JP6323702B2 - 細胞培養用中空糸膜および中空糸モジュール - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するための培養基材として用いる中空糸膜に関する。

幹細胞は臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は万能細胞であり全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は患者自身から採取でき、拒絶反応の恐れがないため細胞移植治療に用いる移植用細胞として注目されている。

ヒトにおける体性幹細胞は現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、これら体性幹細胞は組織中には極めて少数しか存在しない。

そこで、生体組織から得られた体性幹細胞を生体外で培養し、治療に必要な細胞数まで増幅した後、同一人又は他人の治療に使用するという細胞移植治療の研究が進展し、実用化され始めている。

しかしながら、一般に実施されている細胞培養の作業では、生物学的な汚染のリスクが高いことや、人件費によるコスト高などが課題となるため、細胞移植治療の更なる発展には安全かつ低コストで幹細胞を培養することが求められる。

ところで、生体内において接着性であった細胞は、生体外においても培養基材に接着しなければ増殖あるいは生存することが出来ない。このために接着性の幹細胞を培養するには培養基材への接着を促すコラーゲンやフィブロネクチンのような細胞接着因子の存在が必要である。

特許文献１には、中空糸膜を用いた細胞培養システムが開示されている。２種類の中空糸膜が細胞を播種する基材として示されており、デスモパン（登録商標）（０．５％熱可塑性ポリウレタン）およびポリフラックス（商品名）（ポリアミド＋ポリアリールエーテルスルホン＋ポリビニルピロリドン混合物）が試験されている。これらの膜特性は不明であるが、ポリフラックスに関しては、ポリビニルピロリドンの混合物であることから親水化膜である。また、特許文献２には、６５−９５％の疎水性高分子と５−３５％の親水性高分子を含む中空糸膜からなる細胞培養システムが開示されており、前述のポリフラックスの使用例が示されている。これらの文献からは、中空糸膜型の細胞培養装置により、効率的な拡大培養が実施できることが示されている。しかしながら、本文献によれば、培養を行うに際して、膜の使用に先立ち、血小板溶解物、血漿、フィブロネクチンのような表面処理を施すことで、所望の培養が行えることが示されており、接着性細胞の培養においては、予め何らかの細胞接着因子を基材にコーティングすることが必要となることが示されている。特許文献３には、浮遊細胞の培養において中空糸膜を用いた技術が開示されている。該文献には、疎水性の中空糸膜を用いることにより、ガスの供給と培地交換を行うことが示されているが、ここで用いられている中空糸膜は、細胞培養のための基材としての使用ではない。また、特許文献４には、疎水性高分子であるポリスルホン、ポリエーテルスルホンまたはポリアリールエーテルスルホン、および親水性高分子であるポリビニルピロリドンを含む膜に、４〜１００ｖｏｌ％の濃度の酸素の存在下で、１２．５〜１７５ｋＧｙのガンマ線またはベータ線または電子ビームを照射して表面修飾することにより、何らかの前処理なしに接着細胞を培養できる技術が開示されている。

しかしながら、こうした細胞接着因子を培養基材へコーティングすることは、接着因子の材料コストおよび作業にかかるコスト増をもたらす。また、コスト増の問題もさることながら、細胞接着因子が動物由来成分である場合には、未知の感染のリスクを新たに生むこととなる。近年、遺伝子組換え大腸菌により製造された細胞接着因子を用いることにより、感染リスクの低減がもたらされてはいるものの、こうした製造においては組換え大腸菌の培養工程に用いられる培地成分一つ一つの由来追跡など煩雑な作業が必要となる場合もある。
したがって、これら課題を解決するためには、細胞接着因子のコーティングを必要とせずに細胞を接着させ、かつ培養・増殖することが出来る培養基材を提供する必要がある。

特表２００９−５４０８６５号公報 特表２０１０−５２３１１８号公報 特開２０１４−１１７１９０号公報 特表２０１２−５０３６８８号公報

本発明は、細胞接着因子のコーティング処理や電子線等による表面改質等の前処理を必要としない、細胞の接着、培養が可能な中空糸膜および中空糸膜を用いる細胞培養方法を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．接着性細胞の培養基材として用いるための中空糸膜であって、該中空糸膜はポリエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンを含み、該中空糸膜全体における該ポリビニルピロリドンの含有率が０質量％超１質量％未満であり、該中空糸膜表面における該ポリビニルピロリドンの含有率が０質量％超１０質量％未満であることを特徴とする細胞培養用の中空糸膜。
２．１に記載の中空糸膜を複数本束ねた中空糸束が格納された細胞培養用の中空糸モジュール。
３．２に記載の中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる細胞培養方法。
４．２に記載の中空糸モジュールを細胞培養容器として含む細胞培養装置。

