JP6343492B2 - 細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法に関するものである。

細胞培養技術は、創薬、再生医療などの種々の分野で有用な技術として近年注目されている。足場依存性の細胞を培養する際には、細胞の足場となる基材が用いられる。細胞培養の際に用いる基材においては、当該基材の表面の化学的な性質だけでなく、微細な物理的形状が重要であることが知られている。このような基材として、表面に微細な凹凸形状を形成した高分子材料から成る基材が知られており、高分子材料からなる基材に微細な凹凸形状を形成するために、種々の方法が知られている。具体的には、例えば、結露法、ナノインプリント法、リソグラフィ法、およびエマルジョン法等が提案されている（特許文献１参照）。

特開２００９−２４２４９５号公報 特開２００２−３４７１０７号公報 特開２００７−８９７３７号公報 特開２００５−１５２５２６号公報 国際公開第２００８／００１８６５号パンフレット 国際公開第２００６／１１８２４８号パンフレット

しかしながら、従来知られる細胞培養用基材の製造方法は、いずれの方法も煩雑で多くの工程を有するという問題があり、製造コストを抑えることが困難であった。また、従来の方法によれば、一般に、裏面まで貫通する孔を有する多孔質膜の製造は困難であった。貫通孔を有する多孔質膜を用いて細胞培養を行なう場合には、多孔質膜の表裏それぞれの面を用いて細胞を培養することが可能になる。そのため、例えば表裏それぞれで異なる種類の細胞を培養することが可能になり、細胞培養技術の用途がさらに広がることが期待されるため、貫通孔を有する細胞培養シートの開発が望まれていた。特に、従来は、孔径が１０μｍ未満である貫通孔を有する細胞培養用の多孔質膜の製造方法は知られていなかった。一般的な細胞の大きさは約１０μｍ程度であるため、孔径が１０μｍ未満の貫通孔を有する多孔質膜を用いれば、異種細胞間の相互作用を解析することが可能になると考えられる。したがって、孔径が１０μｍ未満の貫通孔を有する多孔質膜の開発が望まれていた。

また、表面に微細な凹凸形状が形成された多孔質膜の中には、細胞増殖抑制効果を有することが知られている膜がある(例えば、特許文献４参照)。多孔質膜が、細胞増殖抑制効果として例えば癌細胞増殖抑制効果を有する場合には、癌の治療用、癌の再発・転移の防止用、あるいは癌の研究用等の用途を期待することができる。そのため、このような細胞増殖抑制効果を有する多孔質膜として、簡便な製造工程により製造可能な膜が望まれていた。

本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することが可能である。
本発明の一形態は、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって；基板上に、未硬化であって、少なくともポリオールとイソシアネートとを含むポリウレタン原料の層を形成する第１の工程と；前記基板上に形成された前記ポリウレタン原料の層における前記基板から離間した露出面に対して水蒸気の供給を行なって、前記ポリウレタン原料の層において、前記ポリウレタン原料の硬化を進行させると共に複数の凹凸を前記露出面に有する多孔質形状を形成させる第２の工程と；を備える。前記第２の工程によって前記ポリウレタン多孔質膜に形成される前記多孔質形状は、前記露出面で開口する複数の発泡孔によって形成され、前記ポリウレタン多孔質膜では、膜厚方向には単一の発泡孔が存在し、前記ポリウレタン多孔質膜の厚さが０．１〜１００μｍである。このような形態であれば、ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給するという簡便な方法により、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いることができ、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を製造できる。その結果、ポリウレタン多孔質膜の製造コストを抑えることができる。
その他、本発明は、以下のような形態として実現することも可能である。

（１）本発明の一形態によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法が提供される。このポリウレタン多孔質膜の製造方法は、基板上に、未硬化であるポリウレタン原料の層を形成する第１の工程と、前記基板上に形成された前記ポリウレタン原料の層における前記基板から離間した露出面に対して水蒸気の供給を行なって、前記ポリウレタン原料の層において、前記ポリウレタン原料の硬化を進行させると共に複数の凹凸を前記露出面に有する多孔質形状を形成させる第２の工程と、を備える。
この形態の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給するという簡便な方法により、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜を製造できる。その結果、ポリウレタン多孔質膜の製造コストを抑えることができる。

（２）上記（１）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第２の工程によって前記ポリウレタン多孔質膜に形成される前記多孔質形状は、前記露出面で開口する複数の発泡孔によって形成され、前記ポリウレタン多孔質膜では、膜厚方向には単一の発泡孔が存在することとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。

（３）上記（２）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記ポリウレタン多孔質膜の厚さが０．１〜１００μｍであることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。

（４）上記（３）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第１の工程で形成する前記層における前記ポリウレタン原料の組成、前記第２の工程における反応温度、および前記第２の工程における反応時間から選択される条件を調節することにより、前記ポリウレタン多孔質膜の厚さを０．１〜１００μｍにすることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を容易に得ることができる。

（５）上記（２）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記ポリウレタン多孔質膜は、前記露出面における平均細孔径が０．１〜１００μｍであることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。

（６）上記（５）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第２の工程における反応温度、前記第２の工程における反応時間、および前記第２の工程において前記露出面に対して供給する水蒸気量から選択される条件を調節することにより、前記ポリウレタン多孔質膜の前記露出面における平均細孔径を０．１〜１００μｍにすることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を容易に得ることができる。

（７）上記（１）から（６）までのいずれか１項に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第２の工程は、前記多孔質形状として、前記露出面で開口する複数の発泡孔によって形成され、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を有する多孔質形状を形成することとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。また、膜の両面を培養細胞の足場として使用可能なポリウレタン多孔質膜を得ることができると共に、このようなポリウレタン多孔質膜を用いることで、各々の面上の細胞間で相互作用が生じる態様の細胞培養が可能になる。

（８）上記（７）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第１の工程で形成する前記層における前記ポリウレタン原料の組成、前記第２の工程における反応温度、および前記第２の工程における反応時間から選択される条件を調節することにより、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として、前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を形成することとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。また、膜の両面を培養細胞の足場として使用可能なポリウレタン多孔質膜を得ることができると共に、このようなポリウレタン多孔質膜を用いることで、各々の面上の細胞間で相互作用が生じる態様の細胞培養が可能になる。

（９）上記（７）に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、前記第１の工程は、少なくともポリオールとイソシアネートとを含む前記ポリウレタン原料を混合する混合工程と、前記混合工程において混合した前記ポリウレタン原料を層状に形成する層形成工程と、を備え、前記混合工程の後に前記層形成工程を行なうまでの時間と、前記混合工程の後に前記層形成工程を行なうまでの間の前記ポリウレタン原料の環境温度と、から選択される条件を調節することにより、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として、前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を形成することとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。

（１０）上記（１）から（９）までのいずれか１項に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法において、さらに、前記第２の工程の後に、前記水蒸気の供給を停止して、前記ポリウレタン原料の硬化をさらに進行させる第３の工程を備えることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、露出面における平均細孔径をより小さくしつつ、露出面で開口する孔の孔径のバラツキがより小さいポリウレタン多孔質膜を得ることが可能になる。

（１１）上記（１）から（１０）までのいずれか１項に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法により製造されるポリウレタン多孔質膜において、前記ポリウレタン多孔質膜は、前記発泡孔として、前記露出面よりも前記基板に近い側の内壁面である底面において、前記ポリウレタン多孔質膜の膜厚方向に垂直な横断面における中央部に近づくにしたがって前記基板との距離が次第に小さくなる発泡孔が形成されることとしてもよい。この形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に適したポリウレタン多孔質膜を得ることができる。

本発明は、製造方法以外の種々の形態で実現することも可能である。例えば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法により製造されたポリウレタン多孔質膜、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜を製造するためのポリウレタン原料の組成の決定方法等の形態で実現することができる。

本発明の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給するという簡便な方法によりポリウレタン多孔質膜を製造できる。その結果、ポリウレタン多孔質膜の製造コストを抑えることができる。

ポリウレタン多孔質膜の一例の概略構成を示す断面模式図である。 ポリウレタン多孔質膜の他の例の概略構成を示す断面模式図である。 ポリウレタン多孔質膜のさらに他の例の概略構成を示す断面模式図である。 ポリウレタン多孔質膜の製造方法を表わす工程図である。 基板上にポリウレタン原料の層を形成する様子を表わす説明図である。 水蒸気を供給しつつポリウレタンを硬化させる様子を表わす説明図である。 ポリウレタン多孔質膜の製造方法を表わす工程図である。 ポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成、硬化条件及び測定結果を表わす説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。 細胞培養器具を模式的に表わす斜視図である。 ポリウレタン多孔質膜の両面に細胞培養を行なう手順を示す説明図である。 表面上にＨＵＶＥＣを播種して片面培養した結果を示す説明図である。 裏面上にＨＵＶＥＣを播種して片面培養した結果を示す説明図である。 表面上にＡｏＳＭＣを播種し、裏面上にＨＵＶＥＣを播種して両面培養した結果を示す説明図である。 表面上にＡｏＳＭＣを播種し、裏面上にＨＵＶＥＣを播種して両面培養した結果を示す説明図である。 ポリウレタン膜の原料の組成、硬化条件及び測定結果を表わす説明図である。 ＴＯＶ２１Ｇを培養した時の細胞増殖率を示す棒グラフである。 Ｃａｏｖ３を培養した時の細胞増殖率を示す棒グラフである。

Ａ．ポリウレタン多孔質膜の構成：
図１は、本願の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法により得られる膜の一例であるポリウレタン多孔質膜１０の概略構成を示す断面模式図である。ポリウレタン多孔質膜１０は、ポリウレタンによって構成されており、複数の発泡孔３０が形成されている。ポリウレタン多孔質膜は、第１の面である表面２２と、第２の面である裏面２４とを有し、上記した複数の発泡孔３０は、いずれも表面２２において開口している。表面２２における発泡孔３０の平均細孔径は、０．１〜１００μｍとすることができる。

ポリウレタン多孔質膜１０では、図１に示すように、膜厚方向には単一の発泡孔３０が存在している。また、発泡孔３０の内壁は、全体として略曲面状に形成されている。ただし、発泡孔３０の内壁面は滑らかである必要は無く、発泡孔３０の内壁面に微細な複数の凹凸が形成されていてもよい。発泡孔３０の内壁面に形成される上記微細な凹凸は、例えば、膜厚の２０％以下の幅を有する凹凸とすることができ、好ましくは膜厚の１０％以下の幅を有する凹凸とすることができる。このような発泡孔３０では、表面２２よりも裏面２４に近い側の内壁面である底面において、ポリウレタン多孔質膜１０の膜厚方向に垂直な横断面における中央部に近づくにしたがって裏面２４との距離が次第に小さくなっている。図１では、ポリウレタン多孔質膜１０の膜厚方向に垂直な横断面における発泡孔３０の中心軸を中心軸Ｏとして表わし、この中心軸Ｏに近づくほど、発泡孔３０の底面と裏面２４との距離が小さくなる様子を矢印で示している。

