JP6281905B2 - 角栓形成抑制剤 - Google Patents

Description

本願発明は、ザクロ果汁及び又はザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする角栓形成抑制剤、ＧＡＴＡ３発現抑制剤、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進剤、及び体毛抑制剤に関する。

角栓とは、周囲の角質や皮脂腺から分泌された皮脂が、毛孔内で凝固、発達したものと考えられており、毛穴の目立ちの原因の一つと考えられている。そのため、角栓を物理的に取り除くなどの施術が提案されており、洗顔などにより取り除く方法、粘着シートなどにより角栓を張り付けて除去する方法や、角栓除去器具などが考案されている（特許文献１−５）。

しかし、粘着シートや器具により角栓を除去する方法では、表皮の角質も失われてしまうため、肌荒れを起こす懸念があった。また、代替方法として、高濃度の有機酸に界面活性剤を添加した角栓再生を抑制する方法や製剤が示されるようになったが、この方法においても角栓を化学的に溶解することに基づいたものであり、肌荒れを起こす懸念は未だ払拭されたとは言えない（特許文献６−８）。この背景には、角栓の形成メカニズムの詳細が不明であり、角栓自体の構造に注目した研究はほとんどないなど、角栓に関して不明な点が多いことに起因する。最近、角栓のタンパク質解析により、ケラチン１７が角栓中に存在することが報告されたが（非特許文献１）、角栓を構成するタンパク質がすべて明らかになったわけではなく、依然として角栓形成メカニズムは不明である。以上の点から、肌荒れを起こさずに角栓を除去するために、生体における角栓形成メカニズムに基づいた新たな角栓形成抑制剤の開発が望まれていた。

ザクロには、エラグ酸等の抗酸化成分が含まれ、抗老化作用が期待できること、また、女性ホルモン様成分が含まれ、美容と健康に対する効果が期待できることから、その花、果実、種子等が健康食品や化粧品原料として利用されている。その主要な特許文献としては、抗酸化作用を有する化粧品（特許文献９）、美白作用を有する化粧品（特許文献１０）、抗アレルギー作用（ヒアルロニダーゼ阻害作用）を有する皮膚外用剤（特許文献１１）、女性ホルモン様作用を有する化粧品（特許文献１２）、エラスターゼ阻害剤（特許文献１３）、炎症性サイトカインの合成抑制剤（特許文献１４）、リパーゼ活性阻害剤（特許文献１５、１６）が挙げられる。しかしながら、角栓形成を抑制する効果についての記載はない。

尚、ザクロ果汁の乳酸菌による発酵物の利用は、ザクロ果汁の酸度が高く発酵性が悪いことからあまり利用されていない。果汁の乳酸菌発酵物を有効成分とする美容剤に関する特許文献（特許文献１０）には、果汁の乳酸菌発酵物の美容剤に関する記載があるが、ザクロ果汁に関する具体的な有効性に関する記載はない。また、特許文献１１には、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムのヒドロキシペルオキシドとリノール酸ヒドロキシペルオキシドに対する分解特性を示す抗酸化剤に関して記載されている。しかしながら、乳酸菌発酵に用いる具体的な対象物について、及び抗酸化作用以外の効果については記載されていない。さらに、特許文献１７には、ヒアルロン酸合成促進剤を含有することを特徴とするシワ改善用皮膚外用剤の記載があるが、ザクロ果汁又はその乳酸菌発酵物の角栓形成抑制効果についての先行文献はなく、また、情報もない。

特開２００７−１１９３９４ 特開平５−９７６２７ 特開２００７−５５９３３ 特開２００９−８２３７６ 特開２０１３−１７７８８ 特開平１０−１２０５３２ 特開２０１３−３２３１９ 特開２０１３−４９６６７ 特開平０５−３２００３７ 特開平０５−３３１０４１ 特開平０９−１１０７１０ 特開２００１−１３１０５３ 特開２００５−５３８７３ 特開２００５−８９３０４ 特開２００５−８５７２ 特開２００５−５３８９１ 特開２０１３−２４５１７０

山崎浩子ら、第７３回ＳＣＣＪ研究討論会要旨集 ｐ１４−１５ ２０１３年１１月２９日開催

かかる状況に鑑み、本願発明の課題は、角栓形成メカニズムに基づいた生薬成分配合の角栓形成抑制剤、角栓形成に関与するＧＡＴＡ３の発現抑制剤、同様に関与する１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進剤、及び体毛抑制剤を提供することにある。

