JP6215541B2 - Method for producing gel fiber assembly having bundle structure - Google Patents
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Description
本発明は、束状構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法、及び、当該方法により得られる束状構造を有するゲルファイバー集合体に関する。 The present invention relates to a method for producing a gel fiber assembly having a bundle structure, and a gel fiber assembly having a bundle structure obtained by the method.
ハイドロゲルは、３次元的に架橋した網状構造の親水性ポリマーを含むゲル状の材料であり、その内部に水を保持できる能力及び優れた生体適合性等の特性から、生体組織の癒着防止、シーリング、ドラッグデリバリー、コンタクトレンズなどの医療目的に加えて、センサーや表面コーティングなどの様々な用途への応用が期待されている材料である（例えば、特許文献１及び２）。
Hydrogel is a gel-like material containing a three-dimensionally cross-linked network-structured hydrophilic polymer, and has the ability to retain water in its interior and the properties such as excellent biocompatibility, preventing adhesion of living tissue, In addition to medical purposes such as sealing, drug delivery, and contact lenses, it is a material that is expected to be applied to various uses such as sensors and surface coatings (for example,
近年、上記の用途に応じて様々な形状のゲルを形成することが試みられており、例えば、一定の方向に直線的に伸長した繊維状のゲルファイバー、さらにそのようなゲルファイバーを複数整列させて束状にしたゲルファイバーの集合体が注目されている。一般に、糸などの束状物質を得るためには、１本１本の繊維を複数本撚り合わせ手法が用いられる。同様の手法によって束状のゲルファイバーを得るためには、高強度なゲルファイバーを大量に調製し単離すること、及び当該ゲルファイバーを安定に撚る技術が必要となる。しかしながら、束の構成単位となる１本のゲルファイバーの強度は十分ではなく、また、ゲルファイバーの単離や外力によって撚ることも非常に困難であるうえ、その間ゲルが乾燥してしまうという問題があった。従って、一定の方向に直線的に伸長した複数のゲルファイバーを束状とした構造を有するゲルファイバーを得る方法が確立されていないのが現状である。 In recent years, attempts have been made to form gels of various shapes in accordance with the above-mentioned applications. For example, fibrous gel fibers that extend linearly in a certain direction, and a plurality of such gel fibers are aligned. A bundle of gel fibers that have been bundled into a bundle is drawing attention. In general, in order to obtain a bundled material such as a yarn, a method of twisting a plurality of individual fibers is used. In order to obtain bundled gel fibers by the same technique, it is necessary to prepare and isolate a large amount of high-strength gel fibers and to stably twist the gel fibers. However, the strength of one gel fiber which is a constituent unit of the bundle is not sufficient, and it is very difficult to isolate the gel fiber or twist it by an external force, and the gel is dried during that time. was there. Therefore, the present condition is that the method of obtaining the gel fiber which has the structure which bundled the several gel fiber linearly extended in the fixed direction was not established.
そこで、本発明は、１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーを束状とすることで優れた力学的強度を有する束状のゲルファイバー集合体を簡便に作製可能な新規な方法、及び当該方法により得られる束状構造を有するゲルファイバー集合体を提供することを課題とするものである。 Accordingly, the present invention provides a novel method capable of easily producing a bundle-like gel fiber assembly having excellent mechanical strength by bundling a plurality of one-dimensionally stretched gel fibers, and An object of the present invention is to provide a gel fiber assembly having a bundle structure obtained by the method.
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、動的な流れ中の反応場と分子の凝集効果を組み合わせることにより、溶液中で相分離し凝集しているプレゲル剤マイクロ流路中において架橋させて束状構造を有するゲルファイバー集合体を簡便な工程によって得ることができることを見出した。より詳細には、マイクロ流路を反応場として、まず、短時間でゲル化可能な第１のプレゲル剤によって糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成させ；相分離して凝集している第２のプレゲル剤を、流路のシェアストレスによって鋳型ゲルファイバーの骨格内部に取り込ませ、そこに保持させた状態でゲル化させて異なる２種類のゲルファイバーからなる複合体を形成させ；その後、鋳型ゲルファイバーを除去することによって、マイクロオーダーの外径を有する束状構造のゲルファイバー集合体が得られることを見出した。かかる知見に基づき、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have combined the reaction field in the dynamic flow and the aggregation effect of the molecules, so that the pregel agent micros It has been found that a gel fiber assembly having a bundle structure can be obtained by a simple process by crosslinking in a flow path. More specifically, using a microchannel as a reaction field, first, a template gel fiber having a shape elongated in a thread shape is formed by a first pregel agent that can be gelled in a short time; The second pregel agent is taken into the skeleton of the template gel fiber by the shear stress of the flow path, and is gelled in a state of being held there to form a composite composed of two different types of gel fibers; It has been found that a bundle of gel fiber aggregates having a micro-order outer diameter can be obtained by removing the template gel fibers. Based on this knowledge, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、一態様において、
（１）１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体の製造方法であって、ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程、ここで、前記第１のプレゲル剤は前記溶液中に溶解した状態であり、前記第２のプレゲル剤は前記溶液中に凝集した状態で存在する、当該工程；ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程；ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することによって、流れ場において前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程、ここで、前記第２のプレゲル剤は前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持される、当該工程；ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することによって、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、それにより、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する、当該工程；及び、ｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程、を含む、該方法
に関する。
That is, the present invention in one aspect,
(1) A method for producing a gel fiber assembly having a structure in which a plurality of one-dimensionally stretched gel fibers are bundled, a) a solution containing a first pregel agent and a second pregel agent Wherein the first pregel is dissolved in the solution and the second pregel is present in an aggregated state in the solution; b) the solution C) injecting into the microchannel; c) by injecting the first cross-linking agent into the microchannel, the first pregel agent is gelled in the flow field, and has a shape elongated in a string shape A step of forming a template gel fiber, wherein the second pregel agent is held in a bundle-like shape inside the skeleton of the template gel fiber; d) a second solution in the solution containing the template gel fiber; Cross-linking Is added, the second pregel agent is cross-linked in a state of being held in a bundle shape inside the skeleton of the template gel fiber, and thereby the gel formed by cross-linking the second pregel agent is obtained. Forming a gel fiber composite having a structure coated with the template gel fiber; and e) removing the template gel fiber by adding a gel remover to the solution containing the gel fiber composite. And obtaining a gel fiber aggregate having a bundle structure.
