JP6385357B2 - 抗体重鎖不変部位の異種二量体、高効率の形成を誘導するｃｈ３ドメイン変異体対、その作製方法および用途 - Google Patents

Description

本発明は、抗体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、ＩｇＧ）の重鎖不変部位の異種二量体形成の収率を増進するための、ＣＨ３ドメインに突然変異を誘導したＣＨ３ドメイン変異体対、上記ＣＨ３突然変異体対を用いた異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対タンパク質、二重特異性抗体、および融合タンパク質に関するものである。

また、本発明は、前記異種二量体、これを含む異種二量体重鎖不変部位対、二重特異性抗体、および融合タンパク質を含む薬学的組成物に関するものである。

また、本発明は、前記抗体ＣＨ３ドメイン異種二量体重鎖不変部位の形成が好まれるＣＨ３ドメイン変異体対と異種二量体重鎖不変部位対、タンパク質の作製方法に関するものである。

１９世紀末、非−致死量のジフテリアと破傷風の投与された実験動物の血清を他の動物に投与することにより、ジフテリアと破傷風から保護されることができるという事実が発見されて以来、血清治療、すなわち抗体治療の概念が徐々に臨床に活用され始めた。しかし、初期の抗体治療は、高純度の抗体と血液由来の感染媒体の汚染などの問題点により、実用性が極めて制限された。これらの伝統的な抗体治療の問題点は、１９７５年に開発されたハイブリドーマの融合技術（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により、野生型の齧歯類起源のモノクローナル抗体を、比較的低価格で大量生産できるようになって、新たな転換点を迎えることになったが、人体投与時にマウス起源のモノクローナル抗体が引き起こす短い半減期、抗−マウス抗体に対する免疫応答、効果の低下、致命的なアレルギー反応など、多くの欠点と副作用のため臨床での使用が制限された。

１９８０年代、バイオ革命の出発点となった遺伝子組換え技術の登場で、遺伝子操作によりマウスモノクローナル抗体をヒト化させるヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の作製を可能にしており、患者への投与時に発生した様々な免疫的副作用を最小化して、臨床において治療用抗体が積極的に活用できる礎となった。一方、１９９０年半ばからファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）技術や遺伝子移植マウスを使用して、完全なヒトモノクローナル抗体を作ることができる基礎技術が開発されており、現在、国内外の多くの製薬会社が死活をかけて抗体を用いた新薬の開発に莫大な研究と投資を行っている。現在、約２６個の抗体新薬が米国食品医薬品安全庁の許可を受けて、世界的に市販されており、３００以上の治療用抗体が臨床試験段階にあり、製薬業界での抗体の重要性をよく証明している。一方、最近になって標的選択性を持つ抗体と標的特異性のない化学療法治療剤を併用投与することにより、副作用を抑制し、治療効果が改善される前臨床および臨床試験の結果が導き出されており、抗ガン治療における抗体の有用性はさらに拡大される見込みである。

一方、現在の抗体新薬は、ガン、自己免疫疾患などを主なターゲットとして開発された、特に固形腫瘍（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）の場合ＩｇＧあるいは純粋な抗体の形態の抗体新薬が満足のいく治療効果を見せず、抗体産生のコスト高の問題などが抗体新薬開発の障害となっており、既存の抗体よりも生物学的効能が改善された組換えタンパク質の形態の新しい抗体新薬開発の試みが着実に進められてきた。そのうちの一つが、特に抗ガン治療に活用しようと、１９８０年代半ばから研究が始まっている、１つの抗体が少なくとも２つ以上の標的分子と結合することができる二重特異性抗体と言える。

自然界に存在する抗体（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）は、同じアミノ酸配列を持つ２つの重鎖と同じ配列を持つ２つの軽鎖の組み合わせ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）された形で存在する。このとき、２つの同じ重鎖間における同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）は抗体の不変領域（Ｆｃ、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の最後のドメイン（すなわちＩｇＧの場合ＣＨ３ドメイン、ＩｇＭの場合ＣＨ４ドメイン、ＩｇＤの場合ＣＨ３ドメイン、ＩｇＥの場合ＣＨ２およびＣＨ４ドメイン、ＩｇＡの場合ＣＨ３ドメイン）との間の相互作用を介して形成が誘導され、続いてヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域間のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）が誘導され、強固な重鎖間の同種二量体が形成される。具体的には、ヒトＩｇＧ１における重鎖と軽鎖の組み合わせは、重鎖のヒンジ領域の５番目のＣｙｓとｋａｐｐａ軽鎖の１０７番目のＣｙｓとの間のジスルフィド結合によって誘導される。

したがって、自然に存在するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）は、１種の抗原に対して二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の形で結合する特性を示す。一方、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、単一の分子の形の抗体で２種の抗原を同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）または択一的に（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）結合することができる抗体を意味する。これらの二重特異性抗体は、２つ以上の抗原と結合することができる二重または多重特異的抗体のような、操作されたタンパク質として当業界に公知されており、細胞融合、化学的接合、組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。

従来の二重特異性抗体は、目的とする特異性を有するマウスモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞株の体細胞融合を利用したクワッドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）技術を使用して作製されたが（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ １９８３）、この場合、クワッドローマ細胞株内にて、それぞれ異なる２つの軽鎖が無操作に対を組んで、最大１０種類程の様々な抗体が作製され、この抗体の混合物からたった一つの所望の二重特異性抗体を分離精製することは非常に難しいという短所があった。したがって、正しくない対を形成した副産物および減少された生産収率によって、目的とする二重抗体のみを得るためには、複雑な精製過程が要求された（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ２００７）。

これらの問題を解決するための一つの方法として、軽鎖と重鎖の抗原結合部位断片を、様々な鎖で連結して、単一構造体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）で発現する形態の二重特異性抗体が開発され、これらの形態には、単鎖ダイアボディ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、タンデム（ｔａｎｄｅｍ）一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などの形態が含まれる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ２００５）。また、抗体の重鎖または軽鎖のＮ−末端またはＣ−末端に追加の抗原結合抗体断片を融合したＩｇと類似した形態の二重特異性抗体もまた作製された（非特許文献１）。

しかし、これらの抗体断片の組み合わせに基づく二重特異性抗体は、低安定性に起因する発現量の減少、抗体凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の形成およびこれにより増加された免疫原性の問題が存在している（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ２０１０）。また、抗体断片の組み合わせのみ基づく二重特異性抗体は、抗体の重鎖不変部位（Ｆｃ）が持っていない、Ｆｃと関連して増加される安定性、増加された大きさとＦｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦｃＲｎ）との結合による血清内半減期の増加（ｌｏｎｇ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）、精製過程での結合部位保存（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）の利点、抗体依存性細胞の細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞の細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が不在する問題点がある（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ２０１０）。

したがって、理想的には、自然発生的抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）と構造が非常に類似して、配列において最少の偏差を有する二重特異性抗体の開発が求められている。

この問題を解決するために、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を用いた二重特異性抗体の開発が試めされたが、この技術は、遺伝子操作を介してそれぞれ異なる２つＩｇ重鎖のＣＨ３ドメインに突然変異を誘導して、一つのＩｇ重鎖のＣＨ３ドメインには、ｈｏｌｅ構造を、別のＩｇ重鎖のＣＨ３ドメインには、ｋｎｏｂ構造を作成し、２つのＩｇ重鎖が異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するように誘導するものである（特許文献１、特許文献２）。このとき、ヒトＩｇ重鎖ＣＨ３ドメインとの間の同種二量体形成に寄与する疎水性コアに含まれるアミノ酸残基は、Ｌｅｕ３５１、Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７であり、上記抗体鎖のアミノ酸数字は、ＥＵナンバリングによるものである（非特許文献２）。ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術は、ＣＨ３ドメインの相互作用部位の疎水性コアに位置している残基につき、片方の重鎖ＣＨ３ドメインには、側鎖の大きさが大きい疎水性アミノ酸残基を、側鎖が小さい疎水性アミノ酸に置換してｈｏｌｅ構造にし（Ｔｈｒ３６６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３６８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０７Ｖａｌ）、他方の重鎖ＣＨ３ドメインには、側鎖の大きさが小さい疎水性アミノ酸残基を、側鎖が大きい疎水性アミノ酸に置換してｋｎｏｂ構造を作り（Ｔｈｒ３６６Ｔｒｐ）、２つの突然変異の対、すなわちＣＨ３Ａ（Ｔｈｒ３６６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ３６８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０７Ｖａｌ）とＣＨ３Ｂ（Ｔｈｒ３６６Ｔｒｐ）が導入された重鎖不変部位の突然変異対を共発現したとき、同種二量体重鎖不変部位よりは異種二量体重鎖不変部位の形成が好まれることを報告した（非特許文献３）。しかし、このようなノブ・イントゥ・ホール技術は、異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成収率が約８０％程度と報告されており、（非特許文献３）、これに上記の異種二量体の安定化を誘導するためにファージディスプレイとジスルフィド架橋を導入し、相互作用をさらに増加させた実例がある（非特許文献４）、（特許文献３）。

異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成を増進した他の方法としては、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面に存在する電荷を帯びるアミノ酸に突然変異を誘導して、一方の不変領域のＣＨ３ドメインはすべて正電荷を有する側鎖アミノ酸に、他方の不変領域のＣＨ３ドメインはすべて負電荷を有する側鎖アミノ酸に突然変異を誘導して、静電反発力によって同種二量体形成は阻害され、静電引力により異種二量体の形成を増進させた例がある（非特許文献５、特許文献４）。つまり、片方のＣＨ３ドメインはＬｙｓ３９２Ａｓｐ、Ｌｙｓ４０９Ａｓｐを、他のＣＨ３ドメインにはＧｌｕ３５６Ｌｙｓ、Ａｓｐ３９９Ｌｙｓを置換して、異種二量体の形成を誘導した。上記ＣＨ３ドメイン突然変異体の異種二量体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成収率は約９０％程度である。

異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成を増進した他の方法として、ＣＨ３の相互作用の疎水性コア（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒｅ）部分を構成する部分に疎水性アミノ酸側鎖間同士の大きさの違いによって、相互補完的な突然変異を誘導して、異種二量体の形成を増進した例がある（非特許文献６、特許文献５）。具体的に、一方のＣＨ３ドメインにはＳｅｒ３６４Ｈｉｓ、Ｐｈｅ４９５Ａｌａを、他方のＣＨ３ドメインにはＴｙｒ３４９Ｔｈｒ、Ｔｈｒ３９４Ｐｈｅを誘導して、異種二量体の形成を誘導した。上記ＣＨ３ドメイン突然変異体の異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成収率は、約８０％〜９０％程度である。

しかし、上記開発されたＣＨ３ドメイン変異体の対を含む異種二量体の重鎖不変部位の熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）と発現収率（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｙｉｅｌｄ）は、野生型抗体と比較して低い結果を示している。

したがって、できるだけ高い異種二量体の形成収率を示しながら、野生型と比較して熱力学的安定性と発現収率が近似するか、向上された異種二量体の重鎖不変部位の開発に対する必要性が台頭しているが、未だこれを満たせるような報告はなされていないのが現状である。

米国登録特許 ＵＳ７６９５９３６Ｂ２ 韓国公開特許 第１０−２０１０−００８７３９４号公報 米国登録特許 ＵＳ５７３１１６８Ａ 米国公開特許 ＵＳ２０１０／０２８６３７４Ａ１ 米国公開特許 ＵＳ２０１１／００５４１５１Ａ１

Miller, Meng etal. 2003; Lu, Zhang et al. 2004 Cunningham,Pflumm et al. 1969 Ridgway, Prestaet al. 1996 Atwell, Ridgwayet al. 1997; Merchant, Zhu et al. 1998 Gunasekaran、Pentony et al.2010 Moore, Bautistaet al. 2011

本発明は、上記のように抗体の異種二量体の重鎖不変部位の形成収率を９０％以上と、安定的に増進させる技術を開発するために案出されたものであり、異種二量体の重鎖不変部位の形成収率を増進するために、ＣＨ３ドメインに突然変異が誘導された、ＣＨ３異種二量体及びその作製方法を提供することをその目的とする。