本発明により、細胞接着因子のコーティング処理が不要な培養基材としての中空糸膜を提供することが可能となる。また、本発明の中空糸膜を用いることにより、間葉系幹細胞などの各種細胞を、安全、簡便かつ高効率に培養することができる細胞培養系の構築、提供を可能とする。

本発明の中空糸モジュールの一例を示す模式図である。 本発明の細胞培養装置の一例を示す模式図である。

本発明において、「疎水性」とは水とのなじみにくさ（「親水性」の場合は、水とのなじみやすさ）を意味する。例えば、高分子と水との疎水性、親水性を客観的に示す指標の例として、接触角が挙げられる。接触角は、高分子のシート、フィルムまたは膜の表面に置いた水滴の固体、液体及び気体（一般的には空気、以下空気という）の接する部位から、液体の曲面に接線を引いたとき、この接線と固体表面のなす角度と定義するものであり、例えば、ＪＩＳ Ｒ３２５７（１９９９）の静滴法に準拠して測定された値である。接触角が小さいほど親水性が高く、接触角が大きいほど疎水性が高くなる。本発明においては、この接触角が、７０度以上のものを疎水性、７０度未満のものを親水性と区分する。

疎水性の高分子のみからなる多孔質膜を乾燥すると、表面張力のため高圧を付加しない限り、細孔内に水を導入することができない。すなわち、簡単には再湿潤化することができない。特に、細孔径がサブミクロンサイズ以下のもので顕著である。このため、疎水性を有する膜は、水を媒体とした固液分離用途には適さず、固気分離、気液分離などの気体を通過させるための用途で好適に使用される。このようなことから、疎水性材料のみからなる膜を固液分離に使用するためには、予め低い表面張力を有する液体（アルコールなど）で膜を濡らし、細孔内に導入後に、その液体を水に置換して用いるという方法によってのみ使用に供することが可能となる。一方、親水性の材料を十分に細孔表面に含有する膜の場合は、低い水との表面張力（低い接触角と同質）により、乾燥状態からの直接の水への置換が可能となる。このことから、固液分離に供する際には、前処理が簡便となり、好適に用いられる。

本発明において、中空糸膜の材料として用いる疎水性高分子は、細胞を中空糸膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではないが、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレンなどが好適に利用出来る。また、これらの誘導体が主成分であってもよい。上記の疎水性高分子の中でも、ポリスルホン系高分子であるポリエーテルスルホンやポリスルホンがより好ましい。ポリスルホン系高分子は、下記の化学式１および２で示される繰り返し単位を主成分とするものである。

本発明において、親水性高分子は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（以下、ＰＶＰと略記することがある）、カルボキシメチルセルロース、デンプンなどの水溶性高分子や、これらの共重合体や誘導体などが例示される。中でも、ポリスルホン系高分子との相溶性、流体処理膜としての使用実績から、ＰＶＰが好ましい。これらは単独で使用しても、２種以上を混合して使用してもよい。ＰＶＰの分子量としては、Ｋ値として１０〜１００のものが好ましい。具体的には、例えば、ＢＡＳＦ社より市販されているＬｕｖｉｔｅｃ（商品名）Ｋ１７、Ｋ３０、Ｋ６０、Ｋ８０、Ｋ８５、Ｋ９０が好ましく、中でもＬｕｖｉｔｅｃ（商品名）Ｋ６０、Ｋ８０、Ｋ８５、Ｋ９０がより好ましい。

本発明において、中空糸膜は、膜全体における親水性高分子の含有率が０質量％超１質量％未満であり、膜表面における親水性高分子の含有率が０質量％超１０質量％未満であることが好ましい。なお、膜全体における親水性高分子の含有率は、核磁気共鳴分光測定（ＮＭＲ）を用いた分析によって決定されたものである。また、膜表面における親水性高分子の含有率は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＥＳＣＡ）を用いて求めたものである。ＥＳＣＡでは、膜表面から深さ１０ｎｍ程度までの親水性高分子の含有率を測定することができる。

本発明において、膜全体における親水性高分子の含有率が０質量％超１質量％未満であり、膜表面における親水性高分子の含有率が０質量％超１０質量％未満の中空糸膜は、中空糸膜表面に液体培地（以下、単に培地と称することがある）を接触させた際に、フィブロネクチン等のタンパク質が短時間のうちに速やかに吸着する。これにより、中空糸膜表面に幹細胞等の接着性細胞が接着しやすい環境ができるため、その後に高効率に増殖させることが出来る。

中空糸膜の表面に付着するタンパク質の量は、特に膜表面の親水性高分子の含有率が低いほど多くなるが、低すぎると、水に濡れないため細胞培養を行う際には、培地を通過させる前に４０％エタノール溶液などを用いた親水化処理が必要となり、培養に用いるには簡便さの点で問題がある。また、親水性高分子の含有率が高すぎると、タンパク質が付着しにくくなるため必然的に細胞の接着も少なくなる問題がある。

