JP6338259B1

JP6338259B1 - 半月板再生用材料及び半月板再生用材料の作製方法

Info

Publication number: JP6338259B1
Application number: JP2017036086A
Authority: JP
Inventors: 克記稲垣; 徹夫須澤; 昌克糸瀬; 竜太郎上條; 達夫代田; 俊和嶋根
Original assignee: Showa University
Current assignee: Showa University
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2018-06-06
Anticipated expiration: 2037-02-28
Also published as: JP2018139898A

Abstract

【課題】半月板の再生をより促進することが可能な半月板再生用材料を提供する。【解決手段】膝関節の半月板の少なくとも一部を再生するため、膝関節内に移植されるように用いられる半月板再生用材料１０である。半月板再生用材料１０は、コラーゲンスポンジ１１と、コラーゲンスポンジに含浸された脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）１２と、を有する。コラーゲンスポンジ１１は、アテロコラーゲンスポンジであることが望ましい。コラーゲンスポンジ１１には、脂肪組織由来再生細胞とアテロコラーゲンゲルとが混合されたＡＤＲＣｓ溶液１３を含浸させることが望ましい。【選択図】図１

Description

本発明は、半月板再生用材料及び半月板再生用材料の作製方法に関する。

半月板は、膝関節内にある軟骨様組織であり、スポーツ活動や加齢などにより損傷・断裂を生じて半月板損傷を起こすことがある。半月板損傷は、慢性化すると痛みを伴う変形性膝関節症に移行するため早期の治療が必要である。半月板損傷の治療には、一般的に切除術、縫合術、保存療法などあるが、半月板内側は血管がなく、自然治癒は困難なことから、再生治療に関する技術の開発が望まれている。

このような再生治療に関する技術として、例えば、特許文献１には、自己再生能と多分化能を有する間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）を、半月板欠損部を覆うように該欠損部に注入することで、軟骨組織を再生させる技術が開示されている。

また、特許文献２には、架橋コラーゲンスポンジと膝蓋下脂肪体とからなる半月板再生基材が開示されている。この基材を膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、膝蓋下脂肪体に含まれる間葉系幹細胞により半月板の再生を促進しようとするものである。

しかしながら、特許文献１に記載の技術では、間葉幹細胞を直に体内に注入するため、間葉幹細胞が欠損部に滞留しにくく、体内に吸収されて十分な再生が行われないおそれがある。また、治療に充分な間葉系幹細胞を取得するためには長期間の培養が必要であるとともに、間葉系幹細胞を採取と移植のために複数回の手術をする必要があり、患者への負担が大きい。

また、特許文献２に記載の基材でも、架橋コラーゲンスポンジと膝蓋下脂肪体とが積層されているか、または架橋コラーゲンスポンジが膝蓋下脂肪体に包埋されている構成であるため、膝蓋下脂肪体が半月板近傍に滞留しにくく、再生が起こる前に体内に吸収されてしまう可能性がある。また、患者から採取した膝蓋下脂肪体をそのまま用いるため、再生に関与する間葉系幹細胞の量も少なく、再生が十分に行えない可能性があり、改良の余地がある。

特許第５６５６１８３号公報特開２０１４−１８３８９６号公報

本発明は、上記の事情に鑑みて為されたもので、半月板の再生をより促進することが可能な半月板再生用材料を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するため、本願に係る半月板再生用材料は、膝関節の半月板の少なくとも一部を再生するため、前記膝関節内に移植されるように用いられる半月板再生用材料であって、コラーゲンスポンジと、前記コラーゲンスポンジに含浸された脂肪組織由来再生細胞と、を有し、前記脂肪組織由来再生細胞は、生体内から採取された脂肪組織から分離され培養されることなく得られた、脂肪組織由来幹細胞を含む細胞集団であることを特徴とする。

