JP6308867B2 - Uracil nucleoside derivatives, uracil nucleotide derivatives and polynucleotide derivatives and probes containing them - Google Patents
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Description
本発明は、塩基部位の５位が、アントラセン及び２−アミノピリジン誘導体を含む置換基で置換されてなるウラシルヌクレオシド誘導体に関する。また本発明は、該ウラシルヌクレオシド誘導体を含むウラシルヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが該ウラシルヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体に関する。 The present invention relates to a uracil nucleoside derivative in which the 5-position of the base moiety is substituted with a substituent containing anthracene and a 2-aminopyridine derivative. The present invention also relates to a uracil nucleotide derivative including the uracil nucleoside derivative, and further to a polynucleotide derivative in which at least one nucleotide is substituted with the uracil nucleotide derivative.
これまでに極性やｐＨなどの周囲の環境変化に伴って発光強度を変化させる蛍光分子については多数の報告がされている。ヌクレオシドに関しても同様であり、環境感応型の蛍光ヌクレオシドに関して多くの報告例がある。本発明者らのグループも、周囲のｐＨ環境の変化に応じて蛍光発光のon-offが切り替わる化合物の研究開発を進めてきた（下記式で示される化合物、非特許文献１："Fluorescent nucleosides with 'on-off’ switching function, pH-responsive fluorescent uridine derivatives"（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 2753）参照）。
［式中、R1及びR2は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子、メチル基、n-ブチル基、t-ブチル基などである。］
この化合物は、特定のｐＨを境に蛍光発光のon-offが切り替わる化合物であり、酸性の条件下で強い蛍光発光を示し、塩基性から中性の条件下で消光するという性質を有している。
So far, there have been many reports on fluorescent molecules that change the emission intensity with changes in the surrounding environment such as polarity and pH. The same applies to nucleosides, and there are many reports on environmentally sensitive fluorescent nucleosides. The group of the present inventors has also advanced research and development of a compound in which the fluorescence emission is switched on and off according to changes in the surrounding pH environment (compound represented by the following formula, Non-Patent Document 1: “Fluorescent nucleosides with “on-off” switching function, pH-responsive fluorescent uridine derivatives ”(see Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 2753).
[Wherein, R 1 and R 2 are independent of each other and are the same or different and are a hydrogen atom, a methyl group, an n-butyl group, a t-butyl group, or the like. ]
This compound is a compound that switches on-off of fluorescence emission at a specific pH, and exhibits strong fluorescence emission under acidic conditions and has the property of quenching under basic to neutral conditions. Yes.
特定のｐＨを境に蛍光発光のon-offが切り替わるという性質を利用すれば、生体内における局所的なｐＨ環境の変化を検出することが可能である。しかし、実際の細胞等への応用を考えた場合、細胞内における蛍光分子の分布は一様ではないため、分布量が少ない場合には蛍光強度が弱くなってしまい、本来発光するｐＨ領域に存在しているにも拘わらず、消光しているように見えてしまい、十分な検出感度が得られないということも考えられる。
このような状況の下、局所的なｐＨ環境をより高感度で正確に検出することができるｐＨセンサー化合物の提供が望まれている。
By utilizing the property that fluorescence emission is switched on and off at a specific pH, it is possible to detect a local change in pH environment in the living body. However, considering the application to actual cells, etc., the distribution of fluorescent molecules in the cells is not uniform, so if the amount of distribution is small, the fluorescence intensity becomes weak and exists in the pH region where it originally emits light. However, it may be considered that the light is extinguished and sufficient detection sensitivity cannot be obtained.
Under such circumstances, it is desired to provide a pH sensor compound that can detect a local pH environment with higher sensitivity and accuracy.
本願発明者らは、周囲のｐＨ環境の変化に応じて蛍光発光のon-offが切り替わる化合物についてさらに研究を進めたところ、アントラセンとピリジンとを炭素−炭素三重結合を介して連結した蛍光性分子をウラシルヌクレオシド誘導体に導入した化合物（下記式参照）が、先の化合物とは発光するｐＨ領域が反転し、中性から塩基性の条件下で蛍光発光し、酸性の条件下で消光することを見出した。この化合物が上記のような性質を示すのは、酸性の条件下でピリジンがプロトン化されて消光し、中性から塩基性の条件下ではこのような消光が起こらないためであると考えられる。
本発明者らは、さらに研究を進めるべく、上記の化合物において、ピリジンに替えて２−アミノピリジン又はその誘導体を用いてみたところ、中性から塩基性の条件下で緑色に発光し、酸性の条件下で上記の化合物で見られた消光が見られず、代わりに大きな発光波長変化を示し、長波長側で黄色く発光するといった現象が見られることを見出した。より高感度で正確にｐＨ環境の検出を行いたい場合には、特定のｐＨを境に蛍光発光のon-offが切り替わる化合物よりも、蛍光発光波長が変化する化合物の方が、蛍光発光色の違いによってｐＨ環境の変化を検出できるという点で、より好ましいといえる。本発明者らはこれらの知見をもとに本発明を完成させた。 In order to further research, the present inventors tried to use 2-aminopyridine or a derivative thereof instead of pyridine in the above-mentioned compounds, and emitted green light under neutral to basic conditions. It was found that the quenching observed with the above compound was not observed under the conditions, but instead a large emission wavelength change was exhibited, and a yellow light emission was observed on the long wavelength side. When it is desired to detect the pH environment with higher sensitivity and accuracy, a compound whose fluorescence emission wavelength changes is more fluorescent than a compound whose fluorescence emission is turned on and off at a specific pH. It can be said that it is more preferable in that a change in pH environment can be detected by the difference. The present inventors have completed the present invention based on these findings.
すなわち、本発明は、以下に示したウラシルヌクレオシド誘導体、ウラシルヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにそれらを含むプローブに関するものである。
［１］下記式Ｉ：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基である。］
で示されるウラシルヌクレオシド誘導体。
［２］前記Ｒ１及びＲ２が水素原子である、［１］に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［３］前記Ｒ１が水素原子であり、前記Ｒ２がＣ１〜Ｃ１０のアルキル基である、［１］に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［４］前記Ｒ３が水素原子である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［５］前記Ｒ４が水素原子である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［６］生体内におけるｐＨ環境の変化を検出するためのものである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体を含むプローブ。本発明はまた、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体を含むプローブを用いて、生体内におけるｐＨ環境の変化を検出する方法にも関する。
［７］下記式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基であり、ｓは、１、２又は３である。］
で示されるウラシルヌクレオチド誘導体。
［８］前記Ｒ１及びＲ２が水素原子である、［７］に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［９］前記Ｒ１が水素原子であり、前記Ｒ２がＣ１〜Ｃ１０のアルキル基である、［７］に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［１０］前記Ｒ３が水素原子である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［１１］前記Ｒ４が水素原子である、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオシド誘導体。
［１２］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［７］〜［１１］のいずれか一項に記載のウラシルヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［１３］［１２］に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
［１４］生体内におけるｐＨ環境の変化を検出するためのものである、［１３］に記載のプローブ。本発明はまた、［１３］に記載のプローブを用いて、生体内におけるｐＨ環境の変化を検出する方法にも関する。
That is, the present invention relates to the following uracil nucleoside derivatives, uracil nucleotide derivatives and polynucleotide derivatives and probes containing them.
