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JP6306593B2 - Cell penetrating peptide - Google Patents

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JP6306593B2 JP2015531671A JP2015531671A JP6306593B2 JP 6306593 B2 JP6306593 B2 JP 6306593B2 JP 2015531671 A JP2015531671 A JP 2015531671A JP 2015531671 A JP2015531671 A JP 2015531671A JP 6306593 B2 JP6306593 B2 JP 6306593B2
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Description

本発明は、生物学的および医学的用途の細胞送達剤としての新たな細胞透過性ペプチドに関する。   The present invention relates to new cell penetrating peptides as cell delivery agents for biological and medical applications.

真核細胞の細胞膜は生物活性分子の無秩序な流入から細胞を保護する、厳重に制御されたバリアである。細胞にとり内因性ではない低分子およびタンパク質または他の高分子をベースとする薬物が細胞膜を横断するためには、固有の輸送系を用いるか、または脂質二重層を介した直接拡散を行うことによる。しかしながら、多くの場合、いずれの侵入様式も、外因性分子にとって非効率である。   The cell membrane of eukaryotic cells is a tightly controlled barrier that protects cells from the uncontrolled flow of bioactive molecules. Small molecules that are not endogenous to the cell and drugs based on proteins or other macromolecules can cross the cell membrane by using an intrinsic transport system or by direct diffusion through the lipid bilayer . In many cases, however, either mode of entry is inefficient for exogenous molecules.

この10年の間に、細胞透過性ペプチド(CPP)は、タンパク質を含めた種々の治療薬をそれらの標的に送達するための有望なベクターとして浮上してきた。CPPは、輸送体または特異的受容体とは無関係に、生体膜を横断する効率的なタンパク質移行を促すペプチド配列である。CPPはまた、その生産においてコスト効率の高いという利点がある。ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化調節タンパク質(HIV TAT)の細胞移行特性が、20年前に発見されて以来、ペネトラチン(アンテナペディアホメオドメイン)、VP22(単純ヘルペスウイルス)および合成ポリアルギニン(ポリR)などのいくつかのCPPが同定されている。種々のカーゴが、新規ワクチン設計のためにCPPに連結されている。   During the last decade, cell penetrating peptides (CPP) have emerged as promising vectors for delivering various therapeutic agents, including proteins, to their targets. CPPs are peptide sequences that facilitate efficient protein translocation across biological membranes, regardless of transporter or specific receptor. CPP also has the advantage of being cost effective in its production. Since the cell translocation properties of human immunodeficiency virus transactivation regulatory protein (HIV TAT) were discovered 20 years ago, penetratin (antennapedia homeodomain), VP22 (herpes simplex virus) and synthetic polyarginine (polyR) Several CPPs have been identified such as Various cargoes are linked to the CPP for new vaccine designs.

最近になり、エプスタイン・バーウイルスの塩基性ロイシンジッパー転写活性化因子であるZEBRAが、生細胞の外膜を横断してリンパ球の核に蓄積することが示された。より詳細には、エプスタイン・バーウイルスZEBRAトランス活性化因子の細胞透過能に必要なZEBRAの最小領域が、ZEBRAの残基170から残基220までであること、そして、この領域に含まれるDNA結合ドメインおよび二量体形成ドメインの両方が細胞透過性に必要であることが明らかにされている(Rothe et al.2010,J.Biological Chemistry 285(26):20224〜20232)。   Recently, it was shown that ZEBRA, the Epstein Barr virus basic leucine zipper transcriptional activator, accumulates in the lymphocyte nucleus across the outer membrane of living cells. More specifically, the minimum region of ZEBRA required for the cell permeability of the Epstein-Barr virus ZEBRA transactivator is from ZEBRA residues 170 to 220, and the DNA binding contained in this region It has been shown that both domains and dimerization domains are required for cell permeability (Rothe et al. 2010, J. Biological Chemistry 285 (26): 20224-20232).

細胞内へカーゴ分子を送達するビヒクルとしての用途を考慮すると、多くのCCPには欠点がある。例えば、これらは細胞内において膜破壊による細胞質漏出または膜タンパク質の正常な機能の妨害などの重篤な副作用を引き起こし得るか、あるいは細胞毒性作用および/または免疫原性作用を引き起こし得る。また、いくつかのCPPは、細胞質内で急速に分解されるか、またはエンドソーム内に捕捉されたままリソソーム内で分解される場合がある。さらに、いくつかのCPPは、カーゴ分子を遊離できないか、あるいは対応しているかまたは遊離できるカーゴ分子の範囲が広くない。   Many CCPs have drawbacks when considered for use as a vehicle to deliver cargo molecules into cells. For example, they can cause serious side effects such as cytoplasmic leakage due to membrane disruption or disruption of the normal function of membrane proteins in the cell, or they can cause cytotoxic and / or immunogenic effects. Some CPPs may also be rapidly degraded in the cytoplasm or degraded in lysosomes while trapped in endosomes. In addition, some CPPs cannot release cargo molecules or correspond to or release a wider range of cargo molecules.

したがって、多種多様なカーゴ分子を細胞内に送達でき、カーゴ分子を高効率で取り込み、かつ毒性が低い改良ビヒクルが今もなお必要とされている。ワクチンとの関連においても、この送達ビヒクルが、カーゴ分子の内部移行のための単一経路に限定されず、抗原提示のためにサイトゾルおよびエンドソームの両方に送達され得るならば有利である。本発明は、例えば抗原提示細胞の細胞表面に抗原決定基を、効率的に送達および提示することが可能なCPPを提供することによって、この問題を解決する。したがって、本発明によるCPPは、例えば、ポリペプチドおよびタンパク質、多糖、脂質、またはそれらの組み合わせ、ならびに核酸、低分子薬物、およびイメージング剤などの種々のカーゴ分子の送達のためのビヒクルとして有用である。   Accordingly, there remains a need for improved vehicles that can deliver a wide variety of cargo molecules into cells, incorporate cargo molecules with high efficiency, and have low toxicity. Also in the context of vaccines, it is advantageous if this delivery vehicle is not limited to a single route for internalization of cargo molecules and can be delivered to both cytosol and endosomes for antigen presentation. The present invention solves this problem, for example, by providing CPPs that can efficiently deliver and present antigenic determinants on the cell surface of antigen presenting cells. Thus, CPPs according to the present invention are useful as vehicles for delivery of various cargo molecules such as polypeptides and proteins, polysaccharides, lipids, or combinations thereof, and nucleic acids, small molecule drugs, and imaging agents, for example. .

本発明の第1の態様によれば、
細胞透過性ペプチドであって、
a)当該ペプチドのアミノ酸配列の全長が15〜30アミノ酸の間にあり、かつ
b)当該ペプチドが、ZEBRAの残基170から残基220にわたる領域のフラグメントを含むアミノ酸配列を有し、ここで、場合により1、2、3、4、または5アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく、置換、欠失および/または付加されていてもよいこと
を特徴とするもの、および
当該ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記ペプチドの変異体
が提供される。
According to a first aspect of the invention,
A cell penetrating peptide comprising:
a) the total length of the amino acid sequence of the peptide is between 15-30 amino acids, and b) the peptide has an amino acid sequence comprising a fragment of the region ranging from residue 170 to residue 220 of ZEBRA, wherein Optionally 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids may be substituted, deleted and / or added without losing the cell permeability of said peptide, and There is provided a variant of said peptide comprising an amino acid sequence having at least one conservatively substituted amino acid as compared to the amino acid sequence.

本発明の第2の態様は、前記細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含んでなる複合体に関する。   A second aspect of the present invention relates to a complex comprising the cell permeable peptide and a cargo molecule.

本発明の第3の態様は、前記細胞透過性ペプチドまたは前記複合体をコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。   The third aspect of the present invention relates to a polynucleotide encoding the cell-penetrating peptide or the complex, and a vector comprising such a polynucleotide.

本発明の第4の態様は、上記で定義されるような細胞透過性ペプチドまたは複合体を発現する宿主細胞、およびそのような細胞を産生する方法にある。   A fourth aspect of the invention resides in a host cell that expresses a cell penetrating peptide or complex as defined above and a method of producing such a cell.

本発明の第5の態様は、上記で定義されるような複合体をロードした細胞に関する。   A fifth aspect of the invention relates to a cell loaded with a complex as defined above.

本発明の第6の態様は、(i)本発明の細胞透過性ペプチド、(ii)本発明の複合体、(iii)本発明の核酸、(iv)本発明のベクター、(v)本発明の宿主細胞、または(vi)本発明による複合体をロードした細胞を含んでなる組成物に関する。   The sixth aspect of the present invention comprises (i) the cell penetrating peptide of the present invention, (ii) the complex of the present invention, (iii) the nucleic acid of the present invention, (iv) the vector of the present invention, (v) the present invention. Or (vi) a composition comprising a cell loaded with a complex according to the invention.

本発明の第7の態様は、医薬として使用するための、またはイメージング組成物もしくは診断用組成物として使用するための上記組成物に関する。   A seventh aspect of the present invention relates to the above composition for use as a medicament or for use as an imaging or diagnostic composition.

本発明の第8の態様は、少なくとも以下の1つを含むパーツキットである:
(a)本発明による細胞透過性ペプチド
(b)本発明による複合体
(c)本発明による核酸
(d)本発明によるベクター
(e)本発明による宿主細胞
(f)本発明による複合体をロードした細胞
The eighth aspect of the present invention is a parts kit comprising at least one of the following:
(A) a cell-penetrating peptide according to the invention (b) a complex according to the invention (c) a nucleic acid according to the invention (d) a vector according to the invention (e) a host cell according to the invention (f) loading a complex according to the invention Cells

本発明の第9の態様は、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。   A ninth aspect of the invention provides a method for delivering a cargo molecule into a cell in vitro, the method comprising contacting the cell with a cell penetrating peptide according to the invention and the cargo molecule. Become.

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。   Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description.

CPP1−OVAおよびCPP2−OVA融合ポリペプチドを樹状細胞内にロードした後のMHCクラスI拘束性提示の結果を示す。骨髄由来樹状細胞に、0.3μMのそれぞれのCPP−OVA融合ポリペプチドを4時間ロードし、LPSを用いて一晩成熟させた。TCRトランスジェニックマウスOT1由来の脾細胞と共に5日間コインキュベーションした後、増殖しているOVA特異的T細胞のCFSE希釈によって、OVAエピトープの正確なMHCクラスI拘束性提示を評価した。T細胞単独(A)または融合ポリペプチドでパルスしなかった成熟骨髄樹状細胞と共にコインキュベーションしたT細胞(B)のいずれかを用いた陰性コントロール;ペプチド(C)またはペプチドでパルスした成熟骨髄由来樹状細胞(D)のいずれかと共にインキュベーションしたT細胞を用いた陽性コントロール;CPP1−OVA(E);CPP2−OVA(F)。Figure 3 shows the results of MHC class I restricted presentation after loading CPP1-OVA and CPP2-OVA fusion polypeptides into dendritic cells. Bone marrow derived dendritic cells were loaded with 0.3 μM of each CPP-OVA fusion polypeptide for 4 hours and matured overnight with LPS. Exact MHC class I-restricted presentation of OVA epitopes was assessed by CFSE dilution of proliferating OVA-specific T cells after co-incubation with spleen cells from TCR transgenic mice OT1. Negative control using either T cells alone (A) or T cells (B) co-incubated with mature bone marrow dendritic cells not pulsed with fusion polypeptide; derived from mature bone marrow pulsed with peptide (C) or peptide Positive control using T cells incubated with any of dendritic cells (D); CPP1-OVA (E); CPP2-OVA (F). CPP1またはCPP2およびオボアルブミン(ovalbumine)ペプチドカーゴを含む融合ポリペプチドを用いたマウスのワクチン接種後のポリクローナル免疫応答を示す。マウスは、20μgの各CPP−OVA融合ポリペプチドおよび100μgの抗CD40を用いて、14日間隔で皮下に2回ワクチン接種を行い、50μgのポリICを、この追加免疫の10日後に筋肉内に注射し、これらのマウスを屠殺して、脾臓を多量体および抗CD8で染色した。PBSを用いた陰性コントロール(A);CPP1−OVA(B);CPP2−OVA(C)。Figure 2 shows a polyclonal immune response after vaccination of mice with a fusion polypeptide comprising CPPl or CPP2 and ovalbumin peptide cargo. Mice were vaccinated twice subcutaneously at 14 day intervals with 20 μg of each CPP-OVA fusion polypeptide and 100 μg of anti-CD40, and 50 μg of poly IC was injected intramuscularly 10 days after this boost. After injection, these mice were sacrificed and the spleen was stained with multimers and anti-CD8. Negative control with PBS (A); CPP1-OVA (B); CPP2-OVA (C).

「細胞透過性ペプチド」(「CPP」)という用語は、細胞膜を横断して種々のタイプのカーゴ分子を輸送することができ、したがって、多様な分子カーゴ(ナノサイズ粒子から低分子化学物質、巨大分子、およびDNAの大きなフラグメントまで)の細胞取り込みを促進することができる短ペプチドを示すのに一般に用いられる。「カーゴ」分子は、共有結合を介する化学結合かまたは非共有相互作用のいずれかによって、細胞透過性ペプチドと結合している。細胞透過性ペプチドは、典型的には、リジンまたはアルギニンなどの正電荷アミノ酸を高い相対存在量で含むか、または極性/荷電アミノ酸と非極性(疎水性)アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有する。これらの2つのタイプの構造はそれぞれ、ポリカチオンまたは両親媒性と呼ばれる。細胞透過性ペプチドは、異なるサイズ、アミノ酸配列および電荷であっても、全てのCPPは、細胞膜を移行することができ、多様な分子カーゴの細胞質または細胞小器官への送達を促進することができるという共通の特性を有する。現在のところ、CPP移行の理論は、膜への直接浸透、エンドサイトーシスを介する侵入、および一過性構造の形成による移行の、3つの主要な侵入機構に分類されている。CPP形質導入は、進行中の研究分野である。細胞透過性ペプチドは、癌を含む種々の疾患の治療における薬物送達剤およびウイルス阻害剤のような医薬において、ならびに細胞標識およびイメージングのための造影剤において、多くの用途が見出されている。   The term “cell penetrating peptide” (“CPP”) is capable of transporting various types of cargo molecules across the cell membrane, and thus a variety of molecular cargoes (from nano-sized particles to small molecule chemicals, macromolecules). It is commonly used to denote short peptides that can promote cellular uptake of molecules, and even large fragments of DNA. “Cargo” molecules are linked to cell penetrating peptides either by chemical bonds through covalent bonds or by non-covalent interactions. Do cell penetrating peptides typically contain a high relative abundance of positively charged amino acids such as lysine or arginine, or have a sequence that contains an alternating pattern of polar / charged amino acids and nonpolar (hydrophobic) amino acids It has any amino acid composition. Each of these two types of structures is called polycation or amphiphilic. Even though cell penetrating peptides are of different sizes, amino acid sequences and charges, all CPPs can translocate the cell membrane and facilitate delivery of diverse molecular cargo to the cytoplasm or organelle. It has the common characteristic. At present, the theory of CPP migration has been classified into three major penetration mechanisms: direct membrane penetration, penetration via endocytosis, and migration through the formation of transient structures. CPP transduction is an ongoing research area. Cell penetrating peptides have found many uses in pharmaceuticals such as drug delivery agents and virus inhibitors in the treatment of various diseases including cancer, and in contrast agents for cell labeling and imaging.

「カーゴ分子」は、本明細書では、共有または非共有結合によって細胞透過性ペプチドに結合している分子を示し、前記細胞透過性ペプチドの存在によって、その細胞内部移行が促進されるかまたは可能になる。本発明において、「カーゴ分子」には、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、それらの組み合わせ(リポタンパク質および糖脂質など)、核酸(例えば、DNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイDNA、プラスミド)、低分子薬物(例えば、シクロスポリンA、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、5−アミノレブリン酸)、イメージング剤(例えば、フルオロフォア、量子ドット(QD)、放射性トレーサー、ガドリニウム(Gd3+)低分子量キレートなどの金属キレート、超常磁性酸化鉄(SPIO))が含まれる。カーゴ分子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である場合、1つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を結合して含み得ると理解される。また、カーゴ分子が核酸である場合、前記核酸は、各々の核酸が1つのペプチドまたはポリペプチドをコードしている、1つ以上の核酸を含み得る。カーゴ分子はまた、リポタンパク質および糖脂質などの、タンパク質、脂質、および/または多糖の組み合わせであってもよい。   “Cargo molecule” as used herein refers to a molecule that is covalently or non-covalently bound to a cell-penetrating peptide, and the presence of said cell-penetrating peptide promotes or allows its internalization. become. In the present invention, “cargo molecule” includes peptides, proteins, polysaccharides, lipids, combinations thereof (such as lipoproteins and glycolipids), nucleic acids (eg, DNA, siRNA, shRNA, antisense oligonucleotides, decoy DNA, plasmids) ), Small molecule drugs (eg, cyclosporin A, paclitaxel, doxorubicin, methotrexate, 5-aminolevulinic acid), imaging agents (eg, fluorophores, quantum dots (QD), radiotracers, gadolinium (Gd3 +) low molecular weight chelates, etc.) Chelate, superparamagnetic iron oxide (SPIO)). When the cargo molecule is a peptide, polypeptide or protein, it is understood that one or more peptides, polypeptides or proteins may be linked and included. Also, when the cargo molecule is a nucleic acid, the nucleic acid can include one or more nucleic acids, each nucleic acid encoding a peptide or polypeptide. The cargo molecule may also be a combination of proteins, lipids, and / or polysaccharides, such as lipoproteins and glycolipids.

「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」という用語およびこれらの用語の変形は、融合タンパク質を含めたペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはタンパク質をいい、これらはそれぞれ少なくとも2つのアミノ酸を含んでなり、通常のペプチド結合によって互いに連結された、または、例えば等配電子体ペプチドの場合、修飾されたペプチド結合によって互いに連結されたものをいう。これらの用語には、本明細書では、非ペプチド構造要素を含むペプチドアナログと定義される「ペプチド模倣薬」も含まれ、これらのペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣するか、またはその作用と拮抗することができる。ペプチド模倣薬は、酵素的に切断できるペプチド結合などの古典的ペプチド特性を有しない。ペプチドまたはポリペプチドは、遺伝コードにより定義される20種のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されていてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、L−アミノ酸および/またはD−アミノ酸から構成されていてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは同様に、当業者に周知の、例えば翻訳後成熟過程などの天然過程によるか、または化学過程によって修飾されたアミノ酸から構成されていてもよい。これらの修飾は、文献に十分詳細に記載されている。これらの修飾は、ポリペプチド中のどこにでも、すなわち、ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中、あるいはカルボキシ末端またはアミノ末端でさえも、出現し得る。ペプチドまたはポリペプチドは、ユビキチン化を受けて分岐状になっていても、あるいは分枝の有無にかかわらず環状であってもよい。このタイプの修飾は、当業者に周知の天然または合成の翻訳後過程の結果であってもよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの修飾としては、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的固定、脂質または脂質誘導体の共有結合的固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合的固定、共有結合的または非共有結合的架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化(seneloylation)、硫酸化(sulfatation)、アミノ酸付加、例えばアルギニル化(arginylation)もしくはユビキチン化が挙げられ得る。これらの修飾は、文献(Proteins Structure and Molecular Properties(1993)2nd Ed.,T.E.Creighton,New York;Post−translational Covalent Modifications of Proteins(1983)B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York;Seifter et al.(1990)Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626〜646 and Rattan et al.,(1992)Protein Synthesis:Post−translational Modifications and Aging,Ann NY Acad Sci,663:48〜62)に十分詳細に記載されている。   The terms “peptide”, “polypeptide”, “protein” and variations of these terms refer to peptides, oligopeptides, oligomers or proteins, including fusion proteins, each comprising at least two amino acids, For example, in the case of an isosteric peptide, it is connected to each other by a modified peptide bond. These terms also include “peptidomimetics,” which are defined herein as peptide analogs that contain non-peptide structural elements, do these peptides mimic the biological effects of the natural parent peptide? Or can antagonize its action. Peptidomimetics do not have classical peptide properties such as peptide bonds that can be cleaved enzymatically. The peptide or polypeptide may be composed of amino acids other than the 20 amino acids defined by the genetic code. The peptide or polypeptide may be composed of L-amino acids and / or D-amino acids. A peptide or polypeptide may also be composed of amino acids that are modified by natural processes well known to those skilled in the art, for example by natural processes such as post-translational maturation processes, or by chemical processes. These modifications are described in sufficient detail in the literature. These modifications can appear anywhere in the polypeptide, ie, in the peptide backbone, in the amino acid chain, or even at the carboxy terminus or amino terminus. The peptide or polypeptide may be branched by ubiquitination, or may be cyclic with or without branching. This type of modification may be the result of natural or synthetic post-translational processes well known to those skilled in the art. For example, peptide or polypeptide modifications include acetylation, acylation, ADP ribosylation, amidation, covalent immobilization of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent immobilization of lipids or lipid derivatives, covalent attachment of phosphatidylinositol. Immobilization, covalent or non-covalent crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, glycosylation including pegylation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic process, phosphorylation , Prenylation, racemization, senoylation, sulfation, amino acid addition, such as arginylation or ubiquitination. These modifications are described in the literature (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Lightton, New York; Post-translational Covalent Mods A. 1988). New York; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modification and nonprotein cofactors, Meth.Enzymol.182: 626-646 and Rattan et al., 1992 Prost. translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48~62) to have been described in sufficient detail.