本発明において、中空糸膜の大きさについては特に制限はないが、内径は好ましくは１００〜１０００μｍ、より好ましくは１５０〜５００μｍ程度である。膜厚についても、特に制限はないが、中空糸膜が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲であればよく、１０〜１５０μｍ、より好ましくは２０〜１００μｍ程度が適している。

本発明において、中空糸膜の孔径は、細胞は通過させないが水、塩類、タンパク質などの培地成分は通過させる通孔であれば、特に限定されるものではない。細胞の培養を考慮すると、物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が望ましく、平均孔径が０．００１〜０．５μｍであることが好ましく、０．０１〜０．１μｍ程度がより好ましい。また、分画分子量（篩係数が０．１未満となる分子量）は、１〜１００万が好ましく、２〜２０万程度がより好ましい。さらに、膜の孔径は、培養に伴う各種生体成分の吸着や目詰まりの影響も受けることになる。すなわち、最適な設計は、これらの物質との相互作用を鑑みて実施されるべきである。

本発明において、中空糸膜の透水性についても特に制限はないが、好ましくは１０〜１０００ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇ、より好ましくは２０〜５００ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇである。透水性が小さすぎると、十分な物資移動を発現できない。また、透水性が大きすぎると、中空糸膜の内腔および外腔に培地などを流した場合に、膜間の圧力差が生じ、勝手にろ過が発生したり、中空糸膜の長さ方向で流れ（培地成分）の分布（濃度差）ができてしまうため好ましくない。

前記したように、本発明の中空糸膜は、培地に接触することにより速やかに培地中に含まれるタンパク質の吸着が起こるが、それによって細胞培養中の膜の透水性や物質透過性が損なわれることは好ましくない。本発明の中空糸膜は、細胞接着を促すタンパク質の付着と共に、培養中の細胞に対し、栄養素やガスの供給と老廃物の除去などの物質交換を培養基材である膜を介して効率よく実施することが可能である。

本発明において、中空糸膜を培養基材として用いるメリットは、通常のシャーレやフラスコ培養では実現できない膜を介した物質交換ができることであり、栄養分や酸素、二酸化炭素の供給（濃度調整）と老廃物の除去を効率的に行うことができる。しかしながら同時に、必要な成分が過剰に除かれてしまう懸念もあるため、細孔径を最適にコントロールすることにより、細胞近傍の培養環境を良好なものとし、培養効率の向上を達成できる。ただし、細孔径（物質透過性）は、培地中のタンパクや細胞分泌タンパク（主に細胞接着性の細胞外マトリックスを形成するフィブロネクチンなど）の付着による影響を非常に受けやすい。従って、これらの影響下においても、十分な物質交換が行われることが必要となる。従来技術では、この点を補うために、膜の親水化が好ましく実施されていた。しかし、細胞の接着性を向上するためには、高度に精製された細胞接着因子を長時間（凡そ１日）かけて基材にコーティングする処理が必要であった。本発明は、疎水性と親水性のバランスに優れる中空糸膜を用いることにより、膜表面への前記タンパクの速やかな付着と物質交換を両立させたものである。

（中空糸モジュール）
本発明において、例えば、筒状容器に数十〜数万本の中空糸束を格納することにより細胞培養容器である中空糸モジュールを作製することができる。このような中空糸モジュールは、中空糸膜の大きさにもよるが、単位容積あたりの培養面積を大きくとることができ、また、培養操作も簡便化することができるため、省スペースで安全性の高い細胞培養を実施することが出来る。

このような中空糸膜を用いたモジュールの構成は特に限定されないが、例えば、図１に示すように、４つの開口部（端部導管および側部導管）を有するモジュールケース３に中空糸膜４が適宜必要な本数束ねられて充填されている形態が挙げられる。前記４つの開口部のうち、２つの端部導管１ａまたは１ｂは、それぞれ前記中空糸束の両端において各中空糸膜の内腔（中空部）と外腔を分離した状態で、中空糸膜の中空部を閉塞しないように適当なシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤）によりモジュールケース端部に接着固定されており、前記端部導管１ａまたは１ｂの一方から導入された液体などが中空糸膜の内腔を通ってもう一方の端部導管１ｂまたは１ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記開口部のうち、残りの２つの側部導管２ａまたは２ｂは、前記モジュールケース３の内側であって、かつ前記中空糸束の外側である空間（以下、単に「外腔」とも呼ぶ）と接続されており、前記側部導管２ａまたは２ｂの一方から導入された液体などがモジュールの外腔を通ってもう一方の側部導管２ｂまたは２ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。