図２は、本願の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法により得られる膜の他の例であるポリウレタン多孔質膜１１０の概略構成を示す断面模式図である。ポリウレタン多孔質膜１１０において、ポリウレタン多孔質膜１０と共通する部分には同じ参照番号を付して詳しい説明は省略する。ポリウレタン多孔質膜１１０には、複数の発泡孔３０に代えて複数の発泡孔１３０が形成されている。発泡孔１３０は、発泡孔３０と同様の形状を有しているが、複数の発泡孔１３０の少なくとも一部が裏面２４側に貫通している点で異なっている。そのため、発泡孔１３０では、ポリウレタン多孔質膜１１０の膜厚方向に垂直な横断面における中央部に近づくにしたがって発泡孔１３０の底面と裏面２４との距離が次第に小さくなるが、裏面２４側に貫通する箇所において上記裏面との距離が０となる。なお、ポリウレタン多孔質膜１１０の表面２２における発泡孔１３０の平均細孔径は、０．１〜１００μｍとすることができる。

図３は、本願の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法により得られる膜のさらに他の例であるポリウレタン多孔質膜２１０の概略構成を示す断面模式図である。ポリウレタン多孔質膜２１０において、ポリウレタン多孔質膜１０と共通する部分には同じ参照番号を付して詳しい説明は省略する。ポリウレタン多孔質膜２１０には、発泡孔３０に代えて複数の孔２３０が形成されている。孔２３０は不定形状の孔である。

このように、本願の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法により得られるポリウレタン多孔質膜は、少なくとも表面２２において、上記したポリウレタン多孔質膜１０，１１０とは異なる凹凸形状が形成されていても良い。いずれの場合であっても、ポリウレタン多孔質膜の膜厚は、０．１〜１００μｍとすることができる。ここで、ポリウレタン多孔質膜の膜厚とは、ポリウレタン多孔質膜の表面２２に形成された凹凸における凸部の最も高い位置と裏面２４との距離（後述するように、本実施形態では基板上にポリウレタン多孔質膜を形成するため、凸部の最も高い位置と基板との距離）を指し、以下の説明では「山部の膜厚」とも呼ぶ。また、以下の説明では、ポリウレタン多孔質膜の表面２２に形成された凹凸における凹部の最も深い位置と裏面２４との距離（凹部の最も深い位置と基板との距離）を、「谷部の膜厚」と呼ぶ。本願の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法により得られる膜において、谷部の膜厚は、山部の膜厚の９５％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましく、５０％以下であることがさらに好ましい。また、谷部の膜厚は、０％であっても（孔が膜を貫通していても）よい。

なお、ポリウレタン多孔質膜の山部の膜厚および谷部の膜厚は、ポリウレタン多孔質膜の断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して求めればよい。具体的には、例えば、ポリウレタン多孔質膜の断面についてのＳＥＭ像において３つの視野を選択し、各々の視野においてランダムに選んだ５箇所について上記膜厚等を測定し、視野ごとに測定値の平均値を求めた後に、視野ごとの平均値の平均値を求めればよい。

また、ポリウレタン多孔質膜の平均細孔径は、ポリウレタン多孔質膜の表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して求めればよい。具体的には、例えば、ポリウレタン多孔質膜の表面についてのＳＥＭ像の特定の視野において、観察される全ての孔の最大長を測定し、測定した値の平均値を求めればよい。なお、上記最大長とは、孔に外接する四角形の辺の長さの最大値をいう。

上記した本実施形態のポリウレタン多孔質膜は、凹凸が形成された表面（例えば発泡孔が開口する表面）を利用して、培養細胞の足場となる細胞培養用基材として用いることができる。本実施形態のポリウレタン多孔質膜を培養細胞の足場として用いる用途の例としては、細胞をアレイ化あるいはパターニングすることによって細胞分布を均一化させて、細胞の応答性を安定化させたセルチップとして用いる用途を含むことができる。あるいは、血管を構成する細胞によって被覆された人工血管など、人工の組織を作製する際の細胞の足場として用いる再生医療分野での用途を含むこともできる。

また、ポリウレタン多孔質膜が裏面まで貫通する孔を有する場合には、膜の両面を利用して細胞培養を行なうことができる。その場合には、表裏各々の面で別々の細胞を培養して異なる種類の細胞間の相互作用を評価するという利用方法も可能になる。特に、裏面まで貫通する孔の孔径（平均細孔径）が、一般的な細胞の大きさである１０μｍ未満である場合には、両面間での細胞の移動を抑制しつつ物質（例えば各々の細胞が分泌する物質）の移動を許容して、異なる種類の細胞間の相互作用をより精度良く詳細に解析することが可能になる。

また、本実施形態のポリウレタン多孔質膜は、細胞培養の用途に加えて、あるいは細胞培養の用途に代えて、癌細胞増殖抑制を目的とした用途に用いることができる。例えば、癌の治療用、癌の再発・転移の防止用、あるいは癌の研究用に用いることができる。癌の治療用、あるいは癌の再発・転移の防止用にポリウレタン多孔質膜を用いる場合には、ポリウレタン多孔質膜は、図１に示すポリウレタン多孔質膜１０のように、細孔３０の底面が、ポリウレタン多孔質膜の裏面２４から離間している形状であることが望ましい。そして、凹凸が形成された表面２２を、癌細胞と接触させるように、あるいは癌細胞の増殖抑制の対象となる組織と接触させるように、ポリウレタン多孔質膜を体内に配置して用いればよい。これにより、ポリウレタン多孔質膜を貫通する孔を経由して、上記表面２２から裏面２４へと癌細胞が移動することを抑制できる。上記のように癌細胞増殖抑制を目的としてポリウレタン多孔質膜を用いる場合には、ポリウレタン多孔質膜の表面２２と裏面２４の少なくとも一方に、さらに抗癌剤を配置してもよい。

Ｂ．ポリウレタン多孔質膜の製造方法：
図４は、本発明の実施形態としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法を表わす工程図である。ポリウレタン多孔質膜を製造する際には、まず未硬化であるポリウレタン原料を用意する（ステップＳ１００）。ポリウレタン原料は、多価アルコールであるポリオールと、イソシアネートと、希釈溶剤を含む。ステップＳ１００において、上記ポリウレタン原料を構成する各成分を混合する工程が、「課題を解決するための手段」に記載した「混合工程」に相当する。

ポリオールとしては、公知のポリオールを用いればよく、例えば水酸基価が２０〜５７０であるポリオールを用いることができる。ポリオールの官能基数は、イソシアネートとの反応を良好に継続するためには２以上であることが望ましい。また、ポリオールの官能基数は、多孔質化の反応を良好に進行させるためには８以下であることが望ましい。ポリオールの数平均分子量は、ポリウレタン多孔質膜の柔軟性を確保するためには１００以上であることが好ましく、１０００以上であることがさらに好ましい。また。ポリオールの数平均分子量は、ポリウレタン原料の粘度を抑えるためには２００００以下であることが好ましく、１００００以下であることがさらに好ましい。ポリオールとしては、具体的には、例えば ポリエーテルポリオール、ポリマーポリオール、ポリエステルポリオール、アクリルポリオール、およびポリカーボネートポリオールを用いることができる。これらのポリオールを単独で、あるいは２種以上を混合して用いることができる。中でもポリエーテルポリオールおよびポリマーポリオールが好ましく、ポリエーテルポリオールが特に好ましい。

ポリエーテルポリオールとしては、例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）および／またはポリテトラメチレンエーテルグリコール（ＰＴＧ）を用いることができる。中でもポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）が好ましい。ポリマーポリオールとしては、ポリエーテルポリオール中で、スチレンやアクリロニトリルなどのエチレン不飽和モノマーを重合させたものを好ましく用いることができる。

イソシアネートとしては、公知のイソシアネートを用いればよく、例えば、１５〜５０質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するイソシアネートを用いることができる。具体的には、例えば芳香族イソシアネートおよび脂肪族イソシアネートから選択されるイソシアネートを用いることができる。中でも芳香族イソシアネートが好ましい。芳香族イソシアネートとしては、例えば、ジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）、トリレンジイソシアネート（ＴＤＩ）、およびこれらの混合物を挙げることができ、中でもジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）が好ましい。

ＭＤＩとしては、１分子中にイソシアネート基とベンゼン環とを二つずつ有するモノメリックＭＤＩ、１分子中にイソシアネート基とベンゼン環とを３個ずつ以上有するポリメリックＭＤＩ、あるいはそれらの混合物を用いることができる。また、ＭＤＩとしては、モノメリックＭＤＩおよび／またはポリメリックＭＤＩに加えて、さらに、ＭＤＩとポリオールとを反応させて得られるＭＤＩプレポリマーを用いることとしてもよい。

希釈溶剤は、ポリオールおよびイソシアネートを含む原料の粘度を調整するために用いる溶剤であり、ポリウレタンの原料の他の構成成分と実質的に反応しないことが望ましい。また、ポリオールおよびイソシアネートを溶解して、均一なポリウレタン原料を作製できることが望ましい。希釈溶剤としては、例えば、テトラヒドロフラン、アセトン、およびメチルエチルケトンから選択される溶媒を用いることができ、中でもテトラヒドロフランが好ましい。

本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法において、ステップＳ１００で用意するポリウレタン原料は、さらに、改質剤としての水を含んでいてもよい。改質剤としてポリウレタン原料に添加する水は、ポリウレタン多孔質膜形成のための基板に対するポリウレタン原料の濡れ性を向上させる働きを有する。すなわち、改質剤としての水は、後述するステップＳ１１０においてポリウレタン原料を基板上に垂らしたり塗布したりする際に、ポリウレタン原料にダマが形成されることを抑え、基板上においてポリウレタン材料の層を均一に形成することを容易化する働きを有する。基板に対するポリウレタン原料の濡れ性を確保する観点から、ポリウレタン原料に添加する水の量は、ポリオール量を１００質量部としたときに、３質量部以上とすることが好ましく、５質量部以上とすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン原料に改質剤として加えた水は、後述する硬化の工程までに大部分が揮発して失われていることが望ましい。そのため、ポリウレタン原料に添加する水の量は、ポリオール量を１００質量部としたときに、１５質量部以下とすることが好ましく、１０質量部以下とすることがさらに好ましい。ただし、後述するステップＳ１２０においてポリウレタン原料の層を支障なく形成可能であれば、ポリウレタン原料に水を加えないこととしてもよい。