細胞透過性ペプチドに連結されたカーゴ分子の「細胞内部移行」という用語は、一般に、細胞膜を横断するカーゴ分子の輸送を意味し、したがって細胞内へのカーゴ分子の侵入を意味する。個々の場合に応じて、カーゴ分子はその後、細胞質中に遊離され、細胞内小器官に向うか、またはさらに細胞表面に提示されてもよい。   The term “cell internalization” of a cargo molecule linked to a cell penetrating peptide generally means the transport of the cargo molecule across the cell membrane, and thus the entry of the cargo molecule into the cell. Depending on the individual case, the cargo molecule may then be released into the cytoplasm and directed to intracellular organelles or further presented to the cell surface.

「ZEBRA」という用語(別名、Zta、Z、EB1、またはBZLF1)は、一般に、エプスタイン・バーウイルス(EBV)の塩基性ロイシンジッパー(bZIP)転写活性化因子を意味する。細胞透過能を示すZEBRAの最小領域は、ZEBRAの残基170から残基220までであると特定されている。ZEBRAのアミノ酸配列は、NCBI受託番号YP_401673に開示され、配列番号23に示す245アミノ酸を含む。   The term “ZEBRA” (also known as Zta, Z, EB1, or BZLF1) generally refers to the Epstein-Barr virus (EBV) basic leucine zipper (bZIP) transcriptional activator. The smallest region of ZEBRA that exhibits cell permeability is identified as residues 170 to 220 of ZEBRA. The amino acid sequence of ZEBRA is disclosed in NCBI accession number YP_401673 and includes the 245 amino acids shown in SEQ ID NO: 23.

「エピトープ」という用語(別名、「抗原決定基」)は、免疫システムによって、具体的には抗体、B細胞、またはT細胞によって認識される、抗原の部分である。本明細書にあって、「エピトープ」という用語は、主に、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に結合して抗原提示細胞の表面に提示される、T細胞エピトープを指すのに用いられる。MHCクラスI分子によって提示されるT細胞エピトープは、限定されないが、典型的には8〜11アミノ酸長の間のペプチドであり、一方、MHCクラスII分子は、限定されないが、一般に12〜25アミノ酸長の間のより長いペプチドを提示する。   The term “epitope” (also known as “antigenic determinant”) is that portion of an antigen that is recognized by the immune system, specifically by antibodies, B cells, or T cells. As used herein, the term “epitope” is primarily used to refer to a T cell epitope that binds to a major histocompatibility complex (MHC) and is presented on the surface of antigen presenting cells. T cell epitopes presented by MHC class I molecules are not limited, but are typically peptides between 8-11 amino acids in length, while MHC class II molecules are generally but not limited to 12-25 amino acids. A longer peptide between the longer is presented.

「CD4エピトープ」または「CD4拘束性エピトープ」という用語は、本明細書では、CD4T細胞によって認識されるエピトープであって、MHCクラスII分子の溝に位置する抗原フラグメントからなるエピトープを指す。 The term “CD4 + epitope” or “CD4 + restricted epitope” is used herein to refer to an epitope that is recognized by CD4 + T cells and consists of an antigen fragment located in the groove of an MHC class II molecule. Point to.

「CD8エピトープ」または「CD8拘束性エピトープ」という用語は、本明細書では、CD8T細胞によって認識されるエピトープであって、MHCクラスI分子の溝に位置する抗原フラグメントからなるエピトープを指す。 The term “CD8 + epitope” or “CD8 + restricted epitope” is used herein to refer to an epitope that is recognized by a CD8 + T cell and consists of an antigen fragment located in the groove of an MHC class I molecule. Point to.

「MHCクラスIと関連してのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面でMHCクラスI分子の溝に位置するCD8エピトープをいう。 The term “epitope presentation in the context of MHC class I” refers to a CD8 + epitope located in the groove of an MHC class I molecule on the surface of a cell.

「MHCクラスIIと関連してのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面でMHCクラスII分子の溝に位置するCD4エピトープをいう。 The term “epitope presentation in association with MHC class II” refers to a CD4 + epitope located in the groove of an MHC class II molecule on the surface of a cell.

「CDIとの関連でのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面で分化抗原群1分子の溝に位置する脂質エピトープをいう。   The term “epitope presentation in the context of CDI” refers to a lipid epitope located in the groove of one molecule of a differentiation antigen group on the surface of a cell.

「MHCクラスI」は、主要組織適合遺伝子複合体分子の2つの主要なクラスの1つを指す。MHCクラスI(別名、「MHCI」)分子は、体のあらゆる有核細胞上で見いだされる。MHCクラスIの機能は、細胞傷害性細胞(CTL)にエピトープを表示することである。ヒトにおいて、MHCクラスI分子は、α−およびβ2−ミクログロブリン(b2m)の2つのペプチド鎖からなる。α鎖のみが多型性であり、HLA遺伝子によってコードされるが、b2mサブユニットは多型性ではなく、β2ミクログロブリン遺伝子によってコードされる。   “MHC class I” refers to one of the two major classes of major histocompatibility complex molecules. MHC class I (aka “MHCI”) molecules are found on every nucleated cell of the body. The function of MHC class I is to display epitopes on cytotoxic cells (CTL). In humans, MHC class I molecules consist of two peptide chains, α- and β2-microglobulin (b2m). Only the α chain is polymorphic and is encoded by the HLA gene, whereas the b2m subunit is not polymorphic and is encoded by the β2 microglobulin gene.

「MHCクラスII」は、主要組織適合遺伝子複合体分子の他方の主要なクラスを指す。MHCクラスII(別名、「MHCII」)分子は、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞を含めた、少数の特殊な細胞型でのみ見いだされ、これらはすべて専門の抗原提示細胞(APC)である。   “MHC class II” refers to the other major class of major histocompatibility complex molecules. MHC class II (aka “MHCII”) molecules are found only in a few specialized cell types, including macrophages, dendritic cells and B cells, all of which are specialized antigen presenting cells (APCs).

「腫瘍エピトープ」とは、本明細書では、腫瘍関連抗原由来または腫瘍特異的抗原由来のエピトープを意味する。例えば、腫瘍エピトープにはグリオーマエピトープが含まれる。   “Tumor epitope” as used herein means an epitope derived from a tumor-associated antigen or a tumor-specific antigen. For example, tumor epitopes include glioma epitopes.

「病原体エピトープ」とは、本明細書では、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および多細胞寄生虫などの病原体に由来する抗原性タンパク質、抗原性多糖、抗原性脂質、抗原性リポタンパク質または抗原性糖脂質由来のエピトープを意味する。病原体に由来する抗原性タンパク質、多糖、脂質、リポタンパク質または糖脂質としては、本明細書では、例えばアメーバ症、炭疽、ブルーリ潰瘍(マイコバクテリウム・ウルセランス)、カリシウイルス関連下痢症、カンピロバクター下痢症、子宮頸癌(ヒトパピローマウイルス)、クラミジア・トラコマチス関連生殖器疾患、コレラ、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、ジフテリア、エボラ出血熱、毒素原性大腸菌(ETEC)下痢症、胃癌(ヘリコバクター・ピロリ)、淋病、A群ストレプトコッカス関連疾患、B群ストレプトコッカス関連疾患、ヘモフィルスインフルエンザB菌による肺炎および侵襲性疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎下痢症、単純ヘルペス2型外陰部潰瘍、HIV/AIDS、鉤虫症、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、リーシュマニア症、レプトスピラ症、肝癌(B型肝炎)、肝癌(C型肝炎)、ライム病、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、上咽頭癌(エプスタイン・バーウイルス)、髄膜炎菌髄膜炎、パラインフルエンザ関連肺炎、百日咳、ペスト、灰白髄炎、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)肺炎、リフトバレー熱、ロタウイルス下痢症、風疹、住血吸虫症、重症急性呼吸器症候群(SARS)、細菌性赤痢、天然痘、黄色ブドウ球菌関連疾患、胃癌(ヘリコバクター・ピロリ)、肺炎球菌および侵襲性疾患、破傷風、ダニ媒介脳炎、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、ウエストナイルウイルス関連疾患、黄熱を含めた、ワクチン接種の標的になり得る疾患の原因である病原体に由来する、それぞれタンパク質、多糖、脂質、リポタンパク質または糖脂質が挙げられる。   “Pathogen epitope” as used herein refers to an antigenic protein, antigenic polysaccharide, antigenic lipid, antigenic lipoprotein or antigenicity derived from pathogens such as viruses, bacteria, fungi, protozoa and multicellular parasites. It means an epitope derived from glycolipid. Examples of antigenic proteins, polysaccharides, lipids, lipoproteins or glycolipids derived from pathogens include, as used herein, for example, amoebiasis, anthrax, buruli ulcer (Mycobacterium ulcerans), calicivirus-related diarrhea, Campylobacter diarrhea , Cervical cancer (human papillomavirus), Chlamydia trachomatis-related genital diseases, cholera, Crimea-Congo hemorrhagic fever, dengue fever, diphtheria, Ebola hemorrhagic fever, toxigenic Escherichia coli (ETEC) diarrhea, gastric cancer (Helicobacter pylori), gonorrhea, A Group Streptococcus-related disease, Group B Streptococcus-related disease, pneumonia and invasive disease caused by Haemophilus influenzae B, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis E diarrhea, herpes simplex type 2 vulvar ulcer, HIV / AIDS, helminthiasis, flu Nza, Japanese encephalitis, Lassa fever, Leishmaniasis, leptospirosis, liver cancer (hepatitis B), liver cancer (hepatitis C), Lyme disease, malaria, Marburg hemorrhagic fever, measles, mumps, epipharyngeal cancer (Epstein Barr virus), meningococcal meningitis, parainfluenza-associated pneumonia, whooping cough, plague, gray leukitis, rabies, respiratory syncytial virus (RSV) pneumonia, Rift Valley fever, rotavirus diarrhea, rubella Schistosomiasis, severe acute respiratory syndrome (SARS), bacterial dysentery, smallpox, Staphylococcus aureus-related disease, gastric cancer (Helicobacter pylori), pneumococcal and invasive disease, tetanus, tick-borne encephalitis, trachoma, tuberculosis , Derived from pathogens that cause disease that can be the target of vaccination, including bark disease, typhoid fever, West Nile virus-related disease, yellow fever , Protein, respectively, polysaccharides, lipids, lipoproteins or glycolipids.

「低分子干渉核酸」(siNA)という用語は、それらの核酸のアンチセンス作用に基づいてmRNA認識およびその下方制御を標的とするストラテジーに用いられる、短鎖核酸をいう。この用語には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびデオキシリボザイムなどの触媒核酸、ならびに低分子干渉RNA(siRNA)が含まれる。   The term “small interfering nucleic acids” (siNA) refers to short nucleic acids used in strategies that target mRNA recognition and its down-regulation based on the antisense action of those nucleic acids. The term includes antisense nucleic acids, catalytic nucleic acids such as ribozymes and deoxyribozymes, and small interfering RNA (siRNA).

「siRNA」という用語は、標的遺伝子由来の標的mRNAをノックダウンまたはサイレンシングすることができる一本鎖または二本鎖RNA(約19〜23ヌクレオチド)である、低分子干渉RNAをいう。人工siRNAは、オリゴヌクレオチドとして化学合成されてもよく、あるいは、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)としてプラスミドまたはウイルスベクター(アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス)中にクローニングされて、任意の細胞型で一過性または安定なトランスフェクションを生じてもよい(Martin et al.,2007,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.,8:81〜108;Kolfschoten et al.,2007,Nat.Clin.Pract.Endocrinol.Metab.,3(12):827〜34; Huang et al.,2008,Expert.Opin.Ther.Targets,12(5),637〜645)。   The term “siRNA” refers to small interfering RNA, which is single-stranded or double-stranded RNA (approximately 19-23 nucleotides) capable of knocking down or silencing target mRNA from a target gene. Artificial siRNAs may be chemically synthesized as oligonucleotides, or cloned as short hairpin RNAs (shRNAs) into plasmids or viral vectors (adenoviruses, retroviruses or lentiviruses) and can be found in any cell type. Transient or stable transfections may occur (Martin et al., 2007, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet., 8: 81-108; Kolfschoten et al., 2007, Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab., 3 (12): 827-34; Huang et al., 2008, Expert. Opin. Ther. Targets, 12 (5), 637-645).

本明細書で使用する場合、「治療」および「治療する」並びにそれに類する語は、所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを一般に意味する。その効果は、疾患、その症状または状態を予防するかまたは部分的に予防するという観点から、予防的なものであってもよく、および/または、疾患、状態、症状、またはその疾患に起因する有害作用の部分的な治癒または完全な治癒という観点から、治療的なものであってもよい。「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳類(特にヒト)における疾患の任意の治療を含み、かつ、(a)疾患に罹患しやすいがまだ罹患していると診断されていない被験体において、疾患を発症しないように予防すること(例えば、予防的早期無症候性介入);(b)疾患を抑制すること、すなわち、その進行を止めること;あるいは、疾患を軽減すること、すなわち、疾患および/またはその症状もしくは状態を退縮させること(例えば、損傷の改善または治療)を含む。詳細には、本発明による方法、使用、製剤および組成物は、癌または感染症の治療に有用であり、かつ/あるいは、初期癌患者における癌の進行期または転移期への移行を阻止し、それによって癌の進行度診断を改善するのに有用である。癌に適用される場合、疾患または障害の予防には、例えば個人の身内に癌の既往歴があることに起因して、その癌になる危険性があると同定された個人における、その癌の発生または進行の予防、ならびに、腫瘍促進病原体、例えばエプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒトヘルペスウイルス8(HHV8)、ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV−1)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)およびヘリコバクター・ピロリなどによる感染の予防が含まれる。また癌の「予防/治療」という用語には、個人において既に診断された癌の安定化も含まれる。「安定化」とは、初期癌患者における癌の進行期または転移期への移行の阻止を意味する。   As used herein, “treatment” and “treating” and like terms generally mean obtaining a desired pharmacological and physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of preventing or partially preventing the disease, its symptoms or conditions, and / or is due to the disease, condition, symptoms, or its diseases It may be therapeutic in terms of partial or complete healing of adverse effects. The term “treatment” as used herein includes any treatment of a disease in a mammal (particularly a human) and (a) is susceptible to the disease but has not yet been diagnosed Preventing a disease from developing in a subject (eg, prophylactic early asymptomatic intervention); (b) suppressing the disease, ie, stopping its progression; or reducing the disease, That includes regressing the disease and / or its symptoms or conditions (eg, amelioration or treatment of damage). In particular, the methods, uses, formulations and compositions according to the invention are useful for the treatment of cancer or infectious diseases and / or prevent the progression of cancer to the advanced or metastatic phase in early cancer patients, It is useful for improving the diagnosis of cancer progression. When applied to cancer, prevention of a disease or disorder includes the prevention of the cancer in an individual who has been identified as at risk for developing the cancer, for example due to a personal history of the cancer. Prevention of development or progression, as well as tumor promoting pathogens such as Epstein-Barr virus (EBV), human papillomavirus (HPV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), human herpesvirus 8 (HHV8) Prevention of infection by human T cell leukemia virus type 1 (HTLV-1), Merkel cell polyoma virus (MCV), Helicobacter pylori and the like. The term “prevention / treatment” of cancer also includes stabilization of cancer already diagnosed in an individual. “Stabilization” refers to the prevention of the transition of cancer to an advanced or metastatic stage in patients with early cancer.

「被験体」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳類をいう。例えば、本発明で意図する哺乳類には、ヒト、霊長類、家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用げっ歯類などが含まれる。   The term “subject” as used herein refers to a mammal. For example, mammals contemplated by the present invention include humans, primates, livestock animals such as cows, sheep, pigs, horses, laboratory rodents, and the like.

「有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、探求対象の組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的応答もしくは医薬品応答を誘発する、少なくとも1つの細胞透過性ペプチド、前記細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体、前記複合体をロードした細胞、本発明によるそれらの組成物または医薬製剤の量をいう。一実施形態において、有効量は、治療を受ける疾患または状態の症状を緩和するための「治療有効量」である。別の実施形態において、有効量は、予防を受ける疾患または状態の症状を予防するための「予防有効量」である。この用語には、本明細書では、疾患の進行を減少させるために、特に、腫瘍増殖または感染を減少もしくは抑制し、それによって探求対象の応答(詳細には、このような応答は、カーゴ分子に含まれるエピトープに対する免疫応答であってもよい)を誘発するために十分な活性ポリペプチドの量(すなわち、「抑制有効量」)も含まれる。   The term “effective amount” as used herein refers to at least one cell-permeable peptide that elicits a biological or pharmaceutical response in the tissue, system, animal or human being sought, said cell permeability It refers to the amount of complexes comprising peptides and cargo molecules, cells loaded with said complexes, their compositions or pharmaceutical formulations according to the invention. In one embodiment, an effective amount is a “therapeutically effective amount” for alleviating symptoms of the disease or condition being treated. In another embodiment, an effective amount is a “prophylactically effective amount” for preventing symptoms of the disease or condition being prevented. The term is used herein to reduce disease progression, in particular to reduce or suppress tumor growth or infection, and thereby the response being sought (in particular, such a response is a cargo molecule. Also included is an amount of active polypeptide sufficient to elicit an immune response against the epitope contained in (ie, a “suppressing effective amount”).

本発明による治療の「有効性」という用語は、本発明による使用または方法に応答して生じる、疾患の経過における変化に基づいて測定され得る。例えば、癌治療の有効性は、腫瘍体積の減少、および/または無増悪生存期間の増加、および/または原発癌切除後再発の危険性の減少によって測定され得る。より具体的には、免疫療法によって治療される癌に関して、有効性の評価は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン(RECIST)および世界保健機関(WHO)基準に沿った、新しい免疫関連応答判断基準(irRC)により、免疫療法剤に対する抗腫瘍応答の臨床パターンの分布によってなされ得る(J.Natl.Cancer Inst.2010,102(18):1388〜1397)。感染症予防の有効性は、ヒト個体群における疫学調査によって最終的に評価され、これは、血清中の中和抗体力価および病原体特異的な多機能T細胞応答の誘導とよく相関する。前臨床評価は、感染性病原体に曝露後の感染への耐性を含んでもよい。感染症の治療は、病原体特異的な抗体および/またはT細胞免疫応答と相関する、病原体増殖の抑制または病原体の排除(したがって、病原体の不検出)によって測定され得る。   The term “effectiveness” of a treatment according to the invention can be measured based on changes in the course of the disease that occur in response to a use or method according to the invention. For example, the effectiveness of cancer treatment can be measured by decreasing tumor volume and / or increasing progression-free survival and / or decreasing the risk of recurrence after primary cancer resection. More specifically, for cancers treated by immunotherapy, efficacy assessment is a new immune-related, in line with guidelines for determining the therapeutic effect of solid cancer (RECIST) and World Health Organization (WHO) criteria. Response criteria (irRC) can be made by the distribution of clinical patterns of anti-tumor responses to immunotherapeutic agents (J. Natl. Cancer Inst. 2010, 102 (18): 1388-1397). The effectiveness of infection prevention is finally assessed by epidemiological studies in human populations, which correlate well with the induction of neutralizing antibody titers in serum and pathogen-specific multi-functional T cell responses. Preclinical evaluation may include resistance to infection after exposure to an infectious agent. Treatment of infection can be measured by suppression of pathogen growth or elimination of pathogens (and thus no detection of pathogens), which correlates with pathogen-specific antibodies and / or T cell immune responses.

「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性が明白に有効になるような形態であり、かつ、前記製剤が投与される被験体にとって有毒である追加成分を含まない、調製物をいう。   The term “pharmaceutical formulation” refers to a preparation that is in a form such that the biological activity of the active ingredient is clearly effective and does not contain additional ingredients that are toxic to the subject to which the formulation is administered.

本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体
本発明の第一の態様は、
細胞透過性ペプチドであって、
a)前記ペプチドのアミノ酸配列の全長が、15〜30アミノ酸の間、例えば15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30アミノ酸の間にあり、かつ
b)前記ペプチドが、ZEBRA(配列番号23)の残基170から残基220にわたる、ZEBRAの最小ドメインのフラグメントを含むアミノ酸配列を有し、場合により1、2、3、4、または5アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および/または付加されていてもよいこと
を特徴とする細胞透過性ペプチド、および
前記ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、前記ペプチドの変異体に関する。
Cell penetrating peptides and complexes according to the invention A first aspect of the invention comprises:
A cell penetrating peptide comprising:
a) the total length of the amino acid sequence of the peptide is between 15 and 30 amino acids, for example 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or B) the peptide has an amino acid sequence comprising a fragment of the smallest domain of ZEBRA, ranging from residue 170 to residue 220 of ZEBRA (SEQ ID NO: 23), optionally 1, 2, A cell-penetrating peptide, wherein 3, 4, or 5 amino acids may be substituted, deleted, and / or added without losing the cell-penetrating ability of the peptide, and the amino acid sequence of the peptide, In comparison, it relates to a variant of said peptide comprising an amino acid sequence having at least one conservatively substituted amino acid.

