JP6312215B2 - 人工多能性幹細胞、心筋細胞又はその前駆細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、体細胞初期化成功群の選別方法に関する。詳細には、本発明は、体細胞を初期化する際に、人工多能性幹（以下、iPSという）細胞を形成する可能性が高い細胞群を選別する方法に関する。更に、本発明は、体細胞を初期化する過程で生じる、iPS細胞を形成する可能性が低い細胞群の、心筋細胞製造のソースとしての利用に関する。

近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Takahashi及びYamanaka（非特許文献１）は、Fbx15遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインしたレポーターマウス由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した。Okitaら（非特許文献２）は、Fbx15よりも多能性細胞に発現が限局しているNanogの遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを作製し、該マウス由来の線維芽細胞で上記4遺伝子を強制発現させ、ピューロマイシン耐性かつGFP陽性の細胞を選別することにより、遺伝子発現やエピジェネティック修飾が胚性幹（ES）細胞とほぼ同等のiPS細胞（Nanog iPS細胞）を樹立することに成功した。同様の結果が他のグループによっても再現された（非特許文献３、４）。その後、c-Myc遺伝子を除いた3因子によってもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（非特許文献５）。

さらに、Takahashiら（非特許文献６）は、ヒトの皮膚由来線維芽細胞にマウスと同様の4遺伝子を導入することにより、iPS細胞を樹立することに成功した。一方、Yuら（非特許文献７）は、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した。また、Parkら（非特許文献８）は、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycの4因子に加えて、ヒト細胞不死化遺伝子として知られるTERTとSV40ラージT抗原を用いて、ヒトiPS細胞を作製した。このように、ヒト及びマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。

しかしながら、これまで、体細胞を初期化してiPS細胞を樹立する効率は極めて低く最高の状態でも数％と報告されている。このiPS細胞の樹立効率の低さが、体細胞初期化の分子機構の解明の遅れの最大の要因の一つであり、この問題を解決することで、実用性の高い、安全で高品質かつ均一なiPS細胞株の樹立方法の開発に繋がることが期待される。

体細胞が初期化されてiPS細胞が樹立する過程で、SSEA1が早期に発現することが報告されている（非特許文献９、１０）。また、MET（mesenchyme epithelial transition：間葉・上皮移行）が体細胞初期化の早期における重要なイベントであることが報告されている（非特許文献１１、１２）。

Sca-1(stem cell antigen-1)は、Ly-6ファミリー(Ly-6A/E)に属する約18kDaのGPI結合型表面タンパク質である。Sca-1は、骨髄中の造血幹細胞や造血前駆細胞に発現し、KSL（c-kit+ Sca-1+ Lin-）のマーカーの一つとして使用されている。CD34は、グリコシル化した膜貫通型タンパク質で、造血幹細胞や内皮幹細胞のような造血前駆細胞や骨髄前駆細胞のマーカーとして周知である。CD34の生物学的な機能はあまり解析されていないが、CD34が表現型として未分化状態にある前駆細胞の維持に関係することが示されている。しかしながら、Sca-1やCD34が、体細胞初期化の成功に関与することは知られていない。

iPS細胞を用いることにより、生体外で分化させた心筋細胞等の体細胞を生体内へ移植する再生医療が劇的に進歩したが、分化させた体細胞の中に未分化な細胞が混入すると奇形腫を形成する危険性がある。そこで、奇形腫形成のリスクが抑制された、細胞ソースを提供することが再生医療の分野で期待されている。

Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007) Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007) Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007) Park, I.H. et al., Nature, 451: 141-146 (2008) Cell Stem Cell, 2: 151-159 (2008) Cell Stem Cell, 2: 230-240 (2008) Cell Stem Cell, 7: 64-77 (2010) Cell Stem Cell, 7: 51-63 (2010)

本発明は、体細胞を初期化する際に、iPS細胞を形成する可能性が高い細胞群を選別する方法を提供することを課題とする。更に、本発明は、奇形腫形成の危険性の低い、心筋細胞又はその前駆細胞のソースを提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、Sca-1及びCD34という２つの表面マーカーに着目し、体細胞へ初期化因子を導入後に、Sca-1陰性CD34陰性細胞群をソートすることにより、最終的にiPS細胞を形成する細胞を濃縮することに成功した。更に、Sca-1陽性CD34陽性細胞群は、iPS細胞を形成する細胞の頻度は少ないものの、心筋細胞への分化能が高く、奇形腫形成の危険性の低い心筋細胞又はその前駆細胞のソースと有用であることを見出した。更に、Sca-1陰性CD34陰性細胞において発現の高い遺伝子をマイクロアレイにより網羅的に検索し、Sca-1に代わるマーカーとして、EpCamが有用であることを見出した。これらの知見に基づき、更に検討を加えた結果、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下を提供する：