さらに、本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法において、ステップＳ１００で用意するポリウレタン原料に、架橋剤として、既述したポリオールよりも低分子量の（例えば分子量６０〜５００、好ましくは分子量６０〜３００以下の）水酸基含有化合物を加えてもよい。架橋剤としては、具体的には、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、および１，４−ブタンジオール等のジオール、ジエタノールアミン等のジオールの化合物、グリセリン等のトリオール、並びにトリエタノールアミンおよびトリメチロールプロパン等のトリオールの化合物を挙げることができる。

また、本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法において、ステップＳ１００で用意するポリウレタン原料に、硬化・発泡を促進するための触媒を加えることも可能である。上記触媒としては、公知の触媒を用いればよく、例えばトリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびトリブチルアミンなどのアミン系の触媒、並びに有機スズ化合物などの有機金属触媒から選択される触媒を用いることができる。さらに、界面活性剤等の整泡剤、着色剤、酸化防止剤や紫外線吸収剤等の老化防止剤、炭酸カルシウムや硫酸バリウム等の充填剤、難燃剤、可塑剤、離型剤等の公知の各種添加剤、助剤を必要に応じて使用することができる。ただし、ポリウレタン原料の組成が単純である（ポリウレタン原料として用いる物質の種類が少ない）方が、後述の細胞への影響を軽減でき好ましい。さらに、上記硬化を促進する触媒を添加しない方が、ゆっくりと発泡反応を進行させることができるため、孔径制御が容易となり好ましい。

ステップＳ１００でポリウレタン原料を用意した後には、基板上にポリウレタン原料の層を形成する（ステップＳ１１０）。ステップＳ１１０が、「課題を解決するための手段」に記載した「層形成工程」に相当する。また、ステップＳ１００およびステップＳ１１０が、「課題を解決するための手段」に記載した「第１の工程」に相当する。ステップＳ１１０で用いる基板は、ポリウレタン原料と実質的に反応せず、ポリウレタン多孔質膜を製造する工程における温度条件下において安定であり、ポリウレタン原料の層を形成するための表面が十分に平滑であればよい。基板としては、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等のフッ素系樹脂、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリアミド、およびポリイミド等から選択される材料から成るフィルムを用いることができる。

図５は、基板４４上にポリウレタン原料の層４０を形成する方法の一例を表わす説明図である。ステップＳ１１０において基板上にポリウレタン原料の層を形成する方法としては、例えば、基板上にポリウレタン原料を垂らして、スピンコーター、バーコーター、あるいはリップコーターを用いてポリウレタン原料を膜状に成形する方法、スプレーコート法、およびロールコート法等を挙げることができる。図５では、スピンコーターを用いたスピンコート法によりポリウレタン原料の層を形成する様子を示している。具体的には、スピンコーターのターンテーブル上に配置したガラス板４２の上に固定した基板４４上に、ポリウレタン原料の層４０を形成する様子を示している。なお、本願明細書では、基板上にポリウレタン原料の層を形成してポリウレタン膜を作製する場合には、得られるポリウレタン膜において、基板から離間した露出面を「表面」と呼び、基板と接する側の面を「裏面」と呼ぶ。

ステップＳ１１０で形成されるポリウレタン原料の層の厚さは、例えば０．１〜２０μｍとすることができる。ポリウレタン多孔質膜の強度を確保して取り扱い性を向上させるためには、ポリウレタン原料の層の厚さは、１μｍ以上とすることが好ましく、３μｍ以上とすることがさらに好ましい。また、後述するステップＳ１２０において基板と接する側にまで発泡孔が貫通したポリウレタン多孔質膜を得るためには、ポリウレタン原料の層の厚さは、１５μｍ以下とすることが好ましく、１０μｍ以下とすることがさらに好ましい。

なお、ポリウレタン原料に含まれる希釈溶剤は一般的に揮発性が高いため、ステップＳ１１０においてポリウレタン原料の層を形成したときには、形成されたポリウレタン原料の層から希釈溶剤が速やかに揮発する。そのため、ステップＳ１１０によって得られるポリウレタン原料の層の厚みは、ステップＳ１１０で上記層を形成するために用いたポリウレタン原料中の希釈溶剤の割合が大きいほど薄くなる。また、ステップＳ１１０では、後述するポリウレタンの硬化に係るステップＳ１２０に先だって、ポリウレタン原料の層中の水が十分に揮発していることが望ましい。すなわち、後述するステップＳ１２０におけるポリウレタンの硬化に係る工程において、ポリウレタン原料中の水が発泡剤として実質的に機能しない程度に、ポリウレタン原料の層中の水の量が低減されていることが望ましい。ステップＳ１１０において、ポリウレタン原料の層を形成するためにスピンコート法を採用する場合には、ポリウレタン原料を層状に成形する際に同時に希釈溶剤や水を揮発させることができる。

ステップＳ１１０でポリウレタン原料の層を形成した後には、このポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給しながらポリウレタン原料の層を硬化させ（ステップＳ１２０）、ポリウレタン多孔質膜を完成する。これにより、例えば図１〜図３に示したポリウレタン多孔質膜１０，１１０，２１０を得ることができる。ステップＳ１２０が、「課題を解決するための手段」に記載した「第２の工程」に相当する。

ステップＳ１２０では、具体的には、ポリウレタン原料の層４０における基板４４から離間した露出面に対して水蒸気の供給を行ないつつ、ポリウレタン原料を硬化させる。ポリウレタン原料の層４０の上記露出面に対して水蒸気を供給する方法としては、例えば、基板４４上に形成されたポリウレタン原料の層４０を、飽和蒸気圧となっている環境下に配置する方法が挙げられる。あるいは、水蒸気を噴射するノズル等を用いてポリウレタン原料の層の上記露出面に対して水蒸気を吹き付ける方法も採用可能である。

図６は、ポリウレタン原料の層４０を飽和水蒸気圧の環境下に配置してポリウレタン多孔質膜を作製する様子を模式的に示す説明図である。ここでは、蓋体５２を有する密閉容器５４を用いており、密閉容器５４内に水５６を加えると共に、蓋体５２の裏側に基板４４を貼り付けて、ポリウレタン原料の層４０の露出面を水５６に対向させている。例えば所定の温度に設定した恒温槽内に上記密閉容器５４を配置することにより、密閉容器５４内を上記所定の温度に維持すると共に、密閉容器５４内の蒸気圧を上記所定の温度における飽和水蒸気圧にすることができる。図６では、水５６が水蒸気となってポリウレタン原料の層４０に供給される様子を矢印で示している。ここで、ステップＳ１２０における反応時の温度（以下、反応温度とも呼ぶ）とは、反応の場であるポリウレタン原料の層の温度であり、図６に示す方法では密閉容器５４を配置する恒温槽の設定温度に相当する。なお、既述したように水蒸気を噴射するノズルを用いる場合には、反応温度は、例えば噴射する水蒸気温度とすることができる。

ポリウレタン原料の層においては、ポリオールとイソシアネートとが混合されているため硬化反応が進行する。また、ポリウレタン原料の層においては、水蒸気が供給されることにより、露出面側から発泡に係る反応が進行する。すなわち、ポリウレタン原料の層では、露出面側から水蒸気が供給されると、ポリウレタン原料中のイソシアネートと水蒸気とが反応して二酸化炭素が生じることにより、硬化途中のポリウレタンが発泡して（孔が形成されて）多孔質化する。このように、本実施形態では、水蒸気がポリウレタンの発泡剤として機能している。なお、発泡剤である水蒸気が露出面側から供給されることにより、露出面側から孔形成が進行するため、通常は、図１〜図３に示すように、ポリウレタン多孔質膜では露出面側（表面２２側）で開口する孔が形成される。

本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法では、ステップＳ１２０における反応温度、ステップＳ１２０における反応を行なう時間（以下、反応時間とも呼ぶ）、ステップＳ１２０でポリウレタン原料の層に供給する水蒸気の量（以下、供給水蒸気量とも呼ぶ）、およびポリウレタン原料の組成から選択される条件を調節することにより、ポリウレタン多孔質膜の形状を制御することが可能になる。なお、ポリウレタン多孔質膜の形状とは、ポリウレタン多孔質膜に形成される孔の形状、孔の孔径、孔の孔径のバラツキ、およびポリウレタン多孔質膜の膜厚を含む。

例えば、ポリウレタンの硬化反応(以下、単に硬化反応とも呼ぶ）およびポリウレタンが発泡する反応（以下、単に発泡反応とも呼ぶ）は、いずれも化学反応であるため、ステップＳ１２０における反応温度が高いほど各々の反応の活性が高まり、反応時間を長くするほど各々の反応が進行する。そのため、ステップＳ１２０における反応温度および／または反応時間を調節することにより、硬化反応と発泡反応のバランスを変更して、得られるポリウレタン多孔質膜の形状を制御することが可能になる。ポリウレタン多孔質膜の生産性を確保すると共にポリウレタン膜を十分に多孔質化する観点からは、反応温度を２０℃以上とすることが好ましく、３０℃以上とすることがより好ましく、４０℃以上とすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン多孔質膜に形成される孔の大きさを抑えるためには、反応温度を１２０℃以下とすることが好ましく、８０℃以下とすることがより好ましく、６０℃以下とすることがさらに好ましい。反応時間は反応温度に応じて適宜設定すれば良いが、ポリウレタン多孔質膜の生産性を確保する観点からは、反応時間を２４時間以下にすることが好ましく、１７時間以下にすることがより好ましく、６０分以下にすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン膜を十分に多孔質化するためには、反応時間を１分以上とすることが好ましく、１０分以上とすることがより好ましい。

ステップＳ１２０における反応温度と反応時間は、得られるポリウレタン多孔質膜に形成される孔の形状を変更するための重要なパラメータである。具体的には、反応温度と反応時間とを適宜設定することにより、孔の形状を、当該孔の内壁が全体として略曲面状に形成された発泡孔形状であって、ポリウレタン多孔質膜の露出面で開口する形状とすることができる。さらに、膜厚方向には単一の発泡孔が存在する（膜厚方向に複数の発泡孔が連続して存在しない）形状とすることができる（図１，２参照）。

