは、長い二本鎖RNA分子（dsRNA）を切断してより短い鎖の二本鎖RNAすなわち低分子干渉RNA（siRNA）にするDicer酵素により、仲介される。siRNA鎖は分離されて2つの一本鎖RNA分子であるssRNAとなり、ガイド鎖が組み込まれてRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれる複合体となり、かつ、mRNA分子への相補的結合によって遺伝子発現をサイレンシングし得る。特定のmRNAをサイレンシングするよう設計されたヌクレオチド配列を含み、その後Dicerによって切断されsiRNAとなる、低分子ヘアピン型RNA分子（shRNA）の細胞内での遺伝子操作された発現による、関心対象の遺伝子の選択的サイレンシングに、RNAi機構を用いることができる。

本明細書において使用される「RNAi分子」とは典型的に、例えばdsRNA、低分子ヘアピン型RNA（shRNA：dsRNAの代わりに出発材料として使用され得る）、miRNA、siRNA、およびssRNAを含む、RNAiプロセスに関与する任意のRNA分子を指す。

インヒビターオリゴヌクレオチド、特にRNAiの使用は、低分子薬物と比較して数多くの利点を有する。低分子は溶解度の問題を呈し、これにより、低分子はインビボ送達のために製剤化することが不可能となっている。一旦製剤化されると、吸収の問題も呈し、これにより経口ではなく静脈経路を介した送達が必要となる。また低分子は、高すぎる間質圧のために、血清タンパク質と結合するか、または例えば腫瘍への侵入が妨げられる可能性があり、このことは、不十分な分散をもたらす。また低分子は、全身的に分散する可能性もあり、これによって腫瘍内濃度の低下がもたらされる。また低分子は代謝される可能性もあり、このことは、安定性低下および毒性の副生成物産生の可能性を導く。排出の結果として、定常状態レベルの低下も起こり得る。最後に、低分子は多数の標的を有し得、生きている多細胞生物において毒性を呈する可能性がある。一方オリゴヌクレオチドは、急速に分解されて非毒性の残基となる。

本発明の態様において、インヒビター分子は、Mycファミリーのメンバーの阻害を達成できるRNAi分子であり得る。そのような態様において、インヒビター分子は、SEQ ID NO: 93〜124の中から選択される、例えば、SEQ ID NO: 93〜102（c-mycを標的とするRNA）、SEQ ID NO: 103〜111（L-mycを標的とする）、またはSEQ ID NO: 112〜124（N-mycを標的とする）から選択されるRNA配列を含み得る。

本発明の態様において、インヒビター分子は、E2Fファミリーのメンバー、例えばE2f1、E2f2、またはE2f3の阻害を達成できるRNAi分子であり得る。そのようなインヒビター分子は、SEQ ID NO: 125〜159、例えば、SEQ ID NO: 125〜140（E2f1を標的とする）、SEQ ID NO: 141〜148（E2f2を標的とする）、またはSEQ ID NO: 149〜159（E2f3を標的とする）から選択されるRNA配列を含み得る。

本発明のさらに他の態様において、インヒビター分子は、Rasファミリーのメンバー、例えばHras、Kras、またはNrasの阻害を達成できるRNAi分子であり得る。そのようなインヒビター分子は、SEQ ID NO: 160〜184から選択される、例えば、SEQ ID NO: 160〜171（Hrasを標的とする）、SEQ ID NO: 172〜177（Krasを標的とする）、またはSEQ ID NO: 178〜184（Nrasを標的とする）から選択されるRNA配列を含み得る。

所望の内容のインヒビター分子、特にRNAi分子、例えばshRNAまたはsiRNAを有するナノ小胞を作製するために、インヒビター分子をコードするDNA配列を、従来の遺伝子操作技術を用いて、例えばウィルスベクターを用いてプロデューサー細胞に挿入してもよい。動物、例えば哺乳動物の細胞における例えばshRNA発現を達成するのに適したベクターは当業者には公知であり、アデノ関連ウィルス、アデノウィルス、またはレトロウィルス/レンチウィルスに基づくベクターが挙げられ得る。