本発明による細胞透過性ペプチドまたは前記細胞透過性ペプチドを含む複合体の細胞透過能(すなわち内部移行)は、生細胞もしくは固定細胞のフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡観察、前記ペプチドまたは複合体で形質導入された細胞の免疫細胞化学、およびウエスタンブロットなどの、当業者に公知の標準方法によって確認され得る。   Cell permeability (ie internalization) of a cell-permeable peptide according to the present invention or a complex comprising said cell-permeable peptide is determined by flow cytometry or fluorescence microscopy of live or fixed cells, transduction with said peptide or complex Can be confirmed by standard methods known to those skilled in the art, such as immunocytochemistry of the generated cells, and Western blots.

有利な実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドの変異体またはフラグメントは、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスII分子との関連で、抗原提示細胞のような細胞の表面に、エピトープのようなタンパク質性カーゴ分子を提示する前記ペプチドの能力をさらに保持している。   In an advantageous embodiment, a variant or fragment of a cell penetrating peptide according to the invention is associated with MHC class I and / or MHC class II molecules on the surface of a cell such as an antigen presenting cell, such as an epitope. It further retains the ability of the peptide to present proteinaceous cargo molecules.

MHCクラスIおよび/またはMHCクラスII分子との関連で、細胞の表面にエピトープのようなタンパク質性カーゴ分子を提示する、細胞透過性ペプチドまたは前記細胞透過性ペプチドを含む複合体の能力は、増殖を刺激する能力および/またはこれらのエピトープに特異性を有するMHC拘束性CD4もしくはCD8T細胞の機能などの、当業者に公知の標準方法によって確認され得る。 In the context of MHC class I and / or MHC class II molecules, the ability of a cell penetrating peptide or complex comprising said cell penetrating peptide to present a proteinaceous cargo molecule such as an epitope on the surface of a cell is Can be confirmed by standard methods known to those skilled in the art, such as the ability to stimulate and / or the function of MHC-restricted CD4 + or CD8 + T cells with specificity for these epitopes.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号13ではない。   In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the invention is not SEQ ID NO: 13.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号14ではない。   In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the invention is not SEQ ID NO: 14.

別の特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号23のZEBRAアミノ酸配列と比較して、189番に相当するSer(S)の位置に置換されたCys(C)を含む。   In another specific embodiment, the cell penetrating peptide according to the invention comprises Cys (C) substituted at position Ser (S) corresponding to position 189 compared to the ZEBRA amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. .

一つの実施形態において、本発明は、
細胞透過性ペプチドであって、
a)前記ペプチドが、少なくとも15アミノ酸長であり、かつ最大で30アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、かつ
b)前記ペプチドが、
(i)配列番号1、または
(ii)1、2、3、4、もしくは5アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および/または付加されている以外は、配列番号1と同一であるアミノ酸配列
を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする、細胞透過性ペプチド、または
前記ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記ペプチドの変異体に関する。
In one embodiment, the present invention provides:
A cell penetrating peptide comprising:
a) the peptide is at least 15 amino acids long and has an amino acid sequence of at most 30 amino acids long; and b) the peptide is
(I) SEQ ID NO: 1 or (ii) a sequence except that 1, 2, 3, 4, or 5 amino acids are substituted, deleted, and / or added without losing the cell permeability of the peptide A cell-permeable peptide comprising an amino acid sequence comprising the amino acid sequence identical to number 1, or an amino acid sequence having at least one conservatively substituted amino acid compared to the amino acid sequence of said peptide A variant of said peptide, comprising

本発明の一態様によれば、細胞透過性ペプチドは、参照される配列と比較して、少なくとも1つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる(所定のアミノ酸残基が、類似の生理化学特性を有する残基で置換されることを意味する)。   According to one aspect of the invention, the cell penetrating peptide comprises an amino acid sequence having at least one conservatively substituted amino acid as compared to the referenced sequence (the predetermined amino acid residue is Meaning substituted with a residue having similar physiochemical properties).

一般に、参照アミノ酸配列中に存在する1つ以上のアミノ酸の置換は、保存的に行われるべきである。保存的置換の例としては、1つの脂肪族残基の別の残基での置換、例えばIle、VaI、Leu、またはAlaの相互の置換、あるいは1つの極性残基の別の残基への置換、例えばLysおよびArg間;GluおよびAsp間;またはGlnおよびAsn間の置換が挙げられる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が周知である(Kyte and Doolittle,1982,J.Mol.Biol.157(1):105〜132)。1つ以上のL−アミノ酸の1つ以上のD−アミノ酸での置換は、本発明に関して保存的置換とみなされる。例示的なアミノ酸置換を、以下の表1に示す。

Figure 0006306593
In general, substitution of one or more amino acids present in a reference amino acid sequence should be made conservatively. Examples of conservative substitutions include substitution of one aliphatic residue with another residue, eg, mutual substitution of Ile, VaI, Leu, or Ala, or one polar residue to another residue Substitutions, for example, between Lys and Arg; between Glu and Asp; or between Gln and Asn. Other such conservative substitutions are well known, for example, substitution of entire regions with similar hydrophobic properties (Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157 (1): 105-132). Substitution of one or more L-amino acids with one or more D-amino acids is considered a conservative substitution with respect to the present invention. Exemplary amino acid substitutions are shown in Table 1 below.
Figure 0006306593

したがって、別の態様において、本発明による細胞透過性ペプチドは、以下であることを特徴とする:
a)前記ペプチドが、少なくとも15アミノ酸長であり、かつ最大で30アミノ酸長であるアミノ酸配列を有し、かつ
b)前記ペプチドは、0、1、2、3、4、もしくは5アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および/または付加されている配列番号6を含むアミノ酸配列を有し、配列中、
は、K、R、またはHであり、
は、R、K、またはHであり、
は、Y、W、またはFであり、
は、K、R、またはHであり、
は、NまたはQであり、
は、R、K、またはHであり、
は、V、I、M、L、F、またはAであり、
は、A、V、L、I、またはGであり、
は、SまたはTであり、
10は、R、K、またはHであり、
11は、K、R、またはHであり、
13は、R、K、またはHであり、
14は、A、V、L、I、またはGであり、
15は、K、R、またはHであり、
16は、F、L、V、I、Y、W、またはMであり、
17は、K、R、またはHであるものである。
Accordingly, in another aspect, the cell penetrating peptide according to the invention is characterized in that:
a) the peptide has an amino acid sequence that is at least 15 amino acids long and at most 30 amino acids long; and b) the peptide has 0, 1, 2, 3, 4, or 5 amino acids, Having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 6 that has been substituted, deleted, and / or added without losing the cell's ability to penetrate the peptide,
X 1 is K, R, or H;
X 2 is R, K, or H;
X 3 is Y, W, or F;
X 4 is K, R, or H;
X 5 is N or Q;
X 6 is R, K, or H;
X 7 is V, I, M, L, F, or A;
X 8 is A, V, L, I, or G;
X 9 is S or T;
X 10 is R, K, or H;
X 11 is K, R, or H;
X 13 is R, K, or H;
X 14 is A, V, L, I, or G;
X 15 is K, R, or H;
X 16 is F, L, V, I, Y, W, or M;
X 17 is one that is K, R, or H.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはKである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 1 is K.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはRである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 2 is R.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはYである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 3 is Y.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはKである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 4 is K.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはNである。 In a particular embodiment, the cell penetrating peptide according to the invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 5 is N.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはRである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6 , wherein X 6 is R.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはVである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 7 is V.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはAである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 8 is A.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、XはSである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 9 is S.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X10はRである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 10 is R.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X11はKである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 11 is K.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X13はRである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 13 is R.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X14はAである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 14 is A.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X15はKである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 15 is K.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X16はFである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 16 is F.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、X17はKである。 In certain embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention is as defined generally above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein X 17 is K.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号6を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、配列番号6と比較して12位に相当する位置のアミノ酸は、Ser(S)である。   In a particular embodiment, the cell penetrating peptide according to the invention is as generally defined above with reference to SEQ ID NO: 6, wherein the position corresponds to position 12 compared to SEQ ID NO: 6 The amino acid is Ser (S).

より具体的な態様において、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号7を含むアミノ酸配列を含み、配列中、
は、KまたはRであり、
は、RまたはKであり、
は、Y、W、またはFであり、
は、KまたはRであり、
は、NまたはQであり、
は、RまたはKであり、
は、V、I、MまたはLであり、
は、AまたはGであり、
は、SまたはTであり、
10は、RまたはKであり、
11は、KまたはRであり、
13は、RまたはKであり、
14は、AまたはGであり、
15は、KまたはRであり、
16は、F、Y、またはWであり、
17は、KまたはRであるものである。
In a more specific embodiment, the cell penetrating peptide comprises an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 7, wherein:
X 1 is K or R;
X 2 is R or K;
X 3 is Y, W, or F;
X 4 is K or R;
X 5 is N or Q;
X 6 is R or K;
X 7 is V, I, M or L;
X 8 is A or G;
X 9 is S or T;
X 10 is R or K;
X 11 is K or R;
X 13 is R or K;
X 14 is A or G;
X 15 is K or R;
X 16 is F, Y, or W;
X 17 is one that is K or R.

詳細には、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号1もしくは配列番号2を含むか、または配列番号1もしくは配列番号2からなる、アミノ酸配列を有する。   Specifically, the cell penetrating peptide according to the present invention has an amino acid sequence comprising or consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号1を含むか、または配列番号1からなる、アミノ酸配列を有する。   In another embodiment, the cell penetrating peptide according to the invention has an amino acid sequence comprising or consisting of SEQ ID NO: 1.

別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号8を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号8からなる、細胞透過性ペプチドに関する。   In another embodiment, the invention relates to a cell penetrating peptide comprising or consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 8.

別の実施形態において、前記細胞透過性ペプチドは、アミノ酸配列の配列番号9を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号9からなる。   In another embodiment, the cell penetrating peptide comprises or consists of the amino acid sequence SEQ ID NO: 9.

別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号10を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号10からなる、細胞透過性ペプチドに関する。   In another embodiment, the invention relates to a cell penetrating peptide comprising or consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 10.

本発明の細胞透過性ペプチドの一次アミノ酸配列はさらに、本発明から逸脱することなく、例えばグリコシル化またはリン酸化などによって翻訳後修飾されてもよいことは、当業者に理解されるであろう。   It will be appreciated by those skilled in the art that the primary amino acid sequence of the cell penetrating peptides of the present invention may be further post-translationally modified, such as by glycosylation or phosphorylation, without departing from the present invention.

さらなる実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、上記のような細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列に加えて、以下のうちのいずれか1つまたは任意の組み合わせを場合によりさらに含んでいてもよい:
(i)核移行シグナル(NLS)。このようなシグナルは、当業者に周知であり、Nair et al.(2003,Nucleic Acids Res.31(1):397〜399)に記載されている。
(ii)Kapoor et al.(2012,PLoS ONE 7(4):e35187)に記載され、http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?に収載されているような腫瘍ホーミングペプチドを含めた、標的ペプチド。
In further embodiments, the cell penetrating peptide according to the present invention may optionally further comprise any one or any combination of the following in addition to the amino acid sequence of the cell penetrating peptide as described above: :
(I) Nuclear localization signal (NLS). Such signals are well known to those skilled in the art and are described in Nair et al. (2003, Nucleic Acids Res. 31 (1): 397-399).
(Ii) Kapoor et al. (2012, PLoS ONE 7 (4): e35187), http: // crdd. osdd. net / raghava / tumorhope / general. php? Target peptides, including tumor homing peptides as listed in

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、カーゴ分子に連結されて、前記カーゴ分子の細胞内部移行を促進する。   In another embodiment, a cell penetrating peptide according to the present invention is linked to a cargo molecule to promote cell internalization of said cargo molecule.

したがって、本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、複合体に関する。   Accordingly, another aspect of the present invention relates to a complex comprising a cell penetrating peptide according to the present invention and a cargo molecule.

カーゴ分子は、本発明による細胞透過性ペプチドのC末端部分またはN末端部分のいずれかに連結され得る。   The cargo molecule can be linked to either the C-terminal part or the N-terminal part of the cell penetrating peptide according to the invention.

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドに連結されているか、または本発明による複合体に含まれているカーゴ分子は、(i)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、(ii)多糖、(iii)脂質、(iv)リポタンパク質、(v)糖脂質、(vi)核酸、(vii)低分子薬物または毒素、および(viii)イメージング剤またはコントラスト剤からなる群から選択され得る。   In a particular embodiment, the cargo molecule linked to a cell-penetrating peptide according to the invention or contained in a complex according to the invention comprises (i) a peptide, polypeptide or protein, (ii) a polysaccharide, ( It may be selected from the group consisting of iii) lipids, (iv) lipoproteins, (v) glycolipids, (vi) nucleic acids, (vii) small molecule drugs or toxins, and (viii) imaging agents or contrast agents.

カーゴ分子は、2つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、2つ以上の多糖、2つ以上の脂質、2つ以上のリポタンパク質、2つ以上の糖脂質、2つ以上の核酸、2つ以上の低分子薬物または毒素、2つ以上のイメージング剤または造影剤、またはそれらの組み合わせを含み得ると理解されている。   A cargo molecule is two or more peptides, polypeptides, or proteins, two or more polysaccharides, two or more lipids, two or more lipoproteins, two or more glycolipids, two or more nucleic acids, two It is understood that these can include small molecule drugs or toxins, two or more imaging agents or contrast agents, or combinations thereof.

さらなる実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドに連結されているか、または本発明による複合体に含まれているカーゴ分子は、病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープから選択される。   In a further embodiment, the cargo molecule linked to a cell penetrating peptide according to the invention or contained in a complex according to the invention is selected from pathogen epitopes and / or tumor epitopes.

一実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体に関し、前記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。   One embodiment relates to a complex comprising a cell-penetrating peptide and a cargo molecule according to the invention, wherein the cargo molecule is a peptide, polypeptide or protein.

本発明に有用なペプチド性、ポリペプチド性、またはタンパク質性カーゴ分子の例としては、エピトープ、抗体、抗体フラグメント、治療的タンパク質、転写因子、トランス活性化因子およびデコイペプチドが挙げられる。例えば、カーゴ分子は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または病原体由来抗原タンパク質の抗原決定基に相当する、CD4エピトープおよび/またはCD8エピトープを含み得る。本発明のポリペプチド中に含まれるCD4エピトープは、一般に、かつ好ましくは、約12〜25アミノ酸からなる。これらはまた、約8〜25アミノ酸または約6〜100アミノ酸からなっていてもよい。本発明のポリペプチド中に含まれるCD8エピトープは、一般に、かつ好ましくは、約8〜11アミノ酸からなる。これらはまた、約8〜15アミノ酸または約6〜100アミノ酸からなっていてもよい。 Examples of peptidic, polypeptide, or proteinaceous cargo molecules useful in the present invention include epitopes, antibodies, antibody fragments, therapeutic proteins, transcription factors, transactivators and decoy peptides. For example, the cargo molecule may comprise a CD4 + epitope and / or a CD8 + epitope corresponding to an antigenic determinant of a tumor associated antigen, a tumor specific antigen, or a pathogen-derived antigen protein. The CD4 + epitope contained in the polypeptides of the present invention generally and preferably consists of about 12-25 amino acids. They may also consist of about 8-25 amino acids or about 6-100 amino acids. The CD8 + epitope contained in the polypeptides of the present invention generally and preferably consists of about 8-11 amino acids. They may also consist of about 8-15 amino acids or about 6-100 amino acids.

具体的な実施形態において、本発明による複合体は、エピトープ、抗体、抗体フラグメント、治療的タンパク質、転写因子、トランス活性化因子およびデコイペプチドから選択されるカーゴ分子を含む。   In a specific embodiment, the complex according to the invention comprises a cargo molecule selected from epitopes, antibodies, antibody fragments, therapeutic proteins, transcription factors, transactivators and decoy peptides.

より具体的な実施形態において、本発明による複合体は、1つ以上のエピトープ(本明細書で定義されるような腫瘍エピトープおよび/または病原体エピトープであってよい)を含むカーゴ分子を含む。   In a more specific embodiment, the complex according to the invention comprises a cargo molecule comprising one or more epitopes, which may be tumor epitopes and / or pathogen epitopes as defined herein.

具体的な実施形態において、本発明による複合体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、および/または病原体由来抗原タンパク質(ウイルス性、細菌性、真菌性、原生動物性および多細胞寄生虫性抗原タンパク質など)に由来するエピトープを含むカーゴ分子を含む。   In a specific embodiment, the complex according to the invention comprises tumor-associated antigens, tumor-specific antigens, and / or pathogen-derived antigenic proteins (viral, bacterial, fungal, protozoal and multicellular parasitic antigens Including cargo molecules containing epitopes derived from proteins, etc.).

本発明の特定の例において、前記エピトープは、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIと関連して、細胞表面に提示される。   In particular examples of the invention, the epitope is presented on the cell surface in association with MHC class I and / or MHC class II.

ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、Novellino et al.(2005,Cancer Immunol Immunother,54(3):187〜207)、Vigneron et al.(2013,Cancer Immun.13:15)に記載されるような複数のグリオーマエピトープの組み合わせが挙げられる。   Examples of cargo molecules that fall within the category of peptides, polypeptides or proteins include Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54 (3): 187-207), Vigneron et al. (2013, Cancer Immun. 13:15) and a combination of a plurality of glioma epitopes.

本発明の別の態様において、前記グリオーマエピトープはすべて、同一の細胞透過性ペプチドに連結されて単一の本発明による複合体を形成するようなことはなく、個々に、または少なくとも2つのエピトープの群によってのいずれかで、別個の本発明による細胞透過性ペプチドに連結されて、少なくとも2つの別個の本発明による複合体を形成する。   In another embodiment of the invention, all said glioma epitopes are not linked to the same cell penetrating peptide to form a single complex according to the invention, but individually or of at least two epitopes. Either by group, linked to separate cell penetrating peptides according to the invention to form at least two separate inventive complexes.

有利な実施形態において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチドおよびエピトープを含み、MHCクラスIおよびMHCクラスIIと関連して、抗原提示細胞の細胞表面に前記エピトープを輸送および提示することができるため、ワクチン接種および免疫療法に有用である。   In an advantageous embodiment, the complex according to the invention comprises a cell penetrating peptide and an epitope, and in association with MHC class I and MHC class II, transports and presents said epitope on the cell surface of antigen presenting cells. It can be useful for vaccination and immunotherapy.

特定の態様において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチドとカーゴ分子を連結している、および/または、ペプチド性、ポリペプチド性もしくはタンパク質性カーゴ分子に含まれる連続的エピトープを連結している、および/または、連続的カーゴ分子を連結している、および/または、カーゴ分子のC末端部分に配置される、非免疫性の切断可能部分であるスペーサーもしくはリンカーを含む。   In a particular embodiment, the complex according to the invention links cell penetrating peptides and cargo molecules and / or links consecutive epitopes comprised in peptidic, polypeptide or proteinaceous cargo molecules. And / or a non-immune cleavable moiety spacer or linker that is linked to and / or located in the C-terminal portion of the cargo molecule.

前記スペーサーは、ペプチド性でも非ペプチド性でもよく、本発明による複合体の2つの成分間の連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。   The spacer may be peptidic or non-peptidic and the linkage between the two components of the complex according to the invention may be covalent or non-covalent.

ペプチド性スペーサーは、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸からなっていてもよい。ペプチド性スペーサーのアミノ酸配列は、カーゴ分子のN末端もしくはC末端隣接領域のアミノ酸配列、または前記カーゴ分子のエピトープのアミノ酸配列と同一であってもよい。あるいは、ペプチド性スペーサーは、前記天然隣接領域の保存的アミノ酸置換によって生じるアミノ酸配列のような非天然アミノ酸配列からなっていてもよく、または公知のプロテアーゼ切断部位の配列、例えばエンテロキナーゼ標的部位(アミノ酸配列DDDK、配列番号15)、第Xa因子標的部位(アミノ酸配列IEDGR、配列番号16)、トロンビン標的部位(アミノ酸配列LVPRGS、配列番号17)、TEVプロテアーゼ標的部位(アミノ酸配列ENLYFQG、配列番号18)、PreScissionプロテアーゼ標的部位(アミノ酸配列LEVLFQGP、配列番号19)、ポリカチオン性アミノ酸(例えば、ポリK)、フューリン標的部位(アミノ酸配列RX(R/K)R、配列番号20)からなっていてもよい。特定の実施形態において、ペプチド性スペーサーは、Cys(C)残基を全く含まない。   The peptidic spacer may comprise, for example, about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids. The amino acid sequence of the peptidic spacer may be the same as the amino acid sequence of the N-terminal or C-terminal flanking region of the cargo molecule or the epitope of the cargo molecule. Alternatively, the peptidic spacer may consist of a non-natural amino acid sequence, such as an amino acid sequence generated by a conservative amino acid substitution of the natural flanking region, or a known protease cleavage site sequence, such as an enterokinase target site (amino acid Sequence DDDK, SEQ ID NO: 15), factor Xa target site (amino acid sequence IEDGR, SEQ ID NO: 16), thrombin target site (amino acid sequence LVPRGS, SEQ ID NO: 17), TEV protease target site (amino acid sequence ENLYFQG, SEQ ID NO: 18), It may consist of a PreScission protease target site (amino acid sequence LEVLFQGP, SEQ ID NO: 19), a polycationic amino acid (eg, poly K), and a furin target site (amino acid sequence RX (R / K) R, SEQ ID NO: 20). In certain embodiments, the peptidic spacer does not contain any Cys (C) residues.

