JP6226464B2 - Method for producing lipid using modified thioesterase - Google Patents
Method for producing lipid using modified thioesterase Download PDFInfo
- Publication number
- JP6226464B2 JP6226464B2 JP2013204893A JP2013204893A JP6226464B2 JP 6226464 B2 JP6226464 B2 JP 6226464B2 JP 2013204893 A JP2013204893 A JP 2013204893A JP 2013204893 A JP2013204893 A JP 2013204893A JP 6226464 B2 JP6226464 B2 JP 6226464B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- substituted
- protein
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 title claims description 145
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 title claims description 139
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims description 80
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 275
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 197
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 153
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 120
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 37
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 34
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 28
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 22
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 21
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 20
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 19
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 17
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 8
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 42
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 40
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 40
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 40
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 17
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 7
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 7
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 7
- -1 alkyl sulfate esters Chemical class 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 3
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 2
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 2
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001558147 Mortierella sp. Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000025271 Umbellularia californica Species 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- VUXXXYMMZBAUSE-UHFFFAOYSA-N pentadecan-7-one Chemical compound CCCCCCCCC(=O)CCCCCC VUXXXYMMZBAUSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001306132 Aurantiochytrium Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000723377 Coffea Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 241000221089 Jatropha Species 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000224474 Nannochloropsis Species 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 235000008674 Umbellularia californica Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 101150008263 accD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004332 deodorization Methods 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 description 1
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、チオエステラーゼ改変体及びこれを用いた脂質の製造方法に関する。 The present invention relates to a modified thioesterase and a method for producing a lipid using the same.
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されており、例えば、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール等の食品の中間原料や、その他各種の工業製品の添加剤、中間原料として利用されている。また、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。例えば、アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。 Fatty acids are one of the major constituents of lipids, and form a lipid such as triacylglycerol by forming an ester bond with glycerin in vivo, and are stored and used as an energy source in many animals and plants. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industrial use, for example, as intermediate materials for foods such as monoacylglycerol and diacylglycerol, as additives for various industrial products, and as intermediate materials It's being used. In addition, higher alcohol derivatives obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. For example, alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants, and polyoxyalkylene alkyl ethers and alkyl polyglycosides are used as nonionic surfactants. It's being used. Similarly, alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts as higher alcohol derivatives are routinely used as fiber treatment agents, hair rinsing agents or bactericides, and benzalkonium-type quaternary ammonium salts as bactericides and preservatives. Has been. Furthermore, higher alcohols having about 18 carbon atoms are useful as plant growth promoters.
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため動植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ACCase）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献１、非特許文献１、特許文献５）、酵母sn-2アシルトランスフェラーゼ（SLC1-1）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献２、特許文献３及び非特許文献２）、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素遺伝子（DGAT）の導入により種子中の脂質量を向上させる方法（特許文献４及び非特許文献３）等が提案されている。また、脂肪酸の生合成に関与する酵素として、アブラヤシ（Elaeis guineensis）由来のアシル−ＡＣＰ チオエステラーゼ（特許文献６）、ココヤシ（Cocos nucifera L.）由来のアシル−ＡＣＰ チオエステラーゼ（特許文献７）、カリフォルニアゲッケイジュ（Umbellularia californica）由来のアシル−ＡＣＰ チオエステラーゼのアミノ酸配列を一部改変したチオエステラーゼ（特許文献８）、等が知られている。 As described above, fatty acids and lipids are widely used, and therefore, attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in animals and plants. For example, a method for improving the amount of lipid in seeds by introducing acetyl CoA carboxylase (ACCase) (Patent Document 1, Non-Patent Document 1, Patent Document 5), and seeds by introducing yeast sn-2 acyltransferase (SLC1-1) Methods for improving the amount of lipid in the seeds (Patent Document 2, Patent Document 3 and Non-Patent Document 2), methods for improving the amount of lipid in seeds by introducing a diacylglycerol acyltransferase gene (DGAT) (Patent Documents 4 and 4) Non-Patent Document 3) has been proposed. In addition, as an enzyme involved in fatty acid biosynthesis, acyl-ACP thioesterase derived from oil palm ( Elaeis guineensis ) (Patent Document 6), acyl-ACP thioesterase derived from Cocos nucifera L. (Patent Document 7), A thioesterase obtained by partially modifying the amino acid sequence of acyl-ACP thioesterase derived from California bay ( Umbellularia californica ) is known (Patent Document 8).
本発明は、野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列を改変したチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供することを課題とする。また、本発明は、チオエステラーゼ改変体を導入しラウリン脂質の生産能が向上した形質転換体を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a modified thioesterase in which the amino acid sequence of wild-type thioesterase is modified, and a method for producing a lipid using the same. Moreover, this invention makes it a subject to provide the transformant which introduce | transduced the thioesterase modified body and improved the production ability of lauric lipid.
本発明者らは、ココヤシ（Cocos nucifera）由来のチオエステラーゼについて研究を行い、ココヤシの野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列にランダムな変異を導入し、複数のチオエステラーゼ改変体を得た。そして、これらを用いて形質転換を行った結果、いくつかの形質転換体において、野生型チオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、ラウリン脂質の生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。 The present inventors have studied thioesterase derived from Cocos nucifera and introduced a random mutation into the amino acid sequence of coco wild-type thioesterase to obtain a plurality of modified thioesterases. And as a result of transformation using these, it was found that productivity of lauric lipid was significantly improved in some transformants compared to transformants into which wild-type thioesterase was introduced. . The present invention has been completed based on this finding.
すなわち本発明は、宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
That is, the present invention includes a step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the following protein (a) or (b) into a host, and a step of collecting a lipid from the obtained transformant. (Hereinafter, also referred to as “the manufacturing method of the present invention”).
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine.
(4) The amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 was substituted from valine to glycine.
(B) The amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted, or added, and has thioesterase activity protein.
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法に関する。
また、本発明は、宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
さらに、本発明は、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質（以下、「本発明のチオエステラーゼ改変体」ともいう。）に関する。
The present invention also relates to a method for improving lipid productivity, comprising the step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host.
The present invention also relates to a transformant obtained by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host (hereinafter also referred to as “transformant of the present invention”).
Furthermore, the present invention relates to the protein (a) or (b) (hereinafter also referred to as “the modified thioesterase of the present invention”).
本発明の形質転換体は、野生型チオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、ラウリン脂質の生産能に優れる。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の脂質の製造方法は、特にラウリン脂質の生産性に優れる。本発明のチオエステラーゼ改変体、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸及び脂質、特にラウリン脂質の工業的生産に好適に用いることができる。 The transformant of the present invention is superior in the ability to produce lauric lipids compared to the transformant introduced with wild-type thioesterase. Therefore, the lipid production method of the present invention using the transformant is particularly excellent in lauric lipid productivity. The modified thioesterase, transformant, and production method of the present invention can be suitably used for industrial production of fatty acids and lipids, particularly lauric lipids.
以下、本発明のチオエステラーゼ改変体、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。また、本発明において、ラウリン脂質とは、ラウリン酸を構成成分とする脂質及びラウリン酸をいう。
Hereinafter, the modified thioesterase of the present invention, the transformant using the same, and the method for producing lipids will be described in order.
In the present invention, lipids include simple lipids such as neutral fats, waxes and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids and sulfolipids; and fatty acids, alcohols and hydrocarbons derived from these lipids. Derived lipids and the like. Moreover, in this invention, a lauric lipid means the lipid and lauric acid which have lauric acid as a structural component.
１．チオエステラーゼ改変体
本発明のチオエステラーゼ改変体は、配列番号１に示すココヤシ（Cocos nucifera）由来の野生型チオエステラーゼ（以下、単に野生型チオエステラーゼともいい、ＣＴＥとも略記する）のアミノ酸配列を一部改変したアミノ酸配列を有し、チオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
チオエステラーゼは、トリグリセリドの生合成系に関与する酵素であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン（Acyl-ACP）チオエステラーゼであって、葉緑体内や色素体内において脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。チオエステラーゼの作用によって、アシルキャリヤープロテイン上での脂肪酸合成が終了し、遊離した脂肪酸は色素体から輸送されトリグリセリド合成に供される。チオエステラーゼは、基質であるアシル‐アシルキャリヤープロテインを構成する脂肪酸残基の種類によって異なる反応特異性を示すものがあることがわかっており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
1. Modified thioesterase The modified thioesterase of the present invention has the amino acid sequence of wild-type thioesterase derived from Cocos nucifera shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter also simply referred to as wild-type thioesterase, also abbreviated as CTE). A protein having a partially modified amino acid sequence and having thioesterase activity.