また、本発明の他の目的は、前記ＣＨ３異種二量体を含む異種二量体の重鎖不変部位対と、二重特異性抗体と、融合タンパク質とを提供することである。

また、本発明のまた他の目的は、前記ＣＨ３異種二量体を含む、元野生型抗体の発現、生産収率（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ）および熱力学的安定性（ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）と類似するか、改善された特徴を示す二重特異性抗体または抗体不変部位の融合タンパク質を提供することである。

さらに、本発明のまた他の目的は、前記ＣＨ３異種二量体を含む、元の野生型抗体が持つ重鎖不変部位（Ｆｃ）固有の機能、すなわち、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦｃＲｓ（Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）との結合能が維持され、血清内の長い半減期（ｌｏｎｇ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を持つようになり効果機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を維持しながら、精製過程での結合部位（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）が保存される、抗体または抗体不変部位の融合タンパク質を提供することである。

さらに、本発明のまた他の目的は、ＣＨ３異種二量体を含む、２種の異なる抗原を同時に標的にすることができる二重特異性抗体または抗体不変部位の融合タンパク質を提供することである。

さらに、本発明のまた他の目的は、異種二量体の重鎖不変部位の形成に望ましいＣＨ３ドメイン変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ＣＨ３）対および異種二量体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対（（ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａ）（Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−Ｃｈ３Ｂ））のタンパク質を作製する方法を提供することである。

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で述べた課題に制限されず、言及されていない別の課題は以下の記載から当業者に明確に理解されることである。

本発明は、下記の（ａ）結合を含む、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を提供する。

（ａ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｔｙｒ３４９、Ａｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｓｅｒ３６４、Ｌｙｓ３７０、Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５およびＬｙｓ４０９からなる第１群の位置において、
ｉ）前記第１群のＣＨ３ドメインの位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸と、
ｉｉ）前記第１群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されるアミノ酸との間の結合（ただし、上記の位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。

本発明の一実施例において、前記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、下記の（ｂ）結合をさらに含むことを特徴とする。

（ｂ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｇｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９、Ｔｈｒ３５０、Ｓｅｒ３５４、Ｌｙｓ３６０、Ｓｅｒ３６４、Ａｓｎ３９０、Ｔｈｒ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｖａｌ３９７およびＳｅｒ４００からなる第２群の位置において、
ｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、リシン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）と、
ｉｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上の選択された位置で置換された、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）との間の結合（ただし、上記の位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。

本発明の一実施例において、第１群の位置は、Ｔｙｒ３４９、Ｇｌｕ３５７、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５およびＬｙｓ４０９からなる群より選択されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の他の実施例において、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、
他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９は、バリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されていることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明のまた他の実施例において、一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に置換され、
他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例において、第２群の位置は、Ｇｌｎ３４７またはＬｙｓ３６０であることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例において、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例において、一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はグルタミン酸（Ｅ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例において、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例で、一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されたことを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例で、一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されたことを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を特徴とする。

本発明の別の実施例において、上記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、下記の（ｃ）結合をさらに含むことを特徴とする。

（ｃ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｔｙｒ３４９およびＳｅｒ３５４からなる第３群の位置において、
ｉ）前記第３群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、システイン（Ｃ）と、
ｉｉ）前記第３群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上の選択された位置で置換されたシステイン（Ｃ）との結合（ただし、上記の位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。

本発明に係る抗体の重鎖不変部位のＣＨ３ドメイン異種二量体は、従来の方法とは異なる方法で突然変異を誘導して、同種二量体の形成を最小限に抑えて、異種二量体の形成収率を９０％〜９５％以上の高収率で作製することができ、前記ＣＨ３ドメイン異種二量体を用いて作製された異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対タンパク質は、動物細胞で発現生産時、元の野生型抗体の発現、生産収率および熱力学的安定性が近似するか、改善された特性を持つようになる。

また、本発明に係る抗体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）のＣＨ３ドメイン異種二量体を用いて作製された異種二量体重鎖不変部位対のタンパク質は、元の野生型抗体が有する重鎖不変部位（Ｆｃ）固有の機能、すなわち、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦｃＲｓ（Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）との結合性が維持されて、血清中の長い半減期（ｌｏｎｇ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を持つようになり、精製過程における結合部位（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａとｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）が保存されるという利点がある外、抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）および補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を維持することができる。

また、本発明に係る抗体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）のＣＨ３ドメイン異種二量体を用いて作製された異種二量体重鎖不変部位対タンパク質は、ＣＨ３ドメイン変異体のそれぞれを別々に発現して再合成することなく、一細胞において同時に発現して、高効率で異種二量体不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）を９０％〜９５％程度以上の高収率で生産することができる。

さらに、本発明により作製される異種二量体不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に、抗原特異性の異なる２種の一本鎖抗体断片ｓｃＦｖが融合したｓｃＦｖ−Ｆｃ型、２種のｓｃＦａｂが融合されたｓｃＩｇＧ（ｓｃＦａｂ−Ｆｃ）の形態、抗原結合Ｆｖをなす重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）対の２種を異種二量体重鎖不変部位対のＮ−末端、Ｃ−末端にそれぞれ融合された（Ｆｖ）２−Ｆｃ形態の二重特異性抗体を高効率および高収率で作製することができる。または、ＣＨ３ドメイン変異体対を含む二つの重鎖不変部位（Ｆｃ）からなる典型的なＩｇＧの重鎖Ｃ−末端に可変単一抗原結合ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）をそれぞれ融合した二重特異性可変部位融合モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｆｖ形態の二重特異性抗体を高効率および高収率で作製することができる。または、ＣＨ３ドメイン変異体対を含む２つの重鎖不変部位（Ｆｃ）のＮ−末端またはＣ−末端に、単一抗原に結合する重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）を融合して、単一抗原に一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）で結合することができるＦｖ−Ｆｃ形態の一価抗原結合抗体を高効率および高収率で作製することができる。または、特定のタンパク質と結合することができる細胞膜受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、単一ドメイン抗体、リガンド、毒素などを融合して、１種または２種のタンパク質を特異的に認知することができる抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）などを高効率および高収率で作製することができる。

また、本発明に係る２種の抗原を同時に標的とすることができる二重特異性抗体または抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）は、発症機序が一つのタンパク質によって誘導されるものではなく、いくつかのタンパク質が、重複、迂回、段階的に作用して発生する腫瘍または免疫疾患に関連する２種の抗原を同時に標的とすることができるので、１種の標的タンパク質のみをターゲットにするモノクローナル抗体よりも改善した治療効果を高めることができる。

その上、本発明により作製される単一抗原に結合する重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）を融合して、単一抗原に一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）で結合することができる抗体（Ｆｖ−Ｆｃ）は、二価結合抗体（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍＡｂ）としてターゲットにすることより、一価結合抗体（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍＡｂ）としてターゲットにするとき、より効果的にターゲット抗原を標的とすることができ、ターゲット抗原関連疾患の治療に高い効果が期待できる。

さらに、本発明により作製される特定のタンパク質と結合することができる細胞膜受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、単一ドメイン抗体、リガンド、毒素などを融合して１種または２種のタンパク質を特異的に認知することができる抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）は、既存の同種二量体重鎖不変部位（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）を利用して標的にすることができるターゲットタンパク質を効果的に標的とすることができるので、ターゲットタンパク質関連疾患の治療に高い効果が期待できる。

