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JP6385356B2 - Ｄｎａの検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ＤＮＡの検出方法に関するものである。
従来、生物テロ防御、医療診断、食品安全性、環境モニタリング等の観点から、安価でロバストなＤＮＡの検出方法が強く求められている。そこで、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）技術によって製作された微小鉗（かん）子を使用してＤＮＡの検出を行う検出方法が提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照。）。
M.Kumemura, D.Collard, S.Yoshizawa, D.Fourmy, N.Lafitte, S.Takeuchi, T.Fujii, L.Jalabert, and H.Fujita, "Direct bio-mechanical sensing of enzymatic reaction on DNA by silicon nanotweezers, " Proc. IEEE MEMS‘10, pp. 915-918, 2010 N.Lafitte, M.Kumemura, L.Jalabert, D.Collard, and H.Fujita, "Real-time sensing of molecule binding on DNA with silicon nanotweezers, " Proc. MicroTAS 2011, 389-391
しかしながら、前記従来の検出方法では、検体に含まれるＤＮＡをあらかじめ増幅して用意しておく必要があった。また、微小鉗子の微細化にも限界があるので、例えば、数〔ｎｍ〕〜数十〔ｎｍ〕程度の非常に短いＤＮＡを捕捉して検出することは、困難であった。
本発明は、前記従来の問題点を解決して、検出装置の一対の電極間を伸張させたＤＮＡによって橋渡しさせ、突起の電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行うことによって、ＤＮＡを、蛍光体等の標識物質を使用することなく、容易に、かつ、確実に検出することができるＤＮＡの検出方法を提供することを目的とする。
そのために、本発明のＤＮＡの検出方法においては、少なくとも一対の電極を備える検出装置を使用するＤＮＡの検出方法であって、前記電極にプライマーを固定し、単鎖ＤＮＡの環状テンプレートを含有する溶液内に前記電極を浸し、前記環状テンプレートをアニールし、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によって単鎖ＤＮＡ生成物を生成することにより、所定の電圧を印加した前記電極間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、複数の単鎖ＤＮＡ分子を含む前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行うこと、を含む。
本発明の他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極の少なくとも一部は金で被覆されている。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記伸張したＤＮＡによる前記電極間の橋渡しは、定温で行われる。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数に基づいて行われる。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間の間隔を所定の周波数で変化させる。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間を橋渡しするＤＮＡは束になっている。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間を橋渡しするＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子を含む束になっている。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの導電性に基づいて行われる。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡのリアルタイム計測によって行われる。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、単鎖の相補的ＤＮＡが生成されるように、対向する電極には異なるプライマーを固定する。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、複数の電極対に複数のプライマーを固定することによって、複数のＤＮＡの性質決定を行う。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、少なくとも一対の電極を備える検出装置を使用するＤＮＡの検出方法であって、前記電極にプライマーを固定し、単鎖ＤＮＡの環状テンプレートを含有する溶液内に前記電極を浸し、前記環状テンプレートをアニールし、ＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物を生成することにより、所定の電圧を印加した前記電極間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、前記電極間を橋渡しするＤＮＡに導電性の微粒子を被覆し、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの存在を確認すること、を含む。
本発明の更に他のＤＮＡの検出方法においては、さらに、複数の電極対に複数のプライマーを固定することによって、複数のＤＮＡの存在を確認する。
本発明によれば、ＤＮＡの検出方法においては、検出装置の一対の電極間を伸張させたＤＮＡによって橋渡しさせ、突起の電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行う。これにより、ＤＮＡを、蛍光体等の標識物質を使用することなく、容易に、かつ、確実に検出することができる。