[1] The following formula I:
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or it is a methoxy group and R < 4 > is a hydrogen atom or a hydroxyl group. ]
A uracil nucleoside derivative represented by:
[2] The uracil nucleoside derivative according to [1], wherein R 1 and R 2 are hydrogen atoms.
[3] The uracil nucleoside derivative according to [1], wherein R 1 is a hydrogen atom, and R 2 is a C 1 to C 10 alkyl group.
[4] The uracil nucleoside derivative according to any one of [1] to [3], wherein R 3 is a hydrogen atom.
[5] The uracil nucleoside derivative according to any one of [1] to [4], wherein R 4 is a hydrogen atom.
[6] A probe comprising the uracil nucleoside derivative according to any one of [1] to [5], which is for detecting a change in pH environment in a living body. The present invention also relates to a method for detecting a change in pH environment in a living body using a probe containing the uracil nucleoside derivative according to any one of [1] to [5].
[7] The following formula (II):
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or a methoxy group, R 4 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and s is 1, 2 or 3. ]
A uracil nucleotide derivative represented by:
[8] The uracil nucleoside derivative according to [7], wherein R 1 and R 2 are hydrogen atoms.
[9] The uracil nucleoside derivative according to [7], wherein R 1 is a hydrogen atom, and R 2 is a C 1 to C 10 alkyl group.
[10] The uracil nucleoside derivative according to any one of [7] to [9], wherein R 3 is a hydrogen atom.
[11] The uracil nucleoside derivative according to any one of [7] to [10], wherein R 4 is a hydrogen atom.
[12] A polynucleotide derivative obtained by substituting at least one nucleotide in the polynucleotide with the uracil nucleotide derivative according to any one of [7] to [11].
[13] A probe comprising the polynucleotide derivative according to [12].
[14] The probe according to [13], which is for detecting a change in pH environment in a living body. The present invention also relates to a method for detecting a change in pH environment in a living body using the probe according to [13].
本発明は、塩基部位の５位が、アントラセン及び２−アミノピリジン誘導体を含む置換基で置換されてなるウラシルヌクレオシド誘導体、該ウラシルヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合してなるウラシルヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが、該ウラシルヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、周囲のｐＨ環境の変化に伴って蛍光発光波長を変化させることができる。この性質を利用して、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体を、例えば生体内におけるｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、蛍光物質のみの場合と比べて溶解性が良好であり、細胞膜透過性も向上すると考えられることから、生体内における局所的なｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとしての有用性は高いと考えられる。
また、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、オリゴヌクレオチド鎖へ容易に導入することが可能である。本発明のウラシルヌクレオシド誘導体又はウラシルヌクレオチド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、タンパク質又は細胞内における局所的なｐＨ環境の調査用プローブとして利用可能である。また、本発明のポリヌクレオチド誘導体を標的ＤＮＡやＲＮＡを検出する試薬として用いることも可能である。
The present invention relates to a uracil nucleoside derivative in which the 5-position of the base moiety is substituted with a substituent containing anthracene and a 2-aminopyridine derivative, a uracil nucleotide derivative in which phosphoric acid is ester-bonded to the uracil nucleoside derivative, Provided is a polynucleotide derivative in which at least one nucleotide is substituted with the uracil nucleotide derivative.
According to a preferred embodiment of the present invention, the uracil nucleoside derivative of the present invention can change the fluorescence emission wavelength with changes in the surrounding pH environment. Utilizing this property, the uracil nucleoside derivative of the present invention can be used as a probe for detecting a change in pH environment in a living body, for example. Since the uracil nucleoside derivative of the present invention is a nucleoside type compound, it is considered to have better solubility and improved cell membrane permeability as compared with the case of using only a fluorescent substance. It is considered that the usefulness as a probe for detecting the change of is high.
Moreover, since the uracil nucleoside derivative of the present invention is a nucleoside type compound, it can be easily introduced into an oligonucleotide chain. The polynucleotide derivative obtained by introducing the uracil nucleoside derivative or uracil nucleotide derivative of the present invention can be used as a probe for investigating a local pH environment in a protein or a cell. The polynucleotide derivative of the present invention can also be used as a reagent for detecting target DNA or RNA.
以下、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体、ウラシルヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体及びプローブ等について詳細に説明する。 Hereinafter, the uracil nucleoside derivative, uracil nucleotide derivative, polynucleotide derivative, probe and the like of the present invention will be described in detail.
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基である。］
で示される化合物である。
The uracil nucleoside derivative of the present invention has the following formula (I):
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or it is a methoxy group and R < 4 > is a hydrogen atom or a hydroxyl group. ]
It is a compound shown by these.
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、塩基部位の５位に、炭素−炭素三重結合を介して、アントラセンと２−アミノピリジン誘導体とを炭素−炭素三重結合で連結してなる蛍光性分子を導入するように設計されている。本発明の好ましい態様によれば、上記のウラシルヌクレオシド誘導体は、周辺のｐＨ環境の変化に応じて、酸性条件下で黄色く発光し、中性から塩基性条件下で緑色に発光し、蛍光発光波長を変化させることができる。 The uracil nucleoside derivative of the present invention introduces a fluorescent molecule formed by linking anthracene and a 2-aminopyridine derivative with a carbon-carbon triple bond via a carbon-carbon triple bond at the 5-position of the base moiety. Designed to. According to a preferred embodiment of the present invention, the uracil nucleoside derivative emits yellow light under acidic conditions and emits green light under neutral to basic conditions in accordance with changes in the surrounding pH environment. Can be changed.
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基である。
本明細書において「Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基」は、炭素数が１から１０のアルキル基を意味する。Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基は、線状でもよいし、枝分かれでもよく、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基が好ましく、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基がより好ましい。好ましいアルキル基の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ドデカニル等が挙げられる。
これらの中でも、Ｒ１としては、水素原子、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル基などが好ましい。
In formula (I), R 1 and R 2 are each independently of one another, identical or different, a hydrogen atom or an alkyl group C 1 -C 10.
In the present specification, the “C 1 -C 10 alkyl group” means an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms. Alkyl C 1 -C 10 may be a linear, it may be branched, preferably an alkyl group of C 1 -C 6, alkyl C 1 -C 4 are preferred. Examples of preferred alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, dodecanyl and the like.