本発明において、細胞培養容器として前記中空糸モジュールを用いる場合、細胞培養は、中空糸膜の内腔または外腔のいずれにおいて行っても良いが、内腔で培養を行うのが好ましい。例えば、内腔にて、細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入して内腔に充填することにより中空糸膜の内表面に細胞を播種し、播種終了後、細胞懸濁液を培地に切り換えて灌流し、一定期間培養を行う。この間、同時に、外腔へも培地を側部導管より注入し灌流するのが好ましい。

液体培地は、細胞に必要な養分や酸素・二酸化炭素などのガスを供給する役割を有する。培養期間中、ガス交換および細胞への栄養供給、老廃物除去のため、内腔、外腔ともに培地を一方向に供給し続けることが好ましい。その際、ポンプ等を用いることにより、適切な速度で循環させたり、供給・排出したりすることができる。

前記中空糸モジュールは、適切な方法で滅菌して市場に供給される。滅菌方法については、特に制限はないが、例えば、高圧蒸気滅菌、電子線滅菌、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌等が挙げられる。

本発明において、培養容器として中空糸モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地を供給することができるため、培養容器としてシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な培地の交換作業は不要となり、作業者の拘束時間やコンタミネーションのリスクを減らすことができる。

（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる細胞は、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子が導入された細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。

（細胞培養装置）
図２は、本発明の細胞培養装置の構成例の一つを示す。図２において、５および６はそれぞれ、液体培地貯留容器（培養バッグなど）である。液体培地貯留容器５からは、無菌接続コネクタ４１およびバルブ２１を経由して、細胞培養容器１０（中空糸モジュール）の端部導管（図１の１ａ）に回路が接続され、液体培地貯留容器５に入っている培地が細胞培養容器１０の内腔に移送できるようになっている。一方、液体培地貯留容器６からは、無菌接続コネクタ４２およびバルブ２３を経由して、細胞培養容器１０の側部導管（図１の２ａ）に回路が接続され、液体培地貯留容器６に入っている培地が細胞培養容器１０の外腔に移送できるようになっている。

細胞培養容器１０の端部導管（図１の１ｂ）からは、ポンプ３１を経由して、廃液回収容器（または細胞回収容器）７まで回路が接続され、細胞培養容器１０を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記回路に設けられたポンプ３１により、液体培地貯留容器５から細胞培養容器１０への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器１０からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。一方、細胞培養容器１０の側部導管（図１の２ｂ）からは、ポンプ３０を経由して、廃液回収容器７まで回路が接続され、細胞培養容器１０を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記回路に設けられたポンプ３０により、液体培地貯留容器６から細胞培養容器１０への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器１０からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。

図２において、少なくとも液体培地貯留容器５、６および細胞培養容器１０は、ＣＯ_２インキュベータ５０内に収容されているのが好ましい。また、上記の操作や工程の制御、およびモニタリングを行うための作業コントローラ（作業パネル）６０を付加してもよい。

（細胞の培養）
本発明の中空糸膜を用い、例えば、中空糸膜内腔において細胞を培養する場合には、前述の中空糸モジュールを用い、端部導管の一方から細胞を懸濁した液を中空糸膜内腔に流入させることにより、細胞を播種することが出来る。一定時間静置して細胞を中空糸膜表面に接着させた後、インキュベータ内に設置した中空糸モジュールに連続あるいは間欠的に培地を送り込むことにより細胞を培養、増殖させることが出来る。また、培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。本発明の培養方法は、無血清培養にも用いることができる。

また、培地の供給にあたり、液体培地貯留容器は内腔および外腔に対して別々のものを用いても良いし、１つの容器から内腔および外腔の両方に培地を分配供給しても良い。この場合、内腔の培地組成と外腔の培地組成は同一であっても異なっていても良い。また、内腔の培地流速と外腔の培地流速は同一であっても異なっていても良いが、外腔の培地流速を早めるのがより好ましい。

細胞培養中の培地の流速については、特に制限はないが、細胞が増殖するのに応じて適宜流速を調整するのが好ましい。特に、対数増殖期に入るまでの培養初期段階においては、栄養供給と細胞周囲の微小環境の維持のために、流速を厳密に制御する必要がある。即ち、流速が遅すぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流速が速すぎると、細胞の周囲の環境変化が大きくなる。流速の調整は、培地中のグルコースや乳酸の濃度変化をモニターし、これをもとに行うのが好ましい。

本発明において、前記中空糸モジュール内の培地の流れは、一方向であることが好ましい。具体的には、培地が常に一方の端部導管から導入され、反対側の導管（導出口）に向けて流れる形態が挙げられる。一旦、中空糸モジュールから導出された培地を再度導入口から導入する、いわゆる循環式であってもよい。また、中空糸膜の内腔と外腔の少なくとも一方が循環式であってもよいし、その両方が循環式であってもよい。