Thioesterase is an acyl-acyl carrier protein (Acyl-ACP) thioesterase, an enzyme involved in triglyceride biosynthesis, and is an acyl-acyl intermediate in the process of fatty acid biosynthesis in chloroplasts and plastids. It is an enzyme that hydrolyzes the thioester bond of a carrier protein (a complex composed of an acyl group that is a fatty acid residue and an acyl carrier protein) to produce a free fatty acid. By the action of thioesterase, fatty acid synthesis on the acyl carrier protein is completed, and the released fatty acid is transported from the plastid and is used for triglyceride synthesis. Thioesterases have been shown to have different reaction specificities depending on the type of fatty acid residues that make up the acyl-acyl carrier protein that is the substrate, and are important factors that determine the fatty acid composition in vivo. It is considered.
本発明のチオエステラーゼ改変体として、具体的には下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が挙げられる。
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
Specific examples of the modified thioesterase of the present invention include the following protein (a) or (b).
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine.
(4) The amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 was substituted from valine to glycine.
(B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein of (a) and having thioesterase activity .
前記（ａ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列を少なくとも有する。配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において、１１２位〜４１４位の領域は、チオエステラーゼとして機能するために特に重要で、チオエステラーゼ活性を示すために必要十分な領域である（Voelker，T．A.，A．C．Worrell，L．Anderson，J．Bleibaum，C．Fan,D．H．Hawkins，S．E．Radke，and H．M．Davies,“Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants”，Science，1992，257，p.72-74参照）。前記（ａ）のタンパク質は、このチオエステラーゼ活性にとって必要十分な領域を有し、後述の実施例でも実証されているように、チオエステラーゼとして機能する。
さらに、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列では、配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列中の、配列番号１の２９４位、２９６位、３１１位、及び３５６位から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が、下記（１）〜（４）のように置換されている。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）からバリン（Ｖａｌ；Ｖ）に置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリン（Ｓｅｒ：Ｓ）からスレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）に置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）からロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）に置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリン（Ｖａｌ：Ｖ）からグリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）に置換。
例えば、前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ａ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の２９４位に相当するアミノ酸がアスパラギン酸からバリンで置換されたアミノ酸配列である。
The protein (a) has at least the amino acid sequence at positions 112 to 414 of the amino acid sequence of wild-type thioesterase shown in SEQ ID NO: 1. In the amino acid sequence of the wild-type thioesterase shown in SEQ ID NO: 1, the region at positions 112 to 414 is particularly important for functioning as a thioesterase, and is a necessary and sufficient region for exhibiting thioesterase activity (Voelker, T. A., A. C. Worrell, L. Anderson, J. Bleibaum, C. Fan, D. H. Hawkins, S. E. Radke, and H. M. Davies, “Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants ", Science, 1992, 257, p.72-74). The protein (a) has a necessary and sufficient region for the thioesterase activity, and functions as a thioesterase as demonstrated in the examples described later.
Furthermore, in the amino acid sequence of the protein of (a), at least one selected from the positions 294, 296, 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 The amino acid at the position is substituted as shown in (1) to (4) below.
(1) The amino acid at position 294 of SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid (Asp: D) to valine (Val; V).
(2) The amino acid at position 296 of SEQ ID NO: 1 was substituted from serine (Ser: S) to threonine (Thr; T).
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine (Phe: F) to leucine (Leu; L).
(4) The amino acid at position 356 of SEQ ID NO: 1 was replaced with glycine (Gly; G) from valine (Val: V).
For example, in the case of having the amino acid substitution of (1) above, the amino acid sequence of the protein of (a) is based on the amino acid sequence of positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1, and position 294 of SEQ ID NO: 1 in the sequence Is an amino acid sequence in which the amino acid corresponding to is substituted from aspartic acid with valine.
以下、配列番号１の２９４位に相当するアミノ酸が、バリンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ）、２９６位に相当するアミノ酸が、スレオイニンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｓ２９６Ｔ）、３１１位に相当するアミノ酸が、ロイシンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ）、３５６位に相当するアミノ酸が、グリシンに置換されたチオエステラーゼ改変体をＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）、とそれぞれ略記する。また、上記（１）〜（４）のアミノ酸置換を複数有するチオエステラーゼ改変体、例えば、２９４位と２９６位の２箇所のアミノ酸が置換されたチオエステラーゼ改変体は、ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ＆Ｓ２９６Ｔ）と略記する。 Hereinafter, CTE (D294V) is a thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 294 of SEQ ID NO: 1 is substituted with valine, and CTE (S296T) is a thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 296 is substituted with threoin. ) A thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 311 is substituted with leucine is CTE (F311L), and a thioesterase variant in which the amino acid corresponding to position 356 is substituted with glycine is CTE (V356G), respectively. Abbreviated. A modified thioesterase having a plurality of amino acid substitutions (1) to (4) above, for example, a modified thioesterase in which two amino acids at positions 294 and 296 are substituted, is abbreviated as CTE (D294V & S296T). .
前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列の一部に欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。ただし、欠失、置換、挿入、又は付加の変異を有するアミノ酸は、前記（ａ）において前記（１）〜（４）から選ばれるアミノ酸置換が施されたアミノ酸以外のアミノ酸である。例えば、（ａ）のタンパク質が前記（１）のアミノ酸置換を有する場合、（ｂ）のタンパク質が有するアミノ酸配列は、配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列を基本とし、当該配列中の配列番号１の２９４位に相当するアミノ酸がアスパラギン酸からバリンで置換され、さらに、当該配列中の該置換が施された２９４位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部欠失等により変化した改変体を用いることができる。
なお、改変タンパク質がチオエステラーゼ活性を有することは、基質としてAcyl‐ACPを用いたin vitro活性測定法、例えば、Robert M et al. Plant Cell Physiol．40(2): 155-163 (1999)に記載の方法により確認することができる。
前記（ｂ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、ラウリン脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
The protein (b) is a protein having an amino acid sequence having a deletion, substitution, insertion, or addition mutation in a part of the amino acid sequence of the protein (a) and having thioesterase activity. However, the amino acid having a deletion, substitution, insertion, or addition mutation is an amino acid other than the amino acid subjected to the amino acid substitution selected from (1) to (4) in (a). For example, when the protein of (a) has the amino acid substitution of (1), the amino acid sequence of the protein of (b) is based on the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1, The amino acid corresponding to position 294 in SEQ ID NO: 1 is substituted with valine from aspartic acid, and one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 294 in the sequence are deleted or replaced , Inserted or added amino acid sequence.
In general, an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced. Also in the present invention, it is possible to use a modified product that retains thioesterase activity and whose amino acid sequence has been changed due to partial deletion or the like.
It should be noted that the modified protein has thioesterase activity as determined by an in vitro activity measurement method using Acyl-ACP as a substrate, for example, Robert M et al. Plant Cell Physiol. 40 (2): 155-163 (1999).
In the protein (b), “1 or several amino acids” is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 from the viewpoint of lauric lipid productivity. More preferably, it is more preferably 1-2.
前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質は、配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列の他に、他のアミノ酸配列を有していてもよい。他のアミノ酸配列としては、ラウリン脂質生産性の観点から、配列番号１の１位〜１１１位のアミノ酸配列若しくはその一部の配列が好ましい。
ラウリン脂質生産性の観点から、前記（ａ）及び（ｂ）のタンパク質として好ましくは、下記（ｃ）及び（ｄ）のタンパク質である。
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換。
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
The proteins (a) and (b) may have other amino acid sequences in addition to the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1. The other amino acid sequence is preferably the amino acid sequence of positions 1 to 111 of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof from the viewpoint of lauric lipid productivity.
From the viewpoint of lauric lipid productivity, the proteins (a) and (b) are preferably the following proteins (c) and (d).
(C) A protein comprising an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine.
(4) The amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 was substituted from valine to glycine.
(D) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid-substituted amino acid are deleted, substituted, inserted, or added in the amino acid sequence of (c) and having thioesterase activity.
前記（ｃ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において配列番号１の２９４位、２９６位、３１１位、及び３５６位から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が、前記（１）〜（４）のように置換されたアミノ酸配列からなる。配列番号１のアミノ酸配列において、２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換されたチオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号１６に、２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換チオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号１８に、３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換チオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号２０に、３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換チオエステラーゼ改変体のアミノ酸配列を配列番号２２に、それぞれ示す。 In the protein of (c), the amino acid at least one position selected from the positions 294, 296, 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the wild-type thioesterase shown in SEQ ID NO: 1 is the above ( It consists of a substituted amino acid sequence as in 1) to (4). In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the modified thioesterase in which the amino acid at position 294 is substituted from aspartic acid to valine is the amino acid sequence in SEQ ID NO: 16, and the amino acid at position 296 is the amino acid in the modified thioesterase modified from serine to threonine The sequence is SEQ ID NO: 18, the amino acid at position 311 is substituted from phenylalanine to leucine, the amino acid sequence of the modified thioesterase is SEQ ID NO: 20, the amino acid at position 356 is replaced from valine to glycine, and the amino acid sequence of the modified thioesterase is SEQ ID NO: 22 respectively.