図１は、一つの抗原に特異的である、自然なＩｇＧ１抗体の構造を図式化したものである。野生型のＩｇＧ１抗体は、同じアミノ酸配列を持つ２つの重鎖と同じ配列を持つ２つの軽鎖の組合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）形態である。２つの重鎖が二量体を達成するにはＣＨ３ドメイン間の相互作用により二量体形成が誘導され、続いてヒンジ領域間のジスルフィド結合が誘導され、強固な鎖間の同種二量体が形成される。重鎖と軽鎖の組み合わせは、重鎖ヒンジ領域の５番目のＣｙｓとｋａｐｐａ軽鎖の場合、１０７番目のＣｙｓ間のジスルフィド結合によって誘導される。 図２は、野生型のＩｇＧ１抗体において、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面を図式化して示したものである。相互作用面の内部には、疎水性結合に関与する残基と静電的相互作用を持つ残基が存在するが、これらの残基はＣＨ３ドメインの二量体形成に寄与する。また、相互作用面には位置するが、隣接する残基との相互作用することなく二量体形成に寄与しないか、または比較的弱い非共有結合で相互作用に関与する残基も存在する。 図３は、ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖構造のＣＨ３ドメイン間の相互作用の面において、突然変異を与えたアミノ酸の側鎖間の相互作用を示したものである。既知のヒト抗体のＦｃ断片構造（ＰＤＢコード：１ＦＣ１（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ１９８１）、１Ｌ６Ｘ（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．２０００）、３ＡＶＥ（Ｍａｔｓｕｍｉｙａ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）をもとにＣＨ３ドメイン間の相互作用面を分析し、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面で突然変異を与えたアミノ酸の側鎖間の相互作用を、３ＡＶＥ構造を基準にして示した。図３（Ａ）は、野生型ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３ドメインにおいて、ＣＨ３ＡドメインではＬｙｓ３６０、Ｌｙｓ４０９アミノ酸の側鎖を示し、ＣＨ３ＢドメインではＧｌｎ３４７、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５アミノ酸の側鎖を示したものである。従来、一方のＣＨ３ドメインのＫ３６０アミノ酸は、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７アミノ酸と隣接しているが、ＣＨ３ドメインが二量体を形成させるために寄与する相互作用は存在しない。また、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９と他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９は静電引力によりＣＨ３ドメイン二量体を形成するために大きく寄与をしているアミノ酸残基である。図３（Ｂ）は、ＣＨ３ドメイン突然変異体のＣＨ３ドメインの構造をモデリングにより予測して示したものである。一方のＣＨ３ドメインにおいてＬｙｓ３６０Ｇｌｕ、Ｌｙｓ４０９Ｔｒｐ突然変異が導入され、他方のＣＨ３ドメインにおいてＧｌｎ３４７Ａｒｇ、Ａｓｐ３９９Ｖａｌ、Ｐｈｅ４０５Ｔｈｒ突然変異が導入された。したがって、既存のＬｙｓ３６０とＧｌｎ３４７はＬｙｓ３６０ＧｌｕとＧｌｎ３４７Ａｒｇに置換されることにより、たがいに相互作用がなかった残基の間で選択的な静電的結合が生成された。このような突然変異戦略は、ＣＨ３ドメインの異種二量体を選択的に形成するために寄与することができる。また、Ｌｙｓ４０９Ｔｒｐと他方ＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９Ｖａｌ、Ｐｈｅ４０５Ｔｈｒ突然変異が導入され、既存の静電結合の代わりに相互補完的な疎水性結合を誘導した。これは、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂのような同種二量体の形成は阻害し、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の形成を誘導する突然変異戦略である。 図４は、突然変異戦略のうち、ＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ４０９、ＣＨ３ＢドメインのＡｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５残基間の相互作用について示している。野生型ＣＨ３ドメインの相互作用面において、一方のドメインのＬｙｓ４０９は他方のドメインのＡｓｐ３９９残基と静電結合することで、ドメイン間の二量体形成に寄与しており、したがって、一方のＣＨ３ドメインにＬｙｓ４０９Ｔｒｐと、他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９Ｖａｌ、Ｐｈｅ４０５Ｔｈｒ突然変異とを導入して、既存の静電結合の代わりに相互補完的な疎水性結合を異種二量体の間にのみ誘導することができる突然変異を誘導した。これは、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂのような同種二量体形成は阻害し、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の形成を誘導する突然変異戦略である。 図５は、突然変異戦略のうち、ＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ３６０ＧｌｕとＣＨ３ＢドメインのＧｌｎ３４７Ａｒｇ突然変異との相互作用について示したものである。突然変異残基は、野生型では隣接しているが、従来ＣＨ３ドメインが二量体を形成するために寄与する相互作用は存在しない。ここで、長距離静電的結合を異種二量体の間にのみ誘導することができる突然変異であるＬｙｓ３６０ＧｌｕとＧｌｎ３４７Ａｒｇ突然変異を誘導した。これは、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂのような同種二量体形成は阻害し、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の形成を誘導する突然変異戦略である。 図６は、突然変異戦略のうち、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｎ３４７Ｅ突然変異と、ＣＨ３ＢドメインのＬｙｓ３６０残基との間の相互作用について示したものである。これらの残基は、ＣＨ３ドメインの相互作用面において、図５に示すＬｙｓ３６０Ｇｌｕ−Ｇｌｎ３４７Ａｒｇ相互作用部位と対称の部位に位置する。上記のＬｙｓ３６０Ｇｌｕ−Ｇｌｎ３４７Ａｒｇ相互作用部位と同様に、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｎ３４７とＣＨ３ＢドメインのＬｙｓ３６０残基とは、野生型では隣接しているが、従来ＣＨ３ドメインが二量体を形成するのに寄与する相互作用は存在しない。ここでＧｌｎ３４７Ｇｌｕ突然変異を導入し、他方のＣＨ３ドメインに存在するＬｙｓ３６０残基と選択的な静電結合を誘導した。これはＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂのような同種二量体形成は阻害し、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の形成を誘導する突然変異戦略である。 図７は、突然変異戦略のうち、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｕ３５７と、ＣＨ３ＢドメインのＴｙｒ３４９、Ｌｙｓ３７０残基との間の相互作用について示している。野生型ＣＨ３ドメインの相互作用面において、一方のドメインのＧｌｕ３５７は他方のドメインのＬｙｓ３７０残基と静電結合することで、ドメイン間の二量体形成に寄与しており、他方のドメインのＴｙｒ３４９残基とも隣接している。したがって、一方のＣＨ３ドメインに、Ｇｌｕ３５７Ｔｒｐと、他方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９Ｓｅｒ突然変異とを導入して、既存のＧｌｕ３５７とＬｙｓ３７０との静電結合の代わりに、相互補完的な疎水性結合を異種二量体の間にのみ誘導することができる突然変異を誘導した。これは、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂのような同種二量体形成は阻害し、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の形成を誘導する突然変異戦略である。 図８は、本発明に係る突然変異が導入されたＣＨ３ドメイン変異体対（ＣＨ３ＡとＣＨ３Ｂ）が、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３ＡまたはＣＨ３Ｂ：ＣＨ３Ｂの相互作用による重鎖不変部位同種二量体の生成は排除され、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの相互作用による異種二量体重鎖不変部位の形成を誘導することを図式化して示すものである。 図９は、本発明に係る異種二量体形成ＣＨ３突然変異体対（ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ）を、抗体重鎖不変部位ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２ドメインのＣ−末端に連結して生成される異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）を用いて作製することができる二重特異性抗体およびＦｃ−融合タンパク質を図式化したものである。異種二量体重鎖不変部位に、抗原結合特異性が異なる２種の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を各アミノ末端（Ｎ−末端）に融合した二重特異性の一本鎖抗体免疫グロブリン断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、抗原結合特異性の異なる２種の単鎖抗原結合断片（Ｆａｂ）を各アミノ末端（Ｎ−末端）に融合した二重特異性の単鎖免疫グロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ）、互いに異なる抗原を認知する抗体から由来の重鎖および軽鎖の可変単一抗原結合ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）の２種をそれぞれ重鎖不変部位Ｎ−末端、Ｃ−末端に対として融合した二重特異性の可変部位融合免疫グロブリン（Ｆｖ）２−Ｆｃ、典型的なＩｇＧの重鎖Ｃ−末端に可変単一抗原結合ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）をそれぞれ融合した二重特異性の可変部位融合モノクローナル抗体ｍＡｂ−Ｆｖ、１種の抗原を認知する抗体に由来した重鎖および軽鎖の可変単一抗原結合ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を重鎖不変部位Ｎ−末端に融合した一価抗原結合の可変部位融合免疫グロブリン（Ｆｖ−Ｆｃ）、およびリガンドを特異的に認知する細胞膜タンパク質外部ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、ペプチド、１種の抗原を認知する単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ペプチド、リガンドタンパク質、毒素タンパク質などの２種をそれぞれ重鎖不変部位Ｎ−末端に融合した抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）を作製することができる。 図１０は、ヒト抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびマウス抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３のＣＨ３ドメインの配列を比較したものである。濃く強調したＧｌｎ３４７、Ｌｙｓ３６０、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５、Ｌｙｓ４０９残基らが、突然変異が導入された残基である。突然変異が導入された残基は、ヒト抗体およびマウス抗体ＩｇＧのサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）に関係なく、ほぼ類似した残基として保存されていることが確認できる。したがって、本発明において異種二量体ＣＨ３突然変異対の形成のために誘導される突然変異は、ヒト抗体ＩｇＧ１に限定されないことが分かる。 図１１は、本発明において、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位において、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異対を図式化したものである。 図１２ａは、本発明において、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位で、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異対のＥ−Ｒ突然変異体対を示すものである。 図１２ｂは、本発明において、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位で、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異対のＷ−ＶＴ突然変異対を示すものである。 図１２ｃは、野生型の対を示すものである。 図１２ｄは、本発明において、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位で、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異対のＥＷ−ＲＶＴ突然変異対を示すものである。 図１２ｅは、本発明で実装して、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位で、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異対のＥＥＷ−ＲＶＴ突然変異対を示すものである。 図１２ｆは、本発明で実装して、発現精製を行った異種二量体重鎖不変部位で、その形成収率を比較した５つのＣＨ３突然変異体対のＳＷ−ＷＶＴ突然変異対を示すものである。 図１３は、作製されたＣＨ３突然変異対によって抗体重鎖不変部位の異種二量体の形成収率を評価するために構築された、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）が融合されたｓｃＦｖ−Ｆｃを動物細胞の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングするために構築した図式図及びベクターマップ（ｍａｐ）である。 図１４は、作製されたＣＨ３突然変異対によって抗体重鎖不変部位の異種二量体の形成収率を評価するために構築された単独Ｆｃ（ｄｕｍｍｙ Ｆｃ）を動物細胞の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングするために構築した図式図及びベクターマップ（ｍａｐ）である。 図１５は、図１３及び図１４で構築されたｓｃＦｖ−Ｆｃおよび単独Ｆｃ動物細胞発現ベクターを動物細胞においてコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して発現すると、同種二量体と異種二量体が互いに異なるサイズの抗体として発現されるので、大きさおよび組み合わせ形態の分析によりＣＨ３突然変異体対による異種二量体の生成収率の評価ができることを説明した図である。 図１６は、図１３及び図１４で製作したＣＨ３突然変異対を、図１５に記載の異種二量体の形成能の評価のために、動物細胞発現ベクターに導入した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換により一時的に発現および精製した後、異種二量体抗体の形成能を評価するために、非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で大きさおよび組み合わせ形態を分析した結果である。この時、陰性対照群として野生型ＣＨ３が使用された抗体を、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を用いており、分析に使用されたタンパク質の量は、それぞれ１０μｇである。 図１７は、図１３及び図１４で作製したＣＨ３突然変異対をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換により一時的に発現した後、精製された異種二量体抗体を、ヒトＦｃ部分を特異的に認知する抗体を用いて、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）により大きさおよび組み合わせ形態を分析した結果である。この時、陰性対照群として野生型ＣＨ３が用いられた抗体を用い、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を用いて、非還元条件下において行った結果であり、分析に用いたタンパク質の量は０．１μｇである。 図１８は、図１３及び図１４で製作したＣＨ３突然変異対をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換により一時的に発現した後、精製された異種二量体抗体を、ヒトＦｃ部分を特異的に認知する抗体を用いて、ウェスタンブロットにより大きさ及び組み合わせ形態を分析した結果である。この時、陰性対照群として野生型ＣＨ３が用いられた抗体を用い、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を用いて、還元条件において行った結果であり、分析に用いたタンパク質の量は０．１μｇである。 図１９は、図１３及び図１４で製作したＣＨ３突然変異対を、図１５に記載の異種二量体の形成能の評価のために、動物細胞発現ベクターに導入した後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換により一時的に発現および精製した後、異種二量体抗体の形成能を評価するために、非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で大きさおよび組み合わせ形態を分析した結果である。この時、陰性対照群として野生型ＣＨ３が使用された抗体を、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を用いており、分析に使用されたタンパク質の量は、それぞれ１０μｇである。 図２０は、突然変異体のＣＨ３ドメインが導入されたＦｃ二量体タンパク質の二次構造が、野生型の形態と同様に保存されているかどうかを確認するために、野生型と突然変異体ＥＷ−ＲＶＴ、陽性対照群ノブ・イントゥ・ホールＦｃ二量体を図１３で構築された形で発現した後、円二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を測定した結果である。その結果、ＣＨ３突然変異体に導入されたＦｃ二量体は、野生型のＦｃ二量体と同じ円二色性を有することにより、タンパク質の二次構造が変形することなくそのまま維持されることを確認した。 図２１は、突然変異体のＣＨ３ドメインが導入されたＦｃ二重体ＦｃＲｎに対する結合能が保存されているかどうかを確認するために突然変異体ＥＷ−ＲＶＴを図１４に記載の異種二量体の形態で発現した後、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った結果である。突然変異ＣＨ３ドメインを含む抗体は、野生型ＣＨ３ドメインを含む抗体と同様、ＦｃＲｎに対する結合能をそのまま保持していることを確認した。この時、陽性対照群として、ヒト抗体ＩｇＧ１を含む抗体であるＲｅｍｉｃａｄｅ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。 図２２の（Ａ）は、本発明で製作したＣＨ３突然変異対がｓｃＦｖ−Ｆｃの形で導入された二重特異性抗体を図式化した図である。標的抗原ＤＲ４に特異的に結合するヒト化ｈＡＹ４ａ ｓｃＦｖ抗体と（Ｌｅｅ、 Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）、標的抗原ＤＲ５に特異的に結合するヒトＨＷ１ ｓｃＦｖ抗体（Ｐａｒｋ、 Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７）の親和性の向上したＡＵ５Ｈ ｓｃＦｖ抗体を、ＣＨ３ドメイン変異体が使用されたＦｃのＮ−末端に融合して、ｓｃＦｖ−Ｆｃ形態のＤＲ４×ＤＲ５二重特異性抗体を構築した。図２２の（Ｂ）は、二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を発現するベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換して、一時的に導入して発現、精製したものを非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。構築したＣＨ３ドメイン突然変異体対ＥＷ−ＲＶＴを重鎖に導入し、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を利用して構築した。図２２の（Ｃ）は、発現精製された二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の自然（ｎａｔｉｖｅ）状態での大きさを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィを行った結果である。対照群と同様、期待される１０３ｋＤ大きさのタンパク質のみが検出されたことを確認した。 図２３の（Ａ）は、本発明で製作したＣＨ３突然変異対がｓｃＦａｂ−Ｆｃ（ｓｃＩｇＧ）の形態で導入された二重特異性抗体を図式化した図である。使用した親抗体は、図２０のｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の二重抗体で使用したものと同じヒト化ｈＡＹ４ａ抗体とＡＵ５Ｈ抗体であり、ＶＨ−ＣＨドメインとＶＬ−ＣＬドメインを２６個のアミノ酸鎖リンカーで連結した形態の単鎖化Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）をＦｃ部分のＮ−末端に融合してｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態のＤＲ４×ＤＲ５二重特異性抗体を構築した。図２３の（Ｂ）は、二重特異性ｓｃＦａｂ−Ｆｃ抗体を発現するベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共形質転換して、一時的に導入して発現、精製したものを非還元性条件と還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。構築したＣＨ３ドメイン突然変異対ＥＷ−ＲＶＴを重鎖に導入し、陽性対照群としてノブ・イントゥ・ホール二重特異性抗体を利用して構築した。対照群と同様、目的とした二重抗体が主に生成されたことを確認することができる。図２３の（Ｃ）は、図２０で精製されたＤＲ４×ＤＲ５二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体および図２１におけるＤＲ４×ＤＲ５二重特異性ｓｃＦａｂ−Ｆｃ抗体の、ＤＲ４およびＤＲ５抗原に対する結合能および特異性を確認するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。その結果、作製された二重抗体が抗原であるＤＲ４とＤＲ５に特異性を持つことが確認され、この時、ＤＲ４およびＤＲ５の類似抗原としては、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２を対照抗原として用いた。 図２４は、図２０で精製されたＤＲ４×ＤＲ５二重特異性ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体および図２１におけるＤＲ４×ＤＲ５二重特異性ｓｃＦａｂ−Ｆｃ抗体のガン細胞死滅能を確認するために、ＨＣＴ１１６とＨｅＬａ細胞株において細胞毒性試験（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）を行った結果である。作製した２つの形態の二重抗体は、親抗体であるｈＡＹ４ ＩｇＧとＡＵ５Ｈ ｓｃＦｖと比較して、細胞毒性がより増加して、陽性対照群として用いたＴＲＡＩＬと細胞毒性が似ているか、もう少し優れていることが分かった。