好ましい態様では、本発明は、
（２）前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、上記（１）に記載の方法、
（３）前記第１のプレゲル剤のゲル化速度が、前記第２のプレゲル剤のゲル化速度よりも速い、上記（１）又は（２）に記載の方法、
（４）前記第２のプレゲル剤が、相転移温度を有する高分子である、上記（１）乃至（３）のいずれか１に記載の方法、
（５）前記相転移温度を有する高分子が、疎水基と親水基を有する両親媒性高分子である、上記（４）に記載の方法、
（６）前記相転移温度を有する高分子が、糖鎖高分子である、上記（４）又は（５）に記載の方法、
（７）前記糖鎖高分子がヒドロキシプロピルセルロースである、上記（６）に記載の方法、
（８）前記第２の架橋剤が、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、、エチレングルコールジメタクリレート、又はグルタルアルデヒドから選択される、上記（１）乃至（７）のいずれか１に記載の方法、
（９）前記第１のプレゲル剤が、イオン架橋によってゲル化し得る高分子である、上記（１）乃至（８）のいずれか１に記載の方法、
（１０）前記イオン架橋によってゲル化し得る高分子が、アルギン酸ナトリウム又はアルギン酸カリウムであり、及び前記第１の架橋剤が、２価以上の金属イオンの塩である、上記（９）に記載の方法、
（１１）前記ゲル除去剤が、キレート剤である、上記（１０）に記載の方法、
（１２）前記第１のプレゲル剤がアルギン酸ナトリウムであり、前記第２のプレゲル剤がヒドロキシプロピルセルロースである、上記（１）に記載の方法、
（１３）前記工程ａ）で調製される第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液が、塩基性の水溶液である、上記（１２）に記載の方法、
（１４）前記塩基性の水溶液中におけるアルギン酸ナトリウムの濃度が１．０ｗｔ％であり、及びヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０ｗｔ％以上である、上記（１３）に記載の方法、
に関する。
In a preferred embodiment, the present invention provides:
(2) The method according to (1), wherein the gel fiber aggregate is a hydrogel,
(3) The method according to (1) or (2) above, wherein the gelation rate of the first pregel preparation is faster than the gelation speed of the second pregel preparation,
(4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the second pregel agent is a polymer having a phase transition temperature,
(5) The method according to (4) above, wherein the polymer having the phase transition temperature is an amphiphilic polymer having a hydrophobic group and a hydrophilic group,
(6) The method according to (4) or (5) above, wherein the polymer having the phase transition temperature is a sugar chain polymer.
(7) The method according to (6) above, wherein the sugar chain polymer is hydroxypropylcellulose,
(8) Any one of the above (1) to (7), wherein the second crosslinking agent is selected from divinylsulfone, N, N′-methylenebisacrylamide, ethylene glycol dimethacrylate, or glutaraldehyde. The method described in
(9) The method according to any one of (1) to (8) above, wherein the first pregel agent is a polymer that can be gelled by ionic crosslinking,
(10) The method according to (9), wherein the polymer that can be gelated by ionic crosslinking is sodium alginate or potassium alginate, and the first crosslinking agent is a salt of a divalent or higher metal ion. ,
(11) The method according to (10) above, wherein the gel removing agent is a chelating agent,
(12) The method according to (1) above, wherein the first pregel preparation is sodium alginate and the second pregel preparation is hydroxypropylcellulose.
(13) The method according to (12) above, wherein the solution containing the first pregel agent and the second pregel agent prepared in the step a) is a basic aqueous solution.
(14) The method according to (13) above, wherein the concentration of sodium alginate in the basic aqueous solution is 1.0 wt% and the concentration of hydroxypropylcellulose is 4.0 wt% or more,
About.
別の態様において、本発明は、
（１５）１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有するゲルファイバー集合体であって、相転移温度を有する高分子が互いに共有結合で架橋された構造を有する、当該ゲルファイバー集合体、
に関する。
In another aspect, the invention provides:
(15) A gel fiber assembly having a structure in which a plurality of one-dimensionally stretched gel fibers are bundled, and having a structure in which polymers having a phase transition temperature are crosslinked by covalent bonds to each other, The gel fiber assembly,
About.