Among these, as R 1 , a hydrogen atom, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, cyclohexyl group and the like are preferable.
式（Ｉ）中、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基である。「Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基」については、Ｒ１及びＲ２で説明したとおりであり、好ましいアルキル基の例についても同じものを挙げることができる。Ｒ３が、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であると、酸性条件下で、ピリジン骨格の反対側の位置に結合した２−アミノ基又はその誘導体がプロトン化されるため、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体が長波長側で黄色く発光することができる。これらの中でも、Ｒ３としては、水素原子が好ましい。 In formula (I), R 3 is a hydrogen atom, a C 1 to C 10 alkyl group or a methoxy group. The “C 1 -C 10 alkyl group” is as described for R 1 and R 2 , and the same examples can be given as examples of preferable alkyl groups. When R 3 is a hydrogen atom, a C 1 to C 10 alkyl group or a methoxy group, a 2-amino group bonded to the opposite side of the pyridine skeleton or a derivative thereof is protonated under acidic conditions. The uracil nucleoside derivative of the present invention can emit yellow light on the long wavelength side. Among these, as R 3 , a hydrogen atom is preferable.
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体において、ウラシル塩基と結合する五炭糖は、２−デオキシリボースでもリボースでもよく、式（Ｉ）中、Ｒ４は、水素原子又は水酸基である。本発明のウラシルヌクレオシド誘導体をヌクレオチドに導入してＤＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ４は水素原子が好ましく、ＲＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒ４としては水酸基が好ましい。 In the uracil nucleoside derivative of the present invention, the pentose sugar bonded to the uracil base may be 2-deoxyribose or ribose, and in formula (I), R 4 is a hydrogen atom or a hydroxyl group. When the uracil nucleoside derivative of the present invention is introduced into a nucleotide and used as a DNA type probe, R 4 is preferably a hydrogen atom, and when used as an RNA type probe, R 4 is preferably a hydroxyl group.
上記のとおり、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、塩基部位の５位に、炭素−炭素三重結合を介して、アントラセンと２−アミノピリジン誘導体とを炭素−炭素三重結合で連結してなる蛍光性分子を導入し、核酸塩基部位と蛍光性分子、アントラセンと２−アミノピリジン誘導体とがπ共役系を形成できるように設計されている。理論に束縛されるものではないが、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、酸性条件下では、２−アミノ基又はその誘導体がプロトン化されることによって、イミノ型に異性化し、共役系が伸びて、長波長側で黄色く発光し、中性から塩基性条件下では、そのようなプロトン化がされないために、緑色に発光し、ｐＨ環境の変化に応じて蛍光発光波長を変化させることができるものと考えられる。
上記のとおり、本発明の好ましい態様によれば、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、周囲のｐＨ環境によって二つの蛍光帯を示す特徴的な性質を有しており、周囲のｐＨ環境の変化を蛍光発光色の違いによって識別することが可能である。この性質を利用して、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体を、生体内におけるｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとして好適に利用することができる。 As described above, according to a preferred embodiment of the present invention, the uracil nucleoside derivative of the present invention has a characteristic property that exhibits two fluorescent bands depending on the surrounding pH environment, and changes in the surrounding pH environment are fluorescent. It is possible to identify by the difference in emission color. Utilizing this property, the uracil nucleoside derivative of the present invention can be suitably used as a probe for detecting changes in pH environment in vivo.
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、ウラシルヌクレオシドの５位にエチニル基を介して蛍光分子を導入することにより、簡便な方法で合成することができる。
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、例えば、下記のスキームに従って製造することができる。
［式中、ＸはＩ又はＢｒであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４と同義である。Ｒ及びＲ’は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基である。］
The uracil nucleoside derivative of the present invention can be synthesized by a simple method by introducing a fluorescent molecule through the ethynyl group at the 5-position of uracil nucleoside.
The uracil nucleoside derivative of the present invention can be produced, for example, according to the following scheme.
Wherein, X is I or Br, R 1, R 2, R 3 and R 4 have the same meaning as R 1, R 2, R 3 and R 4 in formula (I). R and R ′ are each independently the same or different and each represents a C 1 to C 10 alkyl group. ]
以下、各工程について説明する。
＜工程ａ）＞
工程ａ）では、化合物３、任意のアルキル基を有するアルキルアミン（ＮＨＲＲ’、式中、Ｒ及びＲ’は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基である。）、及び、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシドなどの塩基を溶媒に溶解させ、加熱還流させる。
アルキルアミンは、化合物３に対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物３に対して１．２〜３（モル倍量）が好ましい。
また、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシドなどの塩基は、化合物３に対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物３に対して１．２〜３（モル倍量）が好ましい。
溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
反応温度は、８０〜１４０℃が好ましく、１００〜１２０℃がより好ましい。また、反応時間は、８〜２４時間が好ましく、１２〜２０時間がより好ましい。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物４を得ることができる。
Hereinafter, each step will be described.
<Step a)>
In step a), compound 3, alkylamine having an arbitrary alkyl group (NHRR ′, wherein R and R ′ are each independently the same or different and are C 1 -C 10 alkyl groups. ) And a base such as potassium carbonate, sodium hydride or sodium methoxide are dissolved in a solvent and heated to reflux.
The alkylamine is preferably used in an equimolar or slightly excess amount relative to compound 3, and the amount used is preferably 1.2 to 3 (molar amount) relative to compound 3.
Further, the base such as potassium carbonate, sodium hydride, sodium methoxide is preferably used in an equimolar amount or a slight excess with respect to Compound 3, and the amount used is 1.2 to 3 (moles) relative to Compound 3. Double amount) is preferred.
Solvents include ether solvents such as tetrahydrofuran and diethyl ether, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and o-dichlorobenzene, amides such as N, N-dimethylformamide (DMF), sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, benzene and toluene. Aromatic compounds such as xylene can be used.
The reaction temperature is preferably 80 to 140 ° C, more preferably 100 to 120 ° C. The reaction time is preferably 8 to 24 hours, more preferably 12 to 20 hours.
After completion of the reaction, a liquid separation operation is performed, and the organic layer from which the reaction product is extracted is concentrated under reduced pressure. The residue can be purified by silica gel column chromatography to give compound 4.
ピリジン骨格の２位にアミノ基を有する化合物２は、工程ａ）と同様にして合成することもできるし、市販品（例えば、2−アミノ−4−ブロモピリジンなど）を用いることもできる。 Compound 2 having an amino group at the 2-position of the pyridine skeleton can be synthesized in the same manner as in step a), or a commercially available product (for example, 2-amino-4-bromopyridine) can also be used.