したがって、関心対象のインヒビター分子をコードするDNA配列をプロデューサー細胞に導入してもよく、これは、プロデューサー細胞内での該DNA配列の発現すなわちインヒビター分子の産生を可能にする条件下で、維持され得る。インヒビター分子をコードするDNA配列の導入によって、インヒビター分子をプロデューサー細胞内で多量に発現させ、かつサイトゾル内に局在させることができる。例えば、DNA配列にコードされるshRNAを細胞機構によってサイトゾルに移動させ、そこで、プロセシングによりsiRNAとすることができる。インヒビター分子がプロデューサー細胞のサイトゾル区画内で発現して存在している場合、該インヒビター分子は、該細胞から作製されたナノ小胞中にも存在すると考えられる。なぜなら該ナノ小胞は該プロデューサー細胞と同じサイトゾル成分を有しているからである。shRNAを発現する細胞から作製されたナノ小胞は、したがって、例えばshRNAおよび/または、該shRNAに起因するsiRNAを、典型的にはsiRNAを含むと考えられる。

代替的に、オリゴヌクレオチドなどのインヒビター分子を、単離されたナノ小胞中に直接ロードすることができる。

本発明の態様において、インヒビター分子とは、ヒトMYC遺伝子または遺伝子産物の阻害または抑制のためのRNAi分子、典型的にはshRNAまたはsiRNAである。

ヒトc-Mycに対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、およびSEQ ID NO: 9より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよく；あるいは、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、およびSEQ ID NO: 196からなる群より選択されるDNA配列を導入してもよい。

ヒトL-Mycに対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、およびSEQ ID NO: 19より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。あるいは、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、およびSEQ ID NO: 205からなる群より選択されるDNA配列を導入してもよい。

ヒトN-Mycに対するshRNAまたはsiRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、およびSEQ ID NO: 32より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。あるいは、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、およびSEQ ID NO: 218からなる群より選択されるDNA配列を導入してもよい。

SEQ ID NO: 185〜218のDNA配列を含むレンチウィルスプラスミドが、Sigma Aldrich（米国）より市販されている。

本発明の態様において、インヒビター分子とは、ヒトE2F遺伝子または遺伝子産物の阻害または抑制のためのRNAi分子、典型的にはshRNAまたはsiRNAである。ヒトE2f1に対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 33〜48より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。ヒトE2f2に対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 49〜56より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。ヒトE2f3に対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 57〜67より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。

本発明の態様において、インヒビター分子とは、ヒトRAS遺伝子または遺伝子産物の阻害または抑制のためのRNAi分子、典型的にはshRNAまたはsiRNAである。ヒトHrasに対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 68〜79より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。ヒトKrasに対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 80〜85より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。ヒトNrasに対するshRNAなどのRNAi分子を発現させるために、DNA配列を、SEQ ID NO: 86〜92より選択される配列を含むプロデューサー細胞内に導入してもよい。

インヒビター分子をコードするDNA配列は典型的に、プロモーターの制御下にある。プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよい。

本発明の態様において、例えば、プロデューサー細胞が、それ自体の増殖のために機能的ヒトc-Mycタンパク質に依存的であるヒト細胞である場合、所望のプロデューサー細胞数または所望のプロデューサー細胞密度が達成された時などの適切な時点でインヒビター分子の発現を開始できるように、誘導性プロモーターを使用することが好ましい可能性がある。任意の適切な従来のプロモーター、例えばドキシサイクリン誘導性プロモーターを使用することができる。

他の態様において、プロデューサー細胞は、インヒビター分子による阻害または抑制が意図される標的遺伝子の機能に非依存的であってもよい。そのような態様において、プロモーターは、構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよい。本明細書において使用される「標的遺伝子」とは、インヒビター分子による阻害もしくは抑制の対象であるかまたは遺伝子産物がインヒビター分子による阻害もしくは抑制の対象である、遺伝子を指す。