当該ゲルファイバー集合体の好ましい態様として、本発明は、
（１６）前記ゲルファイバー集合体が、ハイドロゲルである、上記（１５）に記載のゲルファイバー集合体、
（１７）１００〜５００μｍの外径を有する、上記（１５）又は（１６）に記載のゲルファイバー集合体、
（１８）前記相転移温度を有する高分子が、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を有する高分子である、上記（１５）乃至（１７）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
（１９）前記相転移温度を有する高分子が、ヒドロキシプロピルセルロースである、上記（１８）に記載のゲルファイバー集合体、
（２０）３ｋＰａ以上のヤング率を有する、上記（１５）乃至（１９）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
（２１）５ｋＰａ以上の単位断面積あたりの破断荷重を有する、上記（１５）乃至（１９）のいずれか１に記載のゲルファイバー集合体、
に関する。
As a preferred embodiment of the gel fiber assembly, the present invention,
(16) The gel fiber assembly according to (15), wherein the gel fiber assembly is a hydrogel,
(17) The gel fiber assembly according to (15) or (16), which has an outer diameter of 100 to 500 μm,
(18) The gel fiber assembly according to any one of (15) to (17), wherein the polymer having the phase transition temperature is a polymer having a lower critical solution temperature (LCST),
(19) The gel fiber assembly according to (18), wherein the polymer having the phase transition temperature is hydroxypropyl cellulose,
(20) The gel fiber assembly according to any one of (15) to (19), which has a Young's modulus of 3 kPa or more,
(21) The gel fiber assembly according to any one of (15) to (19), which has a breaking load per unit cross-sectional area of 5 kPa or more,
About.
本発明によれば、外径がマイクロサイズの束状構造を有するゲルファイバー集合体を簡素なプロセスで容易に作製することができる。また、束状の構造を有することで力学的強度に優れたゲルファイバー集合体、特にハイドロゲルファイバーの集合体を得ることが可能となる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the gel fiber aggregate | assembly which has a bundle structure whose outer diameter is micro size can be easily produced with a simple process. Moreover, it becomes possible to obtain a gel fiber aggregate excellent in mechanical strength, particularly a hydrogel fiber aggregate, by having a bundle structure.
加えて、本発明は、第１及び第２のプレゲル剤の疎水性と親水性のバランスに応じて、当該プレゲル剤を含む溶液中における二成分系相分離の形態を様々なパターンとすることができるため、それに応じて、最終的に得られるゲルの形状を制御することができる。 In addition, according to the present invention, depending on the balance between the hydrophobicity and the hydrophilicity of the first and second pregel agents, the form of the two-component phase separation in the solution containing the pregel agent may be various patterns. Therefore, the shape of the gel finally obtained can be controlled accordingly.
さらに、本発明を用いて、生体適合性の高分子で束状ゲルファイバー集合体を構築することによって、軟骨、腱、平滑筋層などの比較的強度の高い力学的強度を有する生体組織の模倣への応用、或いは、刺激応答性の高分子でゲルファイバー集合体を構築することによって、外部刺激に応答して性質が変化するマイクロアクチュエーターの形成などへの応用が可能である。また、セルロース誘導体等でゲルを構築した場合には、セルラーゼ等の酵素で容易に分解することができるため、本発明のゲルファイバー集合体を鋳型として、更なる化学架橋ゲルを形成し、形成後に分解除去することによってマイクロ細孔を有するゲルを得ることできる。従って、神経や血管等の細胞足場材料、及びドラッグデリバリーシステムへの応用も期待できる。 Furthermore, by constructing bundled gel fiber aggregates with biocompatible polymers using the present invention, imitation of biological tissue having relatively high mechanical strength such as cartilage, tendon, smooth muscle layer, etc. By constructing a gel fiber assembly with a stimulus-responsive polymer, it can be applied to the formation of microactuators whose properties change in response to external stimuli. In addition, when a gel is constructed with a cellulose derivative or the like, it can be easily decomposed with an enzyme such as cellulase, so that a further chemically crosslinked gel is formed using the gel fiber assembly of the present invention as a template, A gel having micropores can be obtained by decomposing and removing. Therefore, application to cell scaffold materials such as nerves and blood vessels, and drug delivery systems can also be expected.
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.
図１は、本発明の代表的な態様によって束状構造のゲルファイバー集合体製造工程の概略を示すものである。第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液（プレゲル溶液）を調製し、これをマイクロ流路に射出する（図１ａ）。当該マイクロ流路が反応場となる。ここで、当該プレゲル溶液中において、第２のプレゲル剤（図では、ＨＰＣで示されている）は、図１ａに示されるように相転移により溶液中で凝集した状態となっている。まず、短時間でゲル化可能な第１のプレゲル剤に第１の架橋剤を注入し、流路の流れによって発生するシェアストレスによって糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成させる。（図１ｂ）ここで、溶液中で相分離して凝集していた第２のプレゲル剤は、シェアストレスによって鋳型ゲルファイバーの骨格内の空間に取り込まれ、鋳型ゲルファイバーの骨格内部の束状に伸長した空間内に保持される。 FIG. 1 shows an outline of a bundle-structured gel fiber assembly manufacturing process according to a typical embodiment of the present invention. A solution containing the first pregel agent and the second pregel agent (pregel solution) is prepared, and this is injected into the microchannel (FIG. 1a). The microchannel becomes a reaction field. Here, in the pregel solution, the second pregel agent (indicated by HPC in the figure) is in an aggregated state in the solution due to phase transition as shown in FIG. 1a. First, a first cross-linking agent is injected into a first pregel agent that can be gelled in a short time, and a mold gel fiber having a shape that is elongated in a thread shape by shear stress generated by the flow of a flow path is formed. (FIG. 1b) Here, the second pregel agent phase-aggregated and aggregated in the solution is taken into the space in the skeleton of the template gel fiber by shear stress, and is bundled inside the skeleton of the template gel fiber. It is held in the extended space.