前記（ｄ）のタンパク質は、配列番号１に示す野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列において配列番号１の２９４位、２９６位、３１１位、及び３５６位に相当するアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が、前記（１）〜（４）のように置換され、さらに当該置換されたアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
前記（ｄ）のタンパク質において、「１又は数個のアミノ酸」は、ラウリン脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
The protein of (d) has at least one amino acid selected from amino acids corresponding to positions 294, 296, 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the wild-type thioesterase shown in SEQ ID NO: 1. Thioesterase activity having an amino acid sequence that is substituted as described in (1) to (4) above, and in which one or several amino acids other than the substituted amino acid are deleted, substituted, inserted, or added It is protein which has.
In the protein (d), “1 or several amino acids” is preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 from the viewpoint of lauric lipid productivity. More preferably, it is more preferably 1-2.
前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質として好ましいのは、前記（１）〜（４）から選ばれるいずれか１つのアミノ酸置換を有するタンパク質、及び前記（１）〜（４）から選ばれる２つのアミノ酸置換を有するタンパク質であり、より好ましくは、前記（１）〜（４）から選ばれるいずれか１つのアミノ酸置換を有するタンパク質、前記（１）及び（２）のアミノ酸置換を有するタンパク質、及び前記（３）及び（４）のアミノ酸置換を有するタンパク質である。 The proteins (a) to (d) are preferably a protein having any one amino acid substitution selected from the above (1) to (4) and two selected from the above (1) to (4). A protein having an amino acid substitution, more preferably a protein having any one amino acid substitution selected from the above (1) to (4), a protein having the amino acid substitution of (1) and (2), and the above It is a protein having the amino acid substitution of (3) and (4).
前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質の好ましい一例として、前記（１）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−１）〜（ｄ−１）、前記（２）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−２）〜（ｄ−２）、前記（３）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−３）〜（ｄ−３）、前記（４）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−４）〜（ｄ−４）、前記（１）及び（２）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−５）〜（ｄ−５）、前記（３）及び（４）のアミノ酸置換を有するタンパク質は下記（ａ−６）〜（ｄ−６）、でそれぞれ示される。 As a preferred example of the proteins (a) to (d), the protein having the amino acid substitution (1) is the following (a-1) to (d-1), and the protein having the amino acid substitution (2) is: The following (a-2) to (d-2), the protein having the amino acid substitution (3) is the following (a-3) to (d-3), and the protein having the amino acid substitution (4) is ( a-4) to (d-4), the proteins having the amino acid substitutions of (1) and (2) are the amino acid substitutions of the following (a-5) to (d-5), (3) and (4) Are represented by the following (a-6) to (d-6), respectively.
（ａ−１）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−１）：（ａ−１）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−１）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−１）：（ｃ−１）のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-1): a protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 is substituted from aspartic acid to valine in the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity .
(B-1): An amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 294 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein of (a-1) And a protein having thioesterase activity.
(C-1): a protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid for valine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has thioesterase activity.
(D-1): consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 294 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of (c-1) And a protein having thioesterase activity.
（ａ−２）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−２）：（ａ−２）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２９６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−２）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−２）：（ｃ−２）のアミノ酸配列において、配列番号１の２９６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-2): A protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 is substituted from serine to threonine in the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(B-2): An amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 296 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein of (a-2) And a protein having thioesterase activity.
(C-2): A protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 is substituted from serine to threonine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(D-2): consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 296 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of (c-2) And a protein having thioesterase activity.
（ａ−３）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−３）：（ａ−３）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−３）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−３）：（ｃ−３）のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-3): A protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 311 in SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine from leucine in the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(B-3): An amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 311 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein of (a-3) And a protein having thioesterase activity.
(C-3): a protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine from leucine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has thioesterase activity.
(D-3): consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 311 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of (c-3) And a protein having thioesterase activity.
（ａ−４）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−４）：（ａ−４）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３５６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−４）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−４）：（ｃ−４）のアミノ酸配列において、配列番号１の３５６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-4): A protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 is substituted from valine to glycine in the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(B-4): An amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 356 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of the protein of (a-4) And a protein having thioesterase activity.
(C-4): a protein having an amino acid sequence in which the amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 is substituted from valine to glycine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(D-4): consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than the amino acid corresponding to position 356 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of (c-4) And a protein having thioesterase activity.
（ａ−５）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに、２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−５）：（ａ−５）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位及び２９６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−５）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに、２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−５）：（ｃ−５）のアミノ酸配列において、配列番号１の２９４位及び２９６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-5): An amino acid sequence in which the amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 is substituted from aspartic acid to valine and the amino acid at position 296 is replaced from serine to threonine in the amino acid sequence at positions 112 to 414 in SEQ ID NO: 1. And a protein having thioesterase activity.
(B-5): In the amino acid sequence of the protein of (a-5), one or several amino acids other than the amino acids corresponding to positions 294 and 296 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted, or added. A protein having an amino acid sequence and having thioesterase activity.
(C-5): an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, comprising an amino acid sequence in which the amino acid at position 294 of SEQ ID NO: 1 is substituted from aspartic acid to valine, and the amino acid at position 296 is replaced from serine to threonine, and thioesterase Protein with activity.
(D-5): In the amino acid sequence of (c-5), one or several amino acids other than the amino acids corresponding to positions 294 and 296 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added A protein comprising a sequence and having thioesterase activity.
（ａ−６）：配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに、３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ−６）：（ａ−６）のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位及び３５６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ−６）：配列番号１に示すアミノ酸配列において配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに、３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ−６）：（ｃ−６）のアミノ酸配列において、配列番号１の３１１位及び３５６位に相当するアミノ酸以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(A-6): An amino acid sequence in which the amino acid at position 311 in SEQ ID NO: 1 is substituted from phenylalanine to leucine and the amino acid at position 356 from valine to glycine in the amino acid sequence from position 112 to position 414 of SEQ ID NO: 1. A protein having thioesterase activity.
(B-6): In the amino acid sequence of the protein of (a-6), one or several amino acids other than the amino acids corresponding to positions 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 are deleted, substituted, inserted, or added. A protein having an amino acid sequence and having thioesterase activity.
(C-6): the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 is substituted from phenylalanine to leucine and the amino acid at position 356 from valine to glycine, and thioesterase activity A protein having
(D-6): In the amino acid sequence of (c-6), one or several amino acids other than the amino acids corresponding to positions 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted, inserted or added A protein comprising a sequence and having thioesterase activity.
２．チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子は、前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。前記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子として具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）の遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）配列番号２の３３４位〜１２４５位の塩基配列において、下記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（i） 配列番号２の８８０位〜８８２位の塩基がアスパラギン酸をコードする塩基からバリンをコードする塩基に置換。
（ii） 配列番号２の８８６位〜８８８位の塩基がセリンをコードする塩基からスレオニンをコードする塩基に置換。
（iii） 配列番号２の９３１位〜９３３位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基からロイシンをコードする塩基に置換。
（iv） 配列番号２の１０６６位〜１０６８位の塩基がバリンをコードする塩基からグリシンをコードする塩基に置換。
（Ｂ） （Ａ）の遺伝子の塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｄ） （Ｃ）の遺伝子の塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
2. Gene encoding thioesterase variant A gene encoding a thioesterase variant is a gene encoding the proteins (a) to (d). Specific examples of the gene encoding the proteins (a) to (d) include the following genes (A) to (D), but the present invention is not limited thereto.
(A) A protein having a base sequence having at least one base substitution selected from the following (i) to (iv) in the base sequence from positions 334 to 1245 of SEQ ID NO: 2 and having a thioesterase activity Gene to do.
(I) The bases at positions 880 to 882 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding aspartic acid to the base encoding valine.
(Ii) The bases at positions 886 to 888 in SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding serine to the base encoding threonine.
(Iii) The bases at positions 931 to 933 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding phenylalanine to the base encoding leucine.
(Iv) The bases at positions 1066 to 1068 in SEQ ID NO: 2 are replaced with bases encoding glycine from bases encoding valine.
(B) The base sequence of the gene of (A) has a base sequence in which one or several bases other than the base-substituted base are deleted, substituted, inserted, or added, and has thioesterase activity. A gene that encodes a protein.
(C) A gene encoding a protein comprising a base sequence having at least one base substitution selected from the above (i) to (iv) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having thioesterase activity.