＜工程ｂ）＞
次に、工程ｂ）において、化合物２又は４の４位にエチニル基を導入する。
化合物２又は４、トリメチルシリルアセチレン、炭酸セシウム、４，５―ビス（ジフェニルホスフィノ)−９，９−ジメチルキサンテン、及び、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドを溶媒に溶解させる。
これにさらにトリエチルアミンを加えて４０〜６０℃の油浴中で１〜３時間撹拌させる。
反応終了後、溶媒を減圧濃縮した後にテトラヒドロフラン及びテトラブチルアンモニウムフルオリドを加え、室温で３０〜６０分間反応させる。
トリメチルシリルアセチレンは、化合物２又は４に対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物２又は４に対して１．２〜１．５（モル倍量）が好ましい。
炭酸セシウム、４，５―ビス（ジフェニルホスフィノ)−９，９−ジメチルキサンテン、及び、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（ＩＩ）ジクロリドは、それぞれ、触媒量で用いればよく、化合物２又は４に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物２又は４に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
テトラヒドロフラン及びテトラブチルアンモニウムフルオリドは、それぞれ、等モルないしやや過剰の範囲で用いればよく、化合物２又は４に対して１．０〜１．２（単位：モル倍量）が好ましい。
溶媒は、工程ａ）で例示したものと同じものを用いることができる。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物５を得ることができる。
<Process b)>
Next, in step b), an ethynyl group is introduced at the 4-position of compound 2 or 4.
Compound 2 or 4, trimethylsilylacetylene, cesium carbonate, 4,5-bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethylxanthene, and bis (benzonitrile) palladium (II) dichloride are dissolved in a solvent.
Triethylamine is further added thereto, and the mixture is stirred in an oil bath at 40 to 60 ° C. for 1 to 3 hours.
After completion of the reaction, the solvent is concentrated under reduced pressure, tetrahydrofuran and tetrabutylammonium fluoride are added, and the mixture is reacted at room temperature for 30 to 60 minutes.
Trimethylsilylacetylene is preferably used in an equimolar or slightly excess amount relative to compound 2 or 4, and the amount used is preferably 1.2 to 1.5 (molar amount) relative to compound 2 or 4.
Cesium carbonate, 4,5-bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethylxanthene, and bis (benzonitrile) palladium (II) dichloride may be used in catalytic amounts, respectively. 0.01 to 0.1 (molar amount) is preferable.
Triethylamine is preferably used in the range of 5 to 10 (molar amount) with respect to compound 2 or 4.
Tetrahydrofuran and tetrabutylammonium fluoride may be used in an equimolar or slightly excess range, respectively, and preferably 1.0 to 1.2 (unit: molar multiple) with respect to compound 2 or 4.
The same solvent as exemplified in step a) can be used as the solvent.
After completion of the reaction, a liquid separation operation is performed, and the organic layer from which the reaction product is extracted is concentrated under reduced pressure. The residue can be purified by silica gel column chromatography to give compound 5.
＜工程ｃ）＞
次に、得られた化合物５にアントラセンを導入する。
まず、化合物６、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅、及び、化合物５を溶媒に溶解させる。これにさらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えて、６０〜８０℃の油浴中で８〜１６時間反応させる。
化合物５は、化合物６に対して、等モルないしやや過剰で用いることが好ましく、その使用量は、化合物６に対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、それぞれ、触媒量で用いればよく、化合物６に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンは、化合物６に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
なお、化合物６は、既知の化合物であり、例えば、J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10083に記載の方法に準拠して合成することができる。
溶媒は、工程ａ）で例示したものと同じものを用いることができる。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して化合物７を得ることができる。
<Process c)>
Next, anthracene is introduced into the obtained compound 5.
First, compound 6, tetrakistriphenylphosphine palladium (0), copper iodide, and compound 5 are dissolved in a solvent. N, N-diisopropylethylamine is further added thereto, and the mixture is reacted in an oil bath at 60 to 80 ° C. for 8 to 16 hours.
Compound 5 is preferably used in an equimolar or slightly excess amount relative to Compound 6, and the amount used is preferably 1.0 to 1.2 (molar amount) relative to Compound 6.
Tetrakistriphenylphosphine palladium (0) and copper iodide may be used in catalytic amounts, respectively, and 0.01 to 0.1 (molar amount) with respect to compound 6 is preferable.
N, N-diisopropylethylamine is preferably used in the range of 5 to 10 (molar amount) with respect to compound 6.
Compound 6 is a known compound and can be synthesized according to the method described in J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 10083, for example.
The same solvent as exemplified in step a) can be used as the solvent.
After completion of the reaction, a liquid separation operation is performed, and the organic layer from which the reaction product is extracted is concentrated under reduced pressure. The residue can be purified by silica gel column chromatography to give compound 7.
＜工程ｄ）＞
次に、得られた化合物７をウラシルヌクレオシドの塩基部位の５位に導入する。
化合物７、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅、及び、化合物８を溶媒に溶解させる。これにさらにトリエチルアミンを加えて、６０〜８０℃の油浴中で８〜１６時間反応させる。
化合物７は、化合物８に対して、等モルないしやや過剰で用いることが好ましく、その使用量は、化合物７に対して１．０〜１．２（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、それぞれ、触媒量で用いればよく、化合物８に対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物８に対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
なお、化合物８は、既知の化合物であり、例えば、Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 3826に記載の方法に準拠して合成することができる。また、市販品を用いてもよい。
溶媒は、工程ａ）で例示したものと同じものを用いることができる。
反応終了後は、分液操作を行い、反応物を抽出した有機層を減圧濃縮する。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して式（Ｉ）で示される本発明のウラシルヌクレオシド誘導体を得ることができる。
<Process d)>
Next, the obtained compound 7 is introduced into the 5-position of the base site of uracil nucleoside.
Compound 7, tetrakistriphenylphosphine palladium (0), copper iodide, and compound 8 are dissolved in a solvent. Triethylamine is further added thereto, and the mixture is reacted in an oil bath at 60 to 80 ° C. for 8 to 16 hours.
Compound 7 is preferably used in an equimolar or slightly excess amount relative to Compound 8, and the amount used is preferably 1.0 to 1.2 (molar amount) relative to Compound 7.
Tetrakistriphenylphosphine palladium (0) and copper iodide may be used in catalytic amounts, respectively, and 0.01 to 0.1 (molar amount) with respect to compound 8 is preferable.
Triethylamine is preferably used in a range of 5 to 10 (molar amount) with respect to Compound 8.
Compound 8 is a known compound and can be synthesized, for example, according to the method described in Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 3826. Moreover, you may use a commercial item.
The same solvent as exemplified in step a) can be used as the solvent.
After completion of the reaction, a liquid separation operation is performed, and the organic layer from which the reaction product has been extracted is concentrated under reduced pressure. The residue can be purified by silica gel column chromatography to obtain the uracil nucleoside derivative of the present invention represented by the formula (I).