次に、第２のプレゲル剤が鋳型ゲルファイバーの骨格内に保持された状態で第２の架橋剤を添加し、第２のプレゲル剤を鋳型ゲルファイバー内部において架橋させて、ゲル化させる（図１ｃ）。当該第２の架橋剤は、上記第１の架橋剤と同様に、マイクロ流路中に添加されてもよいし、或いは、第２のプレゲル剤が鋳型ゲルファイバーの骨格内部に取り込まれた後であれば、マイクロ流路から流出した溶液を別の容器等に捕集し、当該容器中に添加することもできる。これによって、異なる２種類のゲルファイバーから構成される複合体が得られる。当該複合体は、図１に示すように、第２のプレゲル剤が架橋して形成されたゲルを鋳型ゲルファイバーが被覆する構造となっている。 Next, a second cross-linking agent is added in a state where the second pre-gel agent is held in the skeleton of the template gel fiber, and the second pre-gel agent is cross-linked inside the template gel fiber to be gelled (see FIG. 1c). The second cross-linking agent may be added to the micro flow channel in the same manner as the first cross-linking agent, or after the second pre-gel agent is taken into the skeleton of the template gel fiber. If so, the solution flowing out from the microchannel can be collected in another container or the like and added to the container. As a result, a composite composed of two different types of gel fibers is obtained. As shown in FIG. 1, the complex has a structure in which a gel gel fiber covers a gel formed by crosslinking the second pregel agent.
その後、ゲル除去剤を添加して、鋳型ゲルファイバーを除去することによって、マイクロオーダーの外径を有する本発明の束状構造のゲルファイバー集合体が得られる（図１ｄ）。図１中では、３本のゲルファイバーが束になった構造が例示されているが、言うまでもなく、実際にはより多くの本数のゲルファイバーによって束が形成される。 Thereafter, a gel remover is added to remove the template gel fiber, thereby obtaining a bundle-structured gel fiber assembly of the present invention having a micro-order outer diameter (FIG. 1d). In FIG. 1, a structure in which three gel fibers are bundled is illustrated, but it goes without saying that a bundle is actually formed by a larger number of gel fibers.
（１）第１のプレゲル剤及び第１の架橋剤
本発明において用いられる第１のプレゲル剤は、ゲル化して鋳型ゲルファイバーを形成するものである。第１のプレゲル剤は、マイクロ流路の流れによって発生するシェアストレスによって、流路の流れ方向に配向して糸状に伸長した形状を有するゲルを形成し得るものであれば、人工物及び天然物のいずれであっても良く、親水性高分子、糖鎖高分子、多糖類などを含む当該技術分野において公知のプレゲル剤を用いることができる。しかしながら、マイクロ流路中でゲル化し得るためには、架橋剤の添加によって短時間で、好ましくは瞬時にゲル化し得るものであることが望ましい。好ましくは、第１のプレゲル剤は、イオン架橋によってゲル化し得る高分子であり、そのような高分子としては、例えば、２価の金属イオンの添加によって瞬時にゲル化する性質を有する、アルギン酸ナトリウムやアルギン酸カリウム等のアルギン酸塩が挙げられる。これらのなかでも、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
(1) 1st pregel agent and 1st crosslinking agent The 1st pregel agent used in this invention gelatinizes and forms a template gel fiber. As long as the first pregel agent is capable of forming a gel having a shape that is oriented in the flow direction of the flow path and elongated in a thread shape due to the shear stress generated by the flow of the micro flow path, it is an artificial or natural product. Any pre-gel agent known in the art including a hydrophilic polymer, a sugar chain polymer, a polysaccharide and the like can be used. However, in order to be able to gel in the microchannel, it is desirable that the gel can be gelled in a short time, preferably instantaneously, by adding a crosslinking agent. Preferably, the first pregel agent is a polymer that can be gelled by ionic crosslinking, and as such a polymer, for example, sodium alginate having a property of instantly gelling by addition of a divalent metal ion. And alginates such as potassium alginate. Among these, sodium alginate is preferable.
第１のプレゲル剤をゲル化するための第１の架橋剤は、上記第１のプレゲル剤の種類に応じて当業者であれば適宜選択することができるであろう。例えば、第１のプレゲル剤がアルギン酸塩である場合には、第１の架橋剤は、２価以上の金属イオンの塩であることができ、好ましくは、カルシウム塩又はマグネシウム塩であり、より好ましくは、塩化カルシウムである。 A person skilled in the art will be able to select the first cross-linking agent for gelling the first pre-gel agent as appropriate depending on the type of the first pre-gel agent. For example, when the first pregel preparation is an alginate, the first cross-linking agent can be a salt of a divalent or higher metal ion, preferably a calcium salt or a magnesium salt, and more preferably Is calcium chloride.
また、ゲルファイバー複合体が得られた後、最終段階において、第１のプレゲル剤による鋳型ゲルファイバーを除去するために用いられるゲル除去剤は、第２のプレゲル剤によって形成された束状ゲルファイバーには影響を与えることなく、鋳型ゲルファイバーのゲル化のみを解消できるものであれば、特に限定されない。例えば、鋳型ゲルファイバーがアルギン酸ゲルである場合（すなわち、第１のプレゲル剤がアルギン酸塩である場合）、第１のプレゲル剤の分子間を架橋させているカルシウムイオン（Ｃａ２＋）等を除去できるものであればよい。そのようなゲル除去剤の例としては、クエン酸ナトリウム、或いは、ＥＤＴＡ等の任意のキレート剤が挙げられる。好ましくは、クエン酸ナトリウムである。 In addition, after the gel fiber composite is obtained, the gel removing agent used for removing the template gel fiber by the first pregel agent in the final stage is a bundled gel fiber formed by the second pregel agent. There is no particular limitation as long as it can eliminate only the gelation of the template gel fiber without affecting. For example, when the template gel fiber is an alginate gel (that is, when the first pregel agent is an alginate), calcium ions (Ca 2+ ) cross-linking the molecules of the first pregel agent can be removed. Anything is acceptable. Examples of such a gel remover include sodium citrate or any chelating agent such as EDTA. Sodium citrate is preferable.