本発明において、細胞播種後および／または細胞培養中は、中空糸モジュールの回転、震とう、あるいはローリング等を行っても良い。このような操作を行うことは、例えば、中空糸膜の内腔に播種した細胞を中空糸膜の表面に均一に分散・接着させるとか、気泡が発生した場合に除去しやすいとか、培養細胞に満遍なく培地の栄養を行き渡らせる、などの点で好ましい。

（細胞の回収）
本発明において、中空糸膜を用いて培養された細胞を回収するための手段は、特に限定されない。例えば、中空糸膜の内腔において細胞を培養した場合には、培地の灌流を停止した後、中空糸膜の内腔および外腔に存在する培地を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間灌流させ、培地を充分ＰＢＳに置換する。次に、ＰＢＳを除去し、トリプシン等のプロテアーゼ溶液を中空糸膜の内腔と外腔へ充填し、一定時間インキュベートする。このような処理により、培養細胞を中空糸膜から剥離させた後、培地などを中空糸膜の内腔へ流入させることにより中空糸膜から流し出し、細胞を回収することが出来る。

（透水性の測定）
乾燥状態の中空糸膜を含むモジュールに対し、モジュールケースの内容積の５０倍量の純水を一方の端部導管（図１の１ａ）から導入し、他方の端部導管（図１の１ｂ）から流出させ、膜を十分に洗浄し、膜孔と中空部を純水にて置換した。その後、中空糸膜の外腔も同様に図１の２ａから２ｂに向かって、モジュールケースの内容積の５０倍量の純水を通水して洗浄を実施した。２５℃に保温した純水を加圧タンクに入れ、レギュレータにより圧力を制御しながら、２５℃恒温槽で保温したモジュールの内腔へ純水を送り、出口（１ｂ）および透過側出口（２ｂ）を閉じることにより、膜の透過側（２ａ）から流出する濾液量を一定時間測定した。膜間圧力差は、モジュール入り口側への加圧圧力（タンクへの加圧と同一）とし、１００ｍｍＨｇで測定した。使用モジュールの膜透過部分の面積（中空糸膜の内径基準の膜面積）を用いて、中空糸膜の透水性（ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇ）を算出した。
また、乾燥状態の中空糸膜を含む別のモジュールに対し、モジュールケースの内容積の５０倍量の４０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ溶液を一方の端部導管（図１の１ａ）から導入し、他方の端部導管（１ｂ）から流出させ、膜を十分に洗浄し、膜孔と中空部を４０ｖｏｌ％ＥｔＯＨにて置換した。その後、中空糸膜の外腔も同様に、モジュールケースの内容量の５０倍量の４０ｖｏｌ％ＥｔＯＨ純水にて図１の２ａから２ｂに向かって通水することにより洗浄を実施した。その後、再度、上述の純水での洗浄、液置換を行い、ＥｔＯＨから純水に置換し、上述の方法にて、親水化処理後の透水性を測定した。

（ろ過実験）
（１）試験液を以下の通り準備した。即ち、イヌリン（分子量５，５００、ナカライテスク社）、デキストランＴ１０（分子量１０，０００、シグマ−アルドリッチ社）、デキストランＴ４０（分子量４０，０００、シグマ−アルドリッチ社）を注射用蒸留水（大塚製薬社）に溶解して、各々１，０００ｐｐｍ濃度の水溶液を調製し、試験液として以降の実験に用いた。
（２）乾燥状態の中空糸モジュールの中空糸膜内腔に、各試験液を通液してプライミングした後、２５℃に保った蒸留水または各試験液を１００ｍｍＨｇの圧を加え一定時間ろ過し、それぞれの篩（ふるい）係数（Ｓｉｅｖｉｎｇ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ、以下ＳＣ）を求めた。液のサンプリングは、ろ液が出始めた時点を基点として、その２分後からサンプリング開始し、数分間（３〜４分間）のろ液を全量回収した。ＳＣは、供給液のデキストラン等の濃度に対する、透過液のデキストラン等の濃度の比で定義される。デキストラン等の濃度は、ＧＰＣ法、比色法（アンスロン硫酸法）などの定法にて定量されるが、本法のような分子量の規定されている単分散性のデキストラン試薬を用いる場合は、簡便な比色法を用いることができる。また、実験の際に、各試験液での透水性も併せて、測定を実施した。
（３）次に、各中空糸モジュールの中空糸膜の内腔に１０ｖｏｌ％になるようにウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を充填し、２５℃で３０分間放置した後、充填液を除去し、中空糸膜の内腔部体積の凡そ１００倍量の純水で通液洗浄を実施後、前記（２）と同様にして各試験液をろ過し、ＳＣおよび透水性を求めた。なお、変化率は、接触後値／接触前値である。