［１］以下の工程を含む、人工多能性幹細胞の製造方法：
（１）体細胞に核初期化物質を接触させること、
（２）（１）で得られた細胞を培養すること、
（３）（２）で得られた細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離すること、及び
（４）（３）で単離された細胞を、更に培養し、人工多能性幹細胞を得ること。
［２］核初期化物質が、Oct3/4, Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である、［１］の方法。
［３］核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2およびc-MycまたはL-Myc、あるいはそれらをコードする核酸である、［１］または［２］の方法。
［４］体細胞がげっ歯類体細胞またはヒト体細胞である、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］体細胞が線維芽細胞である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］核初期化物質を接触させた体細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離することを含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮する方法。
［７］Sca-1またはEpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮するための試薬。
［８］以下の工程を含む、心筋細胞又はその前駆細胞の製造方法：
（１’）体細胞に核初期化物質を接触させること、
（２’）（１’）で得られた細胞を培養すること、
（３’）（２’）で得られた細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離すること、及び
（４’）（３’）で単離された細胞を、心筋細胞又はその前駆細胞分化条件下で培養し、心筋細胞又はその前駆細胞を得ること。
［９］核初期化物質が、Oct3/4, Klf4およびSox2、またはそれらをコードする核酸である、［８］の方法。
［１０］核初期化物質がOct3/4, Klf4, Sox2およびc-MycまたはL-Myc、あるいはそれらをコードする核酸である、［８］または［９］の方法。
［１１］体細胞がげっ歯類体細胞またはヒト体細胞である、［８］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］体細胞が線維芽細胞である、［８］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］核初期化物質を接触させた体細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離することを含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮する方法。
［１４］Sca-1またはEpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮するための試薬。

本発明により、体細胞の初期化成功の予測に重要な表面マーカーが同定されたので、容易に初期化が成功する可能性の高い細胞群を、初期化因子導入後早い段階で単離することができる。また、初期化成功候補細胞を絞りこめるので、初期化に関する分子機序のより正確かつ詳細な解明に繋がる。更に、本発明により、奇形腫形成の危険性の低い心筋細胞のソースが提供される。

iPS細胞製造の試験方法の模式図を示す。 体細胞初期化過程におけるSca-1及びCD34の発現を示す。 体細胞初期化過程におけるSca-1及びSSEA-1の発現を示す。 マウスES細胞におけるSSEA-1、Sca-1及びCD34の発現を示す。 ４因子導入後２〜５日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群からのNanog陽性iPS細胞コロニーの形成を示す。 ４因子導入後２〜５日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をiPS細胞形成のための培養に付し、SSEA-1の発現を解析した結果を示す。 ４因子導入後５日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群から形成されたNanog陽性iPS細胞コロニーの数を比較した結果を示す。 ４因子導入後５日目のSca-1^-/CD34^-細胞の形態を示す。 ４因子導入後５日目のSca-1^-/CD34^-細胞からiPS細胞のコロニーが形成される過程を示す。 ４因子導入後５日目のSca-1^-/CD34^-細胞からiPS細胞のコロニーが形成される過程を示す。 Sca-1^-/CD34^-細胞群に由来するiPS細胞における未分化マーカー遺伝子、内胚葉マーカー遺伝子、中胚葉マーカー遺伝子、外胚葉マーカー遺伝子の発現を、未分化ES細胞及び分化したiPS細胞と比較した結果を示す。３本のカラムは、左から未分化ES、未分化iPS、分化したiPSをそれぞれ示す。 Sca-1^-/CD34^-細胞から形成されたiPS細胞に由来するキメラマウスを示す。 ４因子導入後５日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群における初期化因子の発現を示す。３本のカラムは、左からSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-をそれぞれ示す。 Sca-1^-/CD34^-細胞におけるOct4の発現レベルを上昇させても、初期化効率が変化しないことを示す。４本のカラムは、左から、Oct4, Sox2, Klf4, c-Mycをそれぞれ示す。 心筋細胞製造の試験方法の模式図を示す。 Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群を心筋前駆細胞誘導培地で培養することにより得られる細胞の形態を示す。 Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群から誘導した心筋前駆細胞のスフィアを示す。 ４因子導入後５日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群から形成された拍動心筋細胞クラスターの数を比較した結果を示す。 拍動心筋細胞クラスターにおける細胞内カルシウム濃度の変動を示す。 Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群を心筋前駆細胞誘導培地中で培養したときの、心筋前駆細胞マーカー遺伝子の発現の経時的変化を示す。 Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞のテラトーマ形成能を示す。 ３因子導入後８日目にソートしたSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群から形成されたNanog陽性iPS細胞コロニーの数を比較した結果を示す。 初期化因子としてc-Mycに代えてL-Mycを使用した場合においても、Sca-1^-/CD34^-細胞群から高頻度にiPS細胞が誘導されたことを示す結果である。DN: Sca-1^-/CD34^-、DP：Sca-1⁺/CD34⁺、SP：Sca-1⁺/CD34^-。 ヒト線維芽細胞へ４因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）を導入後７日目にソートしたEpCam^-/CD34^-、EpCam⁺/CD34^-、EpCam^-/CD34⁺、EpCam⁺/CD34⁺の各細胞群から誘導されたヒトiPS細胞の数を比較した結果を示す。

本発明は、以下の工程を含む、人工多能性幹細胞の製造方法（本発明の製造方法I）を提供する：
（１）体細胞に核初期化物質を接触させること、
（２）（１）で得られた細胞を培養すること、
（３）（２）で得られた細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離すること、及び
（４）（３）で単離された細胞を、更に培養し、人工多能性幹細胞を得ること。

更に、本発明は以下の工程を含む、心筋細胞又はその前駆細胞の製造方法（本発明の製造方法II）を提供する：
（１’）体細胞に核初期化物質を接触させること、
（２’）（１’）で得られた細胞を培養すること、
（３’）（２’）で得られた細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離すること、及び
（４’）（３’）で単離された細胞を、心筋細胞又はその前駆細胞の分化条件下で培養し、心筋細胞又はその前駆細胞を得ること。