また、ステップＳ１２０における反応温度と反応時間は、ポリウレタン多孔質膜の露出面（表面２２）における平均細孔径および孔径のバラツキを変更するための重要なパラメータである。反応温度および／または反応時間を調節することで、ポリウレタン多孔質膜の上記平均細孔径を、０．１〜１００μｍの範囲で制御することができる。平均細孔径を上記範囲で制御するためには、反応温度を２０℃以上とすることが好ましく、３０℃以上とすることがより好ましく、４０℃以上とすることがさらに好ましい。また、平均細孔径を上記範囲で制御するためには、反応温度を１２０℃以下とすることが好ましく、８０℃以下とすることがより好ましく、６０℃以下とすることがさらに好ましい。反応時間は反応温度に応じて適宜設定すれば良いが、平均細孔径を上記範囲で制御するためには、反応時間を２４時間以下にすることが好ましく、１７時間以下にすることがより好ましく、６０分以下にすることがさらに好ましい。また、平均細孔径を上記範囲で制御するためには、反応時間を１分以上とすることが好ましく、１０分以上とすることがより好ましい。

ここで、反応温度が高いほど発泡反応が活発化するため、反応温度をより低く設定することにより、得られるポリウレタン多孔質膜に形成される孔の孔径（平均細孔径）を小さくし、孔径のバラツキを抑えることが可能になる。例えば、孔の孔径を十分に小さくして孔径のバラツキを抑えるためには、反応温度を５５℃以下とすることが好ましく、４５℃以下とすることがより好ましい。ただし、生産効率を考慮すると、３５℃以上とすることが好ましく、３８℃以上とすることがより好ましい。なお、上記反応温度および／または反応時間に加えて、あるいは上記反応温度および／または反応時間に代えて、ポリウレタン原料の層の露出面に対して供給する水蒸気量を調節することによっても、ポリウレタン多孔質膜の露出面（表面２２）における平均細孔径を制御できる。発泡剤である水蒸気が多いほど、発泡反応も活発化するためである。そのため、図６に示したように水を加えた密閉容器内で硬化反応を行なう場合には、温度を高く設定するほど、反応温度が高くなると共に飽和水蒸気圧が高くなって供給水蒸気量が増加し、その結果、発泡反応が活発化されて平均細孔径が大きくなる。このとき、ポリウレタン多孔質膜において孔がより大きくなることにより、孔における谷部の膜厚は、より厚くなる。

また、ステップＳ１２０における反応温度と反応時間は、ポリウレタン多孔質膜の膜厚（山部の膜厚）を変更するための重要なパラメータである。反応温度および／または反応時間を調節することで、ポリウレタン多孔質膜の厚さを０．１〜１００μｍの範囲で制御することができる。例えば、発泡反応が活発に進行するほど、得られるポリウレタン多孔質膜の膜厚が厚くなるため、反応温度をより低く設定することにより、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を薄くすることができる。ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、反応温度を２０℃以上とすることが好ましく、３０℃以上とすることがより好ましく、４０℃以上とすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、反応温度を１２０℃以下とすることが好ましく、８０℃以下とすることがより好ましく、６０℃以下とすることがさらに好ましい。反応時間は反応温度に応じて適宜設定すれば良いが、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、反応時間を２４時間以下にすることが好ましく、１７時間以下にすることがより好ましく、６０分以下にすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、反応時間を１分以上とすることが好ましく、１０分以上とすることがより好ましい。

なお、上記反応温度および／または反応時間に加えて、あるいは上記反応温度および／または反応時間に代えて、ポリウレタン原料の組成を調節することによっても、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を制御できる。具体的には、例えば原料中の希釈溶剤の割合を多くすれば、希釈溶剤が揮発することによりステップＳ１２０の反応に供されるポリウレタン原料の層も薄くなる。その結果、最終的に得られるポリウレタン多孔質膜の膜厚も薄くなる。ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、例えば、原料中の希釈溶剤の割合を、原料中のポリオールの量を１００質量部としたときに、４０質量部以上とすることが好ましく、８０質量部以上とすることがさらに好ましい。また、ポリウレタン多孔質膜の膜厚を上記範囲で制御するためには、原料中の希釈溶剤の割合は、原料中のポリオールの量を１００質量部としたときに、５００質量部以下とすることが好ましく、３５０質量部以下とすることがさらに好ましい。

なお、ステップＳ１２０で硬化反応および発泡反応を進行させるときには、ポリウレタン原料の層が薄いほど、基板側（裏面側）にまで貫通する孔が形成されやすくなる。そのため、上記のように希釈溶剤の割合を増やすことにより、ポリウレタン原料の層を薄く形成して、より多くの孔が裏面側にまで貫通したポリウレタン多孔質膜を得易くすることができる。貫通孔を有するポリウレタン多孔質膜を得るためには、例えば、原料中の希釈溶剤の割合を、原料中のポリオールの量を１００質量部としたときに、９０質量部以上とすることが好ましく、１５０質量部以上とすることがさらに好ましい。また、貫通孔を有するポリウレタン多孔質膜を得るためには、原料中の希釈溶剤の割合は、原料中のポリオールの量を１００質量部としたときに、５００質量部以下とすることが好ましく、３５０質量部以下とすることがさらに好ましい。

また、ステップＳ１００においてポリウレタン原料を配合する「混合工程」の後に、ステップＳ１１０でポリウレタン原料の層を形成する「層形成工程」を行なうまでの時間、および、上記「混合工程」の後に「層形成工程」を行なうまでの間の前記ポリウレタン原料の環境温度と、の少なくとも一方の条件を調節することにより、ポリウレタン多孔質膜に形成される発泡孔の深さ（あるいは、後述する谷部の膜厚）および／または平均細孔径を制御することが可能になる。例えば、上記条件を調節することにより、得られるポリウレタン多孔質膜に形成される発泡孔の少なくとも一部を、基板４４と接する裏面２４にまで貫通する貫通孔とすることができる。

具体的には、「混合工程」から「層形成工程」までの時間が長いほど、あるいは、「混合工程」から「層形成工程」までの温度が高いほど、混合されたポリウレタン原料において硬化反応が進行する。ステップＳ１２０では、ポリウレタン原料の層において硬化反応が進行しているほど、水蒸気を供給しても発泡孔が形成され難くなる。そのため、「混合工程」から「層形成工程」までの時間が長いほど、あるいは「混合工程」から「層形成工程」までの温度が高いほど、発泡孔の深さが浅くなる傾向があり、平均細孔径が小さくなる傾向がある。また、「混合工程」から「層形成工程」までの時間が短いほど、あるいは「混合工程」から「層形成工程」までの温度が低いほど、ポリウレタン多孔質膜に形成される発泡孔の少なくとも一部が貫通孔となり易く、平均細孔径が大きくなる傾向がある。

以上のように構成された本発明の実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、ポリウレタン原料の層に対して水蒸気を供給するという簡便な方法により、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜を製造できる。その結果、ポリウレタン多孔質膜の製造コストを抑えることができる。

また、本発明の実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、水蒸気を供給しつつ硬化反応を進行する際の反応温度、反応時間、供給水蒸気量、およびポリウレタン原料の組成から選択される条件を調節することにより、裏面まで貫通する複数の孔を容易に形成することができる。そのため、膜の両面を培養細胞の足場として用いることができると共に、このようなポリウレタン多孔質膜を用いることで、各々の面上の細胞間で相互作用が生じる態様の細胞培養が可能になる。

特に、本発明の実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、裏面まで貫通する孔の孔径（平均細孔径）を、一般的な細胞の大きさである１０μｍ未満とすることができる。そのため、このような膜を用いることで、両面間での細胞の移動を抑制しつつ物質（例えば各々の細胞が分泌する物質）の移動を許容して、両面の細胞間の相互作用をより詳細に解析することが可能になる。

なお、従来から、多孔質なポリウレタンを製造するための発泡剤として水（液水）を使用する方法が知られている。ポリウレタン原料に対して液水を混合することで、水とイソシアネートとが反応して二酸化炭素が生じてポリウレタンが発泡する。本実施形態では、発泡剤としての水を、液水の状態ではなく気化した水蒸気の状態で用いる点が従来と異なっている。

また、多孔質なポリウレタンを製造するための発泡剤としては、従来、液水の他にフロン、シクロペンタンなども知られていたが、これら液水やフロンを用いる場合には、発泡孔の大きさが通常は数百μｍ程度であった。したがって、細胞培養用の多孔質膜としての要求を満たすことは困難であった。また、液水やフロンを発泡剤として用いる場合には、発泡孔が膜の内部に形成されるため、膜の表面で孔を開口させて膜の表面に十分な凹凸形状を形成したり、膜の裏面へと発泡孔を貫通させることが困難であった。これに対して本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、露出面から発泡剤である水蒸気を供給するため、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いる多孔質膜として適した凹凸形状を表面に有する膜を得ることができる。

また、ポリウレタンの多孔質化の他の技術として、二酸化炭素ガス、窒素ガス、あるいは空気を、通常状態や超臨界状態で試料に含浸させ、温度を調節することでガスとポリマーの溶融状態を実現させ、微細な発泡孔を形成する技術も従来から知られている。しかしながら、このような方法で形成される発泡孔は独泡構造を有するため、膜の表面で開口させて膜の表面に十分な凹凸形状を形成したり、裏面側へと発泡孔を貫通させることが困難であった。また、膜厚を一定の範囲内で制御しながら発泡させることも困難であった。これに対して本実施形態のポリウレタン多孔質膜の製造方法によれば、細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いる多孔質膜として適した凹凸形状を表面に有すると共に、所望の膜厚を有する多孔質膜を得ることができる。

Ｃ．変形例：
図７は、本発明の実施形態の変形例としてのポリウレタン多孔質膜の製造方法を表わす工程図である。図７において、図４と共通する工程には同じ工程番号を付して詳しい説明は省略する。図７に示す変形例では、ステップＳ１００〜ステップＳ１２０までは図４と同様の工程を行なう。そして、ステップＳ１２０の後に、さらに、積極的な水蒸気の供給を停止したドライ条件においてポリウレタンの硬化を促進する工程（ステップＳ１３０）を行なう点が異なっている。具体的には、既述したようにステップＳ１２０で密閉容器５４を用いる場合には、密閉容器５４から液水を除去してさらに硬化反応を継続させる。あるいは、ステップＳ１２０において水蒸気を噴射するノズルを用いる場合には、ノズルを用いた水蒸気の噴射を停止して、さらに硬化反応を継続させる。