次に、本発明のウラシルヌクレオチド誘導体について述べる。
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、上述した本発明のウラシルヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合した化合物であり、
下記式（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基であり、ｓは、１、２又は３である。］
で示される化合物である。
Next, the uracil nucleotide derivative of the present invention will be described.
The uracil nucleoside derivative of the present invention is a compound in which phosphoric acid is ester-bonded to the above-described uracil nucleoside derivative of the present invention,
Formula (II) below:
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or a methoxy group, R 4 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and s is 1, 2 or 3. ]
It is a compound shown by these.
式（ＩＩ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４と同義であり、好ましい例も同じである。
ｓは１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。
R 1, R 2, R 3 and R 4 in formula (II) has the same meaning as R 1, R 2, R 3 and R 4 in formula (I), and preferred examples thereof are also the same.
Although s is 1, 2 or 3, 1 or 3 is preferable, and 3 is particularly preferable because it can be easily introduced into a polynucleotide derivative.
本発明のウラシルヌクレオチド誘導体（ＩＩ）の一リン酸体（ｓ＝１）は、通常、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体（Ｉ）をトリメチルホスファイトなどの溶媒に溶解し、０℃でオキシ塩化リンを加えて反応させた後に水を加えることで簡単に合成することができる。また、三リン酸体（ｓ＝３）は、水を加える前にトリブチルアンモニウムピロリン酸（二リン酸）を加えるステップを加えることを除いて一リン酸体と同様にして合成することができる。 The monophosphate (s = 1) of the uracil nucleotide derivative (II) of the present invention is usually prepared by dissolving the uracil nucleoside derivative (I) of the present invention in a solvent such as trimethyl phosphite and adding phosphorus oxychloride at 0 ° C. In addition, it can be easily synthesized by adding water after the reaction. The triphosphate (s = 3) can be synthesized in the same manner as the monophosphate except that a step of adding tributylammonium pyrophosphate (diphosphate) is added before adding water.
また、本発明のウラシルヌクレオチド誘導体（ＩＩ）の三リン酸体は、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡに容易に導入することができ、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが本発明のヌクレオチド誘導体で置換された本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。あるいは、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体に触媒量の４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて反応させて得られる化合物を、トリエチルアミンの存在下、更に２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジトと反応させて、得られたアミジト体を直接ＤＮＡ自動合成機にかけることで、本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。 In addition, the triphosphate of the uracil nucleotide derivative (II) of the present invention can be easily introduced into DNA using a PCR method, and at least one nucleotide in the polynucleotide is substituted with the nucleotide derivative of the present invention. The polynucleotide derivative of the present invention can be obtained. Alternatively, a compound obtained by adding a catalytic amount of 4,4′-dimethoxytrityl chloride to the uracil nucleoside derivative of the present invention and reacting it is further reacted with 2-cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite in the presence of triethylamine. The polynucleotide derivative of the present invention can be obtained by directly applying the obtained amidite to an automatic DNA synthesizer.
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも一つのヌクレオチドが、本発明のウラシルヌクレオチド誘導体で置換されてなるものである。
本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明のウラシルヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。
The polynucleotide derivative of the present invention is obtained by substituting at least one nucleotide in the polynucleotide with the uracil nucleotide derivative of the present invention.
In the present invention, the polynucleotide derivative may be an oligonucleotide derivative. The number of bases of the uracil nucleotide derivative of the present invention is not particularly limited, and is preferably 2 to 1000, for example, more preferably 2 to 200, and particularly preferably 2 to 100.
以上のようにして、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体、ウラシルヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体を製造することができる。
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、周囲のｐＨ環境の変化に応じて蛍光発光色を変化させることができる。このため、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、蛍光強度がon-offで切り替わる従来の化合物と比べて、検出感度（Ｓ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比）が向上すると考えられる。この性質を利用して、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体を、局所的なｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、蛍光物質のみの場合と比べて溶解性が良好であり、細胞膜透過性も向上すると考えられることから、それ自体、生体内等における局所的なｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとして利用可能である。
また、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、ヌクレオシド型の化合物であるため、ヌクレオチド誘導体を合成し、オリゴヌクレオチド鎖へ容易に導入することが可能である。本発明のウラシルヌクレオシド誘導体又はウラシルヌクレオチド誘導体をオリゴヌクレオチド鎖へ導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、タンパク質又は細胞内における局所的なｐＨ環境の調査用プローブとして利用することができる。
また、ＤＮＡ又はＲＮＡが二重鎖を形成すると、鎖中に含まれるリン酸基の影響により局所的なｐＨ環境が変化することが知られているため、本発明のポリヌクレオチド誘導体を標的ＤＮＡやＲＮＡを検出する試薬として利用することもできる。
上記のとおり、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体、ウラシルヌクレオチド誘導体またはポリヌクレオチド誘導体を用いることによって、生体内等における局所的なｐＨ環境の変化を検出することができる。
As described above, the uracil nucleoside derivative, uracil nucleotide derivative and polynucleotide derivative of the present invention can be produced.
The uracil nucleoside derivative of the present invention can change the fluorescence emission color in accordance with changes in the surrounding pH environment. For this reason, the uracil nucleoside derivative of the present invention is considered to have improved detection sensitivity (S (signal) / N (noise) ratio) as compared with conventional compounds in which the fluorescence intensity switches on-off. Utilizing this property, the uracil nucleoside derivative of the present invention can be used as a probe for detecting a local change in pH environment.
Since the uracil nucleoside derivative of the present invention is a nucleoside type compound, it is considered that the uracil nucleoside derivative has better solubility and improved cell membrane permeability as compared with the case of a fluorescent substance alone. It can be used as a probe for detecting a change in general pH environment.
Further, since the uracil nucleoside derivative of the present invention is a nucleoside type compound, it is possible to synthesize a nucleotide derivative and easily introduce it into an oligonucleotide chain. The polynucleotide derivative obtained by introducing the uracil nucleoside derivative or uracil nucleotide derivative of the present invention into an oligonucleotide chain can be used as a probe for investigating a local pH environment in a protein or cell.
In addition, when DNA or RNA forms a double strand, it is known that the local pH environment changes due to the influence of a phosphate group contained in the strand. It can also be used as a reagent for detecting RNA.
As described above, by using the uracil nucleoside derivative, uracil nucleotide derivative or polynucleotide derivative of the present invention, it is possible to detect a local change in pH environment in a living body or the like.
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されない。なお、以下において、％は、質量基準に基づくものである。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated based on an Example, this invention is not restrict | limited at all to these Examples. In the following,% is based on mass.
