JP6263609B2 - リポソーム組成物及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明はリポソーム組成物及びその製造方法に関する。本発明は、好適に医薬品用途として用いることのできるリポソーム組成物及びその製造方法に関する。

リポソーム（以下、脂質小胞体ともいう）は、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームは、バリア能、化合物保持能、生体適合性、粒径設定の自由度、易分解性、表面修飾性等の特徴を生かして、免疫センサー、人工赤血球、薬物送達システムのキャリヤーなど多様な応用が検討されてきた。キャリヤーの用途において、リポソームは、水溶性化合物、脂溶性低分子、高分子と幅広い物質を内包することができる。

リポソームを特に薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、生体膜での透過の観点から、粒子サイズを２００ｎｍ程度以下にする必要がある。また、薬物送達システムのキャリヤーでは、哺乳類の体温である３７℃程度の温度条件下で分散性が良好な粒子を形成しているリポソームにする必要もある。特に、ナノサイズの微粒子については、凝集、沈降や薬物の漏出など様々な観点から、保存安定性を付与することが好ましい。

薬物送達システムのキャリヤーとして、静脈内注射により薬剤（薬物を含むリポソームを含む溶液等）を投与する場合、静脈注射剤には高い安全性が求められる。クロロホルムなどの塩素系溶剤又は使用が認められていない分散助剤などの添加剤は好ましくない。また、医薬品としての安定性の付与も必要であり、保管後の薬物の漏出、脂質の分解抑制などが求められる。さらに、無菌性を保証するために、無菌ろ過に対する適性も求められる。リポソームを医薬品として工業的規模で製造方法するには、上記のような観点を考慮に入れる必要がある。

特許文献１には、ゲムシタビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシタビンの局所濃度を維持することができるゲムシタビン封入薬剤担体が記載されている。また、膜構成成分としてコレステロール類を特定比率で含有することにより、好適な放出率を示すことが記載されており、リン脂質類とともに、コレステロール類を０〜３５ｍｏｌ％未満の比率で含む担体に、ゲムシタビンを封入してなるリポソームを含む薬物担体が記載されている。さらに、リポソームからの薬物放出率は、コレステロール比率が低下するに従って低下することも記載されている。

特許文献２には、水性媒体中にリポソームを含む水溶液であって、リポソームはコレステロール及びホスファチジルコリンを含む膜によって媒体から隔離された水性内部空間を有し、内部空間は補足されたイリノテカン及びスクロース８硫酸を含む水溶液が開示されている。また、このリポソーム組成物は、７２７ｍｍｏｌ／ｋｇもの高いリポソーム内浸透圧が十分に許容されているが、実施例では、スクロース８硫酸などのポリアニオンを用いているため、リポソームに使用できる薬物が限定されてしまうことがある。また、実施例６４には、浸透圧７２７ｍｍｏｌ／ｋｇの水溶液を調製したとの記載がある。しかし、この水溶液の保存安定性又はリリース性に関して言及はない。

上記のいずれの文献においても、実用上必要な長期の保存安定性を有し、かつ適切なリリース（放出）速度をもつリポソーム組成物及びその製造方法は十分確立されておらず、改良が望まれている。

国際公開第２００５／０２１０１２号 特許第４９７１１４２号公報

リポソームの脂質膜に薬物を吸着させて保持するような方式では、疎水性相互作用、静電相互作用などの強固な相互作用により、リポソーム外に薬物が放出されにくくなる。そのため、製造後のリポソーム組成物の構成が維持でき、長期の保管安定性を担保しやすい。
この場合、相互作用が強すぎるため、患部に薬物を放出させることが困難になる。そこで、薬物をリポソームの内水相に溶解状態で内包することが理想的であり、さらにリポソーム組成物を高張の条件にすることで、リポソーム組成物からの薬物の放出を促進し、より適したドラッグデリバリーが実現できる。ただし、高張の条件にすることで、リポソーム組成物から薬物が漏出し易くなり、長期の保管安定性を担保することが困難であった。

また、効果的に患部に薬剤を送達させる場合、リポソームの平均粒子径が１００ｎｍ以下の微粒子であることが好ましい。しかし、微粒子化することで、リポソームの膜の湾曲（曲率）が大きくなり、薬物を内包させることが困難であった。

リポソームに含まれる薬物が抗がん剤である場合、がん細胞への攻撃が薬物の曝露時間に大きく影響されるものがある。例えば、ＤＮＡ合成を阻害する代謝拮抗剤のような薬物は、ＤＮＡ合成期にある一部の細胞だけを攻撃するため、曝露時間が短いと効果的な殺細胞性が得られない。そのような薬物において、投与後の体内代謝が速いと、腫瘍での充分な曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多い。
また、曝露時間を充分に得るために、希薄濃度の抗がん剤を点滴によって長時間曝露させる投与方法もあるが、患者が点滴時間中拘束されるなどＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ；生活の質）の観点において好ましくない。

本発明は、上記に鑑みて、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節でき、数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節でき、数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、
内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、
リポソームからの薬物のリリース速度が、血漿中３７℃において１０％／２４ｈｒ以上７０％／２４ｈｒ以下であるリポソーム組成物である。

本発明のリポソーム組成物において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、薬物が抗がん剤又は代謝拮抗剤の少なくとも一つである。
好ましくは、リポソームを構成する脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含む。
好ましくは、リポソームの平均粒子径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
好ましくは、リポソームからの薬物のリリース速度が、血液成分を含まない生理食塩水中３７℃において１０％／２４ｈｒ以下である。

本発明は、上記に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物である。

本発明は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
内包されなかった薬物水溶液を低張の液で置換することで内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して高張に調整する浸透圧調整工程
を有するリポソーム組成物の製造方法である。

本発明のリポソーム組成物の製造方法において、以下の態様が好ましい。
好ましくは、浸透圧調整工程が、リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する。
好ましくは、乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる。
好ましくは、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う。