（内径、膜厚の測定）
中空糸膜の内径、外径および膜厚は、中空糸膜をスライドグラスの中央に開けられたφ３ｍｍの孔に中空糸膜が抜け落ちない程度に適当本数通し、スライドグラスの上下面でカミソリによりカットし、中空糸膜断面サンプルを得た後、投影機Ｎｉｋｏｎ−Ｖ−１２Ａを用いて中空糸膜断面の短径、長径を測定することにより得られる。真円に近い中空糸膜について２方向の短径および長径を測定し、それらの算術平均値を中空糸膜断面１個の内径および外径とした。また、膜厚は（外径−内径）／２で算出した。最大および最小を含む５断面について同様に測定を行い、平均値を内径、外径および膜厚とした。

（中空糸膜表面のＰＶＰ含有率の測定）
中空糸膜表面のＰＶＰ含有率は、Ｘ線光電子分光法（ＥＳＣＡ法）で求めた。疎水性高分子としてポリスルホン系高分子を用いた場合の測定法を例示する。
中空糸膜１本を内表面の一部が露出するようにカミソリで斜めに切断し、内表面が測定できるように試料台に貼り付けて測定を行った。測定条件は次に示す通りである。
測定装置：アルバック・ファイ ＥＳＣＡ５８００
励起Ｘ線：ＭｇＫα線
Ｘ線出力：１４ｋＶ，２５ｍＡ
光電子脱出角度：４５°
分析径：４００μｍφ
パスエネルギー：２９．３５ｅＶ
分解能：０．１２５ｅＶ／ｓｔｅｐ
真空度：約１０^−７Ｐａ以下
窒素の測定値（Ｎ）と硫黄の測定値（Ｓ）から、次の式により中空糸膜表面のＰＶＰ含有率を算出した。
＜ＰＶＰ添加ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜の場合＞
ＰＶＰ含有率（Ｈｐｖｐ）［％］
＝１００×（Ｎ×１１１）／（Ｎ×１１１＋Ｓ×２３２）
＜ＰＶＰ添加ＰＳｆ（ポリスルホン）膜の場合＞
ＰＶＰ含有率（Ｈｐｖｐ）［％］
＝１００×（Ｎ×１１１）／（Ｎ×１１１＋Ｓ×４４２）

（中空糸膜全体のＰＶＰ含有率の測定）
中空糸膜をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解し、６０℃で１Ｈ−ＮＭＲを測定した。測定には、Ｂｒｕｃｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−５００を使用した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおける７．２ｐｐｍ付近のポリスルホン系高分子の芳香環由来のピーク（ａ）と、２．０ｐｐｍ付近のＰＶＰのピロリドン環由来のピーク（ｂ）の積分強度比より、次式によりＰＶＰの含有率を算出した。
ＰＶＰ含有率［質量％］
＝｛（ｂ／ｎｂ）×１１１×１００｝／｛（ａ／ｎａ）×Ｍａ＋（ｂ／ｎｂ）×１１１｝
ただし、Ｍａはポリスルホン系高分子の繰り返し単位の分子量、１１１はＰＶＰの繰り返し単位の分子量、ｎａは繰り返し単位中に含まれる上記ａのプロトンの個数、ｎｂは繰り返し単位中に含まれる上記ｂのプロトンの個数を示す。

［実施例１］
（中空糸膜および中空糸モジュール１の作製）
ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（４８００Ｐ、住友化学社製）２０質量％とポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）０．２質量％、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）３５．９１質量％、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）４３．８９質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、ＮＭＰ１３．５質量％、ＴＥＧ１６．５質量％、水７０質量％の混合液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥した。乾燥後の中空糸膜の内径は２００μｍ、外径は３００μｍ、膜厚は５０μｍであった。
次に、中空糸モジュールを以下のように作製した。内径１ｃｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に、前記中空糸膜を１００本挿入した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両端をモジュールケースに固定し、図１に示すような形状の中空糸モジュール１を作製した。

［実施例２］
（中空糸膜および中空糸モジュール２の作製）
ＰＥＳ２０質量％とＰＶＰ０．５質量％、ＮＭＰ３５．７７質量％、ＴＥＧ４３．７３質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、ＮＭＰ１３．５質量％、ＴＥＧ１６．５質量％、水７０質量％の混合液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥した。乾燥後の中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が３００μｍ、膜厚が５０μｍであった。
得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール２を作製した。

［実施例３］
（中空糸膜および中空糸モジュール３の作製）
ＰＥＳ２０質量％とＰＶＰ１．０質量％、ＮＭＰ３５．５５質量％、ＴＥＧ４３．４５質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、ＮＭＰ１３．５質量％、ＴＥＧ１６．５質量％、水７０質量％の混合液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥した。得られた中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が３００μｍ、膜厚が５０μｍであった。
次に、得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール３を作製した。