本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置を示す斜視図である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部を溶液に浸す方法を説明する図である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部を溶液に浸す方法を説明する写真である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部にプライマーを固定する方法を説明する図である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部にＤＮＡ生成物を生成する方法を説明する図である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡを説明する図である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡを示す顕微鏡写真である。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数シフトを示すグラフである。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数の時間変化を示すグラフである。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの電気導電率を示す第１のグラフである。 本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの電気導電率を示す第２のグラフである。 本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡに金の微粒子を被覆させる方法を説明する図である。 本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡに金の微粒子を被覆させた状態を示す顕微鏡写真である。 本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡにパラジウムの微粒子を被覆させた状態の電気導電率を示すグラフである。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの概念図である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの写真である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの電極ユニットを示す図である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルユニットを示す図である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルユニットの突起構造部の顕微鏡写真である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのＤＮＡ捕獲部を示す図である。 本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのＤＮＡ捕獲部の顕微鏡写真である。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置を示す斜視図、図２は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部を溶液に浸す方法を説明する図、図３は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部を溶液に浸す方法を説明する写真である。なお、図２において、（ａ）は模式側面図、（ｂ）は上方からの顕微鏡写真である。
図において、１０は、本実施の形態における検出装置としてのナノ鉗子装置（Ｎａｎｏｔｗｅｅｚｅｒｓ）であって、ＭＥＭＳ技術によってシリコン基板から製作された装置であり、非特許文献１及び２に示されるナノ鉗子装置と類似の構造を有する。
前記ナノ鉗子装置１０は、平面視における形状が略矩（く）形の平板状の本体部１１と、該本体部１１の一側辺から突出した互いに平行な一対の腕部材１５とを有する。該腕部材１５は、前記本体部１１に対して移動可能乃至変位可能に取り付けられた移動腕１５ａと、移動不能に取り付けられた固定腕１５ｂとから成る。なお、前記移動腕１５ａ及び固定腕１５ｂは、本体部１１の表面に平行な平面上に並ぶように配設され、前記移動腕１５ａは本体部１１の表面に平行な平面上を移動する。
そして、前記移動腕１５ａの先端には先鋭な形状を備える移動先端部１６ａが形成され、前記固定腕１５ｂの先端には先鋭な形状を備える固定先端部１６ｂが形成されている。前記移動先端部１６ａと固定先端部１６ｂとは互いに対向する。なお、前記移動先端部１６ａ及び固定先端部１６ｂを統合的に説明する場合には、先端部１６として説明する。該先端部１６は、電極として機能し、所定のＡＣ電圧が印加される。なお、先端部１６の表面の少なくとも一部は、金で被覆されていることが望ましい。
また、前記本体部１１は、前記移動腕１５ａを変位させるための櫛（くし）歯アクチュエータ（Ｃｏｍｂ−ｄｒｉｖｅ Ａｃｔｕａｔｏｒ）１７を有する。該櫛歯アクチュエータ１７は、図示されない導電性の櫛歯間に作用する静電力を利用するリニアアクチュエータであって、図１における両方向矢印で示されるように、移動腕１５ａをその長手方向と直交する方向に変位させ、固定腕１５ｂとの間隔を変化させることができる。これにより、一対の先端部１６間の間隔、すなわち、移動先端部１６ａと固定先端部１６ｂとの間隔を変化させることができる。
さらに、前記本体部１１は、前記移動腕１５ａの変位量を計測するための変位センサ（Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒ）１８を有する。該変位センサ１８は、静電容量の変化を検出する容量式センサであって、移動腕１５ａの変位量を計測することができる。これにより、一対の先端部１６間の間隔、すなわち、移動先端部１６ａと固定先端部１６ｂとの間隔、及び、該間隔の変化量を計測することができる。
前記本体部１１の表面には、櫛歯アクチュエータ１７に駆動電流を供給するためのアクチュエータ用端子２１と、変位センサ１８の静電容量の変化を検出するためのセンサ用端子２２と、一対の腕部材１５の先端部１６にＡＣ電圧を印加するための腕部材用端子２３とが形成されている。
図２に示されるように、本実施の形態において、ナノ鉗子装置１０は、溶液収容装置３０とともに使用される。該溶液収容装置３０は、平板状の一対の板部材３１と、該板部材３１の間に形成された微小空間３２とを有する。前記板部材３１は、上側に配設される上板部材３１ａと、下側に配設される下板部材３１ｂとから成り、上板部材３１ａと下板部材３１ｂとは、微小間隔（例えば、約３００〔μｍ〕程度の間隔）を空けて互いに平行となるように配設されている。なお、少なくとも上板部材３１ａは、ガラス等の透明材料から成るものであることが望ましい。そして、前記微小空間３２内には、ＤＮＡを含む溶液が注入されて収容される。なお、前記微小空間３２は、前方（図２における左方）が開放されているが、上板部材３１ａと下板部材３１ｂとの間隔が微小であるため、収容されている溶液は、ほとんど漏出したり、蒸発したりすることがない。
そして、前記ナノ鉗子装置１０は、実験室の床等に固定される基礎部４０の上面に固定された鉗子保持台４１の平坦（たん）な上面に、本体部１１の表面がほぼ水平となるように取り付けられる。したがって、腕部材１５はほぼ水平となるように配設される。
また、前記溶液収容装置３０は、基礎部４０の上面に前記鉗子保持台４１と対向するように固定された溶液保持装置４２に取り付けられる。該溶液保持装置４２は、前記鉗子保持台４１に対して接近及び離間するように移動可能な可動保持台４２ａを備え、該可動保持台４２ａの平坦な上面に、板部材３１がほぼ水平となるように溶液収容装置３０が取り付けられる。また、板部材３１の間に形成された微小空間３２の位置が鉗子保持台４１に取り付けられたナノ鉗子装置１０の腕部材１５の位置と対応するように、前記可動保持台４２ａの高さ方向の位置は調整されている。