本発明のリポソーム組成物によれば、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節でき、数十時間のオーダーでの薬物のリリース速度をもつリポソーム組成物、及びその製造方法が提供できる。

図１はインキュベーション時間と外水相率との関係をプロットしたものである。 図２はインキュベーション時間と放出率との関係をプロットしたものである。 図３はゲムシタビン塩酸塩の薬物濃度とＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙとの関係をプロットしたものである。 図４は投与後の時間と血漿中の遊離ゲムシタビン濃度との関係をプロットしたものである。 図５はマウスにＣａｐａｎ−１細胞を移植し皮下腫瘍を形成させたときの、腫瘍体積と移植後の日数との関係をプロットしたものである。 図６はマウスにＣａｐａｎ−１細胞を移植し皮下腫瘍を形成させたときの、マウスの体重と移植後の日数との関係をプロットしたものである。 図７はマウスにＢｘＰＣ−３細胞を移植し皮下腫瘍を形成させたときの、移植後の日数と腫瘍体積との関係をプロットしたものである。 図８はマウスにＢｘＰＣ−３細胞を移植し皮下腫瘍を形成させたときの、移植後の日数とマウスの体重との関係をプロットしたものである。 図９はマウスにＳＵＩＴ−２細胞を移植し腫瘍を形成させたときの、移植後の日数と生存率との関係をプロットしたものである。 図１０は本発明のリポソーム組成物の経過時間とゲムシタビン塩酸塩の薬物濃度との関係をプロットしたものである。 図１１は本発明のリポソーム組成物の経過時間とゲムシタビン塩酸塩の存在率（未内包率）との関係をプロットしたものである。 図１２は本発明のリポソーム組成物の経過時間とリポソームの粒径との関係をプロットしたものである。 図１３は本発明のリポソーム組成物の経過時間と血漿中に放出された薬物放出率との関係をプロットしたものである。 図１４は本発明のリポソーム組成物の投与後の時間と血漿中薬物濃度との関係をプロットしたものである。

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。

「封入率」とは、リポソームの構成成分と薬物とを混入して、封入した薬物担体を形成するとき、混入した薬物（仕込み量）に対するリポソームに封入された薬物の比率（質量比またはｍｏｌ比）をいう。
「放出」とは、リポソームに封入された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出ることを意味する。
「放出率」とは、リポソームの構成成分と薬物とを封入したリポソームから外部へ出る薬物と、リポソームに封入された薬物との比率（重量比またはｍｏｌ比）をいう。
「リリース（放出）速度が遅い」とは、単位時間あたりにリポソームの外部へ出る薬物量が少ないことを意味する。
「血中滞留性」とは、リポソーム組成物（又はリポソーム組成物を含有する医薬組成物）を投与した対象（「被検体」又は「個体」であり、好ましくはヒト（患者）、マウス、サル、家畜などの哺乳動物）において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質（状態）を意味する。
「腫瘍」（本発明では、「がん（癌）」と同義で用いる）とは、具体的には食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、喉頭癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、カポジ肉腫などの固形腫瘍、また白血病などの液性腫瘍が挙げられる。腫瘍が発生する部位は、腫瘍の細胞、組織、器官または臓器及びそれらの内部などである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、
内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、
リポソームからの薬物のリリース速度が、血漿中３７℃において１０％／２４ｈｒ以上７０％／２４ｈｒ以下である、
リポソーム組成物である。

（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラ又はユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性及び安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。

リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態などが挙げられ、これらの組合せでもよい。

リポソームの大きさ（平均粒子径）は特に限定されないが、２〜２００ｎｍであり、好ましくは５〜１５０ｎｍ、より好ましくは５〜１２０ｎｍであり、さらに好ましくは５〜１００ｎｍである。なお、本発明において、「平均粒子径」とは、光散乱法により測定されるリポソームの直径の平均値を意味する。
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。

リポソームの脂質二重層を構成する成分（膜成分）は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質として、具体的には、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種又は複数種の成分から構成されてよい。

リン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、又はこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。これらのなかでも、水素添加大豆ホスファチジルコリンなどの水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましく、水素添加大豆ホスファチジルコリンがより好ましい。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。

リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、特に限定されないがリン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。

リン脂質以外の脂質が塩基性官能基を含む場合、例えば、脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。

コレステロール類としては、コレステロールを挙げることができる。平均粒子サイズが１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。しかし、漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋めるためにコレステロールなどを添加することが有効である。

リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸、ジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤などの添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。

本発明のリポソームには、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類及びそれらの誘導体として、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類を親水性高分子で修飾することが含有することが好ましい。

親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は最も汎用であり、血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。

ＰＥＧの分子量は、特に限定されない。ＰＥＧの分子量は５００〜１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００〜７，０００ダルトン、より好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンである。

本発明のリポソームでは、リポソームに含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ＰＥＧ修飾脂質）を用いることが好ましい。ＰＥＧ修飾脂質としては、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）及びジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。これらのＰＥＧ修飾脂質は、全脂質量に対して０．３〜５０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％含有するように添加すればよい。

本発明のリポソームでは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（リポソームに含まれる主たる脂質）、１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（主たる脂質と併用する脂質）、及びコレステロールの脂質の組合せが好ましい。

本発明のリポソーム組成物では、アニオンポリマー（ポリアニオン）を含まないことが好ましい。本発明では、内水相の浸透圧でリリース性をコントロールできるため、汎用性に優れ、リポソームに使用できる薬物が限定されることがないという利点を有する。

（薬物）
本発明のリポソームは、薬物として水溶性薬物の少なくとも一つを含むことができる。
水溶性薬物の場合、リポソームの内水相に保持する形態が有利となるが、脂質二分子膜は薄く、やわらかいために薬物が漏出しやすくなることがある。しかし、本発明のリポソームの製造方法によれば、粒子径を１００ｎｍ程度以下にしても、安全性及び安定性を有するリポソームが製造できる。