このような構成とすれば、ポリウレタンの硬化のための工程が、多孔質化を進行させる工程の後にさらに継続して行なわれるため、ステップＳ１２０の条件を、所望の多孔質化の程度を主として考慮して設定することができる。そのため、多孔質化の程度（具体的には、平均細孔径や、孔が裏面に貫通する程度や、発泡に起因する膜厚の変化の程度等）を、より精度良く制御することが可能になる。例えば、図４の製造方法を採用する場合に比べて、ステップＳ１２０における反応温度を低く設定すると共に反応時間を短く設定することにより、膜の表面における平均細孔径をより小さくして孔の大きさのバラツキをより小さくすることが可能になる。

＜ポリウレタン多孔質膜の作製＞
［サンプル１，２］
図８は、サンプル１および２のポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。サンプル１のポリウレタン膜は、図４に示した製造方法に従って作製した。サンプル２のポリウレタン膜は、後述するように、図４のステップＳ１２０に対応する工程で水蒸気を供給していない点だけが異なっている。サンプル１および２のポリウレタン膜を作製する際には、ステップＳ１００において図８に示す組成の原料を用意した。図８に示すように、サンプル１および２のポリウレタン膜の作製のためには、ポリオールとして、ポリエーテルポリオールを用いた。具体的には、数平均分子量が約４０００、水酸基価が３７のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を用いた。また、イソシアネートとしては、２８．０質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するジフェニルメタンジイソシアネート（ＭＤＩ）のポリオール変性体を用いた。架橋剤としては、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）を用いた。また、希釈溶剤としてはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いた。さらに、改質剤として水、具体的には超純水（ミリＱ水）を用いた。図８では、原料中の各成分の組成を、ポリオールを１００質量部としたときの各成分の質量割合として示すと共に、混合した各成分の重さも併せて記載している。なお、テトラヒドロフランについては、添加した溶剤の容積を併せて記載している。テトラヒドロフランの質量割合は、溶剤中のテトラヒドロフランの濃度を０．８９ｇ／ｍＬとして計算した。

ステップＳ１１０では、図５に示すスピンコート法によって基板４４上にポリウレタン原料の層４０を形成した。ステップＳ１１０では、まず、図８に示す組成のうちのイソシアネート以外の成分を密閉式サンプル容器に加え、ボルテックス（ＩＫＡ社製のＧＥＮＩＵＳ３、以下同じ）を用いて３０秒間攪拌した。その後、上記試料の入ったサンプル容器を氷浴上で冷却した。さらに、図８に示す所定量のイソシアネートを添加してボルテックスを用いて３０秒間攪拌し、その後、反応を抑えるために上記試料の入ったサンプル容器を氷浴上で冷却した。スピンコートする直前に上記試料をボルテックスを用いて再び１分間攪拌し、スピンコーターに取り付けた基板４４上に１ｍＬ塗布してスピンコートを行なった。スピンコーターは、ミカサ株式会社製のＭＳ−Ａ１００を用いた。基板４４としてはポリプロピレン（ＰＰ）フィルムを用い、基板４４は、スピンコーターのターンテーブル上に配置したガラス板の上に粘着テープで固定して使用した。スピンコートは、室温で、回転数５０００ｒｐｍにて６０秒間行なった。

ステップＳ１２０では、図６に示す密閉容器５４として岩崎工業株式会社製のＡＩＲ ＫＥＥＰＥＲ Ａ−０３２（容積１．３５Ｌ）を用いた。サンプル１を製造する際には、上記密閉容器５４内に１００ｍＬの水を入れ、硬化温度である４０℃に設定した恒温槽に配置して、密閉容器５４内の水の温度が硬化温度に達するまで加温した。硬化反応を開始する直前に密閉容器５４を恒温槽から取り出し、密閉容器５４の蓋体５２の裏側の水分をキムタオル（日本製紙クレシア社製）で拭き取って、硬化反応時における水滴の影響を抑えた。そして、スピンコーターを用いてポリウレタン原料の層４０を形成した基板４４を、両面テープを用いて蓋体５２に固定した。ポリウレタン原料の層４０を固定した蓋体５２を閉じ、密閉容器５４を恒温槽に配置して一晩のあいだ加温した。このようにして、４０℃の飽和水蒸気圧に曝された状態で、４０℃にてサンプル１の硬化反応を行なった。以下の説明では、ポリウレタンの硬化時の雰囲気が硬化温度における飽和水蒸気圧であることを、水蒸気雰囲気と呼ぶ。

サンプル２は、ステップＳ１２０に代えて、水蒸気の供給を行なわない硬化の工程を行なった。具体的には、密閉容器内に水を入れなかったこと、および、恒温槽の設定温度が６０℃であったこと以外は上記サンプル１と同じ方法によって製造した。したがって、サンプル２について硬化反応を行なった際の密閉容器内の水蒸気圧は、密閉容器を密閉する前の空気中の水蒸気圧である。以下の説明では、ポリウレタンの硬化時の雰囲気が、積極的な水蒸気供給を行なわない水蒸気圧であることを、ドライ雰囲気と呼ぶ。

図９は、サンプル１および２のポリウレタン膜を観察した結果を示す説明図である。観察には走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立製作所製のＳ−８００）を用い、加速電圧は１５ｋＶとして、２００〜１００００倍にて観察を行なった。図９では、一例として、ポリウレタン膜の表面（基板から離間した面である露出面）および裏面(基板を剥離した面）を３０００倍で観察した様子と、断面を１０００倍で観察した様子を示している。断面を観察するための試料は、基板４４ごと膜厚方向に剃刀刃を用いて切り出して作製した。なお、サンプル２については後述するように孔形成が認められなかったため、基板４４を剥離しての裏面観察は行なわなかった。

図９では、サンプルにおける山部の膜厚（膜の表面に形成された凹凸における凸部の最も高い位置と基板４４との距離）を「膜厚−山部」として示している。また、孔が形成されたサンプルでは、谷部の膜厚（膜の表面に形成された凹凸における凹部の最も深い位置と基板４４との距離）を「膜厚−谷部」として示している。また、孔が形成されたサンプルでは、膜の表面２２（図１〜３を参照）における孔の開口部の径を「表面孔の大きさ」として示し、裏面２４（図１〜３を参照）における孔の開口部の径の最大値を「裏面最大孔の大きさ」として示している。さらに図９では、「膜厚−山部」、「膜厚−谷部」および「表面孔の大きさ」について、標準偏差も併せて示している。

上記「膜厚−山部」、「膜厚−谷部」およびそれらの標準偏差は、サンプルの断面の像の中で３つの視野を選択し、各視野ごとに平均値を算出し、各視野ごとの平均値の平均値を算出することにより求めた。なお、後述する他のサンプルについての「膜厚−山部」等の膜厚、およびその標準偏差についても、同様にして求めた。

また、上記「表面孔の大きさ」「裏面最大孔の大きさ」、および「表面孔の大きさの標準偏差」は、画像解析ソフトＭａｃ−Ｖｉｅｗ（株式会社マウンテック製）を用いて画像解析することにより求めた。具体的には、各サンプルの表面または裏面の特定の視野内（ここでは、１０００倍に拡大した視野）における全ての孔について最大長（孔に外接する四角形の辺の長さの最大値）を測定し、測定した最大長の値を用いて、平均値としての「表面孔の大きさ」や、標準偏差や最大値を求めた。図９では、「表面孔の大きさ」の標準偏差は、「表面孔の大きさ」の平均値の下に記載している。なお、後述する他のサンプルについての「表面孔の大きさ」や「裏面孔の大きさ」およびそれらの標準偏差の値、さらに、表面と裏面の各々における孔の大きさの最大値や最小値についても、上記した画像解析ソフトを用いて同様にして求めた。

図９に示すように、水蒸気雰囲気下にて硬化反応を行なうことにより、サンプル１として、裏面まで貫通する多数の細孔（発泡孔）を有するポリウレタン多孔質膜が得られた。これに対し、ドライ雰囲気下にて硬化反応を行なったサンプル２では、孔の形成は認められなかった。図８に示すようにサンプル１と２とは原料の組成が同じであるため、硬化反応前の原料の層の厚さはほぼ等しくなる。しかしながら、硬化後の膜厚は、発泡したサンプル１の方が厚かった(図９の「膜厚−山部」参照）。また、サンプル１では、表面２２側の開口部の孔径の方が裏面２４側の開口部の孔径よりも大きく、表面２２側から裏面２４側へと孔形成が進行した様子が観察された。

なお、サンプル１，２は、図８に示すように、ポリオール１００質量部に対して７質量部の水を原料中に含有している。この含有割合は、発泡ウレタンを製造する際に発泡剤として水を用いる場合に、原料中に混合する水の割合の一般的な値よりも多い。しかしながら、サンプル２では孔の形成が認められない。これは、原料中の水はスピンコートの際に失われており、原料中に混合した水は発泡剤として実質的にはほとんど機能しないためと考えられる。したがって、発泡孔が形成されたサンプル１では、露出面に供給された水蒸気のみが実質的に発泡剤として機能したと考えられる。

［サンプル３〜８］
図１０は、サンプル３〜８のポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。サンプル３〜８のポリウレタン膜は、図４に示した製造方法に従って作製した。すなわち、サンプル３〜８のポリウレタン膜を作製する際には、ステップＳ１００において図１０に示す組成の原料を用意した。図１０に示すように、サンプル３〜５のポリウレタン膜の作製のためには、ポリオールとして、サンプル１と同じポリエーテルポリオール（水酸基価３７、分子量約４０００）を用いた。これに対してサンプル６〜８のポリウレタン膜の作製のためには、ポリオールとして、ポリマーポリオール（水酸基価２７、分子量約５０００、ポリエーテルポリオール中でスチレンとアクリルニトリルをグラフト共重合させたポリマー）を用いた。原料中のその他の構成成分の種類、および成膜条件は、サンプル１と同様である。図１０では、各構成成分の組成を図８と同様に示している。

その後のステップＳ１１０における原料の層の形成の工程、および、ステップＳ１２０における硬化の工程も、サンプル１と同様に行なった。ただし、サンプル３とサンプル６は硬化温度を室温に設定し、サンプル４とサンプル７は硬化温度を６０℃に設定し、サンプル５とサンプル８は硬化温度を８０℃に設定した点が異なっている。