（２）第２のプレゲル剤及び第２の架橋剤
本発明において用いられる第２のプレゲル剤は、ゲル化して、最終的に束状構造のゲルファイバー集合体を構成することとなる個々のゲルファイバーとなるものである。また、第２のプレゲル剤は、ハイドロゲルを形成し得ることが好ましく、特に、細胞培養用足場などに用いる場合は生分解性であることが好ましい。
(2) Second pregel agent and second cross-linking agent Each of the second pregel agents used in the present invention is gelled and finally constitutes a bundle of gel fiber assemblies. It becomes a fiber. Moreover, it is preferable that the 2nd pregel agent can form hydrogel, and when using for the scaffold for cell cultures etc., it is preferable that it is biodegradable.
別の側面において、本発明において用いられる第２のプレゲル剤は、上記のようにマイクロ流路に射出されるプレゲル溶液中において、相転移により凝集した状態であることが必要である。これは、第２のプレゲル剤が、マイクロ流路のシェアストレスによって、鋳型ゲルファイバーの骨格内の空間に取り込ませることによって、そのゲル化の前に鋳型ゲルファイバーと同様に糸状に伸長した複数のパターンの形状に保持させるためである。 In another aspect, the second pregel used in the present invention needs to be in an aggregated state due to phase transition in the pregel solution injected into the microchannel as described above. This is because the second pregel agent is incorporated into the space in the skeleton of the template gel fiber by the shear stress of the microchannel, so that the plurality of gel gel fibers are elongated before the gelation. This is for maintaining the shape of the pattern.
従って、第２のプレゲル剤は、プレゲル溶液中で相分離し得るもので化合物であることが望ましい。そのような化合物であれば、人工物及び天然物のいずれであっても良く、疎水基と親水基を有する両親媒性高分子、糖鎖高分子、多糖類などを含む当該技術分野において公知のプレゲル剤を用いることができる。好ましくは、相転移温度を有する化合物であり、特に、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）又は上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を有する高分子（天然物及び合成高分子のいずれも含まれる）であることが好ましい。ここで、「下限臨界溶液温度を有する高分子」は、図２に示すように、可逆的にある温度以上において分子内で収縮して或いは分子間で凝集して水等の溶媒に不溶化するが、当該温度以下では当該溶媒に可溶化する性質を有する。好ましくは、第２のプレゲル剤は、セルロース誘導体、ペクチン、又はポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であり、より好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）である。ヒドロキシプロピルセルロースは、水中で約４５℃の下限臨界溶液温度を有する。 Accordingly, the second pregel agent is preferably a compound that can be phase-separated in the pregel solution. As long as it is such a compound, it may be an artificial product or a natural product, and is known in the technical field including an amphiphilic polymer having a hydrophobic group and a hydrophilic group, a sugar chain polymer, a polysaccharide and the like. A pregel agent can be used. Preferably, it is a compound having a phase transition temperature, and in particular, a polymer (including both natural products and synthetic polymers) having a lower critical solution temperature (LCST) or an upper critical solution temperature (UCST). preferable. Here, as shown in FIG. 2, the “polymer having the lower critical solution temperature” is reversibly shrunk within a molecule or aggregated between molecules at a certain temperature or higher and becomes insoluble in a solvent such as water. It has the property of being solubilized in the solvent below the temperature. Preferably, the second pregel is a cellulose derivative, pectin, or poly (N-isopropylacrylamide), more preferably hydroxypropylcellulose (HPC). Hydroxypropylcellulose has a lower critical solution temperature of about 45 ° C. in water.
また、第２のプレゲル剤をゲル化するための第２の架橋剤は、上記第２のプレゲル剤の種類に応じて当業者であれば適宜選択することができるであろう。第２の架橋剤は、共有結合によって第２のプレゲル剤の分子間を架橋するものであることが好ましく、水溶性であることが好ましい。そのような水溶性の架橋剤例としては、ジビニルスルホン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、又はグルタルアルデヒドが挙げられ、好ましくはジビニルスルホンである。さらに、カップリングのためのスペーサーおよび反応性基を両端に含有する二官能性架橋剤を使用してもよい。適切な二官能性架橋剤は当該技術分野で広く知られており、１,６−ジアミノヘキサンなどのジアミン、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベラート、およびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）などのビスＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート、１,４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン、及び、スクシニルジサリチレートなどのジカルボン酸などが挙げられるが、これに限定されるものではない。各末端に異なる反応性基を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤の非限定的な例としては、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが挙げられる。これらの試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、アミンまたはアルコール基と反応するのに対し、マレイミド基はチオール基と反応する。なお、これら架橋剤を用いて、共有結合によって第２のプレゲル剤をゲル化させる手法以外にも、光重合や電子線架橋など、当該技術分野において周知の架橋手法を用いて第２のプレゲル剤をゲル化させてもよい。 Moreover, the 2nd crosslinking agent for gelatinizing the 2nd pregel agent will be able to be suitably selected by those skilled in the art according to the kind of said 2nd pregel agent. The second cross-linking agent is preferably one that cross-links between the molecules of the second pregel agent by a covalent bond, and is preferably water-soluble. Examples of such water-soluble crosslinking agents include divinyl sulfone, N, N′-methylenebisacrylamide, ethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol diacrylate, or glutaraldehyde, preferably divinyl sulfone. It is. Furthermore, a spacer for coupling and a bifunctional crosslinking agent containing reactive groups at both ends may be used. Suitable bifunctional cross-linking agents are widely known in the art and include diamines such as 1,6-diaminohexane, dialdehydes such as glutaraldehyde, ethylene glycol-bis (succinic acid N-hydroxysuccinimide ester), disc Cinnimidyl glutarate, disuccinimidyl suberate, and bis-N-hydroxysuccinimide esters such as ethylene glycol-bis (succinimidyl succinate), diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, 1,4 butanediyl diglycidyl ether, etc. Examples thereof include, but are not limited to, bisoxirane and dicarboxylic acids such as succinyl disalicylate. Heterobifunctional crosslinkers containing different reactive groups at each end can also be used. Non-limiting examples of heterobifunctional crosslinkers include 3-maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester. The N-hydroxysuccinimide ester group of these reagents reacts with amine or alcohol groups, while the maleimide group reacts with thiol groups. In addition to the method of gelling the second pregel agent by covalent bond using these crosslinking agents, the second pregel agent using a crosslinking method known in the technical field such as photopolymerization or electron beam crosslinking. May be gelled.