薬物に含まれる薬物は、リポソームに内包することのできる水溶性の薬物であればよく、具体的には、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、低分子化合物、糖類（オリゴ糖及び多糖）、高分子化合物、抗腫瘍剤、抗菌剤、造影剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、育毛剤等の生理活性又は薬理学的活性を有する水溶性の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。リポソームを薬物送達システムのキャリヤーとして用いる場合、安定性の観点から、水溶性薬物は低分子化合物であることが好ましい。

水溶性薬物としては、具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンなどのアントラサイクリン系、シスプラチン、オキサリプラチンなどのシスプラチン系、パクリタキセル、ドセタキセルなどのタキサン系、ビンクリスチン、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系、ブレオマイシンなどのブレオマイシン系、シロリムスなどのシロリムス系の抗がん剤、メトトレキセート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビン、ペメトレキセドなどの代謝拮抗剤等が挙げられる。これらのなかでも、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ペメトレキセド等の水溶性薬物が好ましい。

（溶解状態で内包した水溶性薬物）
本発明のリポソームに内包した水溶性薬物は、リポソームの内水相に溶解状態で存在している。ここで、溶解状態とは、リポソームの体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで薬物結晶が観察されない、ＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合は、脂質膜が作る物理化学的な環境による溶解促進や、一部薬物が脂質膜に取り込まれるなどして大部分が溶解していることを示し、溶解状態で内包されたものとみなす。また、リポソーム内部で固体物を形成させて、薬物を封入させるローディング方法により内包したものは、水溶性の高い薬物であっても、本発明でいう溶解状態ではない。

溶解状態で内包させる水溶性薬物としては、水に対して１ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものがより好ましい。

（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソームの製造方法は、
乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び
リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する薬物ローディング工程
を有するリポソーム組成物の製造方法である。リポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程等、他の工程を含んでよい。

乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化することでリポソームを形成する乳化工程では、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶剤を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。

（乳化工程）
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化する。脂質が有機溶媒に溶解している油相及び水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相及び水相がＯ／Ｗ型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。又は、油相中の有機溶媒の一部又は全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。

撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波又は機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理又はマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、薬物をローディングしない状態のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。

本発明では、撹拌の速度及び時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性及び安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ以上３５ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ以上３０ｍ／ｓｅｃ以下のせん断を与えることがより好ましい。

（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、又はシクロヘキサンといった有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤をまったく用いないことがより好ましい。

水溶性有機溶媒は、特に限定されないが、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒は、具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類などが挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコールは、エタノール、メタノール、２−プロパノール、及びｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。

エステル系有機溶媒は、特に限定されないが、有機酸及びアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒は、具体的には、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチル、及びプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、プロピオン酸メチルがより好ましく、酢酸エチルがさらに好ましい。

水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合比率は、特に限定されないが質量比で、９０：１０〜３０：７０、好ましくは８０：２０〜４０：６０、より好ましくは８０：２０〜７０：３０であればよい。水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水又は緩衝液など下記に述べる水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば１〜３０質量％の範囲で加えられていてもよい。混合溶媒のｐＨは、特に限定されないが、３〜１０程度の範囲が好ましく、４〜９程度であることがより好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬剤などの生理活性物質などを含んでいてもよい。

水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、特に限定されないが質量比で、８０：２０〜７０：３０であることが好ましい。

脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、４０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌ、好ましくは１００ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであればよい。

（水相）
水相とは、外水相及び内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。たとえば注射剤の場合においては、バイアル瓶やプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液やその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッドバッファーなどがあげられる。水相のｐＨは特に限定されないが、５〜９、好ましくは７〜８であればよい。例えば、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳともいう）及びトリス緩衝生理食塩水などが挙げられる。

（蒸発工程）
本発明では、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、及び油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。

蒸発工程における有機溶剤を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、及び真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。

本発明では、有機溶剤を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶剤を蒸発させる工程の開始後から３０分間以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。

本発明の製造方法を実施する際の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５℃以上４０℃以下の脂質を使用する場合、３５℃以上７０℃以下とすることが好ましい。

乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、又は濃度や浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過、凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。

得られたリポソームは、透析法、濾過法、エクストリュージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。本発明のリポソーム組成物の製造方法では、薬物をローディングしない状態の空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに調製することが好ましい。また、リポソーム内に内包された薬物と内包されない薬物とを分離するには、遠心分離法、透析法、ゲル濾過法等が利用できる。

（エクストリュージョン処理）
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液及びフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。

（薬物ローディング工程）
本発明の薬物ローディング工程では、リポソームに水溶性薬物を封入させる場合、水和・膨潤させる水性媒体に薬物を溶解し、相転移温度以上の加熱、超音波処理又はエクストルージョン等の方法により薬物をリポソームの内水相に内包させることができる。また、脂質乳化時の水相に薬物を溶解させ内水相に内包させることもできる。

（浸透圧調整工程）
本発明では、浸透圧調整工程によって、リポソームの内水相を高張にすること（圧力差）によって、薬物が放出しやすくなる。浸透圧を設定することにより、リリース速度が制御できる。浸透圧調整工程として、特に限定されないが、薬物ローディング工程の後に透析などの方法が採用できる。これにより浸透圧を調整することができる。また、本発明では、薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程（好ましくは内水相の浸透圧調整）を同時に行うことが、生産効率の観点から好ましい。

本発明では、放出（リリース）の制御をすることにより、例えば、ドラッグデリバリーシステムとして本発明のリポソームを用いた場合、ターゲットとする患部において、必要とする薬物を必要な量を放出することができる。ただし、高張のリポソームは、薬物を放出し易いという反面、保管時にも漏出し易くなるという、保管安定性との両立が困難である。本発明のリポソームの組成物によれば、乳化された脂質から得られる、内水相を有するリポソームに対して、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であるように設定することで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるという予想外の効果を有する。

