JP6223962B2

JP6223962B2 - トランス−シクロオクテンジエノフィル及びジエンを有するイメージング又は治療用プレターゲティングキット

Info

Publication number: JP6223962B2
Application number: JP2014509868A
Authority: JP
Inventors: マークステファンロビラード; ジョアンルブ; ラファエラロッシン; デンボッシュサンドラマルティナヴァン; ロニーマチューヴァスティージェン
Original assignee: Koninklijke Philips NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2017-11-01
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: EP2522369A1; CA2835298A1; CA2835298C; WO2012153254A1; US20140093450A1; CN103648533A; AU2012252024B2; CN103648533B; JP2014518861A; EP2707035A1; AU2012252024A1; US9913921B2; EP2707035B1

Description

本発明は、互いに対して生体直交型の反応を示す非生物的（abiotic）反応化学基が使用される標的医療イメージング及び／又は治療のためのプレターゲティング方法に関する。本発明は、また、少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有し、プレターゲティングプローブが、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、エフェクタプローブが、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有するプレターゲティングキットに関する。本発明は、また、上述した方法及びキットに用いられるプレターゲティング剤に関する。本発明は、具体的には、核イメージング及び放射線治療に関連している。

医療診断及び治療の多くの分野では、治療剤（薬物）又は診断（例えば、造影）剤のような薬剤を患者のような被験体の体内の特定の部位又は限られた領域に選択的に運ぶことが望ましい。

臓器又は組織のアクティブターゲティングは、関心のある標的部位において又はその近くで細胞表面に結合する又は細胞の取り込みを促進するターゲティング構造体への所望の活性部分（例えば、コントラスト強調剤又は細胞毒性化合物）の直接的又は間接的な結合により達成される。そのような薬剤を標的にするために用いられるターゲティング部分は、典型的には、細胞表面の標的（例えば、膜受容体）、構造タンパク質（例えば、アミロイド斑）又は細胞内標的（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路）に対して親和性を有する構造体である。これらの部分は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖及びペプチド、ペプトイド及び特定の疾病又は機能不全において蓄積することが知られている有機薬物化合物であり得る。代替として、造影／治療剤は、ＤＮＡ、タンパク質、膜合成及び炭化水素の取り込みのような（感染症又はがん等の）疾病の間に上方制御される代謝経路を標的にすることが可能である。疾病組織では、上述したマーカーが疾病細胞を識別し、早期の検出、特異的診断及び（標的）治療の固有の可能性を与える。

広義には分子イメージング／治療剤、具体的には核イメージング／治療剤の成功のために重要な基準は、それらの薬剤が高い標的の取り込みを示し、同時に非標的組織及び血液からの（腎臓及び／又は肝胆道系を通じての）迅速な排除を示すことである。しかしながら、これは問題のあることが多く、例えば、腫瘍部位における放射性標識された抗体の最大濃度は、２４時間以内に達成可能であるが、循環血液中の標識抗体の濃度が、行われるイメージングの成功のために十分に低いレベルに低下する前に、更に何日か必要とされる。

（特に、核イメージング／治療に対する）標的組織における遅い又は不十分な蓄積及び非標的領域からの遅い排除に関するこれらの問題は、プレターゲティング法のアプリケーションにつながっている。

プレターゲティングは、一次標的（例えば、細胞表面）がプレターゲティングプローブを与えられるターゲティング法のステップを意味している。上記プレターゲティングプローブは、二次ターゲティング部分を備えた他のプローブ（例えば、エフェクタプローブ）により最終的には標的にされる二次標的を有している。

従って、プレターゲティングでは、プレターゲティングプローブが一次標的に結合する。プレターゲティングプローブは、また、診断（イメージング）及び／又は治療剤、エフェクタプローブへの特定の結合を容易にする二次標的を運ぶ。プレターゲティングプローブを形成する構造体が標的部位に局在化した後（所要時間は、例えば２４時間）、自然の排除が十分ではない場合、血液から過剰分を取り除くために除去剤（clearing agent）が用いられ得る。（好ましくは、より短い時間、例えば１ないし６時間を要する）第２のインキュベーションステップでは、エフェクタプローブが、二次ターゲティング部分を介して（予め）結合されているプレターゲティングプローブに結合する。（プレターゲティングプローブに存在する）二次標的及び（エフェクタプローブに存在する）二次ターゲティング部分は、高い特異性及び高い親和性で迅速に結合するべきであり、体内で安定であるべきである。

プレターゲティングの一般的な概念は、図１にイメージングに関して概説されている。ここでは、エフェクタプローブは、イメージングモダリティのための検出可能な標識を有するイメージングプローブである。エフェクタプローブは、二次ターゲティング基を介して（予め）結合されているプレターゲティングプローブに結合する。

二次標的／二次ターゲティング部分のペアのよくある例は、ビオチン／ストレプトアビジン又は抗体／抗原系である。効果的であるように、エフェクタプローブは、非標的部における相対的に低い蓄積とともに腫瘍部における所望の高い蓄積を与えるために、（例えば、腎臓を通じて）体内から迅速に排出されなければならない。従って、これらのプローブは、一般に小さい。

核イメージング及び放射線治療では、時間のかかるプレターゲティングステップが放射性核種を用いることなく行われ、放射性核種を用いる第２のターゲティングステップはより速く行われるので、プレターゲティングの概念は更に有利である。上記第２のターゲティングステップは、患者への放射線量をできる限り少なくするという利点を持つより短い寿命の放射性核種の使用を可能にし、例えば、ＳＰＥＣＴ剤の使用に代えてＰＥＴ剤の使用を可能にする。多座配位子系（ストレプトアビジン、デンドリマ）と組み合わせてＭＲＩにおいてプレターゲティング法を用いることは、標的部位での信号増幅を与える。更に、一般に、この手法は、万能な造影剤の使用を容易にする。

広義には（抗体／抗原のような）生物学において、詳細にはプレターゲティング（ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）において高い選択性の相互作用を行う実体（entity）は、非常に大きい。その結果、二次標的のサイズが小さい一次の基の使用を無意味にするので、一次ターゲティング基として小さい有機部分及びペプチドを用いるプレターゲティング並びに代謝イメージング及び細胞内標的イメージングは達成されていない。

また、現在のプレターゲティングシステムは、生物学的性質と関連する因子により妨げられている。ビオチンは内因性分子であり、その結合は、血清酵素ビオチニダーゼにより開裂し得る。アンチセンスのプレターゲティングが用いられる場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅ及びＤＮＡｓｅによる攻撃に曝され得る。タンパク質及びペプチドは、自然分解経路にも曝される。これらの相互作用は、それらの非共有結合性、動的性質及び制限された標的の滞留時間により更に害される。また、内因性のビオチンは、ストレプトアビジンの結合のためにビオチンの結合と競合する。最後に、ストレプトアビジンは高い免疫抗原性である。

最近の開発は、専ら天然の／生物学的ターゲティング構造体（すなわち、ビオチン／ストレプトアビジン、抗体／ハプテン、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に基づいて、プレターゲティングに関連する欠点を回避することである。

この点に関する参考文献は、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０５１５３０号公報であり、この文献では、テトラジンのような或るジエンとトランス−シクロオクテノール（ＴＣＯ）のようなジエノフィルとの反応性に基づいてプレターゲティングが論じられている。

そのような系に基づいてかなり速い反応が得られるが、これは、上述したビオチン−ストレプトアビジンの系の反応度には及ばない。従って、ビオチン−ストレプトアビジンの系の欠点を回避することは、反応の基本的な要件、すなわち、速度を犠牲する。よって、上述したような生体分子に基づかず、更に、所望の速い反応速度を有する系を与えることが望ましい。

上述の要望により良好に対処するために、本発明は、一観点では、少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び／又は治療用のキットであって、上記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、上記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有し、上記第１及び第２の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、上記第１及び第２の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、上記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して上記プレターゲティングプローブ又は上記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有する当該キットを提供する。

他の観点では、本発明は、プレターゲティング方法、それに用いられるプレターゲティング剤及び上記キットが用いられる標的医療イメージング又は治療を提供する

更に他の観点では、本発明は、動物又は人間におけるプレターゲティング方法に用いられる八員非芳香族環状モノ−アルケニレン部分（好ましくは、シクロオクテン部分、より好ましくは、トランス−シクロオクテン部分）を有する化合物であり、上記部分は、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有している。

更に他の観点では、本発明は、逆ディールス・アルダー反応に基づくプレターゲティング方法におけるジエノフィル反応物質として同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を持つトランス−シクロオクテン部分を有する化合物の使用に属する。

上述したようなプレターゲティングの概念の一般的図式を示している。（３，６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジンとトランス−シクロオクテンジエノフィルとの［４＋２］ディールス・アルダー反応に続いて、生成物及び二窒素が形成される逆ディールス・アルダー反応が起こる反応スキームを与えている。トランスシクロオクテン誘導体は、古典的なディールス・アルダー反応におけるような電子求引基を含んでいないので、このタイプのディールス・アルダー反応は古典的なディールス・アルダー反応と区別され、「逆電子要請型ディールス・アルダー反応」と呼ばれることも多い。以下の文章では、一連の両方の反応ステップ、すなわち、最初のディールス・アルダー環状付加（典型的には、逆電子要請型ディールス・アルダー環状付加）及びその後の逆ディールス・アルダーは、「逆ディールス・アルダー反応」又は「逆ＤＡ」と省略表現で呼ばれる。逆ディールス・アルダー化学現象を用いるプレターゲティングについての一般的図式を示している。逆ディールス・アルダー化学現象を用いるプレターゲティングについての一般的図式を示している。実施例に述べられている化合物の反応スキーム及び化学的構造を示している。実施例に述べられている化合物の反応スキーム及び化学的構造を示している。（Ａ）天然の（native）ＣＣ４９、（Ｂ）分子当たり０．４当量ｅｎｄｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９（６）、（Ｃ）分子当たり５．２当量ｅｎｄｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９（６）、（Ｄ）分子当たり０．７当量ｅｘｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９（７）、（Ｅ）分子当たり８．９当量ｅｘｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９（７）のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム（２６０ｎｍにおけるＵＶプロファイル）を示している。ＣＣ４９-ＴＣＯ構造体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。レーン１ないし５は、それぞれ、天然のＣＣ４９６、０．４当量ｅｎｄｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９６、５．２当量ｅｎｄｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９、０．７当量ｅｘｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９７及び８．９当量ｅｘｏ−ＴＣＯ部分で修飾されたＣＣ４９７を含んでいる（左側に完全長のゲルの分子量の基準が示されている。）。実施例２に説明されている^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンの滴定によるＴＣＯの定量に関する反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している（Ａ：ゲルの放射線写真、Ｂ：タンパク質染料）。レーン１ないし３は、ＣＣ４９-ＴＣＯ６及び^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン（ｍＡｂに対して１０、１３及び１４当量）を含み、レーン４ないし６は、ＣＣ４９-ＴＣＯ７及び^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン（ｍＡｂに対して１０、１３及び１４当量）の混合物を含んでいる。実施例３に説明されている反応速度の測定の結果を示している。^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８（０．６７ｎＭ）と（Ａ）ＣＣ４９-ＴＣＯ６又は（Ｃ）ＣＣ４９-ＴＣＯ７（４つの異なるｍＡｂ濃度）との時間依存性の反応の収率、及びＫ_ｏｂｓ対（Ｂ）ＴＣＯ６又は（Ｄ）ＴＣＯ７濃度のプロットである。実施例４に説明されているＣＣ４９に結合されたＴＣＯ６及び７の生体内安定性を示している。バーは平均値を意味し、エラーバーは一標準偏差（ｎ＝３）を意味している。実施例５に説明されている（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート１２の合成を示している。実施例６に説明されている２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４１，４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−オアート１６の合成を示している。実施例７に説明されているガラクトース−アルブミン−テトラジン２２の合成を示している。実施例８に説明されている（Ｅ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］）デカ−４−エン−９−イル）アセテート（２６）の合成を示している。実施例９に説明されている（Ｅ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１−オール（３２）の合成を示している。実施例１０に説明されている（Ｅ）−３，３ａ，４，５，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロオクタ［ｄ］イミダゾール−２（８Ｈ）−オン（４０）の合成を示している。実施例１１に説明されている２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４７）及び２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（１１−オキソ−１１−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ウンデシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４８）の合成を示している。実施例１５に説明されている^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８（２６．６ｎＭ）とＣＣ４９−ＴＣＯ（１２）（３つの異なるｍＡｂ濃度）との時間依存性の反応の収率及びＫ_ｏｂｓ対ＴＣＯ１２濃度のプロットを示している。実施例１５に説明されている^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８（１．７３ｎＭ）とＣＣ４９−ＴＣＯ（２６）（３つの異なるｍＡｂ濃度）との時間依存性の反応の収率及びＫ_ｏｂｓ対ＴＣＯ２６濃度のプロットを示している。実施例１６に説明されているＣＣ４９と結合したＴＣＯ１２の生体内安定性を示している。バーは平均値を意味し、エラーバーは一標準偏差（ｎ＝３）を意味している。実施例１７に説明されているｍＡｂ注入２９時間後の腫瘍を持ったマウスの^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（７）及び^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（１２）の生体内分布を示している。データは％ＩＤ／ｇとして表され、エラーバーは一標準偏差（ｎ＝４）である。実施例１７に説明されているＣＣ４９−ＴＣＯ（７）及びＣＣ４９−ＴＣＯ（１２）でプレターゲティングされたマウスの（３時間注入後の）^１７７Ｌｕ−テトラジンの生体内分布を示している。データは％ＩＤ／ｇとして表され、エラーバーは一標準偏差（ｎ＝４）である。実施例１８に説明されているモデルソフトウェアにより表された３次元構造を示している（文字ｘ、ｙ及びｚは、ｘ軸、ｙ軸及びｚ軸をそれぞれ表している）。

広い意味では、本発明は、ジエノフィルとしてトランス−シクロオクテン部分を用いる系において、八員環部分が平らな構造（flattened structure）にされる場合に反応速度の大幅な増大が得られるという認識に基づいている。

本発明によれば、この平らな構造は、トランス−シクロオクテン部分に実質的に同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を与えることにより賢明に達成される。

以下において、八員環部分は、認識し易いようにトランス−シクロオクテン部分として定義されるか、又は略して「ＴＣＯ」部分として定義される。要（エッセンス）はジエノフィルとしての役割を果たす八員環の可能性にあることが理解されるであろう。複素環モノアルケニレン八員環もまたジエノフィル活性を有することが知られているので、当業者であれば、ジエノフィル活性は必ずしも環の全ての炭素原子の存在には依存しないという事実をよく知っている。

従って、概して、本発明は、厳密にはトランス−シクロオクテンに限定されるものではない。有機化学に精通している人であれば、トランス−シクロオクテンと同じ環内二重結合を有するが、環の他の場所に１つ以上のヘテロ原子を有する他の八員環をベースとするジエノフィルが存在することに気付くであろう。すなわち、本発明は、一般に、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有する八員非芳香族環状アルケニレン部分、好ましくは、シクロオクテン部分、より好ましくは、トランス−シクロオクテン部分に関連している。

生体内作用が小さい構造的変化を伴って変化することが多い例えば医薬的作用物質の場合以外、本発明は、何よりもまず、適切な化学反応を必要とする。従って、考えられる構造は、当業者がジエノフィルとしてのそれらの反応に精通している構造にまで及ぶ。

有機化学に精通している人であれば、「実質的に同一面に固定された」という表現は、結合が同一面に固定されていると通常考えられる結合論を指すことを理解するであろう。同一面におけるそのような固定の典型的な例は、二重結合及び歪みのある縮合環を含んでいる。例えば、上記少なくとも２つの環外結合は、酸素との二重結合（すなわち、Ｃ＝Ｏ）の２つの結合であり得る。上記少なくとも２つの環外結合は、２つの隣接する炭素原子の単結合であってもよい。これは、これらの結合がともに、そこで実質的に１つの同じ面に上記２つの単結合を固定する実質的に平らな構造をとる縮合環の一部である（すなわち、ＴＣＯ環に縮合している）ことが条件である。上記単結合の例は、シクロプロピル及びシクロブチルのような歪みのある環を含んでいる。

更に他の例では、上述の可能性を組み合わせて、縮合環は芳香族環である。その場合、少なくとも２つの結合が付着するＴＣＯの炭素原子はともにｓｐ^２炭素原子であり、上記結合は縮合環の一部である。上記結合は、芳香族縮合環の混成に加わることが理解されるであろう。

理論に拘束されることを望むことなく、本願発明者等は、この発見に基づいて、同一面内の少なくとも２つの環外結合の存在がＴＣＯ環の少なくとも部分的な平坦化をもたらし、この平坦化が、今度は逆ディールス・アルダー反応に基づくプレターゲティングの際のより高い反応性の必要性の取り組みへの鍵を与えることを確信している。ＴＣＯ環の部分的な平坦化は、同一面に固定された２つの環外結合の存在の本質的な結果であり、少なくとも、環内二重結合の反対側の部分、すなわち、炭素原子５及び６を指す。これは、２つの環外結合が炭素原子５及び６に位置するか、それに隣接して（４、５に）位置するか、又は炭素原子３及び４に位置するかどうかに関係なく当てはまる。

命名法の選択に依存して、ＴＣＯジエノフィルは、Ｅ−シクロオクテンとも示される。従来の命名法を参照して、シクロオクテン環における置換の結果として、置換基の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテンの異性体は、正式にはＺ異性体として表されるようになり得る。本発明では、本発明の任意の置換された変異体は、正式には「Ｅ」若しくは「Ｚ」又は「シス」若しくは「トランス」異性体か否かにかかわらず、未置換トランス−シクロオクテン又は未置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体と見なされる。「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）及びＥ−シクロオクテンという用語は、ほぼ同じ意味で用いられ、置換基が正式には逆の命名法を必要とする場合にも本発明に従って全てのジエノフィルに対して維持される。すなわち、本発明は、以下に番号が付されている炭素原子１及び６がＥ（entgegen）又はトランス位であるシクロオクテンに関するものである。

従って、広い意味では、本発明は、ジエノフィルとしての反応性においてＴＣＯ環を阻害する置換基を含まないならば、上述した要件を満たすいかなる置換されたＴＣＯ部分にも及ぶ。

本発明は、更に、特定の実施形態に関して或る図面を参照して説明されるが、本発明はそれに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるいかなる参照符号も範囲を限定するように解釈されるべきではない。説明されている図面は、単に模式的なものにすぎず、非限定的である。図面において、構成要素の幾つかの大きさは誇張されており、説明の目的のために実際の寸法で描かれてはいない。この説明及び特許請求の範囲において「有する」という表現が用いられる場合、この表現は、他の構成要素又はステップを排除するものではない。単数名詞を指す際に不定冠詞又は定冠詞、例えば、「a」又は「an」、「the」が用いられている場合、これは、何か他のことが特に述べられていない限りは、当該名詞の複数を含んでいる。

更に、この説明及び特許請求の範囲において用いられる「有する」という表現は、その後に列挙される手段に限定されると解釈されるべきではなく、他の構成要素又はステップを排除しないことに気付かれなければならない。従って、「手段Ａ及びＢを有するデバイス」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみより成るデバイスに制限されるべきではない。本発明に関しては、専らデバイスの関連する構成要素がＡ及びＢであることを意味する。