自然状態での抗体の重鎖は、同種二量体として存在する。この時、重鎖間二量体の形成は、重鎖不変領域のＣＨ３−ＣＨ３ドメイン間の非共有結合相互作用によって二重体生成されｈｉｎｇｅ領域のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）によって安定化される（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｖａｃｉｎｉ２０１０）（図１参照）。重鎖不変部位のＣＨ３ドメイン間二量体の生成は、一方の重鎖のベータ−シート（ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ）残基が、他方のベータ−シート（ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ）残基の側鎖の間に非共有結合することにより行われ、これにより、熱力学的に安定した同種二量体が形成される（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｖａｃｉｎｉ２０１０）。

ＩｇＧ抗体の重鎖不変部位の同種二量体を形成させるＣＨ３ドメイン間の相互作用分析は、Ｘ−ｒａｙ結晶構造を見て分析したが、用いられた構造は、ＰＤＢ ｃｏｄｅ＝１ＦＣ１、１Ｌ６Ｘおよび３ＡＶＥである。

ＣＨ３ドメイン間相互作用面の残基を分析した結果、相互作用面の内部には、疎水性結合により、同種二量体の形成に最も大きく寄与する疎水性結合コア構造が存在するが、これはＬｅｕ３５１、Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、Ｔｙｒ４０７残基である。また、相互作用面上において、静電相互作用でＣＨ３ドメイン間の二量体形成に寄与するＡｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｌｙｓ３７０、Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９、Ｌｙｓ４０９、Ｌｙｓ４３９残基が存在する。特に、一方の重鎖のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９残基と他方の重鎖のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９残基との間の静電相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）と、一方の重鎖のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７残基と他方の重鎖のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３７０残基間の静電相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）はＣＨ３ドメイン間の内部に存在しながら、静電気的引力による同種二量体の形成増進に寄与する。

また、相互作用面には存在するが、隣接するアミノ酸残基と疎水性結合や静電結合のようなＣＨ３ドメイン間の二量体形成の増進に大きく寄与する相互作用が存在しない残基であるＧｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９、Ｔｈｒ３５０、Ｓｅｒ３５４、Ｌｙｓ３６０、Ｓｅｒ３６４、Ａｓｎ３９０、Ｔｈｒ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｖａｌ３９７、４００Ｓが存在する（図２参照）。これらの残基の一部は、比較的弱い非共有結合でドメイン間の相互作用に寄与する。

このとき、上記用語「非共有結合（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」は、原子または分子が共有結合以外の相互作用によって集合体を形成する際に結合力が弱い相互作用を意味するもので、静電結合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）、疎水性結合（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、水素結合（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ）、ファンデルワールス結合（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）による相互作用を含む。

上記用語「静電結合（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）」は、反対電荷を有するイオン間の電気的引力に依存する結合を意味し、上記用語「疎水性結合（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」は、極性溶媒との相互作用を避けて、熱力学的に安定化するための疎水性分子の傾向による結合を意味し、上記用語「水素結合（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄｉｎｇ）」は、水素とフッ素、酸素、窒素が会って生じた極性共有結合分子間に生じる双極子−双極子間の相互作用を意味する。また、上記用語「ファンデルワールス結合（Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」は、Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｗａａｌｓ力によって分子に極性が生じて相互間に引力と斥力の作用で行われる結合を意味する。

また、上記用語「同種二量体」は、同じアミノ酸配列を有する抗体ドメインまたはこれを含む抗体の一部または全体の二量体を意味し、具体的には抗体の重鎖不変部位のＣＨ３ドメイン間の二量体またはこの同じＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖不変部位二量体のことを意味する。

また、上記用語「同種二量体重鎖不変部位（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）」は、同じアミノ酸配列を持つ重鎖不変部位（ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）間の二量体を意味する。

本発明では、ＣＨ３ドメイン間の相互作用に寄与するアミノ酸残基を変形して、一方の重鎖のＣＨ３ドメインである「ＣＨ３Ａ」、他方の重鎖のＣＨ３ドメインである「ＣＨ３Ｂ」が非共有結合により、互に選択的に相互作用ができる対（ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ）の形成を誘導することにより、ＣＨ３突然変異体対がヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２のＣ−末端に融合された重鎖不変部位対、つまり、ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａおよびｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ｂの間に異種二量体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）が形成される収率を向上させようと努力した結果、本発明を完成した。

ここで、前記用語「異種二量体」は、アミノ酸配列が互いに異なる２種の抗体ドメインまたはこれを含む抗体の一部または全体からなる二量体を意味し、具体的には抗体の重鎖不変部位の配列が他のＣＨ３ドメイン対の二量体または配列が異なるＣＨ３ドメイン対を含む抗体の一部または全体からなる二量体を意味する。

また、上記用語「異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）」は、アミノ酸配列が異なるＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂをそれぞれ含む重鎖不変部位（ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）間の二量体を意味する。

また、上記用語「異種二量体重鎖不変部位の形成収率」は、ＣＨ３ドメイン突然変異体対を含む重鎖不変部位対をＨＥＫ２９３Ｆ動物細胞に同時に形質転換して発現し精製した時、全重鎖不変部位二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ、ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）またはモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）の合計から、異種二量体に形成された重鎖不変部位の割合をパーセントで表したものを意味する。

本発明は、下記の（ａ）結合を含む、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体を提供する。

（ａ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｔｙｒ３４９、Ａｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｓｅｒ３６４、Ｌｙｓ３７０、Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５およびＬｙｓ４０９からなる第１群の位置において、
ｉ）前記第１群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸と、
ｉｉ）前記第１群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されるアミノ酸との間の結合（ただし、上記位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）。

前記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、下記の（ｂ）結合をさらに含むことができる。

（ｂ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｇｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９、Ｔｈｒ３５０、Ｓｅｒ３５４、Ｌｙｓ３６０、Ｓｅｒ３６４、Ａｓｎ３９０、Ｔｈｒ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｖａｌ３９７およびＳｅｒ４００からなる第２群の位置において、
ｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、リシン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）と、
ｉｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置の１種以上選択された位置において置換された、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）との間の結合（ただし、上記の位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘに従う）。

前記第１群の位置は、Ｔｙｒ３４９、Ｇｌｕ３５７、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５およびＬｙｓ４０９からなる群より選択されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されていることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、前記第２群の位置は、Ｇｌｎ３４７またはＬｙｓ３６０であることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はグルタミン酸（Ｅ）に置換されていることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換されて、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に、Ｌｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に、Ａｓｐ３９９はバリン（Ｖ）に、Ｐｈｅ４０５はスレオニン（Ｔ）に置換されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

また、本発明の上記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、下記の（ｃ）結合をさらに含んでもよい。

（ｃ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｔｙｒ３４９およびＳｅｒ３５４からなる第３群の位置において、
ｉ）前記第３群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置にて置換された、システイン（Ｃ）と、
ｉｉ）前記第３群のＣＨ３ドメイン位置の１種以上選択された位置において置換されたシステイン（Ｃ）との結合。

また、前記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選択された免疫グロブリンのＦｃ部分に含まれることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されなく、前記ＩｇＧはヒトＩｇＧであることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されなく、前記ヒトＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択されることを特徴とする、抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体が好ましいが、これに限定されない。

本発明の一実施例において、異種のＣＨ３ドメインであるＣＨ３ＡとＣＨ３Ｂに誘導される突然変異対は、従来の戦略とは異なる方法により、異種二量体の形成収率が増進され、安定化した異種二量体の重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）が形成されるようにするために、ＣＨ３ドメイン変異体対を考案した。

具体的に、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面の内部に位置して外部に露出されないアミノ酸残基のうち、ＣＨ３ドメイン間の二量体形成に寄与度の高い疎水性コアをそのまま保ちながら、相互作用面の内部に存在し、静電相互作用でＣＨ３ドメイン間の同種二量体形成に寄与するアミノ酸残基Ａｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｌｙｓ３７０、Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９、Ｌｙｓ４０９残基に突然変異を誘導して、一方の重鎖の相互作用面の疎水性残基が他方の重鎖の相互作用面の疎水性残基の間に挿入されるように、空間補完的な疎水性結合突然変異を有する突然変異体対を作製した。このようなアプローチは、既存のＣＨ３ドメイン間の同種二量体の形成に寄与する相互作用を除去し、異種二量体においてのみ疎水性引力形成を誘導することができる相互作用に置換することで、より高い異種二量体の形成能の増進を期待することができる。また、このようなアプローチは、野生型ＣＨ３ドメインの相互作用疎水性コアのアミノ酸残基を最大限に保存したものであって、これにより生成される異種二量体の安定性を向上させることができるだけでなく、既存の疎水性コアの部分に選択的な疎水性結合が形成されて異種二量体抗体を作製したノブ・イントゥ・ホール技術とは（Ｒｉｄｇｗａｙ、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）差別化した戦略である。

また、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面に存在するが隣接するアミノ酸残基と疎水性結合や静電結合をするような、ＣＨ３ドメイン間の二量体形成の増進には大きく寄与しない残基である、Ｇｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９、Ｔｈｒ３５０、Ｓｅｒ３５４、Ｌｙｓ３６０、Ｓｅｒ３６４、Ａｓｎ３９０、Ｔｈｒ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｖａｌ３９７、Ｓｅｒ４００残基に、一方の重鎖のアミノ酸残基の電荷と他方の重鎖の残基の電荷とを相反するように持つ選択的な静電結合突然変異体対を誘導した。これにより、同種ＣＨ３ドメイン間では相互作用が排除され、異種二量体の形成を増加させることができる長距離静電結合が選択的に形成されるように誘導した。このようなアプローチ方法は、アミノ酸残基が互いに向き合う他方のＣＨ３ドメインの残基と、比較的遠い距離においても相互作用ができるように静電的引力を導入することにより、新たな相互作用を付与したものであり、これは選択的な異種二量体の形成に寄与することになる。

また、上記のようなアプローチにおいて、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面の内部に位置する疎水性コアの部分を維持した異種二量体ＣＨ３ドメイン変異体対は、野生型に類似の熱力学的安定性、免疫原性、動物細胞における発現生産性を維持することができる。

また、従来のＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が結合する部位であるＴｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｈｉｓ３１０、Ｇｌｕ３８０、Ｍｅｔ４２８、Ｈｉｓ４３３、Ａｓｎ４３４、Ｈｉｓ４３５、Ｔｙｒ４３６と、ＦｃｇＲ（ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）結合部位であるＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７は維持して、抗体重鎖とＦｃＲｎまたはＦｃｇＲの結合による血清内半減期の増進（ｌｏｎｇ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）、抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）および補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などの抗体の固有活性を維持することができる（Ｗｉｎｅｓ、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０００； Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ ２００７）。

また、本発明の他の一実施例において、考案されたＣＨ３ドメイン変異体の異種二量体の形成能を評価することができるシステムを構築した。具体的には、上記システムは、それぞれのＣＨ３ドメイン変異体対が含まれる抗体の重鎖不変部位が融合された抗体を動物細胞において発現精製し、この時、突然変異体対でＣＨ３Ａドメインが含まれている一方の重鎖不変部位にのみ一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を融合して発現されるようにして、ＣＨ３Ｂドメインが含まれている重鎖不変部位は抗体断片の融合することなく単独で発現されるようにした。これにより、ＣＨ３Ａドメインが含まれている重鎖は、ＣＨ３Ｂドメインが含まれている重鎖に比べて大きな分子量を持つようになり、これにより異種二量体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ：Ｆｃ）と同種二量体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ：Ｆｃ）が非還元性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で互いに異なる移動速度を持つようになり発現精製された抗体中の異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の量を相対的に比較することができる（図１５参照）。