［比較例１］
（中空糸膜および中空糸モジュール４の作製）
ＰＥＳ１９．５質量％とＰＶＰ１．５質量％、ＮＭＰ３５．５５質量％、ＴＥＧ４３．４５質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、ＮＭＰ１３．５質量％、ＴＥＧ１６．５質量％、水７０質量％からなる混合液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥した。得られた中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が３００μｍ、膜厚が５０μｍであった。
得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール４を作製した。

［比較例２］
（中空糸膜および中空糸モジュール５の作製）
ＰＥＳ１６質量％とＰＶＰ３．０質量％、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）７６．０質量％、水５質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、５０質量％ＤＭＡｃ水溶液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、５０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻取り、６０℃で乾燥した。得られた中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が２８０μｍ、膜厚が４０μｍであった。
得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール５を作製した。

［比較例３］
（中空糸膜および中空糸モジュール６の作製）
ＰＥＳ１６質量％とＰＶＰ５．０質量％、ＤＭＡｃ７４．０質量％、水５質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液とし、５０質量％ＤＭＡｃ水溶液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、５０ｃｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻取り、６０℃で乾燥した。得られた中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が２８０μｍ、膜厚が４０μｍであった。
得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール６を作製した。

［比較例４］
（中空糸膜および中空糸モジュール７の作製）
ＰＥＳ２０質量％、ＮＭＰ３６質量％、ＴＥＧ４４質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜原液とし、ＮＭＰ１３．５質量％、ＴＥＧ１６．５質量％、水７０質量％からなる混合液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側よりそれぞれ吐出し、３００ｍｍの空走部を経て、７５℃、水からなる凝固浴中に導き中空糸膜を形成し、水洗後、束状に巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥させた。得られた中空糸膜は、内径が２００μｍ、外径が３００μｍ、膜厚が５０μｍであった。
得られた中空糸膜を用いて、実施例１と同様にして中空糸モジュール７を作製した。

実施例１〜３および比較例１〜４において作製した中空糸膜について、中空糸膜全体のＰＶＰ含有率および中空糸膜表面のＰＶＰ含有率をそれぞれ核磁気共鳴分光測定（ＮＭＲ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＥＳＣＡ）により測定した。また、各々の中空糸モジュールについて、前述の方法で透水性を測定した。その結果を表１に示す。

ろ過実験の結果を表２および表３に示す。表２は、上記（３）に記載の培地を接触させる前と接触させた後の篩い係数（ＳＣ）の変化を示したものである。一方、表３は、上記（３）に記載の培地を接触させる前と接触させた後の透水性（ｍＬ／ｍ^２／ｈｒ／ｍｍＨｇ）の変化を示したものである。
実施例１〜３は、比較例と比べると、分子量が４万以上の高分子においては、若干透過性が下がる傾向があるものの、何れも良好な物質透過性を示している。
これらの中空糸膜に一般的な培地であるウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を一定時間接触させることにより、各中空糸膜の膜特性が変化した。即ち、実施例１〜３は、比較例１〜３に比べ、篩い係数（ＳＣ）や透水性が大きく変化する。これは、疎水性高分子膜の表面に、培地中に含まれるタンパク質がより効率的に付着するためである。また、タンパク質が付着した後においても一定以上の物質透過性を保持しているため、細胞培養には何ら影響を与えることは無い。このことにより、実施例１〜３の中空糸膜（中空糸モジュール）は、細胞接着性に優れた培養基材（培養容器）となる特性を有していることが示された。

（中空糸モジュールを用いた細胞培養実験１：一般培地使用）
図２に、細胞培養実験に用いた培養装置の構成を簡略化して示す。細胞培養実験には、本発明の実施例１〜３および比較例１〜３に記載のモジュールを用いた。細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。培地の流速は、中空糸膜の内腔は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外腔は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。また、培地供給には培養バッグ１Ｌ（ニプロ社製）（図２の５および６）を用いた。培地はウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したＤＭＥＭを用いた。培地灌流用ポンプとして、中空糸膜の内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の３０および３１）を用い、ＣＯ_２インキュベータ内で３７℃で７日間培養した。培地供給方法は、中空糸膜の内腔側、中空糸膜の外腔側ともに一方向とした。中空糸膜の内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸膜内腔側の灌流を開始した。７日間培養後、培地灌流を停止し、中空糸モジュール内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。

（中空糸モジュールを用いた細胞培養実験２：低血清培地使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験２を行った。本発明の実施例１〜３および比較例１〜３に記載の中空糸モジュールを用い、細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培地として、ウシ胎児血清を１ｖｏｌ％になるように添加したＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。その他の条件は、前記細胞培養実験１と同様とした。