幾つかの化学式では、「アルキル」及び「アリール」が引用されている。この点において、「アルキル」は、個々に独立して、場合によってはＯ、Ｎ又はＳのような１ないし３個のヘテロ原子を含む炭素原子が１０個までの、好ましくは、１ないし６個の炭素原子の脂肪族、直鎖状の、分岐した又は環状アルキル基を示し、「アリール」は、個々に独立して、場合によってはＮ又はＳのような１ないし３個のヘテロ原子を含む炭素原子が１０個までの芳香族又は複素芳香族基を示す。幾つかの式では、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」及び種々の番号が付された「Ｒ」基のような文字に関連して、基又は置換基が示されている。これらの文字の定義は、各式に関連して読み取られるべきである。
すなわち、異なる式では、これらの文字は、個々に独立して、特に指示がない限り異なる意味を有し得る。

逆ディールス・アルダー反応
逆ディールス・アルダー反応結合現象は、一般に、不安定な中間体を形成するために結合する反応物質のペアを含んでおり、この中間体は、安定な生成物を形成するための逆ディールス・アルダー反応による単一（唯一）の副産物としての小分子（開始化合物に依存して、これは、例えば、Ｎ_２、ＣＯ_２、ＲＣＮである。）を取り除く。このペアの反応物質は、一方の反応物質（すなわち、一方の生体直交型の反応基）としてテトラジンの誘導体、例えば、電子欠乏テトラジンのような好適なジエンを有し、他方の反応物質（すなわち、他方の生体直交型の反応基）として式（１）に従う歪みのあるシクロオクテンを有している。

例えば、電子欠乏（置換）テトラジンの本発明の平らなＴＣＯ部分との非常に速い反応は、［４＋２］逆ディールス・アルダー環状付加における単一の副産物としてのＮ_２を取り除くことによって安定なジヒドロピリダジンに配列し直すことにより連結反応（ligation）中間体をもたらす。これは、図２に示されている。

上記２つの反応種は、非生物的であり、生体内で速い代謝を経験しない。これらは、生体直交型であり、例えば、生理学的媒体中で互いに選択的に反応する。これの利点は、ジエン及びシクロオクテンの両方が細胞の内部又は表面で並びに血清等のような全ての他の領域生体分子に対して本質的に反応しないことである。従って、本発明の化合物及び方法は、生きた細胞、組織又は有機体において用いられ得る。また、反応基はかなり小さく、生体分子のサイズを大きく変えることなく生体試料又は有機体に導入され得る。［４＋２］逆ディールス・アルダー反応を用いることにより、サイズの大きい一次ターゲティング部分、例えば、抗体を小さい反応相手、例えば、テトラジン又はシクロオクテンを用いる標識又は他の分子と結合させることが可能である。更により有利なことには、かなり小さい一次ターゲティング部分、例えば、ペプチドが、（適合した）かなり小さい反応相手、例えば、テトラジン又はシクロオクテンを用いる標識又は他の分子と結合され得る。プレターゲティングプローブ及びエフェクタプローブのサイズ及び性質は、二次標的及び二次ターゲティング部分により大きく影響を及ぼされず、（プレ）ターゲティング方式が小さいターゲティング部分に対して用いられることを可能にする。このため、抗体−ストレプトアビジンを用いる現在のプレターゲティングの場合のように、他の組織が標的にされ得る。すなわち、プローブの行き先は、脈管系及び間質腔に制限されない。

逆電子要請型ディールス・アルダー反応及び反応種のペアの挙動に関する参考文献は、Thalhammer, F; Wallfahrer, U; Sauer, J, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854、Wijnen, JW; Zavarise, S; Engberts, JBFN, Journal Of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005、Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal Of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19)、R. Rossin, P. Renart Verkerk, Sandra M. van den Bosch, R. C. M. Vulders, l. Verel, J. Lub, M. S. Robillard, Angew Chem Int Ed 2010, 49, 3375、N. K. Devaraj, R. Upadhyay, J. B. Haun, S. A. Hilderbrand, R. Weissleder, Angew Chem Int Ed 2009, 48, 7013及びDevaraj et al., Angew.Chem.Int.Ed., 2009, 48, 1-5を含んでいる。

広い意味では、本発明によれば、上述した結合化学現象は、基本的にはプレターゲティングにおいて用いられることができる分子、基又は部分の任意のペアに適用され得る。すなわち、そのようなペアの一方は、一次標的に結合することができる一次ターゲティング部分を有し、少なくとも１つの二次標的を更に有している。ペアの他方は、上記二次標的に結合する際に用いて好適な二次ターゲティング部分であり、治療作用を発揮するのに好適な部分（典型的には、薬学的活性化合物）、イメージング技術により対処されるのに好適な部分（すなわち、標識）又はそれらの両方を有している。

従って、本発明によれば、プレターゲティングプローブ及びエフェクタプローブのいずれか一方が、上記に定義されたような平らなシクロオクテンを有する官能基を持ち、他方はテトラジン又は他の好適なジエンを有する官能基を持つ。これは、図３に示されている。上側の図（図３ａ）は、（オプションでフレキシブルスペーサを有する）リンカー部分を介して一次ターゲティング部分としての抗体に結合されるジピリジルテトラジンを有するプレターゲティングプローブ及びリンカー（フレキシブルスペーサ）を介して検出可能な標識に付着する（二次ターゲティング部分としての）シクロオクテンを有するエフェクタプローブを示している。下側の図（図３ｂ）は、正反対のこと、すなわち、シクロオクテンを有するプレターゲティングプローブ及びテトラジンを有するエフェクタプローブを示している。

ジエノフィル
本発明の重要な成果は、ジエノフィル、すなわち、１００倍以上にまで生体直交型の結合反応の反応速度の増加の達成を可能にする上記に定義された平らなＴＣＯ部分が選択されることである。又は、言い換えると、元の時間のわずか１％である反応時間しか必要とされない。又は、更に言い換えると、或る反応物質の濃度が１００倍低くなり得る。

このジエノフィルは、広い意味では、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有する八員環非芳香族環状アルケニレン部分（好ましくは、シクロオクテン部分、より好ましくは、トランス−シクロオクテン部分）である。これは、以下、概して「平らなＴＣＯ」と呼ばれる。

好ましくは、上記平らなＴＣＯは、以下の式、すなわち、

を満たす。

ここで、Ａ及びＰはＣＲ^ａ _２であり、各Ｒ^ａは独立してＨ又は置換基、好ましくは、Ｈ又はアルキル及びアリール基よりなる群から選択された置換基、より好ましくは、Ｃ_１−６のアルキル又はフェニル基である。

興味深い実施形態では、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲ^ｂ、Ｓ−ＮＲ^ｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２及びＳ−Ｓよりなる群から選択された隣接する原子のペアが存在しないという条件で、Ｓｉは専らＣＲ^ａ _２又はＯに隣接するように、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑは、個々に独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂ及びＳｉＲ^ｃ _２よりなる群から選択され、Ｙ、Ｚ、Ｘ及びＱの少なくとも１つ且つ多くても４つはＣ＝ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ及びＣ＝ＮＲ^ｂよりなる群から選択される。

他の興味深い実施形態では、ＰＱ及びＹＡが芳香族５員環若しくは６員環、結合７員環又はＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａの一部ではなければ、結合ＰＱ、ＱＸ、ＸＺ、ＺＹ、ＹＡの１つは、縮合環の一部であるか、又はＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａよりなっており、残りのグループ（Ａ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑ、Ｐ）は、Ｐ、ＡがＣＲ^ａであるように、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂ、ＳｉＲ^ｃ _２であり、Ｓｉが存在する場合にはＳｉはＣＲ^ａ _２又はＯに隣接し、ＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａ結合が存在する場合にはＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａ結合はＣＲ^ａ _２又はＣ＝ＣＲ^ａ _２基に隣接するように、多くても２つの基が、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂであり、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲ^ｂ、Ｓ−ＮＲ^ｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２及びＳ−Ｓから選択された隣接する原子のペアが存在しない。

更に他の興味深い実施形態では、Ｏ−Ｏ、Ｏ−ＮＲ^ｂ、Ｓ−ＮＲ^ｂ、Ｏ−Ｓ、Ｏ−Ｓ（Ｏ）、Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２及びＳ−Ｓよりなる群から選択された隣接する原子のペアが存在しないという条件で、且つ、Ｓｉが存在する場合にはＣＲ^ａ _２又はＯに隣接し、ＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａ結合が存在する場合にはＣＲ^ａ _２又はＣ＝ＣＲ^ａ _２基に隣接するように、ＰＱ及びＹＡが芳香族５員環若しくは６員環、結合７員環又はＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａの一部ではなければ、結合ＰＱ、ＱＸ、ＸＺ、ＺＹ、ＹＡの２つが、縮合環の一部であるか、又はＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａよりなっており、残りのグループ（Ａ、Ｙ、Ｚ、Ｘ、Ｑ、Ｐ）は、Ｐ、ＡがＣＲ^ａ _２であるように、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂ、ＳｉＲ^ｃ _２である。

Ｔ、Ｆは、個々に独立して、Ｈ又はアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩよりなる群から選択される置換基を示している。

幾つかの実施形態では、以下に定義されるような縮合３員環、縮合４員環、縮合二環７員環、縮合芳香族５員環、縮合芳香族６員環及び縮合平面結合７員環から選択される縮合環が存在する。

縮合３員環は、

である。

ここで、Ｅ、Ｇは、上述した８員環の一部であり、Ｐ、ＡがＣ又はＣＲ^ａであるようにＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得る。

Ｅ−ＧがＣＲ^ａ−ＣＲ^ａであれば、ＤはＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、ＮＲ^ｂ、Ｏ、Ｓである。

Ｅ−ＧがＣＲ^ａ−Ｎであれば、ＤはＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、ＮＲ^ｂ、Ｏ、Ｓである。

縮合４員環は、

である。

Ｅ−Ｇは、上述した８員環の一部であり、Ｐ、ＡがＣ又はＣＲ^ａであるようにＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得る。

Ｅ、ＧがＣＲ^ａ又はＮであれば、Ｄ、Ｍは、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであるが、Ｏ−Ｏ又はＳ−Ｓ基が隣接していない。

Ｅ−ＤがＣ＝ＣＲ^ａであれば、ＧはＮ、ＣＲ^ａであり、ＭはＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂである。

Ｅ−ＤがＣ＝Ｎであれば、ＧはＮ、ＣＲ^ａであり、ＭはＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏである。

Ｄ−ＭがＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａであれば、Ｅ、Ｇは、互いに独立して、ＣＲ^ａ、Ｎである。

Ｄ−ＭがＣＲ^ａ＝Ｎであれば、ＥはＣＲ^ａ，Ｎであり、ＧはＣＲ^ａである。

ＥはＣであり、ＧはＣＲ^ａ又はＮであり、且つ、Ｄ、Ｍは、ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであるか又はＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２の最大１つであるが、Ｏ−Ｏ又はＳ−Ｓ基が隣接していない。

Ｅ、ＧはＣであり、Ｄ、Ｍは、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであるが、Ｏ−Ｏ又はＳ−Ｓ基が隣接していない。

縮合二環７員環は、

である。Ｅ−Ｇは、上述した８員環の一部であり、Ｐ、ＡがＣ又はＣＲ^ａであるようにＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得る。

Ｅ、ＧはＣ、ＣＲ^ａ又はＮであり、Ｋ、ＬはＣＲ^ａであり、Ｄ、Ｍは、ＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａ若しくはＣＲ^ａ＝Ｎを形成しているか又は、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであるが、Ｏ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基が隣接しておらず、ＪはＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであり、Ｎ基は最大２つである。

Ｅ、ＧはＣ、ＣＲ^ａであり、ＫはＮであり、ＬはＣＲ^ａであり、Ｄ、Ｍは、ＣＲ^ａ＝ＣＲ^ａ結合を形成しているか又は、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、ＮＲ^ｂであるが、Ｏ−Ｏ、Ｓ−Ｓ、Ｎ−Ｓ基が隣接しておらず、ＪはＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、Ｏ、ＮＲ^ｂであり、Ｎ基は最大２つである。

Ｅ、ＧはＣ、ＣＲ^ａであり、Ｋ及びＬはＮであり、Ｄ、Ｍ、Ｊは、互いに独立して、ＣＲ^ａ _２、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｃ＝ＮＲ^ｂ、Ｃ＝ＣＲ^ａ _２基である。

縮合芳香族５員環は、

である。

Ｅ、Ｇは、上述した８員環の一部であり、ＰＱ、ＱＰ、ＱＸ、ＸＱ、ＸＺ、ＺＸ、ＺＹ、ＹＺ、ＹＡ、ＡＹに縮合され得る。

Ｅ、ＧはＣである。Ｌ、Ｋ又はＭのグループの１つはＯ、ＮＲ^ｂ、Ｓであり、上記グループの残りの２つは、互いに独立して、ＣＲ^ａ又はＮである。

ＥはＣであり、ＧはＮである。Ｌ、Ｋ、Ｍは、互いに独立して、ＣＲ^ａ又はＮである。

縮合芳香族６員環は、

である。

Ｅ、ＧはＣである。Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｍは、互いに独立して、ＣＲ^ａ又はＮである。

縮合平面結合７員環は、

である。

Ｅ、ＧはＣであり、Ｌ、Ｋ、Ｄ、ＭはＣＲ^ａであり、ＪはＳ、Ｏ、ＣＲ^ａ _２、ＮＲ^ｂである。

上述した実施形態の全てにおいて、Ａ、Ｐ、Ｑ、Ｙ、Ｘ及びＺの１つ又はこれらが一部である置換基若しくは縮合環は、オプションでスペーサを介して、プレターゲティングプローブ及びエフェクタプローブに結合される。

上記に示されているような各Ｒ^ａは、独立して、Ｈ、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）_２−アリール、Ｓ（Ｏ）_２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ_３、ＳＯ_２Ｈ、ＳＯ_３Ｈ、ＳＯ_４Ｈ、ＰＯ_４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ_２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ_３、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アルキル、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アルキル、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＣＲ′ＮＲ″であり得る。

上記に示されているような各Ｒ^ｂは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、ＯＨ、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＲ′ＣＯ−アルキルよりなる群から選択される。上記に示されているような各Ｒ^ｃは、Ｈ、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、ＯＨよりなる群から選択され、２つ以上のＲ^{ａ，ｂ，ｃ}部分が環を共に形成する。

好ましい実施形態では、トランス−シクロオクテン部分は、式（１）を満たす。
（１）
ここで、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合の存在に加えて、各Ｒは、独立して、Ｈ又は、多くても６つの場合で、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、アルキル、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）_２−アリール、Ｓ（Ｏ）_２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ_２、ＳＯ_３、ＳＯ_４、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＲ′ＣＯ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アルキル、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アルキル並びにＲ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アリールよりなる群から選択される置換基を示しており、２つのＲ部分は、オプションでスペーサを介したプレターゲティングプローブ又はエフェクタプローブとのリンカー部分に含まれる少なくとも１つのＲを伴って環を共に形成することができ、Ｘ及びＹは、個々に独立して、Ｈ又はアルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩよりなる群から選択される置換基を示している。

上述のジエノフィルでは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合が、（ａ）縮合シクロプロピル環の単結合、（ｂ）縮合シクロブチル環の単結合、（ｃ）縮合芳香族環の混成結合、（ｄ）酸素との環外二重結合及び（ｅ）炭素との環外二重結合よりなる群から選択されることが好ましい。

更に好ましい実施形態では、ジエノフィルは、以下の構造から、すなわち、

から選択される化合物である。

上述した構造は、賢明な平らなジエノフィル構造を除き、一般的に、熟練した有機化学者によって合成にとって入手し易い（環及び置換基の）構造的部分に基づいて選択されることに注意されたい。

他の興味深い実施形態では、ジエノフィルは、以下の構造、すなわち、

から選択される化合物である。

上述のジエノフィルは、ここでは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル（ＮＨＳ−エステル）の形で示されている。ＮＨＳ−エステルは、一般に、タンパク質修飾に用いられ、ここでは、ＴＣＯをターゲティング部分又はエフェクタ部分に結合させるツールとしての役割を果たす。

説明の目的のために、ＴＣＯ構造は、特にＮＨＳについて言及することなく示されもできる。ＴＣＯ部分がプレターゲティングプローブ又はエフェクタプローブに含まれる本発明の記述を考慮すると、上述した化合物に関して、これは、以下のように示される。

本発明に用いるジエノフィルは、シクロオクテン及びそれに対応する原子含有環への既知の合成ルートに基づいて当業者により合成され得る。同一面に固定された２個の環外結合を得るために必要な置換は、熟練した有機化学者に知られている技術により実行され得る。好適な開始化合物は、下部に参考文献が示されている以下の前駆体を含んでいる。

当業者であれば、更に、グラブス触媒を用いる閉環メタセシス反応を介して合成され得る多くのシクロオクテン誘導体を知っている。

上述したように、ＴＣＯは、場合によっては環に１つ以上のヘテロ原子を含んでいる。これは、それ自体は当業者にとって十分に入手し易い。Cere et al.Journal of Organic Chemistry 1980, 45, 261には、ＴＣＯにおけるチオエーテルの存在について述べられている。また、例えば、ＴＣＯにおけるＯ−ＳｉＲ_２−Ｏの存在については、Prevost et al. Journal of the American Chemical Society 2009, 131, 14182に述べられている。

ジエン
当業者であれば、逆ディールス・アルダー反応においてよく反応する多くのジエンを知っている。好ましいジエンは、式（２）ないし（５）を参照して以下に与えられる。
（２）
ここで、Ｒ^１は、Ｒ′、Ｒ″及びＲ″′が個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであるアルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ″Ｒ″′、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ″Ｒ″′よりなる群から選択され、Ａ及びＢは、Ａ及びＢが両方ともに炭素ではないという条件で、個々に独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ^＋Ｏ⁻、ＲがアルキルであるＮ^＋Ｒよりなる群から選択され、Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏよりなる群から選択され、Ｙは、ＲがＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ′、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ′、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ′、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″（Ｒ′及びＲ″は、個々に独立して、Ｈ、アリール又はアルキルである。）よりなる群から選択されたＣＲである。

シクロオクテンに対する反応相手として特に好適なジエンは、
（３）
である。ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、ＮＯ_２、ＯＲ′、ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルよりなる群から選択されたものであり、ＢはＯであり、Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものである。

シクロオクテンに対する反応相手として特に好適な他のジエンは、
（４）
である。ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、ＮＯ_２、ＯＲ′、ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものであり、ＢはＮであり、Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものである。

特に有用なテトラジン誘導体は、電子欠乏テトラジン、すなわち、一般に電子供与性として保持しない基又は部分で置換された、好ましくは、電子求引性置換基を所有するテトラジンである。

これらの電子欠乏テトラジンは、一般に、以下の構造式を満たす。
（５）

ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル、又は、オプションで、ＮＯ_２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ_３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒのような１つ以上の電子求引基で置換されたフェニルよりなる群から選択される置換基を示しており、上記ＲはＣ_１ないしＣ_６のアルキルであり、Ａｒは芳香族基、特に、フェニル基、ピリジル基又はナフチル基を表している。

式（２）ないし（５）のそれぞれに従う化合物では、（Ｘ又はＹについての原子団を含む）Ｒ^１基及びＲ^２基は、更に、以下に論じられるような適切なリンカー又はスペーサ部分を備えている。同様に及びそれとは関係無く、上記に定義された式（１）のジエノフィルもまた、以下に論じられるような適切なリンカー又はスペーサ部分を備えている。

ジエンは、全ての実施形態において、オプションでスペーサを介して、プレターゲティングプローブ又はエフェクタプローブと少なくとも１つの結合を有することが理解されるであろう。

一実施形態によれば、本発明は標的イメージングに用いられる。

この実施形態によれば、特定の一次標的のイメージングは、プレターゲティングプローブの一次ターゲティング部分の特異的な結合及びエフェクタプローブに含まれる検出可能な標識を用いるこの結合の検出により達成される。