例えば、非ヒト動物細胞または細菌を、ヒト遺伝子または遺伝子産物に指向するインヒビター分子を含有するナノ小胞の作製のためのプロデューサー細胞として使用してもよい。例えば、マウス細胞を、（少なくとも、マウスとヒト遺伝子の配列類似性が高すぎない位置の）ヒト遺伝子に対する、例えば、ヒトc-MycなどのヒトMYC遺伝子ファミリーのメンバーに対するRNAi分子（およびRNAi分子を含むナノ小胞）の作製のために、使用することができる。代替的に、標的遺伝子と同じ種のプロデューサー細胞を使用してもよく、該細胞は、該標的遺伝子に非依存的であるよう改変されている。一例として、MYCファミリーの第一のメンバーに対するRNAi分子の作製のために使用するヒト細胞を、該第一のMYCメンバーの機能に非依存的になるよう、MYC遺伝子ファミリーの別のメンバーを過剰発現するように改変することができる。具体的には、標準的技術を用いて、通常は低レベルでしか発現しないN-mycを過剰発現するようにヒト細胞を遺伝子改変することができ、これは、機能的にc-Mycと置き換わって該細胞をc-Myc非依存的にすることができる。したがって、同じプロデューサー細胞内でのヒトc-MYCに対するRNAi分子の発現は、細胞の成長および増殖を妨害しない。代替的に、例えば、ヒトc-Mycに指向するRNAi分子との相補性を回避するようなおよび従ってプロデューサー細胞のc-Mycの阻害を回避するような1つまたは複数の点変異の導入によって、ヒト細胞の天然c-Mycを遺伝子改変してもよい。

本発明の態様において、インヒビター分子をコードするDNA配列を挿入することなく、上記のように細胞からナノ小胞を作製してもよい。そのような態様において、インヒビター分子が、単離されたナノ小胞内に、エレクトロポレーション等を用いて直接導入され（「ロードされ」）得る。例えば、siRNAなどのRNAi分子が、単離されたナノ小胞内に、エレクトロポレーションによって直接挿入され得る。以前の研究によって、エキソソーム内への送達に関してこのアプローチが有効であり得ることが示唆されている（Alvarez-Erviti, L., et al., Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol, 2011. 29(4): p. 341-5;）。

本発明においてプロデューサー細胞として使用される細胞は、ナノ小胞を形成することができかつインヒビター分子を発現可能である任意の真核細胞であってよい。典型的には細胞は、マウスおよびヒト細胞を含む動物細胞、特に哺乳動物細胞であり得る。さらに、プロデューサー細胞として使用される細胞は、インビトロでの増殖、インヒビター分子の改変および発現、ならびにナノ小胞の産生に適した細胞系に由来していてもよい。細胞は幹細胞であり得る。適切な細胞の例には、ヒト胎児由来腎臓（HEK、例えばHEK 293）細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞（例えばNIH 3T3マウス線維芽細胞）、または任意のその他の適切な真核細胞が含まれる。間葉系幹細胞は、胚細胞などの他の細胞から、または自己由来の供給源によって（したがって、療法が意図されている患者から）、作製され得る。

癌細胞へのナノ小胞の選択的送達を達成するために、ナノ小胞の膜の外面上にターゲティング分子が存在していてもよい。好ましくは、ターゲティング分子は、癌細胞の表面に特異的であるかまたは癌細胞の表面に過剰に提示された（過剰発現された）別の分子（例えばリガンド受容体）に選択的に結合する、分子（例えばリガンド）であり得る。適切なターゲティング分子の例には、上皮増殖因子（EGF）（EGF受容体（EGFR）に結合する）、および、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）（MSH受容体（MSHR；メラノコルチン1受容体（MC1R）とも称される）に結合する）が含まれる。EGFRは上皮癌細胞タイプの大多数で過剰発現しているのに対し、MC1Rは黒色腫およびメラニン細胞系統の細胞で発現している。最近、血小板由来増殖因子の膜貫通ドメインを用いた、EGF様ペプチドを過剰発現するエキソソームが、マウスにおいてインビボでEGFR発現腫瘍を標的とすることができることが示された（Ohno, S.I., et al., Systemically Injected Exosomes Targeted to EGFR Deliver Antitumor MicroRNA to Breast Cancer Cells. Mol Ther, 2012）。またターゲティング分子には、天然リガンドも、さらには、癌特異的表面抗原に結合する能力を有する操作された抗体断片も、含まれ得る。