また、本発明の別の一実施例では、上記構築された異種二量体の形成能評価システムで、本発明に係るＣＨ３ドメイン変異体対を含む抗体の場合、その形成収率が約９０％〜９５％で、既存のノブ・イントゥ・ホール技術を利用した異種二量体形成収率に比べて、大幅に高いことを確認した（図１６および１７を参照）。

また、本発明は、上記ＣＨ３ドメインの異種二量体を含む異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対と、前記ＣＨ３ドメインの異種二量体を含む二重特異性抗体を提供する。

上記二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＩｇＧ（ｓｃＦａｂ−Ｆｃ）、（Ｆｖ）２−Ｆｃ、ｍＡｂ−ＦｖおよびＦｖ−Ｆｃからなる群より選択されたいずれかの形態であることが好ましいが、これに限定されず、上記融合タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ型であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明に係る抗体の重鎖不変部位ＣＨ３ドメインに突然変異が誘導されたＣＨ３異種二量体は、異種二量体重鎖不変部位対タンパク質を構成することができ、上記異種二量体重鎖不変部位対のタンパク質は、抗原特異性の異なる抗体を重鎖可変部位（ＶＨ）、軽鎖可変部位（ＶＬ）、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）または一本鎖抗体断片（ｓｃＦａｂ）の形で融合して二つの異なる抗原に同時に結合することができる二重特異性抗体および典型的なＩｇＧの重鎖Ｃ−末端に可変単一抗原結合ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）をそれぞれ融合した二重特異性可変部位融合モノクローナル抗体（ｍＡｂ−Ｆｖ）の様々な形態の二重特異性抗体、または単一抗原に結合する重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）を融合して、単一抗原に一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）で結合することができる抗体（Ｆｖ−Ｆｃ）、特定のタンパク質と結合することができる細胞膜受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、単一ドメイン抗体、リガンド、毒素などを融合して、１種または２種のタンパク質を特異的に認知することができる抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）の形態であってもよい。

具体的には、本発明の一実施例では、本発明に係るＣＨ３ドメイン変異体対を使用して、ｓｃＦｖ形態およびｓｃＦａｂ形態の抗−ＤＲ４×ＤＲ５二重特異性抗体を作製し、上記二重特異性抗体が、それぞれ標的分子ＤＲ４およびＤＲ５に対する特異性を有することを確認し（図２２および２３を参照）、これにより、本発明のＣＨ３ドメイン変異体対を用いて作製された二重特異性抗体は、抗原結合部位の結合能をそのまま保持することが分かった。

このとき、上記用語「一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）」は、１つのＶＨと１つのＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｌ）を使用して接続したＶＨ−Ｌ−ＶＬ〜ＶＬ−Ｌ−ＶＨポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片を意味する。

また、上記用語一本鎖抗体断片（ｓｃＦａｂ）は、１つのＶＨからＣＨ１まで発現された重鎖断片と、１つのＶＬとＣＬ部分が含まれている軽鎖に３４残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｌ）を使用して接続したＶＬ−ＣＬ−Ｌ−ＶＨ−ＣＨ１〜ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ−ＶＬ−ＣＬポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片を意味する。

また、Ｆｖは、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片を意味し、本発明で使用された前記用語「Ｆｖ−Ｆｃ」は、単一抗原に結合する重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）を異種二量体重鎖不変部位対タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に融合して、単一抗原に一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態で結合することができる抗体を意味する。

また、本発明で使用された上記用語「ｍＡｂ−Ｆｖ」は、典型的な形のＩｇＧ重鎖Ｃ−末端に重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）がそれぞれ融合して、抗原に三価（ｔｒｉｖａｌｅｎｔ）形態で結合することができる抗体、またはｍＡｂ抗原に二価で、Ｆｖ抗原に一価で結合することができる二重特異性抗体を意味する。

また、本発明で使用された前記用語「抗体不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）」は、本発明に係る異種二量体重鎖不変部位対タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に特定のタンパク質と結合することができる細胞膜受容体の細胞外ドメイン、ペプチド、単一ドメイン抗体、リガンド、毒素などが融合して、１種または２種のタンパク質を特異的に認知することができる融合タンパク質を意味する。

さらに、本発明は、前記異種二量体重鎖不変部位対タンパク質を含む、二重特異性抗体または融合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。

本発明によって作製された二重特異性抗体または融合タンパク質は、腫瘍または自己免疫疾患に関連する抗原またはタンパク質を特異的に標的とすることができるので、上記の疾患を治療または予防することができる薬学的組成物に有効に用いられる。

この時、本発明によって作製された二重特異性抗体または融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一つのタンパク質によって発症機序が誘導されるのではなく、様々なタンパク質が重複的、迂回的、段階的に作用して、発生する腫瘍または自己免疫疾患に関連する２種の抗原を同時に標的とすることができるので、１種のターゲットタンパク質のみを標的とするモノクローナル抗体を含む薬学的組成物に比べて疾患の治療効果を高めることができる。

具体的には、本発明の一実施例では、本発明で作製された抗−ＤＲ４×ＤＲ５ ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂ−Ｆｃ二重特異性抗体のガン細胞死滅能を確認するために、ヒト由来ガン細胞であるＨＣＴ１１６（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）とＨｅＬａ（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株にて細胞毒性試験（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）を行っており、上記二つの形態の二重特異性抗体は、親抗体であるヒト化抗体ｈＡＹ４ａ ＩｇＧと、ヒト抗体ＡＵ５Ｈ−ｓｃＦｖとに比べて、ガン細胞の死滅能が増加し、陽性対照群として用いたＴＲＡＩＬに比べて、細胞毒性が似ているか、少し優れていることが確認できた（図２４参照）。

本発明で使用される用語、「治療」とは、本発明の組成物の投与によって疾患による症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明による前記薬学的組成物を製剤化する場合、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、これらの固形製剤は、一以上の本発明に示される化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトースもしくはゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤またはシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。

非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが用いられる。

本発明の組成物は、所望の方法に応じて、経口投与するか、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態や体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路、および時間に応じて異なるが、当業者によって適切に選択することができる。

本発明による組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比を以て疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与時間、投与経路、および排出率、治療期間、同時使用される薬剤を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、個々の治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与することができ、単一または複数投与することができる。上記の要素をすべて考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定することができる。

具体的には、本発明に係る化合物の有効量は、患者の年齢、性別、体重に応じて異なる場合があり、一般的には体重１Ｋｇあたり１０ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇを毎日または隔日投与するか、１日１回〜３回に分けて投与することができる。しかし投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されることがあるので、上記投与量は如何なる方法によっても、本発明の範囲を限定するものではない。

また、本発明は、下記の段階を含むＣＨ３ドメイン変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対の作製方法を提供する。

（ａ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｔｙｒ３４９、Ａｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｓｅｒ３６４、Ｌｙｓ３７０、Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５およびＬｙｓ４０９からなる第１群の位置において、
ｉ）前記第１群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置を、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択されるアミノ酸に置換し、
ｉｉ）前記第１群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置を、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されるアミノ酸に置換して突然変異対を作製する段階と、
（ｂ）ＣＨ３ドメインのうち、位置Ｇｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９、Ｔｈｒ３５０、Ｓｅｒ３５４、Ｌｙｓ３６０、Ｓｅｒ３６４、Ａｓｎ３９０、Ｔｈｒ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｖａｌ３９７およびＳｅｒ４００からなる第２群の位置において、
ｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置のうち１種以上選択された位置を、リシン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）に置換し、
ｉｉ）前記第２群のＣＨ３ドメイン位置の１種以上選択された位置を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に置換して突然変異対を作製する段階と、
（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）の突然変異対を結合する段階。

また、本発明は、
（ｄ）上記において作製されたＣＨ３ドメイン変異体対が、抗体重鎖不変部位の野生型ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２ドメインのＣ−末端に融合された形態の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を含む、組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質の発現ベクターを作製する段階と、
（ｅ）前記作製された発現ベクターを細胞に共形質転換して、組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質を発現する段階と、
（ｆ）前記共発現された組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質を精製および回収する段階と、を含む、
異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対（（ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａ） （ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ｂ））タンパク質の作製方法を提供する。

（実施例）
以下、本発明の理解を促すために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるのみのものであり、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

＜実施例１＞
抗体重鎖不変部位の異種二量体形成能を増進するためのＣＨ３ドメイン変異体の考案
ヒト抗体ＩｇＧ１の重鎖不変部位（Ｆｃ）の異種二量体を形成するためのＣＨ３ドメイン突然変異体の誘導のために、上述のように、まずＣＨ３ドメイン間の相互作用に主に作用する非共有結合対のアミノ酸残基を分析し、それに基づいてＣＨ３ドメイン間同種二量体形成は排除され、異種二量体の形成が熱力学的に望ましい突然変異対を考案した。つまり、ＣＨ３ドメイン間の相互作用に寄与するアミノ酸残基の変形により一方の重鎖のＣＨ３ドメインである「ＣＨ３Ａ」と、他方の重鎖のＣＨ３ドメインである「ＣＨ３Ｂ」が、互いに選択的な相互作用が増進され得る、非共有結合を生成するためのアミノ酸残基置換をＣＨ３Ａ、ＣＨ３Ｂに誘導して、異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）であるＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ形成を誘導しようとした。

この時、異種のＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに誘導される突然変異対は、既存の文献や特許に開示された重鎖不変部位異種二量体の形成を増進させるための突然変異対とは異なる戦略で、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ形成が高収率で形成されるようにし、安定して維持するように考案した。また、突然変異アミノ酸残基は、潜在的な免疫原性を最小化するためにＣＨ３ドメイン間の相互作用面に存在する残基に限定し、ＦｃＲｎおよびＦｃＲｓ結合部位残基の突然変異も排除して、抗体重鎖不変部位の固有機能を維持させようとした（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ ａｎｄ Ａｋｉｌｅｓｈ ２００７）。また、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに最小限の突然変異対とそれらの組み合わせで構成されたＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに生成される異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）の形成収率を評価し、最も高い異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）形成収率を示すＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ突然変異体対を開発しようとした。

そのために、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面に位置するアミノ酸残基のうち、
１）ＣＨ３ドメインの相互作用内部の静電結合によりＣＨ３ドメイン同種二量体形成に寄与する残基を、空間補完的疎水性結合を生成することができるアミノ酸残基の突然変異対に置換して、同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）形成は排除され、異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形成に望ましい突然変異対と、
２）ＣＨ３ドメインと間の二量体形成に大きく寄与していないアミノ酸残基を長距離静電的引力が選択的に形成されるアミノ酸残基の突然変異対に置換して、同種二量体形成は排除され、異種二量体の形成が熱力学的に望ましいＣＨ３突然変異体対を構想し構築した。

つまり、ＣＨ３ドメインの相互作用内部の選択的な空間補完疎水性結合の突然変異体対の誘導のためには、ＣＨ３ドメイン間の相互作用面内部に位置する親水性、疎水性アミノ酸残基の位置および相互結合を分析して、これらのうち異種二量体の形成のための、空間的に選択的な疎水性結合の形成に望ましい突然変異対をＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに導入した。

また、ＣＨ３ドメインの相互作用面に新たな長距離静電結合の突然変異体対を誘導するために相互作用面の内部の疎水性結合部位およびすでに静電結合に関与している残基を除く、ＣＨ３ドメインの相互作用面には存在するが隣接する残基との相互作用は存在しないかまたは比較的弱い水素結合やファンデルワールス引力による相互作用をする残基と、比較的隣接残基と側鎖との間の距離が遠くて相互作用に適していない残基との位置および相互結合を分析して、これらのうち異種二量体を形成するための選択的な長距離静電結合の形成に望ましい突然変異対をＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに導入して異種二量体の形成を誘導した。

ＣＨ３ドメインの相互作用内部の疎水性結合のコアアミノ酸残基の外に静電的結合に替わる選択的な疎水性結合を生成することができるアミノ酸突然変異対と、新たな静電的引力を相互作用面に導入したアミノ酸変異体対は、次のように分析して構築した。