第１のプレゲル剤と第２のプレゲル剤の好ましい組み合わせは、アルギン酸ナトリウムとヒドロキシプロピルセルロースである。 A preferred combination of the first pregel and the second pregel is sodium alginate and hydroxypropylcellulose.
（３）プレゲル溶液
上記のように、マイクロ流路の内流として射出される溶液（プレゲル溶液）は、第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液である。プレゲル溶液は、好ましくは水溶液であるが、水と混じりあう性質を有する水性有機溶媒、例えばエタノール、アセトン、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシドなどを含むこともできる。溶媒の組成は、用いる第１及び第２のプレゲル剤の種類に応じて、適宜選択することができる。
(3) Pregel solution As described above, the solution (pregel solution) ejected as the internal flow of the microchannel is a solution containing the first pregel agent and the second pregel agent. The pregel solution is preferably an aqueous solution, but can also contain an aqueous organic solvent having a property of mixing with water, such as ethanol, acetone, ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, dimethylformamide, or dimethylsulfoxide. The composition of the solvent can be appropriately selected according to the types of the first and second pregel agents used.
また、プレゲル溶液において、第１のプレゲル剤は溶液中に溶解した状態であり、第２のプレゲル剤は溶液中に凝集した状態で存在する。従って、プレゲル溶液は、第２のプレゲル剤が、相分離により凝集した状態となるような条件、例えば、温度、ｐＨ、各プレゲル剤の濃度、塩濃度、溶媒組成等について適宜設定することができる。 In the pregel solution, the first pregel agent is dissolved in the solution, and the second pregel agent is present in an aggregated state in the solution. Accordingly, the pregel solution can be appropriately set with respect to conditions such as the temperature, pH, concentration of each pregel agent, salt concentration, solvent composition, etc., so that the second pregel agent becomes agglomerated by phase separation. .
例えば、第１のプレゲル剤と第２のプレゲル剤が、アルギン酸ナトリウムとヒドロキシプロピルセルロースの組み合わせである場合、プレゲル溶液は、塩基性の水溶液であることが好ましく、ｐＨ１３の水溶液であることがより好ましい。また、各プレゲル剤の濃度は、アルギン酸ナトリウムが１．０ｗｔ％において、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０ｗｔ％以上であることができる。好ましくは、ヒドロキシプロピルセルロースの濃度が４．０〜１０ｗｔ％、より好ましくは、４．０〜７．０ｗｔ％である。 For example, when the first pregel agent and the second pregel agent are a combination of sodium alginate and hydroxypropylcellulose, the pregel solution is preferably a basic aqueous solution, more preferably an aqueous solution having a pH of 13. . Further, the concentration of each pregel agent may be such that the concentration of hydroxypropylcellulose is 4.0 wt% or more when sodium alginate is 1.0 wt%. Preferably, the concentration of hydroxypropylcellulose is 4.0 to 10 wt%, more preferably 4.0 to 7.0 wt%.
（４）マイクロ流路デバイス
本発明において用いられるマイクロ流路デバイスは、特に限定されず、当該技術分野において公知のものを用いることができるが、流路中で２層の流体流れを形成し得る同軸フロー型のマイクロ流路デバイスが好ましい。同軸フロー型マイクロ流路デバイスの構造は、例えば、Ｋｉｒｉｙａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１２，５１，１５５３−１５５７等で具体的に説明されている。かかるマイクロ流路デバイスによれば、図３に示すように、２つの成分の異なる流体を同軸となるように内流及び外流に分けて射出することができる。マイクロ流路デバイスの内径は、１００〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。
(4) Microchannel device The microchannel device used in the present invention is not particularly limited, and those known in the technical field can be used, but a two-layer fluid flow can be formed in the channel. A coaxial flow type microchannel device is preferred. The structure of the coaxial flow type microchannel device is described in, for example, Kiriya et al., Angew. Chem. Int. Ed. , 2012, 51, 1553-1557, and the like. According to such a microchannel device, as shown in FIG. 3, fluids having two different components can be injected separately into an internal flow and an external flow so as to be coaxial. The inner diameter of the microchannel device is preferably in the range of 100 to 1000 μm.
このような構造のマイクロ流路デバイスを用いることにより、例えば、内流に第１のプレゲル剤を含むプレゲル溶液、及び外流に第１の架橋剤を用い、その内流と外流の流量比を適宜調製することによって、これらの混合により流路中で形成される鋳型ゲルファイバーの直径の大きさを制御することが可能となる。 By using the microchannel device having such a structure, for example, a pregel solution containing a first pregel agent in the internal flow and a first cross-linking agent in the external flow are used, and the flow rate ratio between the internal flow and the external flow is appropriately set. By preparing, it becomes possible to control the size of the diameter of the template gel fiber formed in the channel by mixing them.