したがって、図２（ａ）における両方向矢印で示されるように、可動保持台４２ａを水平方向に移動させることによって、ナノ鉗子装置１０の腕部材１５の先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２に相対的に出し入れすることができ、図２（ｂ）に示されるように、前記先端部１６を微小空間３２内に収容されている溶液に浸すことができる。
なお、図３は、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０及び溶液収容装置３０の位置関係を示す写真であって、ナノ鉗子装置１０の腕部材１５の先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２から出した状態を示している。
次に、本実施の形態におけるＤＮＡを検出する方法であって、本発明の発明者が図３に示されるような装置を使用して実際にＤＮＡを検出した方法について説明する。まず、先端部１６間をＤＮＡによって橋渡しさせる方法について説明する。
図４は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部にプライマーを固定する方法を説明する図、図５は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部にＤＮＡ生成物を生成する方法を説明する図、図６は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡを説明する図、図７は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡを示す顕微鏡写真である。なお、図４及び５において、（ａ）及び（ｂ）は方法の第１及び第２の工程を示す図であり、図６において、（ａ）は先端部に橋渡ししたＤＮＡを示す図、（ｂ）〜（ｄ）は橋渡ししたＤＮＡに含まれるＤＮＡ分子を示す図である。
図４（ａ）に示されるように、互いに対向する先端部１６間の間隔は、最小でも３〜５〔μｍ〕程度である。ナノ鉗子装置１０の微細化にも限界があり、現時点では、これよりも狭い間隔とすることは、不可能である。なお、図においては、左側に移動先端部１６ａが位置し、右側に固定先端部１６ｂが位置しているが、移動先端部１６ａ及び固定先端部１６ｂのいずれが左側に位置してもよく、また、いずれが右側に位置してもよい。また、前記先端部１６は、表面が金で被覆されている。
そして、可動保持台４２ａを図２（ａ）における左方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内に入れ、該微小空間３２内に収容されている第１の溶液に浸すことによって、図４（ｂ）に示されるように、先端部１６の表面にプライマー５１を付着させて固定する。ここで、第１の溶液は、プライマー５１を含む溶液である。
本発明の発明者は、プライマー５１として、５’−チオール−モディファイドＲＣＡプライマー（5'-thiol-modified RCA primer）を使用した。
続いて、可動保持台４２ａを図２（ａ）における右方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内から出した後、該微小空間３２内に収容されている第１の溶液を、該第１の溶液と異なる第２の溶液と入れ替える。そして、可動保持台４２ａを再度図２（ａ）における左方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内に入れ、該微小空間３２内に収容されている第２の溶液に浸す。該第２の溶液は、単鎖ＤＮＡの環状テンプレート５２を含有する溶液である。
本発明の発明者は、環状テンプレート５２として、オリゴヌクレオチドを合成して環状にしたものを使用した。
そして、前記先端部１６を第２の溶液に浸した状態で、図５（ａ）に示されるように、環状テンプレート５２のアニールを定温（等温）で行う。該アニールは、熱サイクル（thermal cycle ）を必要とせず、室温で行うことができる。さらに、前記先端部１６を第２の溶液に浸した状態で、図５（ｂ）に示されるように、その場で（in situ ）行うＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物５３を生成する。ＲＣＡ法は、熱サイクルを必要とせずに等温で行うことができる強力なＤＮＡの増幅方法であって、室温で行うことができ、１時間に十億倍程度の増幅率を達成し得る。
本発明の発明者は、３０〔℃〕の環境下で２時間に亘（わた）ってＲＣＡ法を行い、非常に長い（例えば、１００キロベース〔ｋＢ〕以上）単鎖ＤＮＡ生成物５３を生成することができた。
そして、前記先端部１６に所定の電圧を印加することによって、先端部１６間を伸張したＤＮＡ分子によって橋渡しさせることができ、図６（ａ）に示されるように、ＤＮＡ橋５４を形成することができる。該ＤＮＡ橋５４は、複数の単鎖ＤＮＡ分子を含むものであって、ＤＮＡが束になっている。また、ＤＮＡ橋５４は、二本鎖ＤＮＡ分子を含むＤＮＡの束であってもよい。
本発明の発明者は、先端部１６に高周波のＡＣ電圧（例えば、１〔ＭＨｚ〕、１〔ＭＶ／ｍ〕）を印加して強い電場を生成し、ＤＮＡ分子を伸張し、誘電泳動（ＤＥＰ：ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）させ、左右の先端部１６に引き付け、これにより、ＤＮＡ橋５４を形成した。両端が左右の先端部１６に固定されたＤＮＡ橋５４として、１５〔μｍ〕以上の長いＤＮＡ橋５４を得ることができた。なお、図７は、左右の先端部１６の間隔が６〔μｍ〕の場合に、実際に形成されたＤＮＡ橋５４の写真であって、先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２の外に出して撮影した写真である。
そして、ナノ鉗子装置１０をそのまま使用して、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行うことができる。該性質決定は、ＤＮＡの機械的性質、又は、ＤＮＡの電気的性質に基づいてリアルタイムで行われる。
具体的には、ＤＮＡ橋５４を形成した後、可動保持台４２ａを図２（ａ）における右方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内の第２の溶液から抜き出す際に、具体的には、ナノ鉗子装置１０の櫛歯アクチュエータ１７を作動させて移動先端部１６ａと固定先端部１６ｂとの間隔を所定の周波数で変化させ、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡに振動を付与し、該ＤＮＡの共振周波数を計測することによって、前記ＤＮＡの性質決定を行うことができる。
例えば、図６（ｂ）〜（ｄ）に示されるように、ＤＮＡの鎖同士が架橋結合（cross-linking ）５５によって結合している場合、その共振周波数は、結合形態に応じて変化すると考えられるので、あらかじめ計測した架橋結合５５のないＤＮＡの共振周波数、架橋結合５５によって特定の結合形態になっているＤＮＡの共振周波数等に基づいて、ＤＮＡ橋５４のＤＮＡがどのような結合形態を備えているのかを判別することができる。具体的には、図６（ｂ）に示されるように架橋結合５５によって単鎖ＤＮＡ分子が鎖内で結合している場合、図６（ｃ）に示されるように架橋結合５５によって単鎖ＤＮＡ分子が鎖間で結合している場合、及び、図６（ｄ）に示されるように架橋結合５５によって二本鎖ＤＮＡ分子が鎖間及び鎖内で結合している場合では、それぞれ、共振周波数が異なるから、図６（ｂ）〜（ｄ）に示される場合のいずれに該当するのかを判別することもできる。