本発明の製造方法I及びIIにおいては、哺乳動物由来（例、マウス、ヒト）の生殖細胞以外のいかなる細胞も、iPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞作製のための出発材料として用いることができる。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。未分化な前駆細胞の例としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。体細胞は好ましくは線維芽細胞である。

体細胞のソースとなる哺乳動物の選択は特に制限されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはSca-1を発現する哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、最も好ましくはマウスである。更なる局面において、哺乳動物は、好ましくはEpCamを発現する哺乳動物、より好ましくはげっ歯類又は霊長類、最も好ましくはマウス又はヒトである。

本発明により得られるiPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、体細胞は、患者本人の細胞、又は患者のHLA型と同一か実質的に同一のHLA型を有する他人（提供者）から採取した細胞であることが特に好ましい。本明細書中にて使用する「実質的に同一のHLA型」は、提供者の体細胞由来のiPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞の分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されるときに免疫抑制剤などの使用とともに移植され得る程度に、提供者のHLA型が患者のHLA型と適合していることを意味する。例えば、実質的に同一のHLA型は、3つの主要なHLAである、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRが受容者と一致するようなHLA型を含む（以下において、同一の意味が適用されるであろう）。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして得られたiPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。

本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子またはそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照）
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40 Large T（Stem Cells Express, published online May 29, 2008, p1-16を参照）
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T（Stem Cells Express, published online May 29, 2008, p1-16も参照）
(14) Oct3/4, Klf4（Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照）
(15) Oct3/4, c-Myc（Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照）
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008)を参照)

上記(1)-(16)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、体細胞が上記(1)-(16)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。

これらの組み合わせの中で、得られるiPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4, Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記(9)）が好ましい。一方、iPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2及びLin28の5因子か、それにNanogを加えた6因子（即ち、上記(12)）が好ましい。

上記の各タンパク性因子のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれNCBI accession number NM_145833及びNM_024674を参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。

核初期化物質の体細胞への接触は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-Ject^TM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。

PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。核初期化物質のcDNAとPTD配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。

マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。

体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク性因子自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。

核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞、心筋細胞又はその前駆細胞の用途に応じて適宜選択することができる。

発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。

発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。

核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への接触は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、体細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など。あるいはMesenchymal stem cells basal medium(Lonza社)などの間葉系幹細胞用培地）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM〜約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な、任意の時間であってよい。

従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。

iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 （2008）)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。

尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えば、SV40 large Tは、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。

iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。

iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。

体細胞は、その培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。例えば約5〜20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地またはF12培地等で前培養することが可能である。

核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、体細胞を、培養する。培養は、例えばES細胞の培養に適した条件下で行われる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、bFGFの代わりにLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。

核初期化物質と接触させた体細胞を培養する時間は、核初期化物質との接触により、体細胞の一部の細胞群に、Sca-1及び／又はCD34の発現が誘導され、Sca-1陰性CD34陰性細胞群と、Sca-1陽性CD34陽性細胞群とがフローサイトメトリー解析により区別可能となるのに十分な時間であれば、特に限定されない。更なる局面において、核初期化物質と接触させた体細胞を培養する時間は、核初期化物質との接触により、体細胞の一部の細胞群に、EpCam及び／又はCD34の発現が誘導され、EpCam陽性CD34陰性細胞群と、EpCam陰性CD34陽性細胞群とがフローサイトメトリー解析により区別可能となるのに十分な時間であれば、特に限定されない。通常、核初期化物質との接触から２日後には、Sca-1陰性CD34陰性細胞群とSca-1陽性CD34陽性細胞群、或いはEpCam陽性CD34陰性細胞群とEpCam陰性CD34陽性細胞群とがフローサイトメトリー解析により十分に区別可能となるので、核初期化物質と接触させた体細胞の培養時間は、通常２日以上、好ましくは３日以上、より好ましくは４日以上である。また、培養期間が長すぎると、増殖速度の早いiPS細胞が出現し、非iPS細胞を凌駕してしまい、iPS細胞を形成する、初期化過程の非iPS細胞が濃縮された画分を単離するという目的が達成できなくなってしまうので、培養期間は通常１３日以内、好ましくは９日以内、より好ましくは５日以内である。従って、核初期化物質と接触させた体細胞の培養時間は、通常２〜１３日、好ましくは３〜９日、より好ましくは４〜５日である。ヒト等の霊長類の体細胞を用いる場合には、iPS細胞が誘導されるまでにげっ歯類と比較してより長い時間がかかるので、核初期化物質と接触させた体細胞の培養時間は、通常２〜２０日、好ましくは４〜１５日、より好ましくは６〜７日である。

最終的にiPS細胞の製造を意図とする場合、上記培養後の細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離する。

最終的に心筋細胞又はその前駆細胞の製造を意図とする場合、上記培養後の細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離する。

Sca-1(stem cell antigen-1)は、Ly-6ファミリー(Ly-6A/E)に属する公知の約18kDaのGPI結合型表面タンパク質である。マウスにおいては、異なるマウス系統で発現している２つのLy6-A/Eアリルの遺伝子産物Ly-6E.1及びLy-6A.2が存在し、そのいずれもSca-1に包含される。マウスSca-1の代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_034868.1（2012年12月12日更新）を参照することにより入手できる。ラットSca-1の代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number XP_216959.1（2012年6月20日更新）を参照することにより入手できる。