(D) A protein having a thioesterase activity comprising a base sequence in which one or several bases other than the base-substituted base are deleted, substituted, inserted, or added in the base sequence of the gene of (C) A gene encoding
配列番号２に示す塩基配列は、ココヤシ由来の野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
前記（Ｂ）又は（Ｄ）の遺伝子の塩基配列において、「１又は数個の塩基」は、ラウリン脂質生産性の観点から、１〜１５個であることが好ましく、１〜１０個であることがより好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜２個であることよりさらに好ましい。
前記（Ｃ）の遺伝子の塩基配列として、配列番号２の塩基配列において、８８０位〜８８２位の塩基がアスパラギン酸をコードする塩基からバリンをコードする塩基に置換された塩基配列の一例を配列番号１７に、８８６位〜８８８位の塩基がセリンをコードする塩基からスレオニンをコードする塩基に置換された塩基配列の一例を配列番号１９に、９３１位〜９３３位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基からロイシンをコードする塩基に置換された塩基配列の一例を配列番号２１に、１０６６位〜１０６８位の塩基がバリンをコードする塩基からグリシンをコードする塩基に置換された塩基配列の一例を配列番号２３に、それぞれ示す。
The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an example of a base sequence of a gene encoding a wild type thioesterase derived from coconut palm.
In the base sequence of the gene of (B) or (D), “1 or several bases” is preferably 1 to 15 and preferably 1 to 10 from the viewpoint of lauric lipid productivity. Is more preferable, it is more preferable that it is 1-5, and it is still more preferable that it is 1-2.
As an example of the base sequence of the gene (C), in the base sequence of SEQ ID NO: 2, an example of a base sequence in which the bases at positions 880 to 882 are replaced with bases encoding valine from bases encoding aspartic acid are SEQ ID NO: 17, an example of a base sequence in which the bases at positions 886 to 888 are replaced with a base encoding threonine from a base encoding serine is shown in SEQ ID NO: 19, and the bases at positions 931 to 933 are from bases encoding phenylalanine. An example of a base sequence substituted with a base encoding leucine is SEQ ID NO: 21, and an example of a base sequence wherein bases at positions 1066 to 1068 are replaced with a base encoding glycine from a base encoding valine is SEQ ID NO: 23 Respectively.
チオエステラーゼ改変体及びこれをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法に準じて得ることができる。例えば、野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列情報又は塩基配列情報を取得し、これに基づいて部位特定変異導入法等の手法により所望の位置のアミノ酸配列又は塩基配列に置換（変異）を施すことができる。
野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）及びそれをコードする塩基配列（例えば、配列番号２）は、GenBank等のデータベースから得ることができる（例えばGenBankでは、タンパク質配列；AEM72521.1，ｍＲＮＡ配列：JF338905.1）。得られた配列をもとに、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成はインビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ココヤシから野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子をクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W. Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
部位特異的変異の導入方法としては、例えば、Splicing overlap extension（SOE）PCR反応（Horton et al.，Gene 77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，152，271-276，1995））、又はKunkel法（Kunkel，T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit（タカラバイオ株式会社）、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、又はKOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。なかでも、本発明においては、部位特異的変異導入が高効率である観点から、Kunkel法によって行うことが好ましい。
A modified thioesterase and a gene encoding the same can be obtained according to a common genetic engineering technique. For example, amino acid sequence information or base sequence information of wild-type thioesterase can be obtained, and based on this, substitution (mutation) can be performed on the amino acid sequence or base sequence at a desired position by a technique such as site-specific mutagenesis. .
The amino acid sequence of wild-type thioesterase (SEQ ID NO: 1) and the base sequence encoding it (eg, SEQ ID NO: 2) can be obtained from databases such as GenBank (for example, in GenBank, protein sequence; AEM72521.1, mRNA) Sequence: JF338905.1). Based on the obtained sequence, a gene encoding wild-type thioesterase can be obtained by artificial synthesis. For the artificial synthesis of genes, services such as Invitrogen can be used. A gene encoding wild-type thioesterase can also be obtained from cloning from coconut, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)] This method can be used.
As a method for introducing site-specific mutation, for example, a method using a Splicing overlap extension (SOE) PCR reaction (Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989), an ODA method (Hashimoto-Gotoh et al., Gene, 152, 271-276, 1995)) or the Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 488). Also, Diversify TM PCR Random Mutagenesis Kit (Takara Bio Inc.), Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio Inc.), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech Inc.), or KOD-Plus-Mutagenesis Kit Commercially available kits such as (Toyobo Co., Ltd.) can also be used. In particular, in the present invention, the Kunkel method is preferably used from the viewpoint of high efficiency of site-specific mutagenesis.
チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の調製方法の一例としては、まず、ココヤシよりクローニングした野生型チオエステラーゼ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（Clonthech, Mountain View, California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記（１）〜（４）のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９４℃で３０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約３０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約７０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
As an example of a method for preparing a gene encoding a thioesterase variant, first, the base sequence of a wild-type thioesterase gene cloned from coconut (for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2) is converted into In-Fusion (registered trademark). ) Incorporate into the vector using HD Cloning Kit (Clonthech, Mountain View, California). Next, using the obtained vector DNA as a template, an oligonucleotide containing a base sequence encoding the amino acid sequence having the amino acid mutation of (1) to (4) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used as a primer, A DNA fragment is amplified by the PCR method. Here, as a preferable example of the PCR reaction conditions, a heat denaturation reaction for converting double-stranded DNA into a single strand is performed at 94 ° C. for 30 seconds, and an annealing reaction for hybridizing the primer pair to the single-stranded DNA is performed at 55 ° C. For about 30 seconds, an extension reaction for allowing DNA polymerase to act is performed at 72 ° C. for about 70 seconds, and these are defined as one cycle for 30 cycles.
The DNA amplified by the PCR reaction is treated with a Dpn I enzyme that specifically cleaves methylated DNA, and E. coli is transformed with this enzyme and selected on a plate medium containing antibiotics. By extracting a plasmid from the transformed Escherichia coli, a gene encoding a modified thioesterase into which the target amino acid mutation has been introduced can be obtained.
３．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体に比べ、ラウリン脂質の生産能が有意に向上する。なお、野生型チオエステラーゼ及びチオエステラーゼ改変体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
3. Transformant (recombinant)
The transformant of the present invention is obtained by introducing a gene encoding any of the proteins (a) to (d) into a host. In the transformant, the ability to produce lauric lipid is significantly improved as compared to the transformant into which the wild-type thioesterase gene has been introduced. The ability to produce fatty acids and lipids of wild-type thioesterase and modified thioesterase can be measured by the method used in the examples.
本発明の形質転換体は、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。 The transformant of the present invention can be obtained by introducing a gene encoding a thioesterase variant into a host by an ordinary genetic engineering method. Specifically, it can be prepared by preparing an expression vector capable of expressing a gene encoding a thioesterase variant in a host cell, introducing the vector into the host cell, and transforming the host cell.
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、藻類、植物体、又は動物体を用いることができる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主としては、微生物、藻類、又は植物が好ましく、微生物又は藻類がより好ましく、微生物がさらに好ましい。
宿主として用いる微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよい。原核生物としては、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物が挙げられる。真核生物としては、酵母や糸状菌等が挙げられる。なかでも、有用物質の生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌又は枯草菌がより好ましく、大腸菌がさらに好ましい。
植物としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、トウモロコシ・ダイズ・イネ・トウゴマ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、シアノバクテリア（Synechocystis sp.）、クラミドモナス、ナンノクロロプシス、エノモト藻、オーランチオキトリウム又はフェオダクチラムが好ましく、シアノバクテリアがより好ましい。
The host of the transformant is not particularly limited, and microorganisms, algae, plants, or animals can be used. From the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid, the host is preferably a microorganism, algae, or plant, more preferably a microorganism or algae, and even more preferably a microorganism.
The microorganism used as the host may be either prokaryotic or eukaryotic. Prokaryotes include microorganisms belonging to the genus Escherichia and microorganisms belonging to the genus Bacillus. Examples of eukaryotes include yeast and filamentous fungi. Among these, Escherichia coli , Bacillus subtilis , red yeast ( Rhodosporidium toruloides ), or Mortierella sp. ( Mortierella sp.) Is preferable, and Escherichia coli or Bacillus subtilis is more preferable from the viewpoint of productivity of useful substances. Escherichia coli is more preferable.
As the plant, Arabidopsis thalian a, rapeseed, corn / soybean / rice stalk , coconut palm, palm, coffea, or jatropha is preferable, and Arabidopsis is more preferable, from the viewpoint of high lipid content in seeds.
As the algae, from the viewpoint of establishing a genetic recombination technique, cyanobacteria ( Synechocystis sp.), Chlamydomonas, Nannochloropsis, Enomoto algae, aurantiochytrium, or pheodactinum are preferable, and cyanobacteria are more preferable.