下記スキーム１に従って本発明のウラシルヌクレオシド誘導体を合成した。
化合物４の合成
化合物３（380 mg, 1.70 mmol）、炭酸カリウム（470 mg, 3.40 mmol）、t-ブチルアミン（0.55 ml, 5.20 mmol）をＤＭＳＯ（7 ml）に溶解させ、１２時間、１００℃で還流させた。反応溶液を室温に冷まし、酢酸エチルを加え、飽和食塩水で分液操作を行い、有機層を回収し硫酸ナトリウム（無水）で脱水させた。その後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、酢酸エチルーヘキサン（１：２０）の混合溶液で溶出し、化合物４（174 mg, 37 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 1.35 (s, 9H), 6.35 (s, 1H), 6.74 (dd, J = 1.5, 5.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 1.1 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)
Synthesis of Compound 4 Compound 3 (380 mg, 1.70 mmol), potassium carbonate (470 mg, 3.40 mmol) and t-butylamine (0.55 ml, 5.20 mmol) were dissolved in DMSO (7 ml), and 12 hours at 100 ° C. Refluxed. The reaction solution was cooled to room temperature, ethyl acetate was added, liquid separation was performed with saturated brine, and the organic layer was collected and dehydrated with sodium sulfate (anhydrous). Thereafter, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of ethyl acetate-hexane (1:20) to obtain Compound 4 (174 mg, 37%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.35 (s, 9H), 6.35 (s, 1H), 6.74 (dd, J = 1.5, 5.4 Hz, 1H), 6.94 (d, J = 1.1 Hz , 1H), 7.65 (d, J = 5.4 Hz, 1H)
化合物５ａの合成
化合物２（400 mg, 2.31 mmol）、トリメチルシリルアセチレン（0.38 ml, 2.77 mmol）、炭酸セシウム（39.1 mg, 0.12 mmol）、４，５―ビス（ジフェニルホスフィノ)―９，９―ジメチルキサンテン（69.4 mg, 0.12 mmol）および、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（II）ジクロリド（46.0 mg, 0.12 mmol）をＤＭＦ(5 ml)に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（2 ml）を加えて５０℃の油浴中で２時間撹拌させた。反応終了後、溶媒を減圧濃縮した後にＴＨＦ（3 ml）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド（2.77 ml）を加え、室温で３０分間反応させた。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノール−クロロホルム（１：５０）の混合溶媒で溶出し、化合物５ａ（90.1 mg, 33 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.49 (s, 1H), 4.49 (br, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.71 (dd, J = 1.0, 5.2 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 5.2 Hz, 1H)
Synthesis of Compound 5a Compound 2 (400 mg, 2.31 mmol), trimethylsilylacetylene (0.38 ml, 2.77 mmol), cesium carbonate (39.1 mg, 0.12 mmol), 4,5-bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethyl Xanthene (69.4 mg, 0.12 mmol) and bis (benzonitrile) palladium (II) dichloride (46.0 mg, 0.12 mmol) were dissolved in DMF (5 ml). Triethylamine (2 ml) was further added thereto, and the mixture was stirred in an oil bath at 50 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the solvent was concentrated under reduced pressure, THF (3 ml) and tetrabutylammonium fluoride (2.77 ml) were added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. The solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solvent of methanol-chloroform (1:50) to obtain Compound 5a (90.1 mg, 33%).
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 3.49 (s, 1H), 4.49 (br, 2H), 6.58 (s, 1H), 6.71 (dd, J = 1.0, 5.2 Hz, 1H), 8.04 (d , J = 5.2 Hz, 1H)
化合物５ｂの合成
化合物４（213 mg, 0.77 mmol）、トリメチルシリルアセチレン（0.13 ml, 0.92 mmol）、炭酸セシウム（13.0 mg, 0.04 mmol）、４，５−ビス（ジフェニルホスフィノ)−９，９−ジメチルキサンテン（23.2 mg, 0.04 mmol）および、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（II）ジクロリド（15.3 mg, 0.04 mmol）をＤＭＦ(4 ml)に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（2 ml）を加えて５０℃の油浴中で２時間撹拌させた。反応終了後、溶媒を減圧濃縮した後にＴＨＦ（3 ml）およびテトラブチルアンモニウムフルオリド（0.92 ml）を加え、室温で３０分間反応させた。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルム（１：１００）の混合溶媒で溶出し、化合物５ｂ（87.3 mg, 65 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 1.36 (s, 9H), 4.29 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.41 (dd, J = 1.4, 5.2 Hz, 1H), 6.55 (m, 1H), 7.93 (dd, J = 0.6, 5.2 Hz, 1H)
Synthesis of Compound 5b Compound 4 (213 mg, 0.77 mmol), trimethylsilylacetylene (0.13 ml, 0.92 mmol), cesium carbonate (13.0 mg, 0.04 mmol), 4,5-bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethyl Xanthene (23.2 mg, 0.04 mmol) and bis (benzonitrile) palladium (II) dichloride (15.3 mg, 0.04 mmol) were dissolved in DMF (4 ml). Triethylamine (2 ml) was further added thereto, and the mixture was stirred in an oil bath at 50 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the solvent was concentrated under reduced pressure, THF (3 ml) and tetrabutylammonium fluoride (0.92 ml) were added, and the mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. The solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solvent of methanol-chloroform (1: 100) to obtain Compound 5b (87.3 mg, 65%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.36 (s, 9H), 4.29 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.41 (dd, J = 1.4, 5.2 Hz, 1H), 6.55 (m, 1H), 7.93 (dd, J = 0.6, 5.2 Hz, 1H)
化合物７ａの合成
化合物６（510 mg, 1.33 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（23.1 mg, 0.02 mmol）、ヨウ化銅（13.3 mg, 0.07 mmol）および化合物５ａ（157 mg, 1.33 mmol）をＤＭＦ（7 ml）に溶解させた。これにさらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（2 ml）を加えて、７０℃の油浴中で１４時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノール−クロロホルム（１：５０）の混合溶液で溶出し、化合物７ａ（274 mg, 55 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 6.20 (br, 2H), 6.84 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 1.4, 5.2 Hz, 1H), 7.76-7.79 (complex, 4H), 8.04 (dd, J = 0.5, 5.2 Hz, 1H), 8.47 (m, 2H), 8.58 (m, 2H)
Synthesis of Compound 7a Compound 6 (510 mg, 1.33 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (23.1 mg, 0.02 mmol), copper iodide (13.3 mg, 0.07 mmol) and compound 5a (157 mg, 1.33 mmol) Was dissolved in DMF (7 ml). To this was further added N, N-diisopropylethylamine (2 ml), and the mixture was reacted in an oil bath at 70 ° C. for 14 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of methanol-chloroform (1:50) to obtain Compound 7a (274 mg, 55%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 6.20 (br, 2H), 6.84 (d, J = 0.7 Hz, 1H), 6.88 (dd, J = 1.4, 5.2 Hz, 1H), 7.76-7.79 (complex, 4H), 8.04 (dd, J = 0.5, 5.2 Hz, 1H), 8.47 (m, 2H), 8.58 (m, 2H)
化合物７ｂの合成
化合物６（194 mg, 0.51 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（34.2 mg, 0.03 mmol）、ヨウ化銅（5.9 mg, 0.03 mmol）および化合物５ｂ（89.3 mg, 0.51 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（2 ml）を加えて、７０℃の油浴中で１４時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、酢酸エチル−ヘキサン（１：５）の混合溶液で溶出し、化合物７ｂ（189 mg, 37 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.50 (s, 9H), 4.62 (s, 1H), 6.75 (m, 1H), 6.86 (dd, J = 1.3, 5.2, 1H), 7.61-7.68 (complex, 4H), 8.15 (dd, J = 0.7, 5.2, 1H), 8.56-8.65 (complex, 4H)
Synthesis of Compound 7b Compound 6 (194 mg, 0.51 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (34.2 mg, 0.03 mmol), copper iodide (5.9 mg, 0.03 mmol) and compound 5b (89.3 mg, 0.51 mmol) Was dissolved in DMF (5 ml). To this was further added N, N-diisopropylethylamine (2 ml), and the mixture was reacted in an oil bath at 70 ° C. for 14 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of ethyl acetate-hexane (1: 5) to obtain Compound 7b (189 mg, 37%).