本発明によれば、半月板の再生をより促進することが可能な半月板再生用材料を提供することができる。

本実施形態及び実施例の半月板再生材料を示す概略図である。膝関節の横断面を示す概略図である。ＣＤ３１，ＣＤ３４，ＣＤ４５の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す図であり、（ａ）は脂肪組織由来再生細胞の解析結果であり、（ｂ）は骨髄細胞の解析結果である。評価試験１における２１日培養後の軟骨細胞誘導培地の、アルシアンブルー染色とトルイジンブルー染色の写真である。評価試験１における２１日培養後の骨芽細胞誘導培地の、アルカリホスファターゼ活性染色、アリザリンレッド染色、フォン・コッサ染色の写真である。評価試験２の手順を示す概略図である。評価試験２における実施例１と比較例１の半月板再生用材料を移植して１２週後に摘出した左右の半月板の写真である。半月板（領域Ａ）と脛骨内顆関節面（領域Ｂ）とを示す写真である。脛骨内顆関節面に対する半月板の割合を示すグラフである。評価試験２において、摘出した内側半月板のヘマトキシリン−エオジン染色、トルイジンブルー染色、II型コラーゲンの免疫組織染色の写真であり、（ａ）は実施例１の半月板再生用材料を移植した右側の内側半月板であり、（ｂ）は比較例１の半月板再生用材料を移植した左側の内側半月板である。評価試験３におけるＧＦＰ陽性細胞の分布を示す写真であり、（ａ）は左右の脛骨内顆関節の明視野及び蛍光の写真であり、（ｂ）は摘出した左右の半月板の明視野及び蛍光の写真を横断面写真である。評価試験３におけるII型コラーゲン、ＧＦＰの二重免疫組織染色、及びこれらの重ね合わせの写真である。

近年、脂肪組織由来幹細胞や、それらを含む細胞集団である脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ、以下、単に「ＡＤＲＣｓ」ということがある。）を利用した組織再構築が臨床応用に向けて研究されている。本願の発明者は、半月板損傷治療の新規細胞ソースとして、自己再生能と多分化能に優れるＡＤＲＣｓに着目し、本願発明をするに至った。

以下、本願の一実施形態に係る半月板再生用材料について、図面を参照しながら説明する。図１は、本実施形態の半月板再生用材料の概略図である。この図１に示す本実施形態の半月板再生用材料１０は、膝関節の半月板の少なくとも一部を再生するため、膝関節内に移植されるように用いられる。この半月板再生用材料１０は、コラーゲンスポンジ１１と、コラーゲンスポンジ１１に含浸された脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）（図１に符号「１２」で示した）と、を有して構成される。

また、本実施形態では、ＡＤＲＣｓ１２とコラーゲンゲルとの混合溶液であるＡＤＲＣｓ溶液１３を用いることで、コラーゲンスポンジ１１に含浸させ易くしている。図２の膝関節１の断面図に示されるように、半月板２は、膝関節１の内側と外側に対向するように形成された内側半月板２ａと外側半月板２ｂとからなる。半月板２は、線維軟骨およびコラーゲンから構成される組織であるため、本実施形態のようなコラーゲンスポンジ１１、コラーゲンゲルを用いることで、組成物としても違和感のない使用が可能であり、拒絶反応等を抑制することができる。

上述のような構成の半月板再生用材料１０を膝関節の半月板の欠損部に移植すると、物質の保持性に優れるコラーゲンスポンジ１１によって、ＡＤＲＣｓが流出して体内に吸収されるのを良好に抑制することができる。そして、自己再生能と多分化能に優れるＡＤＲＣｓが、コラーゲンスポンジ１１を骨格として増殖することで、半月板の再生を、より効果的に促進することが可能となる。

また、特許文献２で使用する膝蓋下脂肪体は、体内での分量がもともと少ないため、十分な分量の幹細胞を得るのは困難であるとともに、採取の際に身体へ負担がかかる。これに対して、本実施形態で使用するＡＤＲＣｓは、体内に多く含まれる脂肪組織から採取できるため、再生に十分な分量のＡＤＲＣｓを容易かつ、低侵襲で採取することができる。

また、コラーゲンスポンジ１１のみの移植では、組織の再生が十分に行われない。本実施形態の半月板再生用材料１０のように、コラーゲンスポンジ１１とＡＤＲＣｓとの組み合わせで、しかも、ＡＤＲＣｓをコラーゲンスポンジ１１に含浸させることで、半月板の再生を顕著に促進することができるものである。

また、本実施形態では、ＡＤＲＣｓとコラーゲンゲルとを混合したＡＤＲＣｓ溶液１３を用いているため、ＡＤＲＣｓをコラーゲンスポンジ１１に含浸させ易くなる。さらに、コラーゲンスポンジ１１から体内へＡＤＲＣｓの流出防止効果が高まるとともに、コラーゲンゲルも足場として機能し、半月板の再生能力を、より向上させることができる。