本発明に用いられるジエンは、熟練した有機化学者に知られている合成ルートに基づいて当業者により合成され得る。

一次標的
本明細書において用いられる「一次標的」は、診断及び／又はイメージング法において検出される、及び／又は、薬学的活性化合物により調節、結合又はそうでなければ処理される、又は他の治療モダリティである標的に関連している。

上記一次標的は、人間若しくは動物の体内の又は病原体若しくは寄生体の任意の適切な標的から選択され、例えば、細胞膜及び細胞壁のような細胞と、細胞膜受容体のような受容体と、ゴルジ体又はミトコンドリア、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウィルス又はウィルス粒子、抗体、タンパク質、炭化水素、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミンオキシダーゼ、ムスカリン受容体、心筋交感神経系、例えば白血球のロイコトリエン受容体、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、葉酸受容体、アポトーシスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ドーパミン作動系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ系、アドレナリン作動系、コリン作動系、オピオイド受容体、ＧＰＩＩａ／ＩＩＩａ受容体及び他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフトシン受容体、インテグリン受容体、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＥＧＦ、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌ／セレクチン受容体、ＬＤＬ受容体、Ｐ糖タンパク質、ニューロテンシン受容体、ニューロペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼのような細胞内構造とを有するグループから選択される。

本発明の特定の実施形態によれば、上記一次標的は、受容体のようなタンパク質である。代替として、一次標的は、病気中、例えば、感染症又はがんの間に上方制御されるＤＮＡ合成、タンパク質合成、膜合成及び炭化水素の取り込みのような代謝経路である。疾病組織では、上述したマーカーが健康な組織と異なり、早期の発見、特異的診断及び治療、特に、標的治療の固有の可能性を与える。

プレターゲティングプローブ
プレターゲティングプローブは、関心のある一次標的に結合することができる部分を有している。

ターゲティング部分は、典型的には、細胞表面の標的（例えば、膜受容体）、構造タンパク質（例えば、アミロイド斑）又は細胞内標的（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路）である。これらの部分は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖並びにペプチド、ペプトイド及び特定の病気又は機能不全で蓄積することが知られている有機薬剤化合物であり得る。

本発明のキットで用いる適切な一次ターゲティング部分の特定の実施形態は、本明細書において説明され、受容体結合ペプチド及び抗体を含んでいる。本発明の特定の実施形態は、細胞透過性のターゲティングプローブを得るためにペプチドのような小さいターゲティング部分の使用に関連している。

本発明において用いられる「一次ターゲティング部分」は、一次標的に結合するターゲティングプローブの一部に関連している。一次ターゲティング部分の具体的な例は、受容体に結合するペプチド又はタンパク質である。一次ターゲティング部分の他の例は、細胞化合物に結合する抗体又はその断片である。抗体は、非タンパク質化合物及びタンパク質又はペプチドに産生され得る。他の一次ターゲティング部分は、アプタマ、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖並びにペプトイド及び有機薬物化合物で構成され得る。一次ターゲティング部分は、好ましくは、高い特異性、高親和性で結合し、オプションで、共有結合さえもし、一次標的を伴う結合は、好ましくは、体内で安定である。

上記列挙された一次標的の特異的なターゲティングを可能にするために、ターゲティングプローブの一次ターゲティング部分は、抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、二重特異性抗体、ポリマ（ＥＰＲ効果による腫瘍ターゲティング）、タンパク質、ペプチド、例えば、オクトレオチド及び誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、ＬＨＲＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣薬、炭化水素、単糖類、多糖類、ウィルス、全細胞、ファージ、薬剤、化学療法薬、受容体作用薬（agonist）及び拮抗薬（antagonist）、サイトカイン、ホルモン、ステロイドを含む化合物を有しているが、これに限定されない。本発明の関連の中で想定される有機化合物の例は、エストロゲン、例えば、エストラジオール、アンドロゲン、プロゲスチン、コルチコステロイド、パクリタキセル、エトポシド、ドキソルビシン、メトトレキサート、葉酸及びコレステロールであるか、又はそれらに由来する。

本発明の特定の実施形態によれば、一次標的は受容体であり、適切な一次ターゲティング部分は、依然として受容体に結合するそのような受容体又はその一部のリガンドを含んでおり、例えば、受容体結合タンパク質リガンドの場合には受容体結合ぺプチドであるが、これに限定されない。

タンパク質性の一次ターゲティング部分の他の例は、インターフェロン、例えば、アルファ、ベータ及びガンマインターフェロン、インターロイキン及び腫瘍成長因子、例えば、アルファ、ベータ腫瘍成長因子のようなタンパク質成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｕＰＡＲターゲティングタンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン及びアンギオスタチンを含んでいる。

一次ターゲティング部分の代替の例は、例えば、一次標的に相補的であるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含んでいる。

本発明の特定の実施形態によれば、細胞内一次標的に結合し得る小さい親油性の一次ターゲティング部分が用いられる。

本発明の他の特定の実施形態によれば、一次標的及び一次ターゲティング部分は、がん、炎症、感染症、心血管疾患、例えば、血栓、動脈硬化病変、低酸素部位、例えば、脳卒中、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、器官及びレポータ遺伝子／酵素のような組織又は疾患の特定の又は高められたターゲティングをもたらすように選択される。これは、組織、細胞又は疾患特異的な発現を伴う一次標的を選択することにより達成され得る。例えば、膜葉酸受容体は、メトトレキサートのような葉酸塩及びその類似体の細胞内蓄積を媒介する。正常細胞では発現が制限されるが、受容体は、種々の腫瘍細胞のタイプにおいて過剰発現する。

一実施形態によれば、プレターゲティングプローブ及びエフェクタプローブは、複数の一次及び／又は二次標的及び／又はターゲティング部分を有する多量体（multimeric）化合物である。これらの多量体化合物は、ポリマ、デンドリマ、リポソーム、ポリマ粒子又は他の高分子構造体である。検出の信号を増幅するために特に興味深いのは、１つよりも多い二次標的を伴うターゲティングプローブであり、これは複数のエフェクタプローブの結合を可能にする。

プレターゲティングプローブは、更に、上述した第１の生体直交型の反応基を有している。この基は、「二次標的」としての、すなわち、逆ディールス・アルダー結合化学現象に関する第１の反応相手を与えるターゲティングプローブの一部としての機能を果たす。

上記二次標的は、上述したように、結合反応のどちらか一方の相手であり得る。すなわち、一実施形態では、二次標的は電子欠乏テトラジンである。他の実施形態では、二次標的は、本発明に係る上述したような平らなＴＣＯである。

上記プレターゲティングプローブでは、一次ターゲティング部分と第１の生体直交型の反応基とは、互いに直接結合できる。これらは、リンカーを介しても互いに結合可能であり、更に、これらは両方ともに、一次ターゲティングの骨格、例えば、ポリペプチドのような生体高分子に結合され得る。すなわち、最も単純な意味では、リンカー部分は結合である。好適なリンカー部分は、２から２００まで、特に３ないし１１３、好ましくは５ないし５０の様々な繰り返しユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を更に含んでいるが、これに限定されない。ＰＥＧ鎖の長さを調節することにより、生理系におけるプローブの循環時間に影響を及ぼすことができる。これは、（一次ターゲティング部分を一次標的に結び付ける最初のターゲティングステップが、相対的に遅いプロセスを含んでおり、相対的に長い循環時間を必要とするので、）プレターゲティングプローブにとって特に適切である。リンカー部分は、オプションで、オリゴ若しくはポリペプチド又はポリラクチドのような生体高分子断片を含んでいる。

本発明は、ジエン及びジエノフィルがプレターゲティングプローブ又はエフェクタプローブのいずれか一方に付着する考えられるいかなるやり方をも含んでいることが理解されるであろう。例えば、リジン又はシステインのような反応性アミノ酸を介するこれらのプローブへの結合に影響を及ぼす方法は、当業者には既知である。

エフェクタプローブ
エフェクタプローブは、所望の診断、イメージング及び／又は治療効果を与えることができるエフェクタ部分を有している。エフェクタプローブは、更に、二次ターゲティング部分を有している。

上記二次ターゲティング部分は、利用可能な二次標的、すなわち、プレターゲティングプローブに含まれる（単数又は複数の）生体直交型の反応基に対する反応相手を形成するエフェクタプローブの部分に関連している。二次標的が上記に定義された式（１）の平らなＴＣＯである範囲内で、二次ターゲティング部分はテトラジンのようなジエンであり、逆の場合も同様であることが理解されるであろう。

エフェクタ部分は、例えば、検出可能な標識である。ここで用いられる「検出可能な標識」は、例えば、細胞、組織又は有機体に存在する場合にプローブの検出を可能にするエフェクタプローブの部分に関連している。本発明の関連の中で想定される検出可能な標識の１つのタイプは、コントラスト提供剤（contrast providing agent）である。種々のタイプの検出可能な標識が本発明の関連の中で想定され、本明細書において以下に説明される。

従って、本発明の特定の実施形態によれば、本発明のプレターゲティングキット及び方法は、イメージング、特に、医療用イメージングに用いられる。一次標的を識別するために、エフェクタプローブとして、１つ以上の検出可能な標識を有するイメージングプローブが使用される。イメージングプローブの検出可能な標識の詳細な例は、ＭＲＩにより画像形成可能な構造体のような従来のイメージングシステムに用いられるコントラスト提供部分、スピン標識、光ラベル、超音波に反応する構造体、Ｘ線に反応する部分、放射性核種、（生物）発光及びＦＲＥＴタイプの色素である。本発明の関連の中で想定される例示的な検出可能な標識は、蛍光分子、例えば、自己蛍光分子、試薬等と接すると蛍光を発する分子、放射性標識、例えば、アビジンによってビオチンの結合を通して検出されるビオチン、蛍光タグ、常磁性金属を有するＭＲＩ用のイメージング構造体、例えば、米国特許第４，７４１，９００号及び第５，３２６，８５６号公報に記載されているイメージング試薬等を含んでいるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。イメージングに用いられる放射性核種は、例えば、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２Ｍｎ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｚｎ、^６２Ｃｕ、^６３Ｚｎ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７０Ａｓ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７４Ａｓ、^７５Ｓｅ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１４Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１２０Ｉ、^１２２Ｘｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１９３Ｐｔ、^１９５Ｐｔ、^２０１Ｔｌ及び^２０３Ｐｂよりなる群から選択される同位体である。

治療に用いられるような他の元素及び同位体は、或るアプリケーションにおけるイメージングにも適用され得る。

ＭＲＩにより画像形成可能な部分は、例えば、常磁性イオン又は超常磁性粒子である。常磁性イオンは、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｔｌよりなる群から選択された元素であり得る。超音波に反応する部分は、微小気泡を有しており、その殻は、リン脂質、（生分解性）ポリマ及び／又はヒト血清アルブミンよりなっている。微小気泡は、フッ素化ガス又は液体で満たされ得る。

Ｘ線に反応する部分は、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィンを含んでいるが、これに限定されることはないか、又は、小胞、リポソーム又はヨウ素化合物で満たされたポリマカプセル及び／又は硫酸バリウムを有している。

更に、本発明の関連の中で想定される検出可能な標識は、抗体の結合によって、例えば、検出可能な標識抗体の結合又はサンドイッチ型のアッセイによる結合された抗体の検出によって検出され得るペプチド又はポリペプチドも含んでいる。一実施形態では、検出可能な標識は、^１８Ｆ、^１１Ｃ又は^１２３Ｉのような小さいサイズの有機ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ標識である。それらの小さいサイズのために、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ標識は、一般にターゲティング手段（device）の性能及び特にその膜輸送に影響を大きく及ぼさないので、理想的には、細胞内の事象を監視するのに適している。ＰＥＴ標識及び二次ターゲティング部分としての逆ディールス・アルダー活性部分のいずれか一方を有するイメージングプローブは、親油性であり、結合相手を見付けるまで細胞内及び細胞外に受動的に拡散することが可能である。また、両化合物は、血液脳関門の通過を妨げず、従って、脳の領域のイメージングを可能にする。

エフェクタプローブは、ＭＲＩのコントラストを増強するためのランタニド（例えば、Ｇｄ）のような金属に基づく検出可能な標識を有するように意図されている場合、好ましくは、キレートの形態で与えられる。そのようなケースでは、エフェクタプローブは、好ましくは、そのような金属と配位錯体を形成することができる構造部分を有している。これについての良い例は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（Ｈ_４ｄｏｔａ）及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−α，α′，α″，α″′−テトラメチル−１，４，７，１０−四酢酸（Ｈ_４ｄｏｔｍａ）から生じる大環状ランタニド（ＩＩＩ）キレートである。

上記エフェクタ部分は、薬学的活性化合物のような治療部分でもあり得る。薬学的活性化合物の例は、本明細書に与えられている。治療プローブは、オプションで、検出可能な標識も有している。

従って、他の実施形態によれば、本発明のプレターゲティングキット及び方法は、標的療法に用いられる。これは、二次ターゲティング部分及び１つ以上の薬学的活性薬剤（すなわち、薬物、毒素又は放射線治療のための放射性同位体）を有するエフェクタプローブを使用することにより達成される。標的薬物送達システムとの関連で用いられる好適な薬物は、当業者には既知である。オプションで、治療プローブは、また、１つ以上のイメージング剤のような検出可能な標識を有している。治療に用いられる放射性核種は、例えば、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ及び^２２５Ａｃよりなる群から選択された同位体である。

代替として、治療プローブ中の薬剤は、光線力学療法のための増感剤から選択される。

代替として、治療プローブは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞又はタンパク質のような他の内因性構造体のような生体内の治療実体に結合する認識部分を有する。

上記エフェクタプローブにおいて、二次ターゲティング部分、すなわち、第２の生体直交型の反応基とエフェクタ部分とは、互いに直接的に結合される。それらは、また、リンカーを介しても結合され、更に、それらは両方ともに二次ターゲティングの骨格に結合され得る。上記リンカーは、独立して、上述した部分と同じ部分、例えば、ポリエチレングリコールから選択される。上記二次ターゲティングの骨格は、例えば、ポリペプチドのような生体高分子である。

本発明は、また、逆ディールス・アルダー反応を用いるプレターゲティング法にも関連している。ここでは、好適なジエン、好ましくは、上述した式（２）ないし（５）のいずれか１つに従う化合物で又は上記式（１）に従うシクロオクテンでそれぞれ官能基化される一次ターゲティング部分（例えば、抗体及び抗体断片又は受容体結合ペプチド）を有するプレターゲティングプローブが、被験体に注入される。標的（例えば、初期の又は転移性の腫瘍病変、動脈硬化プラーク、梗塞を起こした（infracted）領域、炎症又は感染部位等）への結合並びに循環から及び非標的組織（例えば、血液、肝臓、脾臓、腎臓等）からの排除の後、例えば、Ｅ−シクロオクテン又はテトラジン誘導体（すなわち、プレターゲティングプローブに存在する生体直交型の反応基の反応性対応物）をそれぞれ運ぶ二次ターゲティング部分を有するエフェクタプローブ及び薬剤又は画像形成可能な標識が注入される。エフェクタプローブは、一次ターゲティング部分に結合し、高いコントラストを与えるか、又は疾患の部位を選択的に処理する。

本発明は、また、ＤＮＡ、タンパク質及び膜合成並びに炭化水素の取り込みのような（感染症又はがん等の）病気の間に上方制御される一般的な代謝経路のターゲティングにも関連している。好適なプローブは、当該技術分野において現在用いられている代謝トレーサ、［^１１Ｃ］−メチオニン、［^１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、デオキシ−［^１８Ｆ］−フルオロチミジン（ＦＬＴ）及び［^１１Ｃ］−コリンと似ているジエン又はジエノフィルで標識されたアミノ酸、糖、核酸及びコリンを有している。高代謝又は高増殖の細胞は、これらの構成要素（building block）のより高い取り込みを有する。この方法では、例えば、テトラジン−又はＥ−シクロオクテン誘導体が、これらの又は他の経路に入り、細胞内及び／又は細胞表面に蓄積する。遊離プローブの十分な蓄積及び排除の後、蓄積されたＥ−シクロオクテンをそれぞれテトラジン代謝物に結合させるために、検出可能に標識された又は薬剤を運ぶ（細胞透過性の）テトラジンプローブ又はＥ−シクロオクテンプローブ（又は本発明に係る他のジエン／ジエノフィルを運ぶプローブ）が送り込まれる。通常のＦＤＧ（フッ素１８）フルオロデオキシグルコース型のイメージングよりも有利な点として、放射能が送り込まれる前にターゲティング部分の高い蓄積を可能にするように十分な時間が利用可能であり、従って、標的と非標的との比を高める。代替として、疾病に対して特異的な代謝経路及び／又は代謝物が標的にされ得る。

本発明は、細胞内標的のプレターゲティングにも関連している。それらの小さいサイズのために、有機ＰＥＴ標識（^１８Ｆ、^１１Ｃ）は、（大きく、極性のある放射性金属−キレート構造体の結合と比較して）一般にターゲティング手段の性能及び特にその膜輸送に影響を大きく及ぼさないので、理想的には、細胞内の事象を監視するのに適している。本発明に用いられる置換テトラジン部分及びＥ−シクロオクテンは、必ずしも小さいわけではないが、無極性であり、タンパク質、ｍＲＮＡ、シグナル伝達経路等の細胞内イメージングに用いられ得る。二次（例えば、ＰＥＴ標識された）置換テトラジン部分又はＥ−シクロオクテンプローブ（すなわち、エフェクタプローブ）は、結合相手を見付けるまで又は能動的な取り込みメカニズムの支配を受けるまで細胞内及び細胞外に受動的に拡散することが可能である。両化合物は血液脳関門の通過を妨げないので、これらの特性は、脳のプレターゲティングの場合の逆ディールス・アルダー反応の使用も可能にする。

本発明は、また、プレターゲティングされる信号増幅及び／又は多価性の導入にも関連している。少なくとも１つの一次ターゲティング手段が、複数のテトラジン部分を含むデンドリマ、ポリマ、リポソーム又はナノ粒子に結合する。受容体の結合後、核イメージング（例えば、放射性金属キレート、放射性ハロゲン等）又はＭＲＩ（例えば、Ｇｄキレート）のための１つ以上のコントラスト部分に結合される（１つ以上の）シクロオクテンが注入される。その後の逆ディールス・アルダー反応は、標的組織における高濃度のＭＲＩ造影剤をもたらす。更に、標的部位における多価性は、平らなＴＣＯエフェクタの結合による反応速度を増加させ、例えば、ＭＲＩ造影剤の効率的な標的蓄積を与える。勿論、平らなＴＣＯは、ターゲティング手段の結合及びエフェクタに結合するテトラジン（又は本発明の他のジエン）にも用いられ得る。

結合ルート及びキット
本発明は、更に、イメージング剤及びペプチドのようなターゲティング構造体に対する薬剤の結合に関する逆ディールス・アルダー反応の使用に関連している。エフェクタは、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ核種で標識された補欠分子族、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＭＲＩのための金属錯体及び超音波イメージングのための微小気泡、光学イメージングのためのフルオロフォアであり得るが、放射線治療のためのα及びβ⁻エミッタ及び一般に細胞傷害性抗がん剤でもあり得る。イメージング剤／治療剤は、ペンダントテトラジン又は他の好適なジエン部分及び平らなＴＣＯ誘導体を有するターゲティング基により官能基化され、逆の場合も同様である。