CD34は、グリコシル化した膜貫通型タンパク質で、造血幹細胞や内皮幹細胞のような造血前駆細胞や骨髄前駆細胞のマーカーとして周知である。マウスCD34の代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_598415.1（2012年12月12日更新）を参照することにより入手できる。ラットCD34の代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_001100672.1（2012年8月27日更新）を参照することにより入手できる。ヒトCD34の代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_001020280.1（2012年12月9日更新）を参照することにより入手できる。

EpCam (Epithelial cell adhesion molecule)は、上皮においてカルシウムイオン非依存的に細胞−細胞接着を媒介する膜貫通型糖タンパク質である。マウスEpCamの代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_032558.2（2013年10月27日更新）を参照することにより入手できる。ラットEpCamの代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_612550.1（2013年9月2日更新）を参照することにより入手できる。ヒトEpCamの代表的なアミノ酸配列情報は、NCBI accession number NP_002345.2（2013年12月21日更新）を参照することにより入手できる。

本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（抗原）発現の陽性／陰性で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子を特異的に認識する抗体による特異的結合の有無で細胞の表現型が表記される。マーカー分子発現の陽性／陰性による細胞の表現型の決定は、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析により行われる。マーカー分子が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上に発現しており、当該マーカー分子を特異的に認識する抗体による特異的結合が確認できることをいう。マーカー分子が「陰性」とは、該マーカー分子が細胞表面上に発現しておらず、当該マーカー分子を特異的に認識する抗体による特異的結合が確認できないことをいう。

Sca-1陰性CD34陰性細胞又はSca-1陽性CD34陽性細胞の単離は、Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体により、上記培養後の細胞を染色し、セルソーターや磁性カラム等を用いて目的とする画分（即ち、Sca-1陰性CD34陰性画分又はSca-1陽性CD34陽性画分）をソートすることにより実施することができる。高い精製度を達成するため、好ましくは、セルソーターが用いられる。

EpCam陽性CD34陰性細胞又はEpCam陰性CD34陽性細胞の単離は、EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体により、上記培養後の細胞を染色し、セルソーターや磁性カラム等を用いて目的とする画分（即ち、EpCam陽性CD34陰性画分又はEpCam陰性CD34陽性画分）をソートすることにより実施することができる。高い精製度を達成するため、好ましくは、セルソーターが用いられる。

本明細書において、「単離」とは、目的とする成分（又は細胞）以外の因子（又は細胞）を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたSca-1陰性CD34陰性細胞」の純度（全細胞数に占めるSca-1陰性CD34陰性細胞数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％である。「Sca-1陽性CD34陽性細胞」や、その他の細胞についても同様とする。

最終的にiPS細胞の製造を意図とする場合、単離されたSca-1陰性CD34陰性細胞又はEpCam陽性CD34陰性細胞を、更に、上述の核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後の体細胞の培養と同じ条件で培養し、iPS細胞を得る。

iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3/4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの、生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。

選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、自体公知の種々の試験方法、例えば後記実施例に記載されるES細胞特異的遺伝子（未分化マーカー遺伝子）の発現解析などにより行うことができる。さらに正確を期す場合は、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認すればよい。或いは、選択された細胞を宿主胚に導入することによりキメラ胚を調製し、これを偽妊娠動物に移入することによりキメラ動物を得て、更に、このキメラ動物を正常動物又は当該キメラ動物同士と交配し、次世代（Ｆ１）個体の中に、選択された細胞の子孫動物が含まれることを確認することにより、生殖系列を含む全ての胚葉への分化能（多能性）を確認することができる。

このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、網膜細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）・組織・臓器への分化を誘導することができる。

最終的に心筋細胞又はその前駆細胞の製造を意図とする場合、単離されたSca-1陽性CD34陽性細胞又はEpCam陰性CD34陽性細胞を、更に、心筋細胞又はその前駆細胞への分化条件下で、培養し、心筋細胞又はその前駆細胞を得る。

心筋細胞又はその前駆細胞への分化条件としては、ES細胞やiPS細胞を心筋細胞又はその前駆細胞へ分化誘導する方法として公知のあらゆる方法を採用することができる。
例えば、細胞を、ｂＦＧＦ及びＥＧＦを含有する無血清培地中で接着培養することにより、心筋前駆細胞を誘導することができる（Tomita Y et al. J Cell Biol. 2005;170:1135-46）。心筋前駆細胞を浮遊培養することにより、スフィアを形成し、当該スフィアを血清含有培地中で接着培養することにより、当該スフィア中に心筋細胞が発生する（Tomita Y et al. J Cell Biol. 2005;170:1135-46）。あるいは、細胞を、ＳＣＦの存在下、ＯＰ９ストローマフィーダー上で培養することにより、心筋細胞への分化を誘導することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.100, p4018-4023, 2003)。細胞をIV型コラーゲンをコートした培養容器上で、LIFを含有しない培地中で培養することにより、Flk＋細胞を誘導し、このFlk＋細胞をソートした上で、ＯＰ９ストローマフィーダー上で培養することにより、心筋細胞への分化を誘導することができる（Yamashita JK et al. FASEB J. 2005;19:1534-1536、Narazaki G et al. Circulation. 2008;118:498-506）。

得られた細胞の心筋前駆細胞への分化は、心筋前駆細胞特異的遺伝子の発現等を評価することにより、確認することができる。

得られた細胞の心筋細胞への分化は、細胞やスフィアの自己拍動、自己拍動と同期して変化する細胞内カルシウム濃度のオシレーション、心筋細胞特異的遺伝子の発現等を評価することにより、確認することができる。