ターゲティング分子をナノ小胞内に導入するために、ターゲティング分子をコードする遺伝子などのDNA配列を含むDNA配列を、細胞内でのターゲティング分子の発現を達成するのに必要なプロモーターなどの任意の配列を含む従来のクローニング技術を用いて導入してもよい。ターゲティング分子は、細胞膜の外面に天然に位置している分子であり得る。あるいはターゲティング分子は、GPIアンカー型タンパク質またはICAM-1の膜貫通/サイトゾルドメイン（T/C ICAM-1）などの膜貫通タンパク質との融合タンパク質であってもよい。

ターゲティング分子が細胞膜に局在する場合、該ターゲティング分子は、上記のとおりナノ小胞を単離した後のナノ小胞膜の一部も形成する。細胞膜の表面にターゲティング分子を発現させるためのプロデューサー細胞の遺伝子改変は、インヒビター分子をコードするDNA配列を該プロデューサー細胞に導入する工程の前に実施することができる。あるいは、本発明の態様において、ターゲティング分子をコードするDNA配列およびインヒビター分子をコードするDNA配列を、プロデューサー細胞に同時に導入してもよい。ターゲティング分子の、プロデューサー細胞の表面への導入、およびしたがってその天然の細胞外小胞または膜を通じた連続押し出しによって作製されたナノ小胞への導入は、プロデューサー細胞がインヒビター分子を発現せず、ナノ小胞が単離され続いて例えばエレクトロポレーションを介したインヒビター分子の直接導入に使用される態様においても、実施され得る。

本発明は、癌を含む数多くの疾患に対する成功裏の療法を開発するための手段を提供する。本発明の態様によるナノ小胞は、インヒビター分子が指向する癌遺伝子または癌原遺伝子によって少なくとも部分的に引き起こされた癌を患う患者に、投与され得る。ナノ小胞は、静脈内注射によって、または直接腫瘍内に、または腫瘍に冒された身体の腫瘍含有器官内もしくは部分内に、任意で薬学的組成物の一部として、投与され得る。

薬学的組成物は、ナノ小胞、および典型的には薬学的に許容される担体も、含み得る。注射に適した薬学的組成物の例には、無菌の水溶液または分散液、および、無菌の注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。典型的には、組成物は無菌である。さらに組成物は、容易に注射可能である程度に流動性であり得る。組成物は好ましくは、製造および保存条件下で安定であり、好ましくは細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されている。

本発明の態様による薬学的組成物の投与は、任意の適切な経路を介して、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、脳内、脊髄液内、皮下、腫瘍もしくは腫瘍が蔓延した組織もしくは手足内に直接、または眼内、または鼻腔内、または吸入によって、または経口および/もしくは腹腔内で、行われ得る。

ナノ小胞は、エキソソームおよび他の小胞と類似の様式で癌細胞によって内部移行され得、したがって、その積荷であるインヒビター分子を癌細胞の内部に送達し、そこで該インヒビター分子は、例えばRNAiによりその阻害機能を実施することができる。