また、ナノ鉗子装置１０の一対の先端部１６間に印加される電圧及び供給される電流の変化に基づいて、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの電気導電率の変化を計測することによって、前記ＤＮＡの性質決定を行うことができる。さらに、先端部１６間をＤＮＡが橋渡しする前、すなわち、ＤＮＡ橋５４が形成される前とでは、電気導電率が異なるから、蛍光体等の標識物質を使用することなく、ＤＮＡ橋５４が形成されたこと乃至ＤＮＡ分子の存在を検出することができる。
次に、本発明の発明者が行ったＤＮＡの性質決定の結果について説明する。まず、ＤＮＡの機械的性質に基づく性質決定の結果について説明する。
図８は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数シフトを示すグラフ、図９は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数の時間変化を示すグラフである。
前述の方法によって先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたと考えられる腕部材１５の共振周波数を計測し、該共振周波数を、図４（ａ）に示されるように、先端部１６に何も付着していない初期状態の腕部材１５の共振周波数と比較することによって、実際に先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否かを、in situ で確認することができる。すなわち、ＤＮＡの検出をin situ で行うことができる。
図８には、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０を使用して行った腕部材１５の共振周波数の計測結果が示されている。ナノ鉗子装置１０の櫛歯アクチュエータ１７を作動させ、腕部材１５の先端部１６間の間隔を変化させる周波数を変化させ、周波数毎の振幅の変化を測定した。図において、○は、ＤＮＡがない状態、すなわち、先端部１６に何も付着していない初期状態の計測値を示し、■は、ss DNA bundle の状態、すなわち、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態の計測値を示している。なお、図において、横軸は共振周波数〔ｋＨｚ〕を示し、縦軸は振幅〔ｍＶ〕を示している。
図８から分かるように、先端部１６に何も付着していない初期状態では、共振周波数が１３７７．７５〔Ｈｚ〕であるのに対し、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態では、共振周波数が１６６９．３９〔Ｈｚ〕である。
したがって、前述の方法によって先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたと考えられる腕部材１５の共振周波数を計測して、図８を参照することによって、実際に先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否かを、in situ で確認することができる。
また、前述の方法によって先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成される途中及びＤＮＡ橋５４が形成された後において、ＤＮＡの機械的性質は、時間の経過とともに変化することが分かった。
図９には、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０を使用して計測したＤＮＡ橋５４の共振周波数の時間変化が示されている。図において、○は、ＤＮＡがない状態、すなわち、先端部１６に何も付着していない初期状態の計測値を示し、■は、ss DNA bundle の状態、すなわち、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態の計測値を示している。なお、図において、横軸は経過時間〔ｓ〕を示し、縦軸は共振周波数〔ｋＨｚ〕を示している。
図９から分かるように、ＤＮＡ橋５４が形成された場合であっても、先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内に入れ、該微小空間３２内に収容されている溶液に浸す、すなわち、In solution の状態にする前は、先端部１６に何も付着していないのであるから、初期状態と同様の共振周波数である。そして、先端部１６が溶液に浸された状態で前述の方法が行われると、先端部１６間がＤＮＡ分子によって橋渡しされてＤＮＡ橋５４が形成されるので、共振周波数が上昇する。そして、先端部１６を微小空間３２内に収容されている溶液から出し始める、すなわち、Removal が開始される時には、共振周波数が相当程度上昇する。そして、先端部１６が微小空間３２内に収容されている溶液の外に出て静電泳動が停止しても、すなわち、DEP stopped になっても、さらに、先端部１６が完全に大気中にあっても、すなわち、In airの状態になっても、共振周波数は、時間の経過とともに上昇し続ける。
次に、ＤＮＡの電気的性質に基づく性質決定の結果について説明する。
図１０は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの電気導電率を示す第１のグラフ、図１１は本発明の第１の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡの電気導電率を示す第２のグラフである。
前述の方法によって先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたと考えられる腕部材１５の先端部１６間に電圧を印加したときに流れる電流を計測し、該電流を、図４（ａ）に示されるように先端部１６に何も付着していない初期状態の先端部１６間に電圧を印加したときに流れる電流と比較することによって、実際に先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否かを、in situ で確認することができる。すなわち、ＤＮＡの検出をin situ で行うことができる。
図１０には、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０を使用して行った先端部１６間に電圧を印加したときに流れる電流の計測結果が示されている。ナノ鉗子装置１０の先端部１６間に印加される電圧を変化させ、電圧毎の電流値を測定した。図において、○は、ＤＮＡがない状態、すなわち、先端部１６に何も付着していない初期状態の計測値を示し、■は、ss DNA bundle の状態、すなわち、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態の計測値を示している。なお、図において、横軸は電圧〔Ｖ〕を示し、縦軸は電流〔ｍＡ〕を示している。
また、図１０中には、電流の単位を〔ｍＡ〕から〔ｐＡ〕に変えて縦軸のスケールを拡大したグラフが枠に囲まれて示されている。これは、先端部１６に何も付着していない初期状態では、電流の変化量が小さく、電流の単位が〔ｍＡ〕の縦軸では、全く変化しないように見えてしまうからである。