発現ベクターの母体となるベクターとしては、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T. et al.,（1986）,Plasmid 15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）等を挙げることができる。植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）等を挙げることができる。藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、又はpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）等を挙げることができる。
特に、大腸菌を宿主とする場合には、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられ、シロイヌナズナを宿主とする場合には、pRI系ベクター、又はpBI系ベクターが好ましく用いられ、シアノバクテリアを宿主とする場合には、pUC系ベクターが好ましく用いられる。
The vector serving as the parent of the expression vector may be any vector that can introduce a gene encoding a thioesterase variant into a host and can express the gene in a host cell. For example, a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used. Further, it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
As specific vectors, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pUC vector (Takara Shuzo), pET vector (Takara Bio) ), PGEX vectors (GE Healthcare), pCold vectors (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T. et al., (1986), Plasmid 15 (2) P.93-103), pBR322 (manufactured by Takara Bio Inc.), pRS403 (manufactured by Stratagene), or pMW218 / 219 (manufactured by Nippon Gene). When a plant cell is used as a host, for example, a pRI vector (manufactured by Takara Bio Inc.), a pBI vector (manufactured by Clontech), an IN3 vector (manufactured by Implanta Innovations) and the like can be mentioned. In the case of using algae as a host, for example, a pUC vector (Takara Shuzo), a pET vector (Takara Bio), or pBluescript II SK (-) (Stratagene) can be used.
In particular, when Escherichia coli is used as a host, pBluescript II SK (-) or pMW218 / 219 is preferably used. When Arabidopsis is used as a host, a pRI-type vector or pBI-type vector is preferably used. When a bacterium is used as a host, a pUC vector is preferably used.
プロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、アクチンやユビキチン等ハウスキーピング遺伝子のプロモーター、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、又は植物由来Rubiscoプロモーター等が挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
上記ベクターにチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。なお、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の取得方法については上述した。
The types of expression regulatory regions such as promoters and terminators and the types of selectable markers are not particularly limited, and can be appropriately selected and used depending on the type of host into which a commonly used promoter or marker is introduced.
Specific promoters include lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, cauliflower mozil virus 35 SRNA promoter, housekeeping gene promoter such as actin and ubiquitin, rapeseed Napin gene promoter, or plant Origin Rubisco promoter and the like.
Selectable markers include antibiotic resistance genes (ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S resistance And drug resistance genes such as genes, bialaphos resistance genes, and hygromycin resistance genes). Furthermore, it is also possible to use a gene defect associated with auxotrophy as a selection marker gene.
An expression vector used for transformation can be constructed by incorporating a gene encoding a modified thioesterase into the vector by a usual technique such as restriction enzyme treatment or ligation. The method for obtaining a gene encoding a thioesterase variant has been described above.
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。
また、目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
The transformation method is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing a target gene into a host. For example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)), electro Polation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)) or LP transformation method (T. Akamatsu and J. Sekiguchi, Archives of Microbiology, 1987, 146, p.353-357; Taguchi, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65, 4, p.823-829) and the like can be used.
In addition, selection of a transformant introduced with a target gene fragment can be performed by using a selection marker or the like. For example, the drug resistance gene acquired by the transformant as a result of introducing a vector-derived drug resistance gene into the host cell together with the target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator. The introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
４．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
4). Lipid production method Next, lipid is produced using the transformant obtained above.
The production method of the present invention includes a step of collecting lipid from a transformant introduced with a gene encoding a thioesterase variant. From the viewpoint of improving lipid productivity, this step is a step of culturing or growing a transformant introduced with a gene encoding a thioesterase variant under appropriate conditions to obtain a culture or a grown product, and Preferably, the method further comprises the step of collecting lipid from the cultured or grown product. Here, the culture refers to the culture solution and transformant after culturing, and the growth refers to the transformant after growth.
形質転換体の培養又は生育条件は、遺伝子が導入された宿主の種類に応じて選択することができ、適宜好ましい条件を採用することができる。例えば、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地で３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することが好ましい。シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間育成することが好ましい。シアノバクテリアを宿主として用いた形質転換体の場合、温度条件２５〜３２℃、白色光を連続照射又は明期１２時間・暗期１２時間等の光条件下で１週間〜１か月間培養することが好ましい。
また、脂肪酸及び脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
The culture or growth conditions of the transformant can be selected according to the type of host into which the gene has been introduced, and preferable conditions can be adopted as appropriate. For example, in the case of a transformant using Escherichia coli as a host, it is preferably cultured in an LB medium at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day. In the case of a transformant using Arabidopsis as a host, it is preferable to grow for 1 to 2 months under a light condition such as a temperature condition of 20 to 25 ° C. and continuous irradiation with white light or a light period of 16 hours and a dark period of 8 hours. . In the case of a transformant using cyanobacteria as a host, culturing for 1 week to 1 month under temperature conditions of 25 to 32 ° C. and continuous irradiation with white light or light conditions such as 12 hours of light period and 12 hours of dark period Is preferred.
From the viewpoint of the production efficiency of fatty acids and lipids, for example, glycerol, acetic acid, malonic acid or the like may be added to the medium as a thioesterase substrate or a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。 As a method for collecting lipid produced in the transformant, a method usually used for isolating lipid components in a living body, for example, filtration, centrifugation from the culture, growth or transformant described above. Examples thereof include a method for isolating and recovering lipid components by separation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like. In the case of a larger scale, oil is recovered from the culture, growth or transformant by pressing or extraction, and then subjected to general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. to obtain lipids be able to. Thus, after isolating a lipid component, a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid. Examples of the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
本発明の製造方法では、本発明のチオエステラーゼ改変体を用いることで、野生型チオエステラーゼを用いた場合と比べ、ラウリン脂質の生産性を有意に向上させることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、炭素原子数１２〜１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数１２〜１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがさらに好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１６の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは６５質量％以上、より好ましくは７５質量％以上、さらに好ましくは８５質量％以上である。また、採取された総脂質成分中の炭素原子数１２〜１４の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは４５質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上である。さらに、採取された総脂質成分中に含まれるラウリン酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは２３質量％以上、さらに好ましくは２５質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
In the production method of the present invention, by using the modified thioesterase of the present invention, the productivity of lauric lipid can be significantly improved as compared with the case of using wild-type thioesterase.
The lipid produced in the production method of the present invention preferably contains one or more selected from simple lipids and derived lipids, more preferably contains derived lipids, and fatty acids from the viewpoint of its availability. Or it is more preferable that the ester is included. The fatty acid or ester thereof contained in the lipid is preferably a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms or an ester thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or an ester thereof, from the viewpoint of availability to a surfactant or the like. More preferred is lauric acid or its ester. Derivatives of higher alcohols obtained by reducing these higher fatty acids can be used as surfactants.
The content of the fatty acid having 12 to 16 carbon atoms in the collected total lipid component is preferably 65% by mass or more, more preferably 75% by mass or more, and further preferably 85% by mass from the viewpoint of utilization as a surfactant. % Or more. In addition, the content of the fatty acid having 12 to 14 carbon atoms in the collected total lipid component is preferably 40% by mass or more, more preferably 45% by mass or more, and still more preferably, from the viewpoint of utilization as a surfactant. It is 50 mass% or more. Furthermore, the content of lauric acid contained in the collected total lipid component is preferably 20% by mass or more, more preferably 23% by mass or more, and further preferably 25% by mass or more, from the viewpoint of utilization as a surfactant. It is. Here, “collected total lipid component” refers to the total lipid component calculated by the method used in the examples.
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、乳化剤として化粧品等に配合したり、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。 Fatty acids and lipids obtained by the production method of the present invention and transformants are used as edible ingredients, blended in cosmetics as emulsifiers, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides. And can be used as a preservative.
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。 The present invention further discloses the following methods, transformants, proteins, and genes with respect to the above-described embodiments.
＜１＞ 宿主に下記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
<1> Lipid production comprising the steps of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) below into a host, and collecting the lipid from the obtained transformant Method.
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine.
(4) The amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 was substituted from valine to glycine.
(B) In the amino acid sequence of the protein of (a), one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more Preferably, a protein having an amino acid sequence in which 1 to 2 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added, and having thioesterase activity.
＜２＞ 前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が、下記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質である、＜１＞項記載の製造方法。
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において下記（１）〜（４）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（４） 配列番号１の３５６位のアミノ酸がバリンからグリシンに置換。
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜３＞ 前記タンパク質をコードする遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの遺伝子である、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
（Ａ）配列番号２の３３４位〜１２４５位の塩基配列において、下記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（i） 配列番号２の８８０位〜８８２位の塩基がアスパラギン酸をコードする塩基からバリンをコードする塩基に置換。
（ii） 配列番号２の８８６位〜８８８位の塩基がセリンをコードする塩基からスレオニンをコードする塩基に置換。
（iii） 配列番号２の９３１位〜９３３位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基からロイシンをコードする塩基に置換。
（iv） 配列番号２の１０６６位〜１０６８位の塩基がバリンをコードする塩基からグリシンをコードする塩基に置換。
（Ｂ） （Ａ）の遺伝子の塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｃ）配列番号２に示す塩基配列において前記（i）〜（iv）から選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（Ｄ） （Ｃ）の遺伝子の塩基配列において、塩基置換された塩基以外の１又は数個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜２個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
<2> The production method according to <1>, wherein the protein (a) or (b) is a protein (c) or (d) below.