また、コラーゲンスポンジとしては、ＡＤＲＣｓを含有できるものであれば、特に限定されないが、アテロコラーゲンを材料としたアテロコラーゲンスポンジを用いるのが最適である。また、ＡＤＲＣｓを混入させるコラーゲンゲルも、アテロコラーゲンを可溶化したものを用いることが好ましい。アテロコラーゲンは、アレルギーなどの原因となる抗原性を有するテロペプチドを酵素処理等で除去したコラーゲンであるため好ましい。

また、コラーゲンスポンジ１１へ含浸させるＡＤＲＣｓの細胞数が、１．７×１０⁴ cells/mm³以上であることが望ましい。このような細胞数のＡＤＲＣｓを含浸させたコラーゲンスポンジ１１からなる半月板再生用材料１０を移植することで、半月板の再生を、より効果的に促進することができる。このような半月板再生用材料１０を得るには、５×１０⁵ cells/10μL以上となるように調製したコラーゲンゲル溶液１３をコラーゲンスポンジ１１に含浸させることが望ましい。

以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
Ｉ型のアテロコラーゲンゲル（高研社製、ＡｔｅｌｏＣｅｌｌＩＰＣ−５０）を培地で中和した溶液１０μｌに、５×１０⁵個のＡＤＲＣｓを均一に懸濁し、ＡＤＲＣｓ溶液１３を得た。このＡＤＲＣｓ溶液１３を、１／４円の扇形、厚さ１／２に切断したアテロコラーゲンスポンジ（高研社製、ＭＩＧＨＴＹ、直径約５×厚み３ｍｍ）へ滴下した。滴下後に１，０００ｒｐｍで１分間遠心して、アテロコラーゲンスポンジ１１全体に、ＡＤＲＣｓが混入したアテロコラーゲンを浸透させて、実施例１の半月板再生用材料１０を作製した（図１、図４参照）。

（比較例１）
実施例１と同様のアテロコラーゲンスポンジに、アテロコラーゲンゲルのみを浸透させて、比較例１の半月板再生用材料２０を作製した（図４参照）。

（評価試験１）
評価試験１では、脂肪組織に含まれるＡＤＲＣｓの軟骨細胞と骨芽細胞への分化能について評価した。まず、８〜１０週齢の雄ＳＤラットの鼠蹊部の脂肪組織からＡＤＲＣｓを単離して、ＣＤ３１（血管内皮細胞），ＣＤ３４（幹細胞），ＣＤ４５（リンパ球）の発現をフローサイトメーターで解析した。

次に、軟骨細胞誘導培地（10% FBS αMEM, 2 mM L-glutamine, 2 mM Sodium pyrnvate,10^-4 M Ascolbicacid, 10 nM Dexamethasone, 1% ITS premix,10 ng/ml TGF-β3）と骨芽細胞誘導培地（10% FBS αMEM, 10 mMβ-glycerophosphate,50 μg/ml Ascolbicacid, 10^-8 M Dexamethasone）で３週間培養した。培養後に、軟骨細胞誘導と、骨芽細胞への誘導と、石灰化能を評価した。評価方法として、軟骨細胞誘導は、Alcian Blue（アルシアンブルー）染色、Toluidine blue（トルイジンブルー）染色で評価し、骨芽細胞への誘導はalkaline phosphatase（アルカリホスファターゼ）（ＡＬＰ）活性染色で評価し、石灰化能はAlizarin red（アリザリンレッド）染色とvon Kossa（フォン・コッサ）染色で評価した。図３Ａ〜図３Ｃに、評価試験結果を示す。

本評価試験１において、ラットの脂肪組織１ｇあたり細胞数約１０^６個が回収できた。図３Ａの（ａ）に示すように、脂肪組織由来幹細胞の指標であるＣＤ３１（−），ＣＤ３４（＋），ＣＤ４５（−）細胞は全細胞数のおよそ４．０％であった。一方、図３Ａの（ｂ）に示すように、骨髄細胞の中には、脂肪組織由来幹細胞の集団は認められなかった。

本評価試験１によれば、ＡＤＲＣｓは培養条件によって、軟骨細胞様細胞または骨芽細胞様細胞へ分化した。軟骨細胞誘導培地にて２１日培養後に各種染色法にて観察すると、図３Ｂのｃ、ｄにそれぞれ示すように、軟骨基質に含まれる酸性ムコ多糖を染めるアルシアンブルー染色とトルイジンブルー染色とは、ともに陽性細胞が認められた。図３Ｂのａ、ｂはコントロール培地（10% FBS αMEM）の染色結果を示す。