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ 1.50 (s, 9H), 4.62 (s, 1H), 6.75 (m, 1H), 6.86 (dd, J = 1.3, 5.2, 1H), 7.61-7.68 ( complex, 4H), 8.15 (dd, J = 0.7, 5.2, 1H), 8.56-8.65 (complex, 4H)
化合物１ａの合成
化合物７ａ（180 mg, 0.48 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（23.3 mg, 0.02 mmol）、ヨウ化銅（3.8 mg, 0.02 mmol）および化合物８（146 mg, 0.58 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（5 ml）を加えて、８０℃の油浴中で１２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノール−クロロホルム（１：１０）の混合溶液で溶出し、化合物１ａ（81.2 mg, 31 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.29 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 5.34-5.39 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 6.62 (br, 2H), 6.97-7.00 (complex, 2H), 7.79-7.82 (complex, 4H), 8.06 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 8.61 (m, 2H), 8.72 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 11.9 (s, 1H).
Synthesis of Compound 1a Compound 7a (180 mg, 0.48 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (23.3 mg, 0.02 mmol), copper iodide (3.8 mg, 0.02 mmol) and compound 8 (146 mg, 0.58 mmol) Was dissolved in DMF (5 ml). Triethylamine (5 ml) was further added thereto, and the mixture was reacted in an oil bath at 80 ° C. for 12 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of methanol-chloroform (1:10) to obtain Compound 1a (81.2 mg, 31%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.29 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.79 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 4.38 (m, 1H), 5.34-5.39 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 6.62 (br, 2H), 6.97-7.00 (complex, 2H), 7.79-7.82 (complex, 4H), 8.06 (d , J = 5.4 Hz, 1H), 8.61 (m, 2H), 8.72 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 11.9 (s, 1H).
化合物１ｂの合成
化合物７ｂ（76.6 mg, 0.18 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（11.7 mg, 0.01 mmol）、ヨウ化銅（1.9 mg, 0.01 mmol）および化合物８（55.4 mg, 0.22 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（3 ml）を加えて、８０℃の油浴中で１２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノール−クロロホルム（１：１０）の混合溶液で溶出し、化合物１ｂ（84.0 mg, 76 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 1.43 (s, 9H), 2.26 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 3.71 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.32-5.36 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.82 (m, 1 H), 6.95 (s, 1H), 7.79-7.80 (complex, 4H), 8.10 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.59 (m, 2H), 8.73 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 11.9 (s, 1H).
Synthesis of Compound 1b Compound 7b (76.6 mg, 0.18 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (11.7 mg, 0.01 mmol), copper iodide (1.9 mg, 0.01 mmol) and compound 8 (55.4 mg, 0.22 mmol) Was dissolved in DMF (3 ml). Triethylamine (3 ml) was further added thereto, and the mixture was reacted in an oil bath at 80 ° C. for 12 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of methanol-chloroform (1:10) to obtain Compound 1b (84.0 mg, 76%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 1.43 (s, 9H), 2.26 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 3.71 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.87 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.32-5.36 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.82 (m, 1 H), 6.95 (s, 1H) , 7.79-7.80 (complex, 4H), 8.10 (d, J = 5.2 Hz, 1 H), 8.59 (m, 2H), 8.73 (m, 2H), 8.78 (s, 1H), 11.9 (s, 1H) .
得られた化合物１ａ及び１ｂについてそれぞれ下記の手順に従い、光学特性を測定した。なお、測定試料のｐＨ濃度は、下記の方法で調整した。
〔ｐＨ調整法〕
０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液と０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用意し、それぞれ適量混ぜた水溶液を何種類か作製後、ｐＨ測定メーターで測定し、各水溶液のｐＨを決定した。それらを「Ｈ２Ｏ」として使用した。
The obtained compounds 1a and 1b were measured for optical properties according to the following procedures. The pH concentration of the measurement sample was adjusted by the following method.
[PH adjustment method]
A 0.1N HCl aqueous solution and a 0.1N NaOH aqueous solution were prepared, and several types of aqueous solutions mixed with appropriate amounts were prepared and then measured with a pH measurement meter to determine the pH of each aqueous solution. They were used as “H 2 O”.
[１]ＵＶスペクトルの測定
得られた化合物を、それぞれ、２．５μＭの濃度で、各種ｐＨ濃度の溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１％含有、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：ＤＭＦ＝５０：４９：１（質量比））に溶解し、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）を用いてＵＶスペクトルを測定した。
[1] Measurement of UV spectrum Each of the obtained compounds at a concentration of 2.5 μM and containing various solvents at various pH concentrations (N, N-dimethylformamide (DMF) 1%, H 2 O: MeOH: DMF = 50) : 49: 1 (mass ratio)), and UV spectrum was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer UV-2550 (Shimadzu Corporation).
［２］蛍光スペクトルの測定
得られた各化合物を、それぞれ、２．５μＭの濃度で、各種ｐＨ濃度の溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１％含有、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：ＤＭＦ＝５０：４９：１（質量比））に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて蛍光スペクトルを測定した。化合物１ａの蛍光スペクトルの測定において、励起波長は４７０ｎｍであった。化合物１ｂの蛍光スペクトルの測定において、励起波長は４８０ｎｍであった。
［３］蛍光強度変化の観察
蛍光スペクトルの測定で用いた各測定試料をｐＨ濃度順に並べて蛍光強度の変化を観察した。その結果、中性から塩基性の条件下で緑色に発光し、酸性の条件下で黄色く発光し、広範囲のｐＨ領域で蛍光発光が観察された。蛍光発光色の変化をデジタルカメラで撮影した。
[2] Measurement of fluorescence spectrum Each of the obtained compounds was contained at a concentration of 2.5 μM and containing various solvents at various pH concentrations (N, N-dimethylformamide (DMF) 1%, H 2 O: MeOH: DMF = 50: 49: 1 (mass ratio)), and a fluorescence spectrum was measured using a fluorometer RF-5300PC (Shimadzu Corporation). In the measurement of the fluorescence spectrum of Compound 1a, the excitation wavelength was 470 nm. In the measurement of the fluorescence spectrum of Compound 1b, the excitation wavelength was 480 nm.