このルートは、核イメージング及び放射線治療の薬品に関して特に有利であり、放射性核種の崩壊の点から、プレターゲティングステップのような最も時間を要するステップ（被験体の体内での実際のターゲティング）を行うのに有益である。本発明によれば、二次ターゲティングについての上述した非常に迅速な逆ディールス・アルダー化学現象を得るための平らなＴＣＯの選択は、既存の方法の場合よりも寿命の短い放射性核種を含む広範囲の放射性核種の使用を可能にする。平らなＴＣＯにより官能基化されたエフェクタプローブ及び好適なジエン、例えば、プレターゲティングプローブを運ぶテトラジンは、（放射性核種のような）エフェクタ部分の持続的な血液循環を必要とせずに生体内で極めて低い濃度で結合され得る。これは、ジエン、特に、テトラジンと組み合わせられてプレターゲティングプローブを運ぶ平らなＴＣＯにより官能基化されるエフェクタプローブに等しく適用できる。また反応基は、有利なことに安定であり、従って、あまりにも簡単に副反応を起こす傾向を伴うことなく、より長い寿命の反応性を与える。

上述したことは、患者への放射線量を最小限にするような利点を与えることが理解されるであろう。また、上述したことは、ＳＰＥＣＴ剤、すなわち、単一光子放射形コンピュータ断層撮影剤の代わりにＰＥＴ剤、すなわち、陽電子放射形断層撮影剤の利用を可能にすることをもたらす。更に、増大した反応性は、生体内におけるより低い濃度での適用を可能にする。

本発明は、オプションで同じ標的を視覚化するために種々のイメージング剤を用いるマルチモーダルイメージングに特に適している。代替として、イメージングプローブは、マルチモーダルイメージングを可能にする少なくとも２つの異なる標識を有している。

分子イメージングにおける本発明の改善された［４＋２］逆ディールス・アルダー化学現象の適用は、同じタイプ及びサイズのターゲティング構造体にプレターゲティングを広げる。これは、細胞内及び代謝イメージングがプレターゲティングの強化を通して達成可能な高い標的蓄積及び低いバックグラウンドの恩恵を受けることを可能にする。同様に、プレターゲティングされる信号増幅体系、例えば、ポリテトラジン及び／又はポリアルケンデンドリマ又はリポソームが、より小さく、より多様なターゲティング手段に適用可能になる。

反応相手は非生物的な生体直交型であるので、上述したようにジエノフィルとして平らなＴＣＯを用いる［４＋２］逆ディールス・アルダー反応を用いたプレターゲティングは、内因性の競合作用及び代謝／分解によって妨げられず、安定な共有結合を与える。正常細胞と比較して例えば腫瘍細胞内の高い流量によって標的代謝経路及び対応するテトラジン代謝物誘導体を選択することは、細胞内又は標的細胞の表面における人工テトラジン受容体又は他の化学的処理の高い密度の導入を与え、低いレベルのこともある内因性の細胞表面の受容体の使用を回避する。

本発明の更に詳細な実施形態は、代謝前駆体と、従来のイメージングシステムにおいて用いられている造影剤であるイメージングプローブ、より詳細には、検出可能な標識を有するイメージングプローブとを有するキットに関連している。そのような検出可能な標識は、ＭＲＩにより画像形成可能な構造体、スピン標識、光ラベル、超音波に反応する薬剤、Ｘ線に反応する薬剤、放射性核種及びＦＲＥＴタイプの色素よりなる群から選択される標識であるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、レポータープローブが使用される。そのようなレポータープローブは、酵素、より詳細には、細胞に対して内因性ではないが、遺伝子治療又は異質薬剤の感染により細胞に取り込まれた酵素の基質であり得る。ここでの細胞又は組織内の遺伝子に関する非内因性は、遺伝子が当該細胞又は組織内に自然に存在しない及び／又は発現されないことを示すために用いられる。代替として、そのようなレポータープローブは、内因性であるか、又は遺伝子治療若しくは異質薬剤の感染により細胞に取り込まれ得る受容体又はポンプにより細胞内に取り込まれる分子である。代替として、レポータープローブは、細胞又は組織環境内の或る（変化する）状況に反応する分子である。

本発明は、また、上述したキットに用いる薬剤を含んでいる。１つのそのような薬剤は、一次ターゲティング部分及び生体直交型の反応基を有するプレターゲティング剤であり、生体直交型の反応基は、［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手である。特定の反応相手は、上記に説明されている。すなわち、一般的には、電子欠乏テトラジン若しくは上記に論じられたような他の好適なジエンのいずれか一方又は本発明に係る平らなシクロオクテンである。本発明は、また、標的医療イメージング又は標的治療におけるこれらの薬剤の使用及びそのような方法に用いる上記薬剤にも関連している。特に、本発明は、プレターゲティング法におけるこれらの薬剤及びそのような方法に用いるこれらの薬剤に関連している。他のそのような薬剤は、検出可能な標識及び生体直交型の反応基を有するイメージングプローブであり、生体直交型の反応基は、［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手である。

本発明は、また、検出可能な標識及び生体直交型の反応基を有するイメージングプローブにも関連しており、生体直交型の反応基は、［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手である。本発明は、更に、薬学的活性化合物及び生体直交型の反応基を有する治療プローブに関連しており、生体直交型の反応基は、［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手である。

本発明の一部は、被験体に上述したようなプレターゲティング剤を投与することと、上記薬剤が一次標的への一次ターゲティング部分の結合を達成するために効果的な或る期間被験体の系を循環することを可能にすることとを含み、後に、オプションで洗浄剤を用いて体から結合されていない薬剤を除去するプレターゲティング法でもある。これについての典型的な期間は、１２ないし９６時間であり、特に、約４８時間である。

更に、本発明は、上述したようなプレターゲティング法を行うことを有し、その後、同様に本発明に係るイメージングプローブを投与するイメージング法を与え、プレターゲティング剤及びイメージングプローブ中の生体直交型の反応基は、ともに［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手を形成する。同様に、本発明は、上記のプレターゲティング方法を実行することと、その後に本発明に従って治療プローブを投与することとを含む標的治療を与え、プレターゲティング剤及びイメージングプローブ中の生体直交型の反応基は、ともに［４＋２］逆ディールス・アルダー反応の反応相手を形成する。

本発明は、また、上述したようなイメージング又は治療方法に用いる上記プレターゲティング剤にも関連している。

要は、逆ディールス・アルダー化学現象に基づいて、生体直交型のプレターゲティングされる分子イメージング及び治療が、患者に大きな利点をもたらすのに役立つ。一方では、これは、がん及び心血管病変のような標的組織の優れた画像の取得を与えるのに役立つ。他方では、放射性化合物の投与に由来する内因性の副作用及び概して潜在的に毒性の薬物は大きく減少するが、病変組織に達する効果的な放射線量を増やす。更に、これは、疾病の根底にある追跡可能な分子事象の収集を大きく拡大する。特に、この技術は、血管から遠い標的組織にアクセス可能にし、情報が豊富な細胞内環境のイメージングを容易にする。

以下の非限定的な実施例及び添付の非限定的な図面を参照して本発明が説明される。

実施例
材料：全ての試薬及び溶剤は、商業的供給源（試薬に関しては、シグマアルドリッチ社、アクロス社、バイオソルブ社、ＡＢＣＲ社、インビトロゲン社及びメルク社、標準溶剤及び重水素化溶剤に関しては、バイオソルブ社、メルク社及びケンブリッジアイソトープラボラトリーズ社）から得られ、特に明記しない限り、更なる精製を行うことなく用いられた。［^１７７Ｌｕ］塩化ルテチウム溶液は、パーキンエルマー社から購入された。水は、ミリＱ水濾過システム（ミリポア社）により蒸留され、脱イオン化された（１８ＭΩｃｍ）。標識緩衝剤は、一晩、キレックス−１００樹脂（バイオラッド社）で処理され、その後、０．２２μｍを通して濾過され、４℃で保管された。ジェルコードブルータンパク質染色溶液（Gelcode blue protein staining solution）は、Pierce Protein Research（サーモフィッシャーサイエンティフィック）社から購入された。アミコンウルトラ（Amicon Ultra）−４遠心式フィルタユニット（５０ｋＤａの分子質量の分画）は、ミリポア社から購入された。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を調製するタブレットは、Calbiochem（メルク）社から得た。

方法：ＮＭＲスペクトルは、ブルカー社製ＤＰＸ３００分光計を用いてＣＤＣｌ_３に記録された。^１３ＣＮＭＲの多重線（ｑ＝４重線、ｔ＝３重線、ｓ＝２重線及びｐ＝１重線）は、ＤＥＰＴパルスシーケンスを用いて識別された。^１Ｈの化学シフトは、２Ｄ−ＣＨ相関スペクトルを用いて決定された。

分取カラムクロマトグラフィは、SiliCycle社のシリカカラムを用いるCombiflash Companion装置（テレダインイスコ（Teledyne Isco）社）で行われた。分取ＨＰＬＣは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有のアセトニトリル及び水の勾配を適用するZorbax C18カラム（２１．２×１５０ｍｍ、５μｍ粒子）を備えたアジレント（Agilent）１２００装置を用いて行われた。Ｇａｂｉ放射能検出器（レイテスト（Raytest）社）を備えたアジレント１１００システムで分析ラジオＨＰＬＣが行われた。試料はZorbax Eclipse XDB-C18カラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ粒子）上にロードされ、０．１％ＴＦＡ含有水中の直線的な勾配のアセトニトリル（ＭｅＣＮ）（１０％ＭｅＣＮで２分、その後、４５％ＭｅＣＮに高めて１１分）を用いて１ｍＬ／分で溶出された。ＵＶ波長は２５４ｎｍでプリセットされた。Ｇａｂｉ放射能検出器を備えたアジレント１２００システムでサイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣが行われた。試料は、Superdex-200 10/300 GLカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）上にロードされ、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸塩緩衝液を用いて０．５ｍＬ／分で溶出された。ＵＶ波長は、２６０及び２８０ｎｍでプリセットされた。

ＤＯＴＡ−テトラジン８（図５）の合成及び放射性標識は、Rossin et al., Angew Chem Int Ed 2010, 49, 3375-8に説明されている通りに行われた。^１７７Ｌｕ標識化の収率は、０．９％ＮａＣｌ溶液中の２００ｍＭＥＤＴＡで溶出され、ホスフォイメージャ（phosphor imager）（ＦＬＡ−７０００、富士フィルム社）に映し出されるＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（バリアン（Varian）社）を用いて、ラジオＴＬＣにより決定された。これらの条件では、遊離した^１７７ＬｕがＲ_ｆ＝０．９で移動し、^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンは元のままである。

７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ホモジニアスゲル（homogeneous gel）（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）を用いてファストゲルシステム（phastgel system）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われた。ゲルの放射線写真は、ＡＩＤＡ（Advanced Image Data Analyzer）ソフトウェアを用いて解析されるホスフォイメージャに映される。タンパク質分子量標準溶液（プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード）はバイオラッド社から購入された。電気泳動の際、ゲルはジェルコードブルーを用いて２時間染色され、水中で一晩脱染され、その後、通常のフラットベッドスキャナでデジタル化された。

ＣＣ４９溶液の濃度は、３２２ｎｍ及び２８０ｎｍそれぞれの吸光度からナノドロップ１０００分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて決定された。

実施例１
（Ｅ−ｅｎｄｏ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（６）及び（Ｅ−ｅｘｏ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（７）

化合物１は、Dommerholt et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9422-9425に従って合成された。

（Ｚ）−エチルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（１）：
１，５−シクロオクタジエン（１８．５ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）及び酢酸ロジウム（ＩＩ）二量体（陽イオン量）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）溶液に、１５％ジアゾ酢酸エチル（２．０ｍＬ、１８．８ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）溶液が３．５時間にわたって氷浴中で冷却しながらゆっくり加えられた。加えた後、反応混合物が室温（ＲＴ）まで温められた。１．５時間後、ＮＭＲ解析によると反応は完了しており、混合物はシリカゲルプラグで濾過され、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄された。濾液は、全てのＣＨ_２Ｃｌ_２が除去されるまで集められ、その後、ヘプタンで希釈された。この溶液は、ヘプタン（５００ｍＬ）及びＭＴＢＥ（４００ｍＬ）を用いてシリカゲルのフィルタを通って溶出された。ＭＴＢＥ部分は生成物を含んでおり、これは、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、０％ないし４％のヘプタン／ＥｔＯＡｃ勾配）により更に精製された。ｅｎｄｏ／ｅｘｏ異性体の混合物として無色油状体の化合物１が得られた（２．５０ｇ、１２．９ｍｍｏｌ、収率６８％）。

（Ｅ−ｅｎｄｏ）−エチルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（２）：
ヘプタン／Ｅｔ_２Ｏ混合物（１：１、約６５０ｍＬ）で満たされた反応器に、上記化合物１（２．５０ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）及び安息香酸メチル（１．６ｍＬ、１２．７ｍｍｏｌ）のヘプタン／Ｅｔ_２Ｏ溶液が加えられた。反応混合物は、タングステンランプで照射され、同時に、１０％ｗ／ｗＡｇＮＯ_３含浸シリカゲル（２２ｇ）を含有するカラムを通ってポンプでくみ上げられた。照射の１６時間後、ほぼ完全な転化が得られ、カラムはＭＴＢＥ（５００ｍＬ）で洗浄された。カラムが、１０％ＭｅＯＨ／ＭＴＢＥ混合物で洗浄され、これが濃縮され、アンモニアで処理され、ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いて抽出されて、或る量のＥ異性体（６５１ｍｇ）を供給した。カラムの材料は、更に、アンモニアで処理され、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出され、より多くのＥ異性体（４９８ｍｇ）を与えた。

Ｅ異性体の組み合わされた混合物は、カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ３％）により精製され、無色油状体として化合物２（３１９ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、収率１３％）及びその異性体３を供給した。

（Ｅ−ｅｘｏ）−エチルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（３）：
この化合物は、前の実験におけるクロマトグラフ分離後、無色油状体として２３％収率で得られた（５６８ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）。

（Ｅ−ｅｎｄｏ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボン酸（４）：
上記化合物２（３１９ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（３．０ｍＬ）に、水酸化リチウム一水和物（２７５ｍｇ、６．６ｍｍｏｌ）の水溶液（１．５ｍＬ）が加えられた。この混合物が、４５℃で２時間加熱され、３０℃で一晩攪拌された。反応物は、ＴＬＣ解析により完全な転化が得られるまで４５℃で６時間更に加熱された。混合物は、濃縮され、水及びＭＴＢＥで希釈され、クエン酸水溶液で中和された。ＭＴＢＥ（３ｘ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、白色固体として化合物４が得られた（２６９ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、収率９９％）。

（Ｅ−ｅｘｏ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボン酸（５）：
上記化合物３（５６８ｍＬ、２．９２ｍｍｏｌ）のメタノール（６．０ｍＬ）溶液に、水酸化リチウム一水和物（４８７ｍｇ、１１．６１ｍｍｏｌ）の水（２．０ｍＬ）溶液が加えられた。この混合物が、４５℃で２時間加熱され、ＴＬＣ解析により完全な変換が得られるまで３０℃で１６時間攪拌された。混合物は、濃縮され、水及びＭＴＢＥで希釈され、クエン酸水溶液で中和された。ＭＴＢＥ（３ｘ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４を用いて乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、帯黄色の結晶性固体として化合物５が得られた（４４０ｍＬ、２．６５ｍｍｏｌ、収率９１％）。

（Ｅ−ｅｎｄｏ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（６）：
上記化合物４（２６９ｍＬ、１．６２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２２４ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液が氷浴中で冷却され、ＤＣＣ（３３５ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液が加えられた。氷浴が取り除かれ、混合物は室温で１６時間攪拌された。白色の懸濁液がＭＴＢＥで希釈され、ガラスフィルタを通して濾過され、ＭＴＢＥで洗浄された。濾液は減圧下で濃縮された。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、１０％ないし４０％のヘプタン／ＥｔＯＡｃ勾配）による精製が白色の結晶性固体として化学物６を与えた（２９０ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌ、収率６８％）。この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ= 5.77 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 2.82 (s, 4H), 2.41 (m, 1H), 2,34 (m, 1H), 2.11 (m, 1H) , 2.09 (t, 1H, J=8.4Hz), 2.04 (m, 1H) , 1.98 (m, 1H), 1.95 (m, 1H) , 1.6-1.2 (m, 4H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ=169.6 (q), 166.9 (q), 137.5 (t), 132.5 (t), 33.2 (s), 32.9 (s), 25.6 (t), 26.7 (s), 26.8 (s), 25.8 (t), 25.7 (s), 18.0 (t)である。

（Ｅ−ｅｘｏ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（７）：
上記化合物５（４４０ｍＬ、２．６５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３６６ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１７ｍＬ）溶液が氷浴中で冷却され、ＤＣＣ（５４６ｍｇ、２．６５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液が加えられた。氷浴が取り除かれ、混合物は室温で１６時間攪拌された。白色の懸濁液がＭＴＢＥで希釈され、ガラスフィルタを通して濾過され、ＭＴＢＥで洗浄された。濾液は減圧下で濃縮された。カラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ_２、１０％ないし６０％のヘプタン／ＥｔＯＡｃ勾配）による精製が白色の結晶性固体として化学物７を与えた（５５３ｍＬ、２．１０ｍｍｏｌ、収率７９％）。この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ= 5.88 (m, 1H), 5.20 (m, 1H), 2.82 (s, 4H), 2.5-2.3 (m, 4H) , 2.00 (m, 2H) , 1.49 (m, 1H) , 1.40 (m, 1H), 1.23 (t, 1H, J=5.7Hz), 0.92 (m, 1H) , 0.70 (m, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ=169.8 (q), 169.4 (q), 137.9 (t), 132.0 (t), 38.0 (s), 33.1 (s), 31.9 (s), 29.2 (t), 28.2 (t), 26.9 (s), 25.5 (s), 23.9 (t) である。

実施例２
ｅｎｄｏ−及びｅｘｏ−Ｅ−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（６及び７）を用いた抗体の修飾

５００μＬの全ＰＢＳ量で、ＣＣ４９（５ｍｇ／ｍＬ、２５０μＬ）のＰＢＳ溶液が、１又は１０モル当量のＴＣＯ−ＮＨＳ（６又は７、１０ｍｇ／ｍＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液）で修飾された。１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨが９に調節された。この反応は、暗い場所において攪拌の下で室温で３０分間行われた。続いて、ＴＣＯで修飾されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、アミコンウルトラ−１５遠心式デバイスを用いてＰＢＳで十分に洗浄された。結合手順の最後に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によりＣＣ４９−ＴＣＯ結合体の純度及び完全性が評価された（図６及び７）。結合の収率は、テトラジンの滴定により決定された。ＴＣＯで修飾されたｍＡｂ（２５μＬ）が、ＰＢＳ（５０μＬ）中の既知の過剰の担体が加えられた^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンと反応した。３７℃における１０分の培養の後、反応混合物は、非還元性試料緩衝液を加えられ、１０分間煮沸され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。ゲル電気泳動の後、ホスフォイメージャを用いて各レーンの放射能分布が評価された。^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン及びＣＣ４９−ＴＣＯ構造体の反応の収率は、当該レーンの全放射能に対する放射性ｍＡｂのバンドの強度から推定された（図８）。１当量のＴＣＯ−ＮＨＳ６及び７が用いられると、結合手順は、ｍＡｂ分子当たり０．４及び０．７ＴＣＯをそれぞれ与えた。１０当量のＴＣＯ−ＮＨＳ６及び７が用いられると、結合手順は、ｍＡｂ分子当たり５．２及び８．４ＴＣＯをそれぞれ与えた。

実施例３
テトラジンとｍＡｂ結合ｅｎｄｏ−及びｅｘｏ−Ｅ−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（６及び７）との反応速度の測定