また、骨芽細胞誘導培地にて２１日培養後に各種染色法にて観察した。その結果を図３Ｃに示す。図３Ｃのａ，ｂ，ｃはコントロール培地、ｄ，ｅ，ｆは骨芽細胞誘導培地、ｇ，ｈ，ｉは骨芽細胞誘導培地＋ＢＭＰ-2 100 ng/mlの各染色結果を示す。この図３Ｃによれば、骨芽細胞分化の指標であるアルカリホスファターゼ活性染色陽性の細胞が増加して、石灰化の指標であるフォン・コッサ染色とアリザリンレッド染色陽性の領域が拡大した。

以上の評価試験１の結果から、脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）は、培養条件によって、種々の細胞へと分化する前駆細胞様の性状を備えることが確認できた。

（評価試験２）
評価試験２では、実施例１の半月板再生材料１０を用いて動物実験を行い、半月板の再生程度について評価した。また、対照実験として、比較例１の材料２０を用いて、同様の動物実験を行った。以下、図４に沿って、評価試験２の手順を説明する。

［半月板損傷モデルの作成と半月板再生用材料の移植］
実験動物として複数のラットを用意した。ラットには全身麻酔を施し、十分に麻酔が効いた状態で剃毛後、膝前方皮膚を切開して関節まで達した後に、内側側副靭帯を頸骨付着部の顆間隆起の間で切離した。さらに周囲の軟組織は関節包から剥離して、内側半月板を十分に明示した状態で、図４に示すように、ラットの後脚の両膝において、その内側半月板２ａ，２ａ’の前側１／２を切除した。

切除した半月板の部位に、ＡＤＲＣｓ溶液１３をアテロコラーゲンスポンジ１１に含浸させた実施例１の半月板再生用材料１０を、右膝の内側半月板２ａの切除部位に移植し、ナイロン糸で縫合して閉創した。対照として左膝の内側半月板２ａ’の切除部位に、アテロコラーゲンゲルのみ含ませた比較例１の材料２０を移植し、ナイロン糸で縫合して閉創した。

［免荷］
移植後１週間は、尾部懸垂によって、後脚の免荷を施した。

［評価２−１］
移植して４週後と１２週後に、両膝の半月板２を摘出して観察した。図５Ａに、１２週後の半月板２の写真を示す。図５Ａの左図に示される実施例１の半月板再生用材料１０を移植した右膝の内側半月板２ａは、図５Ａの右図に示される比較例１の半月板再生用材料２０を移植した左膝の内側半月板２ａ’に比較して、内側半月板の前方半側の組織修復が亢進した。

また、修復した組織を定量化するため、脛骨内顆関節面（図５Ｂの領域Ｂ）に対する半月板（図５Ｂの領域Ａ）の割合（領域Ａ／領域Ｂ）を算出した。図５Ｃは、算出した脛骨内顆関節面に対する半月板の割合を示すグラフである。この図５Ｃのグラフから解るように、実施例１の脂肪組織由来半月板再生用材料１０を移植したグループは、比較例１の半月板再生用材料２０を移植した対照グループに比べ、組織修復の割合が高いことが認められた（＊ｐ＜０．０１）。

［評価２−２］
移植して４週後と１２週後に、両膝の内側半月板２ａ，２ａ’を摘出し、Hematoxylin-Eosin（ＨＥ）（ヘマトキシリン−エオジン）染色、Toluidine Blue（トルイジンブルー）染色とII型コラーゲンの免疫組織染色からＡＤＲＣｓの再生能を評価した。

ここでは、図６に移植後１２週の組織を組織学的に観察した結果を示す。図６（ａ）に示すように、ＡＤＲＣｓを含浸させたアテロコラーゲンスポンジ１１からなる実施例１の半月板再生用材料１０を移植した右側内側半月板２ａは、ヘマトキシリン−エオジン染色によれば、修復した前方欠損部に線維性軟骨とみられる組織修復が進んでいた。そして、既存の半月板（内側半月板２ａの後方半側）と同様に、軟骨の指標であるII型コラーゲンの発現と、酸性ムコ多糖を染めるトルイジンブルー染色陽性の領域が観察された。一方、図６（ｂ）に示すように、アテロコラーゲンスポンジ１１のみの比較例１の半月板再生用材料２０を移植した左側内側半月板２ａ’は、組織修復が認められなかった。