図１１は、サンプル３〜８のポリウレタン膜を、サンプル１と同様にしてＳＥＭで観察した結果を示す説明図である。図１１では、一例として、ポリウレタン膜の表面（基板から離間した面である露出面）を１０００倍および５０００倍で観察した様子を示している。図１１では、各サンプルにおける全体の膜厚（山部の膜厚）も併せて示している。

図１１に示すように、サンプル３〜８では、水蒸気雰囲気下にて硬化反応を行なうことにより表面に凹凸形状が形成された。ただし、室温よりも高い温度条件の方が、より多くの凹凸形状、さらには発泡孔が形成された。これは、水蒸気を用いて膜の表面に凹凸形状（発泡孔）を形成する反応は、硬化反応と同様に化学反応であって、ある程度温度を高めることにより十分な活性が得られるためと考えられる。

ポリオールとしてポリエーテルを用いた場合には、硬化温度が室温の場合には、表面に凹凸形状は形成されるものの、発泡孔と認められる孔は観察されなかった（サンプル３）。硬化温度が６０℃および８０℃の場合には、いずれも多くの発泡孔が観察された（サンプル４，５）。ただし、硬化温度がより低い６０℃であるサンプル４の方が発泡孔の孔径が全体に細かく揃っており（表面１０００倍の像を参照）、膜厚も厚かった。ポリオールとしてポリマーポリオールを用いた場合には、硬化温度が室温および６０℃の場合には、表面に凹凸形状は形成されるものの、発泡孔と認められる孔は観察されなかった（サンプル６，７）。硬化温度が８０℃の場合には、多くの発泡孔が観察された(サンプル８）。以上より、用いるポリウレタン原料の種類に応じて、硬化温度を含む硬化条件を適宜設定することにより、膜表面に形成される凹凸形状あるいは発泡孔の態様を適宜調節できると考えられる。

［サンプル９〜１１］
図１２は、サンプル９〜１１のポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。サンプル９、１０のポリウレタン膜は、図４に示した製造方法に従って作製した。サンプル１１のポリウレタン膜は、後述するように、ステップＳ１２０に対応する工程の雰囲気がドライ雰囲気である点が異なっている。サンプル９〜１１のポリウレタン膜を作製する際には、ステップＳ１００において図１２に示す組成の原料を用意した。図１２に示すように、サンプル９〜１１のポリウレタン膜の作製で用いた原料の構成成分の種類、および成膜条件は、サンプル１と同様である。図１２では、各構成成分の組成を図８と同様に示している。

その後のステップＳ１１０における原料の層の形成の工程、および、ステップＳ１２０における硬化の工程も、サンプル１と同様に行なった。ただし、硬化温度は、サンプル９では５０℃に設定し、サンプル１０およびサンプル１１では６０℃に設定した。また、サンプル１１のみ、ドライ雰囲気下にて硬化反応を行なった。

図１３は、サンプル９〜１１のポリウレタン膜を、サンプル１と同様にしてＳＥＭで観察した結果を示す説明図である。図１３では、一例として、ポリウレタン膜の表面、裏面、および断面を３０００倍で観察した様子を示している。なお、サンプル１１については後述するように孔形成が認められなかったため、基板を剥離しての裏面観察は行なわなかった。また、図１３では、各々のサンプルについての「膜厚−山部」、「膜厚−谷部」および各々の標準偏差、並びに表面と裏面のそれぞれについての平均細孔径、その標準偏差、孔径の最大値および最小値についても併せて示している。孔径の解析のためには、表面側については１０００倍に拡大した像を用い、裏面側については２００倍に拡大した像を用いた。

図１３に示すように、サンプル９，１０では、水蒸気雰囲気下にて硬化反応を行なうことにより、裏面まで貫通する発泡孔が形成された。これに対して、ドライ雰囲気下で硬化反応を行なったサンプル１１では、発泡孔あるいは凹凸形状の形成は認められなかった。

サンプル９とサンプル１０とを比較すると、原料組成が同じであるにもかかわらず、硬化温度が高いサンプル１０の方が膜厚が厚かった。すなわち、ステップＳ１１０で形成される原料の層の厚みが同じであるにもかかわらず、硬化後の膜厚が厚かった。これは、硬化温度が高いサンプル１０の方が、水蒸気を用いた発泡反応が活発に進行したためと考えられる。また、サンプル９とサンプル１０とを比較すると、硬化温度が低いサンプル９の方が、発泡孔の表面側の開口部の孔径が小さく、孔径のバラツキも小さかった。さらに、裏面側の開口部の孔径を比較すると、硬化温度が低いサンプル９の方が平均孔径は大きいが、バラツキが小さいという結果が得られた。すなわち、発泡孔の形成に係る化学反応は硬化温度が高いほど活発に進行するが、発泡反応を伴う硬化時の温度を適宜調節することによって、孔径の大きさおよび孔径のバラツキがより小さく、裏面側にまで貫通する発泡孔を有するポリウレタン多孔質膜を製造可能であることが分かる。

なお、既述したサンプル４およびサンプル５では、それぞれ、６０℃あるいは８０℃の硬化温度にて水蒸気雰囲気下で硬化を行なったが、裏面にまで貫通する発泡孔は形成されなかった。これに対して、水蒸気雰囲気下で硬化を行なったサンプルであって、硬化温度が４０℃であるサンプル１、硬化温度が５０℃であるサンプル９、および硬化温度が６０℃であるサンプル１０は、裏面にまで貫通する発泡孔が形成された。これは、サンプル１、９および１０は、サンプル４および５に比べて原料中の希釈溶剤の含有割合(ポリエーテルの量を１００質量部としたときの希釈溶剤量）が高いため、硬化反応に供される原料の層の厚さが薄くなり、貫通孔が形成されやすくなるためと考えられる。

［サンプル１２〜１４］
図１４は、サンプル１２〜１４のポリウレタン膜の原料の組成および硬化条件を表わす説明図である。サンプル１２、１３のポリウレタン膜は、図７に示した製造方法に従って作製した。サンプル１４のポリウレタン膜は、後述するように、ステップＳ１２０およびステップＳ１３０に代えて、ドライ雰囲気下での一段階の硬化反応のみを行なった点が異なっている。サンプル１２〜１４のポリウレタン膜を作製する際には、ステップＳ１００において図１４に示す組成の原料を用意した。図１４に示すように、サンプル１２〜１４のポリウレタン膜の作製で用いた原料の構成成分の種類、および成膜条件は、サンプル１と同様である。図１４では、各構成成分の組成を図８と同様に示している。

サンプル１２および１３では、その後のステップＳ１１０における原料の層の形成の工程、および、ステップＳ１２０における硬化の工程も、サンプル１と同様に行なった。ただし、ステップＳ１２０において、サンプル１２は硬化温度４０℃にて３０分間硬化反応を行ない、サンプル１３は硬化温度５０℃にて３０分間硬化反応を行なった点が異なっている。その後、サンプル１２および１３では、さらにステップＳ１３０として、ドライ雰囲気下にて硬化を促進する工程を行なった。具体的には、密閉容器から液水を除去してドライ雰囲気に変更し、６０℃で一晩のあいだ硬化反応を続行させた。サンプル１４では、ステップＳ１２０における水蒸気雰囲気下での硬化反応を行なうことなく、ドライ雰囲気下で硬化温度６０℃にて一晩のあいだ硬化反応を行なった。

図１５は、サンプル１２〜１４のポリウレタン膜を、サンプル１と同様にしてＳＥＭで観察した結果を示す説明図である。図１５では、一例として、各ポリウレタン膜の表面については５００倍で観察し、断面については１０００倍で観察した様子を示している。ただし、裏面については、サンプル１２は２００倍で観察した様子を示し、サンプル１３は５００倍で観察した様子を示している。なお、サンプル１４については後述するように孔形成が認められなかったため、基板を剥離しての裏面観察は行なわなかった。また、図１５では、各々のサンプルについての「膜厚−山部」、「膜厚−谷部」および各々の標準偏差、並びに表面と裏面のそれぞれについての平均細孔径、その標準偏差、孔径の最大値および最小値についても併せて示している。孔径の解析のためには、表面側については５００倍に拡大した像を用い、裏面側については２００倍に拡大した像を用いた。

図１５に示すように、サンプル１２，１３では、水蒸気雰囲気下にて硬化反応を行なうことにより、裏面まで貫通する発泡孔が形成された。これに対して、ドライ雰囲気下でのみ硬化反応を行なったサンプル１４では、発泡孔あるいは凹凸形状の形成は認められなかった。

サンプル１２とサンプル１３とを比較すると、原料組成が同じであるにもかかわらず（原料の層の厚さが同じであるにもかかわらず）、硬化温度が高いサンプル１３の方が膜厚が厚かった。これは、硬化温度が高いサンプル１３の方が、水蒸気を用いた発泡反応が活発に進行したためと考えられる。また、サンプル１２とサンプル１３とを比較すると、水蒸気雰囲気における硬化温度が低いサンプル１２の方が、表面側と裏面側の双方において、発泡孔の孔径（平均細孔径、最大値、最小値）が小さく、孔径のバラツキ（孔径の標準偏差）も小さかった。

なお、硬化反応の前段であるステップＳ１２０における反応温度が４０℃であるサンプル１２では、ポリウレタン多孔質膜の表面に干渉縞が見られた。干渉縞が見られることからも、膜表面で開口する複数の孔の孔径のバラツキが非常に小さいことが分かる。これに対して、発泡反応を伴う硬化時の温度を４０℃にする場合であっても、既述したサンプル１のように、ドライ雰囲気下で硬化促進するステップＳ１３０の工程を行なわない場合には、いずれのサンプルにおいてもポリウレタン多孔質膜の表面に干渉縞は観察されなかった（干渉縞についてはデータ示さず）。以上の結果より、水蒸気を用いた発泡反応を伴う硬化反応の時間をより短く設定して、その後さらにドライ雰囲気下での硬化促進反応を進行させることにより、平均細孔径をより小さくしつつ孔径のバラツキを小さくすることが可能であると考えられる。これは、硬化反応を２段階で行ない、１段目のみを水蒸気雰囲気下で行なうことにより、発泡反応が過剰に進行する前の孔径が小さく揃っている状態で発泡反応を停止させることができるためと考えられる。

［サンプル１５〜２３］
図１６は、サンプル１５〜２３のポリウレタン膜の原料の組成、硬化条件、および得られたポリウレタン多孔質膜の表面の形状に係る測定結果を示す説明図である。サンプル１５〜２３のポリウレタン膜は、図７に示した製造方法に従って作製した。図１６では、原料中の各成分の組成を、ポリオールを１００質量部としたときの各成分の質量割合として示している。