［ＣＨ３Ａ（Ｌｙｓ４０９Ｔｒｐ）：ＣＨ３Ｂ（Ａｓｐ３９９Ｖａｌ、Ｐｈｅ４０５Ｔｈｒ）］
ＣＨ３ＡのＬｙｓ４０９は、ＣＨ３ドメインの相互作用内部に位置し、ＣＨ３ＢのＬｅｕ３６８、Ａｓｐ３９９、Ｐｈｅ４０５、Ｔｙｒ４０７と隣接している。このうち、Ｌｙｓ４０９と他の鎖のＡｓｐ３９９との静電的引力は、ＣＨ３ドメイン同士の相互作用に寄与している。ＣＨ３ＢのＡｓｐ３９９は、ＣＨ３ＡのＬｙｓ３９２、Ｌｙｓ４０９と隣接しており、これらの間の静電的引力はＣＨ３ドメイン間の相互作用に寄与している。このようなＣＨ３ドメイン間の相互作用の疎水性コアに隣接している静電的引力を、選択的な疎水性結合が形成されるよう置換すると、既存のＣＨ３ドメイン間の同種二量体の形成に寄与していた静電的結合は消え、空間補完的な疎水性結合によって選択的にＣＨ３ドメイン間の異種二量体形成が誘導され、異種二量体の形成能の増進を期待することができる。そのために、ＣＨ３ＡのＬｙｓ４０９Ｔｒｐと、ＣＨ３ＢのＡｓｐ３９９Ｖａｌとの突然変異対を誘導した（図４）。

また、ＣＨ３ＢのＰｈｅ４０５は、ＣＨ３ＡのＬｙｓ３９２、Ｔｈｒ３９４、Ｌｙｓ４０９と隣接しているが、突然変異が誘導されたＣＨ３ＡのＬｙｓ４０９Ｔｒｐの側鎖がＣＨ３ＢのＰｈｅ４０５の大きい疎水性側鎖との空間的な衝突により異種二量体の形成が阻害されることがある。したがって、側鎖と空間的に配置され、かつ、疎水性結合が維持されるようにＰｈｅ４０５Ｔｈｒ突然変異を誘導した。

ＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ４０９をトリプトファン（Ｗ）に置換すると、ＣＨ３Ａドメイン間の同種二量体の生成が阻害される。これは、従来のＬｙｓ４０９：Ａｓｐ３９９の静電的結合を維持することができないだけでなく、隣接する他のチェーンのＰｈｅ４０５、Ｔｙｒ４０７の側鎖によってＣＨ３ドメイン境界面内の空間配置が難しくなるからである。

ＣＨ３ＢドメインのＡｓｐ３９９をバリン（Ｖ）に置換すると、既存のＡｓｐ３９９：Ｌｙｓ３９２、Ａｓｐ３９９：Ｌｙｓ４０９対の静電引力が消え同種二量体の生成を相対的に阻害することができる。

また、ＣＨ３ＢドメインのＰｈｅ４０５をスレオニン（Ｔ）に置換すると、同種二量体の生成を相対的に阻害する効果はないが、異種二量体の形成時ＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ４０９Ｔｒｐと疎水性結合に寄与することができる。

したがって、ＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ４０９Ｔｒｐ置換とＣＨ３ＢのＡｓｐ３９９Ｖａｌ置換との組み合わせ、およびＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ４０９Ｔｒｐ置換とＣＨ３ＢドメインのＰｈｅ４０５Ｔｈｒ置換との組み合わせは、ＣＨ３ドメイン間の相互作用境界面において最も適切な距離を維持しながら、相互補完的な疎水性結合を維持するようになり、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの異種二量体の生成に望ましい。

［ＣＨ３Ａ（Ｌｙｓ３６０Ｇｌｕ）：ＣＨ３Ｂ（Ｇｌｎ３４７Ａｒｇ）］
ＣＨ３ＡのＬｙｓ３６０は、ＣＨ３ドメインの相互作用外部に位置し、ＣＨ３ＢのＧｌｎ３４７、Ｔｙｒ３４９の側鎖と隣接しているが、距離が遠く、非常に弱い水素結合によりＣＨ３ドメイン間の相互作用に寄与する。したがってＣＨ３ＡのＬｙｓ３６０、ＣＨ３ＢのＧｌｎ３４７残基に、側鎖が大きく、互いに反対の電荷を帯びるアミノ酸残基に変えると、長距離静電引力により異種二量体の形成に望ましい。したがってＣＨ３ＡのＬｙｓ３６０をＧｌｕに置換し、ＣＨ３ＢのＧｌｎ３４７をアルギニン（Ｒ）に置換すると、ＣＨ３ＡのＧｌｕ３６０とＣＨ３ＢのＡｒｇ３４７間の相互作用によりＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ形成に望ましい。しかし、ＣＨ３Ｂの場合は、Ｌｙｓ３６０：Ｇｌｎ３４７Ａｒｇ対の静電反発により同種二量体の形成が阻害される（図５）。

［ＣＨ３Ａ（Ｇｌｎ３４７Ｇｌｕ）：ＣＨ３Ｂ（Ｌｙｓ３６０）］
上記のＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ３６０とＣＨ３ＢドメインとのＧｌｎ３４７側鎖間の弱い相互作用と同様に、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｎ３４７側鎖とＣＨ３ＢドメインのＬｙｓ３６０側鎖間において、長距離の弱い水素結合によりＣＨ３ドメイン間の相互作用に寄与する。したがって、互いに反対の電荷を帯びるアミノ酸残基に置き換えることにより、比較的長距離の静電的引力を導入して、異種二量体の形成を助けることができる。この時、上記のＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ３６０ＧｌｕとＣＨ３ＢドメインのＧｌｎ３４７Ａｒｇとの突然変異体対と一緒に利用するために、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｎ３４７にはＧｌｕに置換して、ＣＨ３ＢドメインのＬｙｓ３６０と相互作用ができるようにした（図６）。

したがって、上記のＣＨ３ＡドメインのＬｙｓ３６０ＧｌｕとＣＨ３ＢドメインのＧｌｎ３４７Ａｒｇとの突然変異対と、ＣＨ３ＡドメインのＧｌｎ３４７ＧｌｕとＣＨ３ＢドメインのＬｙｓ３６０との突然変異対は、それぞれの静電相互作用により異種二量体の形成に望ましいと同時に、ＣＨ３Ａドメイン同士はＧｌｎ３４７ＧｌｕとＬｙｓ３６０Ｇｌｕ間の静電的反発力により同種二量体の形成が阻害され、ＣＨ３Ｂドメイン同士はＧｌｎ３４７ＡｒｇとＬｙｓ３６０との間の静電反発力により同種二量体の形成が阻害される。

［ＣＨ３Ａ（Ｔｙｒ３４９Ｓｅｒ）：ＣＨ３Ｂ（Ｇｌｕ３５７Ｔｒｐ）］
ＣＨ３ＡのＴｙｒ３４９は、ＣＨ３ドメインの相互作用外部に位置し、ＣＨ３ＢのＳｅｒ３５４、Ａｓｐ３５６、Ｇｌｕ３５７、Ｌｙｓ３６０の側鎖と隣接している。ＣＨ３ＢのＧｌｕ３５７は、ＣＨ３ドメインの相互作用外部に位置し、ＣＨ３ＡのＴｙｒ４５９、Ｌｙｓ３７０の側鎖と隣接しており、このうちＬｙｓ３７０と長距離静電結合によりＣＨ３ドメイン間の相互作用に関与している。

したがってＣＨ３ＡのＴｙｒ３４９をセリン（Ｓ）に置換して、ＣＨ３ＢのＧｌｕ３５７をトリプトファン（Ｗ）に置換すると、既存ＣＨ３ＢのＧｌｕ３５７とＣＨ３ＡのＬｙｓ３７０との静電的結合がなくなり、ＣＨ３ＡのＴｙｒ３４９ＳｅｒとＧｌｕ３５７Ｔｒｐ間の側鎖の大きさによる相互補完的な作用でＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂの形成に望ましい（図７）。

また、ＣＨ３ＢのＧｌｕ３５７Ｔｒｐは、ＣＨ３ＡのＬｙｓ３７０との静電的結合を除去する役割に加え、ＣＨ３ＢのＴｙｒ３４９とも隣接することになり、ドメイン境界面内の空間配置が難しくなってＣＨ３Ｂドメイン間の同種二量体の生成を阻害することができる。

［ＣＨ３Ａ（Ｓｅｒ３５４Ｃｙｓ）：ＣＨ３Ｂ（Ｔｙｒ３４９Ｃｙｓ）／ＣＨ３Ａ（Ｔｙｒ３４９Ｃｙｓ）：ＣＨ３Ｂ（Ｓｅｒ３５４Ｃｙｓ）］
ＣＨ３ＡドメインのＳｅｒ３５４は、ＣＨ３ＢドメインのＴｙｒ３４９と隣接しており、両残基を両方ともシステイン（Ｃ）に置換すると、ドメイン間のジスルフィド架橋が生成される。ジスルフィド架橋の導入により生成された異種二量体の安定化を図ることができ、導入した一つのジスルフィド架橋は、ＣＨ３ドメインの相互作用面に非対称的に存在するので、異種二量体の生成収率を向上させるのに役立つ。ＣＨ３ＡドメインのＴｙｒ３４９とＣＨ３ＢドメインのＳｅｒ３５４残基をシステイン（Ｃ）に置換することも同じ役割ができる。

＜実施例２＞
抗体重鎖不変部位の異種二量体の形成能を増進するためのＣＨ３ドメイン突然変異体の構築方法
上記実施例１で考案されたＣＨ３ドメインの突然変異体対は、それぞれ、または組み合わせで構成されたＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂに構築されて、５種のＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ異種二量体対を構築しており、構築した異種二量体対の安定化および異種二量体の生成収率の向上のためにジスルフィド架橋を導入した突然変異体の２種を構築した（図１１および表１）。

ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂ突然変異体は、ＩｇＧ１の重鎖不変部位ＣＨ３ドメイン塩基配列に基づいて、設計された突然変異が誘導されるようにＤＮＡを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）した。塩基配列は、シークエンシングで確認し（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）、構築したＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ突然変異対は、下記［表１］の通りである。

＜実施例３＞
本発明で作製したＣＨ３ドメイン変異体の異種二量体形成能評価システムの構築
上記＜実施例２＞で作製したＣＨ３ドメイン突然変異体の異種二量体の形成収率を評価するために構築されたＣＨ３ＡドメインはｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットに、ＣＨ３Ｂドメインはｄｕｍｍｙ−Ｆｃフォーマットに発現されるよう、動物発現ベクターにクローニングした（図１３及び図１４）。使用したｓｃＦｖ抗体は、ＤＲ４に特異的に結合するヒト化抗体ｈＡＹ４の親和性が向上されたバージョンであるｈＡＹ４ａのＶＨとＶＬ部位を接続した抗体である（Ｌｅｅ、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１０）。

ｈＡＹ４ａ ｓｃＦｖ−Ｆｃとｄｕｍｍｙ−Ｆｃとを、ＣＭＶプロモーターを有する動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に、ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｈＡＹ４ａ ｓｃＦｖ−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３またはｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３を有するように、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でＳａｃＩ／ＸｂａＩを用いてクローニングした。

上記のように、ＣＨ３ＡドメインはｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットで、ＣＨ３Ｂドメインはｄｕｍｍｙ−Ｆｃフォーマットで発現すると、精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で同種二量体と異種二量体の収率を確認することができる。これは、ｓｃＦｖ−Ｆｃの形態がｄｕｍｍｙ−Ｆｃの形態よりも分子量が大きいため、ｓｃＦｖ−Ｆｃ同種二量体とｓｃＦｖ−Ｆｃ／ｄｕｍｍｙ−Ｆｃ異種二量体、ｄｕｍｍｙ−Ｆｃ同種二量体の分子量がそれぞれ異なって表示され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でバンド移動度の違いにより区別が可能である原理を利用したものである（図１５）。下記［表２］は、構築したｓｃＦｖ−Ｆｃ／ｄｕｍｍｙ−Ｆｃ ＣＨ３ドメインの突然変異体対を示したもので、構築されたＣＨ３ドメインの変異体対を含む重鎖不変部位の異種二量体の形成能を評価するためのｓｃＦｖ−Ｆｃおよびｄｕｍｍｙ−Ｆｃ発現形態を示しており、ＫｉＨは対照群として使用した。