マイクロ流路内の流速は、第１のプレゲル剤を糸状に伸長した形状の鋳型ゲルファイバーとするため、及び溶液中で凝集している第２のプレゲル剤を鋳型ゲルファイバー骨格内部に取り込ませるために十分なシェアストレスが流路内を生じさせるように、適宜選択されるべきものである。代表的な例として、第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含むプレゲル溶液の射出速度（内流）は、１００〜５００μＬ／分の流速であることができ、また、第１の架橋剤を含む溶液（外流）は、１〜１０ｍｌ／分であることができるが、当該内流と外流は任意の比率とすることができる。また、上記のように、これらの流速の比によって、鋳型ゲルファイバーの直径を制御することができ、結果として、最終的に得られる束状ゲルファイバー集合体の本数や外径を制御することができる。 The flow rate in the microchannel is such that the first pregel agent is formed into a template gel fiber having an elongated shape, and the second pregel agent aggregated in the solution is incorporated into the template gel fiber skeleton. Therefore, it should be appropriately selected so that a sufficient shear stress is generated in the flow path. As a representative example, the injection rate (internal flow) of the pregel solution containing the first pregel agent and the second pregel agent can be a flow rate of 100 to 500 μL / min, and the first crosslinker The solution (external flow) containing 1 can be 1 to 10 ml / min, but the internal flow and the external flow can be in any ratio. Moreover, as described above, the diameter of the template gel fiber can be controlled by the ratio of these flow rates, and as a result, the number and outer diameter of the bundled gel fiber aggregate finally obtained can be controlled. it can.
（５）束状構造ゲルファイバー
本発明のゲルファイバー集合体は、１次元的に伸長した複数本のゲルファイバーが束状となった構造を有することを特徴とする。上記のように、好ましくは、ゲルファイバー集合体はハイドロゲルで構成される。「束状となった構造」とは、整列した２以上のゲルファイバーを含む集合体を形成していることを意味する。「整列した」という用語は、複数のゲルファイバーが全体として概ね平行関係を維持していることが好ましいが、２以上のゲルファイバーにおいて部分的に平行関係が失われている場合や、複数のゲルファイバーの一部又は全体がねじれて重なり合う場合なども含まれると解釈されるべきである。
(5) Bundled structure gel fiber The gel fiber assembly of the present invention is characterized by having a structure in which a plurality of gel fibers that are extended one-dimensionally are bundled. As described above, the gel fiber aggregate is preferably composed of a hydrogel. “Bundled structure” means that an aggregate including two or more gel fibers aligned is formed. The term “aligned” preferably means that a plurality of gel fibers maintain a generally parallel relationship as a whole. However, when two or more gel fibers partially lose the parallel relationship, It should be construed that the case where a part or all of the fibers are twisted and overlapped is also included.
束状の集合体に含まれるゲルファイバーの数は２以上であれば特に限定されないが、一般的には５以上、好ましくは１０以上、さらに好ましくは２０以上である。上限も特に限定されないが、好ましくは１００００以下、より好ましくは１００以下、さらに好ましくは５０以下である。 The number of gel fibers contained in the bundle-like aggregate is not particularly limited as long as it is 2 or more, but is generally 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more. The upper limit is not particularly limited, but is preferably 10,000 or less, more preferably 100 or less, and still more preferably 50 or less.
ゲルファイバー集合体を形成する各ゲルファイバーの外径は特に限定されないが、一般的には１０〜５０００ｎｍ程度であり、概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。各ゲルファイバーの断面は概ね円形であるが、用いるプレゲル剤の種類などに応じて円形以外の断面を与える場合もある。複数のゲルファイバーは一般的には概ね同一の外径を有するが、それぞれ異なった外径を有していてもよい。 The outer diameter of each gel fiber forming the gel fiber aggregate is not particularly limited, but is generally about 10 to 5000 nm and has substantially the same outer diameter, but each may have a different outer diameter. Good. The cross section of each gel fiber is generally circular, but a cross section other than circular may be given depending on the type of pregel agent used. The plurality of gel fibers generally have substantially the same outer diameter, but may have different outer diameters.
束状ゲルファイバー集合体の断面形状としては、円形、楕円系、又は四角形や五角形などの多角形など多様な形状であってもよいが、断面形状としては円形が好ましい。束状ゲルファイバー集合体の外径も特に限定されず、ファイバーの本数に応じて適宜選択することができ、例えば１００ｎｍ〜５００μｍであることができるが、外径は用途によって適宜選択可能である。当該外径は、マイクロ流路の流速によって鋳型ゲルファイバーの直径を制御することによって、選択することができる。当該束状のゲルファイバー集合体の長さは特に限定されないが、数百マイクロメートル以上、好ましくは数ミリメートル以上であり、数センチメートル程度の長さを有する場合もある。 The cross-sectional shape of the bundle-like gel fiber aggregate may be various shapes such as a circle, an ellipsoid, or a polygon such as a quadrangle or a pentagon, but the cross-sectional shape is preferably a circle. The outer diameter of the bundled gel fiber aggregate is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the number of fibers. For example, the outer diameter can be appropriately selected depending on the application. The outer diameter can be selected by controlling the diameter of the template gel fiber according to the flow rate of the microchannel. The length of the bundled gel fiber aggregate is not particularly limited, but is several hundred micrometers or more, preferably several millimeters or more, and may have a length of about several centimeters.