追加的にまたは代替的に、ナノ小胞を事前に単離することなく、本発明の態様によるプロデューサー細胞を患者に直接、例えば腫瘍内に直接、投与してもよい。そのような場合、投与後にターゲティング分子が癌細胞に近接して局在化されるように、プロデューサー細胞は該分子を細胞表面に発現していることが好ましい。投与は、任意の適切な経路を介して、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、脳内、脊髄液内、皮下、腫瘍もしくは腫瘍が蔓延した組織もしくは手足内に直接、または眼内、または鼻腔内、または吸入によって、または経口および/もしくは腹腔内で、行うことができる。さらにそのような場合、分子インヒビターをコードするDNA配列は、ドキシサイクリンによって誘導可能なプロモーターなどの誘導性プロモーターの制御下にあることが好ましい。細胞の投与後、経口または静脈内などの任意の適切な経路による患者へのドキシサイクリンの投与によって、インヒビター分子の発現が誘導され得る。RNAi分子が発現すると、細胞はストレスを受け、結果として多量のエキソソームおよび他の小胞を短期間に放出し、これによって、腫瘍細胞近傍に高濃度のRNAi含有小胞がもたらされ、腫瘍細胞はその後、天然の手段を介して該小胞を取り込む。RNAi分子は、c-Mycまたは他の転写因子などの極めて重要な癌原遺伝子を阻害することによって腫瘍細胞の内部で治療効果を有すると考えられる。注射された細胞におけるインヒビター分子の大量かつ/または長期間の発現はアポトーシスを誘導する可能性が非常に高く、アポトーシスは、アポトーシス小体を介した該細胞からの分子インヒビターのさらなる放出をもたらし、アポトーシス小体もまた、その積荷をレシピエント腫瘍細胞へと送達することができる。結果として、RNAi分子は腫瘍細胞に近接した天然のナノ小胞および微小胞内に封入され、その後、癌細胞に侵入してRNAiを誘発する。遊離分子として間質組織中に（細胞外に）存在する場合RNAi分子は天然に分解されるので、小胞へのRNAi分子の封入は重要である。

本発明は、数多くの癌性疾患の治療に使用できる可能性のある治療用ツールを提供する。全ての癌の80%程度において、c-Myc遺伝子が過剰発現している可能性がある（Nilsson & Cleveland Oncogene. 2003 Dec 8;22(56):9007-21）。

本発明の態様による細胞またはナノ小胞を用いて治療され得る癌の一例は、黒色腫である。悪性のヒト黒色腫細胞系の大多数において老化を引き起こすのにc-Myc阻害が有効でありうることが、以前に示された（Wang et al., 2008）。さらに、Ras誘発性肺腺癌のマウスモデルにおける優性干渉（dominant-interfering）Myc変異体の全身的な発現によるMyc阻害が初発のおよび確立された肺腫瘍の迅速な退縮を引き起こし、これにより、Mycを標的とすることは悪性腫瘍の治療において有効でありうることが確認された（Soucek, L., et al., Modelling Myc inhibition as a cancer therapy. Nature, 2008. 455(7213): p. 679-83）。これらの以前の研究はともに、黒色腫を含む多くの悪性腫瘍がc-Mycに依存的であることを示唆している。

したがって、 (a) 悪性黒色腫細胞を標的とし、かつ (b) 下流の癌遺伝子または黒色腫細胞にとって極めて重要な転写因子を下方制御するRNAi分子を含む、本発明の態様によるナノ小胞を、発癌遺伝子の変異状態にかかわらず、転移性ブドウ膜黒色腫および転移性皮膚黒色腫において使用することが可能であり得る。c-MycおよびE2f1遺伝子は黒色腫全般において極めて重要であることが証明されているので、これらはそのような療法に非常に適した標的遺伝子であると考えられる。最後に、黒色腫を標的とする細胞またはナノ小胞は、転移のないブドウ膜黒色腫における目の局所療法としてまたは腫瘍の局所除去と共に補助療法として使用できる可能性もあり、眼球摘出を回避できる可能性もある。