一般に、内水相を高張にする方法としては、例えば、薬物が内包されていないリポソームの内水相と外水相とを高い浸透圧にして、その後、透析などで、外水相の浸透圧を低下させる方法がある。その場合、その後に行われる薬物ローディング工程において、内水相に含まれる薬物が漏出し、かつ内水相の浸透圧が低下することがある。

したがって、本発明では、薬物のローディングとともに、高い浸透圧の溶液で内水相を置換し、その後、透析により外水相の薬物の除去と外水相浸透圧の低下を同時に行うことで、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。

本発明のリポソームでは、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、好ましくは２．５倍〜６倍であり、より好ましくは３倍〜５倍である。２倍以上にすることによって、リポソームの脂質二重膜は、二重膜構造又は指組み構造などの構造を示すことが一般的に知られている。内水相の浸透圧が外水相に対して２倍以上になると、リポソームは二重膜構造から指組み構造になり始める。本発明では、好適な指組み構造をとるために、各種脂質の条件を設定すればよいが、コレステロール比率の調整により制御することが好ましい。その結果、薬物の放出し易さと保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。

最終的な薬物ローディング工程後に得られた液は、外水相と内水相の溶質が均一化されており、そのときの浸透圧を、完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧と定義できる。ただし、その後の外水相の透析による置換・浸透圧調整工程において、加熱操作は脂質の相転移以下に抑えるなど、内水相の溶質が充分に保持されている場合に限る。また外水相の浸透圧は、最終的な透析工程に用いる透析液の浸透圧で定義できる。ただし、透析液にて充分に置換できた場合に限る。また、リポソーム組成物の完成液について、遠心分離や限外ろ過を利用し、外水相の溶質の組成濃度と内水相の溶質の組成濃度を定量し、その組成液の浸透圧を計測することでも、内水相及び外水相の浸透圧を得ることができる。

浸透圧の計測は第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定法にしたがえばよい。具体的には水の凝固点（氷点）降下度測定により、オスモル濃度を求めることができる。また、水の凝固点降下度は溶質モル濃度で定義されるものであり、溶質モル濃度からもオスモル濃度を求めることができる。

本発明における外水相の持つ浸透圧は、投与に際して重要な影響を生体に及ぼす。体液の浸透圧から大きく離れる場合は、各組織での水分の移動を原因とした溶血や痛みが発生する。したがって、本発明における外水相の浸透圧は、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、もっとも好ましくは体液と等張である。

（無菌ろ過）
本発明のリポソーム組成物の製造方法によって得られた、リポソームを含む水溶液を医薬組成物とするために、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜、メンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、特に限定されないが、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。通常、ろ過工程において、ろ過滅菌フィルターへのリポソームが吸着又は凝集が発生することがある。しかし、本発明では、特定の平均粒子径及び均一な粒子径分布を有するリポソームが得られるため、ろ過を行う時に圧損などの影響が少ないという予想外の効果を有する。

リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程及び後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。

（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソームを含む水溶液は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。

本発明によって得られるリポソームを含む水溶液に、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えてリポソーム組成物を含有する医薬組成物とすることができる。医薬組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、及びｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。

等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。

安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。

酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ等が挙げられる。安定化剤及び酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。

ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウムなどが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。

特に、本発明では、医薬組成物に、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウム、塩酸などを含有することが好ましい。

医薬組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。

医薬組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部及び薬液中のガスを窒素などの不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。

医薬組成物の投与方法は、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射、髄腔内注射を選択することができる。リポソーム組成物の具体的な投与方法としては、シリンジ、点滴による投与が挙げられる。

医薬組成物に含まれる薬物の投与量は、通常、一日につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。しかし、本発明のリポソーム組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。

（リリース速度）
リリース速度とは、単位時間あたりにリポソームの外部へ出る薬物量を意味する。本発明において、リリース速度は、血漿中３７℃において、１０質量％／２４ｈｒ以上７０質量％／２４ｈｒ以下が好ましく、２０質量％／２４ｈｒ以上６０質量％／２４ｈｒ以下がより好ましくは２０質量％／２４ｈｒ以上５０質量％／２４ｈｒ以下がさらに好ましい。

リリース速度は、温度に依存するため、定温条件で測定することが好ましい。例えば、ヒトの場合、温度は特に限定されることはないが、体温（３５℃以上３８℃以下）の範囲内で測定することが好ましい。

リポソームに含まれる薬物が抗がん剤である場合、リリース速度が１０質量％／２４ｈｒ未満であると、抗がん剤として充分な体内での曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多く、また、場合によっては抗がん剤を含むリポソームが不要に長い時間体内に残留することで、皮膚などの本来分布しにくい組織に集積することで予想外の毒性が発現する場合がある。また７０質量％／２４ｈｒより大きいと、単位時間あたりの曝露する薬物量が多くなるため、最高血中濃度が高くなることで毒性が大きくなり、また、漏出した薬剤が腫瘍部部以外の組織に分布あるいは速やかな代謝を受け血中滞留性が低下するために好ましくない。

上記のように、血漿中での適度なリリースを得る場合において、緩衝液などでも同様に薬物のリリースが生じると、製剤の保管時に薬物が漏出する、又は投与時の輸液による希釈時に漏出することがある。したがって、血漿成分を含まない生理食塩水に対する漏出は抑制する必要があり、好ましくは１０質量％／２４ｈｒ以下である。

リポソームに含まれる薬物は、液体高速クロマトグラフ、マススペクトルなどの方法によって測定することができる。
また、薬物のリリース速度を測定する際、薬物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤では、例えば、ヒト（患者；体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好ましい。他の動物の場合も、上記の体重６０ｋｇ当たりの投与量に対して、体重及び表面積に応じて換算した量を投与することができる。