（中空糸モジュールを用いた細胞培養実験３：無血清培地使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験３を行った。本発明の実施例１〜３および比較例１〜３に記載の中空糸モジュールを用い、細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培地として、血清無添加のＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。その他の条件は、前記細胞培養実験１と同様とした。

細胞培養実験１〜３の結果を表４にまとめて示す。
細胞培養実験１においては、本発明の疎水性高分子と親水性高分子を含む実施例１〜３の中空糸膜（中空糸モジュール）を用いることにより、一般的な培地であるウシ胎児血清を１０ｖｏｌ％になるように添加したＤＭＥＭを使った培養にて良好な細胞増殖率が得られた。一方、比較例１〜３の中空糸膜（中空糸モジュール）を使用すると、ほとんど細胞増殖が見られなかった。

細胞培養実験２においては、間葉系幹細胞培養に特化した低濃度（１ｖｏｌ％）血清の間葉系幹細胞専用培地を用い、培養実験を実施した。この培養実験においても、本発明の疎水性高分子と親水性高分子を含む実施例１〜３の中空糸膜（中空糸モジュール）が良好な細胞増殖率を示した。
更に、細胞培養実験３においては、この間葉系幹細胞専用培地に血清を添加しない無血清培地を用い、培養実験を実施した。この細胞培養実験においても、本発明の疎水性高分子と親水性高分子を含む実施例１〜３の中空糸膜（中空糸モジュール）が良好な細胞増殖率を示した。
一方、比較例の中空糸膜（中空糸モジュール）を使用すると、ほとんど細胞増殖が見られなかった。
即ち、細胞培養基材として優れるのは、中空糸膜全体の親水性高分子の含有率が０質量％超１質量％未満であり、膜表面の親水性高分子の含有率が０質量％超１０質量％未満の中空糸膜であると言える。

（細胞増殖率の測定）
培養終了後の細胞培養容器（中空糸モジュール）より回収した生細胞数と初期の播種細胞数を用いて以下の式により細胞増殖率を算出した。なお、細胞数の測定は、後述する方法にしたがった。
細胞増殖率（％）＝（回収した生細胞数−播種細胞数）／播種細胞数×１００

（細胞数の測定）
細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ^２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算方法：
Ｃ＝Ｎ×１０^４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０^４：１ｍｍ^２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量

（細胞表面マーカー測定）
培養後においても、間葉系幹細胞の性能を維持していることを確認するために、培養前および７日間培養後の表面マーカー測定を行った。表面マーカーは、ＩＳＣＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）のステートメントに基づき、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０は陽性(≧９５％)、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲは陰性(≦２％)であることを基準とした。
表面マーカー発現の測定は、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社製）を用いて実施した。抗体は、Ｈｕｍａｎ ＭＳＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いた。
培養前後の間葉系幹細胞の表面マーカー測定を行った結果を表５（培養前）および表６（培養後）に示す。中空糸モジュールを用いた培養前後で、細胞表面マーカーの発現パターンに変化がないことから、間葉系幹細胞の性質を維持していることを確認できた。

本発明により、細胞接着因子のコーティング処理が不要な培養基材としての中空糸膜を提供することが可能となる。また、本発明の中空糸膜を用いることにより、間葉系幹細胞などの各種細胞を、簡便かつ高効率に培養することができる細胞培養系の構築、提供が可能となる。

１ａ、１ｂ ： 端部導管
２ａ、２ｂ ： 側部導管
３ ： モジュールケース
４ ： 培養基材（中空糸膜）
５、６ ： 液体培地貯留容器
７ ： 廃液回収溶液または細胞回収容器
２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８ ： バルブ
４１、４２、４３ ： 無菌接続コネクタ
８ ： 細胞培養容器（中空糸モジュール）
３０、３１ ： ポンプ
５０ ： ＣＯ_２インキュベータ
６０ ： 作業コントローラ（作業パネル）

Claims (4)

1. 接着性細胞の培養基材として用いるための中空糸膜であって、該中空糸膜はポリエーテルスルホンおよびポリビニルピロリドンを含み、該中空糸膜全体における該ポリビニルピロリドンの含有率が０質量％超１質量％未満であり、該中空糸膜表面における該ポリビニルピロリドンの含有率が０質量％超１０質量％未満であることを特徴とする細胞培養用の中空糸膜。
2. 請求項１に記載の中空糸膜を複数本束ねた中空糸束が格納された細胞培養用の中空糸モジュール。
3. 請求項２に記載の中空糸モジュールを細胞培養容器として用いる細胞培養方法。
4. 請求項２に記載の中空糸モジュールを細胞培養容器として含む細胞培養装置。
   

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