またc-Mycは子宮頸癌、結腸癌、乳癌、肺癌、および胃癌にも関連しており、従って本発明は、そのような悪性腫瘍の療法においても有用であり得る。

それゆえ、黒色腫に加えて、例えばEGFR陽性悪性腫瘍を標的としかつc-Mycに対するインヒビターを含む細胞および/またはナノ小胞は、多くの悪性疾患に対する推定上の治療的アプローチであり得る。

実施例1：ヒトプロデューサー細胞の表面へのターゲティング分子の導入
最初にGPIアンカータンパク質またはI-CAM1のいずれかと共にEGFまたはMSHをインフレームで発現するpCMV-zeoベクターを作製し、HEK 293細胞または間葉系幹細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、ゼオシンで処理し、磁気ビーズまたはセルソーターを用いて、EGFまたはMSHの表面発現に基づき耐性細胞を選別する。トランスジェニック発現の維持は、フローサイトメトリーによりルーチンでモニターしてもよい。

EGFまたはMSH融合タンパク質を発現する細胞は、任意でインヒビター分子の発現と共に、ナノ小胞の産生のためにさらに用いてもよい。

実施例2：c-Mycに非依存的となるよう改変されたヒト細胞を用いたナノ小胞の産生
A．c-Mycに非依存的であるようにするヒト細胞の改変
マウスレトロウィルス受容体（mCAT-1）と、IRES（キャップ非依存的翻訳を可能にする）によって隔てられているN-Myc:GFP融合物を含む哺乳動物発現ベクターを、HEK 293T細胞または間葉系幹細胞にトランスフェクトする。使用する細胞株は、職員の安全性の向上のため、マウス特異的エンベロープ偽型レンチウィルスに対するエコトロピック受容体を備えていてもよい。さらに、クローニングのためにpcDNA-neoベクターを用いて、ネオマイシン耐性カセットを発現させることも可能である。代替として、インヒビターがc-Mycに指向している場合、N-Myc遺伝子の代わりに、発現ベクターはL-myc遺伝子を含有していてもよい。

Amaxaヌクレオファクターまたは任意の他の適した手法を用いて、ベクターをヒト細胞にクローニングする。ネオマイシンおよびGFP陽性細胞についてのFACS選別により、首尾よく形質導入された細胞を選択する。

B．ヒトMycタンパク質に対するインヒビターをコードするDNA配列の、ナノ小胞産生細胞への導入
Sigma Aldrich, USA（MISSION TRCpLKO-puro clones）から入手した、SEQ ID NO：185〜196からなる群より選択される配列を有するレンチウィルスプラスミドを、HEK 293T細胞にトランスフェクトする。細胞にトランスフェクトする際、3'の長い末端反復内の欠失によって複製能がなく、自己不活性化されているHIV-1ベースの転写物を作製する。さらにレンチウィルスベクターを、pCMV-dR8.2 dvprおよびpHCMV-Eco（どちらもAddgene plasmid depositoryから入手）と同時トランスフェクションし、前者はHIV-GAGを発現する最小限のベクターを含有し、後者はエコトロピックエンベロープを含有する。したがってHEK 293T細胞が産生するレンチウィルスは、複製能がなく、実施例2Aに記載のようにマウス細胞またはマウスレトロウィルス受容体（mCAT1）を発現する細胞にのみ感染することができる。次に、HEK 293T細胞を培養し、トランスフェクトした細胞由来のウィルスを含む細胞培養物の上清を用いて、mCAT1を発現するヒト細胞の形質導入を行い、その後ピューロマイシン（レンチウィルスプラスミドによってコードされる）によって選択する。mCAT1を発現するヒト細胞は、N-Myc遺伝子には依存的であるが、ヒト標的遺伝子、例えばc-Mycには非依存的であるため、その成長と生存は、ヒト標的遺伝子、例えばヒトc-Mycに指向するインヒビター分子の発現には影響され得ない。