本願発明者らは、毛包中のタンパク質解析から、角栓形成には毛包の内毛根鞘、及びそのタンパク質が関与することを明らかにした。また、角栓の形成には皮膚中の男性ホルモンの活性化が重要であることを明らかにした。このような事情により、角栓を構成するタンパク質の産生抑制や男性ホルモンの活性化抑制が角栓形成を防ぐ手段になりうると考え鋭意研究を重ねた結果、ザクロ果汁、又はザクロ果汁の乳酸菌発酵物が、角栓形成を予防する作用、角栓の構成成分である内毛根鞘の形成に関与するＧＡＴＡ３の発現を抑制する作用、男性ホルモンの活性化を抑制する１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２の発現を促進する作用、及び体毛抑制作用を有することを見出し、本願発明を完成するに至った。

本願発明に用いるザクロ果汁とは、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の果汁である。果汁は、果肉、果皮、種子を含めてもよく、絞りかすを含めてもよい。果汁は、そのまま未調整、又は濃縮果汁を用いてもよく、また希釈して用いても良い。また、水酸化ナトリウム等のアルカリでｐＨを３〜８に調整して用いても良い。また、乳酸桿菌の生育促進を目的として、酵母エキスや大豆ペプチド等の有機物、硫酸マグネシウム等のミネラルを添加しても良い。また、本願発明の果汁には、水やエタノールなどの溶媒を用いて抽出した、ザクロの溶媒抽出物も含めるものとする。

本願発明に用いる乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。特に好ましくは、発酵による有効性向上の点でラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する乳酸菌であって、特に植物、又はその発酵食品である漬け物などから分離した菌株であっても、菌株保存機関に登録されたものであっても良い。また、特にザクロ果汁をｐＨ３〜５の範囲で効率よく発酵させ得るものが好ましい。

培養条件としては、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、目安として１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃が良い。

ザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物は、そのまま用いても良く、必要に応じて、抽出、濃縮、希釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。抽出する溶媒としては、水、エタノール、１，３ブチレングリコール、又はその混合液でも良く、抽出温度は、室温でも加熱しても良い。

本願発明の外用剤又は内用剤への配合は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を配合することもできる。

本願発明の剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料等が挙げられる。

本願発明で用いる、ザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物を、溶液の状態で用いる場合の含有量は特に限定されないが、配合する角栓形成抑制剤、ＧＡＴＡ３発現抑制剤、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進剤、及び体毛抑制剤に対し、固形物に換算して０．００１重量％以上、好ましくは０．００１〜５重量％が良い。０．０００１重量％未満であると本願発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本願発明のザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物は、天然で安全性の高い素材であり、優れたＧＡＴＡ３発現抑制効果を認めた。また、その乳酸菌発酵物は、発酵前のザクロ果汁よりもさらにＧＡＴＡ３発現抑制効果が促進されることに加え、発酵前には見られなった男性ホルモンの活性化を抑制する１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進効果が顕著に発揮されることから、毛穴の目立ち改善や体毛抑制効果が期待でき、ザクロ果汁と併せて医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。

本願発明におけるＧＡＴＡ３遺伝子とは、細胞の核内に存在する転写因子をコードする遺伝子であり、免疫細胞であるＴ細胞、血管内皮細胞、毛包の内毛根鞘細胞などの細胞分化に関与することが報告されており、この遺伝子の欠損、遺伝子産物の機能不全は上記細胞への分化能が損なわれる。

本願発明における１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは、１７βヒドロキシステロイドと１７βケトステロイドを相互変換することで、ステロイドホルモンの活性を調節する酵素である。この酵素の中で１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２はテストステロン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、１７βエストラジオールなどの性ホルモンを、それぞれアンドロステンジオン、アンドロステンジオン、エストロンなど、基質となるホルモンと比べて活性の弱いものに変換する反応を触媒する。生体内の主要な男性ホルモンには、ＤＨＴ、テストステロン、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）等があり、男性ホルモン活性はこの順番に低下する。即ち、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２の働きが強まれば、強い男性ホルモン活性を有するＤＨＴやテストステロンが減少し、弱い男性ホルモン活性を有するアンドロステンジオンやＤＨＥＡが増加する。この酵素は、上述した性ホルモンなどの作用を受ける末梢組織で発現している。また、細胞中では小胞体膜に局在し、膜タンパク質の状態で存在する。１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２遺伝子は、この酵素をコードする遺伝子であり、この遺伝子の発現により当該酵素タンパク質が細胞中に生成される。

本願発明のザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物は、優れた角栓形成抑制作用、ＧＡＴＡ３発現抑制作用、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進作用、及び体毛抑制作用を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において利用できるものである。特に、ザクロ果汁を特定の条件で発酵すると、上記効果が向上する。

次に本願発明を詳細に説明するため、実施例として本願発明に用いる発酵物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本願発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を、％とは重量％を示す。
以下に、ザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物であるザクロ果汁の発酵物の製造例を示す。

製造例１ ザクロ果汁
圧搾法にて調製された市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を用いた。

製造例２ ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ１５に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例３ ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ１１に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例４ ザクロ果汁の発酵物
濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ８に調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例５ ザクロ果汁の発酵物
ザクロ果汁を、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た

製造例６ ザクロ果汁の発酵物
製造例３のザクロ果汁の発酵物２１０ｇに１，３−ブチレングリコール９０ｇを加えてろ過し、ザクロ果汁の発酵物２８０ｇを得た。

製造例７ ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物
製造例２のザクロ果汁の発酵物１００ｇについて、凍結乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物１５ｇを得た。

製造例８ ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物
製造例４のザクロ果汁の発酵物１００ｇについて、凍結乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物８ｇを得た。

製造例９ ザクロ果汁の発酵物の乾燥物
製造例５のザクロ果汁の発酵物２００ｇに１２０ｇのデキストリンを加え、スプレードライヤーにて乾燥し、ザクロ果汁の発酵物の乾燥物１４５ｇを得た。

以下に、ザクロ果汁、又はその乳酸菌発酵物を用いた処方例を示す。

処方例１ 化粧水
処方 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物（製造例６） ０．５
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

比較例１ 従来の化粧水
処方例１において、ザクロ果汁の発酵物（製造例６）を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。

処方例２ 乳液
処方 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物（製造例６） ０．５
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して成分１を加え、製品とする。

比較例２ 従来の乳液
処方例２において、ザクロ果汁の発酵物（製造例６）を精製水に置き換えたものを従来の乳液とした。

処方例３ クリーム
成分 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物（製造例６） ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

比較例３ 従来のクリーム
処方例３において、ザクロ果汁の発酵物（製造例６）を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。

処方例４ ゲル剤
成分 配合量（部）
１．ザクロ果汁（製造例１） ５．０
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例５ 浴用剤
成分 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物（製造例７） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

処方例６ 錠剤
成分 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の凍結乾燥物（製造例８） ５．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例７ 錠菓
成分 配合量（部）
１．ザクロ果汁の発酵物の乾燥物（製造例９） ２．０
２．乾燥コーンスターチ ４９．８
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
６．香料 ０．１
７．精製水 ０．１
［製造方法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

以下、本願発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。なお、本願発明はこれにより限定されるものではない。

実験例１ 上皮系細胞におけるＧＡＴＡ３の産生抑制試験
上皮系細胞である角化細胞におけるＧＡＴＡ３の産生抑制効果を下記の条件にて測定した。

胎児由来ヒト正常ケラチノサイト（以下、ＨＮＫと省略）の培養のため、培養液としてＨｕｍｅｄｉａ ＫＧ２（クラボウ）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて培養した。また、１週間に３回の割合にて培地交換を行った。ＨＮＫを２×１０^４個／ｃｍ^２の密度にて、２４ウェルプレートに播種し、細胞が接着したことを確認した後に、各試料を添加した。また、コントロールには、試料の溶解に用いた溶媒を添加した。添加後、セミコンフルエントに達するまで培養した後に、ＲＮＡｉｓｏ試薬（タカラバイオ）を用いてＲＮＡを単離した。このＲＮＡに対して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬（タカラバイオ）を用いて逆転写反応によるｃＤＮＡ合成を行った後に、ＰＬＡＴＩＮＵＭ ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ ＱＰＣＲ試薬（インビトロジェン）を用いてＰＣＲ反応を実施し、ＧＡＴＡ３の発現量を測定した。測定に際しては、９５℃、２分の初期変性を行った後、ＰＣＲ反応として９５℃にて２０秒、６０℃にて３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。その他の操作は、定められた方法に従い、ＧＡＴＡ３の発現量を内部標準であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量に対する割合として求めた。ＧＡＴＡ３の産生抑制効果は、コントロールのＧＡＴＡ３の発現量に対する試料添加群のＧＡＴＡ３の発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＧＡＴＡ３用のプライマーセット
Ｆｏｒｗａｒｄ ＣＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＣＣＧＧＧＴＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
Ｆｏｒｗａｒｄ ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）

試験結果を表１に示した。ＧＡＴＡ３の発現量は、発酵させていないザクロ果汁の添加により、コントロール（試料未添加）と比べて減少したことから（ｐ＜０．１）、ザクロ果汁にはＧＡＴＡ３の発現を抑制させる作用があることが示された。また、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を添加した場合も、ＧＡＴＡ３の発現量はコントロール（試料未添加）と比べて濃度依存的に減少した（ｐ＜０．０５）。ザクロ果汁を添加した場合よりもザクロ果汁の乳酸菌発酵物を添加した方が、ＧＡＴＡ３の発現量が減少したことから（ｐ＜０．１）、ザクロ果汁におけるＧＡＴＡ３発現抑制作用は、乳酸菌発酵により得られたザクロ果汁の乳酸菌発酵物において増強されることが示された。

実験例２ 上皮系細胞における１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２（ＨＳＤ１７Ｂ２）の産生促進試験
上皮系細胞である角化細胞におけるＨＳＤ１７Ｂ２の産生促進効果を下記の条件にて測定した。

ヒトケラチノサイト由来の株化細胞であるＨａＣａＴを培養するために、培養液として１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地を用い、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて培養した。また、１週間に３回の割合にて培地交換を行った。ＨａＣａＴを６０ｍｍ ｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、コンフルエントになった時点で、試料を添加した。コントロールには、試料の溶解に用いた溶媒を添加した。２４時間培養後、ＲＮＡｉｓｏ試薬（タカラバイオ）を用いてＲＮＡを単離した。このＲＮＡに対して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬（タカラバイオ）を用いて逆転写反応によるｃＤＮＡ合成を行った後に、ＰＬＡＴＩＮＵＭ ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ ＱＰＣＲ試薬（インビトロジェン）を用いてＰＣＲ反応を実施し、ＨＳＤ１７Ｂ２の発現量を測定した。測定に際しては、９５℃、２分の初期変性を行った後、ＰＣＲ反応として９５℃にて２０秒、６０℃にて３０秒を１サイクルとして４０サイクル行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＨＳＤ１７Ｂ２の発現量を、内部標準であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量に対する割合として求めた。ＨＳＤ１７Ｂ２の産生促進効果は、コントロールのＨＳＤ１７Ｂ２の発現量に対する試料添加におけるＨＳＤ１７Ｂ２の発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＨＳＤ１７Ｂ２用のプライマーセット
Ｆｏｒｗａｒｄ ＴＧＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＡＴＴＧＣ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＡＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
Ｆｏｒｗａｒｄ ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号４）

これらの試験結果を表２に示した。ＨＳＤ１７Ｂ２の産生量は、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物の添加により、コントロール（試料未添加）と比べて２０％の増加を示したことから（ｐ＜０．０５）、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物はＨＳＤ１７Ｂ２発現促進作用を有していることが示された。

実験例３ 連用試験１
ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を配合した化粧水の処方例１及び比較例１を用いて、２０代〜４０代の男性被験者１０名を対象に１ヵ月間の連用試験を行った。被験者には有効成分の有無を告知しない、ブラインドテストとし、被験者の一方の半顔頬部に有効成分配合の処方例１を、他方の半顔頬部に比較例１を連用させるハーフサイドテストとし、１日２回、朝、晩、１ヶ月間連用させた。連用前と連用１ヶ月後それぞれ頬部を対象に、角栓形成の指標であるポルフィリン蛍光と角質中の男性ホルモン量を測定した。

角栓形成の指標であるポルフィリン量は、角栓スコープＣｈａｒｍ Ｖｉｅｗ（モリテックス）を用いて頬部の紫外線画像を取得し、画像をガウスフィルターにて平滑化後、二値化を行い、白画素として検出される蛍光部位を定量することで得た。有効成分であるザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含む処方例１を連用させた側の方では、比較例１を連用させた側よりもポルフィリン蛍光が減少していたことから（ｐ＜０．０５）、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物による角栓形成抑制作用が示された（表３）。

洗顔直後に１．５ｃｍ×１．５ｃｍのＢｌｅｎｄｅｒｍテープ（３Ｍ）を顔面頬部に貼付し、テープが十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質サンプルを得た。各被験者より採取した角質サンプルは、３５０μｌの ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを加え、約１分間、ｖｏｒｔｅｘにより攪拌した後に、５秒×３回の超音波処理を行った。テープを取り除いた後に、１０，０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件にて遠心分離を行い、その上清を角質抽出液として、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、及びジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の定量に供した。ＤＨＥＡの定量には、Ｓａｌｉｖａｒｙ ＤＨＥＡ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ）を、ＤＨＴの定量には、Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ＥＬＩＳＡ （ＡＬＰＣＯ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）用い、添付のマニュアルに従い行った。測定値は、角質抽出液中の蛋白質量により補正した。その結果、有効成分であるザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含む処方例１を連用させた側の方では、比較例１を連用させた方よりもＤＨＥＡが増加し、ＤＨＴの量が減少することを確認した（表４、表５）。この結果から、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を用いることで、皮膚における男性ホルモンの活性化が抑制されることが示された。