（評価試験３）
評価試験３では、全身の細胞が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識されたＳＤ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）グリーンラットのＡＤＲＣｓを用いて、実施例１と同様の半月板再生用材料１０を作製し、ヌードラットの右側の半月板切除部に移植して欠損部位への定着を評価した。また、対照として、アテロコラーゲンスポンジのみの比較例１の半月板再生用材料２０をヌードラットの左側の半月板切除部に移植した。また、修復された半月板の物性を評価するため、ナノインデンテーション法を用いて解析した。

［評価３−１］
図７（ａ）に、左右の脛骨内顆関節の明視野及び蛍光の写真を示し、図７（ｂ）に摘出した左右の半月板の明視野及び蛍光の写真を示す。また、図８に、II型コラーゲン、ＧＦＰの二重免疫組織染色（核染色）、及びこれらの重ね合わせの写真を示す。

移植したＡＤＲＣｓの修復後の分布を解析する目的で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識されたグリーンラット由来のＡＤＲＣｓを含む半月板再生用材料１０を移植すると、図７（ａ）、（ｂ）に実線で囲ったように、ＧＦＰ陽性細胞は移植相当部に局在した。

さらに、図８に示すII型コラーゲンとＧＦＰの二重免疫組織染色の所見では、４週後ではII型コラーゲン陽性細胞は確認できなかったが、１２週後になるとＧＦＰ陽性の移植したＡＤＲＣｓの一部はII型コラーゲン陽性細胞であった。

以上の結果から、移植したＡＤＲＣｓは修復部位に定着して、さらに軟骨様細胞へ分化することが示唆された。

［評価３−２］
また、膝関節に掛かる荷重を分散する能力を調べるために、修復された半月板の物性を評価した。ナノインデーテンション法による物性試験から、既存の半月板と比較して修復された半月板は僅かに弾性係数が高いが、近似した粘弾性を示した。

以上、評価試験１の結果から、実施例１に係るラット鼠径部の脂肪組織から採取したＡＤＲＣｓの一部は脂肪組織由来幹細胞を含み、培養条件によって、種々の細胞へと分化することが明らかになった。また、評価試験２、３の半月板損傷モデルの試験から、ＡＤＲＣｓによって健常組織に類似した半月板が誘導されること明らかとなった。このように、ＡＤＲＣｓは高い誘導能を有し、低侵襲で移植時に新鮮な細胞が十分量採取できることから、半月板再生医療の理想的な細胞ソースとして応用可能なことが示唆された。

以上、本発明の実施例を図面により詳述してきたが、上記各実施例は本発明の例示にしか過ぎないものであり、本発明は上記各実施例の構成にのみ限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計の変更等があっても、本発明に含まれることは勿論である。

１０半月板再生用材料１１コラーゲンスポンジ
１２脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）１３ＡＤＲＣｓ溶液（混合溶液）

Claims

膝関節の半月板の少なくとも一部を再生するため、前記膝関節内に移植されるように用いられる半月板再生用材料であって、
コラーゲンスポンジと、
前記コラーゲンスポンジに含浸された脂肪組織由来再生細胞と、を有し、
前記脂肪組織由来再生細胞は、生体内から採取された脂肪組織から分離され培養されることなく得られた、脂肪組織由来幹細胞を含む細胞集団であることを特徴とする半月板再生用材料。
前記コラーゲンスポンジが、アテロコラーゲンスポンジであることを特徴とする請求項１に記載の半月板再生用材料。
前記脂肪組織由来再生細胞と、アテロコラーゲンゲルとの混合溶液が、前記コラーゲンスポンジに含浸されていることを特徴とする請求項１または２に記載の半月板再生用材料。
前記コラーゲンスポンジへ含浸される前記脂肪組織由来再生細胞の細胞数が、１．７×１０⁴ cells/mm³以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の半月板再生用材料。
膝関節の半月板の少なくとも一部を再生するため、前記膝関節内に移植されるように用いられる半月板再生用材料の作製方法であって、
生体内から脂肪組織を採取する工程と、
採取された前記脂肪組織から脂肪組織由来幹細胞を含む細胞集団である脂肪組織由来再生細胞を分離する工程と、
分離した前記脂肪組織由来再生細胞を、培養することなくコラーゲンスポンジに含浸させる工程と、を有することを特徴とする半月板再生用材料の作製方法。