図１６に示すように、サンプル１５〜２３は、ポリウレタン膜の原料として用いたポリオールおよびイソシアネートの種類が、既述したサンプル１〜１４とは異なっている。用いたポリオールは、以下の通りである。サンプル１５では、水酸基価が３９７であるポリエーテルポリオール（ポリオキシプロピレングリセリルエーテル）を用いた。サンプル１６では、水酸基価が２７であるポリマーポリオール（グリセリンにプロピレンオキサイドとエチレンオキサイドを付加重合させたポリエーテルポリオール中で、スチレンとアクリロニトリルを ラジカル重合させたもの ）を用いた。サンプル１７では、水酸基価が５６であるポリエステルポリオール（ポリ（エチレンアジペート）ジオール）を用いた。サンプル１８では、水酸基価が５５であるポリカーボネートジオールを用いた。

イソシアネートとしては、サンプル１９では３３．６質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するモノメリックＭＤＩを用い、サンプル２０では２３．１質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するＭＤＩのポリオール変性体を用い、サンプル２１では３０．７質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するポリメリックＭＤＩを用い、サンプル２２では２８．７質量％のイソシアネート基（ＮＣＯ）を分子末端に含有するＭＤＩのカルボジイミド変性体を用いた。架橋剤としては、サンプル２３では、エチレングリコールを用いた。サンプル１５〜２３において、上記した成分以外は、サンプル１〜１４と同じ種類の原料を用いた。図１６では、ポリウレタン膜の原料の組成は，ポリオール量を１００質量部としたときの相対的な量によって表わしている。また、サンプル１５〜２３を製造する際には、ステップＳ１１０〜ステップＳ１３０の工程は、既述したサンプル１２と同様の条件で行なった。

図１７〜図２５は、作製したサンプル１５〜２３のポリウレタン膜を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立製作所製のＳ−８００）を用い、加速電圧は１５ｋＶとして斜めから観察した様子を示す。図１７〜図２５に示すように、ポリオール、イソシアネート、あるいは架橋剤の種類を異ならせた場合にも、少なくとも表面２２側で複数の細孔が開口するポリウレタン多孔質膜が得られることが確認された。なお、図１６には、サンプル１５〜２３の各ポリウレタン多孔質膜の、膜厚および表面２２の平均細孔径（表面孔の大きさ）も記載している。

＜ポリウレタン多孔質膜を用いた細胞培養＞
ポリウレタン多孔質膜（サンプル２４、２５）を作製し、これらのポリウレタン多孔質膜を用いて細胞培養を行なった結果を、以下に説明する。

［サンプル２４、２５］
図２６は、サンプル２４、２５のポリウレタン多孔質膜の原料の組成、硬化条件、および得られたポリウレタン多孔質膜の表面の形状に係る測定結果を示す説明図である。サンプル２４、２５のポリウレタン多孔質膜は、図７に示した製造方法に従って作製した。サンプル２４、２５のポリウレタン多孔質膜の作製で用いた原料の構成成分の種類は、サンプル１と同様である。図２６では、各構成成分の組成を図８と同様に示している。

サンプル２４および２５では、ステップＳ１１０〜ステップＳ１３０の工程は、既述したサンプル１２と同様の条件で行なった。なお、サンプル２４とサンプル２５とでは、ステップＳ１００における原料の混合（混合工程）から、ステップＳ１１０におけるスピンコート（層形成工程）までの時間を異ならせた。サンプル２４では、混合工程と層形成工程の間は、室温で１２分放置し、サンプル２５では、室温で３０分放置した。

上記のようにして作製したサンプル２４は、裏面２４まで貫通する孔を有する貫通膜であった。また、サンプル２５は、非貫通膜であった。なお、膜が「非貫通」であるとは、膜の裏面２４（製造時に基板と接していた面）を２０００倍で観察した特定の視野内において、孔の面積の合計が、視野面積全体の５％未満であることをいう。裏面２４側の孔の面積は、既述した「表面孔の大きさ」と同様に、画像解析ソフトＭａｃ−Ｖｉｅｗ（株式会社マウンテック製）を用いて画像解析により求められる。

サンプル２４のポリウレタン多孔質膜では、表面２２の平均細孔径（表面孔の大きさ）は１４μｍであり、裏面２４の平均細孔径（裏面孔の大きさ）は１１μｍであり、膜厚（山部の膜厚）は６μｍであった。また、サンプル２５の表面２２の平均細孔径は３μｍであり、膜厚は３μｍであった。上記のように、混合工程から層形成工程までの時間がより短いサンプル２４は貫通膜となり、混合工程から層形成工程までの時間がより長いサンプル２５は、表面２２の平均細孔径がより小さい非貫通膜となった。

［細胞培養条件］
（ｉ）細胞株
培養には、以下の２種の細胞株を用いた。
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）：ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ（独立行政法人 医薬基盤研究所 ＪＣＲＢ 細胞バンク：ＩＦＯ５０２７１）
ＡｏＳＭＣ（ヒト大動脈平滑筋細胞）：ＡｏＳＭＣ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−２５７１）

（ｉｉ）使用培地
ＨＵＶＥＣ用培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３３０−０５７）に、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０−１２２）、へパリンナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｈ３１４９−１００ＫＵ）、およびＥＣＧＳ（endothelial cell growth supplement) (ＳＩＧＭＡ、Ｅ２７５９)を添加したものを用いた。ＡｏＳＭＣ用培地としては、ＳｍＧＭ^ＴＭ−２ 平滑筋増殖培地−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１８２）を用いた。

（ｉｉｉ）培養用器具
図２７は、ポリウレタン多孔質膜の両面を用いて細胞培養を行なう際に用いた細胞培養器具６０を模式的に表わす斜視図である。細胞培養器具６０は、ガラス製であって、外径が１３ｍｍのリング状部材である。

細胞を培養する際には、上記リング状の細胞培養器具６０の一方の開口を覆うように、ポリウレタン多孔質膜を配置した。具体的には、細胞培養器具６０の側面の２箇所に予め両面テープを配置し、エタノール中でポリウレタン多孔質膜を細胞培養器具６０上に配置し、ポリウレタン多孔質膜の周辺部を上記両面テープに接着させた。その後、エタノールを除去してポリウレタン多孔質膜を乾燥させることにより、細胞培養器具６０にポリウレタン多孔質膜を固着させた。その際、後述する両面培養、および、表面２２に播種する片面培養のためには、リング状の細胞培養器具６０の内部でポリウレタン多孔質膜の表面２２が露出する向きとなるように、ポリウレタン多孔質膜を配置した。また、裏面２４に播種する片面培養のためには、リング状の細胞培養器具６０の内部でポリウレタン多孔質膜の裏面２４が露出する向きとなるように、ポリウレタン多孔質膜を配置した。

（ｉｖ）培養手順
（ｉｖ）−１：両面培養
図２８は、細胞培養器具６０を用いてポリウレタン多孔質膜の両面に細胞培養を行なう手順を示す説明図である。細胞培養の際には、細胞培養器具６０に取り付けたポリウレタン多孔質膜を、ＵＶ滅菌後、まず、ＡｏＳＭＣ用培地中で一晩プレコンディショニングした（図２８（Ａ））。そして、ポリウレタン多孔質膜の表面２２上にＡｏＳＭＣを播種し（図２８（Ｂ））、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５日間培養した（図２８（Ｃ））。その後、細胞培養器具６０を上下反転させ（図２８（Ｄ））、培地をＨＵＶＥＣ用培地に交換した（図２８（Ｅ））。そして、ポリウレタン多孔質膜の裏面２４上にＨＵＶＥＣを播種し（図２８（Ｆ））、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３日間培養した（図２８（Ｇ））。

（ｉｖ）−２：片面培養
片面培養の際には、細胞培養器具６０に取り付けたポリウレタン多孔質膜の一方の面（リング状の細胞培養器具６０の内部で露出する面）上のみに細胞を播種した。片側培養の際には、細胞培養器具６０に取り付けたポリウレタン多孔質膜を、ＵＶ滅菌後、播種する細胞に応じた培地中で一晩プレコンディショニングした。その後、ＨＵＶＥＣあるいはＡｏＳＭＣを、ポリウレタン多孔質膜の表面２２上または裏面２４上に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で、ＨＵＶＥＣならば３日間、ＡｏＳＭＣならば４日間培養した。

［評価方法］
細胞培養の後、ポリウレタン多孔質膜を、細胞培養器具６０ごと、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。その後、組織固定用４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（和光純薬工業株式会社、１６３−２０１４５）を用いて、３７℃環境下で１０分間処理して細胞を固定し、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有ＰＢＳおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで処理することで細胞膜に透過性を持たせ、各細胞を以下のようにして観察した。

ＨＵＶＥＣは、内皮細胞表面に集中して発現する細胞表面レセプターであるＣＤ３１に対するマウス抗体（ＳＩＧＭＡ、Ｐ８５９０）を一次抗体として用い、抗マウスＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−１１００４）を二次抗体として用いた。二次抗体で処理した細胞において蛍光物質を励起することにより、ＨＵＶＥＣのＣＤ３１を赤色に発色させた。

ＡｏＳＭＣは、平滑筋細胞の細胞骨格タンパクであるαＳＭＡに対するウサギ抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ３２５７５）を一次抗体として用い、抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ−１１００８）を二次抗体として用いた。二次抗体で処理した細胞において蛍光物質を励起することにより、ＡｏＳＭＣのαＳＭＡを緑色に発色させた（洗浄から染色までが図２８（Ｈ））。

上記した処理の後、ポリウレタン多孔質膜を細胞培養器具６０から剥離し、さらにプレパラート上に封入した。そして、ポリウレタン多孔質膜において細胞を培養した面を、レーザ共焦点顕微鏡を用いて観察した（図２８（Ｉ））。

［細胞培養結果］
図２９は、サンプル２５のポリウレタン多孔質膜（非貫通膜）の表面２２上にＨＵＶＥＣを播種して片面培養した結果を示す説明図である。また、図３０は、サンプル２５のポリウレタン多孔質膜（非貫通膜）の裏面２４上にＨＵＶＥＣを播種して片面培養した結果を示す説明図である。いずれも、ＨＵＶＥＣの播種密度は、５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。図２９、図３０共に、４００倍で観察した結果を示す。