(C) A protein comprising an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to (4) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine.
(4) The amino acid at position 356 in SEQ ID NO: 1 was substituted from valine to glycine.
(D) In the amino acid sequence of (c), one or several amino acids other than amino acid-substituted amino acids, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably A protein having an amino acid sequence in which 1 to 2 amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and having thioesterase activity.
<3> The production method according to <1> or <2>, wherein the gene encoding the protein is any one of the following genes (A) to (D).
(A) A protein having a base sequence having at least one base substitution selected from the following (i) to (iv) in the base sequence from positions 334 to 1245 of SEQ ID NO: 2 and having a thioesterase activity Gene to do.
(I) The bases at positions 880 to 882 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding aspartic acid to the base encoding valine.
(Ii) The bases at positions 886 to 888 in SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding serine to the base encoding threonine.
(Iii) The bases at positions 931 to 933 of SEQ ID NO: 2 are substituted from the base encoding phenylalanine to the base encoding leucine.
(Iv) The bases at positions 1066 to 1068 in SEQ ID NO: 2 are replaced with bases encoding glycine from bases encoding valine.
(B) In the base sequence of the gene of (A), one or several other than the base-substituted base, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more A gene encoding a protein having a base sequence in which 1 to 2 bases are preferably deleted, substituted, inserted or added, and having thioesterase activity.
(C) A gene encoding a protein comprising a base sequence having at least one base substitution selected from the above (i) to (iv) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having thioesterase activity.
(D) In the base sequence of the gene of (C), one or several other than the base-substituted base, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more A gene encoding a protein having a thioesterase activity, preferably having a base sequence in which 1 to 2 bases are deleted, substituted, inserted, or added.
＜４＞ 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜５＞ 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜６＞ 前記脂質がラウリン酸又はそのエステルを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜７＞ 前記脂質中に、ラウリン酸が２０質量％以上、好ましくは２３質量％以上、より好ましくは２５質量％以上含有される、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜８＞ 前記脂質中に、炭素原子数１２〜１６の脂肪酸が６５質量％以上、好ましくは７５質量％以上、より好ましくは８５質量％以上含有される、＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜９＞ 前記宿主が微生物である、＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の製造方法。
＜１０＞ 前記宿主が大腸菌である、＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載の製造方法。
<4> The production method according to any one of <1> to <3>, wherein the host is selected from plants, algae, and microorganisms.
<5> The production method according to any one of <1> to <4>, wherein the host is selected from Arabidopsis thaliana, cyanobacteria, and Escherichia coli.
<6> The production method according to any one of <1> to <5>, wherein the lipid contains lauric acid or an ester thereof.
<7> The production according to any one of <1> to <6>, wherein lauric acid is contained in the lipid in an amount of 20% by mass or more, preferably 23% by mass or more, more preferably 25% by mass or more. Method.
<8> Any one of <1> to <7>, wherein the lipid contains a fatty acid having 12 to 16 carbon atoms in an amount of 65% by mass or more, preferably 75% by mass or more, and more preferably 85% by mass or more. 2. The production method according to item 1.
<9> The production method according to any one of <1> to <8>, wherein the host is a microorganism.
<10> The production method according to any one of <1> to <9>, wherein the host is Escherichia coli.
＜１１＞ 宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。 <11> A method for improving lipid productivity, comprising a step of introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host to obtain a transformant.
＜１２＞ 宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜１３＞ 前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質が、前記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質である、＜１２＞項記載の形質転換体。
＜１４＞ 前記タンパク質をコードする遺伝子が、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの遺伝子である、＜１２＞又は＜１３＞項記載の形質転換体。
＜１５＞ 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、＜１２＞〜＜１４＞のいずれか１項に項記載の形質転換体。
＜１６＞ 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、＜１２＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の形質転換体。
＜１７＞ 前記宿主が微生物である、＜１２＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の形質転換体。
＜１８＞ 前記宿主が大腸菌である、＜１２＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の形質転換体。
<12> A transformant obtained by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) into a host.
<13> The transformant according to <12>, wherein the protein (a) or (b) is the protein (c) or (d).
<14> The transformant according to <12> or <13>, wherein the gene encoding the protein is any one of the genes (A) to (D).
<15> The transformant according to any one of <12> to <14>, wherein the host is selected from plants, algae, and microorganisms.
<16> The transformant according to any one of <12> to <15>, wherein the host is selected from Arabidopsis thaliana, cyanobacteria, and E. coli.
<17> The transformant according to any one of <12> to <16>, wherein the host is a microorganism.
<18> The transformant according to any one of <12> to <17>, wherein the host is Escherichia coli.
＜１９＞ 前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
＜２０＞ 前記（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質である、＜１９＞項記載のタンパク質。
<19> The protein of (a) or (b).
<20> The protein according to <19>, which is the protein of (c) or (d).
＜２１＞ ＜１９＞又は＜２０＞項記載のタンパク質をコードする、前記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの遺伝子。 <21> The gene according to any one of (A) to (D), which encodes the protein according to <19> or <20>.
＜２２＞ 脂質を製造するための、＜１２＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜２３＞ 前記脂質がラウリン酸又はそのエステルである、＜２２＞項に記載の形質転換体の使用。
<22> Use of the transformant according to any one of <12> to <18> for producing a lipid.
<23> Use of the transformant according to <22>, wherein the lipid is lauric acid or an ester thereof.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example, this invention is not limited to this.
実施例
１．野生型チオエステラーゼ（ＣＴＥ）遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号２に示す塩基配列からなる野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を鋳型として、下記表１に示すＣＴＥ ＦＷ（配列番号４）及びＣＴＥ ＲＶ（配列番号５）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、野生型チオエステラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。また、プラスミドベクターｐＢＳ（pBluescript II SK(-)，配列番号３）を鋳型とし、ｐＢＳ ＦＷ（配列番号６）及びｐＢＳ ＲＶ（配列番号７）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、直鎖状にしたｐＢＳを取得した後、これをＤｐｎＩ処理した。これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて連結し、ベクター由来のＬａｃＺタンパク質のＮ末端１６アミノ酸と野生型チオエステラーゼ遺伝子断片（配列番号２に示す塩基配列において、３３４位〜１２４５位の塩基配列）が融合する形で野生型チオエステラーゼ遺伝子が発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、ＤＮＡシークエンス法によって、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
Example 1. Construction of wild-type thioesterase (CTE) gene expression plasmid CTE FW (SEQ ID NO: 4) and CTE RV (sequence) shown in Table 1 below using as a template a gene encoding a wild-type thioesterase consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A DNA fragment of the wild-type thioesterase gene was obtained by a PCR reaction using the primer pair No. 5). In addition, the plasmid vector pBS (pBluescript II SK (-), SEQ ID NO: 3) was used as a template, and linearized by PCR using a primer pair of pBS FW (SEQ ID NO: 6) and pBS RV (SEQ ID NO: 7). After obtaining the pBS, it was Dpn I treated. These two DNA fragments were ligated using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Clontech, Mountain View, California), and the N-terminal 16 amino acids of the LacZ protein derived from the vector and the wild-type thioesterase gene fragment (SEQ ID NO: In the base sequence shown in Fig. 2, a plasmid in which the wild-type thioesterase gene is expressed in the form of fusion of the base sequence at positions 334 to 1245) was constructed. The obtained plasmid was confirmed to have a gene encoding a wild-type thioesterase inserted by a DNA sequencing method.
２．チオエステラーゼ改変体発現プラスミドの構築
前記１．で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミドを鋳型として、下記表１に示すＣＴＥ（ＲＤ） ＦＷ（配列番号８）及びＣＴＥ（ＲＤ） ＲＶ（配列番号９）のプライマー対を用い、ＤｉｖｅｒｓｉｆｙTM ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）でＰＣＲを行い、ＣＴＥ遺伝子配列に無作為に突然変異を導入した。一方、プラスミドベクターｐＢＳ（配列番号３）を鋳型とし、ｐＢＳ（ＲＤ） ＦＷ（配列番号１０）及びｐＢＳ（ＲＤ） ＲＶ（配列番号１１）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応より、直鎖状にしたｐＢＳを取得した。得られた両ＰＣＲ反応溶液をＤｐｎＩで処理し、鋳型ＤＮＡを消化した後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて連結し、ランダム変異を有するＣＴＥの発現プラスミドライブラリーを構築した。
2. Construction of thioesterase variant expression plasmid Diversity ™ PCR Random Mutagenesis using the CTE (RD) FW (SEQ ID NO: 8) and CTE (RD) RV (SEQ ID NO: 9) primer pairs shown in Table 1 below using the wild-type thioesterase expression plasmid constructed in step 1 as a template. PCR was performed with Kit (Takara Bio Inc.), and mutations were randomly introduced into the CTE gene sequence. On the other hand, the plasmid vector pBS (SEQ ID NO: 3) was used as a template and was linearized by PCR reaction using pBS (RD) FW (SEQ ID NO: 10) and pBS (RD) RV (SEQ ID NO: 11) primer pairs. pBS was obtained. Both PCR reaction solutions obtained were treated with Dpn I, digested with template DNA, then ligated using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Clontech, Mountain View, California), and CTE having random mutations. An expression plasmid library was constructed.