実験例４ 連用試験２
ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を配合した乳液の処方例２及び比較例２を用いて、２０代〜４０代の女性被験者１６名を対象に２ヵ月間の連用試験を行った。被験者には有効成分の有無を告知しない、ブラインドテストとし、被験者の一方の半顔頬部に有効成分を含む処方例２を、他方の半顔頬部に比較例２を連用させるハーフサイドテストとし、１日２回、朝、晩、２ヶ月間連用させ、連用前、連用１、２ヶ月後に、頬部における角栓形成の指標であるポルフィリン量の解析、レプリカによる毛穴形状解析、及び画像データを用いた毛穴印象度解析を行った。

角栓の指標であるポルフィリン量は、角栓スコープＣｈａｒｍ Ｖｉｅｗ（モリテックス）を用いて頬部の紫外線画像を取得し、画像をガウスフィルターにて平滑化後、二値化を行い、白画素として検出される蛍光部位を定量することで得た。有効成分を含まない比較例２を連用させた側では、連用期間中ポルフィリン量が増加したが、有効成分であるザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含む処方例２を連用した側ではポルフィリン量の増加が見られず、また群間差が認められたことから（ｐ＜０．０５）、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物による角栓形成抑制作用が示された（表６）。

頬部のレプリカを、レプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（ＦＬＥＸＩＣＯ）を用いて採取し、採取したレプリカは実体顕微鏡下、光源入射角を３０度の下、撮影した。得られた画像に対し、気泡等によるノイズの軽減処理を加え、二値化により得られた毛孔について、最大毛穴平均深さを計測し、使用前に対する比率として算出した。その結果、比較例２を連用した側では、最大毛穴平均深さの経時的な増加が認められたが（Ｐ＜０．０５）、処方例２を連用させた側では、連用による変化は認められなかった。また、使用２ヶ月後においては、処方例２連用側と比較例２連用側との間に群間差が認められたことから（Ｐ＜０．０５）、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物により毛穴の深さが減少することによる、毛穴の目立ち改善効果が示された（表７）。

Ｆａｃｉａｌ Ｓｔａｇｅ ＤＭ−３（モリテックス）にて撮影した臨床写真撮影にて得られたカラー画像をＲＧＢに色分解し、Ｇｒｅｅｎ画像を用いて二値化した後に、解析領域内の黒画素数の分散を求め、毛穴の目立ちが均一化された指標として毛穴印象度とした。有効成分を含まない比較例２を連用させた側では、連用期間中毛穴印象度が有意に増加したが（ｐ＜０．０５）、有効成分であるザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含む処方例２を連用した側では毛穴印象度の増加が見られなかった。また、処方例２連用側と比較例２連用側との間に群間差が認められたことから（Ｐ＜０．０５）、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物により毛穴印象度が改善されることによる、毛穴の目立ち改善効果が示された（表８）。

実験例５ 連用試験３
ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を配合したクリームの処方例３及び比較例３を用いて、２０代〜４０代の男性被験者１２名を対象に、１ヶ月間の連用試験を行った。被験者には有効成分の有無を告知しないブラインドテストとし、また被験者の一方の前腕部に有効成分を含む処方例３を、他方の前腕部に比較例３を連用させるハーフサイドテストとした。そして、１日２回朝、晩、１ヶ月間連用させ、１ヶ月後にアンケート調査を行った。その結果、有効成分を含む処方例３を連用させた場合に、体毛の目立ち改善効果や、肌の状態の改善効果を認める回答が得られた。

本願発明は、角栓形成メカニズムに基づき、ザクロ果汁及び／又はザクロ果汁の乳酸菌発酵物の使用により、角栓形成に関与する毛包の内毛根鞘形成を抑制し、男性ホルモンの活性化を抑制することで、角栓形成を防ぎ毛穴の目立ちを改善することができる、角栓形成抑制剤、ＧＡＴＡ３発現抑制剤、１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進剤、及び体毛抑制剤を提供できる。

Claims (5)

1. ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする角栓形成抑制剤。
2. ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とするＧＡＴＡ３発現抑制剤。
3. ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする１７βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ２発現促進剤。
4. ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする角栓形成抑制剤であって、乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムであることを特徴とする角栓形成抑制剤。
5. ザクロ果汁の乳酸菌発酵物を含有することを特徴とする体毛抑制剤。