非ペプチド性スペーサーは、エステル、チオエステルまたはジスルフィドを含み得る。   Non-peptidic spacers can include esters, thioesters or disulfides.

特定の態様において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチド配列と、ペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴとの間に配置される、スペーサーまたはリンカー、特にペプチド性スペーサーを含む。このペプチド性スペーサーは、一旦、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体が内部移行されると、細胞内機構によって切断され得る(従って、細胞透過性ペプチドを含まないカーゴを、細胞内、細胞小器官内、または細胞表面に遊離する)ように、当業者によって選択され得る。   In a particular embodiment, the complex according to the invention comprises a spacer or linker, in particular a peptidic spacer, arranged between the cell-permeable peptide sequence and the peptidic, polypeptide or proteinaceous cargo. This peptidic spacer can be cleaved by intracellular mechanisms once the complex containing the cell permeable peptide and the cargo molecule is internalized (thus, the cargo without the cell permeable peptide can be cleaved into the cell Can be selected by one skilled in the art to be released into the organelle or to the cell surface.

より詳細な態様において、細胞透過性ペプチドを、ペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子と、またはペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子に由来する隣接エピトープと連結している前記スペーサーは、前記カーゴ分子または隣接エピトープに隣接する領域の約1、2、3、4、もしくは5アミノ酸に相当する、約1、2、3、4、もしくは5アミノ酸からなっていてもよい。   In a more detailed embodiment, the cell penetrating peptide is linked to a peptide, polypeptide or proteinaceous cargo molecule or to an adjacent epitope derived from a peptide, polypeptide or proteinaceous cargo molecule. The spacer may consist of about 1, 2, 3, 4, or 5 amino acids corresponding to about 1, 2, 3, 4, or 5 amino acids of the region adjacent to the cargo molecule or adjacent epitope.

カーゴ分子が数個のエピトープを含む場合、本発明の複合体中に含まれる各エピトープは、互いに直接連結され得るか、または、少数のアミノ酸からなるペプチド性スペーサーのようなスペーサーもしくはリンカーを介して連結され得るということが、当業者には明らかであろう。あるいは、カーゴ分子が数個のエピトープを含む場合、本発明の複合体中に含まれるいくつかのエピトープは、互いに直接連結され、かつ、他のいくつかのエピトープは、少数のアミノ酸からなるペプチド性スペーサーのようなスペーサーもしくはリンカーを介して連結されるということも可能である。   If the cargo molecule contains several epitopes, each epitope contained in the complex of the invention can be linked directly to each other or via a spacer or linker such as a peptidic spacer consisting of a few amino acids. It will be apparent to those skilled in the art that they can be linked. Alternatively, if the cargo molecule contains several epitopes, some epitopes contained in the complex of the invention are directly linked to each other and some other epitopes are peptidic consisting of a few amino acids. It is also possible to connect via a spacer such as a spacer or a linker.

本発明の具体的な態様において、本発明のペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子中に含まれる、2個の連続したエピトープは、前記エピトープの天然隣接領域からなるスペーサーによって、互いに連結される。一実施形態によれば、第1エピトープと第2エピトープの連結に用いられるスペーサーは、第1エピトープのN末端もしくはC末端隣接領域の約4個を超えるアミノ酸とそれに続く第2エピトープのN末端もしくはC末端隣接領域の約4個を超えるアミノ酸に相当する、約8個を超えるアミノ酸からなる。本発明の例において、第1エピトープ(「エピトープ1」)と第2エピトープ(「エピトープ2」)の連結に用いられるスペーサーは、エピトープ1の0個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の8個の隣接アミノ酸から、エピトープ1の8個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の0個の隣接アミノ酸までに及ぶ、任意の可能な組み合わせ(すなわち、エピトープ1の1個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の7個の隣接アミノ酸、エピトープ1の2個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の6個の隣接アミノ酸、エピトープ1の3個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の5個の隣接アミノ酸、エピトープ1の4個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の4個の隣接アミノ酸、エピトープ1の5個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の3個の隣接アミノ酸、エピトープ1の6個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の2個の隣接アミノ酸、エピトープ1の7個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の1個の隣接アミノ酸、エピトープ1の8個の隣接アミノ酸およびエピトープ2の0個の隣接アミノ酸など)に相当する、約8個のアミノ酸からなる。2個の連続エピトープを連結するスペーサーを構成する合計8個のアミノ酸は、絶対値ではなく、またそのスペーサーは、合計、例えば3個のアミノ酸、4個のアミノ酸、5個のアミノ酸、6個のアミノ酸、7個のアミノ酸、9個のアミノ酸または10個のアミノ酸から構成されてもよいことが理解されるであろう。同様に、スペーサーが8個より少ないかまたは多いアミノ酸を有する場合において、上記と同等の組み合わせも、この状況における本発明の例である。   In a specific embodiment of the present invention, two consecutive epitopes contained in the peptide, polypeptide or proteinaceous cargo molecule of the present invention are linked to each other by a spacer consisting of the natural adjacent region of the epitope. Is done. According to one embodiment, the spacer used to link the first and second epitopes is more than about 4 amino acids of the N-terminal or C-terminal flanking region of the first epitope followed by the N-terminal of the second epitope or It consists of more than about 8 amino acids, corresponding to more than about 4 amino acids in the C-terminal flanking region. In the example of the present invention, the spacer used for linking the first epitope (“Epitope 1”) and the second epitope (“Epitope 2”) is 0 adjacent amino acids of Epitope 1 and 8 adjacent amino acids of Epitope 2 Any possible combination (ie, 1 adjacent amino acid of Epitope 1 and 7 adjacent amino acids of Epitope 2, Epitope 2 to 0 adjacent amino acids of Epitope 1 and 0 adjacent amino acids of Epitope 2) 2 adjacent amino acids of 1 and 6 adjacent amino acids of Epitope 2, 3 adjacent amino acids of Epitope 1 and 5 adjacent amino acids of Epitope 2, 4 adjacent amino acids of Epitope 1 and 4 of Epitope 2 Adjacent amino acids, 5 adjacent amino acids of epitope 1 and 3 adjacent amino acids of epitope 2 No acid, 6 adjacent amino acids of Epitope 1 and 2 adjacent amino acids of Epitope 2, 7 adjacent amino acids of Epitope 1 and 1 adjacent amino acid of Epitope 2, 8 adjacent amino acids of Epitope 1 and Epitope 2 About 8 amino acids corresponding to 0 adjacent amino acids). The total of 8 amino acids that make up the spacer linking two consecutive epitopes is not an absolute value, and the spacer is a total, eg 3 amino acids, 4 amino acids, 5 amino acids, 6 amino acids It will be understood that it may be composed of amino acids, 7 amino acids, 9 amino acids or 10 amino acids. Similarly, combinations equivalent to the above where the spacer has fewer or more amino acids than 8 are examples of the invention in this context.

本発明の別の特定の例において、第1エピトープ(「エピトープ1」)と第2エピトープ(「エピトープ2」)の連結に用いられるスペーサーは、約4個のアミノ酸、例えば、1、2、3、4、または5個のアミノ酸からなる。より詳細には、前記スペーサーのアミノ酸配列は、エピトープ1またはエピトープ2のN末端もしくはC末端隣接領域の4個のアミノ酸に相当し得る。   In another specific example of the invention, the spacer used to link the first epitope (“Epitope 1”) and the second epitope (“Epitope 2”) is about 4 amino acids, eg, 1, 2, 3 Consists of 4, or 5 amino acids. More particularly, the amino acid sequence of the spacer may correspond to 4 amino acids in the N-terminal or C-terminal flanking region of epitope 1 or epitope 2.

上記のようなスペーサーはまた、カーゴ分子中に含まれる最後のエピトープのC末端部分に配置されてもよい。   A spacer as described above may also be placed at the C-terminal portion of the last epitope contained in the cargo molecule.

ペプチド性スペーサーの例としては、例えばアミノ酸配列EQLE(配列番号11)またはTEWT(配列番号12)、あるいはその任意の保存的置換体が挙げられる。   Examples of peptidic spacers include, for example, the amino acid sequence EQLE (SEQ ID NO: 11) or TEWT (SEQ ID NO: 12), or any conservative substitutions thereof.

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体に関し、前記カーゴ分子は、多糖、脂質、リポタンパク質、および/または糖脂質、詳細には、多糖性、脂質性、リポタンパク質性、および/または糖脂質性エピトープであり、本明細書で定義されるような病原体エピトープであってもよい。   Another embodiment relates to a complex comprising a cell penetrating peptide according to the invention and a cargo molecule, wherein the cargo molecule is a polysaccharide, lipid, lipoprotein, and / or glycolipid, in particular a polysaccharide, lipidic, Lipoproteinaceous and / or glycolipidic epitopes and may be pathogen epitopes as defined herein.

特定の例において、本発明による複合体は、病原体由来の抗原(ウイルス性、細菌性、真菌性、原生動物性および多細胞寄生虫性抗原など)に由来する、多糖性、脂質性、リポタンパク質性、および/または糖脂質性エピトープを含むカーゴ分子を含む。   In particular examples, the complex according to the invention is a polysaccharide, lipidic, lipoprotein derived from a pathogen-derived antigen (such as viral, bacterial, fungal, protozoan and multicellular parasitic antigens) Including cargo molecules containing sex and / or glycolipid epitopes.

本発明の特定の例において、前記エピトープは、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIとの関連で、細胞表面に提示される。   In particular examples of the invention, the epitope is presented on the cell surface in the context of MHC class I and / or MHC class II.

本発明の別の例において、前記脂質性エピトープは、CD1(分化抗原群1)との関連で、細胞表面に提示される。   In another example of the invention, the lipidic epitope is presented on the cell surface in the context of CD1 (differentiation antigen group 1).

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、低分子薬物または毒素である。   Another embodiment provides a complex comprising a cell penetrating peptide according to the invention and a cargo molecule, wherein the cargo molecule is a small molecule drug or toxin.

本発明に有用な分子薬物または毒素のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、シクロスポリンA、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、5−アミノレブリン酸、ジフテリア毒素、スニチニブ、およびDe wit Amer(2010,Neuro Oncol,12(3):304〜16)に概説されるような分子が挙げられる。   Examples of cargo molecules that fall within the category of molecular drugs or toxins useful in the present invention include cyclosporin A, paclitaxel, doxorubicin, methotrexate, 5-aminolevulinic acid, diphtheria toxin, sunitinib, and De wit Amer (2010, Neuro Oncol, 12 (3): 304-16).

さらに別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、イメージング剤またはコントラスト剤である。   Yet another embodiment provides a complex comprising a cell penetrating peptide according to the invention and a cargo molecule, wherein the cargo molecule is an imaging agent or a contrast agent.

本発明に有用なイメージング剤またはコントラスト剤のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、フルオロフォア、量子ドット(QD)、ガドリニウム(Gd3+)低分子量キレートなどの金属キレートおよび超常磁性酸化鉄(SPIO)、放射性トレーサーが挙げられる。 Examples of cargo molecules that fall within the category of imaging or contrast agents useful in the present invention include metal chelates such as fluorophores, quantum dots (QD), gadolinium (Gd 3+ ) low molecular weight chelates and superparamagnetic iron oxides (SPIO). ) And radioactive tracers.

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は核酸である。   Another embodiment provides a complex comprising a cell penetrating peptide according to the invention and a cargo molecule, wherein the cargo molecule is a nucleic acid.

本発明に有用な核酸カーゴ分子の例としては、DNA、RNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイDNA、プラスミド、マイクロRNAが挙げられる。   Examples of nucleic acid cargo molecules useful in the present invention include DNA, RNA, siRNA, shRNA, antisense oligonucleotides, decoy DNA, plasmids, and microRNAs.

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする(詳細には、エピトープを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする)核酸である。   Another embodiment provides a complex comprising a cell penetrating peptide according to the invention and a cargo molecule, said cargo molecule encoding a peptide, polypeptide or protein (in particular a peptide, poly A nucleic acid encoding a peptide or protein.

核酸のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、本発明によるペプチド性、ポリペプチド性またはタンパク質性カーゴ分子をコードする核酸が挙げられる。詳細な例は、本発明によるペプチド性、ポリペプチド性またはタンパク質性カーゴ分子中に含まれるエピトープをコードする核酸である。別の例は、Reardon et al(2013,Expert Rev Vaccines,12(6):597〜615)に記載されるような複数のグリオーマエピトープの組み合わせをコードする核酸である。   Examples of cargo molecules that fall within the category of nucleic acids include nucleic acids encoding peptidic, polypeptide or proteinaceous cargo molecules according to the present invention. A detailed example is a nucleic acid encoding an epitope contained in a peptidic, polypeptide or proteinaceous cargo molecule according to the present invention. Another example is a nucleic acid that encodes a combination of multiple glioma epitopes as described in Reardon et al (2013, Expert Rev Vaccines, 12 (6): 597-615).

別の有利な実施形態において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチド、およびエピトープをコードする核酸を含み、これにより、細胞内での前記核酸の輸送が可能になる。形質導入された核酸は次に、細胞内で前記エピトープを生成するために転写および翻訳され得、これらのエピトープは次いで、MHCクラスIおよびMHCクラスIIとの関連で、抗原提示細胞の細胞表面に提示される。したがって、そのような複合体は、ワクチン接種および免疫療法に有用である。   In another advantageous embodiment, the complex according to the invention comprises a cell penetrating peptide and a nucleic acid encoding the epitope, which allows the transport of said nucleic acid within the cell. The transduced nucleic acid can then be transcribed and translated to produce said epitope within the cell, which epitopes are then associated with MHC class I and MHC class II on the cell surface of antigen presenting cells. Presented. Such conjugates are therefore useful for vaccination and immunotherapy.

本発明の一実施形態において、カーゴ分子は、本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーによるなどで、本発明による細胞透過性ペプチドと共有的または非共有的に結合され得る。   In one embodiment of the invention, the cargo molecule may be covalently or non-covalently linked to the cell penetrating peptide according to the invention, such as by a peptidic spacer as described herein.

本発明による細胞透過性ペプチドとカーゴ分子を連結する技術は、文献に十分詳細に記載され、カーゴ分子の性質によって左右され得る。例えば、カーゴ分子と細胞透過性ペプチドとの間の結合は、全段階的固相合成または液相もしくは固相フラグメントカップリングによる切断可能ジスルフィド結合、安定なアミド、チアゾリジン、オキシムおよびヒドラジン結合、ジスルフィド結合、安定なチオマレイミド結合、ペプチド結合(融合タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を含む)、または静電気的もしくは疎水性相互作用によって達成され得る。   Techniques for linking cell penetrating peptides and cargo molecules according to the present invention are described in sufficient detail in the literature and may depend on the nature of the cargo molecule. For example, the linkage between the cargo molecule and the cell penetrating peptide can be cleavable disulfide bonds, stable amide, thiazolidine, oxime and hydrazine bonds, disulfide bonds by full-step solid phase synthesis or liquid phase or solid phase fragment coupling Stable thiomaleimide bonds, peptide bonds (including peptide bonds between amino acids of the fusion protein), or electrostatic or hydrophobic interactions.

本発明によるペプチドおよびタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または本発明によるペプチド性、ポリペプチド性、またはタンパク質性カーゴ分子を含んでなる複合体をコードする、ポリヌクレオチドに関する。
Polynucleotides Encoding Peptide and Protein Complexes According to the Invention Another aspect of the invention is to encode a cell penetrating peptide according to the invention or a peptide, polypeptide or proteinaceous cargo molecule according to the invention. It relates to a polynucleotide encoding a complex comprising.

一つの実施形態において、本発明は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または、場合により本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーを用いて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる複合体をコードする、核酸に関する。   In one embodiment, the present invention encodes a cell penetrating peptide according to the present invention or optionally a peptide, spacer or peptide cargo molecule using a peptidic spacer as described herein. Relates to a nucleic acid encoding a complex comprising said cell-permeable peptide covalently bound to

さらなる実施形態において、本発明は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または、場合により本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーを用いて、少なくとも1つのエピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる複合体をコードする、核酸に関する。   In a further embodiment, the present invention relates to a peptide, poly, encoding a cell penetrating peptide according to the present invention, or optionally comprising at least one epitope, using a peptidic spacer as described herein. It relates to a nucleic acid encoding a complex comprising said cell permeable peptide covalently bound to a peptide or protein cargo molecule.

またさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも1つのエピトープを含んでなる、本発明によるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子をコードする、核酸に関する。   In yet a further embodiment, the invention relates to a nucleic acid encoding a peptide, polypeptide or protein cargo molecule according to the invention comprising at least one epitope.

本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体の生成ならびに精製
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターが提供される。
Production and purification of cell penetrating peptides and complexes according to the invention According to another aspect of the present invention there is provided a recombinant vector comprising a polynucleotide according to the present invention.

これらに限定されるものではないが、染色体、エピソーム、および派生ウイルスなどの多数の発現系が使用され得る。より詳細には、使用される組換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスに由来するものであってもよい。   A number of expression systems such as, but not limited to, chromosomes, episomes, and derived viruses can be used. More particularly, the recombinant vectors used are bacterial plasmids, transposons, yeast episomes, insertion factors, yeast chromosomal elements, viruses such as baculovirus, papillomavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, foxpox virus, It may be derived from pseudorabies virus or retrovirus.

これらの組換えベクターは同様に、コスミドまたはファージミド派生体であってもよい。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法、例えばMOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Sambrook et al.,4th Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001に記載の方法によって、組換え発現ベクターに挿入され得る。   These recombinant vectors may also be cosmid or phagemid derivatives. Nucleotide sequences can be obtained by methods well known to those skilled in the art, for example, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al. , 4th Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N .; Y. , 2001, can be inserted into a recombinant expression vector.

組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチドの発現および転写ならびに本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含んでもよく、これらの配列は、使用される宿主細胞に従い選択される。   The recombinant vector may include nucleotide sequences that control the regulation of polynucleotide expression, as well as nucleotide sequences that allow for expression and transcription of the polynucleotides of the invention and translation of the polypeptides of the invention, these sequences comprising: Selected according to the host cell used.

したがって、例えば、適切な分泌シグナルが組換えベクターに組み込まれてもよく、その結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、小胞体の内腔へ、細胞膜周辺腔へ、膜上に、または細胞外環境へと導かれる。適切な分泌シグナルの選択により、その後のタンパク質精製が促進され得る。   Thus, for example, an appropriate secretion signal may be incorporated into the recombinant vector so that the polypeptide encoded by the polynucleotide of the invention can enter the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, onto the membrane. Or led to the extracellular environment. Subsequent protein purification can be facilitated by selection of appropriate secretion signals.

さらなる実施形態において、本発明による組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。   In a further embodiment, a host cell comprising a recombinant vector according to the present invention is provided.

宿主細胞への組換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Davis et al.,2nd ed.,McGraw−Hill Professional Publishing,1995、およびMOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(前出)に記載の方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染によって行われ得る。   Introduction of the recombinant vector into the host cell is performed by methods well known to those skilled in the art, for example, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al. , 2nd ed. , McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, and MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (supra), eg, transfection with calcium phosphate, transfection with DEAE dextran, transfection, microinjection, transfection with cationic lipids, It can be done by electroporation, transduction or infection.

宿主細胞は、例えば、E.coliのような細菌細胞、酵母細胞およびAspergillus、Streptomycesの細胞のような真菌の細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、C127マウス細胞株、シリアンハムスター細胞のBHK細胞株、ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞であってもよい。   Host cells include, for example, E. coli. Bacterial cells such as E. coli, fungal cells such as yeast cells and Aspergillus and Streptomyces cells, insect cells, Chinese hamster ovary cells (CHO), C127 mouse cell line, Brian cell line of Syrian hamster cells, kidney derived from human fetus It may be a 293 (HEK293) cell.

宿主細胞を用いて、例えば、本発明のポリペプチドを発現し得る。標準方法による精製の後、本発明のポリペプチドは、後述の方法に使用され得る。   Host cells can be used, for example, to express a polypeptide of the invention. After purification by standard methods, the polypeptides of the invention can be used in the methods described below.

本発明のさらなる実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチド、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる本発明による複合体を調製する方法を提供し、その方法は、培地中で上記のような宿主細胞を培養すること、および培地から前記細胞透過性ペプチドもしくは複合体を分離すること、または宿主細胞溶解後に宿主細胞溶解物から前記細胞透過性ペプチドもしくは複合体を分離することを含んでなる。   A further embodiment of the invention provides a method for preparing a cell-penetrating peptide according to the invention, or a complex according to the invention comprising said cell-penetrating peptide covalently linked to a peptide, polypeptide or protein cargo molecule. And the method comprises culturing host cells as described above in a medium and separating the cell permeable peptide or complex from the medium, or the cell permeation from the host cell lysate after host cell lysis. Separating the sex peptide or complex.

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体は、合成化学的方法、例えば固相ペプチド合成によって調製され得る。これらのペプチドの精製は、タンパク質/ペプチド精製の技術分野で公知の任意の技術を用いて行われ得る。例示的な技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティー法が挙げられる。   In another embodiment, cell penetrating peptides and complexes according to the invention can be prepared by synthetic chemistry methods such as solid phase peptide synthesis. Purification of these peptides can be performed using any technique known in the protein / peptide purification art. Exemplary techniques include ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and immunoaffinity methods.

本発明のさらなる実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドを調製する方法を提供し、その方法は、前記ペプチドを化学的に合成および精製することを含んでなる。   A further embodiment of the present invention provides a method for preparing a cell penetrating peptide according to the present invention, which method comprises chemically synthesizing and purifying said peptide.

本発明の別の実施形態は、本明細書で定義されるような、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子に共有結合している細胞透過性ペプチドを含む、本発明による複合体を調製する方法を提供し、その方法は、前記細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列および前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを、化学的に合成および精製することを含んでなる。   Another embodiment of the present invention provides a method for preparing a complex according to the present invention comprising a cell penetrating peptide covalently linked to a peptide, polypeptide or protein cargo molecule as defined herein. And the method comprises chemically synthesizing and purifying a polypeptide having an amino acid sequence comprising the amino acid sequence of the cell-permeable peptide and the amino acid sequence of the peptide, polypeptide or protein cargo molecule. .

別の実施形態において、本発明による方法は、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を別々に合成すること、ならびにその精製されたペプチドおよびカーゴ分子を混合するかまたは前記ペプチドおよびカーゴ分子を共有結合させることを含んでなる。   In another embodiment, the method according to the invention synthesizes the cell permeable peptide and the cargo molecule separately and mixes the purified peptide and cargo molecule or covalently binds the peptide and cargo molecule. Comprising.

本発明による複合体をロードした細胞
本発明の別の態様は、本発明による複合体をロードした細胞に関する。特定の実施形態において、その細胞は、治療されるべき患者に由来する。
Cells loaded with complexes according to the invention Another aspect of the invention relates to cells loaded with complexes according to the invention. In certain embodiments, the cells are derived from the patient to be treated.

さらなる実施形態において、その細胞は、抗原提示細胞のような免疫系の細胞であるか、または神経幹細胞のような幹細胞である。   In further embodiments, the cell is a cell of the immune system such as an antigen presenting cell or a stem cell such as a neural stem cell.

一つの実施形態において、本発明による複合体をロードした抗原提示細胞が提供される。   In one embodiment, antigen presenting cells loaded with a complex according to the invention are provided.

具体的な実施形態において、その抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびB細胞から選択される。樹状細胞、特に、治療されるべき患者に由来する樹状細胞(従来型および形質細胞様)が好ましい。   In a specific embodiment, the antigen presenting cell is selected from dendritic cells, macrophages and B cells. Dendritic cells, particularly those derived from the patient to be treated (conventional and plasmacytoid) are preferred.

抗原提示細胞、特に樹状細胞を患者から採取する方法は、当業者に公知である。それらの方法は、骨髄、臍帯血、または末梢血から、単球もしくは造血幹細胞を収集することを含む。それらの方法はまた、胚性幹(ES)細胞および誘導多能性幹細胞(iPS)の使用も含む。抗原提示細胞、特に樹状細胞またはその前駆体は、水簸および磁性ビーズベースの分離を含む方法によって濃縮され得、これはCD14前駆細胞の濃縮を含み得る。 Methods for collecting antigen-presenting cells, particularly dendritic cells, from patients are known to those skilled in the art. These methods include collecting monocytes or hematopoietic stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood. Those methods also include the use of embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem cells (iPS). Antigen presenting cells, particularly dendritic cells or their precursors, can be enriched by methods including chickenpox and magnetic bead-based separation, which can include enrichment of CD14 + progenitor cells.

本発明の複合体を細胞内に、特に上記の抗原提示細胞内にロードし、そのような細胞を患者に投与する前にさらに調製する方法は、当業者に公知である。樹状細胞の調製には、GM−CSFおよびIL−4などのサイトカインを用いた樹状細胞の培養または分化が含まれ得る。樹状細胞株を使用してもよい。細胞内への、特に樹状細胞内への本発明の複合体のロードには、本発明の細胞透過性ペプチドの固有特性(すなわち、その内部移行能力)を利用した、本発明の複合体と培養細胞とのコインキュベーションが含まれ得る。このようにロードされた樹状細胞の効率的な成熟を誘導するためのさらなる培養には、サイトカイン、例えばIL−1β、IL−6、TNFα、PGE2、IFNα、ならびにアジュバント、例えばポリIC、ポリICLC(すなわち、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、およびポリ−L−リジン二本鎖RNAの合成複合体)、および他のTLR(Toll様受容体)およびNLR(ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体)アゴニストの添加が含まれ得る。   Methods of loading the complexes of the invention into cells, particularly into the antigen-presenting cells described above, and further preparing such cells prior to administration to a patient are known to those skilled in the art. Dendritic cell preparation may include culturing or differentiation of dendritic cells using cytokines such as GM-CSF and IL-4. Dendritic cell lines may be used. For loading of the complex of the present invention into cells, particularly into dendritic cells, the complex of the present invention utilizing the inherent property of the cell-penetrating peptide of the present invention (that is, its internalization ability) Co-incubation with cultured cells can be included. Further cultures to induce efficient maturation of dendritic cells loaded in this way include cytokines such as IL-1β, IL-6, TNFα, PGE2, IFNα, and adjuvants such as Poly IC, Poly ICLC (Ie, synthetic complexes of carboxymethylcellulose, polyinosinic acid-polycytidylic acid, and poly-L-lysine double stranded RNA), and other TLRs (Toll-like receptors) and NLRs (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors) Addition of an agonist may be included.

さらなる態様は、カーゴ分子がイメージング剤である本発明による複合体をロードした、細胞療法に用いられる細胞、例えば幹細胞、樹状細胞、T細胞またはナチュラルキラー細胞をイメージングすることに関する。   A further aspect relates to imaging cells used for cell therapy, such as stem cells, dendritic cells, T cells or natural killer cells, loaded with a complex according to the invention in which the cargo molecule is an imaging agent.

上記のように本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞を調製する方法を提供することも、本発明の目的であり、この方法は、前記細胞を本発明の複合体で形質導入すること、前記細胞を培地中で培養すること、および前記細胞を培地から分離することを含んでなる。   It is also an object of the present invention to provide a method for preparing a cell loaded with a complex according to the present invention as described above, in particular an antigen presenting cell, the method transducing said cell with the complex of the present invention. Culturing the cells in a medium and separating the cells from the medium.

特定の実施形態において、その細胞は、カーゴ分子を含む複合体がロードされ、前記カーゴ分子は、(i)ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または(ii)核酸から選択される。   In certain embodiments, the cell is loaded with a complex comprising a cargo molecule, wherein the cargo molecule is selected from (i) a peptide, polypeptide or protein, or (ii) a nucleic acid.

本発明の別の実施形態において、本発明によるエピトープを含む複合体をロードした細胞は、MHCクラスIおよびMHCクラスIIとの関連で、細胞表面に前記エピトープを提示する。   In another embodiment of the invention, a cell loaded with a complex comprising an epitope according to the invention presents said epitope on the cell surface in the context of MHC class I and MHC class II.

本発明による組成物およびキット
本発明は、以下から選択される少なくとも1つの成分を含む組成物を提供する:
(i)本発明の細胞透過性ペプチド、
(ii)本発明の複合体、
(iii)本発明の核酸、
(iv)本発明のベクター、
(v)本発明の宿主細胞、および
(vi)本発明による複合体をロードした細胞。
Compositions and kits according to the present invention The present invention provides compositions comprising at least one component selected from:
(I) the cell-penetrating peptide of the present invention,
(Ii) the complex of the present invention,
(Iii) the nucleic acid of the present invention,
(Iv) the vector of the present invention,
(V) a host cell of the invention, and (vi) a cell loaded with a complex according to the invention.

特定の実施形態において、本発明の組成物は、2つ以上の(i)〜(vi)の成分を含む。   In certain embodiments, the composition of the present invention comprises two or more components (i) to (vi).

本発明の例において、その組成物は、少なくとも2つの異なる(i)のペプチド、少なくとも2つの異なる(ii)の複合体、少なくとも2つの異なる(iii)の核酸、少なくとも2つの異なる(iv)のベクター、少なくとも2つの異なる(v)の宿主細胞、および/または少なくとも2つの異なる(vi)の細胞を含んでなる。   In an example of the invention, the composition comprises at least two different (i) peptides, at least two different (ii) complexes, at least two different (iii) nucleic acids, at least two different (iv) The vector comprises at least two different (v) host cells and / or at least two different (vi) cells.

別の例において、本発明の組成物は、本発明による少なくとも2つの異なる複合体および/または少なくとも2つの異なる核酸を含んでなる。   In another example, the composition of the invention comprises at least two different complexes and / or at least two different nucleic acids according to the invention.

詳細には、本発明による組成物は、2つ以上の本発明による複合体、例えば、各複合体が1つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含み得る。   In particular, the composition according to the invention comprises at least two or more complexes according to the invention, for example each complex comprising one or more cargo molecules and the cargo molecules differ between the complexes. Two complexes may be included.

一つの例において、本発明の組成物は、各複合体が1つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含んでなる。   In one example, the composition of the invention comprises at least two complexes, each complex comprising one or more epitopes, and said epitopes differ between complexes.

別の例において、本発明の組成物は、各複合体が1つ以上のエピトープをコードする1つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含んでなる。   In another example, the composition of the invention comprises at least two complexes, each complex comprising one or more nucleic acids encoding one or more epitopes, and wherein the nucleic acids differ between the complexes. Comprising.

本発明は、医薬、特にワクチンとして使用するための、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞もまた提供する。   The present invention also provides a complex as described herein or a cell loaded with said complex for use as a medicament, in particular a vaccine.

特定の実施形態において、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するために、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞を提供する。   In certain embodiments, the invention provides a conjugate as described herein or said conjugate for use in the treatment of a disease or disorder comprising cancer, infection, autoimmune disease and graft rejection. Provide loaded cells.

別の実施形態において、本発明は、イメージング組成物または診断組成物として使用するために、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞を提供する。   In another embodiment, the invention provides a complex as described herein or a cell loaded with the complex for use as an imaging or diagnostic composition.

本発明はまた、本明細書に記載されるような、本発明による複合体または前記複合体をロードした細胞を含む、イメージング組成物または診断組成物も提供する。   The present invention also provides an imaging or diagnostic composition comprising a complex according to the present invention or a cell loaded with said complex, as described herein.

本発明は、医薬組成物、特にワクチン組成物、ならびに被験体を、好ましくは哺乳類被験体を、そして最も好ましくは、内科的障害、特に免疫療法によって治療され得る障害、例えば癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などに罹患しやすいか、または罹患しているヒト患者を治療する方法を提供する。   The present invention relates to pharmaceutical compositions, particularly vaccine compositions, as well as subjects, preferably mammalian subjects, and most preferably disorders that can be treated by medical disorders, especially immunotherapy, such as cancer, infectious diseases, self Methods are provided to treat human patients susceptible to or suffering from immune diseases and transplant rejection.

本発明による医薬組成物、特にワクチン組成物、または製剤は、本明細書に記載される任意の形態で本発明による細胞透過性ペプチドもしくは複合体を含み得る、医薬製剤として投与され得る。   A pharmaceutical composition, particularly a vaccine composition, or formulation according to the present invention may be administered as a pharmaceutical formulation, which may comprise a cell penetrating peptide or complex according to the present invention in any form described herein.

本発明による医薬組成物、特にワクチン組成物、または製剤はまた、本明細書に記載される任意の形態で本発明による複合体をロードした抗原提示細胞を含み得る、医薬製剤として投与されてもよい。   A pharmaceutical composition, particularly a vaccine composition, or formulation according to the present invention may also be administered as a pharmaceutical formulation, which may comprise antigen-presenting cells loaded with a complex according to the present invention in any form described herein. Good.

本発明による組成物は、通常使用されるアジュバント、免疫調節物質、キャリア、希釈剤または賦形剤と共に、医薬組成物およびその単位用量の形態中に収められ得、そしてそのような形態で、固体、例えば錠剤もしくは充填カプセル剤、または液体、例えば溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル剤、もしくはそれらを充填したカプセル剤(すべて経口用)として使用され得るか、あるいは、注射もしくは持続点滴によって非経口(皮下および皮内を含む)用の滅菌注射用溶液の形態で使用され得る。注射用組成物は、典型的には、注射用滅菌生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水または当該分野で公知の他の注射用キャリアを基剤とする。このような医薬組成物およびその単位用量形態は、追加の活性化合物または成分の有無にかかわらず、成分を従来の比率で含み得、このような単位用量形態は、使用される目的の1日用量範囲に相応する任意の適切な有効量の活性成分を含み得る。   The composition according to the invention can be contained in the form of a pharmaceutical composition and its unit doses together with commonly used adjuvants, immunomodulators, carriers, diluents or excipients and in such a form a solid Can be used as, for example, tablets or filled capsules, or liquids, such as solutions, suspensions, emulsions, elixirs, or capsules filled with them (all orally), or by injection or continuous infusion It can be used in the form of sterile injectable solutions for parenteral (including subcutaneous and intradermal). Injectable compositions are typically based on injectable sterile saline or phosphate buffered saline or other injectable carriers known in the art. Such pharmaceutical compositions and unit dosage forms thereof may contain the ingredients in conventional ratios, with or without additional active compounds or ingredients, and such unit dosage forms may be used for the daily doses intended. Any suitable effective amount of active ingredient commensurate with the range may be included.

適切なアジュバントおよび/または免疫調節物質の例としては、MPL(登録商標)(Corixa)、アルミニウム化合物を含むアルミニウムベースのミネラル(一般的にAlumと呼ばれる)、ASO1−4、MF59、リン酸カルシウム、リポソーム、イスコム、ポリイノシン・ポリシチジン酸(ポリ−IC)(その安定化形態であるポリ−ICLC(Hiltonol)を含む)、CpGオリゴデオキシヌクレオチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、リポ多糖(LPS)、モンタニド、乳酸・グリコール酸共重合体(PLG)、フラジェリン、シャボンノキ(Soap Bark tree)サポニン(QS21)、アミノアルキルグルコサミド(amino alkyl glucosamide)化合物(例えば、RC529)、合成オリゴデオキシヌクレオチドを含む二成分抗菌ペプチド(例えば、IC31)、イミキモド、レシキモド、免疫刺激配列(ISS)、モノホスホリルリピドA(MPLA)、線維芽細胞刺激リポペプチド(FSL1)、および抗CD40抗体が挙げられる。   Examples of suitable adjuvants and / or immunomodulators include MPL® (Corixa), aluminum-based minerals containing aluminum compounds (commonly referred to as Alum), ASO1-4, MF59, calcium phosphate, liposomes, Iscom, polyinosine polycytidic acid (poly-IC) (including its stabilized form poly-ICLC (Hiltonol)), CpG oligodeoxynucleotide, granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), lipopolysaccharide (LPS) , Montanide, Lactic acid / Glycolic acid copolymer (PLG), Flagellin, Soap Bark tree Saponin (QS21), Aminoalkyl glucosamide compound (E.g., RC529), two component antimicrobial peptides containing synthetic oligodeoxynucleotides (e.g., IC31), imiquimod, resiquimod, immunostimulatory sequence (ISS), monophosphoryl lipid A (MPLA), fibroblast stimulating lipopeptide (FSL1) And anti-CD40 antibodies.

本発明の組成物は、これらに限定されないが、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシル剤などの液体製剤であってよい。これらの組成物はまた、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて再構成される乾燥製品として製剤化されてもよい。このような液体調製物は、限定されないが、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存料などの添加物を含み得る。懸濁化剤としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース/糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂が挙げられる。乳化剤としては、限定されないが、レシチン、ソルビタンモノオレエート、およびアラビアゴムが挙げられる。保存料としては、限定されないが、p−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよびソルビン酸が挙げられる。分散剤または湿潤剤としては、限定されないが、ポリ(エチレングリコール)、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Tween(登録商標)、Span(登録商標)が挙げられる。   The compositions of the present invention may be liquid formulations such as, but not limited to, aqueous or oily suspensions, solutions, emulsions, syrups, and elixirs. These compositions may also be formulated as a dry product that is reconstituted with water or other suitable vehicle prior to use. Such liquid preparations can include additives such as, but not limited to, suspending agents, emulsifiers, non-aqueous vehicles and preservatives. Suspending agents include, but are not limited to, sorbitol syrup, methyl cellulose, glucose / sugar syrup, gelatin, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, aluminum stearate gel, and hardened edible fat. Emulsifiers include but are not limited to lecithin, sorbitan monooleate, and gum arabic. Preservatives include, but are not limited to, methyl or propyl p-hydroxybenzoate and sorbic acid. Dispersants or wetting agents include, but are not limited to, poly (ethylene glycol), glycerol, bovine serum albumin, Tween®, Span®.

本発明による組成物は、また、移植によるかまたは筋肉内注射によって投与され得る、デポー調製物として製剤化されてもよい。   The composition according to the invention may also be formulated as a depot preparation, which can be administered by implantation or by intramuscular injection.

本発明による固体組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態であってよい。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、これらに限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤などの従来の賦形剤を含み得る。結合剤としては、これらに限定されないが、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、デンプンの粘液およびポリビニルピロリドンが挙げられる。充填剤としては、これらに限定されないが、ラクトース、糖、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが挙げられる。潤滑剤としては、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられる。崩壊剤としては、これらに限定されないが、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウム(sodium starch glycollate)が挙げられる。湿潤剤としては、これらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。   The solid composition according to the invention may be in the form of a tablet or lozenge formulated in a conventional manner. For example, tablets and capsules for oral administration can contain conventional excipients such as, but not limited to, binders, fillers, lubricants, disintegrants, and wetting agents. Binders include, but are not limited to, syrup, gum arabic, gelatin, sorbitol, tragacanth, starch mucus and polyvinylpyrrolidone. Fillers include, but are not limited to, lactose, sugar, crystalline cellulose, corn starch, calcium phosphate, and sorbitol. Lubricants include, but are not limited to, magnesium stearate, stearic acid, talc, polyethylene glycol, and silica. Disintegrating agents include, but are not limited to, potato starch and sodium starch glycolate. Wetting agents include, but are not limited to, sodium lauryl sulfate. The tablets can be coated by methods well known in the art.

本発明の化合物はまた、徐放形態でまたは徐放薬物送達系から投与され得る。   The compounds of the invention can also be administered in sustained release forms or from sustained release drug delivery systems.

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、皮下用である。   According to a particular embodiment, the composition according to the invention is for subcutaneous use.

別の特定の態様によれば、本発明による組成物は、反復投与による送達に適している。   According to another particular embodiment, the composition according to the invention is suitable for delivery by repeated administration.

さらなる材料および製剤加工技術などは、Part 5 of Remington’s“The Science and Practice of Pharmacy”,22nd Edition,2012,University of the Sciences in Philadelphia,Lippincott Williams & Wilkinsに記載されており、これは引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 Is such as additional materials and formulations processing technology, Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22 nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, are described in Lippincott Williams & Wilkins, this is cited Is made a part of the disclosure of this specification.

本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドもしくは複合体、または本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞と、医薬的に許容されるキャリアを混合する工程を含む、本発明による医薬組成物を調製する方法を提供することである。   Another aspect of the present invention comprises mixing a cell permeable peptide or complex according to the present invention or a cell loaded with a complex according to the present invention, in particular an antigen presenting cell, with a pharmaceutically acceptable carrier, It is to provide a method for preparing a pharmaceutical composition according to the present invention.

本発明による複合体、本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞、本発明による組成物、それらの製剤、または本発明による方法は、疾患または障害、特に免疫療法によって治療または予防され得るもの、例えば癌および感染症の予防および/または治療に有用である。   A complex according to the invention, a cell loaded with a complex according to the invention, in particular an antigen presenting cell, a composition according to the invention, a formulation thereof, or a method according to the invention is treated or prevented by a disease or disorder, in particular by immunotherapy. It is useful for the prevention and / or treatment of what is obtained, such as cancer and infectious diseases.

別の態様において、本発明は、イメージング組成物または診断用組成物を提供する。さらに他の態様は、イメージング剤を送達する方法、および、被験体において、好ましくは哺乳類被験体において、そして最も好ましくは、内科的障害、特に癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶に罹患している疑いがあるヒト患者において、疾患または障害を診断する方法に関する。   In another aspect, the present invention provides an imaging composition or a diagnostic composition. Yet another embodiment is a method of delivering an imaging agent and in a subject, preferably a mammalian subject, and most preferably suffering from medical disorders, particularly cancer, infections, autoimmune diseases and transplant rejection. It relates to a method of diagnosing a disease or disorder in a human patient suspected of having

医薬組成物のための本明細書に記載される製剤および投与様式はまた、本発明によるイメージング組成物または診断組成物に適したものであってもよい。   The formulations and modes of administration described herein for pharmaceutical compositions may also be suitable for imaging or diagnostic compositions according to the present invention.

さらなる態様において、本発明はまた、以下の少なくとも1つを含むパーツキットにも関する:
(a)本発明による細胞透過性ペプチド
(b)本発明による複合体
(c)本発明による核酸
(d)本発明によるベクター
(e)本発明による宿主細胞
(f)本発明による複合体をロードした細胞
In a further aspect, the present invention also relates to a parts kit comprising at least one of the following:
(A) Cell-penetrating peptides according to the invention (b) Complexes according to the invention (c) Nucleic acids according to the invention (d) Vectors according to the invention (e) Host cells according to the invention (f) Loading complexes according to the invention Cells

特定の実施形態において、本発明のパーツキットは、2つ以上の(a)〜(f)の成分を含む。   In certain embodiments, the parts kit of the present invention comprises two or more components (a)-(f).

本発明の一つの例において、そのパーツキットは、少なくとも2つの異なる(a)のペプチド、少なくとも2つの異なる(b)の複合体、少なくとも2つの異なる(c)の核酸、少なくとも2つの異なる(d)のベクター、少なくとも2つの異なる(e)の宿主細胞、および/または少なくとも2つの異なる(f)の細胞を含んでなる。   In one example of the invention, the kit of parts comprises at least two different (a) peptides, at least two different (b) complexes, at least two different (c) nucleic acids, at least two different (d ) Vector, at least two different (e) host cells, and / or at least two different (f) cells.

別の例において、本発明のパーツキットは、本発明による少なくとも2つの異なる複合体および/または少なくとも2つの異なる核酸を含んでなる。   In another example, the parts kit of the present invention comprises at least two different complexes and / or at least two different nucleic acids according to the present invention.

詳細には、本発明のパーツキットは、2つ以上の本発明による複合体、例えば、各複合体が1つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含み得る。   In particular, the kit of parts of the invention comprises at least two or more complexes according to the invention, for example each complex comprising one or more cargo molecules, and wherein the cargo molecules differ between the complexes. Two complexes may be included.

一つの例において、本発明のパーツキットは、各複合体が1つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含んでなる。   In one example, the part kit of the present invention comprises at least two complexes, each complex comprising one or more epitopes, and said epitopes differ between the complexes.

別の例において、本発明のパーツキットは、各複合体が1つ以上のエピトープをコードする1つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体を含んでなる。   In another example, the kit of parts of the present invention comprises at least two complexes, each complex comprising one or more nucleic acids encoding one or more epitopes, and wherein the nucleic acids differ between the complexes. Comprising.

パーツキットの多様な成分は、1つ以上の容器にパッケージングされ得る。上記成分は、凍結乾燥形態もしくは乾燥形態で、または適切な緩衝液中に溶解されて提供され得る。このキットはまた、例えば保存料、増殖培地、および/または上記成分の貯蔵および/または再構成のための緩衝液、洗浄溶液などの追加の試薬も含み得る。別の実施形態において、本発明によるパーツキットはまた、使用説明書も含む。   The various components of the part kit can be packaged in one or more containers. The components can be provided in lyophilized or dried form, or dissolved in a suitable buffer. The kit may also include additional reagents such as preservatives, growth media, and / or buffers, wash solutions, etc. for storage and / or reconstitution of the components. In another embodiment, the parts kit according to the present invention also includes instructions for use.

本発明の別の態様は、本発明による医薬組成物および前記医薬組成物の使用説明書を含む、癌または感染症を治療、予防または安定化するためのワクチン接種キットである。   Another aspect of the present invention is a vaccination kit for treating, preventing or stabilizing a cancer or an infectious disease comprising a pharmaceutical composition according to the present invention and instructions for using said pharmaceutical composition.

特定の実施形態において、本発明による組成物および/またはパーツキットは、イメージング技術用である。   In certain embodiments, the compositions and / or parts kits according to the present invention are for imaging technology.

別の実施形態において、本発明による組成物および/またはパーツキットは、本願に沿って記載されるような疾患または障害の診断用である。   In another embodiment, the composition and / or part kit according to the present invention is for the diagnosis of a disease or disorder as described along with the present application.

本発明による使用および方法
本発明の一つの態様は、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。
Uses and Methods According to the Invention One aspect of the present invention provides a method for delivering a cargo molecule into a cell in vitro, wherein the cell is contacted with a cell penetrating peptide according to the invention and the cargo molecule. The process of making it comprise.

特定の態様において、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する本発明の方法は、以下の工程を含む:
a)本発明による細胞透過性ペプチドと細胞内に送達されるべきカーゴ分子との複合体を形成する工程、および
b)前記細胞を、工程a)で形成された複合体と接触させる工程。
In certain embodiments, the method of the invention for delivering a cargo molecule into a cell in vitro comprises the following steps:
a) forming a complex of the cell penetrating peptide according to the present invention with a cargo molecule to be delivered into the cell; and b) contacting the cell with the complex formed in step a).

本発明の別の態様は、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIと関連して、細胞の表面にカーゴ分子由来のエピトープを送達および提示するインビトロ方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。   Another aspect of the present invention provides an in vitro method for delivering and presenting an epitope derived from a cargo molecule on the surface of a cell in association with MHC class I and / or MHC class II, the method comprising: Contacting with a cell-penetrating peptide according to the invention and said cargo molecule.

別の態様において、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などの、免疫療法によって治療され得るような疾患または障害の予防、治療または安定化のための医薬を調製するために、以下のいずれか1つの使用を提供する:(i)本発明の複合体、(ii)本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞。   In another embodiment, the present invention is for preparing a medicament for the prevention, treatment or stabilization of diseases or disorders that can be treated by immunotherapy, such as cancer, infections, autoimmune diseases and graft rejection. Provides for the use of any one of the following: (i) a complex of the invention, (ii) a cell loaded with the complex of the invention, eg, an antigen presenting cell.

本発明の有利な実施形態において、細胞透過性ペプチドおよびエピトープを含み、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIと関連して抗原提示細胞の細胞表面に前記エピトープを輸送および提示することができる、ワクチン接種および免疫療法に使用するための本発明による複合体が提供される。   In an advantageous embodiment of the invention, a vaccine comprising a cell penetrating peptide and an epitope and capable of transporting and presenting said epitope on the cell surface of antigen presenting cells in association with MHC class I and / or MHC class II Provided are complexes according to the invention for use in inoculation and immunotherapy.

別の態様によれば、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などの、免疫療法によって治療され得るような疾患または障害を予防、治療または抑制する方法を提供し、前記方法は、以下のうちのいずれか1つを前記被験体に投与することを含む:(i)本発明の複合体、(ii)本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または(iii)(i)〜(ii)の医薬製剤。   According to another aspect, the present invention provides a method for preventing, treating or inhibiting diseases or disorders that can be treated by immunotherapy, such as cancer, infections, autoimmune diseases and graft rejection, The method comprises administering to the subject any one of the following: (i) a complex of the invention, (ii) a cell loaded with the complex of the invention, eg, an antigen presenting cell, or (Iii) Pharmaceutical preparations of (i) to (ii).

別の実施形態によれば、被験体において、CD4ヘルパーT細胞および/またはCD8細胞傷害性T細胞に依存する1つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法が提供され、前記方法は、以下のうちのいずれか1つを前記被験体に投与することを含む:(i)1つまたは複数のエピトープを含むカーゴ分子を含む本発明の複合体、(ii)前記複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または(iii)(i)〜(ii)の医薬製剤。 According to another embodiment, there is provided a method for inducing or ameliorating an immune response in a subject against one or more epitopes that depend on CD4 + helper T cells and / or CD8 + cytotoxic T cells, The method comprises administering to the subject any one of the following: (i) a complex of the invention comprising a cargo molecule comprising one or more epitopes, (ii) the complex. A loaded cell, such as an antigen presenting cell, or a pharmaceutical formulation of (iii) (i)-(ii).

CD4および/またはCD8応答に依存する免疫応答は、本発明の化合物の投与前のレベルと比較して、IFN−γ、TNF−αおよびIL−2のmRNAまたはタンパク質の1つ以上の発現量が増加するなどの炎症反応(炎症性サイトカイン反応)を評価することによって決定され得る。また、HLA−ペプチド多量体染色、ELISPOTアッセイ、および遅延型過敏症試験によって測定される、本発明の化合物の投与後の抗原特異的T細胞の頻度または絶対数の増加によっても測定され得る。また、抗原特異的Tヘルパー細胞に依存する抗原特異的血清抗体の増加によっても、間接的に測定され得る。 An immune response that is dependent on a CD4 + and / or CD8 + response is an expression of one or more of IFN-γ, TNF-α and IL-2 mRNA or protein as compared to the pre-dose level of a compound of the invention. It can be determined by evaluating an inflammatory response (inflammatory cytokine response), such as an increase in amount. It can also be measured by an increase in the frequency or absolute number of antigen-specific T cells after administration of the compounds of the invention, as measured by HLA-peptide multimer staining, ELISPOT assay, and delayed hypersensitivity test. It can also be measured indirectly by an increase in antigen-specific serum antibodies that depend on antigen-specific T helper cells.

別の実施形態によれば、被験体において、複数のMHCクラスI分子および/または複数のMHCクラスII分子によって拘束される1つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法が提供され、前記方法は、以下のうちのいずれか1つを前記被験体に投与することを含む:(i)1つまたは複数のエピトープを含むカーゴ分子を含む本発明の複合体、(ii)前記複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または(iii)(i)〜(ii)の医薬製剤。   According to another embodiment, a method is provided for inducing or ameliorating an immune response in a subject against one or more epitopes constrained by a plurality of MHC class I molecules and / or a plurality of MHC class II molecules; The method comprises administering to the subject any one of the following: (i) a complex of the invention comprising a cargo molecule comprising one or more epitopes, (ii) the complex. Loaded cells, such as antigen-presenting cells, or pharmaceutical formulations (iii) (i) to (ii).

被験体において、複数のMHCクラスI分子および/または複数のMHCクラスII分子によって拘束される複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法は、抗原提示細胞上の別々のMHCクラスIおよびクラスII分子に結合している個々のペプチドによるT細胞のインビトロ刺激の後、本発明の化合物の投与前のレベルと比較して、IFN−γ、TNF−αおよびIL−2のmRNAまたはタンパク質の1つ以上の発現量が増加するなどのサイトカイン反応を評価することによって決定され得る。異なるMHC分子への拘束はまた、異なるMHC分子を発現している抗原提示細胞を使用することによって、またはMHC阻止抗体を用いることによっても検証され得る。また、異なるMHC分子で構築された多量体を用いるHLA−ペプチド多量体染色によって測定される、本発明の化合物の投与後の抗原特異的T細胞の頻度または絶対数の増加によっても測定され得る。   A method for inducing or ameliorating an immune response against a plurality of epitopes constrained by a plurality of MHC class I molecules and / or a plurality of MHC class II molecules in a subject is disclosed in separate MHC class I and class II on antigen presenting cells. One of the mRNAs or proteins of IFN-γ, TNF-α and IL-2 after in vitro stimulation of T cells with individual peptides bound to the molecule, compared to the level before administration of the compound of the invention It can be determined by evaluating a cytokine response such as an increase in the expression level. Constraints on different MHC molecules can also be verified by using antigen presenting cells expressing different MHC molecules, or by using MHC blocking antibodies. It can also be measured by the increase in the frequency or absolute number of antigen-specific T cells after administration of the compounds of the invention, as measured by HLA-peptide multimer staining using multimers constructed with different MHC molecules.

本発明による1つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法の好ましい態様において、その免疫応答は、例えば、Novellino et al.(2005,Cancer Immunol Immunother,54(3):187〜207)およびVigneron et al.(2013,Cancer Immun.13:15)に記載されるようなグリオーマエピトープの組み合わせのように、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍特異的抗原の1つまたは複数のエピトープに対するものである。   In a preferred embodiment of the method for inducing or ameliorating an immune response against one or more epitopes according to the present invention, the immune response is described, for example, in Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54 (3): 187-207) and Vigneron et al. (2013, Cancer Immun. 13:15), such as a combination of glioma epitopes, against one or more epitopes of a tumor-associated antigen or a tumor-specific antigen.

別の好ましい態様において、その免疫応答は、病原体由来の抗原タンパク質の複数のエピトープに対するものである。   In another preferred embodiment, the immune response is against multiple epitopes of an antigenic protein from a pathogen.

本発明による方法の特定の態様において、前記方法は、MHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子によって拘束される1つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を、被験体において誘発または改善するためのものである。   In a particular embodiment of the method according to the invention, said method is for inducing or ameliorating an immune response in a subject against one or more epitopes restricted by MHC class I and / or MHC class II molecules. It is.

別の態様において、本発明は、イメージング技術用のイメージング組成物の調製のため、または、疾患もしくは障害の診断用の診断組成物の調製のためのそれぞれの目的で、以下のうちのいずれか1つの使用を提供する:(i)本発明の複合体、(ii)本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞。本発明を用いて診断され得る疾患または障害としては、免疫療法によって治療され得るもの、例えば癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶が挙げられる。   In another aspect, the present invention provides any one of the following for the preparation of an imaging composition for an imaging technique or for the preparation of a diagnostic composition for the diagnosis of a disease or disorder: One use is provided: (i) a complex of the invention, (ii) a cell loaded with the complex of the invention, eg, an antigen presenting cell. Diseases or disorders that can be diagnosed using the present invention include those that can be treated by immunotherapy, such as cancer, infections, autoimmune diseases and graft rejection.

別の態様によれば、本発明はイメージング方法を提供し、前記方法は、以下のうちのいずれか1つを、インビトロ、エクスビボまたはインビボで用いることを含む:(i)本発明の複合体、(ii)本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または(iii)(i)〜(ii)の医薬製剤。   According to another aspect, the present invention provides an imaging method comprising using any one of the following in vitro, ex vivo or in vivo: (i) a complex of the invention, (Ii) a cell loaded with the complex of the present invention, such as an antigen-presenting cell, or a pharmaceutical preparation of (iii) (i) to (ii).

さらなる態様によれば、本発明は、被験体における疾患または障害を診断する方法を提供し、前記方法は、前記被験体に、またはエクスビボで前記被験体のサンプルに、以下のうちのいずれか1つを投与することを含む:(i)本発明の複合体、(ii)本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または(iii)(i)〜(ii)の医薬製剤。   According to a further aspect, the present invention provides a method of diagnosing a disease or disorder in a subject, said method being directed to said subject or to a sample of said subject ex vivo, any one of the following: (Ii) a complex of the present invention, (ii) a cell loaded with the complex of the present invention, such as an antigen-presenting cell, or (iii) a pharmaceutical formulation of (i)-(ii).

特定の実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明による複合体の投与を含む。   In certain embodiments, the uses and methods of the invention comprise the administration of a complex according to the invention.

別の特定の実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明による2つ以上の複合体、細胞、または医薬製剤の投与を含む。   In another specific embodiment, the uses and methods of the invention comprise the administration of two or more conjugates, cells, or pharmaceutical formulations according to the invention.

本発明の使用および方法の例において、各複合体が1つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体が使用されるかまたは投与される。   In examples of uses and methods of the invention, at least two complexes are used or administered such that each complex includes one or more cargo molecules and the cargo molecules differ between the complexes. .

本発明の使用および方法の別の例において、各複合体が1つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体が使用されるかまたは投与される。   In another example of the uses and methods of the invention, at least two complexes are used or administered, such that each complex includes one or more epitopes and the epitopes differ between the complexes. .

本発明の使用および方法のなおさらなる例において、各複合体が1つ以上のエピトープをコードする1つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも2つの複合体が使用されるかまたは投与される。   In yet a further example of the uses and methods of the present invention, at least two complexes wherein each complex comprises one or more nucleic acids encoding one or more epitopes and the nucleic acids differ between the complexes Used or administered.

本発明の使用および方法のための癌の例としては、脳癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、肺癌、肝癌、腎癌、メラノーマ、消化管癌、肺癌、頭頸部扁平上皮癌、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、骨髄性白血病、肺扁平上皮癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、膀胱腫瘍、前骨髄球性白血病、非小細胞肺癌、肉腫が挙げられる。   Examples of cancers for use and methods of the present invention include brain cancer, prostate cancer, breast cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer, kidney cancer, melanoma, gastrointestinal cancer, lung cancer, head and neck squamous cell carcinoma, Chronic myeloid leukemia, colorectal cancer, gastric cancer, endometrial cancer, myeloid leukemia, lung squamous cell carcinoma, acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, bladder tumor, promyelocytic leukemia, non-small cell lung cancer, sarcoma Is mentioned.

癌は、固形腫瘍、血液癌、またはリンパ性癌であってもよい。癌は、良性であっても転移性であってもよい。   The cancer may be a solid tumor, a blood cancer, or a lymphatic cancer. The cancer may be benign or metastatic.

本発明の使用および方法のための感染症の例としては、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および多細胞寄生虫によって引き起こされる疾患が挙げられる。これらとしては、例えば、アメーバ症、炭疽、ブルーリ潰瘍(マイコバクテリウム・ウルセランス)、カリシウイルス関連下痢症、カンピロバクター下痢症、子宮頸癌(ヒトパピローマウイルス)、クラミジア・トラコマチス関連生殖器疾患、コレラ、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、ジフテリア、エボラ出血熱、毒素原性大腸菌(ETEC)下痢症、胃癌(ヘリコバクター・ピロリ)、淋病、A群ストレプトコッカス関連疾患、B群ストレプトコッカス関連疾患、ヘモフィルスインフルエンザB菌による肺炎および侵襲性疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎下痢症、単純ヘルペス2型外陰部潰瘍、HIV/AIDS、鉤虫症、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、リーシュマニア症、レプトスピラ症、肝癌(B型肝炎)、肝癌(C型肝炎)、ライム病、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、上咽頭癌(エプスタイン・バーウイルス)、髄膜炎菌髄膜炎、パラインフルエンザ関連肺炎、百日咳、ペスト、灰白髄炎、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)肺炎、リフトバレー熱、ロタウイルス下痢症、風疹、住血吸虫症、重症急性呼吸器症候群(SARS)、細菌性赤痢、天然痘、黄色ブドウ球菌関連疾患、胃癌(ヘリコバクター・ピロリ)、肺炎球菌および侵襲性疾患、破傷風、ダニ媒介脳炎、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、ウエストナイルウイルス関連疾患、黄熱が挙げられる。   Examples of infectious diseases for the uses and methods of the present invention include diseases caused by viruses, bacteria, fungi, protozoa and multicellular parasites. These include, for example, amebiasis, anthrax, Buruli ulcer (Mycobacterium ulcerans), calicivirus-related diarrhea, Campylobacter diarrhea, cervical cancer (human papillomavirus), Chlamydia trachomatis-related genital diseases, cholera, Crimea Congo hemorrhagic fever, Dengue fever, Diphtheria, Ebola hemorrhagic fever, Toxigenic Escherichia coli (ETEC) diarrhea, Gastric cancer (Helicobacter pylori), Gonorrhea, Group A Streptococcus related disease, Group B Streptococcus related disease, Pneumonia due to Haemophilus influenza B and invasiveness Disease, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis E diarrhea, herpes simplex type 2 vulva ulcer, HIV / AIDS, helminthism, influenza, Japanese encephalitis, Lassa fever, leishmaniasis, leptospirosis, Liver cancer (hepatitis B) Liver cancer (hepatitis C), Lyme disease, malaria, Marburg hemorrhagic fever, measles, epidemic parotitis, nasopharyngeal carcinoma (Epstein-Barr virus), meningococcal meningitis, parainfluenza-associated pneumonia, pertussis, Plague, leukomyelitis, rabies, respiratory syncytial virus (RSV) pneumonia, Rift Valley fever, rotavirus diarrhea, rubella, schistosomiasis, severe acute respiratory syndrome (SARS), bacterial dysentery, smallpox, yellow Staphylococcus-related diseases, gastric cancer (Helicobacter pylori), pneumococci and invasive diseases, tetanus, tick-borne encephalitis, trachoma, tuberculosis, barbaric disease, typhoid fever, West Nile virus-related diseases, yellow fever.

本発明による使用および方法の別の実施形態において、本発明による細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、より詳細には治療されるべき被験体由来の樹状細胞である。   In another embodiment of the uses and methods according to the invention, the cells according to the invention are antigen presenting cells, in particular dendritic cells, more particularly dendritic cells from the subject to be treated.

典型的には、癌治療の場合、本発明によるポリペプチドの治療有効量は、注射1回あたり約0.1mg〜2mg、または注射1回あたり約マイクロモル〜1ミリモルである。   Typically, for cancer treatment, a therapeutically effective amount of a polypeptide according to the present invention is about 0.1 mg to 2 mg per injection, or about micromolar to 1 millimole per injection.

典型的には、癌治療の場合、本発明によるポリペプチドをロードした抗原提示細胞の治療有効量は、注射1回あたり約20万細胞〜200万細胞である。   Typically, for cancer treatment, a therapeutically effective amount of antigen presenting cells loaded with a polypeptide according to the invention is about 200,000 to 2 million cells per injection.

単回投与または複数回投与として個体に投与される投薬量は、薬物動態学的特性、患者の状態および特徴(性別、年齢、体重、健康、サイズ)、症状の程度、併用治療、治療の頻度ならびに所望の効果などを含む、様々な要因によって変化する。   The dosage administered to an individual as a single dose or multiple doses will vary according to pharmacokinetic characteristics, patient status and characteristics (sex, age, weight, health, size), severity of symptoms, combination treatment, frequency of treatment As well as the desired effect.

投与様式
本発明による化合物、組成物、特にワクチン組成物、およびそれらの製剤は、経口、非経口、静脈内、直腸内、またはそれらの組み合わせを含む、任意の様式で投与され得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下、皮内および筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物はまた、局所、腫瘍内、鼻腔内、または筋内経路によっても投与され得る。本発明の組成物はまた、組成物の徐放および緩徐制御静脈内注入を可能にする移植片の形態でも投与され得る。
Modes of Administration The compounds, compositions, particularly vaccine compositions, and formulations thereof according to the present invention can be administered in any manner, including oral, parenteral, intravenous, rectal, or combinations thereof. Parenteral administration includes, but is not limited to, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal and intramuscular. The compositions of the present invention can also be administered by local, intratumoral, intranasal, or intramuscular route. The compositions of the present invention can also be administered in the form of an implant that allows for slow release and slow controlled intravenous infusion of the composition.

好ましくは、本発明による化合物、組成物、特にワクチン組成物、およびそれらの製剤は、皮下に投与される。   Preferably, the compounds, compositions, especially vaccine compositions, and their formulations according to the present invention are administered subcutaneously.

本発明の一つの実施形態において、本発明の複合体、抗原提示細胞および組成物の投与は、複数回連続注射を必要とする。したがって、一次免疫注射として1回、その後、追加免疫注射というように、少なくとも2回反復投与され得る。   In one embodiment of the invention, administration of the conjugates, antigen presenting cells and compositions of the invention requires multiple consecutive injections. Thus, it can be administered at least twice as a primary immunization injection followed by a booster injection.

本発明の特定の実施形態において、ワクチン組成物は、反復または連続して投与され得る。ワクチン組成物は、少なくとも1、2、3、または4週間;2、3、4、5、6、8、10、または12ヶ月間;あるいは2、3、4、または5年間、反復または連続して投与され得る。   In certain embodiments of the invention, the vaccine composition may be administered repeatedly or sequentially. The vaccine composition may be repeated or continuous for at least 1, 2, 3, or 4 weeks; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, or 12 months; or 2, 3, 4, or 5 years Can be administered.

別の実施形態において、本発明による複合体を構成する細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子は、別個の組成物中に含まれ、これらの組成物は、投与直前に混合されるか、またはそれらを必要とする被験体に同時に投与される。   In another embodiment, the cell penetrating peptides and cargo molecules that make up the complex according to the invention are contained in separate compositions, which are mixed or require them just prior to administration. Are administered simultaneously to the subject.

組み合わせ
さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、単独で実施されても、あるいは治療または抑制されるべき疾患または障害の治療および/または安定化に有用な補助剤と組み合わせて実施されてもよい。
According to a further embodiment of the combination , the administration of the pharmaceutical composition in the methods and uses according to the invention may be carried out alone or as an adjunct useful for the treatment and / or stabilization of a disease or disorder to be treated or suppressed. It may be carried out in combination with an agent.

例えば、癌の治療、予防、または安定化の場合、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、固形腫瘍に対するものであって転移定着の制御のために従来の化学療法に使用される物質、またはプログラム細胞死を引き起こすことによって作用する任意の他の分子、例えば、限定されないが、Fasリガンドおよび腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導(TRAIL)リガンドなどの腫瘍壊死ファミリーメンバーから選択される補助剤と組み合わせて実施され得る。さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、放射線療法と平行して実施され得る。   For example, in the case of cancer treatment, prevention, or stabilization, administration of the pharmaceutical composition in the methods and uses according to the invention is for solid tumors and is used in conventional chemotherapy for control of metastasis establishment Substance, or any other molecule that acts by causing programmed cell death, such as, but not limited to, tumor necrosis family members such as Fas ligand and tumor necrosis factor (TNF) -related apoptosis-inducing (TRAIL) ligand It can be carried out in combination with adjuvants. According to a further embodiment, the administration of the pharmaceutical composition in the methods and uses according to the invention can be carried out in parallel with radiation therapy.

本発明は、本発明の複合体、本発明の複合体をロードした細胞、または本発明によるその医薬組成物の投与を包含し、癌の治療および/または安定化および/または再発癌の予防に有用な他の治療計画または補助剤(例えば、複数の投薬計画)の前に、同時に、あるいは連続して、治療有効量で被験体に投与される。前記補助剤と同時に投与される前記複合体、細胞、または医薬組成物は、同一または別個の組成物中で、かつ、同一または別個の投与経路によって投与され得る。   The present invention includes administration of a complex of the present invention, a cell loaded with the complex of the present invention, or a pharmaceutical composition thereof according to the present invention, for treating and / or stabilizing cancer and / or preventing recurrent cancer. The subject is administered in a therapeutically effective amount prior to other useful treatment regimens or adjuvants (eg, multiple dosing regimens), simultaneously or sequentially. The complex, cell, or pharmaceutical composition administered concurrently with the adjuvant can be administered in the same or separate composition and by the same or separate route of administration.

前記他の治療計画または補助剤は、放射線療法、化学療法、手術、標的療法(低分子、ペプチドおよびモノクローナル抗体を含む)、および抗血管新生療法からなる群から選択され得る。抗血管新生療法は、腫瘍関連脈管構造を直接的または間接的に標的とする薬剤の投与として本明細書で定義される。   Said other treatment plan or adjuvant may be selected from the group consisting of radiation therapy, chemotherapy, surgery, targeted therapy (including small molecules, peptides and monoclonal antibodies), and anti-angiogenic therapy. Anti-angiogenic therapy is defined herein as the administration of an agent that directly or indirectly targets tumor-associated vasculature.

一つの実施形態によれば、本発明の複合体または本発明の細胞、特に本発明の抗原提示細胞を含む医薬製剤が、癌の治療および/または安定化および/または再発癌の予防に有用な少なくとも1つの補助剤、ならびに少なくとも1つの医薬的に許容されるキャリアと組み合わせて提供される。   According to one embodiment, the complex of the present invention or the pharmaceutical preparation comprising the cell of the present invention, particularly the antigen-presenting cell of the present invention, is useful for treating and / or stabilizing cancer and / or preventing recurrent cancer. Provided in combination with at least one adjuvant, as well as at least one pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の別の実施形態によれば、本発明による化合物およびその医薬製剤は、再発および/または転移に対する予防として、固形腫瘍を除去する手術の後に投与され得る。   According to another embodiment of the present invention, the compounds according to the present invention and pharmaceutical formulations thereof can be administered after surgery to remove solid tumors as prevention against recurrence and / or metastasis.

さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用におけるイメージング組成物または診断組成物の投与は、単独で実施されても、あるいは疑われる疾患または障害をイメージングおよび/または診断するのに有用な補助剤と組み合わせて実施されてもよい。   According to a further embodiment, administration of the imaging or diagnostic composition in the methods and uses according to the invention may be performed alone or as an aid useful for imaging and / or diagnosing a suspected disease or disorder. It may be carried out in combination with an agent.

患者
カーゴ分子の治療効果に応じて、本発明は、前記カーゴ分子の作用によって予防、治療、または軽減され得る任意の疾患または障害に罹患しやすいか、または罹患している任意の患者に適用され得る。カーゴ分子がエピトープを含む場合、前記カーゴ分子の治療効果は、前記エピトープに対する免疫応答、特に、CD4ヘルパーT細胞および/またはCD8細胞傷害性T細胞に依存し、かつ/あるいはMHCクラスI分子および/またはMHCクラスII分子によって拘束される応答を誘発することであってもよい。
Depending on the therapeutic effect of the patient cargo molecule, the present invention applies to any patient susceptible to or suffering from any disease or disorder that can be prevented, treated, or alleviated by the action of the cargo molecule. obtain. If the cargo molecule comprises an epitope, the therapeutic effect of said cargo molecule depends on the immune response against said epitope, in particular CD4 + helper T cells and / or CD8 + cytotoxic T cells and / or MHC class I molecules And / or triggering a response constrained by MHC class II molecules.

一つの実施形態において、本発明による患者は、癌に、例えば脳、結腸、頭部もしくは頸部の癌に、または子宮頸癌に罹患しやすいか、または罹患している患者である。   In one embodiment, a patient according to the present invention is a patient susceptible to or suffering from cancer, eg, brain, colon, head or neck cancer, or cervical cancer.

特定の実施形態において、本発明による患者は、グリオーマなどの脳癌に罹患している患者である。   In certain embodiments, a patient according to the present invention is a patient suffering from brain cancer such as glioma.

特定の実施形態において、本発明による患者は、腫瘍の外科的除去を受けている。   In certain embodiments, a patient according to the present invention is undergoing surgical removal of a tumor.

別の実施形態において、本発明による患者は、感染症に罹患しやすいか、または罹患している患者である。   In another embodiment, a patient according to the present invention is a patient susceptible to or suffering from an infection.

本明細書中に引用される参考文献は、その全体が、参考として援用される。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様の1つの説明であることが意図されており、機能的に等価な方法および組成物が本発明の範囲内にある。実際に、本発明の種々の変更が、本明細書に示されかつ記載されるものに加えて、上述の記載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。   All references cited herein are incorporated by reference in their entirety. The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments described herein, which are intended to be one illustration of individual aspects of the invention, Functionally equivalent methods and compositions are within the scope of the invention. Indeed, various modifications of the invention will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and accompanying drawings, in addition to those shown and described herein. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.

本発明を記載してきたが、以下の実施例は、例として示すものであり、本発明はこれらに限定されない。   Although the invention has been described, the following examples are given by way of illustration and the invention is not limited thereto.

以下の実施例は、細胞内へのペプチドおよびタンパク質の送達ならびにインビボでの免疫応答の誘導のための細胞透過性ペプチドとしてのZEBRAのいくつかのフラグメントの有効性を支持するために行った。   The following examples were performed to support the effectiveness of several fragments of ZEBRA as cell penetrating peptides for delivery of peptides and proteins into cells and induction of immune responses in vivo.

以下の略語は、それぞれ以下の意味を示す:
aa(アミノ酸)、h(時間)、μl(マイクロリットル)、μM(マイクロモル濃度)、mM(ミリモル濃度)、mg(ミリグラム)、min(分)、CFSE(カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル)、DC(樹状細胞)。
The following abbreviations have the following meanings, respectively:
aa (amino acid), h (time), μl (microliter), μM (micromolar concentration), mM (molar concentration), mg (milligram), min (minute), CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester), DC (dendritic cell).

実施例1:本発明のCPP1またはCPP2およびオボアルブミンペプチドカーゴを含む融合ポリペプチドの調製
2つのCPP、ならびに構築物1および2に相当する2つの融合ポリペプチド(これらの融合ポリペプチドは、それぞれ、ZEBRA由来の2つのCPPのうちの1つおよびオボアルブミン由来の免疫優性CD8T細胞エピトープを含む)を化学的に合成した。
Example 1 Preparation of Fusion Polypeptide Containing CPP1 or CPP2 of the Invention and Ovalbumin Peptide Cargo Two CPPs and two fusion polypeptides corresponding to constructs 1 and 2 (these fusion polypeptides are ZEBRA, respectively) One of the two CPPs derived from and including an immunodominant CD8 + T cell epitope from ovalbumin was chemically synthesized.

これらのCPPおよび融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである:
CPP1:(全17個のアミノ酸)
配列番号1:KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2:(全30個のアミノ酸)
配列番号2:KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
オボアルブミンCD8エピトープ(全8個のアミノ酸)
配列番号3:SIINFEKL
複合体1:構築物1:オボアルブミンCD8エピトープに融合されたCPP1を含む(全33個のアミノ酸)
配列番号4:KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
複合体2:構築物2:オボアルブミンCD8エピトープに融合されたCPP2を含む(全46個のアミノ酸)
配列番号5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
The amino acid sequences of these CPPs and fusion polypeptides are as follows:
CPP1: (17 total amino acids)
Sequence number 1: KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2: (all 30 amino acids)
Sequence number 2: KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
Ovalbumin CD8 epitope (all 8 amino acids)
Sequence number 3: SIINFEKL
Complex 1: Construct 1: Containing CPP1 fused to ovalbumin CD8 epitope (33 total amino acids)
Sequence number 4: KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
Complex 2: Construct 2: contains CPP2 fused to ovalbumin CD8 epitope (total 46 amino acids)
SEQ ID NO: 5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT

実施例2:本発明によるCPP1−OVAまたはCPP2−OVA融合ポリペプチドを樹状細胞内にロードした後の送達およびMHCクラスI拘束性提示
抗原提示細胞によって取り込まれるCPP1およびCPP2の能力を、オボアルブミンエピトープのプロセシングおよび提示を用いて、最初にインビトロで試験した。構築物1および2の各々を、骨髄由来樹状細胞の培養物に添加し、これらの細胞を続いてリポ多糖(LPS)で一晩成熟させた。次いで、MHCクラスI分子上でのオボアルブミンエピトープのプロセシングおよび提示を、樹状細胞とOT1トランスジェニックマウスの脾臓由来のオボアルブミン特異的CD8T細胞との共培養により、機能アッセイで検出した。OT1CD8T細胞は、蛍光色素CFSE(細胞分裂毎に希釈されるので、抗原特異的増殖の指標としての役割を果たす)で予め標識した。CD8OT1T細胞と、構築物1および2の各々をロードした樹状細胞との5日間の共培養後、フローサイトメトリーによって増殖を評価した(図1)。
Example 2: Delivery of CPP1-OVA or CPP2-OVA fusion polypeptides according to the invention into dendritic cells and the ability of CPP1 and CPP2 to be taken up by MHC class I-restricted presentation antigen presenting cells Initially tested in vitro using epitope processing and presentation. Each of constructs 1 and 2 was added to a culture of bone marrow-derived dendritic cells and these cells were subsequently matured overnight with lipopolysaccharide (LPS). Processing and presentation of ovalbumin epitopes on MHC class I molecules was then detected in a functional assay by co-culture of dendritic cells and ovalbumin-specific CD8 + T cells from the spleen of OT1 transgenic mice. OT1CD8 + T cells were pre-labeled with the fluorescent dye CFSE (which is diluted at every cell division and thus serves as an indicator of antigen-specific proliferation). Proliferation was assessed by flow cytometry after 5 days co-culture of CD8 + OT1 T cells and dendritic cells loaded with each of constructs 1 and 2 (FIG. 1).

構築物1および2に相当するポリペプチドは、OT1T細胞の増殖を同等に誘導することができた(CFSE希釈に基づき、93〜96%のT細胞が増殖した)。さらに、培養物中の細胞の生存率も類似していた(69〜75%)。最小T細胞エピトープに相当する合成ペプチド(SIINFEKL)を添加した陽性コントロール培養物に対して、この増殖は類似しており、生存率はより優れていた(図1C、1D)。また、OT1T細胞の単独培養または抗原を持たない樹状細胞との共培養の後に、生存OT1T細胞がほとんど検出されなかったので、増殖はオボアルブミン特異的でもあった(図1A、1B)。   Polypeptides corresponding to constructs 1 and 2 were able to induce OT1 T cell proliferation equally (93-96% T cells proliferated based on CFSE dilution). In addition, cell viability in culture was similar (69-75%). This growth was similar and the survival rate was better (FIG. 1C, 1D) relative to a positive control culture supplemented with a synthetic peptide corresponding to the minimal T cell epitope (SIINFEKL). In addition, proliferation was also ovalbumin-specific since few surviving OT1T cells were detected after OT1T cell single culture or co-culture with dendritic cells without antigen (FIGS. 1A, 1B).

実施例3:本発明のCPP1−OVAまたはCPP2−OVA融合ポリペプチドを使用したマウスのワクチン接種
よりストリンジェントな条件で抗原特異的CD8T細胞を刺激する構築物1および2に相当するポリペプチドの能力を試験するために、これらをワクチン接種プロトコルにおいてインビボで試験した(図2)。インビボ応答を誘発するためには、このポリペプチドワクチンは、注射された動物に天然に存在する抗原提示細胞によって取り込まれなければならず、かつ、オボアルブミン特異的T細胞がエクスビボで検出されることになっている場合、ポリクローナルT細胞の刺激は高効率でなければならない。これらの実験についての読み取りは、オボアルブミン特異的CD8T細胞を検出するためにMHC−ペプチド多量体を使用した、脾細胞のフローサイトメトリーで行った。
Example 3: Polypeptides corresponding to constructs 1 and 2 that stimulate antigen-specific CD8 + T cells under more stringent conditions than vaccination of mice using CPP1-OVA or CPP2-OVA fusion polypeptides of the invention To test their ability, they were tested in vivo in a vaccination protocol (Figure 2). In order to elicit an in vivo response, the polypeptide vaccine must be taken up by antigen presenting cells naturally present in the injected animal and ovalbumin-specific T cells are detected ex vivo. If so, polyclonal T cell stimulation must be highly efficient. Readings for these experiments were made by splenocyte flow cytometry using MHC-peptide multimers to detect ovalbumin-specific CD8 + T cells.

2回のみのワクチン接種にもかかわらず、オボアルブミン特異的CD8T細胞の比率の上昇が、2つのワクチン接種群について検出された(PBSでワクチン接種したマウス(陰性コントロール)の場合の0.18%と比較して、0.37〜1.14%のCD8T細胞が多量体陽性であった)。構築物2に相当するペプチドは、1%を超えるオボアルブミン特異的CD8T細胞を誘発したので、インビボで特に有効であった。 Despite only two vaccinations, an increase in the ratio of ovalbumin-specific CD8 + T cells was detected for the two vaccinated groups (0. 0 for mice vaccinated with PBS (negative control)). Compared to 18%, 0.37 to 1.14% of CD8 + T cells were multimer positive). The peptide corresponding to construct 2 was particularly effective in vivo as it induced more than 1% of ovalbumin-specific CD8 + T cells.

結論:全般的にこれらのデータは、細胞透過性ペプチドとしてのCPP1および2の機能性を確証するものである。これらのデータはまた、構築物1および2に相当するポリペプチド(それぞれが、これらの2つのCPPの各々およびオボアルブミンT細胞エピトープを含む)が樹状細胞に取り込まれ得ること、かつ、カーゴ分子(すなわち、構築物中に含まれるT細胞エピトープ)がインビトロでおよびインビボワクチン接種との関連で、CD8T細胞に交差提示されることを確証するものでもある。 Conclusion: Overall, these data confirm the functionality of CPP1 and 2 as cell penetrating peptides. These data also indicate that the polypeptides corresponding to constructs 1 and 2, each containing each of these two CPPs and the ovalbumin T cell epitope, can be taken up by dendritic cells and the cargo molecule ( That is, it also confirms that the T cell epitopes contained in the construct are cross-presented to CD8 + T cells in vitro and in the context of in vivo vaccination.

実施例4:本発明の異なるCPP−OVA融合ポリペプチドを使用したインビトロ形質導入実験
細胞内への形質導入を、CPP1、CPP2、CPP8、またはCPP10を含む異なるCPP−OVA融合ポリペプチドを用いてモニタリングした。オボアルブミン由来の免疫優性CD8T細胞エピトープと融合したこれらのCPPの各々を化学合成し、フルオレセインで標識した。5×10細胞を、0.9μMの異なる融合ポリペプチドとともに、37℃で2時間インキュベートした。試験した細胞は、ヒトリンパ球系細胞K562、マウスリンパ球系細胞EL4、ヒト星状細胞腫細胞U251およびマウス星状細胞腫細胞GL261であった。これらの細胞を酸緩衝液で洗浄して、膜に結合したペプチドをすべて除去し、生存率についてLive−Dead Yellowを用いて染色した。フローサイトメトリーによって分析を行った。蛍光の指標は、細胞の天然自己蛍光を超える蛍光のレベルを示す。これは、細胞単独とCPP−OVA融合ポリペプチドをロードした細胞との間の、フローサイトメトリーによって測定される平均蛍光指標の比である。
Example 4: In vitro transduction experiments using different CPP-OVA fusion polypeptides of the invention Monitoring transduction into cells using different CPP-OVA fusion polypeptides comprising CPP1, CPP2, CPP8, or CPP10. did. Each of these CPPs fused to an immunodominant CD8 + T cell epitope derived from ovalbumin was chemically synthesized and labeled with fluorescein. 5 × 10 5 cells were incubated for 2 hours at 37 ° C. with 0.9 μM of different fusion polypeptides. The cells tested were human lymphoid cell K562, mouse lymphoid cell EL4, human astrocytoma cell U251 and mouse astrocytoma cell GL261. These cells were washed with acid buffer to remove any peptide bound to the membrane and stained for viability using Live-Dead Yellow. Analysis was performed by flow cytometry. The indicator of fluorescence indicates a level of fluorescence that exceeds the cell's natural autofluorescence. This is the ratio of the average fluorescence index measured by flow cytometry between cells alone and cells loaded with CPP-OVA fusion polypeptide.

結果は表2に示される通りであった。

Figure 0006306593
The results were as shown in Table 2.
Figure 0006306593

全般的に、CPP−OVA融合ポリペプチドの毒性作用は観察されなかった。さらに、これらの結果は、試験したすべてのCPPが、ヒトまたはマウス起源の細胞を類似の効率で透過できることを実証している。   Overall, no toxic effects of the CPP-OVA fusion polypeptide were observed. Furthermore, these results demonstrate that all tested CPPs can permeate cells of human or mouse origin with similar efficiency.

実施例5:本発明の異なるCPP−OVA融合ポリペプチドを使用したマウスのインビボワクチン接種
この実験は、実施例3に記載されるように行った。
Example 5: In vivo vaccination of mice using different CPP-OVA fusion polypeptides of the invention This experiment was performed as described in Example 3.

オボアルブミンCD8エピトープ(配列番号3)に、そのCD8エピトープのN末端およびC末端部分にそれぞれ配列番号11および配列番号12のスペーサーを介して隣接して、表2に示すCPPの1つが融合されて含まれている、10nmolの融合ポリペプチドを用いて、一群あたり4〜8匹のマウスを、14日間隔で2回皮下にワクチン接種した。各CPP−OVA融合ポリペプチドを、PBS中100μgの抗CD40と共に注射した。50μgのポリ−ICを、2回目のワクチン接種の7日後に筋肉内注射した。五量体染色後のフローサイトメトリー分析によって、血液中の免疫応答をモニタリングした。 Ovalbumin CD8 + epitope (SEQ ID NO: 3) is fused with one of the CPPs shown in Table 2 adjacent to the N-terminal and C-terminal portions of the CD8 + epitope via spacers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively. With 10 nmol fusion polypeptide included, 4-8 mice per group were vaccinated subcutaneously twice at 14 day intervals. Each CPP-OVA fusion polypeptide was injected with 100 μg anti-CD40 in PBS. 50 μg of poly-IC was injected intramuscularly 7 days after the second vaccination. The immune response in the blood was monitored by flow cytometric analysis after pentamer staining.

これらの結果は、配列番号22のCPP14を含む参照のCPP−OVA融合ポリペプチドに対する増加倍数として、表3に示されるとおりであった。表2から分かるように、試験したすべてのCPP−OVA融合ポリペプチドは、CPP14を含む参照融合ポリペプチドよりも高い免疫原性を有していた(ただし、陰性コントロールを構成し、かつ、CPP14を含む参照融合ポリペプチドよりも低い免疫原性を有していた、配列番号21のCPP7を含む別の参照融合ポリペプチドを除いて)。

Figure 0006306593
These results were as shown in Table 3 as fold increase over the reference CPP-OVA fusion polypeptide comprising CPP14 of SEQ ID NO: 22. As can be seen from Table 2, all CPP-OVA fusion polypeptides tested had higher immunogenicity than the reference fusion polypeptide containing CPP14 (but constitute a negative control and CPP14 Except for another reference fusion polypeptide comprising CPP7 of SEQ ID NO: 21, which had a lower immunogenicity than the containing reference fusion polypeptide).
Figure 0006306593

CPP7は、Zebraの178〜185位にわたる、Zebraの8アミノ酸長フラグメントである。   CPP7 is an 8-amino acid long fragment of Zebra that spans positions 178-185 of Zebra.

CPP14は、Zebraの178〜219位にわたる、Zebraの42アミノ酸長フラグメントである。   CPP14 is a 42 amino acid long fragment of Zebra that spans positions 178-219 of Zebra.

結論:総合すれば、実施例4および5の結果は、本発明の様々なCPPが、ヒトまたはマウス起源の細胞を透過できること、ならびにそのようなCPPによって運ばれたカーゴ分子が、CD8T細胞に交差提示される(すなわち、輸送されたカーゴ分子に特異的な免疫応答を誘導する)ので、ワクチン接種および免疫療法に有用性があることを示している。 Conclusion: Taken together, the results of Examples 4 and 5 show that the various CPPs of the present invention can penetrate cells of human or mouse origin, and that the cargo molecules carried by such CPPs are CD8 + T cells. Have been shown to be useful in vaccination and immunotherapy (ie, induce an immune response specific to the transported cargo molecule).

配列表
CPP1:(全17個のアミノ酸)
配列番号1:KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2:(全30個のアミノ酸)
配列番号2:KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
オボアルブミンCD8エピトープ(全8個のアミノ酸)
配列番号3:SIINFEKL
CPP−OVA融合ポリペプチド:
構築物1:オボアルブミンCD8エピトープに融合されたCPP1を含む(全33個のアミノ酸)
配列番号4:KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
構築物2:オボアルブミンCD8エピトープに融合されたCPP2を含む(全46個のアミノ酸)
配列番号5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
人工配列
配列番号6:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
は、K、R、またはHであり
は、R、K、またはHであり
は、Y、W、またはFであり
は、K、R、またはHであり
は、NまたはQであり
は、R、K、またはHであり
は、V、I、M、L、F、またはAであり
は、A、V、L、I、またはGであり
は、SまたはTであり
10は、R、K、またはHであり
11は、K、R、またはHであり
13は、R、K、またはHであり
14は、A、V、L、I、またはGであり
15は、K、R、またはHであり
16は、F、L、V、I、Y、W、またはMであり
17は、K、R、またはHである。
人工配列
配列番号7:X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
は、KまたはRであり
は、RまたはKであり
は、Y、W、またはFであり
は、KまたはRであり
は、NまたはQであり
は、RまたはKであり
は、V、I、MまたはLであり
は、AまたはGであり
は、SまたはTであり
10は、RまたはKであり
11は、KまたはRであり
13は、RまたはKであり
14は、AまたはGであり
15は、KまたはRであり
16は、F、Y、またはWであり
17は、KまたはRである。
CPP8:(全15個のアミノ酸)
配列番号8:QHYREVAAAKSSEND
CPP10:(全19個のアミノ酸)
配列番号9:REVAAAKSSENDRLRLLLK
CPP11:(全25個のアミノ酸)
配列番号10:QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
スペーサー(人工配列)
配列番号11:EQLE
配列番号12:TEWT
人工配列(全21個のアミノ酸)
配列番号13:LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQ
人工配列(全21個のアミノ酸)
配列番号14:SELEIKRYKNRVASRKCRAKF
エンテロキナーゼ標的部位
配列番号15:DDDK
第Xa因子標的部位
配列番号16:IEDGR
トロンビン標的部位
配列番号17:LVPRGS
プロテアーゼTEV標的部位
配列番号18:ENLYFQG
PreScissionプロテアーゼ標的部位
配列番号19:LEVLFQGP
フューリン標的部位
配列番号20:RX2X3R
は、任意のアミノ酸であり
は、RまたはKである。
CPP7(全8個のアミノ酸)
配列番号21:KRYKNRVA
CPP14(全42個のアミノ酸)
配列番号22:KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
ZEBRAアミノ酸配列(エプスタイン・バーウイルス(EBV)由来の天然配列) (YP_401673)
配列番号23:
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
Sequence Listing CPP1: (17 total amino acids)
Sequence number 1: KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP2: (all 30 amino acids)
Sequence number 2: KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
Ovalbumin CD8 epitope (all 8 amino acids)
Sequence number 3: SIINFEKL
CPP-OVA fusion polypeptide:
Construct 1: contains CPP1 fused to ovalbumin CD8 epitope (33 amino acids total)
Sequence number 4: KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
Construct 2: contains CPP2 fused to ovalbumin CD8 epitope (total 46 amino acids)
SEQ ID NO: 5:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
Artificial sequence SEQ ID NO: 6: X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 SX 13 X 14 X 15 X 16 X 17
X 1 is K, R, or H, X 2 is R, K, or H, X 3 is Y, W, or F, and X 4 is K, R, or H, X 5 Is N or Q, X 6 is R, K, or H and X 7 is V, I, M, L, F, or A and X 8 is A, V, L, I, or X is G, X 9 is S or T, X 10 is R, K, or H, X 11 is K, R, or H, X 13 is R, K, or H, and X 14 Is A, V, L, I, or G, X 15 is K, R, or H and X 16 is F, L, V, I, Y, W, or M and X 17 is K, R, or H.
Artificial sequence SEQ ID NO: 7: X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 SX 13 X 14 X 15 X 16 X 17
X 1 is K or R, X 2 is R or K, X 3 is Y, W, or F, X 4 is K or R, X 5 is N or Q, and X 6 Is R or K, X 7 is V, I, M or L, X 8 is A or G, X 9 is S or T, X 10 is R or K, and X 11 is , K or R and X 13 is R or K and X 14 is A or G and X 15 is K or R and X 16 is F, Y or W and X 17 is K Or R.
CPP8: (15 total amino acids)
Sequence number 8: QHYREVAAAKSSEND
CPP10: (total 19 amino acids)
Sequence number 9: REVAAAKSSENDRLRLLLK
CPP11: (all 25 amino acids)
SEQ ID NO: 10: QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
Spacer (artificial arrangement)
SEQ ID NO: 11: EQLE
Sequence number 12: TEWT
Artificial sequence (all 21 amino acids)
SEQ ID NO: 13: LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQ
Artificial sequence (all 21 amino acids)
Sequence number 14: SELEIKRYKNRVASRKCRAKF
Enterokinase target site SEQ ID NO: 15: DDDK
Factor Xa target site SEQ ID NO: 16: IEDGR
Thrombin target site SEQ ID NO: 17: LVPRGS
Protease TEV target site SEQ ID NO: 18: ENLYFQG
PreScission protease target site SEQ ID NO: 19: LEVLFQGP
Furin target site
Sequence number 20: RX 2 X 3 R
X 2 is any amino acid and X 3 is R or K.
CPP7 (8 amino acids in total)
SEQ ID NO: 21: KRYKNRVA
CPP14 (42 amino acids in total)
Sequence number 22: KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
ZEBRA amino acid sequence (natural sequence derived from Epstein-Barr virus (EBV)) (YP — 401673)
SEQ ID NO: 23
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPKKRT

Claims (19)

列番号1または配列番号2を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド。 SEQ ID NO 1 or that having a amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 cells penetrating peptide. (1)配列番号1または配列番号2を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドと、
(2)カーゴ分子であって、(i)ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、(ii)多糖、(iii)脂質、(iv)リポタンパク質、(v)糖脂質、および(vi)核酸からなる群から選択され、ここで前記(i)のカーゴ分子が病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープを含んでなるものである、カーゴ分子と
を含んでなる、複合体。
(1) a cell-penetrating peptide having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ,
(2) a cargo molecule, the group consisting of (i) a peptide, polypeptide or protein, (ii) a polysaccharide, (iii) a lipid, (iv) a lipoprotein, (v) a glycolipid, and (vi) a nucleic acid Wherein the cargo molecule of (i) comprises a pathogen epitope and / or a tumor epitope.
前記細胞透過性ペプチドが、MHCクラスIおよび/またはMHCクラスIIと関連して、細胞表面での前記カーゴ分子のエピトープの提示を促進する、請求項に記載の複合体。 The complex of claim 2 , wherein the cell penetrating peptide facilitates presentation of epitopes of the cargo molecule on the cell surface in association with MHC class I and / or MHC class II. (1)配列番号1または配列番号2を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド、または
(2)病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなるアミノ酸複合体
をコードする、核酸。
(1) a cell penetrating peptide having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 , or (2) covalently linked to a peptide, polypeptide or protein cargo molecule comprising a pathogen epitope and / or a tumor epitope A nucleic acid encoding an amino acid complex comprising the cell-penetrating peptide.
請求項に記載の核酸を含んでなる、ベクター。 A vector comprising the nucleic acid according to claim 4 . 請求項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。 A host cell comprising the vector of claim 5 . 請求項1に記載の細胞透過性ペプチドを調製する方法であって、前記細胞透過性ペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主細胞を培地中で培養すること、および前記ペプチドを培地からかまたは宿主細胞溶解後の宿主細胞溶解物から分離することを含んでなる、方法。   A method for preparing a cell permeable peptide according to claim 1, wherein a host cell comprising a vector comprising a nucleic acid encoding the cell permeable peptide is cultured in a medium, and the peptide is removed from the medium. Or separating from the host cell lysate after host cell lysis. 請求項に記載の複合体をロードした、単離された細胞。 An isolated cell loaded with the complex of claim 2 . 前記細胞が抗原提示細胞である、請求項に記載の細胞。 The cell according to claim 8 , wherein the cell is an antigen-presenting cell. 以下の少なくとも1つを含んでなる、組成物:
(a)配列番号1または配列番号2を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド、
(b)(1)配列番号1または配列番号2を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドと、
(2)カーゴ分子であって、(i)ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、(ii)多糖、(iii)脂質、(iv)リポタンパク質、(v)糖脂質、および(vi)核酸からなる群から選択され、ここで前記(i)のカーゴ分子が病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープから選択される、カーゴ分子と
を含んでなる複合体、
(c)前記(a)の細胞透過性ペプチドまたは前記(b)の複合体(ここで、前記(b)(2)のカーゴ分子が、前記(b)(1)の細胞透過性ペプチドに共有結合している病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質カーゴ分子である)をコードする核酸、
(d)前記(c)の核酸を含んでなるベクター、
(e)前記(d)のベクターを含んでなる宿主細胞、
(f)前記(b)の複合体をロードした細胞。
A composition comprising at least one of the following:
(A) a cell-permeable peptide having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ,
(B) (1) a cell-penetrating peptide having an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 ,
(2) a cargo molecule, the group consisting of (i) a peptide, polypeptide or protein, (ii) a polysaccharide, (iii) a lipid, (iv) a lipoprotein, (v) a glycolipid, and (vi) a nucleic acid A complex comprising a cargo molecule, wherein the cargo molecule of (i) is selected from pathogen epitopes and / or tumor epitopes,
(C) The cell-permeable peptide of (a) or the complex of (b) (where the cargo molecules of (b) and (2) are shared by the cell-permeable peptide of (b) and (1) A nucleic acid encoding a peptide, polypeptide or protein cargo molecule comprising a pathogen epitope and / or a tumor epitope to which it is bound,
(D) a vector comprising the nucleic acid of (c) above,
(E) a host cell comprising the vector of (d),
(F) A cell loaded with the complex of (b).
(a)請求項1に記載の少なくとも1つの細胞透過性ペプチド、および
(b)医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。
A pharmaceutical composition comprising (a) at least one cell-penetrating peptide according to claim 1, and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
(a)請求項に記載の少なくとも1つの複合体、および
(b)医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。
A pharmaceutical composition comprising (a) at least one complex according to claim 2 , and (b) at least a pharmaceutically acceptable carrier.
前記組成物が、少なくとも2つの異なる複合体を含んでなる、請求項12に記載の医薬組成物。 13. A pharmaceutical composition according to claim 12 , wherein the composition comprises at least two different complexes. 癌、感染症、自己免疫疾患、および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するための、請求項に記載の複合体。 3. A complex according to claim 2 for use in the treatment of diseases or disorders including cancer, infectious diseases, autoimmune diseases and graft rejection. 癌、感染症、自己免疫疾患、および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するための、請求項に記載の細胞。 9. The cell of claim 8 , for use in the treatment of a disease or disorder comprising cancer, infection, autoimmune disease, and graft rejection. インビトロで細胞内にカーゴ分子を送達するための方法であって、
a)請求項1に記載の細胞透過性ペプチドと細胞内に送達されるべきカーゴ分子との複合体を形成し、そして
b)前記細胞を、工程a)で形成された複合体と接触させること
を含んでなる、方法。
A method for delivering a cargo molecule into a cell in vitro, comprising:
a) forming a complex between the cell penetrating peptide of claim 1 and a cargo molecule to be delivered into the cell, and b) contacting the cell with the complex formed in step a). Comprising a method.
分離された細胞透過性ペプチドが、病原体エピトープおよび/または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパクに共有結合しているものである、請求項に記載の方法。 8. The method of claim 7 , wherein the separated cell penetrating peptide is covalently linked to a peptide, polypeptide or protein comprising a pathogen epitope and / or a tumor epitope. (a)請求項に記載の少なくとも1つの宿主細胞、および
(b)医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。
A pharmaceutical composition comprising (a) at least one host cell according to claim 6 , and (b) at least a pharmaceutically acceptable carrier.
(a)請求項に記載の複合体を含んでなる少なくとも一つの宿主細胞、および
(b)医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。
A pharmaceutical composition comprising (a) at least one host cell comprising the complex of claim 2 , and (b) at least a pharmaceutically acceptable carrier.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9187534B2 (en) * 2011-03-11 2015-11-17 Universite De Geneve Multi-epitopic vaccine
CN105579464B (en) * 2013-08-07 2021-01-26 耶达研究及发展有限公司 Peptides capable of reactivating p53 mutants
US10131690B2 (en) 2014-04-25 2018-11-20 Phi Pharma Sa C6S specific transporter molecules
KR101835554B1 (en) 2014-06-24 2018-04-19 서울대학교 산학협력단 Composition comprising C/EBF for promoting differentiation or stability of induced regulatroy T cell and method therefor
US10316061B2 (en) 2014-10-02 2019-06-11 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of cell penetrating peptides for drug delivery and stem cell applications
CA2970211A1 (en) * 2014-12-10 2016-06-16 Vaxsia Biomedical Inc. Novel protein structure produced by effective antibody used for immunization
WO2016146143A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
LT3429618T (en) 2016-03-16 2024-05-10 Amal Therapeutics Sa Combination of an immune checkpoint modulator and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist for use in medicine
WO2017176081A1 (en) * 2016-04-07 2017-10-12 (주)네오리젠바이오텍 Cell-penetrating peptide
KR101799805B1 (en) * 2016-04-07 2017-11-21 (주)네오리젠바이오텍 Cell-penetrating peptide
IL265479B (en) 2016-09-21 2022-09-01 Amal Therapeutics Sa A fusion containing a cell-penetrating peptide, a multiple epitope, and a peptide tlr agonist for cancer therapy
CN106544351B (en) * 2016-12-08 2019-09-10 江苏省农业科学院 CRISPR-Cas9 knock out in vitro drug resistant gene mcr-1 method and its dedicated cell-penetrating peptides
EP3360891B1 (en) 2017-02-14 2022-03-30 Karlsruher Institut für Technologie Cell penetrating peptides of human origin
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
CA3066077A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Adrx, Inc. Tau aggregation inhibitors
WO2019036725A2 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Adrx, Inc. Tau aggregation peptide inhibitors
CN108070025B (en) * 2017-10-24 2019-11-19 中山大学附属口腔医院 A kind of application of cell-penetrating peptides and cell-penetrating peptide complexes and the two
JP7640976B2 (en) 2019-12-31 2025-03-06 シァメン・ユニヴァーシティ Multimerized delivery systems for intracellular delivery of molecules
WO2022079175A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of a sting agonist and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist
FR3143031A1 (en) * 2022-12-08 2024-06-14 Université Grenoble Alpes New peptides and their use as transporters for the internalization of molecules of interest into target cells

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
FR2728904B1 (en) 1995-01-04 1997-03-14 Pasteur Institut PEPTIDE REAGENT FOR DETECTING PRIMARY INFECTION WITH EPSTEIN-BARR VIRUS BY SEARCHING CORRESPONDING ANTIBODIES, AND METHOD OF USING THE SAME
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US6750008B1 (en) 1999-07-09 2004-06-15 Trimeris, Inc. Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission
US20060222656A1 (en) 2005-04-01 2006-10-05 University Of Maryland, Baltimore MAGE-A3/HPV 16 peptide vaccines for head and neck cancer
EP1279404A1 (en) * 2001-07-26 2003-01-29 Istituto Superiore di Sanità Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
GB0519303D0 (en) 2005-09-21 2005-11-02 Oxford Biomedica Ltd Chemo-immunotherapy method
US9127077B2 (en) 2009-09-23 2015-09-08 L'universite Paris Descartes Polypeptides and nucleic acids for treating ErbB2-dependent cancers
WO2011101332A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma
WO2011135222A2 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Universite Joseph Fourier Use of peptides as transporters intended for the internalization of molecules of interest into target cells
EP3511013B1 (en) 2010-08-24 2022-09-07 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Interleukin-13 receptor alpha 2 peptide-based brain cancer vaccines
US9187534B2 (en) 2011-03-11 2015-11-17 Universite De Geneve Multi-epitopic vaccine

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