C．ナノ小胞の単離
ナノ小胞およびまたは天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。

実施例3：ヒト細胞を用いるナノ小胞の産生（誘導性発現）
A．Mycタンパク質に対するインヒビターをコードするDNA配列（誘導性発現）のヒト細胞への導入
テトラサイクリン（ドキシサイクリン）またはIPTG誘導性発現システムを、所望のインヒビター分子のDNA配列（ここではSEQ ID NO：185〜218のいずれか一つに記載のDNA配列）をクローニングするために用いる。例えば、pLKO-TetON-puroシステム（Addgene）またはpLKO_IPTG_3xLacOシステム（Sigma）を用いてもよい。

B．ナノ小胞の単離（任意）
ナノ小胞およびまたは天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。

代替として、ナノ小胞を単離する代わりに、インヒビター分子を細胞培養物から回収し、その後例えば電気穿孔法を用いてナノ小胞に直接導入するために用いてもよい。そのような態様において、インヒビター分子は、上記のように人工的に作製されたナノ小胞に導入してもよい。

代替として、順次押し出しによる人工ナノ小胞の作製を使用する代わりに、遺伝子操作したプロデューサー細胞、例えばエキソソーム、微小胞、またはアポトーシス小体から天然に放出される細胞外小胞を、細胞培養物から単離してもよい。そのような天然の細胞外小胞は、その表面に標的とする分子を発現し、かつインヒビター分子も含むであろう。

実施例4：マウス細胞を用いたナノ小胞の産生
A．MycインヒビターをコードするDNA配列のマウス細胞への導入
Sigma Aldrich, USA（MISSION TRCpLKO-puro clones）から入手した、SEQ ID NO：185〜218からなる群より選択される配列を有するレンチウィルスプラスミドを、HEK 293T細胞にトランスフェクトする。細胞にトランスフェクトする際、3'の長い末端反復内の欠失によって複製能がないHIV-1ベースの転写物を作製する。さらにレンチウィルスベクターを、pCMV-dR8.2 dvprおよびpHCMV-Eco（どちらもAddgene plasmid depositoryから入手）と同時トランスフェクションし、前者はHIV-GAGを発現する最小限のベクターを含有し、後者はエコトロピックエンベロープを含有する。したがってHEK 293T細胞が産生するレンチウィルスは、複製能がなく、マウス細胞にのみ感染することができる。次に、HEK 293T細胞を培養し、トランスフェクトした細胞由来のウィルスを含む細胞培養物の上清を用いて、NIH 3T3マウス線維芽細胞の形質導入を行い、その後ピューロマイシン（レンチウィルスプラスミドによってコードされる）によって選択する。マウス線維芽細胞は、ネイティブのマウス遺伝子には依存的であるが、ヒト標的遺伝子、例えばc-Mycには非依存的であるため、その成長と生存は、ヒト標的遺伝子、例えばヒトc-Mycに指向するインヒビター分子の発現には影響され得ない。

B．ナノ小胞の単離
ナノ小胞および／または天然の細胞外小胞の単離は、遠心分離工程を含む公知の手順により行うことができる。例えば、人工ナノ小胞をUS 2012/0177574に記載のように作製してもよい。核膜から生じる人工の高密度小胞を、短い遠心分離工程によって取り出すことができる。例えばEGF受容体を標的とする分子を発現するナノ小胞を、advanced FACSソーティングプロトコール、磁気法、または任意の他の方法のいずれかを用いて、抗体技術を用いて、陽性選択または陰性選択のいずれかにより精製してもよい。

Claims (23)