＜実施例４＞
ＣＨ３ドメイン変異体を含む抗体の発現及び精製
ＨＥＫ２９３−Ｆシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、前記＜実施例３＞で構築された、それぞれのプラスミドＣＨ３Ａ変異体を含む重鎖およびＣＨ３Ｂ変異体を含む重鎖の一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を利用して、二重特異性抗体を生成した。振とうフラスコまたは撹拌発酵機において、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２つの発現プラスミドおよびＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物で形質感染した。１Ｌの振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の場合、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、２００ｍＬ中１．０Ｅ×６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％ＣＯ_２で培養した。一日後、細胞を約２．０Ｅ×６細胞／ｍＬの細胞密度において同じモル比で、ＣＨ３Ａ変異体を含む重鎖およびＣＨ３Ｂ変異体を含む重鎖をエンコードするプラスミドＤＮＡを、計４００（２／ｍＬ）を含有する１０ｍＬのＦｒｅｅＳｙｔｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１０ｍＬのＦｒｅｅＳｙｔｌｅ２９３発現培地＋８００ＰＥＩ（４／ｍＬ）の、約２１ｍＬの混合物でトランスフェクションした。上澄みを５日後に採取した。

標準プロトコルを参照して、採取した細胞培養の上澄みからタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液を用いてｐＨ３．０から抗体を溶離した後、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液を用いてサンプルを即座に中和した。溶離した抗体分画は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（５ＫのＭＷＣＯ）を用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を交換した後、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（１０ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を使用して濃縮し、精製されたＦｃ変異体抗体はＢＣＡ法により定量した。

＜実施例５＞
ＣＨ３ドメイン変異体を含む抗体の異種二量体の形成能評価と収率比較、タンパク質２次構造およびＦｃＲｎに対する結合能分析
上記＜実施例４＞で精製されたＣＨ３突然変異体対が挿入された抗体１０ｇを１２％非還元性条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した（図１６）。ＣＨ３Ａ変異体の同種二量体は１０３ｋＤ、ＣＨ３Ｂ変異体の同種二量体は５３ｋＤ、ＣＨ３Ｂ変異体の単量体は２５ｋＤで観察され、ＣＨ３Ａ変異体とＣＨ３Ｂ変異体の異種二量体は７８ｋＤで観察された。

ＣＨ３Ａ変異体を含む重鎖およびＣＨ３Ｂ変異体を含む重鎖プラスミドＤＮＡを、同じモル濃度で一時的形質感染して発現精製した時、対照群である野生型ＣＨ３ドメインが導入された異種二量体と比較して、突然変異体の異種二量体形成能がより高いことを確認した。Ｅ−Ｒ変異体およびＷ−ＶＴ変異体に比べて、２つの対をすべて組み合わせたＥＷ−ＲＶＴとＥＥＷ−ＲＶＴ変異体の異種二量体形成能がそれぞれ９１％程度と、より増加したことを確認しており、上記２つの変異体は、対照群であるノブ・イントゥ・ホールの異種二量体形成能の約８６％よりも異種二量体の形成能が増加したことが分かった（表３）。また、野生型抗体を含むすべての変異体においてＦｃ単量体が少量観察されたが、これは重鎖間の発現程度の差に起因するものと予想される。

また、Ｅ−Ｒ変異体の場合、ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ異種二量体の形成が約５３％を示し、Ｗ−ＶＴ変異体のｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ異種二量体の形成能が約７７％を示すことを確認することにより、異種二量体の形成能の増加は、長距離静電結合を新たに追加することによっても寄与することができるが、相互作用面内部に既存の同種二量体形成能に作用していた相互作用を除去し、選択的な空間補完的疎水性結合を追加した戦略が比較的もっと寄与したことが確認できた。

また、ＣＨ３ドメインの相互作用面内部に追加的な空間補完的疎水性結合を導入するための戦略や、相互作用面に新たな長距離静電的引力の突然変異対をさらに導入する戦略を単独で実行するよりも、２つの戦略を同時に実行することが異種二量体形成能の増進に役立つことを確認した。

そして、構築されたＣＨ３突然変異体対が導入された重鎖不変部位Ｆｃ二量体タンパク質が、野生型重鎖不変部位Ｆｃのように、タンパク質Ａ樹脂によく精製されるのは、ＣＨ３突然変異体対に導入された突然変異が、タンパク質Ａと重鎖不変部位との間の相互作用には影響を与えていないことを示唆している。

また、精製された野生体および突然変異体ＣＨ３ドメインを含む異種二量体抗体０．１ｇを、それぞれ非還元性および還元性条件下でウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によっても確認した（図１７及び図１８）。上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをＰＶＤＦ膜に移し、ｇｏａｔ抗−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）、抗−ｇｏａｔ ＩｇＧ ＨＲＰ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を標識し、ＰｏｗｅｒＯｐｔｉ−ＥＣＬ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ）で検出して、分析にはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。ウェスタンブロットで異種二量体の形成を確認した結果、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認された結果と類似して、（図１６）、ＥＲ変異体およびＷ−ＶＴ変異体と対照群ノブ・イントゥ・ホールに比べて、２つの対をすべて組み合わせたＥＷ−ＲＶＴおよびＥＥＷ−ＲＶＴ変異体の同種二量体の形成が阻害されたことが確認できた。

上記の実験において異種二量体の形成能の増加は、長距離静電結合を新たに追加したときよりも、相互作用面の内部に既存の同種二量体形成能に作用していた相互作用を除去し、選択的な空間補完的疎水性結合を追加した戦略が、比較的多く寄与したことを確認したので（図１６）、Ｗ−ＶＴ変異体に付加的な空間補完的結合対（Ｔｙｒ３４９Ｓｅｒ：Ｇｌｕ３５７Ｔｒｐ）を組み合わせたＳＷ−ＷＶＴ変異体を構築し、異種二量体の形成能を確認した（図１９）。ＳＷ−ＷＶＴ変異体の場合、ＥＷ−ＲＶＴ変異体に比べて、同種二量体の形成能はやや減少したものの、Ｆｃ単量体が観察され、約８９％の異種二量体形成能を有することを確認した（表３）。これは、重鎖間の発現程度の違いによるもので、形質感染時にプラスミドのモル比を調節することにより、異種二量体形成能を向上させることができると予想される。

また、ＥＷ−ＲＶＴ変異体とＳＷ−ＷＶＴ変異体とにジスルフィド架橋を導入し、異種二量体形成能を比較した（図１９）。ＥＷ−ＲＶＴ変異体の場合には、導入されたＥ−Ｒ突然変異対（Ｌｙｓ３６０Ｇｌｕ：Ｇｌｎ３４７Ａｒｇ）による長距離静電的結合がＣＨ３ドメインの相互作用面の外郭部位に非対称的に存在するので、反対側の静電結合が存在しない部位にジスルフィド架橋を導入するために、ＣＨ３ＡドメインにＴｙｒ３４９Ｃｙｓ、ＣＨ３ＢドメインにＳｅｒ３５４Ｃｙｓの突然変異を導入した。ＳＷ−ＷＶＴ変異体にジスルフィド架橋を導入するに当たっては、Ｓ−Ｗ突然変異対（Ｔｙｒ３４９Ｓｅｒ：Ｇｌｕ３５７Ｗ）によって導入された空間補完的結合に影響を与えないようにするために、ＣＨ３ＡドメインにＳｅｒ３５４Ｃｙｓ、ＣＨ３ＢドメインにＴｙｒ３４９Ｃｙｓの突然変異を導入し、Ｓ−Ｗ突然変異対の位置の反対側ＣＨ３ドメインの相互作用面にジスルフィド架橋が生成された。

ジスルフィド架橋が導入された変異体は、導入されていない変異体に比べて、ＥＷ−ＲＶＴの場合は約３％、ＳＷ−ＷＶＴの場合は約９％が増加したことを確認し（表３）、ジスルフィド架橋の導入が異種二量体の形成能向上に寄与することを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上において、ジスルフィド架橋が導入された変異体が、導入されていない変異体に比べて、より小さいサイズで確認されるが、これは異種二重体が、ＳＤＳ変性条件下でジスルフィド架橋によって比較的密集した形で存在するため、ＰＡＧＥ上の移動能の違いを有するものであって、実際に自然状態での異種二量体の大きさの違いではないと判断される。

また、それぞれの突然変異体を含む異種二量体を繰り返し発現精製してＩｍａｇｅＪプログラム（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の各バンド（ｂａｎｄ）の密度（ｄｅｎｓｉｔｙ）を分析した結果、既存の陽性対照群のノブ・イントゥ・ホール異種二量体の収率が約８５％〜９０％程度であるのに対し、ＥＷ−ＲＶＴとＥＥＷ−ＲＶＴ突然変異が含まれている異種二量体の形成収率が約９０％〜９５％程度と高いことが確認できた（表３）。下記［表３］は、構築されたＣＨ３ドメイン突然変異対を含む重鎖不変部位の異種二量体形成能を比較したもので、ＫｉＨを対照群として使用し、結果値は、３回以上の独立した実験を実行した後、平均の標準誤差（ｍｅａｎＳ．ＥＭ）で示した。

ＣＨ３ドメイン変異体が含まれている異種二量体タンパク質の発現収率を確認した（表４）。ＨＥＫ２９３細胞に一時的形質感染し、約２０ｍｌの培養液の量で５日間発現して、精製過程が終わった後のタンパク質の濃度と体積を定量してタンパク質の発現収率を計算した。実験は、３回〜５回繰り返して行われたことを平均標準誤差（ｍｅａｎＳ．ＥＭ）で表したものである。

その結果、ＣＨ３ドメイン変異体が含まれている異種二量体タンパク質は、野生型ＣＨ３ドメインを含む異種二量体に比べて収率がやや減少し、対照群のノブ・イントゥ・ホールよりは近似しているか、やや高い程度の収率を持っていることを確認した。これにより、ＣＨ３ドメインに導入された変異体対は、野生型抗体と比較したとき、タンパク質の安定性を大きく阻害しないと判断することができる。

突然変異対を含むＣＨ３ドメインのタンパク質二次構造が、野生型のＣＨ３ドメインのタンパク質二次構造と同じように保存されているかどうかを確認するために円二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）を測定した。ＣＨ３ＡドメインおよびＣＨ３Ｂドメインをそれぞれｄｕｍｍｙ−Ｆｃベクターで構築してＦｃドメイン二量体を作製して分析に利用した（図１４）。Ｃｈｉｒａｓｃａｎ（登録商標）−ｐｌｕｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＰｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ、ＵＫ）を用いており、分析温度２５℃で行った。測定緩衝液の条件は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いており、１９５ｎｍ〜２６０ｎｍの区間で分析した。

その結果、ＥＷ−ＲＶＴ突然変異対が導入されたＣＨ３ドメインを持つＦｃ二量体は、野生型ＣＨ３ドメインを持つＦｃ二量体と同じ値の平均残余楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｙ）を持つことが確認できた。これは、突然変異体対が導入されても、タンパク質の二次構造には変化がないことを示す（図２０）。

また、突然変異対が導入されたＣＨ３ドメインを含む抗体が野生型ＣＨ３ドメインを持つ抗体と比較してＦｃＲｎに対する結合能を保持しているかを確認するためにＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を用いており、ＥＷ−ＲＶＴ突然変異対のＣＨ３変異体が含まれている異種二量体抗体と、対照群として野生型ＣＨ３ドメインを持つＩｇＧ１抗体であるＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とを、ｓＦｃＲｎ（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ ．，２０１１）に対して結合能を分析した。ｓＦｃＲｎを１０ｍＭ Ｎａ−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）に約１０００反応単位（ｒｅｐｏｎｓｅ ｕｎｉｔｓ、ＲＵ）で固定化した。泳動用緩衝液としては、Ｔｗｅｅｎ２０が０．００５％含まれているＰＢＳ（ｐＨ６．０）およびＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いており、ＣＨ３突然変異体を０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５μＭ、５μＭの濃度で分析した。