図１０から分かるように、先端部１６に何も付着していない初期状態では、電圧を上昇させても電流があまり大きく増加せず、例えば、電圧を５〔Ｖ〕にまで上昇させても電流は３〔ｐＡ〕に届かないのに対し、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態では、電圧を上昇させると電流が大きく増加し、例えば、電圧を５〔Ｖ〕にまで上昇させると電流が１．７〔ｍＡ〕を超えるほどになる。
したがって、前述の方法によってＤＮＡ橋５４が形成されたと考えられる先端部１６間に電圧を印加して電流を計測して、図１０を参照することによって、実際に先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否かを、in situ で確認することができる。
ところで、リアルタイムでＤＮＡ橋５４の形成を確認するという観点からは、ＤＮＡ橋５４が形成される直前の段階と比較することが望ましい。つまり、図４（ａ）に示されるような先端部１６に何も付着していない初期状態でなく、図４（ｂ）に示されるような先端部１６にプライマー５１が固定された状態と比較することが望ましい。
図１１には、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０を使用して行った先端部１６間に電圧を印加したときに流れる電流の他の計測結果が示されている。ナノ鉗子装置１０の先端部１６間に印加される電圧を変化させ、電圧毎の電流値を測定した。図において、●は、primer の状態、すなわち、先端部１６にプライマー５１としての５’−チオール−モディファイドＲＣＡプライマーが固定された状態の計測値を示し、■は、rinsed ss DNA bundleの状態、すなわち、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態であって、ＤＮＡ橋５４を純水に浸してリンス（洗浄）した状態の計測値を示している。なお、図において、横軸は電圧〔Ｖ〕を示し、縦軸は電流〔ｐＡ〕を示している。
図１０及び１１から分かるように、先端部１６にプライマー５１が固定された状態では、電圧を上昇させても電流があまり大きく増加しないのに対し、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態では、電圧を上昇させると電流が大きく増加する。
したがって、前述の方法によってＤＮＡ橋５４が形成されたと考えられる先端部１６間に電圧を印加して電流を計測して、図１０及び１１を参照することによって、実際に先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否かを、in situ で確認することができる。
また、図１１に示されるように、ＤＮＡ橋５４を純水に浸してリンスした状態では、電圧を上昇させても電流があまり大きく増加しないのに対し、図１０に示されるように、ＤＮＡ橋５４をリンスしない状態では、電圧を上昇させると電流が大きく増加する。これは、ＤＮＡ橋５４をリンスしない状態では、ＤＮＡ橋５４に塩が付着しているために、電気導電率が高くなっているからである。ＤＮＡ橋５４を純水に浸してリンスすることによって、ＤＮＡ橋５４に付着した塩が除去されるので、ＤＮＡ橋５４自体の電気導電率を計測することができる。
このように、本実施の形態におけるＤＮＡの検出方法は、一対の電極として腕部材１５の先端部１６を備える検出装置であるナノ鉗子装置１０を使用する方法であって、先端部１６にプライマー５１を固定し、単鎖ＤＮＡの環状テンプレート５２を含有する溶液内に先端部１６を浸し、環状テンプレート５２をアニールし、ＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物５３を生成することにより、所定の電圧を印加した先端部１６間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、複数の単鎖ＤＮＡ分子を含む先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行うこと、を含む方法である。
これにより、ＤＮＡを、蛍光体等の標識物質を使用することなく、容易に、かつ、確実に検出することができる。
なお、先端部１６の少なくとも一部は金で被覆されていることが望ましい。
また、伸張したＤＮＡによる先端部１６間の橋渡しは、定温で行われる。したがって、従来の検出方法で行われているようなＤＮＡを増幅させるために溶液等の温度を変化させる温度サイクル操作が不要となるので、容易にＤＮＡを検出することができる。
さらに、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数に基づいて行われる。より具体的には、先端部１６間の間隔を所定の周波数で変化させることによって行われる。これにより、ＤＮＡの検出をin situ で行うことができる。
また、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡは束になっている。さらに、このＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子を含む束になっている。
さらに、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの導電性に基づいて行われる。これにより、ＤＮＡの検出をin situ で行うことができる。
さらに、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡのリアルタイム計測によって行われる。したがって、時間経過に伴うＤＮＡの性質変化を把握することができる。
さらに、単鎖の相補的ＤＮＡが生成されるように、対向する先端部１６には異なるプライマー５１を固定することもできる。生成された単鎖ＤＮＡ同士は、相補的であるため、二本鎖ＤＮＡを形成する。したがって、合成された二本鎖ＤＮＡの性質変化を把握することができる。
さらに、複数対の先端部１６を、例えば、厚さ方向に並べるようにして、並列に配置し、異なるプライマー５１を固定することによって、プライマー５１に相互作用するそれぞれのテンプレートからＤＮＡの増幅、橋渡し、性質決定を行うことができる。
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、前記第１の実施の形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図１２は本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡに金の微粒子を被覆させる方法を説明する図、図１３は本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡに金の微粒子を被覆させた状態を示す顕微鏡写真、図１４は本発明の第２の実施の形態におけるナノ鉗子装置の腕部材の先端部間を橋渡しするＤＮＡにパラジウムの微粒子を被覆させた状態の電気導電率を示すグラフである。なお、図１２において、（ａ）は先端部に橋渡ししたＤＮＡを示す図、（ｂ）は金の微粒子を被覆させたＤＮＡを示す図であり、図１３において、（ａ）はＤＮＡがない状態の写真、（ｂ）及び（ｃ）はＤＮＡに金の微粒子を被覆させた第１及び第２の状態の写真である。