最終的に得られた心筋細胞やその前駆細胞を心筋内に移植することにより、心筋の障害により生じる種々の心筋疾患（心筋症、心筋炎、心臓腫瘍等）を治療することができる。

また、本発明は、Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮するための試薬（キット）を提供する（本発明の試薬I）。本発明の試薬Iを用いて、上記本発明の製造方法Iにおいて、Sca-1陰性CD34陰性細胞を単離することにより、容易に人工多能性幹細胞を製造することができる。

更なる局面において、本発明は、EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮するための試薬（キット）を提供する（本発明の試薬I’）。本発明の試薬I’を用いて、上記本発明の製造方法Iにおいて、EpCam陽性CD34陰性細胞を単離することにより、容易に人工多能性幹細胞を製造することができる。

更に、本発明は、Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮するための試薬（キット）を提供する（本発明の試薬II）。本発明の試薬IIを用いて、上記本発明の製造方法IIにおいて、Sca-1陽性CD34陽性細胞を単離することにより、容易に心筋細胞又はその前駆細胞を製造することができる。

更なる局面において、本発明は、EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させた体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮するための試薬（キット）を提供する（本発明の試薬II’）。本発明の試薬II’を用いて、上記本発明の製造方法IIにおいて、EpCam陰性CD34陽性細胞を単離することにより、容易に心筋細胞又はその前駆細胞を製造することができる。

本明細書において、抗体による抗原Ｘの「特異的認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対する結合親和性が、非特異的な抗原（例、ＢＳＡ）に対する結合親和性よりも高いことを意味する。

本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体；及び遺伝子組換技術を用いて製造され得る組換え抗体（例えば、single-chain Fv fragments (scFv)、bispecific-chimeric scFV (χ-scFv)、tandem scFV (scFv)₂、bispecific-(scFv)₂、disulfide-linked scFv、disulfide-stabilized Fv fragments(dsFv)、diabody、single-chain diabody (scDb)、bivalent diabody、bispecific diabody、knob-into-hole stabilized diabody、disulfide-stabilized diabody、triabody、tetrabody、trispecific triabody、CL-dimerized scFv、CH1-CL-dimerized scFv、CH3-dimerized scFv、knob-into-hole CH3-dimerized scFv、CH3-dimerized bivalent diabody、Fc-dimerized scFv、Fab-scFv fusions、Ig-scFv fusions、leucine-zipper stabilized scFv dimers、helix-stabilized scFv dimers、4 helix-bundle stabilized scFv tetramers、streptavidin-scFv、intrabody、Fab’fragments、F(ab’) fragments、Fv fragments (Fv)、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体等）、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、作成の容易さ等の点から、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が、好ましく用いられる。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。

また、本発明において、「抗体」は、その結合性断片をも含む概念である。抗体の結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')₂、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、scFv、dsFv（disulfide stabilised Fv）、dAb（single domain antibody）等や（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）、Fab発現ライブラリーによって作製された抗体断片等が例示される。

Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体は、それぞれ、Sca-1及びCD34のポリペプチド、又はその抗原性のある部分ペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫感作し、Sca-1を特異的に認識する抗体、CD34を特異的に認識する抗体をそれぞれ単離することで製造することができる。

EpCamを特異的に認識する抗体は、EpCamのポリペプチド、又はその抗原性のある部分ペプチドで非ヒト哺乳動物を免疫感作し、EpCamを特異的に認識する抗体を単離することで製造することができる。

モノクローナル抗体を製造する場合は、抗原ポリペプチドを非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター等）に対して、それ自体あるいは担体、希釈剤等とともに投与し、当該リン酸化ポリペプチド又は結合体で非ヒト哺乳動物を免疫感作し、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495 (1975)〕および公知のその変法に従い、脾臓やリンパ節に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立し、目的とする抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをELISA等により選択し、上記ハイブリドーマの培養上清や、上記ハイブリドーマをプリスタン処理ヌードマウスに移入することにより得られる腹水から、目的とする抗原（Sca-1/CD34）を特異的に認識するモノクローナル抗体が単離される。

ポリクローナル抗体を製造する場合、抗原ポリペプチドを非ヒト哺乳動物（ウサギ、ヒツジ、ヤギ等）に対してそれ自体あるいは担体、希釈剤等とともに投与し、当該結合体で哺乳動物を免疫感作し、免疫感作された非ヒト哺乳動物の血清、腹水など、好ましくは血清から抗体画分を単離することにより、目的とする抗原（Sca-1/CD34）を特異的に認識するポリクローナル抗体を得ることができる。

Sca-1を特異的に認識する抗体、CD34を特異的に認識する抗体、及びEpCamを特異的に認識する抗体は、それぞれ、蛍光色素（FITC、PE等）、ビオチン、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、磁性ビーズ等により標識されていてもよい。

本発明の試薬（キット）I及びIIには、Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体のほか、上述の本発明の製造方法の実施に使用する種々の試薬を含むことができる。該試薬としては、上述の核初期化物質、培地、磁性ビーズ等を挙げることができる。ヒトiPS細胞を製造する場合、本発明の試薬IはbFGFを更に含むことができる。マウスiPS細胞を製造する場合、本発明の試薬IはLIFを更に含むことができる。本発明の試薬IIは、心筋細胞や心筋前駆細胞への分化誘導に有用なサイトカイン（ｂFGF、EGF、SCF等）、OP9ストローマ細胞等を更に含むことができる。