その結果、突然変異体対が導入されたＣＨ３ドメインを含む抗体は、野生体ＣＨ３ドメインを含む抗体と同様に、ＦｃＲｎに対する結合能をそのまま保持していることを確認した（図２１）。

＜実施例６＞
ｓｃＦｖの形態の抗−ＤＲ４×ＤＲ５抗体が融合された形態のＣＨ３ドメイン変異体を用いた抗−ＤＲ４×ＤＲ５ ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性抗体の発現および精製分析
標的抗原ＤＲ４に特異的に結合するヒト化ｈＡＹ４ａ ｓｃＦｖ抗体（Ｌｅｅ、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）と、標的抗原ＤＲ５に特異的に結合するヒトＨＷ１ ｓｃＦｖ抗体（Ｐａｒｋ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）の親和性向上バージョンであるＡＵ５Ｈ ｓｃＦｖ抗体を、ＣＨ３ドメイン変異体が使用されたＦｃのＮ−末端に融合して二重特異性抗体を構築した（図２２−Ａ）。

この際使用した突然変異体対は、ＥＷ−ＲＶＴ対であり、構築したｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の二重特異性抗体は、上記＜実施例５＞における方法と同様にして発現および精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質を分析した。突然変異体対が導入されたｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗−ＤＲ４×ＤＲ５二重特異性抗体は、対照群であるノブ・イントゥ・ホールを導入したｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体と比較して、目的の抗体が二量体の形で組み合わせ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）されていないか、または、タンパク質の不安定性による切断副産物もなく精製されることを確認した（図２２−Ｂ）。

また、二重特異性抗体の結合状態を測定するためにＨＰＬＣ（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ１０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を行った。溶出緩衝液は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）を利用しており、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。タンパク質のサイズマーカーとして、ＩｇＧ（１５０ｋＤ）、アルブミン（６６ｋＤａ）、炭酸無水化酵素（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）（２９ｋＤａ）タンパク質を用いた。Ｍ７突然変異体対が導入されたｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗−ＤＲ４×ＤＲ５二重特異性抗体は、サイズ排除クロマトグラフィ上でも対照群のノブ・イントゥ・ホールを導入したｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の抗体と比較して、二量体の形で組み合わせ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）されないか、タンパク質の不安定性による切断副産物もなく精製されることを確認した（図２２−Ｃ）。

＜実施例７＞
ｓｃＦａｂ形態の抗−ＤＲ４×ＤＲ５抗体が融合された形態のＣＨ３ドメイン変異体を用いた抗−ＤＲ４×ＤＲ５ ｓｃＦａｂ−Ｆｃ二重特異性抗体の作製および二重特異性抗体の抗原に対する結合能分析
製作したＣＨ３突然変異体対を導入し、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ（ｓｃＩｇＧ）の形で二重特異性抗体を構築した。使用した親抗体は、前記＜実施例６＞のｓｃＦｖ−Ｆｃ形態の二重抗体で使用したものと同じヒト化ｈＡＹ４ａ抗体とＡＵ５Ｈ抗体であり、ＶＨ−ＣＨドメインとＶＬ−ＣＬドメインを２６個のアミノ酸の鎖で連結した形態の単鎖化Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）をＦｃのＮ−末端に融合して作製した（図２３−Ａ）。

この時使用した突然変異体対は、ＥＷ−ＲＶＴ対であり、構築したｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態の二重特異性抗体は、実施例６と同じ方法で発現および精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でタンパク質を分析した。非還元性条件下で突然変異体対が導入されたｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態の二重特異性抗体が、対照群のノブ・イントゥ・ホールが導入された二重特異性抗体と同様に、目的とする二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の形で結合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）された抗体として主要に精製されることを確認し、還元性条件下で目的とする二重特異性抗体の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が凝集反応（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）や切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）なく精製されたことを確認した（図２３−Ｂ）。

精製されたＦｃ変異体の二重特異性抗体の二重特異結合能を測定するためにＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を行った。標的分子ＢＳＡ、ＤＲ４、ＤＲ５と、対照群であるＤｃＲ１、ＤｃＲ２を、９６ｗｅｌｌ ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎ．，ＵＳＡ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間３回洗浄した。５％のスキームミルク（５％Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、ｐＨ ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１時間結合した後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間３回洗浄した。精製されたＦｃ変異体の二重特異性抗体を結合させた後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。ＡＰが接合された抗ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）で結合させた後、ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で反応させて４０５ｎｍの吸光度を定量した。ＥＬＩＳＡの結果により発現精製したｓｃＦｖ−Ｆｃ形態とｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態の二重特異性抗体がそれぞれ標的分子ＤＲ４とＤＲ５に対する特異性を持つことを確認した（図２３−Ｃ）。突然変異体対のＭ７が導入されたｓｃＦｖ−Ｆｃ形態とｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態の二重特異性抗体は、対照群のノブ・イントゥ・ホールが導入された二重特異性抗体と比較して、類似する程度の標的分子であるＤＲ４とＤＲ５に対する結合力を持っており、ＤｃＲ１とＤｃＲ２には交差反応性なく標的分子に対する特異性が維持された。これによって、改良されたＣＨ３ドメインの突然変異体対を導入することが抗原結合部位の結合能には影響を及ぼさないことを確認した。

＜実施例８＞
抗−ＤＲ４×ＤＲ５抗体が融合した形態のＣＨ３ドメイン変異体を用いた抗−ＤＲ４×ＤＲ５ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂ−Ｆｃ二重特異性抗体の細胞毒性評価
上記＜実施例６＞と＜実施例７＞で作製された抗−ＤＲ４×ＤＲ５ｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂ−Ｆｃ二重特異性抗体のガン細胞死滅能を確認するために、ヒト由来ガン細胞であるＨＣＴ１１６（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）とＨｅＬａ（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株からの細胞毒性試験（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）を行った。

具体的には、９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにガン細胞株をｗｅｌｌあたり１×１０^４ｃｅｌｌｓで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）をした後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで１．５日培養した後、親抗体である抗−ＤＲ４ヒト化抗体ｈＡＹ４ａ ＩｇＧと抗−ＤＲ５ヒト抗体ＡＵ５Ｈ−ｓｃＦｖ、作製されたｓｃＦｖ−ＦｃおよびｓｃＦａｂ−Ｆｃ形態の二重抗体と、陽性対照群としてＤＲ４およびＤＲ５のリガンドであるＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）を、インキュベーターで２０時間培養した。この時、ＴＲＡＩＬは、大腸菌から発現精製したものを用いた。この後、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）をウエル（ｗｅｌｌ）あたり２０μｌ処理した後、３４時間培養し、ウエル内の培養液を除去し、１００μｌのＤＭＳＯでホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を溶解し、５９５ｎｍで溶解されたホルマザンの吸光度を測定して細胞毒性を定量した。

その結果、上記二つの形態の二重特異性抗体は、親抗体であるヒト化抗体ｈＡＹ４ａＩｇＧとヒト抗体ＡＵ５Ｈ−ｓｃＦｖとを比較して、ガン細胞の死滅能が増加しており、陽性対照群として用いたＴＲＡＩＬと比較して、細胞毒性が類似するか、やや優れたことを確認することができた（図２４）。

下記表５は、本発明の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体および異種二量体重鎖不変部位対の配列情報を示す。

上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更しないで、他の具体的な形で容易に変形が可能であることを理解するべきである。したがって、以上で述べた実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解されるべきである。

Claims (15)

1. 抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体であって、
   一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５はそれぞれバリン（Ｖ）及びスレオニン（Ｔ）に置換され、前記置換されたトリプトファン（Ｗ）とバリン（Ｖ）又はスレオニン（Ｔ）との間の結合を含み、
   さらに、
   （ａ）一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に置換され、前記置換されたセリン（Ｓ）とトリプトファン（Ｗ）との間の結合を含む、
   （ｂ）一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換され、前記置換されたグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）との間の結合を含む、又は、
   （ｃ）一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７及びＬｙｓ３６０はそれぞれグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換され、前記置換されたグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）との間の結合を含む、
   （ただし、上記の位置は、ＥＵ ｉｎｄｅｘによる）抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
2. 第１のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０及びＬｙｓ４０９は、それぞれグルタミン酸（Ｅ）及びトリプトファン（Ｗ）に置換され、第２のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７、Ａｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５は、それぞれアルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びスレオニン（Ｔ）に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
3. 第１のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７、Ｌｙｓ３６０及びＬｙｓ４０９は、それぞれグルタミン酸（Ｅ）、グルタミン酸（Ｅ）及びトリプトファン（Ｗ）に置換され、第２のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７、Ａｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５は、それぞれアルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）及びスレオニン（Ｔ）に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
4. 第１のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９及びＬｙｓ４０９は、それぞれセリン（Ｓ）及びトリプトファン（Ｗ）に置換され、第２のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７、Ａｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５は、それぞれトリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）及びスレオニン（Ｔ）に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
5. 第１のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９及びＳｅｒ３５４のうちの少なくとも１つは、システイン（Ｃ）に置換されている、又は、第２のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９及びＳｅｒ３５４のうちの少なくとも１つは、システイン（Ｃ）に置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
6. 前記抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選択された免疫グロブリンのＦｃ部分の一部として含まれ得ることを特徴とする、請求項１に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
7. 前記ＩｇＧは、ヒトＩｇＧであることを特徴とする、請求項６に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
8. 前記ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体ＣＨ３ドメインの異種二量体。
9. 請求項１に記載のＣＨ３ドメインの異種二量体を含む、異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対。
10. 請求項１に記載のＣＨ３ドメインの異種二量体を含む、二重特異性抗体。
11. 請求項９に記載の異種二量体の重鎖不変部位対タンパク質を含む一価抗原結合抗体であって、
    前記抗体は、単一抗原に結合する重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）を含むＦｖ−Ｆｃ形態であることを特徴とする、抗体。
12. 請求項９に記載の異種二量体重鎖不変部位対タンパク質を含む不変部位融合タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｃ）形態の融合タンパク質。
13. 請求項１０に記載の二重特異性抗体、請求項１１に記載の一価抗原結合抗体および請求項１２に記載の融合タンパク質からなる群より選ばれるいずれか１つを有効成分として含む薬学的組成物。
14. 異種二量体重鎖不変部位の形成に望ましいＣＨ３ドメイン変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ＣＨ３）対の作製方法であって、
    一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ４０９はトリプトファン（Ｗ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＡｓｐ３９９及びＰｈｅ４０５はそれぞれバリン（Ｖ）及びスレオニン（Ｔ）に置換され、前記置換されたトリプトファン（Ｗ）とバリン（Ｖ）又はスレオニン（Ｔ）との間の結合を含み、
    さらに、
    （ａ）一方のＣＨ３ドメインのＴｙｒ３４９はセリン（Ｓ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｕ３５７はトリプトファン（Ｗ）に置換され、前記置換されたセリン（Ｓ）とトリプトファン（Ｗ）との間の結合を含む、
    （ｂ）一方のＣＨ３ドメインのＬｙｓ３６０はグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換され、前記置換されたグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）との間の結合を含む、又は、
    （ｃ）一方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７及びＬｙｓ３６０はそれぞれグルタミン酸（Ｅ）に置換され、他方のＣＨ３ドメインのＧｌｎ３４７はアルギニン（Ｒ）に置換され、前記置換されたグルタミン酸（Ｅ）とアルギニン（Ｒ）との間の結合を含む、
    突然変異対を作製する段階を含む、異種二量体重鎖不変部位の形成に望ましいＣＨ３ドメイン変異体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対の作製方法。
15. （ｄ）請求項１４に記載の方法により作製されたＣＨ３ドメイン変異体対が、抗体重鎖不変部位の野生型ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２ドメインのＣ−末端に融合された形態の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を含む、組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質の発現ベクターを作製する段階と、
    （ｅ）前記作製された発現ベクターを細胞に共形質転換して、組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質を発現する段階と、
    （ｆ）前記共発現された組み換え重鎖不変部位（Ｆｃ）対タンパク質を精製および回収する段階と、
    を含む、異種二量体重鎖不変部位（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ）対（（ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａ） （ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３Ｂ））タンパク質の作製方法。