テトラジン−ＤＯＴＡ８（図５）が、８ＭＢｑ／μｇの比放射能において担体転化^１７７Ｌｕで放射性標識された。^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン（０．６７ｎＭ）が、３７℃においてｐＨ７．４１ｍＬＰＢＳ中０．４又は０．７当量のｅｎｄｏ及びｅｘｏＴＣＯ（６及び７）で修飾された濃度が上昇したＣＣ４９と反応した。選択された時間（１５、３０、４５、６０、９０及び１２０秒）に、２０μＬの試料が採取され、テトラジン誘導体９（３μＬ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１ｍｇ／ｍＬ）を用いてクエンチされた。その後、試料は、非還元性試料緩衝液を加えられ、１０分間煮沸され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。ゲル電気泳動の後、ホスフォイメージャを用いて各レーンの放射能分布が評価された。^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジンとＣＣ４９−ＴＣＯ構造体との反応の収率は、当該レーンの全放射能に対する放射性ｍＡｂのバンドの強度から推定された。時間依存性の反応の収率は、疑似一次関連曲線に一致し、適合値（fit）から速度定数（Ｋ_ｏｂｓ）が決定された（図９Ａ及びＣ）。その後、Ｋ_ｏｂｓ値がＴＣＯのモル濃度に対してプロットされ、直線回帰を使用して適合された（図９Ｂ及びＤ）。Ｋ_ｏｂｓ＝［ＣＣ４９−ＴＣＯ］（ｋ_２）に基づいて、二次速度定数は直線の傾きであり、ｅｎｄｏ及びｅｘｏＴＣＯ異性体に関して、それぞれ、３．７２±０．０１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１及び２．８０±０．０８×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１であることが分かった。

全ての計算は、グラフパッドプリズム・バージョン５．０１を用いて行われた。

実施例４
ｅｎｄｏ−及びｅｘｏ−Ｅ−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（６及び７）と結合するｍＡｂの生体内安定性

５．２及び８．４モル等量の上記６及び７でそれぞれ官能基化されたｍＡｂＣＣ４９が、製造業者の使用説明書に従ってボルトン・ハンター手順により^１２５Ｉで放射性標識された。すなわち、約５ＭＢｑの［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウムが、５０μＬＰＢＳで希釈され、１μＬボルトン・ハンター試薬（ＳＨＰＰ、Pierce社）ＤＭＳＯ（０．１μｇ／μＬ）溶液が２５μＬクロラミンＴ（シグマアルドリッチ社）ＰＢＳ（４ｍｇ／ｍＬ）溶液を加えられた。この溶液が、１０ないし２０秒間混合され、その後、５μＬのＤＭＦ及び１００μＬのトルエンが加えられた。ボルテックス後、^１２５Ｉ−ＳＨＰＰを含有する有機層がガラスバイアルに移され、それを緩やかな流れのＮ_２の下で室温で乾燥させた。その後、ＰＢＳ中の３００μｇのＣＣ４９−ＴＣＯが^１２５Ｉ−ＳＨＰＰでコートされたガラスバイアルに加えられ、ｐＨ９．６の１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨが９に調節された。このバイアルは、緩やかな攪拌の下で約６０分間室温で培養され、その後、ラジオＩＴＬＣにより^１２５Ｉ−ｍＡｂ標識化の収率が求められた（７８ないし８５％）。粗^１２５Ｉ−ｍＡｂは、生理食塩溶液により予め平衡にされたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａの分子質量の分画、Pierce社）を通して精製された。ラジオＩＴＬＣ、ラジオＨＰＬＣ及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析により決定された^１２５Ｉ標識ＣＣ４９−ＴＣＯの放射化学的純度は、９８％よりも大きかった。ｍＡｂの比放射能は、非標識ＣＣ４９−ＴＣＯを加えることにより８ないし９ｋＢｑ／μｇに調節された。

ヌード雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０ないし２５ｇ、チャールズリバーラボラトリ社、ｎ＝３）が、３００μｇの^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ構造体を注入された。選択された時点（注入後１、６、２４及び４８時間）に、血液試料が伏在静脈から採取され、ヘパリンを含有するバイアル瓶に回収された。実験の最後に、マウスは、麻酔をかけられ、頸椎脱臼により犠牲になった。胃及び甲状腺が除去され、ブロットドライされ、器官当たりの現在の注入量（％ＩＤ）を決定するために、基準物質とともにガンマカウンタ（Wizard 3、パーキンエルマー社）で数えられた。これらの器官における低い^１２５Ｉの取り込み（表参照）は、放射性標識ｍＡｂが生体内で標識を保持することを裏付けた。

回収の直後に、血液試料は、正確に０．１ＭＢｑ／μｇの比放射能で放射性標識された過剰の担体添加（carrier-added）^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８を加えられた。混合物は、３７℃で１０分間培養され、その後、血液細胞を分離するために４００×ｇで５分間遠心分離された。この手順が２回繰り返され、その後、２０μＬの上澄みが回収され、３０μＬのＰＢＳで希釈された。Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａの分子質量の分画、３０μＬの試料の投入）により、逆ディールス・アルダー反応生成物が未反応^１７７Ｌｕ−テトラジンから分離された。溶離液に含まれる放射能が、二核種プロトコルを用いるガンマカウンタ（^１２５Ｉに関して１０ないし８０ｋｅＶのウィンドウ、^１７７Ｌｕに関して１５５ないし３８０ｋｅＶのウィンドウ）で測定された。Ｚｅｂａカラムからの^１７７Ｌｕの「漏れ」を補正するために、^１７７Ｌｕ−テトラジンのみを含む血清試料が用いられた。^１２５Ｉのカウントが放射性崩壊に対して補正され、その後、^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比が計算された。生体外の^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比の減少が、生体内のＴＣＯ基の不活性化により引き起こされた。図１０は、時間に伴う^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比の変化を（ｔ＝０において１００％に正規化された）無傷ＴＣＯ６及び７の％として示している。両方のＴＣＯが、依然として、注入６時間後に約７５ないし８０％無傷であり、注入２４時間後に１７ないし２５％無傷であった。注入２日後に、ＴＣＯ６及び７の非活性化が完了した。

ＴＣＯ６及び７で官能基化された放射性標識ＣＣ４９を注入されたマウスの胃及び甲状腺における^１２５Ｉの取り込み；データは、％ＩＤ±ＳＤとして与えられている。

実施例５
（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）の合成

（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）の合成は、図１１に示されている。文献（M. Royzen, G. P. A. Yap, J. M. Fox, J Am Chem Soc 2008, 130, 3760）の手順に従って、（Ｅ）−シクロオクト−４−エノール（１０、約１３％のＺ異性体を含むメジャー異性体）が合成された。６０％水素化ナトリウム分散体（１．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）が、氷浴で冷却された上記化合物１０の６０ｍＬＤＭＦ（７０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）溶液に加えられた。室温で４時間攪拌した後、４−ブロモメチル安息香酸（３．８５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）が一部に加えられ、懸濁液がシオンで一晩攪拌された。この混合物は、水（１００ｍＬ）中に流し込まれ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１００ｍＬ）が加えられた後、３７％塩酸（５ｍＬ）が加えられた。分離後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２×１００ｍＬ）を用いて水層が抽出された。混合性の有機層は、水（２５ｍＬ）で洗浄され、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて脱水された。残渣は、４：１ヘキサン／酢酸エチルを有する薄いシリカ層を通過した。脱水後に得られた残渣は、７０℃でヘプタン（５０ｍＬ）に溶解された後、冷却され、化合物１１を与えた。生成物はジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５７ｇ、４．９ｍｍｏｌ）が加えられ、この混合物は氷浴で冷却され、その後、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０３ｇ、４．９９ｍｍｏｌ）が加えられた。３０分後、氷浴が取り除かれ、反応混合物は室温で１８時間攪拌された。濾過及び脱水した後、残渣がヘプタン中の酢酸エチルの勾配（０ないし１５％）を使用してシリカに基づくカラムクロマトグラフィにより精製された。次に、残渣がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２０ｍＬ）溶解され、ヘプタン（５０ｍＬ）中に流し込まれ、白色固体として化合物１２（１．４２ｇ、２９％）を与えた。この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ=8.10 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.45 (d, J=8.5 Hz, 2H), 5.60 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 4.54 (d, J=13.4 Hz, 1H), 4.47 (d, J=13.4 Hz, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.91 (s, 4H), 2.43-1.40 (m, 10H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ=169.0 (q), 161.5 (q), 146.7 (q), 135.1 (t), 132.1 (t), 130.4 (t), 127.0 (t), 123.7 (q), 85.3 (t), 68.0 (s), 40.5 (s), 37.7 (s), 34.2 (s), 32.7 (s), 31.4 (s), 25.4 (s); HRMS (ESI, m/z): Calculated for C₂₀H₂₃NO₅Na⁺([M-Na]⁺): 380.1474, Found: 380.1472である。

実施例６
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４１，４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−オアート（１６）の合成

Rossin等のAngewandte Chemie International Edition 2010, 49(19), 3375-8に従って製造される５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタノイック酸（９）から始まる化合物１６の合成は、図１２に概説されている。

Ｔｅｒｔ−ブチル４１，４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）アミノ）−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−オアート（１４）：
ｔｅｒｔ−ブチル１−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６−ドデカオキサノナトリアコンタン−３９−オアート１３（１２３ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ；IRIS Biotech社）が、乾燥した反応バイアル瓶に加えられ、トルエンを用いて２度共沸された（co-evaporate）。このバイアル瓶は、その後、窒化下に置かれ、過剰のドライＤＭＦ（２ｍｌ）が加えられ、無色の溶液９（１００ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）を与え、過剰のドライＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解された（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＢＯＤ；２６７ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）が、窒素雰囲気下で反応混合物に連続的に加えられ、赤色の懸濁物を与えた。最後に、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）が反応混合物に液滴状に加えられ、結果として得られた溶液は、一晩攪拌された。この反応混合物は、乾燥状態まで脱水されて、ＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解され、ＤＣＭの１ないし１０％ＭｅＯＨの勾配を使用してシリカに基づくフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製された。関連部分が組み合わされ、減圧下で脱水され、暗いピンク色の固体として化合物１４（１６７ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ）を与えた。

この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ=10.58 (s, 1H), 9.05 (d, J=2.4 Hz, 1H), 8.93 (ddd, J₁=0.9 Hz, J₂=1.7 Hz, J₃=4.7 Hz, 1H), 8.62 (d, J=8.8 Hz, 1H), 8.59 (d, J=8.6 Hz, 1H), 8.43 (dd, J₁=2.4 Hz, J₂=8.8 Hz, 1H), 8.15 (td, J₁=1.8 Hz, J₂=7.8 Hz, 1H), 7.93 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.73 (ddd, J₁=1.1 Hz, J₂=4.7 Hz, J₃=7.8 Hz, 1H), 3.57 (t, J=6.2 Hz, 2H), 3.53-3.47 (broad s, 46H), 3.25-3.16 (m, 2H), 3.41 (t, J=6.2 Hz, 2H), 2.44 (t, J=7.3 Hz, 2H), 2.17 (t, J=7.3 Hz, 2H), 1.85 (q, J=7.3 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ=172.1 (q), 171.7 (q), 170.4 (q), 163.0 (q), 162.8 (q), 150.6 (t), 150.2 (q), 143.8 (q), 141.3 (t), 138.5 (q), 137.8 (t), 126.5 (t), 126.1 (t), 124.8 (t), 124.2 (t), 79.7 (q), 69.8 (s), 69.7 (s), 69.6 (s), 69.5 (s), 69.1 (s), 66.2 (s), 38.5 (s), 35.8 (s), 35.7 (s), 34.4 (s) 27.7 (p), 20.9 (s)である。

４１，４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−オイック酸（１５）：
攪拌された化合物１４（１６０ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下でＴＦＡ（２ｍＬ）が加えられた。この反応混合物は、室温で２時間攪拌され、乾燥状態まで脱水された。残渣が、ドライＤＣＭ（２ｍＬ）中で再溶解され、同様にＴＦＡ（２ｍＬ）で２時間処理された。このプロセスがもう一度繰り返された。最後に、反応混合物が乾燥状態まで脱水され、ＤＣＭを用いて２度共沸され、定量的な収率で脱保護生成物１５を与えた。

この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ=10.57 (s, 1H), 9.05 (broad s, 1H), 8.94 (broad s, 1H), 8.63 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.60 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.43 (dd, J₁=2.4 Hz, J₂=8.8 Hz, 1H), 8.16 (td, J₁=1.7 Hz, J₂=7.8 Hz, 1H), 7.93 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.74 (dd, J₁=4.7 Hz, J₃=6.8 Hz, 1H), 3.58 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.53-3.46 (broad s, 46H), 3.41 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.25-3.17 (m, 2H), 2.44 (t, J=7.3 Hz, 2H), 2.17 (t, J=7.3 Hz, 2H), 1.85 (q, J=7.3 Hz, 2H)である。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４１，４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−オアート（１６）：
攪拌された化合物１５（１５０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、Ｎ_２雰囲気下、０℃でジ−（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（４７．８ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌｓ）、ピリジン（１５μＬ）及びトリエチルアミン（０．２５ｍＬ）が加えられた。この混合物は、室温まで温められながら２時間攪拌され、その後、乾燥状態まで脱水され、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で再溶解されて、Ｈ_２Ｏ（３×１０ｍＬ）で洗浄された。有機層は、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて濾過され、減圧下で脱水され、暗いピンク色の固体として化合物１６（９４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、５７％）を与えた。

この化合物のスペクトルデータは、¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ=9.67 (s, 1H), 9.01-8.97 (m, 2H), 8.77-8.71 (m, 2H), 8.64 (dd, J₁=2.4 Hz, J₂=8.8 Hz, 1H), 8.02 (td, J₁=1.7 Hz, J₂=7.7 Hz, 1H), 7.58 (ddd, J₁=1.1 Hz, J₂=4.7 Hz, J₃=7.5 Hz, 1H), 6.60 (t, J=5.4 Hz, 1H), 3.84 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.70-3.55 (broad s, 46H), 3.52-3.43 (m, 2H), 2.90 (t, J=6.5 Hz, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.58 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.37 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.09 (q, J=6.8 Hz, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ=172.9 (q), 172.5 (q), 168.9 (q), 166.7 (q), 163.6 (q), 163.4 (q), 151.0 (t), 150.3 (q), 144.0 (q), 142.0 (t), 138.6 (q), 137.4 (t), 126.5 (t), 126.4 (t), 125.1 (t), 124.3 (t),70.7 (s), 70.5 (s), 70.2 (s), 69.6 (s), 65.7 (s) 39.3 (s), 35.9 (s), 35.0 (s), 32.1 (s) 25.6 (s), 21.3 (s)である。

実施例７
ＴＣＯで官能基化されたｍＡｂ用の除去剤（ガラクトース−アルブミン−テトラジン）の合成

ガラクトース及びテトラジン部分により官能基化されたタンパク質の骨格（マウス血清アルブミン、ＭＳＡ）を有する除去剤が、図１３に概説されているように合成された。静脈内注射の後、除去剤のテトラジン基は、逆ディールス・アルダー反応を介して循環ｍＡｂ−ＴＣＯと反応し、ガラクトース部分は肝細胞のアシュウェル（Ashwell）受容体と相互作用して（L.J. Theodore、D.B. Axworthy及びJ.M. Renoの米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１２９１９１号公報参照）、ｍＡｂ−除去剤構造体を肝臓に運んだ。

上記除去剤は、ＭＳＡの最初にガラクトースと、続いてテトラジンとの２つのステップの連続する共有結合修飾によって調製された。ガラクトース修飾は、アルブミン上でリジンと結合するアミン反応性２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２０）を用いて達成された。

ガラクトース−アルブミン（２１）の合成：
図１３に示されているように、ガラクトースカップリング剤の２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２０）が、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（１７）から始まって、中間体２−Ｓ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムブロミド（１８）及びシアノメチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル―１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１９）を介して３ステップで調製された。

２−Ｓ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムブロミド（１８）：
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（１７、１５．００ｇ、３６．４８ｍｍｏｌ）及びチオ尿素（３．０５ｇ、４０．０７ｍｍｏｌ）がアセトン（７５ｍＬ）に溶解された。この溶液は、２時間還流させるために加熱され、続いて、濾過され、２０℃に冷却された。ペンタン（７５ｍＬ）を加ええることにより、白色の結晶性固体として化合物（１６．１１ｇ、９１％）の沈殿がもたらされた。この化合物のスペクトルデータは、¹H-NMR (400MHz, [D₆]DMSO,): δ = 1.95 (s, 3H, CH₃), 2.01 (s, 3H,CH₃), 2.08 (s, 3H, CH₃), 2.14 (s, 3H, CH₃), 4.09 (m, 2H, H₆, H_6’), 4.45 (t, J=6.4 Hz, 1H, H₅), 5.11 (t, J_2,3=10 Hz, 1H, H₂), 5.22 (dd, J_2,3=9.9 Hz, J_3,4=3.2 Hz, 1H, H₃), 5.39 (d, J 3.2 Hz, 1H, H₄), 5.71 (d, J_1,2=10 Hz, 1H, H₁), 9.11 (br, 2H, NH₂), 9.35 (br, 2H, NH₂)である。

シアノメチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル―１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１９）：
２−Ｓ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムブロミド（１８；１６．１１ｇ、３１．０７ｍｍｏｌ）、ピロ亜硫酸ナトリウム（１１．８１ｇ、６２．１４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４．７２ｇ、３４．１８ｍｍｏｌ）及びクロロアセトニトリル（８．２１ｇ、１０８．７ｍｍｏｌ）がアセトン／水（５０：５０ｖ／ｖ、２００ｍＬ）に溶解され、室温で１時間攪拌された。この反応混合物は、氷水（３００ｍＬ）中に流し込まれ、更に２時間攪拌された。濾過により白色の沈殿物が回収され、高温メタノール（３０ｍＬ）から再結晶化された。この生成物は、濾過され、白色の結晶性固体（９．６１ｇ、７７％）とされた。融点は９７℃であった（文献：９５ないし９７℃）。これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 2.00 (s, 3H, CH₃), 2.07 (s, 3H, CH₃), 2.09 (s, 3H, CH₃), 2.17 (s, 3H, CH₃), 3.35 (d, J=17 Hz, 1H, S-CH), 3.64 (d, J=17 Hz, 1H, S-CH’), 4.01 (t, J 6.9 Hz, 1H, H₅), 4.16 (m, 2H, H₆, H_6’), 4.7 (d, J_1,2=10 Hz, 1H, H₁), 5.11 (dd, J_3,4=3.2 Hz, J_2,3=10 Hz, 1H, H₃), 5.24 (t, J=10 Hz, 1H, H₂), 5.47 (d, J=2.4 Hz, 1H, H₄). FT-IR (ATR): ν = 2249 (CN, w), 1739 (C=O, s)である。

２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２０）：
シアノメチル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル―１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１９；２．０２ｇ、５．００ｍｍｏｌ）が無水ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解され、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２５ｗｔ％、１１５μＬ、０．５０ｍｍｏｌ）が加えられた。反応混合物は、２４時間室温で攪拌され、続いて、１５ｍＬの体積まで濃縮された。生成物は、室温で結晶化させることが可能であり、その後、−１８℃にされた。濾過及び乾燥により、白色の結晶（１．１１ｇ；８３％）が与えられた。融点は１２９℃であった。これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD): δ = 3.44 (dd, J_2,3=10 Hz, J_3,4=4.2 Hz, 1H, H₃), 3.52 (dd, J_2,3=10 Hz, J_1,2=9.0 Hz, 1H, H₂), 3.54 (m, 1H, H₅), 3.73 (-OCH₃), 3.78 (m, 2H, H₆, H_6’), 3.87 (dd, J_3,4=4.0 Hz, J_4,5=1.5 Hz, 1H, H₄), 4.27 (d, J_1,2=9.6 Hz, 1H, H₁). FT-IR (ATR): ν = 3287 (N-H, s), 1650 (C=NH, s)である。