本発明の試薬（キット）I’及びII’には、EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体のほか、上述の本発明の製造方法の実施に使用する種々の試薬を含むことができる。該試薬としては、上述の核初期化物質、培地、磁性ビーズ等を挙げることができる。ヒトiPS細胞を製造する場合、本発明の試薬I’はbFGFを更に含むことができる。マウスiPS細胞を製造する場合、本発明の試薬I’はLIFを更に含むことができる。本発明の試薬II’は、心筋細胞や心筋前駆細胞への分化誘導に有用なサイトカイン（ｂFGF、EGF、SCF等）、OP9ストローマ細胞等を更に含むことができる。

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

［実施例１］ 人工多能性幹細胞の製造
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)に記載された方法に従い、マウス胎児線維芽細胞へマウス由来の４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)をレトロウイルスで導入し、培地（FBS mES medium without LIF）中で培養した。培地の組成は以下の通りである。

経時的に、フローサイトメトリーにより、Sca-1、CD34及びSSEA１の発現を解析し、所望の細胞集団をセルソーターで単離後、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたMEFを用いた（図１）。

Sca-1及びCD34発現の経時的変化を図２に示す。２つのマーカーのうち、Sca-1は、もともとマウス線維芽細胞（MEF）で70％程度が発現しているが、４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入により、５日目をピークに95％程度にまで陽性率が上昇した。CD34は、コントロール（Mock導入）では発現が認められないが、４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入により、4〜5日目以降30〜40%程度の陽性細胞が出現した。

一方、SSEA1は、４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)の導入から11日目まではほとんど陽性細胞は現れず、16日目以降に陽性細胞が出現した（図３）。

参考として、マウスES細胞におけるSca-1、CD34及びSSEA１の発現をフローサイトメトリーにより解析した（図４）。マウスES細胞はSSEA1陽性であった。Sca-1及びCD34については、僅かなピークシフトが認められた。

４因子導入から２〜５日目に、Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をセルソーターでソートし、フィーダー細胞上への蒔き直し、iPS細胞形成に適した条件で培養を再開した。培養１４日目に抗Nanog抗体によりiPS細胞のコロニーを可視化した（図５）。４因子導入から２日目にソートした場合、iPS細胞のコロニーが出現する頻度は、３つの画分の間に差は無かったが、３日目にソートした場合、Sca-1^-/CD34^-の細胞群においてiPS細胞のコロニーが出現する頻度が高い傾向が観察された。更に、４日目及び５日目以降にソートした場合、Sca-1^-/CD34^-の細胞群から主にiPS細胞が出現した。従って、４因子導入から４〜５日目において、iPS細胞への運命決定が強くなされている可能性が示唆された。

iPS細胞形成の指標としてNanogの代わりにSSEA1の発現を採用し、図５と同一の試験を実施した（図６）。４因子導入から２日目にソートした場合、iPS細胞のコロニーが出現する頻度は、３つの細胞群の間に差は無かったが、３日目にソートした場合、Sca-1^-/CD34^-の細胞群においてiPS細胞のコロニーが出現する頻度が高い傾向が観察された。更に、４日目及び５日目にソートした場合、Sca-1^-/CD34^-の細胞群から主にiPS細胞が出現した。Sca-1^-/CD34^-の細胞群から主にiPS細胞が出現する傾向は５日目以降も保たれた。従って、４因子導入から４〜５日目において、iPS細胞への運命決定が強くなされている可能性が示唆された。

４因子導入から５日目に、Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をセルソーターでソートし、フィーダー細胞上への蒔き直し、iPS細胞形成に適した条件で培養を再開した。培養１４〜２１日目に抗Nanog抗体によりiPS細胞のコロニーを可視化し、コロニー数を計測した（図７）。Sca-1^-/CD34^-群が全細胞の約5％、Sca-1⁺/CD34⁺群が全細胞の約35％で、全体のiPS細胞形成効率が２〜３％であることから計算すると、Sca-1^-/CD34^-群から約30％という非常に高い効率でiPS細胞が形成されたことが示された。

４因子導入から５日目における各細胞群の形態を蛍光顕微鏡で観察した（図８）。Sca-1は緑色（FITC）、CD34は赤色（PE）で示す。Sca-1^-/CD34^-細胞は、小型化し、互いに密接に接着してコロニーを形成しようとしているのが観察された。Sca-1^-/CD34^-細胞は、線維芽細胞とiPS細胞の中間の様な単層上皮細胞様の形態を示した。

４因子導入から５日目に、細胞を生きたまま染色して（Sca-1は緑色（FITC）、CD34は赤色（PE））、培養を継続して、iPS細胞を誘導した（図９、１０）。Sca-1^-/CD34^-細胞群からiPS細胞が形成される様子が観察された。

４因子導入から５日目にセルソーターでソートした、Sca-1^-/CD34^-細胞群から樹立したiPS細胞の遺伝子発現を定量的RT-PCRで評価した（図１１）。その結果、未分化のES細胞と同様に、Oct4、Sox2、Nanog、E-Ras、Zfp42の各遺伝子を発現し、３つの分化した胚葉系に特異的なマーカー遺伝子は発現しないことが示された。

４因子導入から５日目にセルソーターでソートした、Sca-1^-/CD34^-細胞群から樹立したiPS細胞からキメラマウスの樹立を試みたところ、iPS細胞由来の毛色（黒色）を含むキメラマウスの樹立に成功した。このキメラマウスを野生型マウスと交配したところ、iPS細胞由来の毛色（黒色）の子孫マウスが生まれた。この結果から、Sca-1^-/CD34^-細胞群から樹立したiPS細胞が、生殖系列を含む全ての胚葉系へ分化する能力（多能性）を有することが確認された。

４因子導入から５日目にセルソーターでソートした、Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群における各初期化因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc）の発現を定量的RT-PCRで評価した（図１３）。その結果、Sca-1^-/CD34^-細胞群では、Oct4発現のみ軽度の上昇が認められたが、他の因子の発現は有意差が認められなかった。

図１３からOct4発現が高いことが、iPS細胞形成頻度が高い原因である可能性が考えられたことから、Oct4のウイルス量を変化させて、Sca-1^-/CD34^-細胞群からのiPS細胞形成頻度を比較した（図１４）。その結果、Oct4のウイルス量を増やして、その発現量を高くしても、iPS細胞の誘導効率に大きな相違は認められなかった。従って、Oct4の強制発現の程度が高いということだけでは、Sca-1^-/CD34^-細胞群がiPS細胞誘導効率が高い（約３０％）理由を説明し難いことが示された。

［実施例２］ 心筋細胞の製造
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)に記載された方法に従い、マウス胎児線維芽細胞へマウス由来の４因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)をレトロウイルスで導入し、培地（FBS mES medium without LIF）中で培養した。培地の組成は以下の通りである。

導入から５日目に、セルソーターでSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をソートし、１日培養した後、Tomita Y et al. J Cell Biol. 2005;170:1135-46に記載された方法に従い、bFGF及びEGFを含有する無血清培地中で培養することにより心筋前駆細胞への分化を試みた。更に、Tomita Y et al. J Cell Biol. 2005;170:1135-46に記載された方法に従い、得られた心筋前駆細胞を、浮遊培養に付し、スフィアを形成させ、得られたスフィアを血清含有培地中で接着培養に付すことにより、心筋細胞への分化を試みた。フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（図１５）。

４因子導入から５日目に、セルソーターでSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をソートし、心筋前駆細胞誘導培地で接着培養しても、Oct4-GFP陽性のiPS細胞コロニーは出現しなかった。またその形態もiPS細胞とは異なっていた（図１６）。

４因子導入から５日目に、セルソーターでSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をソートし、心筋前駆細胞誘導培地で接着培養すると、１０継代まではその形質が維持された。即ち、接着培養後の細胞を浮遊培養に付すと、心筋前駆細胞の特徴の一つであるスフィア形成能を示した（図１７）。

４因子導入から５日目に、セルソーターでSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をソートし、心筋前駆細胞誘導培地で接着培養（１０継代まで）した後、スフィアを形成させた。得られたスフィアを再び接着培養することにより、自己拍動する心筋細胞のクラスターを誘導することに成功した（図１８）。心筋細胞クラスターは、Sca-1⁺/CD34⁺細胞群から最も効率的に誘導された。誘導された心筋細胞クラスターは、細胞内カルシウム濃度が自己拍動と同期して変化することが観察された（図１９）。

心筋前駆細胞のマーカー遺伝子の発現を経時的に測定した（図２０）。その結果、心筋前駆細胞誘導培地中で接着培養することにより、Sca-1⁺/CD34⁺細胞が各心筋前駆細胞のマーカー遺伝子を高発現することが示された。

４因子導入から５日目に、セルソーターでSca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をソートし、各細胞群を免疫不全マウス（NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) mice）（Ito M et al. Curr Top Microbiol Immunol. 2008;324:53-76）へ移植して、テラトーマ形成能を評価した（図２１）。その結果、Sca-1⁺/CD34⁺細胞群は、直径20mmを上回るテラトーマを形成しなかった。従って、Sca-1⁺/CD34⁺細胞群が、腫瘍形成のリスクが低い、心筋細胞のソースとして有用であることが示された。

［実施例３］ ３因子による人工多能性幹細胞の製造
Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)に記載された方法に従い、マウス胎児線維芽細胞へマウス由来の３因子(Oct3/4, Sox2, Klf4)をレトロウイルスで導入し、培地（FBS mES medium without LIF）中で培養した。３因子導入８日後に、Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をセルソーターで単離後、フィーダー細胞上への蒔き直しを行い、iPS細胞形成に適した条件で培養を再開した。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたMEFを用いた。培養１４〜２１日目に抗Nanog抗体によりiPS細胞のコロニーを可視化し、iPS細胞のコロニーが出現する頻度を比較した（図２２）。その結果、３因子を導入した場合においても、Sca-1^-/CD34^-の細胞群からiPS細胞のコロニーが高い効率で出現することが示された。

［実施例４］ 人工多能性幹細胞の製造
c-Mycに代えてL-Mycを使用した以外は、実施例１と同様の条件で、マウス胎児線維芽細胞から人工多能性幹細胞を樹立した。４因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc）導入から５〜８日目に、Sca-1^-/CD34^-、Sca-1⁺/CD34⁺、Sca-1⁺/CD34^-の各細胞群をセルソーターでソートし、フィーダー細胞上への蒔き直し、iPS細胞形成に適した条件で培養を再開した。培養１４〜２１日目にNanog陽性iPS細胞のコロニーをカウントした（図２３）。その結果、Sca-1^-/CD34^-の細胞群から主にiPS細胞コロニーが出現し、Sca-1⁺/CD34⁺の細胞群から出現したiPS細胞コロニーは僅かだった。従って、４因子導入から４〜５日目において、iPS細胞への運命決定が強くなされている可能性が示唆された。従って、初期化因子の組み合わせの種類にかかわらず、Sca-1^-/CD34^-細胞群から高頻度にiPS細胞が誘導される可能性が示された。