本実施の形態においては、図１２（ｂ）に示されるように、ナノ鉗子装置１０の腕部材１５の先端部１６間を橋渡しするＤＮＡに金（Ａｕ）から成る微粒子５７を被覆させ、これにより、前記先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの存在を確認する。
なお、ナノ鉗子装置１０及び溶液収容装置３０の構成は、前記第１の実施の形態と同様であるので、その説明を省略する。また、ナノ鉗子装置１０の腕部材１５の先端部１６間をＤＮＡによって橋渡しさせ、図１２（ａ）に示されるように、ＤＮＡ橋５４を形成するまでの動作についても、前記第１の実施の形態と同様であるので、その説明を省略する。なお、図１２（ａ）は、前記第１の実施の形態において説明した図６（ａ）と同様のものである。
図１２（ａ）に示されるように、先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されると、可動保持台４２ａを図２（ａ）における右方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内から出した後、該微小空間３２内に収容されている第２の溶液を、該第２の溶液と異なる第３の溶液と入れ替える。そして、可動保持台４２ａを再度図２（ａ）における左方向に移動させ、前記先端部１６を溶液収容装置３０の微小空間３２内に入れ、該微小空間３２内に収容されている第３の溶液に浸す。
該第３の溶液は、金の微粒子５７を含有する溶液である。前記微粒子５７は、ナノ粒子（nanoparticle）であって、直径が１〜１００〔ｎｍ〕程度の超微粒子である。そして、前記第３の溶液には、例えば、３〜３０〔ｎｇ／μｌ〕程度の割合で、微粒子５７が含有されている。
これにより、図１２（ｂ）に示されるように、前記先端部１６間に形成されたＤＮＡ橋５４が金の微粒子５７によって被覆される。金の微粒子５７によって被覆されたＤＮＡ橋５４は、被覆されていないＤＮＡ橋５４と比較して、視認が容易であるとともに、電気導電率が高い（導電抵抗が低い）。したがって、顕微鏡写真を撮影したり、先端部１６間に電圧を印加して流れる電流を計測したりすることによって、先端部１６間にＤＮＡ橋５４が形成されたか否か、すなわち、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの存在を容易に確認することができる。
本発明の発明者は、第３の溶液として、３〔ｎｇ／μｌ〕の割合で、金の微粒子５７が含有されている溶液、及び、３０〔ｎｇ／μｌ〕の割合で、金の微粒子５７が含有されている溶液を使用することによって、先端部１６間に形成されたＤＮＡ橋５４に金の微粒子５７を被覆した。図１３は、左右の先端部１６の間隔が６〔μｍ〕の場合に、実際に形成されたＤＮＡ橋５４の写真であって、図１３（ａ）は、ＤＮＡ橋５４が形成される前の状態を示し、図１３（ｂ）は、３〔ｎｇ／μｌ〕の割合で金の微粒子５７が含有されている溶液に浸してＤＮＡ橋５４に金の微粒子５７を被覆した状態を示し、図１３（ｃ）は、３０〔ｎｇ／μｌ〕の割合で金の微粒子５７が含有されている溶液に浸してＤＮＡ橋５４に金の微粒子５７を被覆した状態を示している。なお、図１３（ａ）に示されるように、左右の先端部１６の間隔は、６〔μｍ〕である。
図１３（ｂ）に示されるように、金の微粒子５７が被覆されたＤＮＡ橋５４は、視認が容易になっていることが分かる。また、図１３（ｂ）と（ｃ）とを比較すると、金の微粒子５７の含有量の多い溶液に浸した場合の方がＤＮＡ橋５４を被覆する金の微粒子５７の量が多いので、視認がより容易になっていることが分かる。
また、先端部１６間に電圧を印加して流れる電流を計測し、前記先端部１６間の導電抵抗を算出したところ、図１３（ａ）に示される場合が２６〔ＴΩ〕、図１３（ｂ）に示される場合が６９２〔ＧΩ〕、図１３（ｃ）に示される場合が３９０〔ＧΩ〕であった。
このことから、金の微粒子５７によって被覆されたＤＮＡ橋５４は、被覆されていないＤＮＡ橋５４と比較して、導電抵抗が桁（けた）違いに低く、検出が容易であることが分かる。また、ＤＮＡ橋５４を被覆する金の微粒子５７の量が多い方が、導電抵抗がより低いので、検出がより容易であることが分かる。
ところで、ＤＮＡに被覆する微粒子５７の材料は、必ずしも金である必要はなく、その他の導電性の材料であってもよく、例えば、パラジウム（Ｐｄ）であってもよい。
本発明の発明者は、第３の溶液として、パラジウムの微粒子５７が含有されている溶液を使用することによって、先端部１６間に形成されたＤＮＡ橋５４にパラジウムの微粒子５７を被覆した。図１４には、本発明の発明者が実際に製作したナノ鉗子装置１０を使用して行った先端部１６間に電圧を印加したときに流れる電流の計測結果が示されている。ナノ鉗子装置１０の先端部１６間に印加される電圧を変化させ、電圧毎の電流値を測定した。図には、ss DNA bundle の状態、すなわち、先端部１６間に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態の計測値、DNA coated with Pdの状態、すなわち、先端部１６間に形成されたＤＮＡ橋５４がパラジウムの微粒子５７で被覆された状態、及び、rinsed DNA coated with Pd の状態、すなわち、先端部１６間に形成されたＤＮＡ橋５４がパラジウムの微粒子５７で被覆された状態であって、該微粒子５７で被覆されたＤＮＡ橋５４を純水に浸してリンス（洗浄）した状態の計測値を示している。なお、図において、横軸は電圧〔Ｖ〕を示し、縦軸は電流〔ｐＡ〕を示している。
図１４から分かるように、先端部１６に単鎖ＤＮＡ分子が束になったＤＮＡ橋５４が形成された状態では、電圧を上昇させても電流があまり大きく増加しないのに対し、ＤＮＡ橋５４がパラジウムの微粒子５７で被覆された状態では、電圧を上昇させると電流が大きく増加する。なお、リンスをした状態では、ＤＮＡ橋５４に付着した塩が除去されるので、電気導電率が低くなっている。
このように、本実施の形態におけるＤＮＡの検出方法は、一対の電極として腕部材１５の先端部１６を備える検出装置であるナノ鉗子装置１０を使用する方法であって、先端部１６にプライマー５１を固定し、単鎖ＤＮＡの環状テンプレート５２を含有する溶液内に先端部１６を浸し、環状テンプレート５２をアニールし、ＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物５３を生成することにより、所定の電圧を印加した先端部１６間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡに導電性の微粒子５７を被覆し、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの存在を確認すること、を含む方法である。
これにより、先端部１６間を橋渡しするＤＮＡの存在を容易に、かつ、確実に確認することができる。
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。なお、第１及び第２の実施の形態と同じ構造を有するものについては、同じ符号を付与することによってその説明を省略する。また、前記第１及び第２の実施の形態と同じ動作及び同じ効果についても、その説明を省略する。