アルブミン−カップリング：
ＰＨ７．４のＰＢＳ／ｐＨ８．５の０．５Ｍホウ酸塩緩衝液（９００μＬ）の１０：１混合物に溶解しているＭＳＡ（２０ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）の溶液に、同じ緩衝液（２００μＬ）中の２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２０）の新たに調製された１８．２ｍｇ／ｍｌの保存溶液が加えられ、ＭＳＡに対して４５倍モル過剰のガラクトースカップリング剤（２０）をもたらした。この反応混合物は、室温で２時間振動（１０００ｒｐｍ）を与えられ、その後、予め水と平衡にされたＺｅｂａ脱塩スピンカートリッジ（７ｋＤａの分子質量の分画、Pierce社）を用いて脱塩された。凍結乾燥後、ガラクトース−アルブミン（化合物２１）が白色のふわふわした（fluffy）固体（１５．３ｍｇ、７２％）として得られた。続いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によりガラクトース修飾のグレードが決定された。ＭＳＡ：ＮＨ^＋＝６５９４１であった。ガラクトース−ＭＳＡ：ＮＨ^＋＝６９８２３であり、これは、ガラクトース／ＭＳＡの１６．４の平均に対応している（加えられたガラクトース断片の質量は２３６Ｄａである。）。種々のバッチ（batch）間のばらつきは、約１６ないし１８（ガラクトース／ＭＳＡ）である。４℃における水中のガラクトース−アルブミンの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の安定性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析を２週間毎に５か月間繰り返すことにより評価された。結合は、安定であることが分かった。

ガラクトース−アルブミン−テトラジン（２２）の合成：
ＰＢＳ中のガラクトースにより官能基化されたマウス血清アルブミン（２１、１ｍｇ）が、ＤＭＳ（３０μＬ、ガラクトース−アルブミンに対して２０当量）中でテトラジン−ＮＨＳ（１６）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液と混合され、ｐＨ９．６の１Ｍ炭酸塩緩衝剤（７．５μＬ）が加えられた。この溶液（全体で２５０μＬ）が、３７℃で３０分間培養され、その後、ウルトラ−１５遠心式フィルタユニット（３０ｋＤａの分子質量の分画）に移された。生成物２２は、水で十分に洗浄され、その後、一晩凍結乾燥され、ピンク色のふわふわした粉末を与えた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析によりテトラジン修飾のグレードが決定された。ガラクトース−アルブミン−テトラジン：ＮＨ^＋＝７９０１０であり、これは、テトラジン／ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡの９．７の平均に対応している（加えられたテトラジン断片の質量は９４８Ｄａであり、ＮＨ^＋（ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡ）＝６９８２３である。）。ナノドロップ（nanodrop）での紫外線−可視光線の測定により、分子当たり９ないし１０のテトラジンの存在が確認された（測定値：８．９テトラジン／ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡ）。

実施例８
（Ｅ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］）デカ−４−エン−９−イル）アセテート（２６）の合成

上記２６の合成は、図１４に概説されている。

（Ｚ）−９−アザビシクロ［６．２．０］デカ−４−エン−１０−オン（２３）
この化合物は、文献（Tanaka, M.; Oba, M.; Ichiki, T.; Suemune, H. Chem. Pharm. Bull. 2001, 49, 1178-1181）の方法によって調製された。シクロオクタジエン（１０８ｍＬ、８７９ｎｍｏｌ）のトルエン（２００ｍＬ）溶液に、クロロスルホニルイソシアネート（１８ｇ、１２７ｍｍｏｌ、１４％）が加えられた。この溶液が室温で一晩攪拌された。ＮＭＲによる解析は転化を示さなかった。この反応が、３０℃で一晩及び６０℃で一晩続けられた。混合物は、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）で希釈された。硫酸ナトリウム（５０ｇ）の水（３００ｍＬ）溶液が、激しい攪拌の下でゆっくりと加えられた。混合物は、５％含水ＫＯＨによりｐＨ８にされ、一晩攪拌された。層が分離され、ＴＢＭＥ（２×１５０ｍＬ）及びジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）を用いて水溶性の層が抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、７．７９ｇの黄色の油状体を与えた。粗生成物は、カラムクロマトグラフィ（シリカ、メタノール５％に対してジクロロメタン／酢酸エチル５０％）により精製され、白色固体としてラクタム２３（２．６８ｇ、１７．７ｍｍｏｌ、２％）を与えた。

（Ｅ）−９−アザビシクロ［６．２．０］デカ−４−エン−１０−オン（２４）
上記ラクタム２３（２．６８ｇ、１７．７ｍｍｏｌ）及び安息香酸メチル（２．４１ｇ、１７．７ｍｍｏｌ、１．０当量）のジエチルエーテル（２００ｍＬ）溶液が、反応容器内で６日間照射され、同時に、この混合物を硝酸銀／シリカカラム（３０．０ｇ、０．５９ｍｍｏｌ／ｇ）を通して流した。カラムは、ＴＢＭＥ（４００ｍＬ）及び９／１のＴＢＭＥ／メタノール（５００ｍＬ）で洗浄された。カラムはアンモニアで処理され、ジクロロメタン（３×１５０ｍＬ）を用いて抽出された。結合ジクロロメタン層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、４５℃において減圧下で脱水されて、灰色の固体としてトランス−シクロオクテン２４（２つの異性体、１．７２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ、６４．３％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.4 - 2.4 (m, 8H), 3.0 - 3.1 (m) and 3.1 - 3.2 (m) (1H), 3.55 - 3.6 (m) and 3.75 - 3.8 (m) (1H), 5.4 - 5.7 (m, 2H), 6.1 - 6.4 (bd, 1H). ¹³C-NMR: δ 27.2, 27.3, 28.5, 31.3, 32.9, 33.2, 34.9, 40.4, 54.1, 54.5, 56.2, 57.0, 134.2, 134.4, 134.8, 135.1, 171.1, 171.2である。

（Ｅ）−２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］デカ−４−エン−９−イル）酢酸（２５）
水素化ナトリウム（油分中６０％の分散度、３３０ｍｇ、８．２７ｍｍｏｌ、２．５当量）の１７ｍＬドライＴＨＦ懸濁液が氷で冷却された。ラクタム２４（５００ｍｇ、３・３１ｍｍｏｌ、１．０当量）及びブロモ酢酸（５５１ｍｇ、３・９７ｍｍｏｌ、１．２当量）のドライＴＨＦ（１１ｍＬ）溶液が上記懸濁液に加えられた。反応混合物が、２０分間攪拌された。ＤＭＦ（１．２ｍＬ、ドライ）が液滴状に加えられた。この混合物は、室温で週末にかけて撹拌された。この混合物は、４０℃において減圧下で濃縮された。ＴＢＭＥ（２５ｍＬ）、氷及び氷水（約２５ｍＬ）が加えられた。層が分離され、水溶性の層がＴＢＭＥ（１５ｍＬ）で洗浄された。混合性のＴＢＭＥ層が水（１５ｍＬ）で抽出された。混合性の水溶性層は氷の中で冷却され、クエン酸（１．４１ｇ）でｐＨ１ないし２まで酸性にされ、ＴＢＭＥ（３×２５ｍＬ）で抽出された。混合性の有機層が硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、４０℃において減圧下で脱水されて、白色固体として酸２５（２つの異性体、３６０ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、５２．０％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.25 - 1.7 (m, 2H), 1.8 - 2.3 (m, 4H), 2.3 - 2.5 (m, 2H), 3.15 - 3.25 (m) and 3.25 -3.35 (m) (1H), 3.65 - 3.95 (t + m, 2H), 4.1 (t, 1H), 5.6 (m, 3H). ¹³C-NMR: δ 27.0, 27.6, 28.5, 31.0, 31.5, 33.0, 33.2, 36.9, 41.4, 41.6 (all CH₂ signals), 54.4, 56.8, 58.4, 60.5 (all CH signals), 134.0, 134.5, 135.0, 135.2 (all CH signals), 171.4, 171.6, 171.7 (all C=O signals)である。

（Ｅ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］）デカ−４−エン−９−イル）アセテート（２６）
上記酸２５（２１５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１４ｇ、１．２ｍｍｏｌ、２．２５当量）及びＥＤＣＩ（２１５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液が、アルミニウム箔で覆われたフラスコ内において室温で一晩攪拌された。この溶液は、別の容器に移され（decant）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈された。溶液は、水（２×５ｍＬ）及び塩水（２×５ｍＬ）で洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、脱水されて、褐色の油状体（０．２４ｇ）を与えた。油状体は、ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解され、ペンタン（２０ｍＬ）中に沈殿した。残渣がペンタンで洗浄され、減圧下で乾燥され、オフホワイトの固体として上記２６（２つの異性体、０．１６ｇ、０．５２ｍｍｏｌ、５２％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.25 - 1.7 (m, 2H), 1.8 - 2.3 (m, 4H), 2.35 -2.5 (m, 2H), 2.85 (m, 4H), 3.15 - 3.25 (m) and 3.25 - 3.35 (m) (1H), 3.75 - 3.85 (m) and 3.85 - 3.95 (m) (1H), 4.0 - 4.1 (dd, 1H), 4.4 - 4.6 (dd, 1H), 5.45 - 5.65 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 26.0, 27.0, 27.5, 28.5, 31.0, 31.5, 33.0, 33.5, 37.0, 39.5, 39.5, 55.0, 57.5, 58.5, 60.5, 134.0, 134.5, 135.0, 135.5, 164, 169.5, 170, 170.5である。

実施例９
（Ｅ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１−オール（３２）の合成

上記３２の合成は、図１５に概説されている。

（４ａ，１０ａ，Ｚ）−１，２，３，４−テトラクロロ−１１，１１−ジメトキシ−１，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン（２８）
（Tetrahedron 1981, 37, 4479-4494を参照されたい。）５，５−ジメトキシ−１，２，３，４−テトラクロロシクロペンタジエン２７（６．７ｍＬ、１０ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）及び１，５シクロオクタジエン（３７．３ｍＬ、３２．８ｇ、３０３ｍｍｏｌ、８．０当量）の混合物が、１０時間還流温度に加熱された。５０℃に冷却した後、白色の沈殿物が形成された。混合物は、減圧下で濃縮された。固体は、濾過されて離れ、ペンタンで洗浄された。混合性の濾液は、減圧下で濃縮され、トルエンを用いて（２回）相互に蒸留され（codistill）、黄色の粘性油状体として付加物２８（１１．４ｇ、３０．６ｍｍｏｌ、８０．７％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.35 - 1.5 (m, 2H), 1.95 -2.1 (m, 4H), 2.3- 2.45 (m, 2H), 2.65 - 2.75 (m, 2H), 3.55(s, 3H), 3.6 (s, 3H), 5.7 - 5.8 (m, 2H) である。

（４ａ，１０ａ，Ｚ）−１１，１１−ジメトキシ−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン（２９）
ドライテトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）中のリチウム（４．１６ｇ、０．６０ｍｍｏｌ、２８．７当量）の混合物が、窒素雰囲気下において還流温度で攪拌された。上記付加物２８（７．７８ｇ、２０．９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びｔｅｒｔ−ブタノール（２２ｍＬ、１７ｇ、０．２３ｍｏｌ、１１当量）のテトラヒドロフラン（１３ｍＬ）溶液が液滴状に加えられた。加えられている間、気体が発生し、反応混合物は黒色に変化した。混合物は、週末にわたって還流温度で攪拌された。固体は、セライトで濾過されて離れ、テトラヒドロフランで洗浄された。混合性の濾液は、濃縮され、褐色の固体を与えた。この固体は、氷（２５ｍＬ）と混合され、ＴＢＭＥ（４×１００ｍＬ）で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、褐色の油状体として未精製物２９（４．２３ｇ）を与えた。ＩＳＣＯによる精製は、わずかに黄色がかった油状体として化合物２９（１．２１ｇ、５．１２ｍｍｏｌ、２４．５％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.5 (s) and 1.5 - 1.65 (m) (6H), 1.7 - 1.9 (m, 4H), 1.95 - 2.1 (m, 2H), 2.25 - 2.4 (m, 4H), 3.25 (s, 3H), 3.3 (s, 3H), 5.8 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 16 (CH₂), 25 (CH₂), 28 (CH₂), 37 (CH), 46 (CH), 130 (CH)である。

（４ａ，１０ａ，Ｚ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１−オン（３０）
上記化合物２９（１．２１ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（３ｍＬ）溶液が、含水硫酸（２Ｍ、１２ｍＬ）と混合された。混合物は、５日間激しく攪拌され、ジエチルエーテル（２×２０ｍＬ）で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、黄色がかった油状体としてケトン３０（７３１ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ、７５．０％）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.6 - 1.75 (m, 4H), 1.75 - 1.9 (m, 4H), 1.95 - 2.1 (m, 4H), 2.25 - 2.45 (m, 4H), 5.75 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 16 (CH₂), 25 (CH₂), 28 (CH₂), 37 (CH), 46 (CH), 130 (CH)である。

（４ａ，１０ａ，Ｚ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１−オール（３１）
上記ケトン３０（５９８ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）のドライジエチルエーテル（１８ｍＬ）溶液に、水素化アルミニウムリチウムが加えられた。混合物は、窒素雰囲気下で３日間攪拌され、続いて、水（５ｍＬ）を液滴状に加えることによりクエンチされた。層が分離され、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を用いて水溶性の層が抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、無色の油状体としてアルコール３１（４９９ｍｇ、２．５９ｍｍｏｌ、８２．６％、１２ないし８５の異性体の混合）を与えた。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.3 - 2.2 (m, 16H), 4.05 (bs, 1H), 5.75 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 20 (CH₂), 26 (CH₂), 28 (CH₂), 39 (CH), 48 (CH), 80 (CH), 132 (CH)である。

（４ａ，１０ａ，Ｅ）−１，２，３，４，４ａ，５，６，９，１０，１０ａ−デカヒドロ−１，４−メタノベンゾ［８］アヌレン−１１−オール（３２）
上記Ｚ−アルケン３１（５３０ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）及び安息香酸メチル（０．３４７ｍＬ、３７５ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ、１．０当量）のジエチルエーテル／ヘプタン（１／２、６００ｍＬ）溶液が、３６時間照射され、同時に、シリカ／硝酸銀／（９／１、５ｇ、約１当量）、シリカ（０．５ｃｍ）及び砂（０．５ｃｍ）で満たされたカラムを通して連続的に流された。カラムは、照射中、暗所に置かれた。シリカがジクロロメタン（４０ｍＬ）で洗浄され、粗生成物が、ジクロロメタン／水／２５％アンモニア水（２／１／１、３×４０ｍＬ）を用いてカラムから抽出された。混合性の水溶性層は、ジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、０．３２ｇの黄色の油状体を与えた。粗生成物は、カラムクロマトグラフィ（５０ｍＬシリカ、酢酸エチル／ヘプタンが１／９）により部分的に精製され、オフホワイトの固体として生成物及び脂肪族不純物の混合物（３８ｍｇ、最大０．１９８ｍｍｏｌ、７．２％）を与えた。この生成物は、場合によっては、２つのＥ−異性体の混合物である。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 0.8 - 2.4 (m, 16H), 4.0 - 4.15 (m, 2H), 5.4 - 5.85 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 20 - 60 (numerous CH and CH₂ signals), 80 (CH), 134 (CH)である。８０及び１３４のシグナルは、それぞれ、その隣りに小さいピーク（minor peak）を有しており、大きいピーク対小さいピークの比は約３／１である。

実施例１０
（Ｅ）−３，３ａ，４，５，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロオクタ［ｄ］イミダゾール−２（８Ｈ）−オン（４０）の合成

上記４０の合成は、図１６に概説されている。

トランス（Ｚ）−８−アジドシクロオクト−４−エノール（３３）
酢酸及びジクロロメタン中における１，５−シクロオクタジエンと過ホウ酸ナトリウムとの反応（Gunes, Y.; Senocak, E.; Tosun, C.; Taskesenligil, Y., Org. Commun. 2009, 2:3, 79-83参照）により、エポキシシクロオクテンが調製された。粗生成物は、そのようなものが用いられた。エポキシシクロオクテン（８０．０ｇ、０．６４５ｍｍｏｌ）の１４０ｍＬアセトン溶液が、４５分間にわたってアジ化ナトリウム（８０ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）の２００ｍＬ水溶液に加えられた。更に２０ｍＬのアセトンが漏斗を用いて流され、混合物が７６時間還流下で加熱された。アセトンのほとんどは回転蒸発により除去された。１００ｍＬの水が残渣に加えられ、混合物が３×２５０ｍＬのＴＢＭＥで抽出された。有機層は、１００ｍＬの水で洗浄され、その後、乾燥及び回転蒸発し、（エポキシドと混合された）未精製アジドアルコール３３を与え、これ自体は次のステップに用いられた。これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃, product signals): δ 1.6 - 2.6 (m, 8H), 3.65 - 3.8 (m, 2H), 5.5 - 5.65 (m, 2H)である。

シス（Ｚ）５，６−ジアジドシクロオクト−１−エン（３４）
上記残渣にトルエンが加えられ、約１５０ｍＬの溶媒が回転蒸発により除去された。３００ｍＬのトルエンが残留物（アジドアルコール３３と開始エポキシドとの約１／１の混合物）に加えられ、この溶液が氷中で冷却された。トリエチルアミン（８６．１ｇ、０．８５２ｍｍｏｌ）が加えられ、その後、１００ｍＬトルエン中のメタンスルホニルクロリド（９３．８ｇ、０．８１９ｍｍｏｌ）が、１時間にわたって機械的に攪拌されながら加えられた。懸濁液が２日間攪拌され、その後、２００ｍＬの水が加えられた。層が分離され、有機層は２×５０ｍＬの水で洗浄された。連続する水溶性層は、２５０ｍＬのトルエンで抽出された。乾燥及び回転蒸発が、メシル酸アジドと開始エポキシドとの混合物である残渣をもたらした。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃, product signals): δ 1.95 - 2.6 (m, 8H), 3.95 (dt, 1H), 4.8 (dt, 1H), 5.5 - 5.65 (m, 2H)である。

残渣の半分が、１００ｍＬＤＭＦ及びアジ化ナトリウム（２０ｇ、０．３０７ｍｍｏｌ）を用いて７５℃で４４時間温められ、その後、８５℃で３時間温められた。混合物は、２００ｍＬの水に流し込まれ、その後、３×２００ｍＬのＴＢＭＥで抽出された。有機層は、３×５０ｍＬの水で洗浄された後、乾燥及び回転蒸発し、ジアジド３４、エポキシクロロオクテン及び不純物の混合物である残渣をもたらした。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃, product signals): δ 1.8 (m, 2H), 1.95 -2.1 (m, 4H), 2.5 - 2.65 (m, 2H), 3.8 (dt, 2H), 5.6 - 5.7 (m, 2H)である。

シス（Ｚ）Ｎ，Ｎ′−（シクロオクト−５−エン−１，２−ジイル）ビス（２，２，２、−トリフルオロアセトアミド）（３６）
上記のように得られた未精製ジアジド３４が、１５０ｍＬのＴＨＦに溶解され、２００ｍＬＴＨＦ中の水素化アルミニウムリチウム（１２．０ｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）に９０分間にわたって加えられ、冷水で冷却が行われた。反応混合物は、還流下で８時間加熱された後、冷却され、６ｍＬの水及び１２ｍＬの３０％水酸化ナトリウム溶液でゆっくりとクエンチされた。濾過、ＴＨＦでの洗浄及び回転蒸発が、１５０ｍＬのジクロロメタンに溶解され、その後、氷中で冷却された残渣をもたらした。トリフルオロ酢酸無水物（６９．０ｇ、０．３２８ｍｏｌ）が３０分間にわたって加えられた。溶液は、４時間攪拌され、その後、回転蒸発した。残渣が２５０ｇシリカゲルカラムのクロマトグラフィにかけられ、増加した酢酸エチルを含むヘプタンを用いて溶出が行われた。第１の分画は、シクロオクト−２−エン−１−オールのトリフルオロ酢酸塩であった。所望の（Ｚ）Ｎ，Ｎ′−（シクロオクト−５−エン−１，２−ジイル）ビス（２，２，２、−トリフルオロアセトアミド）を有する分画が結合され、ＴＢＭＥ及びヘプタンの混合物から再結晶化されて、１８．８５ｇの生成物３６（５６．４７ｍｍｏｌｍ、エポキシシクロオクテンを基にして１８％）を与えた。