1. 以下の工程を含む、インビトロまたはエクスビボにおける、癌遺伝子もしくは癌原遺伝子またはこれらの遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を作製する方法：
   (a) L-Myc遺伝子を含む構築物を、哺乳動物細胞にトランスフェクトまたは形質導入する工程；
   (b) 該細胞に該L-Myc遺伝子を過剰発現させる条件下で、該細胞を維持する工程；
   (c) ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるインヒビターオリゴヌクレオチドであってL-Mycを阻害しないインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を該細胞に導入する工程；および
   (d) 該細胞から、該インヒビターオリゴヌクレオチドを含むナノ小胞を入手する工程。
2. 前記インヒビターオリゴヌクレオチドが、ヒトMYC遺伝子またはヒトMYC遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチド、または、c-Myc遺伝子またはc-Myc遺伝子産物に対するインヒビターオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
3. 前記インヒビターオリゴヌクレオチドがRNA、またはRNAi分子である、請求項1または2のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択されるDNA配列である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
5. 前記細胞が、細胞表面でターゲティング分子を発現する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程 (a) の前または工程 (a) と同時に、該細胞表面で発現されるターゲティング分子をコードするDNA配列を導入する工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ターゲティング分子が、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に特異的に結合するリガンドである、請求項5または6に記載の方法。
8. 前記ターゲティング分子が、上皮増殖因子（EGF）、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）、または、癌細胞上で過剰発現している表面タンパク質に指向する抗体の可変領域もしくは該抗体のfab断片である、請求項7に記載の方法。
9. 前記細胞がヒト細胞である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程 (c) が、動作可能なように誘導性プロモーターに連結された、ヒトc-Mycを阻害できるインヒビターオリゴヌクレオチドをコードする前記DNA配列を含む遺伝子構築物を導入すること、および該誘導性プロモーターの活性化により発現を誘導することを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
11. 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法によって作製される、単離されたナノ小胞。
12. ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドであってL-Mycを阻害しないインヒビターオリゴヌクレオチドを含む、単離されたナノ小胞。
13. 前記ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子およびMYC遺伝子産物のファミリーのメンバー、または、ヒトc-Mycまたはヒトc-Mycをコードする遺伝子である、請求項11または12に記載の単離されたナノ小胞。
14. 前記ヒト癌遺伝子また癌原遺伝子が、E2F遺伝子またはE2F遺伝子産物のファミリーのメンバー、またはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3またはヒトE2f1、E2f2、もしくはE2f3をコードするヒト遺伝子である、請求項11または12に記載の単離されたナノ小胞。
15. 前記インヒビターオリゴヌクレオチドがRNA、またはRNAi分子である、請求項11〜14のいずれか一項に記載の単離されたナノ小胞。
16. 前記RNAが、SEQ ID NO: 93〜102からなる群より選択される配列を含むshRNAまたはsiRNAである、請求項15に記載の単離されたナノ小胞。
17. マイクロフィルターおよび/またはナノフィルターを通じた細胞の連続押し出しによって作製された人工ナノ小胞である、請求項12に記載の単離されたナノ小胞。
18. L-Myc遺伝子を含む遺伝子構築物をトランスフェクトまたは形質導入したヒト細胞であって、該L-Myc遺伝子の遺伝子産物が、該ヒト細胞によって天然に発現されるヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子と機能的に置き換わり、該細胞が、ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子を阻害することができるインヒビターオリゴヌクレオチドであってL-Mycを阻害しないインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列をさらに含む、ヒト細胞。
19. 前記ヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子が、MYC遺伝子ファミリーの1つのメンバーによってコードされる、請求項18に記載のヒト細胞。
20. L-Myc遺伝子を含む遺伝子構築物およびヒト癌遺伝子または癌原遺伝子の転写因子に対するインヒビターオリゴヌクレオチドであってL-Mycを阻害しないインヒビターオリゴヌクレオチドをコードするDNA配列を形質導入またはトランスフェクトしたヒト細胞であって、該DNA配列が誘導性プロモーターに機能的に連結されている、ヒト細胞。
21. 前記DNA配列が、SEQ ID NO: 1〜10およびSEQ ID NO: 185〜196からなる群より選択される、請求項18または20に記載のヒト細胞。
22. 幹細胞、胚性幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項18〜21のいずれか一項に記載のヒト細胞。
23. 請求項11〜17のいずれか一項に記載のナノ小胞と薬学的に許容される担体とを含む、組成物。