図１５は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの概念図、図１６は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの写真、図１７は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスの電極ユニットを示す図、図１８は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルユニットを示す図、図１９は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのマイクロチャネルユニットの突起構造部の顕微鏡写真、図２０は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのＤＮＡ捕獲部を示す図、図２１は本発明の第３の実施の形態におけるマイクロ流体デバイスのＤＮＡ捕獲部の顕微鏡写真である。なお、図１６において、（ａ）はマイクロ流体デバイスの全体を示す写真、（ｂ）は電極ユニットを示す写真、（ｃ）は電極先端部を示す写真であり、図１７において、（ａ）は電極ユニットの全体を示す図、（ｂ）は電極ユニットの中央部拡大図であり、図１８において、（ａ）はマイクロチャネルユニットの全体を示す図、（ｂ）はマイクロチャネルユニットの中央部拡大図であり、図１９において、（ａ）は突起構造部の顕微鏡写真、（ｂ）は（ａ）の写真に突起構造部の外周を示す黒線を付加した写真であり、図２０において、（ａ）はＤＮＡ捕獲部の全体を示す図、（ｂ）はＤＮＡ捕獲部の中央部拡大図であり、図２１において、（ａ）はＤＮＡがない状態の写真、（ｂ）は蛍光染色したＤＮＡを捕獲した状態の写真である。
本実施の形態においては、図１６（ａ）に示されるようなマイクロ流体デバイスを使用してＤＮＡを検出する。該マイクロ流体デバイスは、図１７に示されるような電極ユニット６１、及び、図１８に示されるようなマイクロチャネルユニット７０であって前記電極ユニット６１と統合されたマイクロチャネルユニット７０を有する。より具体的には、前記マイクロ流体デバイスは、一方の表面に金（Ａｕ）から成る電極ユニット６１がパターン形成されたカバーガラスと、前記マイクロチャネルユニット７０が形成され、前記カバーガラスに重ね合わされたポリマー製の板とを有する。なお、図１６（ａ）に示される例において、カバーガラスは、縦２６〔ｍｍ〕、横３６〔ｍｍ〕の矩形の透明なガラス板である。
前記電極ユニット６１は、互いに同じ形状を有する一対の第１電極ユニット６１ａ及び第２電極ユニット６１ｂから成る。そして、第１電極ユニット６１ａと第２電極ユニット６１ｂとは、図１７に示されるように、互いに向き合って配設され、これにより、電極ユニット６１は、全体としてほぼ左右対称の形状を有する。
前記第１及び第２電極ユニット６１ａ、６１ｂは、それぞれ、第１及び第２接続パッド６２ａ、６２ｂと、該第１及び第２接続パッド６２ａ、６２ｂに基端が接続された第１及び第２軸部６３ａ、６３ｂと、該第１及び第２軸部６３ａ、６３ｂの先端に接続された第１及び第２櫛部６４ａ、６４ｂと、該第１及び第２櫛部６４ａ、６４ｂが含む複数の第１及び第２歯部６５ａ、６５ｂと、該第１及び第２歯部６５ａ、６５ｂの各々の先端から突出する第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂとを備える。
前記第１及び第２接続パッド６２ａ、６２ｂは、縦及び横が３〔ｍｍ〕の正方形の部分であり、図１６（ａ）に示されるような外部の電源に他端が接続されたテープ状の導電線の先端が接続される部分である。また、前記第１及び第２軸部６３ａ、６３ｂは、幅が２００〔μｍ〕の帯状の部分である。さらに、前記第１及び第２歯部６５ａ、６５ｂは、幅の狭い直線的な帯状の部分であり、前記第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂは、第１及び第２歯部６５ａ、６５ｂよりも幅の狭い直線的な帯状の部分である。
そして、対応する第１歯部６５ａと第２歯部６５ｂとは互いに平行となるように配置され、かつ、対応する第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとは互いに平行となるように配置される。対応する第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間隔は、図１６（ｃ）に示されるように、４〔μｍ〕である。
また、前記マイクロチャネルユニット７０は、図１８に示されるように、第１及び第２接続部７４ａ、７４ｂと、第１接続部７４ａと第２接続部７４ｂとを連結する直線的なマイクロチャネル７１と、該マイクロチャネル７１の中央部においてマイクロチャネル７１の両側縁から突出するように形成された複数の突起構造部７３とを備える。
前記第１及び第２接続部７４ａ、７４ｂは、縦及び横が３〔ｍｍ〕の正方形の部分であり、図１６（ａ）に示されるような外部の溶液供給口及び溶液排出口に他端が接続されたチューブの先端が、パイプ状の金具を介して接続される部分である。また、前記マイクロチャネル７１は、前記第１の溶液、第２の溶液、第３の溶液等の溶液や純水、すなわち、流体を流すための流路であって、幅が７０〔μｍ〕、厚さ（深さ）が３〔μｍ〕の直線的な帯状の部分である。さらに、前記突起構造部７３は、マイクロチャネル７１の両側縁から外方に突出するように、かつ、左右対称となるように形成された部分であって、互いに対向する一対の突起構造部７３の先端同士の間隔は１０５〔μｍ〕となっている。各突起構造部７３は、マイクロチャネル７１と連通する空洞であるから、マイクロチャネル７１内を流れる流体によって満たされる。
そして、前記電極ユニット６１とマイクロチャネルユニット７０とは、図２０に示されるように組み合わされる。具体的には、第１及び第２歯部６５ａ、６５ｂ並びに第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂの延在する方向とマイクロチャネル７１の延在する方向とが直交し、対応する第１歯部６５ａの先端と第２歯部６５ｂの先端との間をマイクロチャネル７１が通過し、一対の第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂが、少なくとも部分的に、一対の突起構造部７３と重なり合うように、前記電極ユニット６１とマイクロチャネルユニット７０とは組み合わされる。
このように電極ユニット６１とマイクロチャネルユニット７０とを組み合わせたマイクロ流体デバイスにおいて、図１５に示されるように、マイクロチャネル７１に矢印７２で示される方向に溶液を流しつつ、電極ユニット６１に所定の電圧を印加することによって、互いに対応する第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間にＤＮＡ橋５４を形成することができる。
なお、マイクロチャネル７１内を溶液が流れているので、互いに対応する第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間にＤＮＡ橋５４が形成されても、該ＤＮＡ橋５４は、溶液の流れによって前記第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂから離脱して流されてしまうことがある。しかし、突起構造部７３内では溶液が滞留するので、図１５に示されるように、突起構造部７３と対応する箇所に位置する第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間に形成されたＤＮＡ橋５４は、流されることがない。