（腫瘍体積）
本発明では、腫瘍体積を測定するために、モデルとなる動物（好ましくはマウスもしくはラット）に対して腫瘍を移植できる。本発明のリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、腫瘍の体積の増殖抑制という効果が観測できる。腫瘍の体積の増殖抑制は、使用される薬物、リポソームを構成する脂質等の組合せ、及び有効量に依存する。腫瘍体積の増殖抑制とは、腫瘍成長を抑制し得るか、腫瘍静止を達成し得るか、及び実質的若しくは完全な腫瘍退縮の少なくとも一つを意味する。

本発明のリポソーム組成物を哺乳動物等の対象に投与する場合、モデル動物に対して、処置グループ及びコントロールグループに分配して、腫瘍細胞が定着するよう、腫瘍細胞移植の例えば、腫瘍細胞が１００〜１０００ｍｍ²に成長した後、開始できる。投薬量は、治療開始時の体重に基づいて０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与できる。例えば、モデル動物がマウスの場合、本発明のリポソーム組成物の評価として、各グループのマウスを最低体重に達するまで毎日全体として体重を測定した。次いで、実験の終了まで、各グループの体重を測定した。サンプリング時のための最終屠殺まで、腫瘍が２０００ｍｍ³に達するまで又は動物が死亡するまでノギス等で腫瘍を測定できる

哺乳動物の対象の中の腫瘍体積は、任意の当分野で認められている方法を用いて測定され得る。例えば、ノギスの測定を用いて、式：（ａ×ｂ²）×０．５（式中、“ａ”は最大直径であって、“ｂ”は短径の長さである）を用いて腫瘍体積を評価できる。また、ヒトでは、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）走査、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）走査のような画像診断などの手法により腫瘍体積を測定することができる。

本発明のリポソーム組成物及びその製造方法では、実用上必要な長期の保存安定性を有し、内水相を高張にすることで、薬物の放出性を適度に調節でき、数十時間のオーダーでの薬物のリリース制御をもつリポソーム組成物を得ることができる。本発明のリポソーム組成物は、医薬品、化粧品、食品など適用可能であり、特に医薬用途に有用である。

以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。
溶剤組成における混合比は容量比を意味する。例えば、「エタノール／酢酸エチル＝９０／１０」は、容量比で９０％エタノール／１０％酢酸エチルを意味する。
全相とは、油相及び水相を意味する。

（実施例１、２及び比較例１〜３）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロールを７６／１９のモル比となるようにそれぞれ１．７９ｇ、０．２２ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝１／１）１５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。

ｂ）水相の調製
ゲムシタビン塩酸塩を注射用水と１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）を用い、８ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。その際、注射用水とＰＢＳの比率を変更することで、下表の浸透圧になるよう調整した。

ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成と同時に実施した薬物内包工程
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ−３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに６０００ｒｐｍにて１０分間混合し、つぎに１２０００ｒｐｍにて１０分間混合した。その後、水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧともいう）とのモル比が７６／１９／５となるように０．４１ｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧを水溶液として添加した。つづいて、７０℃での加温を維持し攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸散させ、表２に示す浸透圧となった時点で加温と攪拌を止め、蒸散を停止した。このときの浸透圧が完成する薬物内包リポソームの内水相浸透圧となる。つづいて、７０〜８０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、０．２μｍフィルター及び０．０５μｍフィルターを順次通過させることで整粒した。

透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として水で１０倍容量に希釈した１０×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ニッポンジーン社製）を調製した。この液の浸透圧は３０７ｍＯｓｍ／Ｌであった。この浸透圧が完成する薬物内包リポソームの外水相浸透圧となる。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。

体積平均粒子径の測定
体積平均粒子径は試料を水で１０００倍重量に希釈し、ナノトラックＵＰＡ−ＵＴ（日機装社製）を用いた動的光散乱法で測定した。結果を表３に示す。

血漿中のリリース速度の測定
実施例１、２及び比較例１〜３のリポソーム組成物５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、０、１、４、９、２４時間の時点で１００μＬ採取した。つづいて、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ、ミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、リリース速度及び外水相率を次の式により算出した。
式：リリース速度（％／２４ｈｒ）＝（インキュベーション２４時間後のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物の全相に含まれる薬量×１００
式：外水相率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×１０）÷製剤中薬物濃度×１００
結果を表３及び図１に示す。

以上の結果より、本発明によれば外水相に対する内水相の浸透圧を調整することにより、血漿中におけるリリース速度を任意にコントロールできることが分かる。

（実施例３）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＤＳＰＥ−ＰＥＧを７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６．６ｇ、２．０ｇ、４．３ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝７５／２５）４０５ｍｌを加えて７０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。

ｂ）水相の調製
６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８６）を調製し水相とした。

ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機にて、周速２０ｍ／ｓ、１３０００ｒｐｍで３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤と水とを蒸発させ、乳化前の容積に対して約１／１０の体積になるまで濃縮し、薬物未内包リポソームを得た。このときの粒子径は６７．０ｎｍであった。

ｄ）薬剤内包リポソームの調製
薬物ローディング
１）ＰＢＳ（１０×）の調製
塩化ナトリウム８１．６３ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２９．０１ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．２９ｇを注射用水９４８ｇで溶解し、ＰＢＳ（１０×）とした。実施例３ではここで調製したＰＢＳを用いた。
２）薬物ローディング液の調製
ゲムシタビン塩酸塩７．６８ｇ、ＰＢＳ（１０×）３１．９９ｇ、日局注射用水４４．８３ｇ、８Ｎ水酸化ナトリウム１．６０ｍＬを混合し、薬物溶液とした。つづいて、４つのバイアルにそれぞれ薬物溶液１７．６４ｍＬ、薬物未封入リポソーム１８．００ｍＬ、８Ｎ水酸化ナトリウム０．３６ｍＬを混合した。７０℃で１０分間加熱した後４０℃で３０分間かけて放冷した。この液の浸透圧は１０３９ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソーム組成物の内水相浸透圧になる。つづいて、２．７倍希釈したＰＢＳ（１０×）で希釈した。１つのバイアルにまとめて薬物ローディング液とした。