図２９と図３０とを比較すると、ポリウレタン多孔質膜(非貫通膜)の表面２２の方が裏面２４よりも細胞の増殖が良好であった。この結果により、ポリウレタンの硬化時に水蒸気を供給することにより多孔質化（凹凸形成）したポリウレタン多孔質膜は、このような凹凸が形成されていないポリウレタン膜よりも、細胞培養膜として優れていることが確認された。

図３１は、サンプル２４のポリウレタン多孔質膜（貫通膜）の表面２２上にＡｏＳＭＣを播種し、裏面２４上にＨＵＶＥＣを播種して両面培養した結果を示す説明図である。図３２は、サンプル２５のポリウレタン多孔質膜（非貫通膜）の表面２２上にＡｏＳＭＣを播種し、裏面２４上にＨＵＶＥＣを播種して両面培養した結果を示す説明図である。いずれも、ＡｏＳＭＣの播種密度は１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２としており、ＨＵＶＥＣの播種密度は５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。図３１、図３２共に、４００倍で観察した結果を示す。

図３１と図３２とを比較すると、サンプル２４のポリウレタン多孔質膜（貫通膜）を用いた方が、サンプル２５のポリウレタン多孔質膜（非貫通膜）を用いた場合よりも、ＡｏＳＭＣおよびＨＵＶＥＣの増殖が良好であった。これは、ＡｏＳＭＣとＨＵＶＥＣとが、ポリウレタン膜の細孔を介して相互作用した影響によるものと考えられる。したがって、サンプル２４のような、貫通孔を有するポリウレタン多孔質膜の両面を用いて細胞培養を行なうことにより、例えば異なる細胞間の相互作用を解析することが可能になると考えられる。

＜ポリウレタン多孔質膜による癌細胞増殖抑制＞
ポリウレタン膜（サンプル２６、２７、２８）を作製し、これらのポリウレタン多孔質膜を用いて癌細胞増殖抑制効果を調べた結果を、以下に説明する。

［サンプル２６〜２８］
図３３は、サンプル２６〜２８のポリウレタン膜の原料の組成、硬化条件、および得られたポリウレタン膜の表面の形状に係る測定結果を表わす説明図である。サンプル２６、２７のポリウレタン多孔質膜は、図７に示した製造方法に従って作製した。サンプル２８のポリウレタン膜は、後述するように、ステップＳ１２０における水蒸気の供給を伴う硬化の工程を行なわずに製造した点が異なっている。図３３に示すように、サンプル２６〜２８のポリウレタン多孔質膜の作製で用いた原料の構成成分の種類は、サンプル１と同様である。図３３では、各構成成分の組成を図８と同様に示している。

サンプル２６および２７は、ステップＳ１１０における層形成工程も、サンプル１と同様に行なった。ステップＳ１２０では、水蒸気雰囲気下にて４０℃で３０分硬化反応を行ない、ステップＳ１３０では、ドライ雰囲気下にて６０℃で一晩硬化反応を行なった。サンプル２８は、ステップＳ１１０の層形成工程は、室温で、回転数２０００ｒｐｍにて６０秒間スピンコート処理を行なった。そして、水蒸気雰囲気下での硬化反応を行なうことなく、ドライ雰囲気下にて６０℃で一晩硬化反応を行なった。

上記のようにして作製したサンプル２６および２７は、孔が裏面にまで達していない非貫通膜であった。また、サンプル２８は、実質的に孔が形成されていない無孔膜であった。ここで、「無孔膜」であるとは、膜の表面２２（製造時に基板から離間していた面）を２０００倍で観察した特定の視野内において、孔の面積の合計が、視野面積全体の５％未満であることをいう。図３３に示すように、サンプル２６のポリウレタン多孔質膜では、表面の平均細孔径（表面孔の大きさ）は１６．２μｍであり、膜厚（山部の膜厚）は９μｍであった。また、サンプル２７の表面の平均細孔径は１１．１μｍであり、膜厚は１４μｍであった。また、サンプル２８の膜厚は６μｍであった。

［細胞培養条件］
（ｉ）細胞株
培養には、以下の２種の細胞株を用いた。
ＴＯＶ２１Ｇ（ヒト卵巣癌細胞）：ＣＲＬ−１１７３０（ＡＴＣＣ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
Ｃａｏｖ３（ヒト卵巣癌細胞）：ＨＴＢ−７５（ＡＴＣＣ）

（ｉｉ）使用培地
ＴＯＶ２１Ｇ用培地は、Ｍ１９９培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４５３０）とＭ１０５培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６３９５）とを１：１で混合した混合培地４５ｍＬと、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１．０３）５ｍＬとを混合し、さらにペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＶ３００１０）５００μＬを加えて調製した。Ｃａｏｖ３用培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｄ５９２１）４５ｍＬとＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１．０３）５ｍＬとを混合した混合培地に、さらにペニシリン（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＶ３００１０）５００μＬとＬ−グルタミン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｇ７５１３）１ｍＬとを加えて調製した。

（ｉｉｉ）培養手順
ＴＯＶ２１Ｇは、サンプル２６（ポリウレタン多孔質膜）、サンプル２８(ポリウレタン平滑膜)、および細胞培養プレート（ＨＴＢ−７５、Ｆａｌｃｏｎ）の各々の上に播種して培養を行なった。Ｃａｏｖ３は、サンプル２７（ポリウレタン多孔質膜）、サンプル２８(ポリウレタン平滑膜)、および細胞培養プレート（ＨＴＢ−７５、Ｆａｌｃｏｎ）の各々の上に播種して培養を行なった。サンプル２６〜２８上に細胞を播種する際には、基板上に成膜したポリウレタン膜を、基板から剥離せずに用いた。

細胞培養の際には、まず、基板上に成膜したポリウレタン膜を、ＵＶ滅菌後、播種する細胞に応じた培地中で一晩プレコンディショニングした。その後、ＴＯＶ２１ＧあるいはＣａｏｖ３を播種した。播種密度は、いずれの細胞も１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。播種した各細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４８時間培養した。

［評価方法］
培養後の細胞数（細胞密度）を測定し、各々のポリウレタン膜について細胞増殖率を求めた。具体的には、細胞増殖率は、培養後の細胞培養プレート上の細胞数（細胞密度）を１００としたときの、培養後のポリウレタン膜上の細胞数（細胞密度）の相対的な値として求めた。上記細胞密度は、細胞培養プレートあるいはポリウレタン膜の各々について、蛍光顕微鏡（オリンパス製）を用いて１００倍の倍率で観察する際に、ランダムに選択した５視野において計測した細胞密度の平均値として求めた。細胞増殖率の値が小さいほど、細胞増殖が抑制されていることを示す。

［評価結果］
図３４は、ＴＯＶ２１Ｇを、サンプル２６、サンプル２８、および培養プレートの各々の上に播種して培養を行なった結果を示す棒グラフである。また、図３５は、Ｃａｏｖ３を、サンプル２７、サンプル２８、および培養プレートの各々の上に播種して培養を行なった結果を示す棒グラフである。なお、図３４および図３５の棒グラフには、標準偏差も併せて示している。

図３４，３５に示すように、いずれの癌細胞を用いた場合にも、ポリウレタン平滑膜（サンプル２８）を用いた場合には、培養プレート上で培養した場合に比べて細胞増殖率が高かった。これに対し、ポリウレタン多孔質膜（サンプル２６またはサンプル２７）を用いた場合には、培養プレート上で培養した場合に比べて細胞増殖率が低くなり、癌細胞増殖抑制効果が認められた。

本発明は、上述の実施形態や実施例、変形例に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態、実施例、変形例中の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。

１０，１１０，２１０…ポリウレタン多孔質膜
２２…表面
２４…裏面
３０，１３０…発泡孔
４０…ポリウレタン原料の層
４２…ガラス板
４４…基板
５２…蓋体
５４…密閉容器
５６…水
２３０…孔

Claims (8)

1. 細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   基板上に、未硬化であって、少なくともポリオールとイソシアネートとを含むポリウレタン原料の層を形成する第１の工程と、
   前記基板上に形成された前記ポリウレタン原料の層における前記基板から離間した露出面に対して水蒸気の供給を行なって、前記ポリウレタン原料の層において、前記ポリウレタン原料の硬化を進行させると共に複数の凹凸を前記露出面に有する多孔質形状を形成させる第２の工程と、
   を備え、
   前記第２の工程によって前記ポリウレタン多孔質膜に形成される前記多孔質形状は、前記露出面で開口する複数の発泡孔によって形成され、前記ポリウレタン多孔質膜では、膜厚方向には単一の発泡孔が存在し、
   前記ポリウレタン多孔質膜の厚さが０．１〜１００μｍである
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
2. 請求項１に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記第１の工程で形成する前記層における前記ポリウレタン原料の組成、前記第２の工程における反応温度、および前記第２の工程における反応時間から選択される条件を調節することにより、前記ポリウレタン多孔質膜の厚さを０．１〜１００μｍにする
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
3. 請求項１に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記ポリウレタン多孔質膜は、前記露出面における平均細孔径が０．１〜１００μｍである
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
4. 請求項３に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記第２の工程における反応温度、前記第２の工程における反応時間、および前記第２の工程において前記露出面に対して供給する水蒸気量から選択される条件を調節することにより、前記ポリウレタン多孔質膜の前記露出面における平均細孔径を０．１〜１００μｍにする
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
5. 請求項１から４までのいずれか１項に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記第２の工程は、前記多孔質形状として、前記露出面で開口する複数の発泡孔によって形成され、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を有する多孔質形状を形成する
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
6. 請求項５に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記第１の工程で形成する前記層における前記ポリウレタン原料の組成、前記第２の工程における反応温度、および前記第２の工程における反応時間から選択される条件を調節することにより、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として、前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を形成する
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
7. 請求項５に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、
   前記第１の工程は、
   前記ポリウレタン原料を混合する混合工程と、
   前記混合工程において混合した前記ポリウレタン原料を層状に形成する層形成工程と、
   を備え、
   前記混合工程の後に前記層形成工程を行なうまでの時間と、前記混合工程の後に前記層形成工程を行なうまでの間の前記ポリウレタン原料の環境温度と、から選択される条件を調節することにより、複数の前記発泡孔の少なくとも一部として、前記基板と接する側の面にまで貫通する発泡孔を形成する
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。
8. 請求項１から７までのいずれか１項に記載の細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法であって、さらに、
   前記第２の工程の後に、前記水蒸気の供給を停止して、前記ポリウレタン原料の硬化をさらに進行させる第３の工程を備える
   ポリウレタン多孔質膜の製造方法。