３．形質転換体の構築
前記で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミド、ＣＴＥランダム変異発現プラスミドライブラリーを用いて、大腸菌突然変異株であるＫ２７株（ｆａｄＤ８８）（Ｏｖｅｒａｔｈ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７，５５９−５７４，１９６９）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたＫ２７株を３０℃で一晩静置して得られたコロニーをＬＢＡｍｐ液体培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％，Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％，ＮａＣｌ １％，アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）０．２ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。２４時間後の培養液を別のＬＢＡｍｐ液体培地２．０ｍＬに２０μＬ添加し、３０℃で振とう培養し、培養開始から１６時間、２４時間経過した培養液中に含まれている脂質成分を後述の方法にて解析した。また１６時間、２４時間後の培養液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を計測し、培養液に含まれる大腸菌の量を測定した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターｐＢＳにて形質転換した大腸菌Ｋ２７株についても同様に実験を行った。
3. Construction of Transformant Using the wild-type thioesterase expression plasmid and CTE random mutation expression plasmid library constructed above, the E. coli mutant K27 strain (fadD88) (Overath et al, Eur. J. Biochem. 7). , 559-574, 1969) were transformed by the competent cell transformation method. A colony obtained by allowing the transformed K27 strain to stand at 30 ° C. overnight was 0.2 mL of LBAmp liquid medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, ampicillin 100 μg / mL) And inoculated with shaking at 30 ° C. for 24 hours. 20 μL of the culture solution after 24 hours was added to another 2.0 mL of LBAmp liquid medium, cultured at 30 ° C. with shaking, and lipid components contained in the culture solution after 16 hours and 24 hours from the start of the culture are described below. The method was analyzed. Further, the absorbance at 600 nm (OD600) of the culture solution after 16 hours and 24 hours was measured, and the amount of E. coli contained in the culture solution was measured. As a negative control, E. coli K27 strain transformed with plasmid vector pBS was also tested in the same manner.
４．大腸菌培養液中の脂質の抽出および脂肪酸分析
培養開始後１６時間、２４時間経過した培養液０．９ｍＬに、２Ｎ塩酸５０μＬ、および内部標準としてメタノールに溶解した７−ペンタデカノン（５ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加した。この液に対してクロロホルム０．５ｍＬとメタノール１ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に１５分間静置した。さらに、１．５％塩化カリウム水溶液０．５ｍＬとクロロホルム０．５ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に１５分間静置した。室温、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに３−フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を０．３ｍＬ添加し、８０℃で１０分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水１ｍＬとヘキサン０．３ｍＬを添加し、十分に攪拌した後に３０分間静置した。上層部分を採取し、ガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０）解析に供した。使用したガスクロマトグラフィーは［キャピラリーカラム：ＤＢ−１ ＭＳ ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、移動相：高純度ヘリウム、カラム内流量：１．０ｍＬ／分、昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）、平衡化時間：１分間、注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１），圧力１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分，注入量１μＬ、洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム、検出器温度：３００℃］の条件で行った。
4). Extraction of Lipids and Fatty Acid Analysis in E. coli Culture Solution 50 μL of 2N hydrochloric acid 50 μL and 7-pentadecanone (5 mg / mL) dissolved in methanol as an internal standard were added to 0.9 mL of the culture solution 16 hours and 24 hours after the start of the culture. Added. Chloroform 0.5mL and methanol 1mL were added with respect to this liquid, and after stirring sufficiently, it was left still for 15 minutes. Further, 0.5 mL of a 1.5% potassium chloride aqueous solution and 0.5 mL of chloroform were added, and after sufficiently stirring, the mixture was allowed to stand for 15 minutes. After centrifugation at room temperature and 1500 rpm for 5 minutes, the lower layer part was collected and dried with nitrogen gas. 0.3 mL of 3-boron fluoride methanol complex solution was added to the dried sample, and the fatty acid was methyl esterified by maintaining at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 mL of saturated saline and 0.3 mL of hexane were added, and after sufficiently stirring, the mixture was allowed to stand for 30 minutes. The upper layer portion was collected and subjected to gas chromatography (Agilent 6890) analysis. The gas chromatography used was [capillary column: DB-1 MS 30 m × 200 μm × 0.25 μm (J & W Scientific), mobile phase: high purity helium, flow rate in column: 1.0 mL / min, temperature rising program: 100 ° C. (1 Min) → 10 ° C./min→300° C. (5 min), equilibration time: 1 min, inlet: split injection (split ratio: 100: 1), pressure 14.49 psi, 104 mL / min, injection volume 1 μL, wash Vials: methanol / chloroform, detector temperature: 300 ° C.].
５．大腸菌培養液中の脂質及び脂肪酸量の解析
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、各ピーク面積を内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１ミリリットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、算出した各脂肪酸量を、事前に計測した培養液中に含まれる大腸菌量（ＯＤ６００）で標準化した。また、上記で算出された各脂肪酸生産量を合計して総脂肪酸生産量（脂質量）を算出した。さらに、総脂肪酸生産量に占める各脂肪酸生産量の割合を算出した。
5. Analysis of lipid and fatty acid content in E. coli culture solution The amount of methyl ester of each fatty acid was determined from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis. Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per milliliter of culture solution was calculated. Furthermore, the calculated amount of each fatty acid was standardized by the amount of E. coli (OD600) contained in the culture solution measured in advance. In addition, the total fatty acid production amount (lipid amount) was calculated by summing up the respective fatty acid production amounts calculated above. Furthermore, the ratio of each fatty acid production amount in the total fatty acid production amount was calculated.
６．ＣＴＥ改変体のスクリーニング
前記５．で得られた結果から、総脂肪酸量に対するラウリン酸の含有割合を指標として、チオエステラーゼ改変体導入株のスクリーニングを行った。その結果、野生型チオエステラーゼ導入株よりもラウリン酸の含有割合が有意に増加したチオエステラーゼ改変体導入株を４株得た。得られた４株それぞれについて、導入されたチオエステラーゼ改変体の塩基配列をＤＮＡシークエンス法より解読し、変異箇所を同定した。結果を表２に示す。
6). 4. Screening of CTE variants From the results obtained above, the thioesterase-modified strain-introduced strain was screened using the content of lauric acid relative to the total amount of fatty acids as an index. As a result, 4 thioesterase variant-introduced strains in which the content of lauric acid was significantly increased compared to the wild-type thioesterase-introduced strains were obtained. For each of the obtained 4 strains, the nucleotide sequence of the introduced thioesterase variant was decoded by the DNA sequencing method, and the mutation site was identified. The results are shown in Table 2.
４つのチオエステラーゼ改変体Ａ〜Ｄは、いずれも一点変異（一塩基置換）であり、表２に示す位置に変異が導入されていた。すなわち、改変体Ａは、配列番号１の２９４位に相当するアスパラギン酸がバリンに置換されたＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ）、改変体Ｂは、配列番号１の２９６位に相当するセリンがスレオニンに置換されたＣＴＥ（Ｓ２９６Ｔ）、改変体Ｃは、配列番号１の３１１位に相当するフェニルアラニンがロイシンに置換されたＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ）、改変体Ｄは、配列番号１の３５６位に相当するバリンがグリシンに置換されたＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）であった。 All of the four thioesterase variants A to D were single point mutations (single base substitutions), and mutations were introduced at the positions shown in Table 2. That is, in variant A, CTE (D294V) in which aspartic acid corresponding to position 294 of SEQ ID NO: 1 was substituted with valine, and in variant B, serine corresponding to position 296 in SEQ ID NO: 1 was replaced with threonine. CTE (S296T), variant C is CTE (F311L) in which phenylalanine corresponding to position 311 of SEQ ID NO: 1 is replaced with leucine, and variant D is valine corresponding to position 356 of SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine CTE (V356G).
これら４つのチオエステラーゼ改変体導入株、野生型チオエステラーゼ導入株、及び陰性対照であるプラスミドベクターｐＢＳ導入株の総脂肪酸生産量（脂質量）及び総脂肪酸生産量に占める各脂肪酸生産量の割合を、表３−１及び表３−２に示す。 The total fatty acid production amount (lipid amount) of these four thioesterase variant-introduced strains, wild-type thioesterase-introduced strains, and the plasmid vector pBS-introduced strain, which is a negative control, Table 3-1 and Table 3-2.