スペクトルデータは、¹H-NMR of diamine 35 (CDCl₃, product signals): δ 1.65 (m, 2H), 1.8 (m, 2H), 2.0 (m, 2H), 2.4 (m, 2H), 3.0 (dt, 2H), 5.6 (m, 2H)である。

スペクトルデータは、¹H-NMR of bisamide 36 (CDCl₃): δ 1.65 (m, 2H), 2.0 (m, 2H), 2.2 (m, 2H), 2.35 (m, 2H), 4.15 (dt, 2H), 5.9 (m, 2H), 7.5 (m, 2H). ¹³C-NMR: δ 23 (CH₂), 32 (CH₂), 54 (CH), 110 -122 (q, CF₃), 132 (CH), 157 - 159 (q, C=O). ¹⁹F-NMR: δ -76である。

シス（Ｅ）Ｎ，Ｎ′−（シクロオクト−５−エン−１，２−ジイル）ビス（２，２，２、−トリフルオロアセトアミド）（３７）
３．５０ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）（Ｚ）−シクロオクト−エン−１，２−ジアミンからの反応生成物の脱水後に、粗トリフルオロアセトアミド３６が得られ、４．０ｇの安息香酸メチルと混合され、及びトリフルオロ酢酸無水物（１２．３ｇ、５８．６ｍｍｏｌ）が、４．０ｇの安息香酸メチル及び約５００ｍＬのヘプタン−エーテル（約２／１）と混合された。混合物は４２時間照射され、同時に、溶液は、４１ｇ硝酸銀を含浸させた（約４．１ｇの硝酸銀を含む）シリカゲルカラムを通って連続的に流された。カラムは１５０ｍＬのＴＢＭＥで流され、その後、幾らかのメタノールを含む１５０ｍＬのＴＢＭＥで流された。各部分が、１００ｍＬの１５％アンモニアで洗浄され、乾燥及び回転蒸発した。第１の部分はＺアルケン及びＥアルケンの１／２の混合物をもたらし、第２の部分は少量のＥアルケンをもたらした。カラムは、ＴＢＭＥ及びアンモニアを用いて攪拌された後、濾過され、層が分離された。固体は、水溶性層及びＴＢＭＥでもう一度処理された後、濾過され、層が分離された。有機層は乾燥及び回転蒸発し、３．０７ｇのＥアルケン３７（９．２５ｍｍｏｌ、アミンを基にして３７％）をもたらした。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.6 - 1.9 (m, 4H), 2.1 - 2.5 (m, 4H), 3.8 (m, 1H), 4.1 (t, 1H), 5.4 - 5.55 (m, 1H), 5.65 - 5.8 (m, 1H), 6.4 (bs, 1H), 7.9 (bs, 1H)である。

シス（Ｅ）５−エン−１，２−ジアミン（３８）
上述のように得られたアミド３７が、４０ｍＬのメタノール、５．０ｇの水酸化ナトリウム及び１０ｍＬの水と混合された。混合物は、還流温度付近で９０分間温められ、回転蒸発し、残渣が３０ｍＬの水で希釈された。３×５０ｍＬのジクロロメタンによる抽出及び回転蒸発が、少量の溶媒を含む所望のジアミン３８（１．３８ｇ、約１００％）をもたらした。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.4 - 2.5 (m, 8H), 2.8 (bs, 1H), 2.9 (d, 1H), 5.4 - 5.6 (m, 2H)である。

シス（Ｅ）−フェニル（８−アミノシクロオクト−４−エン−１−イル）カルバメート（３９）
ジフェニルカーボネート（５００ｍｇ、２．３３ｍｍｏｌ）が、ジアミン３８（３００ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）の１０ｍＬジクロロメタン溶液に加えられ、この溶液が室温で４日間攪拌された。溶液は、２５ｇシリカのクロマトグラフィにかけられ、増加したメタノールを有するジクロロメタンを用いて溶出した。生成物の部分は、混合性であり、１５ｍＬのＴＢＭＥを用いて２時間攪拌された。１５ｍＬのヘプタンが加えられ、混合物が濾過された。固体は１５ｍＬのＴＢＭＥを用いて攪拌された後、濾過された。混合性の濾液は回転蒸発し、残渣はヘプタンを伴って一晩攪拌され、固体を与えた。濾過が所望の生成物３９をもたらした。

これについてのスペクトルデータは、¹H-NMR (CDCl₃): δ 1.5 (bs, 4H), 1.8 - 2.35 (m, 6H), 3.1 (bs, 1H), 3.6 (t, 1H), 5.5 (bd, 1H), 5.6 (m, 2H), 7.05 - 7.4 (m, 5H). ¹³C-NMR: δ 28.4 (CH₂), 33.0 (CH₂), 36.7 (CH₂), 40.7 (CH₂), 57.7 (CH), 58.4 (CH), 121.8 (CH), 125.4 (CH), 129.5 (CH), 133.2 (CH), 133.3 (CH), 151.3 (C), 154.0 (C)である。

シス（Ｅ）−３，３ａ，４，５，９，９ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロオクタ［ｄ］イミダゾール−２（８Ｈ）−オン（４０）
カルバメート３９が、ＤＭＳＯに溶解され、２４時間暗所において４０℃で攪拌され、その後、尿素４０への分子内環化が完了した。生成物は、そのようなものとして用いられた。これについてのスペクトルデータは、¹H NMR (DMSO-d6): δ 1.4 - 2.3 (m, 8H), 3.38 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 5.51 (m, 2H), 6.07 (s, 1H), 6.12 (s, 1H). LCMS: m/z = 167.1 (M+H⁺)である。

実施例１１
２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４７）及び２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（１１−オキソ−１１−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ウンデシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４８）の合成

上記４７及び４８の合成は、図１７に概説されている。

ｔｅｒｔ−ブチル６−（６−シアノピリジン−３−イルアミノ）−６−オキソヘキシルカルバメート（４３）
５−アミノ−２−シアノピリジン４１（１．０２ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ―６−アミノ−ヘキサン酸４２（０．９９ｇ；４．３０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１．７７ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．０５ｇ；８．６０ｍｍｏｌ）及びＰＰＴＳ（０．３７ｇ；１．４７ｍｍｏｌ）がクロロフォルム（１５ｍＬ）中に懸濁された。混合物は、室温で１８時間攪拌され、その後、乾燥するまで脱水され、アセトニトリル（２０ｍＬ）中で攪拌された。沈殿物が濾過により除去され、濾液は乾燥するまで脱水され、クロロフォルム（２０ｍＬ）中で溶解され、クエン酸水溶液（１５ｍＬ、０．５Ｍ）、炭酸水素カリウム水溶液（１５ｍＬ、１Ｍ）及び水（１５ｍＬ）でそれぞれ洗浄された。有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水された。粗生成物がカラムクロマトグラフィ（シリカ、ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）により精製され、白色固体として生成物４３（０．９５ｇ；６１％）を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C₁₇H₂₅N₄O₃ ⁺([M+H]⁺): 333.19, Found: 333.17である。

ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２−ジヒドロ−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカルバメート（４４）
ｔｅｒｔ−ブチル６−（６−シアノピリジン−３−イルアミノ）−６−オキソヘキシルカルバメート４３（０．７０ｇ；２．１ｍｍｏｌ）、２−シアノピリジン（０．８７ｇ；８．４ｍｍｏｌ）、ヒドラジン水和物（１．２５ｇ；２０ｍｍｏｌ）がエタノール（２ｍＬ）中で溶解され、硫黄（０．２２ｇ；７ｍｍｏｌ）が加えられた。混合物は、アルゴン不活性雰囲気下において７０℃で２時間攪拌され、その後、５０℃で１６時間攪拌された。オレンジ色の懸濁物がクロロフォルム（１０ｍＬ）で希釈され、得られた溶液は水（１５ｍＬで２回）で洗浄された。有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水された。粗生成物がカラムクロマトグラフィ（シリカ、クロロホルム／アセトン＝４：１）により精製され、オレンジ色の固体として生成物４４（０．６５ｇ；６６％）を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C₂₃H₃₁N₈O₃ ⁺([M+H]⁺): 467.25, Found: 467.33である。

ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカルバメート（４５）
ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２−ジヒドロ−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカルバメート４４（０．３０ｇ；０．６４ｍｍｏｌ）がＴＨＦ（１．５ｍＬ）中で溶解され、酢酸（２ｍＬ）が加えられた。亜硝酸ナトリウム（０．２５ｇ；３．６２ｍｍｏｌ）が水（１ｍＬ）中で溶解され、液滴状に加えられた。赤色の溶液が炭酸水素カリウム水溶液（５０ｍＬ；１Ｍ）中に流し込まれ、クロロフォルム（5０ｍＬ）で生成物が抽出された。有機層は、水（５０ｍＬ）で洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水され、紫色の固体として生成物４５（０．２５ｇ；８３％）を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C₂₃H₂₉N₈O₃ ⁺([M+H]⁺): 465.23, Found: 465.42である。

６−アミノ−Ｎ−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）ヘキサンアミド（４６）
ｔｅｒｔ−ブチル６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルカルバメート４５（６６ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）がクロロホルム（６ｍＬ）中で溶解され、ＴＦＡ（６ｍＬ）が加えられた。溶液は、室温で２時間攪拌され、続いて、乾燥するまで脱水され、ＴＦＡ塩として生成物４６（５２ｍｇ；１００％）を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C₁₈H₂₁N₈O⁺([M+H]⁺): 365.19, Found: 365.33である。

２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４７）
６−アミノ−Ｎ−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）ヘキサンアミド４６（５２ｍｇ；０．１４ｍｍｏｌ）がＴＨＦ（２．５ｍＬ）中で溶解され、ＤＩＰＥＡ（３２０ｍｇ；２．０ｍｍｏｌ）が加えられた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたＤＯＴＡ（１６１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）が加えられ、混合物は室温で５時間攪拌された。溶液は乾燥するまで脱水され、粗組成物がアセトニトリル及び水の混合物に溶解され、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製された。凍結乾燥後、ピンク色のふわふわした固体として純生成物４７（８０ｍｇ；収率７６％）が得られた。この化合物のスペクトルデータは、¹H-NMR (30% acetonitrile-d₃in D₂O): δ = 8.90 (m, 2H, ArH), 8.68 (d, 1H, ArH), 8.60 (dd, 1H, ArH), 8.31 (m, 1H, ArH), 8.24 (t, 1H, ArH), 7.82 (t, 1H, ArH), 3.80 (br s, 6H, NCH₂COOH), 3.72 (br s, 2H, NCH₂CONH), 3.34-3.23 (br m, 18H, NCH₂CH₂N, CH₂NHCO), 2.49 (t, 2H, NHCOCH₂), 1.70 (m, 2H, NHCOCH₂CH₂), 1.59 (m, 2H, CH₂CH₂NHCO), 1.41 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂NHCO) ppm. ¹³C-NMR (30% acetonitrile-d₃ in D₂O): δ = 175.5, 171.5 (br), 162.6, 162.5, 150.1, 148.1, 142.9, 141.6, 139.6, 138.4, 128.0, 127.9, 125.4, 124.8, 55.4, 54.3 (br), 49.4 (br), 39.4, 36.5, 28.2, 25.9, 24.6 ppm. ESI-MS: m/z for C₃₄H₄₇N₁₂O₈ ⁺([M+H]⁺): 751.37; Obs. [M+H]⁺ 751.58, [M+Na]⁺773.50, [M+2H]²⁺ 376.42, [M+3H]³⁺ 251.33. FT-IR (ATR): υ = 3263, 3094, 2941, 2862, 1667, 1637, 1582, 1540, 1460, 1431, 1395, 1324, 1296, 1272, 1251, 1226, 1198, 1128, 1087, 1060, 1020, 992, 977, 920, 860, 831, 798, 782, 742, 718, 679, 663 cm^-1である。

２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（１１−オキソ−１１−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ウンデシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸（４８）
２，２′，２″−（１０−（２−オキソ−２−（６−オキソ−６−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ヘキシルアミノ）エチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）トリ酢酸４７の合成に説明されている手順に匹敵する手順が用いられた。

凍結乾燥後、ピンク色のふわふわした固体として純生成物４８（９０ｍｇ；収率７８％）が得られた。この化合物のスペクトルデータは、¹H-NMR (DMSO-d₆): δ = 10.65 (s, 1H, NH), 9.06 (d, 1H, ArH), 8.93 (d, 1H, ArH), 8.61 (t, 2H, ArH), 8.44 (dd, 1H, ArH), 8.16 (t, 2H, ArH, NH), 7.73 (dd, 1H, ArH), 3.51 (br s, 6H, NCH₂COOH), 3.28 (br s, 2H, NCH₂CONH), 3.06 (q, 2H, CH₂NHCO), 3.34-3.23 (br m, 16H, NCH₂CH₂N), 2.43 (t, 2H, NHCOCH₂), 1.64 (m, 2H, NHCOCH₂CH₂), 1.42 (m, 2H, CH₂CH₂NHCO), 1.38-1.22 (m, 12H, CH₂) ppm. ¹³C-NMR (DMSO-d₆): δ = 173.0, 171.0 (br), 169.1 (br), 163.5, 163.2, 151.0, 150.6, 144.2, 141.7, 139.1, 138.2, 127.0, 126.5, 125.3, 124.6, 57.3 (br), 55.2 (br), 50.7, 39.0, 36.8, 29.5, 29.4, 29.3, 29.19, 29.17, 29.1, 26.9, 25.3 ppm. ESI-MS: m/z Calcd for C₃₉H₅₇N₁₂O₈ ⁺([M+H]⁺): 821.44; Obs. [M+Na]⁺ 843.58, [M+H]⁺821.58, [M+2H]²⁺ 411.42, [M+3H]³⁺ 274.67. FT-IR (ATR): υ = 3261, 3067, 2925, 2851, 1633, 1583, 1541, 1458, 1433, 1394, 1324, 1298, 1270, 1249, 1228, 1200, 1165, 1128, 1088, 1059, 1016, 991, 920, 885, 860, 832, 798, 782, 764, 742, 719, 687, 661 cm^-1である。

実施例１２
テトラジンモデル化合物の安定性及び反応性

テトラジンの加水分解安定性
特定のテトラジンのＤＭＳＯ（２５ｍＭ）溶液１０μＬがＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）（又は、水溶解度が非常に低い場合はＰＢＳ及びアセトニトリルの混合物）で希釈された。この溶液が濾過され、ＵＶ分光法を用いて、２２５ｎｍにおける吸収バンドの減少が観測された。このデータから、加水分解の速度及び半減期が決定された。

トランス−シクロオクト−４−エン−１−オール（マイナー異性体）に対するテトラジンの反応性
トランス−シクロオクト−４−エン−１−オール（マイナー異性体）との逆電子要請型ディールス・アルダー反応における特定のテトラジン及び（基準テトラジンとして選択された）３−（５−アセトアミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５、−テトラジンの反応性比を決定するために、競合実験が行われた。

特定のテトラジンのＤＭＳＯ（２５ｍＭ）溶液５μＬ及び基準テトラジンのＤＭＳＯ（２５ｍＭ）溶液５μＬが、アセトニトリル（０．１００ｍＬ）に加えられた。この混合液が、水（０．９ｍＬ）で希釈され、両テトラジンの絶対量が、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ解析により決定された。続いて、トランス−シクロオクト−４−エン−１−オール（マイナー異性体）のＤＭＳＯ（２５μＬ、２．５ｍＭ）溶液がゆっくり加えられ、混合物は５分間攪拌された。再度、両テトラジンの絶対量が、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ解析により決定され、両テトラジンの転化が求められた。これらの転化から、Ingold and Shaw (J. Chem. Soc., 1927, 2918-2926)からの数学的手法を用いて両テトラジンの反応性比（Ｒ＝ｋ_{２，ＴＣＯ}／ｋ_{２，Ｒｅｆ}）が計算された。以下の表は、テトラジンの反応性及び安定性のプロファイルが種々の置換基の使用によりどのようにして或る仕様に合わせられるかを示している。

この値は、ＰＢＳ及びアセトニトリルの５０／５０の混合物中で決定されたものである。

実施例１３
ＴＣＯモデル化合物の安定性及び反応性

トランス−シクロオクテン誘導体の安定性
特定のトランス−シクロオクテン誘導体の溶液１０μＬがＰＢＳ緩衝液（３ｍＬ）で希釈され、この溶液が暗所に２０℃で保管された。ＴＣＯ化合物のフェイス（faith）がＨＰＬＣ−ＭＳ解析により観測され、半減期の推定が行われた。

ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンに対するトランス−シクロオクテン誘導体の反応性
ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応における特定のトランス−シクロオクテン誘導体及び（基準トランス−シクロオクテンとして選択された）トランス−シクロオクト−４−エン−１−オール（マイナー異性体）の反応性比を決定するために、競合実験が行われた。

特定のトランス−シクロオクテン誘導体（５μＬ、２５ｍＭ、１．２５×１０^−７モル）のジオキンサン溶液及び基準トランス−シクロオクテン誘導体（５μＬ、２５ｍＭ、１．２５×１０^−７モル）のジオキンサン溶液が、アセトニトリル（０．０５ｍＬ）に加えられた。この混合液が、水（０．４５ｍＬ）で希釈された。続いて、激しく攪拌されながら、ビス（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）のアセトニトリル（０．０５ｍＬ）及び水（０．４５ｍＬ）混合溶液がゆっくり加えられた。両トランス−シクロオクテン誘導体の転化がＨＰＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡ解析により決定され、これらの転化から、Ingold and Shaw (J. Chem. Soc., 1927, 2918-2926)からの数学的手法を用いて両テトラジンの反応性比（Ｒ＝ｋ_{２，ＴＣＯ}／ｋ_{２，Ｒｅｆ}）が計算された。以下の表は、平らなＴＣＯ構造体４、５、２５及び４０が、高い反応性のマイナー異性体トランス−シクロオクト−４−エン−１−オールと比較してテトラジンに対する著しく増加した反応性を示したことを証明している。

種々の１，２，４，５−テトラジンを有するトランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体の反応性
上記技術の広い適用性を示すために、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５が種々の１，２，４，５−テトラジンと反応した。

３−（５−アセトアミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンとの反応：
３−（５−アセトアミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）が加えられた。（ピンク色から無色への）テトラジン溶液の直後の変色が、ＴＣＯとの定量的な反応を示した。これ（テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成）が、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析により確かめられた（ｍ／ｚ＝４７５．３３（Ｍ＋Ｈ^＋））。

３−（５−ブチルアミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンとの反応：
３−（５−ブチルアミド−２−ピリジル）−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）が加えられた。（ピンク色から無色への）テトラジン溶液の直後の変色が、ＴＣＯとの定量的な反応を示した。これ（テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成）が、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析により確かめられた（ｍ／ｚ＝５０４．４２（Ｍ＋Ｈ^＋））。

（４−（１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミンとの反応：
（４−（１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）が加えられた。（ピンク色から無色への）テトラジン溶液の直後の変色が、ＴＣＯとの定量的な反応を示した。これ（テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成）が、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析により確かめられた（ｍ／ｚ＝３６９．１７（Ｍ＋Ｈ^＋））。