[3] Observation of fluorescence intensity change Each measurement sample used in the measurement of the fluorescence spectrum was arranged in order of pH concentration, and the change in fluorescence intensity was observed. As a result, green light was emitted under neutral to basic conditions, yellow light was emitted under acidic conditions, and fluorescence was observed in a wide pH range. Changes in fluorescent color were taken with a digital camera.
化合物１ａについての測定結果を図１（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に、化合物１ｂについての測定結果を図２（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示す。なお、図１（ｃ）及び図２（ｃ）は、蛍光発光色の変化をデジタルカメラで撮影した写真のモノクロコピーであるため、白濁してみえる試料が蛍光発光が観察された試料である。 The measurement results for Compound 1a are shown in FIGS. 1 (a), (b) and (c), and the measurement results for Compound 1b are shown in FIGS. 2 (a), (b) and (c). In addition, since FIG.1 (c) and FIG.2 (c) are monochrome copies of the photograph which image | photographed the change of the fluorescence emission color with the digital camera, the sample which appears cloudy is a sample by which fluorescence emission was observed.
［比較例］
比較例として、下記式で示される化合物１’を下記スキーム２に従って合成し、実施例１と同じ条件にて、ＵＶスペクトル及び蛍光スペクトルを測定し、蛍光強度の変化を観察した。なお、化合物１’の蛍光スペクトルの測定において、励起波長は４７３ｎｍであった。化合物１’についての測定結果を図３（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）に示す。
As a comparative example, a compound 1 ′ represented by the following formula was synthesized according to the following scheme 2, UV spectrum and fluorescence spectrum were measured under the same conditions as in Example 1, and changes in fluorescence intensity were observed. In the measurement of the fluorescence spectrum of compound 1 ′, the excitation wavelength was 473 nm. The measurement results for Compound 1 ′ are shown in FIGS. 3 (a), (b) and (c).
化合物（７ｃ）の合成
化合物６（450 mg, 1.17 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（70.1 mg, 0.06 mmol）、ヨウ化銅（11.3 mg, 0.06 mmol）および４−エチニルピリジン（145 mg, 1.40 mmol）をＤＭＦ（7 ml）に溶解させた。これにさらにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（2 ml）を加えて、７０℃の油浴中で１４時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、酢酸エチル−ヘキサン（１：３）の混合溶液で溶出し、化合物７ｃ（129 mg, 31 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ7.61-7.67 (complex, 6H), 8.58-8.72 (complex, 6H).
Synthesis of Compound (7c) Compound 6 (450 mg, 1.17 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (70.1 mg, 0.06 mmol), copper iodide (11.3 mg, 0.06 mmol) and 4-ethynylpyridine (145 mg) , 1.40 mmol) was dissolved in DMF (7 ml). To this was further added N, N-diisopropylethylamine (2 ml), and the mixture was reacted in an oil bath at 70 ° C. for 14 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of ethyl acetate-hexane (1: 3) to obtain Compound 7c (129 mg, 31%).
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz) δ7.61-7.67 (complex, 6H), 8.58-8.72 (complex, 6H).
化合物（１'）の合成
化合物７ｃ（107 mg, 0.30 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（23.6 mg, 0.02 mmol）、ヨウ化銅（3.7 mg, 0.02 mmol）および化合物８（90.1 mg, 0.36 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（3 ml）を加えて、８０℃の油浴中で１２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノール−クロロホルム（１：１０）の混合溶液で溶出し、化合物１'（57.8 mg, 36 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.29 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.78 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.35-5.38 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 7.77-7.88 (complex, 6H), 8.67-8.74 (complex, 6H), 8.79 (s, 1H), 11.9 (s, 1H).
Synthesis of Compound (1 ′) Compound 7c (107 mg, 0.30 mmol), tetrakistriphenylphosphine palladium (0) (23.6 mg, 0.02 mmol), copper iodide (3.7 mg, 0.02 mmol) and compound 8 (90.1 mg, 0.36 mmol) was dissolved in DMF (3 ml). Triethylamine (3 ml) was further added thereto, and the mixture was reacted in an oil bath at 80 ° C. for 12 hours. After the reaction, the solvent was distilled off, and the resulting residue was adsorbed on a silica gel column and eluted with a mixed solution of methanol-chloroform (1:10) to obtain Compound 1 ′ (57.8 mg, 36%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.29 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.78 (m, 1H), 3.88 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.35-5.38 (complex, 2H), 6.20 (m, 1H), 7.77-7.88 (complex, 6H), 8.67-8.74 (complex, 6H), 8.79 (s, 1H), 11.9 (s , 1H).
本発明のウラシルヌクレオシド誘導体は、生体内等におけるｐＨ環境の変化を検出するためのプローブとして用いることができる。
また、本発明のウラシルヌクレオシド誘導体又はウラシルヌクレオチド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、タンパク質又は細胞内における局所的なｐＨ環境の調査用プローブとして利用することができる。また、本発明のポリヌクレオチド誘導体を標的ＤＮＡやＲＮＡを検出する試薬として利用することもできる。
The uracil nucleoside derivative of the present invention can be used as a probe for detecting a change in pH environment in vivo or the like.
Moreover, the polynucleotide derivative obtained by introducing the uracil nucleoside derivative or uracil nucleotide derivative of the present invention can be used as a probe for investigating a local pH environment in a protein or cell. The polynucleotide derivative of the present invention can also be used as a reagent for detecting target DNA or RNA.
Claims (14)
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基である。］
で示されるウラシルヌクレオシド誘導体。 Formula I below:
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or it is a methoxy group and R < 4 > is a hydrogen atom or a hydroxyl group. ]
A uracil nucleoside derivative represented by:
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又はＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基又はメトキシ基であり、Ｒ４は、水素原子又は水酸基であり、ｓは、１、２又は３である。］
で示されるウラシルヌクレオチド誘導体。 Formula (II) below:
[Wherein, R 1 and R 2 are each independently the same or different and are a hydrogen atom or a C 1 -C 10 alkyl group, and R 3 is a hydrogen atom, a C 1 -C 10 alkyl group] Or a methoxy group, R 4 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, and s is 1, 2 or 3. ]
A uracil nucleotide derivative represented by:
The probe according to claim 13, which is for detecting a change in pH environment in a living body.
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