表３−１、３−２から明らかなように、チオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ）、ＣＴＥ（Ｓ２９６Ｔ）、ＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ）、ＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）を導入した形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と比較して、ラウリン酸の割合が大きく増加していた。したがって、これらの改変チオエステラーゼでは、野生チオエステラーゼに比べてラウリン酸の選択性が向上しているといえる。 As is clear from Tables 3-1 and 3-2, in the transformants into which the thioesterase variant CTE (D294V), CTE (S296T), CTE (F311L), and CTE (V356G) were introduced, the wild-type thioesterase gene The ratio of lauric acid was greatly increased as compared with the transformant into which was introduced. Therefore, it can be said that these modified thioesterases have improved lauric acid selectivity compared to wild thioesterases.
７．複数のアミノ酸変異を有するチオエステラーゼ改変体
上記で構築したチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ）発現プラスミドを鋳型として、前記表１に示すＣＴＥ（Ｓ２９６Ｔ）ＦＷ（配列番号１２）及びＣＴＥ（Ｓ２９６Ｔ）ＲＶ（配列番号１３）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号１の２９４位と２９６位の２箇所にアミノ酸変異を有するチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ＆Ｓ２９６Ｔ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。同様に、チオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ）発現プラスミドを鋳型として、表１に示すＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）ＦＷ（配列番号１４）及びＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）ＲＶ（配列番号１５）のプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、配列番号１の３１１位と３５６位の２箇所にアミノ酸変異を有するチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ＆Ｖ３５６Ｇ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＰＣＲ反応溶液をＤｐｎＩで処理し、鋳型ＤＮＡを消化した後、大腸菌Ｋ２７株（ｆａｄＤ８８）を形質転換し、チオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ＆Ｓ２９６Ｔ）導入株、及びＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ＆Ｖ３５６Ｇ）導入株を得た。
上記と同様の方法で、両導入株を培養し、各脂肪酸量及び総脂肪酸量の解析を行った。 結果を表４に示す。
7). Modified thioesterase having a plurality of amino acid mutations Using the thioesterase modified CTE (D294V) expression plasmid constructed above as a template, CTE (S296T) FW (SEQ ID NO: 12) and CTE (S296T) RV (shown in Table 1) A DNA fragment containing a gene encoding a thioesterase variant CTE (D294V & S296T) having an amino acid mutation at two positions of positions 294 and 296 of SEQ ID NO: 1 was amplified by a PCR reaction using the primer pair of SEQ ID NO: 13) . Similarly, PCR reaction using a thioesterase variant CTE (F311L) expression plasmid as a template and a primer pair of CTE (V356G) FW (SEQ ID NO: 14) and CTE (V356G) RV (SEQ ID NO: 15) shown in Table 1 By this, a DNA fragment containing a gene encoding a thioesterase variant CTE (F311L & V356G) having amino acid mutations at two positions of positions 311 and 356 of SEQ ID NO: 1 was amplified. Each PCR reaction solution was treated with DpnI and the template DNA was digested, and then Escherichia coli K27 strain (fadD88) was transformed to obtain a thioesterase variant CTE (D294V & S296T) -introduced strain and a CTE (F311L & V356G) -introduced strain. .
Both introduced strains were cultured by the same method as described above, and each fatty acid amount and total fatty acid amount were analyzed. The results are shown in Table 4.
表４から明らかなように、２箇所にアミノ酸変異を有するチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ＆Ｓ２９６Ｔ）とＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ＆Ｖ３５６Ｇ）を導入した形質転換体では、表３−２に示した１箇所にアミノ酸変異を有するチオエステラーゼ改変体ＣＴＥ（Ｄ２９４Ｖ）、ＣＴＥ（Ｓ２９６Ｖ）、ＣＴＥ（Ｆ３１１Ｌ）、ＣＴＥ（Ｖ３５６Ｇ）を導入した形質転換体と比較して、ラウリン酸の含有割合が増加していた。これは、複数のアミノ酸変異を導入することで、相加的にラウリン酸の選択性が増したためと考えられる。 As is clear from Table 4, the transformants into which thioesterase variants CTE (D294V & S296T) and CTE (F311L & V356G) having amino acid mutations at two positions have amino acid mutations at one position shown in Table 3-2 The content of lauric acid was increased as compared to transformants into which the thioesterase variant CTE (D294V), CTE (S296V), CTE (F311L), or CTE (V356G) was introduced. This is considered to be because the selectivity of lauric acid increased in addition by introducing a plurality of amino acid mutations.
Claims (10)
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 A method for producing lipid, comprising a step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein of the following (a) or (b) into a host, and a step of collecting lipid from the obtained transformant.
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to ( 3 ) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine .
( B) The amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has thioesterase activity. protein.
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 A method for improving lipid productivity, comprising a step of obtaining a transformant by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) below into a host.
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to ( 3 ) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine .
( B) The amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has thioesterase activity. protein.
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 A transformant obtained by introducing a gene encoding the protein (a) or (b) below into a host.
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to ( 3 ) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine .
( B) The amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has thioesterase activity. protein.
（ａ） 配列番号１の１１２位〜４１４位のアミノ酸配列において、下記（１）〜（３）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（１） 配列番号１の２９４位のアミノ酸がアスパラギン酸からバリンに置換。
（２） 配列番号１の２９６位のアミノ酸がセリンからスレオニンに置換。
（３） 配列番号１の３１１位のアミノ酸がフェニルアラニンからロイシンに置換。
（ｂ） （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸置換されたアミノ酸以外の１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 The following protein (a) or (b).
(A) A protein having an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the following (1) to ( 3 ) in the amino acid sequence at positions 112 to 414 of SEQ ID NO: 1 and having thioesterase activity.
(1) The amino acid at position 294 in SEQ ID NO: 1 was substituted from aspartic acid to valine.
(2) The amino acid at position 296 in SEQ ID NO: 1 was substituted from serine to threonine.
(3) The amino acid at position 311 of SEQ ID NO: 1 was substituted from phenylalanine to leucine .
( B) The amino acid sequence of the protein of (a) has an amino acid sequence in which 1 to 15 amino acids other than amino acid-substituted amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has thioesterase activity. protein.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013204893A JP6226464B2 (en) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | Method for producing lipid using modified thioesterase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013204893A JP6226464B2 (en) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | Method for producing lipid using modified thioesterase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015065932A JP2015065932A (en) | 2015-04-13 |
| JP6226464B2 true JP6226464B2 (en) | 2017-11-08 |
Family
ID=52833401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013204893A Active JP6226464B2 (en) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | Method for producing lipid using modified thioesterase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6226464B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6890827B2 (en) * | 2017-06-23 | 2021-06-18 | 国立大学法人京都大学 | Molten salt electrolyte and potassium molten salt battery |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101939423A (en) * | 2007-10-05 | 2011-01-05 | 蓝宝石能源公司 | System for capturing and modifying large pieces of genomic DNA and constructing organisms with synthetic chloroplasts |
| JP5798729B2 (en) * | 2009-12-25 | 2015-10-21 | 花王株式会社 | Method for producing fatty acid-containing lipid using modified thioesterase |
| EP2519589B1 (en) * | 2009-12-28 | 2013-12-11 | Dow Global Technologies LLC | Algae oil based dielectric fluid for electrical components |
| JP5764339B2 (en) * | 2010-05-06 | 2015-08-19 | 花王株式会社 | Thiesterase and method for producing fatty acid or lipid using the same |
-
2013
- 2013-09-30 JP JP2013204893A patent/JP6226464B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015065932A (en) | 2015-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5798729B2 (en) | Method for producing fatty acid-containing lipid using modified thioesterase | |
| JP6310544B2 (en) | Method for producing lipid using β-ketoacyl-ACP synthase | |
| JP6491881B2 (en) | Acyl-ACP thioesterase | |
| JP5764339B2 (en) | Thiesterase and method for producing fatty acid or lipid using the same | |
| JP6592434B2 (en) | Method for producing lipid | |
| JP6646580B2 (en) | Method for producing medium-chain fatty acid using β-ketoacyl-ACP synthase | |
| JP6319889B2 (en) | Method for producing lipid using modified acyl-ACP thioesterase | |
| JP2017192342A (en) | Method for producing lipid | |
| JP6381139B2 (en) | Acyl-ACP thioesterase | |
| JP6779664B2 (en) | Lipid production method | |
| JP5925651B2 (en) | Method for producing lipid using modified thioesterase | |
| JP6587468B2 (en) | Method for producing lipid | |
| JP6226464B2 (en) | Method for producing lipid using modified thioesterase | |
| JP6969941B2 (en) | Lipid manufacturing method | |
| JP6332855B2 (en) | Method for producing lipid using acyl-ACP thioesterase | |
| JP6520008B2 (en) | Method for producing lipid using diacylglycerol acyltransferase | |
| WO2017022587A1 (en) | Lipid production method | |
| WO2016190239A1 (en) | Lipid production method | |
| JP2018099107A (en) | Lipid production methods | |
| JP2019047756A (en) | Lipid production method | |
| JP2016054703A (en) | Lauric acid production method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160616 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170328 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20170525 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170525 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170912 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171006 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6226464 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |