JP6299660B2

JP6299660B2 - 菌叢解析方法と菌叢解析用デバイス

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Publication number: JP6299660B2
Application number: JP2015089562A
Authority: JP
Inventors: 宏之大島; あい野澤
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2014-05-12
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2018-03-28
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: JP2020188799A; JP2015231362A; JP2018086016A; JP7040562B2

Description

本発明は、菌叢解析用デバイス及びそれを用いた菌叢の解析方法に関する。

サンプル中に含まれる細菌の菌種の同定や定量結果は、環境や動植物の健康状態等を評価する指標として有用であり、感染症診断を含めて今日さまざまな応用例がある。
このような評価方法としては、実際に顕微鏡などでサンプル中に含まれる細菌を個々に観察し、形態等から細菌の菌種を同定し、各々の細菌について直接的に数を数える方法が挙げられる。場合によっては、選択培地等を用いて細菌をスクリーニングすることで同定効率を向上させることもある。

また、細菌の合成するタンパク質を当該タンパク質に特異的な抗体を利用して検出する方法や、代謝産物を質量分析機器にて検出する方法がある。
最も迅速性に優れ、汎用的に使われている技術は、ＰＣＲやＬＡＭＰ法といった分子生物学的な核酸増幅技術や、インベーダー法等のシグナル増幅技術である。これらの手法により、検出対象細菌がもつ特異的な配列の核酸を選択的増幅し検出する方法は、広く利用されている（特許文献１、２）。

一方で、サンプル中に含まれる細菌群、いわゆる菌叢を包括的に解析する技術についても環境評価や診断等の分野での応用を目指した研究が多くなされている。例えば、検出対象となる細菌に共通した核酸配列を基に当該核酸を非選択的に増幅し、その後制限酵素処理でフラグメント解析したり、クローニングしてシーケンサー等による配列決定をしたり、もしくは当該増幅配列内における特異的な配列とのハイブリダイゼーションによる同定したりすることなどが挙げられる。これらのために電気泳動装置や、ＤＮＡチップ等のハイスループットなデバイスを用いることもある（特許文献３、４）。

特開２００４−５７０５９号公報特開２００７−２４４３４９号公報特開２００４−２９０１７１号公報特許第５１３９６２０号公報

環境中に存在する細菌叢、例えば腸内細菌、皮膚の常在菌、口内細菌、土壌中に含まれる細菌、活性汚泥中に含まれる細菌などは、多種類の細菌が相互に影響しつつ、その存在する環境自体にも大きな影響を与えている。
これらの菌叢を解析する場合、培養を用いた方法では時間がかかるし、多種類の細菌から構成される一部の細菌のみしか検出できない恐れがある。また、培養前と培養後で菌叢が異なる可能性も考えられる。抗原抗体反応や質量分析を用いた方法は、特異的な抗体のない細菌や、事前に当該細菌に特徴的なタンパク質や代謝物等が明らかでない細菌が存在する場合は適用が困難なので、検出できる細菌の種類が限られる。

例えば、菌叢に含まれる多種類の細菌を一括評価するために、PCR等の増幅手段によって菌叢中に含まれる核酸を一括増幅し、ＤＮＡチップ等によってプローブとのハイブリダイゼーションの特異性を基に個々の細菌を選別し、定性的に評価することは可能であるが、網羅的なアレイであったとしても、菌叢の中に未知の細菌が存在する可能性を考慮する
と、全体としての菌の量を定量的に評価する評価することは困難であった。また、プローブのハイブリダイゼーション効率も個々に異なることから、定量的に評価することは困難であった。

そこで本発明は、菌叢を定量的に評価するための菌叢解析方法及びその方法に用いるデバイスを提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブと、総量指標プローブ及び/又は絶対量指標プローブとを使用することにより菌叢を解析し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したデバイスである。
（ａ）検出の対象となる１種又は２種以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ

本発明のデバイスにおいて、プローブ（ｂ）は、前述した検出の対象となる１種又は２種以上の細菌が共通に有する塩基配列を含むものであることが好ましい。また、プローブ（ｃ）は、所定の外部添加コントロール１と、当該外部添加コントロール１とは異なる少なくとも１種類の外部コントロール２との混合物であって、前記外部添加コントロール１に対し外部添加コントロール２が２のｎ乗倍（ｎは任意の整数）の濃度比で混合されている混合物中に含まれるものであることが好ましい。

ここで、検出の対象となる細菌は、例えば、腸内細菌、皮膚の常在菌、及び口内細菌などが挙げられる。
腸内細菌としては、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｅｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌のうちの少なくとも１種が挙げられる。
皮膚の常在菌としては、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌のうちの少なくとも１種が挙げられる。
口内細菌としては、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌うちの少なくとも１種が挙げられる。
また、口内細菌としては、より具体的には、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓｂｖ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｐａｒｖｕｌａ、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＩＩ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓｎｏｘｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓのうちの少なくとも１種が挙げられる。

また本発明のデバイスにおいて、プローブ（ａ）は、好ましくは以下のいずれかの配列が挙げられる。
（ア）配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列
（イ）（ア）の相補配列
（ウ）（ア）又は（イ）の配列と実質的に同一の配列
また、本発明のデバイスは、繊維型マイクロアレイとすることができる。

さらに、本発明は、以下の工程を含む、検出対象菌種の絶対量を推定する方法である。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程