３−メチル−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジンとの反応：
３−メチル−６−（２−ピリジル）−１，２，４，５−テトラジン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）が加えられた。（ピンク色から無色への）テトラジン溶液の直後の変色が、ＴＣＯとの定量的な反応を示した。これ（テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成）が、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析により確かめられた（ｍ／ｚ＝３５５．３３（Ｍ＋Ｈ^＋））。

３，６−ジフェニル−１，２，４，５−テトラジンとの反応：
３，６−ジフェニル−１，２，４，５−テトラジン（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）の水（１ｍＬ）溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体２５（６．２５×１０^−８ｍｏｌ）が加えられた。（ピンク色から無色への）テトラジン溶液の直後の変色が、ＴＣＯとの定量的な反応を示した。これ（テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成）が、ＨＰＬＣ−ＭＳ解析により確かめられた（ｍ／ｚ＝４１６．４２（Ｍ＋Ｈ^＋））。

実施例１４
（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）及び（Ｅ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］）デカ−４−エン−９−イル）アセテート（２６）による抗体修飾

実施例２において説明されたように、１当量のＴＣＯ−ＮＨＳ１２が用いられると、結合手順はｍＡｂ分子当たり６．６ＴＣＯを与えた。３又は２０モル当量の上記２６との結合は、ＣＣ４９分子当たり０．６及び３．５ＴＣＯを与えた。

実施例１５
テトラジンとｍＡｂ結合（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）及び（Ｅ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（１０−オキソ−９−アザビシクロ［６．２．０］）デカ−４−エン−９−イル）アセテート（２６）との反応速度の測定

実施例３において説明されたように、ＴＣＯ１２は、３２０００±２３００Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_２を有することが分かり（図１８）、ＴＣＯ２６は、３７４８００±３３７０Ｍ^−１ｓ^−１のｋ_２を有することが分かった（図１９）。

実施例１６
（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）と結合したｍＡｂの生体内安定性

６．６モル量の上記１２で官能基化されたｍＡｂＣＣ４９が、製造業者の使用説明書に従ってボルトン・ハンター手順により^１２５Ｉで放射性標識された。すなわち、約５ＭＢｑの［^１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウムが、５０μＬＰＢＳで希釈され、１μＬボルトン・ハンター試薬（ＳＨＰＰ、Pierce社）ＤＭＳＯ（０．１μｇ／μＬ）溶液が２５μＬクロラミンＴ（シグマアルドリッチ社）ＰＢＳ（４ｍｇ／ｍＬ）溶液を加えられた。この溶液が、１０ないし２０秒間混合され、その後、５μＬのＤＭＦ及び１００μＬのトルエンが加えられた。ボルテックス後、^１２５Ｉ−ＳＨＰＰを含有する有機層がガラスバイアルに移され、それを緩やかな流れのＮ_２の下で室温で乾燥させた。その後、ＰＢＳ中の２００μｇのＣＣ４９−ＴＣＯが^１２５Ｉ−ＳＨＰＰでコートされたガラスバイアルに加えられ、ｐＨ９．６の１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨが９に調節された。このバイアルは、緩やかな攪拌の下で約６０分間室温で培養され、その後、ラジオＩＴＬＣにより^１２５Ｉ−ｍＡｂ標識化の収率が求められた（７９％）。粗^１２５Ｉ−ｍＡｂは、生理食塩溶液により予め平衡にされたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａの分子質量の分画、Pierce社）を通して精製された。ラジオＩＴＬＣ、ラジオＨＰＬＣ及びＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析により決定された^１２５Ｉ標識ＣＣ４９−ＴＣＯの放射化学的純度は、９８％よりも大きかった。ｍＡｂの比放射能は、非標識ＣＣ４９−ＴＣＯを加えることにより１．４ｋＢｑ／μｇに調節された。

ヌード雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０ないし２５ｇ、チャールズリバーラボラトリ社、ｎ＝３）が、３００μｇの^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ構造体を注入された。注入後９６時間までの選択された時点に、血液試料が伏在静脈から採取され、ヘパリンを含有するバイアル瓶に回収された。実験の最後に、マウスは、麻酔をかけられ、頸椎脱臼により犠牲になった。胃及び甲状腺が除去され、ブロットドライされ、器官当たりの現在の注入量（％ＩＤ）を決定するために、基準物質とともにガンマカウンタ（Wizard 3、パーキンエルマー社）で数えられた。胃（０．１９±０．０４％ＩＤ）及び甲状腺（０．５７±０．１０％ＩＤ）における低い^１２５Ｉの取り込みが、放射性標識ｍＡｂが生体内で標識を保持することを裏付けた。

回収の直後に、血液試料は、正確に０．１ＭＢｑ／μｇの比放射能で放射性標識された過剰の担体添加^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８（図５）を加えられた。混合物は、３７℃で１０分間培養され、その後、血液細胞を分離するために４００×ｇで５分間遠心分離された。ディールス・アルダー反応生成物を未反応^１７７Ｌｕ−テトラジンから分離するために、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（４０ｋＤａの分子質量の分画）により３０μＬが精製された。溶離液に含まれる放射能が、二核種プロトコルを用いるガンマカウンタ（^１２５Ｉに関して１０ないし８０ｅＶのウィンドウ、^１７７Ｌｕに関して１５５ないし３８０ｅＶのウィンドウ）で測定された。Ｚｅｂａカラムからの^１７７Ｌｕの「漏れ」を補正するために、^１７７Ｌｕ−テトラジンのみを含む血清試料が用いられた。^１２５Ｉのカウントが放射性崩壊に対して補正され、その後、^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比が計算された。生体外の^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比の減少が、生体内のＴＣＯ基の不活性化により引き起こされた。図２０は、時間に伴う^１７７Ｌｕ／^１２５Ｉ比の変化を（ｔ＝０において１００％に正規化された）無傷ＴＣＯ１２の％として示している。データの直線回帰が、生体内のＴＣＯ１２関して６．２日の半減期を示した。

実施例１７
（Ｅ−ｅｘｏ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イルビシクロ［６．１．０］ノナ−４−エン−９−カルボキシレート（７）及び（Ｅ−ｍａｊｏｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（シクロオクト−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート（１２）と結合したＣＣ４９を用いた腫瘍プレターゲティング

ｅｎｄｏ異性体６よりも生体内におけるわずかに高い安定性により、ＣＣ４９構造体を運ぶｅｘｏ−ＴＣＯ７が（ｋ_２＝２．８±０．１×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１）が生体内評価ために選択された。従って、この化合物の腫瘍ターゲティング能力及び生体内反応性が、より安定であるが、反応性の低いＣＣ４９−ＴＣＯ１２の腫瘍ターゲティング能力及び生体内反応性と合わせて評価された。

ヒト大腸がん細胞ラインＬＳＩ７４ＴがＡＴＣＣから得られ、１０％熱失活ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２ｍＭグルタマックス（Glutamax）で補完されたイーグル最小必須培地（シグマ社）中に保持された。ヌード雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重２０ないし２５ｇ、チャールズリバーラボラトリ社）が、１００μＬ無菌ＰＢＳ中の５×１０^６の細胞を皮下接種された。腫瘍は約１００ｍｍ^３のサイズに広がり、マウスは、ＴＣＯ７（ｍＡｂ当たり８．４）又はＴＣＯ１２（ｍＡｂ当たり６．６）で官能基化された^１２５Ｉ−ＣＣ４９を注入された。ｍＡｂ注入の２４時間後、マウスは、１ダースの除去剤（２２、マウス当たり１６０μｇ／１００μＬ）を受け取り、その２時間後に、^１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−テトラジン８（ｍＡｂに対して１当量、約０．５ＭＢｑ）を受け取った。テトラジン注入の３時間後、マウスは、麻酔をかけられ、頸椎脱臼により犠牲になり、心臓穿刺により血液が回収され、関心の或る器官及び組織が回収され、ブロットドライされた。全ての収集された試料は計測され、1ｍＬのＰＢＳを加えられた。組織グラム当たりの注入量パーセント（％ＩＤ／ｇ）を決定するために、全ての試料の放射能が、標準物質とともに（二核種プロトコルを用いて）ガンマカウンタで測定された。図２１は、２つの^１２５Ｉ標識ＣＣ４９−ＴＣＯ構造体の生体内分布を示しており、図２２は、２つのＣＣ４９−ＴＣＯ構造体で前処理された腫瘍を持ったマウスの^１７７Ｌｕ−テトラジンの生体内分布を示している。

ＴＣＯ７で官能基化されたＣＣ４９が、ＴＣＯ１２を運ぶ対応する構造物においてよりも著しく長く血液中に保持され、結果として、腫瘍の取り込み量も著しく高かった（３４．８５±５．８６対１８．７１±；Ｐ＜０．０５）。^１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ１２よりも高い腫瘍のＴＣＯ７と結合した^１２５Ｉ−ＣＣ４９の取り込みにもかかわらず、マウスの２つのグループにおける^１２５Ｉ−テトラジンの腫瘍の取り込みは同様であった。これは、ＴＣＯ１２に対するＴＣＯ７のより低い安定性のためである。実際に、テトラジン注入の時間における１８．７％の残渣無傷ＴＣＯ７及び９０．２％の残渣無傷ＴＣＯ１２を考えると、腫瘍に関するＴＣＯ７の局所濃度は、ＴＣＯ１２の局所濃度よりも低い（表参照）。しかしながら、これにもかかわらず、ＣＣ４９−ＴＣＯ（７）でプレターゲティングされたマウスの腫瘍についての（無傷ＴＣＯの量に基づく）反応の収率は、ＣＣ４９−ＴＣＯ（１２）でプレターゲティングされたマウスの収率よりも高かった。従って、これらの発見は、ＴＣＯ１２に対するＴＣＯ７に関して、試験管内のより高い反応性は、生体内のより高い反応性に言い換えることができ、７のような高い反応性のＴＣＯ部分は、短い間隔ないし中程度の間隔で抗体及びプローブを投与するプレターゲティングにうまく用いられ得ることを示唆している。長いプレターゲティング間隔の場合、例えばＴＣＯ４０の誘導体が好適である。

ＣＣ４９−ＴＣＯ（７）及びＣＣ４９−ＴＣＯ（１２）で前処理されたマウスの血液及び腫瘍内のＴＣＯ濃度及び逆ディールス・アルダー反応の収率

実施例１８
同一面に固定される２つの環外結合の存在の結果としてのＴＣＯ環の部分的平坦化の分子モデリング
以下の実施例は、ＴＣＯ環の部分的平坦化が、同一面に固定される２つの環外結合の存在の本質的な結果であることを示すものであり、少なくとも、環外二重結合の対向する部分、すなわち、炭素原子５及び６について言及している。これは、２つの環外結合が位置する場所に関わらず適用できる。

分子は、ChemBioOffice version 12.02を用いて描かれ、ＭＭ２を用いてエネルギーを最小化した。この構造体が、CS MOPAC PRO version 8.03を用いて更に最適化された。選択された原子にフィットする最小二乗面からの二乗平均平方根（ＲＭＳ）の偏差（単位はÅ）がChemBioOffice version 12.02で計算された。この面は、この面までの４つの原子４，５，６及び７の平均距離が最小であるように位置している。

図２３が参照される。この図は、Ｅ−オレフィン部分の面がＸ−Ｙ面に配列される基本的な化合物を示している。８員環は、ほぼＸ−Ｙ面に配列されている。オレフィン結合の反応性を高めるために、Ｘ−Ｙ面の系の平坦化が行われた。オレフィン基の隣りの炭素原子に関する強い供与基／求引基／結合（conjugating）基の導入は好ましくない。これは、電子の作用が重要な役割を果たすが、それらのケースでは、他の平坦化要素（例えば、縮合シクロブチル）がこれらの位置に用いられ得るためである。同一面に固定される２つの環外結合の位置は、Ｃ３からＣ８までであり、テトラメチレン鎖（Ｃ^４、Ｃ^５、Ｃ^６及びＣ^７）から形成される分子の一部で平坦化を採り入れ、ＴＣＯの反応性の増大をもたらす。そのような平坦化は、４つのテトラメチレン炭素原子（Ｃ^４、Ｃ^５、Ｃ^６及びＣ^７）にフィットする最小二乗面ＡからのＲＭＳ偏差の減少として測定され得る。表から、種々の環による置換基及びシクロオクテン環のアミド結合が、全てのケースで（表の最初に記載されている）未置換の基本化合物の０．４３０Åの値を減少させることが明らかである。

Claims

少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び／又は治療用のキットであって、前記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、前記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有し、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有し、
前記少なくとも２つの環外結合が、前記トランス−シクロオクテン環における単一のｓｐ^２炭素に付着する、
当該キット。
前記少なくとも２つの環外結合が、炭素−ヘテロ原子二重結合の一部である、請求項１記載のキット。
少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び／又は治療用のキットであって、前記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、前記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有し、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有し、
前記少なくとも２つの環外結合が、縮合芳香族環の一部である、
当該キット。
少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び／又は治療用のキットであって、前記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、前記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有し、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有し、
前記同一面に固定された少なくとも２つの環外結合が、（ａ）縮合シクロプロピル環の単結合、（ｂ）縮合シクロブチル環の単結合、（ｃ）縮合芳香族環の混成結合、（ｄ）酸素との環外二重結合及び（ｅ）炭素との環外二重結合よりなる群から選択された、
当該キット。
前記トランス−シクロオクテン部分が式（１）
（１）
を満たし、式中、前記同一面に固定された少なくとも２つの環外結合の存在に加えて、各Ｒは、独立して、Ｈ又は、多くても６つの場合で、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、アリール、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）_２−アリール、Ｓ（Ｏ）_２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ_２、ＳＯ_３、ＳＯ_４、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ_２、ＣＮ、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであるＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＲ′ＣＯ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アルキル、Ｒ′がＨ、アルキル又はアリールであるＯＣＯＮＲ′−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アルキル、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＯＮＲ″−アリール、Ｒ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アルキル並びにＲ′及びＲ″が個々に独立してＨ、アルキル又はアリールであるＮＲ′ＣＳＮＲ″−アリールよりなる群から選択される置換基を示しており、２つのＲ部分は環を共に形成することができ、少なくとも一つのＲがオプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとのリンカー部分に含まれ、Ｘ及びＹは、個々に独立して、Ｈ又は、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ_２、ＮＯ_２、並びにＲ及びＲ′が個々に独立してＨ若しくはアルキルであるＮＲＲ′よりなる群から選択される置換基を示している、請求項１ないし４のいずれか一項に記載のキット。
少なくとも１つのプレターゲティングプローブと少なくとも１つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び／又は治療用のキットであって、前記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第１の生体直交型の反応基を有し、前記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第２の生体直交型の反応基を有し、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、前記第１及び第２の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも２つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有し、
前記ジエノフィルが、以下の構造、すなわち、
から選択された化合物であり、この化合物は、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を更に有する、
当該キット。
前記ジエンが、以下に定義される式（２）、（３）、（４）及び（５）、すなわち、
（２）、
式中、Ｒ^１は、Ｒ′、Ｒ″及びＲ″′が個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであるアルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ″Ｒ″′、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ″Ｒ″′よりなる群から選択され、Ａ及びＢは、Ａ及びＢが両方ともに炭素ではないという条件で、個々に独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ^＋Ｏ⁻、ＲがアルキルであるＮ^＋Ｒよりなる群から選択され、Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏよりなる群から選択され、Ｙは、ＲがＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ′、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ′、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ′、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″（Ｒ′及びＲ″は、個々に独立して、Ｈ、アリール又はアルキルである。）よりなる群から選択されたＣＲであり、
（３）、
式中、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、ＮＯ_２、ＯＲ′、ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルよりなる群から選択されたものであり、ＢはＯであり、Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものであり、
（４）、
式中、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ_３、ＣＦ_２−Ｒ′、ＮＯ_２、ＯＲ′、ＳＲ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ′、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ″′、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ″′、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ′、Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ″、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＮＲ′Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものであり、ＢはＮであり、Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ′、ＣＳ（＝Ｏ）_２Ｒ″′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ′、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ′Ｒ″よりなる群から選択されたものであり、Ｒ′及びＲ″は個々に独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ″′は独立してアリール又はアルキルであって、Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ^＋Ｏ⁻よりなる群から選択されたものであり、
（５）
式中、Ｒ^１及びＲ^２は、個々に独立して、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２，６−ピリミジル、３，５−ピリミジル、２，４−ピリミジル、又は、オプションで、ＮＯ_２、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ_３、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ_２、ＣＨＯ、ＣＯＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＯＲ、ＮＯ、Ａｒのような１つ以上の電子求引基で置換されたフェニルよりなる群から選択される置換基を示しており、ＲはＣ_１ないしＣ_６のアルキルであり、Ａｒは、フェニル基、ピリジル基又はナフチル基を表している、化合物よりなる群から選択され、
前記ジエンが、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも１つの結合部を有する、請求項１ないし６のいずれか一項に記載のキット。
前記プレターゲティングプローブが、一次ターゲティング部分として抗体を有する、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のキット。
前記エフェクタプローブが、エフェクタ部分として検出可能な標識を有し、好ましくは、ＭＲＩにより画像形成可能な薬剤、スピン標識、光学的標識、超音波に反応する薬剤、Ｘ線に反応する薬剤、放射性核種、ＦＲＥＴタイプの色素、（生物）発光若しくは蛍光分子又はタグ、ビオチン、常磁性イメージング剤及び超常磁性イメージング剤よりなる群から選択されるイメージングシステムに用いる造影剤を有する、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のキット。
前記エフェクタプローブが、エフェクタ部分として薬学的活性化合物を有する、請求項１ないし９のいずれか一項に記載のキット。
前記薬学的活性化合物が、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ及び^２２５Ａｃよりなる群から選択された同位体である、請求項１０記載のキット。
以下の構造、すなわち、
から選択される化合物。
一次ターゲティング部分及び生体直交型の反応基を有し、前記生体直交型の反応基は、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエン、又は、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルであり、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエンと、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルとの［４＋２］逆ディールス・アルダー反応に用いるためのプレターゲティング剤。
検出可能な標識、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５１Ｃｒ、^５２Ｆｅ、^５２Ｍｎ、^５５Ｃｏ、^６０Ｃｕ、^６１Ｃｕ、^６２Ｚｎ、^６２Ｃｕ、^６３Ｚｎ、^６４Ｃｕ、^６６Ｇａ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７０Ａｓ、^７１Ａｓ、^７２Ａｓ、^７４Ａｓ、^７５Ｓｅ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^８９Ｓｒ、^８９Ｚｒ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１４Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１２０Ｉ、^１２２Ｘｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１９３Ｐｔ、^１９５Ｐｔ、^２０１Ｔｌ及び^２０３Ｐｂよりなる群から選択された同位体と、生体直交型の反応基とを有し、前記生体直交型の反応基は、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエン、又は、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルであり、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエンと、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルとの［４＋２］逆ディールス・アルダー反応に用いるためのイメージングプローブ。
薬学的活性化合物、^２４Ｎａ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^７６Ａｓ、^７７Ａｓ、^８０Ｂｒ、^８２Ｂｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｎｂ、^９０Ｙ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１２１Ｓｎ、^１２７Ｔｅ、^１３１Ｉ、^１４０Ｌａ、^１４１Ｃｅ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４４Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１４９Ｔｂ、^１５１Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６９Ｅｒ、^１７２Ｔｍ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１４Ｂｉ、^２２３Ｒａ及び^２２５Ａｃよりなる群から選択される同位体と、生体直交型の反応基とを有し、前記生体直交型の反応基は、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエン、又は、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルであり、請求項７に記載の式（２）ないし（５）のいずれか１つに従うジエンと、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のジエノフィルとの［４＋２］逆ディールス・アルダー反応に用いるための治療プローブ。