透析によるリポソーム組成物の完成
透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程より、ゲムシタビン濃度０．６８ｍｇ／ｍＬ、粒子径７３ｎｍ、内水相／外水相浸透圧比３．６倍の薬物内包リポソーム組成物を得た。

血漿中のリリース速度及び外水相率の測定
実施例３で得られたリポソーム組成物５０μＬを、それぞれマウス血漿が０％、１％、３％、１０％、３３％、１００％となるようにＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈した溶液で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、０、１、４、９、２４時間の時点で１００μＬ採取した。つづいて、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ、メルクミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、リリース速度及び外水相率を次の式により算出した。
式：リリース速度（％／２４ｈｒ）＝（インキュベーション２４時間後のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物全相に含まれる薬量×１００
式：外水相率（％）＝（各インキュベーション時点のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物全相に含まれる薬量×１００
結果を表４及び図２に示す。

表４の結果から、本発明のリポソーム組成物は、ＰＢＳ中ではリリースが抑えられ、驚くべきことに血漿中でリリースが加速することが分かった。この現象は比較例１及び２の血漿中の放出試験の結果からも分かる通り、内水相の外水相に対する浸透圧差が大きくないリポソーム組成物には生じない。血漿中だけでリリースが向上することは、リポソーム組成物の保管時や点滴液への希釈時における漏出は抑制しながらも、体内への投与された場合のみ放出が促進されることを示し、実用上の大きな利点である。内水相の浸透圧が高いと、脂質膜が指組みゲル構造に変化し、血漿中に含まれるリポタンパクなどとの相互作用が高まることで放出が促されると考えられる。

（実施例４）
実施例４は下記に記載する方法で薬物ローディング液を調製した以外は実施例３同様に作製した。
薬物ローディング液の調製
ゲムシタビン塩酸塩１．０３ｇ、１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１７．９２ｇ、日局注射用水１０．７６ｇ、１Ｍ水酸化ナトリウム３．４２ｍＬを混合し、薬物溶液とした。つづいて、薬物溶液２７．０ｍＬ、薬物未封入リポソーム２７．０ｍＬを混合した。７０℃で１０分間加熱した後室温で３０分間かけて放冷し、薬物ローディング液とした。この液の浸透圧は１０１４ｍＯｓｍ／Ｌであった。

（比較例４及び５）
比較例４は、１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を減量した分量について日局注射用水を増量し、浸透圧を２３９ｍＯｓｍ／Ｌに調整した以外は実施例４と同様に作製した。
比較例５は、１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を増量した分量について日局注射用水を減量し、浸透圧を１４８２ｍＯｓｍ／Ｌに調整した以外は実施例４と同様に作製した。

平均粒子径の測定
平均粒子径は試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で１００倍重量に希釈し、ＦＰＡＲ−１００ＡＳ（大塚電子）を用いた動的光散乱法でキュムラント平均粒子径を測定した。結果を表５に示す。

血漿中のリリース速度の測定
実施例４及び比較例４、５で得られたリポソーム組成物５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ、メルクミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、リリース速度を次の式により算出した。
式：リリース速度（％／２４ｈｒ）＝（インキュベーション２４時間後のろ液中の薬物量−インキュベーション前のろ液中の薬物量）×２０÷リポソーム組成物の内水相に含まれる薬量×１００
結果を表５に示す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ がん細胞増殖阻害
Ｃａｐａｎ−１（ヒト膵がん細胞株）を２×１０³Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ／ｗｅｌｌを９６ウェルプレートに播種した。つづいて、遊離薬物（ゲムシタビン塩酸塩）溶液、実施例４及び比較例４、５のリポソーム組成物に内包された薬物を各濃度添加した後、１４４時間後まで培養した。培養終了後にＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより得られた発光量から細胞生存率を算出した。結果を図３に示す。また、がん細胞増殖を５０％阻害する薬物作用濃度（ＩＣ５０）を求めた。遊離薬物が７ｎＭ、実施例４のリポソーム組成物が６ｎＭ、比較例４が２２ｎＭ、比較例５が５ｎＭを示した。図３からリリース速度が低い比較例４のリポソーム組成物における有効性が顕著に低下していることが分かる。

血中滞留性の測定
７週齢雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに飽食条件下で実施例４及び比較例４、５のリポソーム組成物を、薬物量として１ｍｇ／ｋｇ尾静脈注射により投与した。投与後１５分間、４時間、２４時間で採血し、遠心分離を施し血漿中の遊離ゲムシタビン濃度を定量した。結果を図４に示す。また、血中濃度半減期（以下、Ｔ_1/2ともいう）を求めた。実施例４のリポソーム組成物が１５ｈｒ、比較例４が１３ｈｒ、比較例５が１３ｈｒを示した。マウス中における遊離ゲムシタビンのＴ_1/2は０．７ｈｒであり、いずれのリポソーム組成物も血中滞留性が大幅に向上しているが、リリース速度が９０％／ｈｒである比較例４は、比較的滞留性が乏しいことが分かった。このことは、薬物が速やかな代謝を受けるため、血中での漏出が多過ぎると濃度が低下することを示している。