増幅産物の配列中に、菌種特異的なプローブと、総量指標プローブもしくは絶対量指標プローブのいずれか一方、もしくは両方を搭載したデバイスを用いることで、菌叢中の複数の菌を一括に絶対定量が可能となる。また、サンプル中に含まれる菌の総量も定量可能である。

以下本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１４−０９８７１９号（２０１４年５月１２日出願）の明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。

本発明の検出対象菌種の絶対量を推定する方法（絶対量推定方法）は、以下の工程を含む。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程

ここで本発明の絶対量推定方法に使用することができるデバイスは、
以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）及び（ｃ）の少なくとも一方のプローブとを搭載したデバイスである。
（ａ）検出の対象となる複数種類の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）総量指標プローブ
（ｃ）１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ

デバイス
プローブが独立にかつ位置を特定できるように固定化されているアレイタイプのデバイスであればどのような種類のデバイスであっても使用可能である。アレイのタイプも特に限定されないが、後述の総量指標プローブでのシグナルを安定的に取得する目的からすると、単に平面基板上にプローブを固定化しているものよりも、プローブ固定化量の多いアレイが適している。このようなアレイとしては、ＤＮＡマイクロアレイ好ましい。特に、ゲルを介して三次元的にプローブを固定化する繊維型ＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。デバイスについて、その支持体の形態は特には限定されず、平板、棒状、ビーズ等のいずれの形態も使用できる。支持体として、平板を使用する場合は、その平板上に、所定の間隔をもって、所定のプローブを種類毎に固定することができる（スポッティング法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０，４６７−４７０（１９９５）等参照）。また、平板上の特定の位置で、所定のプローブを種類毎に逐次合成していくこともできる（フォトリソグラフィー法等；Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１，７６７−７７３（１９９１）等参照）。

他の好ましい支持体の形態としては、中空繊維を使用するものが挙げられる。支持体として中空繊維を使用する場合は、オリゴヌクレオチドプローブを種類毎に各中空繊維に固定し、すべての中空繊維を集束させ固定した後、繊維の長手方向で切断を繰り返すことにより得られるデバイスが好ましく例示できる。このデバイスは、貫通孔基板にオリゴヌクレオチドプローブを固定化したタイプのものと説明することができる（特許第３５１０８８２号公報等を参照、図１）。

支持体へのプローブの固定化方法は特には限定されず、どのような結合様式でもよい。また、支持体に直接固定化することに限定はされず、例えば、予め支持体をポリリジン等のポリマーでコーティング処理し、処理後の支持体にプローブを固定することもできる。さらに、支持体として中空繊維等の管状体を使用する場合は、管状体にゲル状物を保持させ、そのゲル状物にプローブを固定化することもできる。

プローブ
本明細書では、細菌由来の核酸をハイブリダイゼーション反応により捕捉し、捕捉された核酸を蛍光や化学発光、着色、ＲＩ等で測定し、細菌の有無を判別することや量を測定することを検出と呼ぶ。
プローブは検出対象となる細菌の持つ核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉するものであり、当該捕捉対象核酸に特異的な配列の相補配列から構成されるオリゴＤＮＡが用いられることが多いが、捕捉対象核酸に特異的な配列とハイブリダイゼーションするものであれば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＰＮＡやＬＮＡなどを含んでいてもよい。用途に応じてｃＤＮＡを固定化する場合もある。

一般的に多種類のプローブを一括搭載しているデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を使用する場合、多種類のプローブを同一条件下でハイブリダイゼーション反応に供するため、プローブ間のハイブリダイゼーション効率を揃えることが重要となる。このような目的のため、プローブは設計時にＧＣ含量や配列長を調整し、Ｔｍ値を可能な範囲で一定に揃える必要がある。デバイスに搭載されるプローブの種類や数は特に限定されない。

細菌特異的プローブ（前記プローブ（ａ））は、鋳型となる塩基配列又はプローブの塩基配列中に、細菌の種類によって特異的な塩基配列を含むものである。

デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に対してサンプルをハイブリダイゼーションさせる際、多くの場合は検出感度を向上させ、検出可能な標識を付加するために、ＰＣＲやＬＡＭＰ法などの核酸増幅手法を適用する。増幅反応においては、後の工程におけるデバイスとのハイブリダイゼーションに必要な範囲を増幅させることが重要であり、ハイブリダイゼーションに必要でない部分は試薬コスト等の観点からなるべく増幅させないことが望ましい。

上述のＰＣＲ法では、プライマー対で挟まれた範囲のみを増幅するため、ハイブリダイゼーションに不必要な配列を除外した上で増幅反応を行うのに適している。ここで「対」とは、増幅反応に最低限必要なプライマーのセットであり、その種類は増幅反応の方法によって異なる場合がある。一般的なＰＣＲの場合は、プライマー対はフォワードプライマーとリバースプライマーの２種類のオリゴＤＮＡから構成される。

特定のプライマーとは、増幅対象配列が限定されるという意味であり、プライマー対は必ずしも１対である必要はない。必要に応じて2対以上のプライマー対を用いるマルチプレックス手法も適用できる。例えば、細菌増幅用プライマー対（配列番号１、２）や、外部添加コントロール用プライマー対（配列番号９１、９２）を利用することが可能である。

上記のようなデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて菌叢解析を行うに際しては、用途は特に限定されない。健康状態の検査・診断的な用途であれば、腸内細菌叢、口内細菌叢、皮膚の常在菌などが考えられる。また、環境検査的な用途であれば土壌中の細菌叢、水処理における活性汚泥等に活用が可能である。

これらの中で、腸内細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｅｉｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌などを、検出対象菌種とすることができる。

皮膚の常在菌の評価を行う場合は、例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌（例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属細菌などを、検出対象菌種とすることができる。

口内細菌叢の評価を行う場合は、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、及びＣａｎｄｉｄａ属の細菌などを、検出対象菌種とすることができる。より具体的には、例えば、現在歯周病や虫歯や日和見感染に関連していると考えられる、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｈａｇｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｃｅｓｃｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｈｏｗａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓｍｉｃｒａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｎｃｉｓｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｏｃｈｒａｃｅａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐｕｔｉｇｅｎａ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓｂｖ２、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｐａｒｖｕｌａ、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＩＩ、及びＳｅｌｅｎｏｍｏｎａｓｎｏｘｉａなどの細菌を検出対象菌種とすることが好ましく、より好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａであり、特に好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓである。

これらについては、例えば、後述の表１に示すプライマー（配列番号１、２）を用いて増幅する場合、配列番号３〜５９に記載の配列をプローブとすることが可能である。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列を用いることが好ましい。配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列であってもよく、配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列と実質的に同一の配列又は配列番号３〜５９に示される塩基配列から選ばれる少なくとも２つの配列の相補配列と実質的に同一の配列であってもよい。

ここで、実質的に同一とは、配列番号３〜５９に記載の配列又は相補配列に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
プローブの長さとしては、例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ＳａｌｉｎｅＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。

これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

総量指標プローブ（前記プローブ（ｂ））
デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載するプローブの種類がどれだけ多くても、被検試料の中には、未同定の細菌が混在する可能性が高く、増幅される核酸の中には、特異的なプローブが搭載されていない検出対象ではない細菌（「非検出対象細菌」という）由来の核酸が存在する。
従って、すべての細菌を検出対象細菌として検出することは困難であり、菌叢を解析する上では、検出対象細菌が、非検出対象細菌を含む全体の細菌叢の中でどの程度の割合であるのか、また、そもそもサンプル中にどれくらいの量の細菌が存在しているのかといった観点から細菌の総量を評価することもきわめて重要となる。

非検出対象細菌は、(i)正体は分かっているが検出対象としなくてもよい細菌、及び(ii)存在や種類が不明である細菌の和として理解できる。その一方で、(ii)については存在も不可知で特異的な配列も不明であるため、必ずしも実際に検出できるとは限らない。このため、(ii)の中でも、増幅できた菌については非検出対象細菌を含むすべての検出対象細菌とする。増幅できた菌については必ずプライマー配列に対する相補配列を持っているので、プライマーと同じ配列をもつプローブに対してハイブリすることができる。

従って、本発明において全ての検出対象細菌とは特定のプライマー対で増幅できた細菌を意味する。
このような細菌の総量を評価するに際しては、例えば、デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）とは独立に細菌数を測定することも可能である。この場合、デバイス中に細菌の総量の指標となるプローブを搭載しておくことが操作の簡便性を向上させる観点から有利となる。プローブについては、プライマー対によって増幅される塩基配列の中から、多種類の菌種に共通な塩基配列を使用してもよい。そのような配列が見つからない場合は、比較的共通な配列を複数設計し、それらを総合的に判断することで総量指標プローブとしてもよい。総量指標プローブは、好ましくは、被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にハイブリダイズするプローブ、詳しくは、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列を含むプローブである。

総量指標は、個々の菌種特異的な増幅産物の合計量を表すため、一般的に量が多くなることから、シグナル強度が頭打ち（検出できるシグナル強度の許容範囲を超えるシグナルが出てしまうこと）になりやすい。

そのような状況を防ぐためには、個々の菌種特異的な増幅産物を捕捉するプローブに比較して、ハイブリダイゼーション効率を落とすことで対応が可能である。ＰＣＲを実施するに際しては、二種類のオリゴＤＮＡを一つのプライマー対とし、そのうちの一方を蛍光標識し、他方を基本的に無標識として使用する。例えば無標識の方のオリゴＤＮＡと同じものをプローブとして用いると、増幅された全ＰＣＲ産物がハイブリダイゼーションすることになるので、このハイブリダイゼーションシグナルを測定する。プローブを設計する際には、例えば当該プローブのＴｍ値を低くする。具体的にはＧＣ含量を少なくすることや、プローブの配列長自体を短くする方法が考えられる。

また、ハイブリダイゼーションに際して、増幅された核酸と総量指標プローブとのハイブリダイゼーションに対して競合的に作用するような核酸を添加することで、シグナル強度の低減化を図ることが可能である。このような核酸としては、例えば、総量指標プローブと（部分的に）同じ配列を有する核酸、あるいは総量指標プローブの相補配列を（部分的に）有する核酸などが挙げられる。

一方で、プライマー対と同じもしくは一部同じ配列を総量指標プローブとすることも可能である。例えば、フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、リバースプライマーを構成する配列の全部もしくは一部を含むプローブを使用することで、増幅産物の総量を評価することが可能となる。

フォワードプライマーに蛍光標識がなされている場合、フォワードプライマーから伸長した側の鎖をハイブリダイゼーションに供してシグナル検出する。この場合、上記同様、当該プローブの捕捉対象となる増幅産物の多さから、シグナル強度が頭打ちすることが懸念されるが、上記と同様にプローブの長さやＧＣ含量を調整することでその影響を抑えることが可能である。

ハイブリダイゼーション効率係数
本明細書において、ハイブリダイゼーション効率係数とは、各菌種におけるプローブのシグナル強度から、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率係数を算出する。複数の細菌に対してハイブリダイゼーションを形成するプローブについてはその平均値をハイブリダイゼーション効率係数とする。

外部添加コントロール
本明細書において、外部添加コントロールとは、被検サンプル中に含まれる細菌のＤＮＡが増幅されないように人工的に設計された核酸を意味する。増幅反応やハイブリダイゼーション反応の前に、サンプル中に一定量添加する核酸である。外部添加コントロールは、通常の増幅反応を行えば増幅反応が確実に行われる核酸であり、いわゆる陽性コントロールとしての役割を果たす。従って、外部添加コントロールに特異的なプローブをデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載しておけば、その検出結果から、増幅反応やハイブリダイゼーション等が適切に実施されたかを評価することができる。

また、外部添加コントロールを複数設計し、それぞれについて濃度を変えた混合物を使用すれば、当該濃度に対する検出結果、例えば蛍光強度との対応付けにより、サンプル中に含まれる細菌やその総量を定量することが可能である。
外部添加コントロールを増幅反応前に添加するのであれば、上記特定のプライマー対にて増幅される核酸であること、すなわちプライマー対と相補な塩基配列を所持していること、かつ、ハイブリダイゼーションで検出するためには、検出対象細菌、非検出対象細菌いずれにおいても所持していない塩基配列を所持している必要がある。

外部添加コントロールの設計
例えば、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ社のソフトウェアー「ＥＸＣＥＬ」のＲＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を使用し、１から４までの整数をランダムにＸ個（Ｘは任意の数）発生させ、それをつなげて１から４までの数値のみから構成されるＸ桁の数値とし、１をＡ、２をＴ、３をＣ、４をＧと置き換えることにより、ＡＴＧＣのＸ塩基によるランダム配列を多数得ることができる。これらの配列につき、ＧとＴの和がＡとＴの和と同数になる配列のみを抜粋し、抜粋された配列を、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに対してＢｌａｓｔ検索し、類似配列の少ないものを選抜し、配列の両末端にプライマー配列を付加することで、設計可能である。また、設計された配列を適宜連結させて長くしたり、部分的に除去して短くすることも可能である。外部添加コントロールを複数用いて検出対象細菌等を定量する場合、増幅反応時における反応効率をなるべく一定にするために、検出対象細菌にて増幅される塩基長と大きな差のないようにすることが望ましい。例えば、検出対象細菌の増幅産物が５００ｂｐ程度となるのであれば、外部添加コントロールの増幅産物は３００ｂｐから１０００ｂｐ程度とすることが望ましい。一方で、増幅後に電気泳動等で増幅鎖長を確認する場合においては、検出対象細菌とは異なる長さの増幅産物となるように設計した上で、外部添加コントロール由来の増幅産物を検出対象細菌のバンドとは異なる位置で検出し、ハイブリダイゼーションの前に増幅反応の成否を確認することも可能である。

また、外部添加コントロールを複数使用する場合においては、各外部添加コントロール間においては、プローブによって捕捉される配列やその付近以外は同じ塩基配列で構成されることが望ましい。

外部添加コントロールを添加したうえで増幅反応をＰＣＲ等で実施する場合
１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ（前記プローブ（ｃ））は、特定のプライマー対を用いて増幅されたプローブであって被検試料に含まれる細菌に由来する核酸にはいずれもハイブリダイズせず、コントロールとして作製した外部添加コントロール核酸にハイブリダイズするプローブである。
絶対量指標プローブは、所定の外部添加コントロール１と、当該外部添加コントロール１とは異なる少なくとも１種類の外部添加コントロール２との混合物に含まれている。この場合、外部添加コントロール２は、外部添加コントロール１に対し２のｎ乗（ｎは任意の整数）の濃度比で混合されている。これはＰＣＲ自体がnサイクル後に２n倍の増幅産物量となるためである。外部添加コントロールの種類は２種類以上であるが、５０種類以下であることが好ましい。

またデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）のダイナミックレンジが１０^４程度で
あることを考慮すると、濃度段階を２^ｎ倍のステップで１５種類用意すれば２^１５＞１０^４であるため、デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）のダイナミックレンジ内においては十分な指標とすることができる。ただし、各１５種類の濃度ステップにおける外部添加コントロールを複数用意する場合においては、より多種類の外部添加コントロールを用意することも可能であるため、例えば各濃度段階において３種類の外部添加コントロールを作製する場合などを考慮すると４５種類程度の外部添加コントロールを、２のｎ乗の濃度ステップにて混合することが望ましい。

本発明において、複数種類の絶対量指標プローブを用いる場合、複数種類の外部添加コントロール核酸が増幅されてそれぞれのプローブで複数種類の外部添加コントロールを検出する。ｋ種類（第１番〜第ｋ番）の外部添加コントロールを使用する場合、第１番からみた第ｋ−１番の濃度比と、第１番からみた第ｋ番の濃度比を２のｎ乗（ｎは任意の整数）で表すことができる。

例えば、第１番からみた第２番のときのｎを３とし、第１番からみた第３番のときのｎも３とすると、第１番からみた第２番の濃度比も、第１番からみた第３番の濃度比も、２の３乗＝８倍となって同じ濃度比にすることができる。また、第１番からみた第２番のときのｎを２とし第１番からみた第３番のときのｎを３として、別の濃度比にすることもできる。
すなわち、複数種類の絶対量指標プローブを、同一濃度で使用してもよく、異なる濃度で使用してもよい。

基本的には、複数種類の絶対量指標プローブはどのような組み合わせで入れてもよい。１５種類の場合に、濃度１のものを７種類、濃度２のもの（濃度１に対する濃度比が２のもの、以下同様）を８種類入れてもよく、濃度１のものを７種類、濃度４のものを８種類入れてもよい。濃度１のものを２種類、濃度４のものを３種類、濃度８のものを１種類・・・でもよい。後述する実施例のように、濃度１のものを１種類、濃度２のものを１種類、濃度４のものを１種類、濃度８のものを１種類、・・・濃度１５のものを１種類でもよい。

検量線を引くために、濃度が２段階以上あることが必要であるが、その２段階が、２のｎ乗（ｎは整数）の濃度比になっていればよい。
一方で、サンプル中に含まれる外部添加コントロールはあまりにも濃度が高いと検出対象の細菌と増幅反応における競合が激しくなり、本来検出できるはずの検出対象細菌が検出できなくなる可能性もあるため、アプリケーションに応じて適宜濃度調整をする必要がある。

複数の外部添加コントロールをハイブリダイゼーションによって検出するために、複数の外部添加コントロールそれぞれに特異的な配列の相補配列をプローブとして個別にデバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）に搭載する必要がある。
上記デバイス（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて実際に未知サンプル（実サンプル）の細菌叢に含まれる検出対象菌種の有無や量を解析する場合、上記のデバイスに含まれる検出対象菌種に対するプローブそれぞれについて、絶対量指標プローブのシグナルと、総量指標プローブのシグナル強度を基に補正する係数で処理することで、検出対象細菌由来の核酸を絶対定量することが可能となる。

検出対象菌種の絶対量推定方法
検出対象細菌
菌叢の中に未知の細菌がいる可能性は否定できない。このため、デバイス（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）を用いて全ての細菌種を検出対象とすることは困難である。過去に同定済みの細菌の中からある現象を評価するに際して、検出するにふさわしい細菌が対象となる。例えば、口内細菌は数百種類存在し、同定されている菌も多い。しかし、歯周病を評価するに際しては、これらの同定される菌が必ずしも検出対象として適しているとは限らない。

従って、歯周病を評価する場合は、歯周ポケットの中に存在する、例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍなどが歯周病を評価することに適している菌であると言える。さらに好ましくは、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａが、特に好ましくはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが歯周病を評価することに適している。

これらの細菌の個々について、上記特定のプライマー対で増幅される塩基配列の中から、当該細菌に特異的な配列をプローブとして選抜する。すなわち、特定のプライマー対で増幅された塩基配列の中には、プローブとして使用できるものと使用できないものが含まれているので、そのうち使用できるプローブを選別する。基本的には一種類のプライマー対で多種類の菌を増幅し、増幅配列内で、菌種によって配列の多様性が認められる部分でプローブを作製する。

本来のプローブとして使用できる配列と同じ作用効果を有するプローブも実質的に同一の配列であるプローブとして使用できる。
従って、これらの検出対象細菌は上記特定のプライマー対によって増幅される核酸配列を持っている必要があり、また、これらの核酸を基に当該細菌を検出するために、増幅された配列内に、他の細菌とは異なる菌種特異的な配列を含んでいる必要がある。

一方でその特異性は、属レベルの特異性を基に同じ属の細菌を一括に検出するものであってもよいし、個々の種レベルで検出可能な特異性であってもよく、菌叢解析の目的に応じて当適宜判断が可能である。
複数の細菌を一括に増幅し、さらに特異的な配列を基にして検出するに際しては、プライマー対については菌種間で保存された配列から設計する必要があり、鋳型（プライマーによって増幅される範囲）として細菌特異的な配列を持っている遺伝子を使用する必要がある。このような鋳型となる遺伝子としては１６ＳｒＲＮＡが挙げられる。本発明においては、１６ＳｒＲＮＡそのものを検出対象としてもよいし、転写もととなるゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡを検出対象とすることも可能である。

例えば、まず検出対象細菌を単離する。このとき、すでに菌株として販売されているものを使用してもよい。また、細菌は生きていても死んでいてもよく、さらに細菌そのものではなく細菌から抽出されたゲノムＤＮＡであってもよい。

（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、当該検出対象細菌を検出するためのプローブのシグナル強度比から係数を算出する工程
これら単離された細菌もしくは核酸の１種類について、本発明のデバイスによって処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＡと、総量指標プローブで検出されるシグナルＢが得られる。

また別途、上記とは異なる単離された細菌もしくは核酸を用いて同様に本発明のデバイスによる処理を行う。その結果、当該細菌特異的なプローブで検出されるシグナルＣと、総量指標プローブで検出されるシグナルＤが得られるとする。

（２）上記（１）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検サンプルから得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程
ここで、シグナルＢおよびシグナルＤについては、同じ配列の総量指標プローブから得られるシグナルであるため、理論上ハイブリダイゼーションの効率は同じといえる。一方で、シグナルＡとシグナルＢにおいてはプローブ配列自体が異なるが、検出対象とする核酸は同じであり、ハイブリダイゼーションに供された量や実験条件も同一である。このことは、シグナルＣとシグナルＤについても同様のことが言える。

従って、シグナルＢとシグナルＤの値が一致する場合のシグナルＡとシグナルＣの強度比が、それぞれのプローブのハイブリダイゼーション効率の違いとなる。従って、Ａ／Ｂの値とＣ／Ｄの値は、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率の違いを補正したうえで比較が可能な値となる。例えば実サンプルを用いてＤＮＡマイクロアレイでデータを取得した際に、あらかじめ取得しておいたこれらの個々の値の逆数を、それぞれのプローブのシグナル強度に乗算することで、各プローブ間のハイブリダイゼーション効率を補正したうえで、シグナル強度を比較することが可能となる。

（３）上記（２）の工程で演算した演算後のシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較する工程
これらのシグナル強度を、絶対量指標プローブのシグナル強度と比較することで、各菌種の絶対量を評価することが可能となる。
この工程では、検出対象の分子数が既知である外部添加コントロールともハイブリダイゼーション効率の違いを補正したうえでシグナル強度の比較を行うと、より正確な絶対量の値を算出することが可能となる。すなわち、外部コントロールの分子数が既知であるので、それらのシグナル強度と添加した外部コントロールの分子数の対応で作成できる検量線により、各菌種特異的なプローブのシグナル強度をより正確に分子量に変換することが可能となる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

＜デバイスとプライマーの作製＞
ＮＣＢＩより１６ＳｒＲＮＡの配列データをダウンロードし、菌種間において高度に保存された二つの配列を表１に示すフォワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）としてオリゴＤＮＡの合成（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）行った。またこのとき、フォワードプライマーについてはＣｙ５による蛍光標識を行った。これらのプライマーについて、フォワードプライマーは５０ｐｍｏｌ／μＬ、リバースプライマーは１０ｐｍｏｌ／μＬの濃度にそれぞれ調製した。

検出対象とする口内細菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ．）、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａｆｏｒｓｙｔｈｉａ（Ｔ．ｆ．）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔ．ｄ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｇｒａｃｉｌｉｓ（Ｃ．ｇｒ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｒｅｃｔｕｓ（Ｃ．ｒ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｈｏｗａｅ（Ｃ．ｓｈ．）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ（Ｆ．ｎ．ｖ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｍ（Ｆ．ｎ．ｐ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ａｎｉｍａｌｉｓ（Ｆ．ｎ．ａ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（Ｆ．ｎ．ａ）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｕｍ（Ｆ．ｐ．）、Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓｍｉｃｒａ（Ｐ．ｍ．）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（Ｐ．ｉ．）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｎ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ（Ｓ．ｃ．）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａ．ａ．）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｎｃｉｓｕｓ（Ｃ．ｃ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｃ．ｇｉ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｏｃｈｒａｃｅａ（Ｃ．ｏ．）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐｕｔｉｇｅｎａ（Ｃ．ｓｐ．）、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａｃｏｒｒｏｄｅｎｓ（Ｅ．ｃ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ（Ｓ．ｇ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（Ｓ．ｉ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ（Ｓ．ｍ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓｂｖ２（Ｓ．ｍｂ．）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ａ．ｏ．）、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｐａｒｖｕｌａ（Ｖ．ｐ．）、ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｎａｅｓｌｕｎｄｉｉＩＩ（Ａ．ｎ．）、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓｎｏｘｉａ（Ｓ．ｎ．））それぞれのゲノムＤＮＡを基にして、上記プライマーで増幅される範囲を１塩基ずつずらしながら２０塩基の配列を設計した。

次に、上記設計した塩基配列の中から、おおよそのＧＣ含量が５０％前後となるものを抽出し、それらの配列すべてをＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを用い、全菌種に対する１６ＳｒＲＮＡ配列をマスキングデータベースとして相同性検索を行い、配列特異性の最も高かった配列を二つ抽出した。抽出された配列を菌種間で比較し、他に比べてＧＣ含量の高いものについてはその配列の前後を１塩基から２塩基を追加し、低いものについては１塩基から２塩基削除した。

得られた配列をプローブとするために、５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した（配列番号３〜５９）。別途、前記特定のプライマー対により増幅される塩基配列のうちの、検出の対象となる複数種類の細菌が共通に有する塩基配列の、５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した（配列番号６０）。
さらに、１６ＳｒＲＮＡ中には含まれない配列からなるプローブを１５種類（配列番号６１〜７５）用意し、これらについても５末端ビニル化オリゴＤＮＡを合成した。

これらすべての種類の５末端ビニル化オリゴＤＮＡを用い、プローブを三菱レイヨン性ＤＮＡチップジェノパールのプラットフォームを用いてアレイ化した。設計したすべてのプローブ配列を表２に示す。

＜検体の調製＞
次に、サーマルサイクラーの電源を入れ、表３に示す通りプログラムを設定した。

消毒用エタノールとキムワイプ／キムタオル等でゴム手袋、実験台の上、ピペットマン、チューブラック等をきれいに清掃し、氷の上にチューブラックを置いた。チューブラックの上に、評価用サンプル、プライマー（２本）、ＥｘＴａｑ、外部添加コントロール、ヌクレアーゼフリーの水を置いた。必要に応じて試薬を溶解、ボルテックス、スピンダウンした。プレミックス作製用エッペンチューブ、プライマー希釈用エッペンチューブ、外部添加コントロール希釈用チューブ、反応実施用エッペンチューブ（０．２ｍＬ，サンプル数分）をチューブラックに置いた。プライマー希釈用エッペンチューブにプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬとなるように希釈して入れた。

＜ＰＣＲ用Ｐｒｅｍｉｘの作製＞
エッペンチューブに水をサンプル数×６μＬ入れた。１０万倍希釈外部添加コントロールをサンプル数×１μＬ入れた。１０ｐｍｏｌ／μＬプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ）サンプル数×１μＬを入れた。５０ｐｍｏｌ／μＬプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ）サンプル数×１μＬを入れた。２ｘＴａｑをサンプル数×１０μＬ入れた。ボルテックスで撹拌し、スピンダウンしたものを、Ｐｒｅｍｉｘとした。

＜反応液の作製＞
Ｐｒｅｍｉｘを１９μＬ、反応用エッペンチューブ（０．２ｍＬ）に小分け分注し、反応用エッペンチューブに、下表に示すサンプルを１μＬ入れた。ボルテックスで撹拌し、スピンダウンし、反応液とした。
サンプルは凍結乾燥された菌株もしくはゲノムＤＮＡをＡＴＣＣから購入したものを使用した。使用したサンプルを表４に示した。ゲノムＤＮＡについては１０ｎｇ／μＬに調整したもの、菌株については、３００μＬの水で溶解したものから、ＤｎｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＤＮＡを抽出した。濃度は０．０１から１０ｐｇまで、それぞれ必要な範囲を測定した。

＜ＰＣＲ＞
反応液をサーマルサイクラーにセットし、サーマルサイクラーの蓋をしっかり閉じ、スタートボタンを押して反応を開始した。

＜ハイブリダイゼーションの準備＞
サーマルサイクラーのスイッチを入れて、プログラム［９５℃５ｍｉｎ（必要に応じて４℃で任意の時間放置）反応液量：１００μＬ、ＲａｍｐＳｐｅｅｄ：Ｍａｘ］を設定した。小さめの容器（９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅが入る大きさ）に氷を入れ、氷の隙間に水がいきわたるくらい純水を入れた。

＜ハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘの作製＞
１．５ｍＬのエッペンチューブもしくは８ｍＬのコニカルチューブを用意した。チューブにきれいな水をサンプル数×１．１×６４μＬ入れた。チューブに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌをサンプル数×１．１×４８μＬ入れた。チューブに１ＭＮａＣｌをサンプル数×１．１×４８μＬ入れた。チューブに０．５％Ｔｗｅｅｎ２０をサンプル数×１．１×２０μＬ入れた。ボルテックスでよく混ぜて、必要に応じてスピンダウンし、ハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘとした。

＜ハイブリダイゼーション溶液の作製＞
サンプル溶液（ＰＣＲ産物の入った０．２ｍＬのエッペンチューブ）に対してハイブリダイゼーション用Ｐｒｅｍｉｘ１８０μＬを小分け分注した。ボルテックスして、スピンダウンし、ハイブリダイゼーション溶液とした。

＜ハイブリダイゼーション前処理＞
ハイブリダイゼーション溶液をサーマルサイクラーにセットして、蓋をしっかりしめて加温を開始した。９５℃５分の加熱が終了後、即座に蓋をあけ、中に入っているサンプルチューブをプラスチックのラックごと取り出し、氷水の入った小さめの容器に漬け込み、２分放置した。その後、サンプルチューブを氷水から取り出し、氷上のラックにおいた。

＜ハイブリダイゼーション＞
エアインキュベーターが５０℃になっていることを確認し、ハイブリチャンバーに全量（２００μｌ）のハイブリダイゼーション溶液を入れた。上記で作製したジェノパールハイブリチャンバー内に浸漬した。ハイブリチャンバーに蓋をし、密閉した状態でエアインキュベーター内に入れ、そのままの状態で２時間遮光放置した。

＜洗浄＞
２時間経過後、ハイブリチャンバーをエアインキュベーターから取り出し、蓋を開けた。０．２４ＭＴＮＴバッファーの入ったコニカルチューブをウォーターインキュベーターから取り出し、蓋についた結露を落とすために、一旦コニカルチューブの蓋をしたまま回転し、その後、蓋を開けた。ハイブリチャンバーからピンセットでチップを取り出し、底面をキムワイプ等に接触させ、過剰なハイブリ溶液を吸収除去した。チップをコニカルチューブに入れ、再度蓋をして、ウォーターインキュベーターに浸漬し、そのまま２０分間加温した。２０分経過後、上記と同様の方法で、チップを同一バッファーの入った別のコニカルチューブに移し、さらに２０分間加温した。２０分経過後、上記と同様の方法で、チップを今度は０．２４ＭＴＮバッファーの入ったコニカルチューブに移し、さらに１０分間加温した。１０分経過後、上記と同様の方法で、チップを同一バッファーの入った８ｍＬのコニカルチューブに移し、回転架台を用いて１０分以上回転撹拌した。

＜検出操作＞
チップをコニカルチューブから取り出し、ＧｅｎｏｐａｌＲｅａｄｅｒ用検出ケース（三菱レイヨン製）にセットした。
ＧｅｎｏｐａｌＲｅａｄｅｒ（三菱レイヨン製）を用い、装置取扱い説明書に従って以下の露光時間を４０秒、４秒、１秒、０．１秒の各条件にてＤＮＡマイクロアレイの撮像を行い、検出された蛍光シグナルを基に換算された数値データを解析に使用した。

＜解析＞
市販の表計算ソフトを用い、パソコン上でサンプル名称他、サンプルやチップ、実験条件に関する情報とシグナル強度の数値を貼り付けた。
外れ値を除外した複数のバックグラウンドスポット（プローブが搭載されていないスポット）の平均値をバックグラウンド値とした。またその時の標準偏差の値を最小シグナル値とした。
プローブスポットのシグナル値から、バックグラウンド値を減算し、正味シグナル値を算出した。

正味シグナル値が最小シグナル値よりも低い場合はそれらを最小シグナル値に置き換えた。
結果を表５（表５−１〜５−５；表５−１の左端側に表５−２〜５−５が順に繋がったもの全体で表５である。）に示した。データ中の細囲いは、細菌種特異的なハイブリダイゼーション由来のシグナルを示している。部分的にクロスハイブリダイゼーションは散見されるものの、およそのサンプルにおいては当該菌種を検出するプローブと総量指標プローブに強いシグナルが検出された。

次に、各菌種におけるプローブのシグナル強度から、各プローブにおけるハイブリダイゼーション効率係数を算出した。複数の細菌に対してハイブリダイゼーションを形成するプローブについてはその平均値をハイブリダイゼーション効率係数とし、結果を表６に示した。なお、値の記載のない部分は、単離された菌または核酸が無いため、ハイブリダイゼーション効率係数が算出できなかったものである。

＜外部添加コントロールの作製＞
フォワードプライマーとリバースプライマーで増幅可能で、かつ配列番号６１〜７５のプローブを用いてそれぞれ独立にハイブリダイゼーションが可能である、配列番号７６〜９０に記載の２本鎖ＤＮＡを合成した。合成した配列を表７に示す。

＜ＰＣＲからデータ取得まで＞
菌株やゲノムＤＮＡ溶液の代わりに社内で公募した検査対象人１名の唾液５００μＬから、ＤｎｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ＤＮＡを抽出した。その濃度は、１４．８ｎｇ／μＬであり、３０００倍希釈した溶液１μＬを実サンプルとし、１０万倍希釈した外部添加コントロールを１μＬ添加した。その他は反応溶液中の水の量を１サンプルあたり１μＬ減らす以外、実施例１の手順と同じ方法によりＰＣＲを行い、続いてＤＮＡマイクロアレイによるハイブリダイゼーションを行って、各プローブにおける蛍光シグナルデータを取得した。検出限界以上のシグナルが検出されたプローブについて結果を表８にまとめた。

表８の結果は、実施例１にて算出したハイブリダイゼーション効率係数を利用し、各プローブにおけるコピー数を算出したものである。
表８においては、「コピー数」の欄に記載の数字が、実際の細菌の個数を意味している。

絶対量指標プローブの定量範囲内（検出限界以下であったプローブとシグナル強度が頭打ちになったプローブのデータを除外したデータ）にて作成された検量線の傾きの値を算出した。結果を表９に示す。

以上より、検査対象人の唾液サンプル中に含まれる検出対象細菌を絶対定量することが可能となった。

本発明によれば、環境中に含まれる複数の細菌の個々を一括に定量可能とし、かつ全体の量の増減を評価できる。従って、本発明のデバイスは、例えば腸内、皮膚、口内等の健康状態の評価、土壌、海水、河川の環境評価、活性汚泥の性能評価等に利用可能である。

配列番号１〜９２：合成核酸

Claims

以下のプローブ（ａ）と、プローブ（ｂ）と、プローブ（ｃ）とを搭載した、細菌叢解析用デバイス。
（ａ）腸内、皮膚、口内、土壌、海水、河川又は活性汚泥に含まれる細菌から選ばれる検出の対象となる２種以上の細菌のそれぞれに特異的な１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイズする核酸からなるプローブ
（ｂ）前記２種以上の細菌が共通に有する塩基配列にハイブリダイズするプローブを含む総量指標プローブ
（ｃ）被検試料中に含まれる細菌に由来する核酸にはハイブリダイズせず、被検試料中に含まれる細菌のＤＮＡが増幅されないように人工的に設計された核酸にハイブリダイズする、１種類又は複数種類の絶対量指標プローブ
デバイスが、繊維型ＤＮＡマイクロアレイである請求項１に記載のデバイス。
口内に含まれる細菌が、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属又はＴｒｅｐｏｎｅｍａ属に属する細菌である、請求項１又は２に記載のデバイス。
以下の工程を含む、検出対象菌種のコピー数を演算する方法。
（１）予め単離された検出対象細菌のそれぞれについて、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデバイスを用いて各プローブのシグナル強度を測定する工程
（２）前記シグナル強度比から係数を算出する工程
（３）前記（２）の工程で算出した算出値をプローブのハイブリダイゼーション効率係数とし、当該ハイブリダイゼーション効率係数を用いて被検試料から得られるデータの各検出対象菌種のコピー数を演算する工程