また、マイクロチャネル７１内を流れる溶液を、例えば、第１の溶液から第２の溶液に取り替えたり、リンスのための純水に取り替えたりすることにより、第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂが浸される溶液又は流体を容易に交換することができる。
このようなマイクロ流体デバイスを使用することにより、前記第１及び第２の実施の形態と同様の方法で、第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間をＤＮＡによって橋渡しさせることができる。
本発明の発明者は、実際に前記マイクロ流体デバイスを使用して予備的実験を行うことによって、第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間をＤＮＡにより橋渡しさせることが可能であることを確認した。なお、前記予備的実験では、ＤＮＡの増幅を行わなかった。また、前記予備的実験で使用したマイクロ流体デバイスでは、電極ユニット６１とマイクロチャネルユニット７０との組み合わせが完璧でなく、図２１（ａ）に示されるように、一対の第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂと、一対の突起構造部７３とが完全には重なり合っていない。さらに、前記予備的実験では、便宜的に、ＹＯＹＯ−１と呼ばれる蛍光色素によって標識付けを行い、蛍光を観察することにより、図２１（ｂ）における点線の楕（だ）円内に示されるように、第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間を橋渡しするＤＮＡの存在を確認した。
このように、本実施の形態におけるＤＮＡの検出方法では、一対の電極として一対の第１及び第２電極先端部６６ａ、６６ｂを備える電極ユニット６１とマイクロチャネルユニット７０とを組み合わせたマイクロ流体デバイスを使用する。そして、前記第１及び第２の実施の形態において説明した方法と同様の方法によって、一対の第１電極先端部６６ａと第２電極先端部６６ｂとの間を伸張したＤＮＡにより橋渡しさせ、該ＤＮＡの性質決定を行うことや、前記ＤＮＡの存在を確認することができる。
これにより、ＤＮＡを容易に、かつ、確実に検出することができる。
前記第１〜第３の実施の形態において説明したように、本発明は、ＤＮＡを容易に、かつ、確実に検出することができるＤＮＡの検出方法に関するものである。したがって、本発明は、蛍光体等の標識物質を使用することのない突然変異及び病原体の検出、遺伝子型判定から、種々のＤＮＡ相互作用因子（例えば、架橋結合化学物質）及び照射のような物理的効果に対応した配列特異ＤＮＡの物理的性質決定までの広汎（はん）な分野に適用することができる。配列特異ＤＮＡの物理的性質決定は、トランスレーショナルリサーチ（例えば、癌（がん）治療薬の機能確認）及び環境試験に直接的に適用し得る。本発明は、単一のプラットホームにおいて、ＤＮＡの検出と物性分析とを可能にするものである。
なお、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づいて種々変形させることが可能であり、それらを本発明の範囲から排除するものではない。
本発明は、ＤＮＡの検出方法に適用することができる。
１０ ナノ鉗子装置
１６ 先端部
５１ プライマー
５２ 環状テンプレート
５３ 単鎖ＤＮＡ生成物
５７ 微粒子

Claims (13)

  1. 少なくとも一対の電極を備える検出装置を使用するＤＮＡの検出方法であって、
    （ａ）前記電極にプライマーを固定し、
    （ｂ）単鎖ＤＮＡの環状テンプレートを含有する溶液内に前記電極を浸し、前記環状テンプレートをアニールし、ＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物を生成することにより、所定の電圧を印加した前記電極間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、
    （ｃ）複数の単鎖ＤＮＡ分子を含む前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定を行うこと、
    を含むことを特徴とするＤＮＡの検出方法。
  2. 前記電極の少なくとも一部は金で被覆されている請求項１に記載のＤＮＡの検出方法。
  3. 前記伸張したＤＮＡによる前記電極間の橋渡しは、定温で行われる請求項１又は２に記載のＤＮＡの検出方法。
  4. 前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの共振周波数に基づいて行われる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  5. 前記電極間の間隔を所定の周波数で変化させる請求項４に記載のＤＮＡの検出方法。
  6. 前記電極間を橋渡しするＤＮＡは束になっている請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  7. 前記電極間を橋渡しするＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子を含む束になっている請求項６に記載のＤＮＡの検出方法。
  8. 前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡの導電性に基づいて行われる請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  9. 前記電極間を橋渡しするＤＮＡの性質決定は、前記電極間を橋渡しするＤＮＡのリアルタイム計測によって行われる請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  10. 単鎖の相補的ＤＮＡが生成されるように、対向する電極には異なるプライマーを固定する請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  11. 複数の電極対に複数のプライマーを固定することによって、複数のＤＮＡの性質決定を行う請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡの検出方法。
  12. 少なくとも一対の電極を備える検出装置を使用するＤＮＡの検出方法であって、
    （ａ）前記電極にプライマーを固定し、
    （ｂ）単鎖ＤＮＡの環状テンプレートを含有する溶液内に前記電極を浸し、前記環状テンプレートをアニールし、ＲＣＡ法によって単鎖ＤＮＡ生成物を生成することにより、所定の電圧を印加した前記電極間を伸張したＤＮＡによって橋渡しさせ、
    （ｃ）前記電極間を橋渡しするＤＮＡに導電性の微粒子を被覆し、
    （ｄ）前記電極間を橋渡しするＤＮＡの存在を確認すること、
    を含むことを特徴とするＤＮＡの検出方法。
  13. 複数の電極対に複数のプライマーを固定することによって、複数のＤＮＡの存在を確認する請求項１２に記載のＤＮＡの検出方法。
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