（実施例５、６及び比較例６）
実施例５は薬物ローディング液のスケールが異なる以外は実施例３と同様に作製した。実施例６は浸透圧調節のため実施例３のｄ）１）で調製したＰＢＳ（１０×）を増量した分注射用水を減量し、比較例６は実施例３のｄ）１）で調製したＰＢＳ（１０×）をさらに増量した分注射用水を減量した以外は実施例３と同様に作製した。
実施例４と同様にリリース速度を測定した。
平均粒子径は試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３３倍重量に希釈し、ＦＰＡＲ−１００ＡＳ（大塚電子）を用いた動的光散乱法でキュムラント平均粒子径を測定した。
結果を表６に示す。

Ｃａｐａｎ−１皮下移植担がんモデルマウスでの薬効試験
ヒト膵臓癌細胞株であるＣａｐａｎ−１細胞１×１０⁷個を雌性ヌードマウスの脇腹部皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。移植後１１日目から遊離ゲムシタビン水溶液（２４０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ／週）、実施例５、６及び比較例６のリポソーム組成物（４ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ／週）並びに溶媒参照（９．４％スクロース）を投与開始した。遊離ゲムシタビン水溶液、リポソーム組成物及び溶媒参照を尾静脈投与して、１週間１回を１クール、合計３クール実施した。移植後３２日後の腫瘍体積をノギスで測定し、皮下腫瘍の抑制効果について評価した。結果を図５に示す。また、毒性を示す尺度として体重変動を測定した。結果を図６に示す。

遊離ゲムシタビンに比べて、実施例５、６及び比較例６の投与群において、毒性を示す体重減少率が同等にも関わらず腫瘍抑制率が有意に向上し、いずれも腫瘍抑制効果を有することが分かった。また、驚くべきことに実施例５、６は腫瘍の退縮まで観察され高い効果を有することが分かった。一方、血中での放出率の高い比較例６は、退縮までの効果は示さず、最適な放出率でないことが分かった。

（実施例７）
実施例７は下記に記載する薬物ローディング液の調製が異なる以外は実施例３と同様に作製した。
薬物ローディング液の調製
ゲムシタビン塩酸塩１．０２ｇ、１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１７．８２ｇ、日局注射用水１０．７６ｇ、１Ｍ水酸化ナトリウム３．４２ｍＬを混合し、薬物溶液とした。つづいて、バイアルに薬物溶液２７．００ｍＬ、薬物未封入リポソーム２７．００ｍＬ、１Ｍ水酸化ナトリウム３．４２ｍＬを入れ、混合した。７０℃で１０分間加熱した後４０℃で３０分間かけて放冷した。この液を薬物ローディング液とした。浸透圧は１０８４ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソーム組成物の内水相浸透圧になる。
実施例４と同様にリリース速度を測定した。
平均粒子径は試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で１００倍重量に希釈し、ＦＰＡＲ−１００ＡＳ（大塚電子）を用いた動的光散乱法でキュムラント平均粒子径を測定した。
結果を表７に示す。

ＢｘＰＣ−３皮下移植担がんモデルマウスでの薬効試験
遊離ゲムシタビンに対してｉｎ ｖｉｖｏにおいて低感受性である癌細胞に対する効果を確認した試験である。
遊離ゲムシタビンに対してｉｎ ｖｉｖｏで低感受性となるヒト膵臓癌細胞株であるＢｘＰＣ−３細胞５×１０⁶個を雌性ヌードマウスの脇腹部皮下に移植し皮下腫瘍を形成させた。移植後４６日目から遊離ゲムシタビン水溶液（２４０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ／週）及び実施例６〜９のリポソーム組成物（４ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ／週）を投与開始した。遊離ゲムシタビン水溶液を腹腔内投与、リポソーム組成物と溶媒対照（９．４％スクロース）を尾静脈投与として、１週間１回を１クールとして、合計２クール実施した。移植後６０日後の腫瘍体積をノギスで測定し、皮下腫瘍の抑制効果について評価した。結果を図７に示す。また、毒性を示す尺度として体重変動を測定した。結果を図８に示す。

遊離ゲムシタビンに比べ実施例７の投与群において、毒性を示す体重減少が同等にも関わらず腫瘍抑制が有意に向上し、驚くべきことに遊離ゲムシタビン低感受性細胞株に対しても高い腫瘍抑制効果を有することが分かった。

（実施例８）
実施例８は薬物ローディング液のスケールが異なる以外は実施例３同様に作製した。
実施例４と同様にリリース速度を測定した。
平均粒子径は試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３３倍重量に希釈し、ＦＰＡＲ−１００ＡＳ（大塚電子）を用いた動的光散乱法でキュムラント平均粒子径を測定した。
結果を表８に示す。

ＳＵＩＴ−２細胞膵臓移植モデルマウスでの薬効試験
ヒト膵臓癌細胞株であるＳＵＩＴ−２細胞１×１０⁶個を雌性ヌードマウスの膵臓に移植し腫瘍を形成させた。癌細胞を移植しないが、同様の開腹手術を施した参照群をｓｈａｍ群とした。転移及び腹膜播種の認められる移植後７日目から遊離ゲムシタビン水溶液（２４０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ）、実施例８のリポソーム組成物（４ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ）及び溶媒参照（９．４％スクロース）を尾静脈投与し、移植後９１日までの生存曲線を求めた。結果を図９に示す。

遊離ゲムシタビンに比べ実施例８の投与群において、生存期間が有意に向上することが分かった。

（実施例９）
実施例３のｄ）１）で調製したＰＢＳ（１０×）の代わりに１０×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いたこと、内水相浸透圧が異なること及び薬物ローディング液のスケールが異なること以外は実施例３同様に作製し、ゲムシタビン濃度０．７１ｍｇ／ｍＬ、粒子径８４ｎｍ、薬物未内包率２．１％、内水相浸透圧９４０ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．３倍の薬物内包リポソーム組成物を得た。

保管安定性の測定
実施例９の薬物内包リポソームを２ｍＬバイアルビンに充填し５℃にて保管し、一定の時点で試料として一部サンプリングを実施した。この試料を用いて、下記各種評価を実施し、本発明におけるリポソーム組成物の安定性を測定した。

薬物の安定性の測定
サンプリングした試料５０μＬをメタノールで２０倍希釈（体積）することでリポソームに内包された薬物を抽出した。つづいて、抽出液を水で１０倍希釈（体積）し、この液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量した。結果を図１０に示す。２４ヶ月の長期間に渡り、本発明のリポソーム組成物における薬物が充分に安定であることが分かった。

未内包率の測定
サンプリングした試料５０μＬを水で１０倍希釈（体積）し、限外ろ過フィルター（ミリポア製アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、外水相に存在する薬剤の存在率（未内包率）を次の式により算出した。
式：未内包率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×１０）÷製剤中薬物濃度×１００
結果を図１１に示す。

驚くべきことに、２４ヶ月の長期間に渡り未内包率の変化がほとんどなく、本発明のリポソーム組成物の薬物が外水相に漏れずに充分に安定であることが分かった。

粒子径の測定
サンプリングした試料を１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３３倍希釈（体積）し、動的光散乱法測定を大塚電子社製ＦＰＡＲ−１０００ＡＳにて体積平均粒子径を測定した。結果を図１２に示す。１２ヶ月の長期間に渡り粒子径の変化がほとんどなく、本発明のリポソーム組成物の粒子は充分に安定であることが分かった。

血漿中の薬物放出率の測定
サンプリングした試料５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈し、３７℃で２４時間インキュベートした。つづいて外ろ過フィルター（ミリポア製アミコンウルトラ−０．５ １０ｋＤａ）を用い７４００×ｇ、３０分間、４℃の条件で遠心ろ過を実施した。回収したろ液に含まれる薬物量をＨＰＬＣにて定量し、血漿中に放出された薬物放出率を次の式により算出した。
式：薬物放出率（％）＝（ろ液中の薬物濃度×２０）÷製剤中薬物濃度×１００
結果を図１３に示す。

驚くべきことに１２ヶ月の長期間に渡り薬物放出率の変化がほとんどないことが分かった。

（実施例１０）
薬剤ローディング工程以外は、実施例３と同様に作製した。薬剤ローディングは、ペメトレキセド２ナトリウム７水和物１．９ｇ、塩化ナトリウム２．４ｇ、注射用水２４ｇを混合し、４５℃で加熱して溶解させ、薬物溶液とした。続いて、薬物溶液８．０ｍＬ、薬剤未封入リポソーム８．０ｍＬを混合し、７０℃で１０分加熱し、薬剤ローディング液とした。この液を透析してリポソーム組成物を完成させた。

ペメトレキセド濃度０．６５ｍｇ／ｍＬ、粒子径７６．８ｎｍ、内水相浸透圧１８５０ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が６．５倍の薬剤内包リポソーム組成物を得た。血漿中でのリリース速度は２９％であった。

また、８週齢雄Ｃ３Ｈマウスに非絶食条件下で実施例１０のリポソーム組成物を、薬物量として６ｍｇ／ｋｇ尾静脈注射により投与した。投与後１５分間、１時間、４時間、２４時間で採血して血漿中の遊離ペメトレキセド濃度を定量し、Ｔ_1/2を求めた。結果を図１４に示す。薬物水溶液の場合のＴ_1/2は、２時間であったことに対し、実施例１０のリポソーム組成物では、１７時間と薬剤水溶液と比較して十分に長く、ＤＤＳ製剤は十分長い血中滞留性を示すことが確認できた。

表９は、本発明のリポソーム組成物に関する、浸透圧比、リリース速度、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、及びｉｎ ｖｉｖｏ試験について示す。表９に示す結果から、リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、かつリポソームからの薬物のリリース速度が、血漿中３７℃において１０％／２４ｈｒ以上７０％／２４ｈｒ以下であるリポソーム組成物は、癌細胞増殖阻害活性が良好で、かつ優れた血中滞留性を有することが分かる。

Claims (7)

1. 内水相を有するリポソームと、外水相を構成するリポソームを分散する水溶液とを有するリポソーム組成物であって、
   リポソームが溶解状態の薬物を内包し、内水相の浸透圧が外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下であり、
   リポソームからの薬物のリリース速度が、血漿中３７℃において１０％／２４ｈｒ以上７０％／２４ｈｒ以下であり、
   リポソームを構成する脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含み、
   リポソームからの薬物のリリース速度が、血液成分を含まない生理食塩水中３７℃において１０％／２４ｈｒ以下である、リポソーム組成物。
2. 薬物が、抗がん剤又は代謝拮抗剤の少なくとも一つである請求項１に記載のリポソーム組成物。
3. リポソームの平均粒子径が５ｎｍ以上１００ｎｍ以下である請求項１又は２に記載のリポソーム組成物。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物を含有する医薬組成物。
5. 乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化してリポソームを形成する乳化工程、
   乳化工程で得られたリポソームに水溶性薬物を内包させる薬物ローディング工程、及び内包されなかった薬物水溶液を低張の液で置換することで内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して高張に調整する浸透圧調整工程
   を有するリポソーム組成物の製造方法であって、
   有機溶媒として水溶性有機溶媒及びエステル系有機溶媒の混合溶媒を用い、
   脂質が、水素添加大豆ホスファチジルコリン、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール、及びコレステロールを少なくとも含み、
   浸透圧調整工程が、リポソームの内水相の浸透圧を外水相の浸透圧に対して２倍以上８倍以下に調整する、リポソーム組成物の製造方法。
6. 乳化工程の後に得られるリポソームをエクストリュージョン処理せずに次の工程に用いる請求項５に記載のリポソーム組成物の製造方法。
7. 薬物ローディング工程及び浸透圧調整工程を同時に行う請求項５又は６に記載のリポソーム組成物の製造方法。