［実施例５］ Sca-1の代替マーカーの検索
マウス胎児線維芽細胞へ４因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）を導入し、導入から５日目にセルソーターでソートしたSca-1^-/CD34^-細胞群で発現の高い細胞表面マーカー遺伝子をマイクロアレイにより網羅的に検索し、EpCamを同定した。そこで、EpCamがSca-1に代わる初期化成功マーカーとして機能するか、ヒトiPS細胞を用いて試験した。

新生児ヒト線維芽細胞に初期化因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc）をレトロウイルスで導入し、導入７日目にEpCam^-/CD34^-、EpCam⁺/CD34^-、EpCam^-/CD34⁺、EpCam⁺/CD34⁺の各細胞群をソートし、フィーダー細胞上への蒔き直し、iPS細胞形成に適した条件で更に培養することにより、iPS細胞を誘導した。誘導されたiPS細胞の数を、未分化ヒトiPS細胞のマーカーであるTra1-81の発現をフローサイトメーターで解析することによりカウントした。その結果、EpCam⁺/CD34^-の細胞群から、最も高頻度でiPS細胞が誘導された（図２４）。この結果から、EpCamがSca-1と同様に初期化成功マーカーとして機能することが示された。

本発明により、体細胞の初期化成功の予測に重要な表面マーカーが同定されたので、容易に初期化が成功する可能性の高い細胞群を、初期化因子導入後早い段階で単離することができる。また、初期化成功候補細胞を絞りこめるので、初期化に関する分子機序のより正確かつ詳細な解明に繋がる。更に、本発明により、奇形腫形成の危険性の低い心筋細胞のソースが提供される。従って、本発明は再生医療の分野に有用である。

本出願は日本で出願された特願２０１２−２８８９５５（出願日：２０１２年１２月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (24)

1. 以下の工程を含む、マウス又はヒト人工多能性幹細胞の製造方法：
   （１）インビトロにおいてマウス又はヒト体細胞に核初期化物質を接触させること、
   （２）（１）で得られた細胞を培養すること、
   （３）（２）で得られた細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離すること、及び
   （４）（３）で単離された細胞を、更に培養し、人工多能性幹細胞を得ること。
2. 核初期化物質が、(I)(i)Oct3/4, (ii)Klf4および(iii)Sox2、または(II)それらをコードする核酸である、請求項1記載の方法。
3. 核初期化物質が、(I)(i)Oct3/4, (ii)Klf4, (iii)Sox2および(iv)c-MycまたはL-Myc、あるいは(II)それらをコードする核酸である、請求項１または２記載の方法。
4. 体細胞が線維芽細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. （３）においてSca-1陰性CD34陰性細胞を単離する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. （３）においてEpCam陽性CD34陰性細胞を単離する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
7. インビトロにおいて核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、Sca-1陰性CD34陰性細胞またはEpCam陽性CD34陰性細胞を単離することを含む、インビトロにおいて核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮する方法。
8. Sca-1陰性CD34陰性細胞を単離する、請求項７に記載の方法。
9. EpCam陽性CD34陰性細胞を単離する、請求項７に記載の方法。
10. Sca-1またはEpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、人工多能性幹細胞を形成する細胞を濃縮するための試薬。
11. Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、請求項１０に記載の試薬。
12. EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、請求項１０に記載の試薬。
13. 以下の工程を含む、マウス又はヒト心筋細胞又はその前駆細胞の製造方法：
    （１’）インビトロにおいてマウス又はヒト体細胞に核初期化物質を接触させること、
    （２’）（１’）で得られた細胞を培養すること、
    （３’）（２’）で得られた細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離すること、及び
    （４’）（３’）で単離された細胞を、心筋細胞又はその前駆細胞分化条件下で培養し、心筋細胞又はその前駆細胞を得ること。
14. 核初期化物質が、(I)(i)Oct3/4, (ii)Klf4および(iii)Sox2、または(II)それらをコードする核酸である、請求項１３記載の方法。
15. 核初期化物質が、(I)(i)Oct3/4, (ii)Klf4, (iii)Sox2および(iv)c-MycまたはL-Myc、あるいは(II)それらをコードする核酸である、請求項１３または１４記載の方法。
16. 体細胞が線維芽細胞である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. （３’）においてSca-1陽性CD34陽性細胞を単離する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. （３’）においてEpCam陰性CD34陽性細胞を単離する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
19. インビトロにおいて核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、Sca-1陽性CD34陽性細胞またはEpCam陰性CD34陽性細胞を単離することを含む、インビトロにおいて核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮する方法。
20. Sca-1陽性CD34陽性細胞を単離する、請求項１９に記載の方法。
21. EpCam陰性CD34陽性細胞を単離する、請求項１９に記載の方法。
22. Sca-1またはEpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、核初期化物質を接触させたマウス又はヒト体細胞から、心筋細胞又はその前駆細胞への分化能を有する細胞を濃縮するための試薬。
23. Sca-1を特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、請求項２２に記載の試薬。
24. EpCamを特異的に認識する抗体及びCD34を特異的に認識する抗体を含む、請求項２２に記載の試薬。