本発明の束状ゲルファイバー集合体は、優れた力学的強度を有し、例えば、３ｋＰａ以上、好ましくは４ｋＰａ以上のヤング率を有する。また、５ｋＰａ以上、好ましくは１０ｋＰａ以上の単位断面積あたりの破断荷重を有する。 The bundled gel fiber aggregate of the present invention has excellent mechanical strength, and has a Young's modulus of, for example, 3 kPa or more, preferably 4 kPa or more. Moreover, it has a breaking load per unit cross-sectional area of 5 kPa or more, preferably 10 kPa or more.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited by these.
１．プレゲル溶液の調製
第１のプレゲル剤としてアルギン酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｌｇ）、第２のプレゲル剤としてヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を用いて、マイクロ流路の内流として射出するプレゲル溶液の調製を行った。
1. Preparation of pregel solution Using sodium alginate (Na-Alg) as the first pregel agent and hydroxypropylcellulose (HPC) as the second pregel agent, a pregel solution to be injected as an internal flow of the microchannel was prepared. .
まず、当該プレゲル溶液の調製にあたり、第２のプレゲル剤であるＨＰＣが凝集状態となる条件の検討を行った。図４に示すように、ＨＰＣは、Ｎａ−Ａｌｇの非存在下ではいずれのｐＨでも白濁しないが、１ｗｔ％のＮａ−Ａｌｇの存在下では、ＨＰＣが３ｗｔ％以上かつｐＨが１３では溶液が白濁し、すなわちＨＰＣが凝集体を形成することが確認された。また、Ｎａ−Ａｌｇの存在下、種々のＨＰＣ濃度における白濁の温度依存性を図５に示す。ｐＨ７の条件ではＨＰＣ濃度にかかわらず室温では白濁を示さないが、ｐＨ１３の条件では白濁を示した。この結果は、Ｎａ−Ａｌｇの存在下のｐＨ１３以上のアルカリ溶液とすることによって、ＨＰＣのＬＣＳＴが室温以下に制御できることを示すものであり、このことから上記のＨＰＣ凝集体の形成が理由付けられる。
First, in preparing the pregel solution, the conditions under which HPC as the second pregel agent is in an aggregated state were examined. As shown in FIG. 4, HPC does not become cloudy at any pH in the absence of Na—Alg, but in the presence of 1 wt% Na—Alg, the solution becomes cloudy when HPC is 3 wt% or more and pH is 13. That is, it was confirmed that HPC forms an aggregate. FIG. 5 shows the temperature dependence of cloudiness at various HPC concentrations in the presence of Na—Alg. Under the condition of
２．束状構造を有するゲルファイバー集合体の作製
図６に示す同軸フロー型のマイクロ流路デバイスを用いて、上記のように調製したＮａ−Ａｌｇ及びＨＰＣを含むプレゲル溶液を内流として射出し、ＨＰＣゲルファイバー集合体を作製した。プレゲル溶液は，所定量の蒸留水中にＮａ−Ａｌｇが１．０ｗｔ％でかつＨＰＣが２．０〜７．０ｗｔ％となるように溶解後、ＮａＯＨによってｐＨを１３以上としたものを用いた。Ｎａ−Ａｌｇをイオン架橋によってゲル化するための架橋剤として、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を用いた。また、ＨＰＣを共有結合によって架橋しゲル化させるための架橋剤として、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）水溶液を用いた。また、アルギン酸ゲルを除去するための除去剤として、クエン酸ナトリウム水溶液を用いた。
2. Preparation of gel fiber assembly having a bundle structure Using the coaxial flow type microchannel device shown in FIG. 6, the pregel solution containing Na-Alg and HPC prepared as described above was injected as an internal flow, and HPC A gel fiber assembly was prepared. The pregel solution was dissolved in a predetermined amount of distilled water so that Na-Alg was 1.0 wt% and HPC was 2.0 to 7.0 wt%, and then the pH was adjusted to 13 or more with NaOH. A calcium chloride (CaCl 2 ) aqueous solution was used as a crosslinking agent for gelling Na—Alg by ionic crosslinking. Moreover, divinyl sulfone (DVS) aqueous solution was used as a crosslinking agent for bridge | crosslinking HPC by a covalent bond and gelatinizing. Moreover, sodium citrate aqueous solution was used as a removal agent for removing alginate gel.
具体的な操作手順としては、図７に示すように、マイクロ流路中にプレゲル溶液を内流として射出し（流速：３００μＬ／分）、次いで、外流としてＣａＣｌ２水溶液を注入し（流速：２．５ｍＬ／分）、鋳型となるアルギン酸ゲルのゲルファイバーを形成させた。マイクロ流路から流出したゲルファイバーを容器に捕集し、ＤＶＳ水溶液を添加してＨＰＣをゲル化した。これにより、アルギン酸ゲルの骨格内部にＨＰＣがゲル化したゲルファイバー複合体を得た。 As a specific operation procedure, as shown in FIG. 7, the pregel solution is injected into the microchannel as an internal flow (flow rate: 300 μL / min), and then an CaCl 2 aqueous solution is injected as an external flow (flow rate: 2). 5 mL / min), a gel fiber of alginate gel as a template was formed. The gel fibers that flowed out of the microchannel were collected in a container, and an aqueous DVS solution was added to gel HPC. As a result, a gel fiber composite in which HPC was gelated inside the skeleton of the alginate gel was obtained.
プレゲル中のＨＰＣ濃度が２．０、３．０、４．０、５．０、及び７．０ｗｔ％の各条件において、得られたアルギン酸ゲル及びゲルファイバー複合体の光学顕微鏡画像を図８に示す。これによれば、ＨＰＣ濃度が４．０ｗｔ％以上において、ＨＰＣがアルギン酸ゲルの骨格内部に繊維状の形状に保持された状態でゲル化されていることが分かった。複合体の直径は、いずれも４００μｍ程度であった。 FIG. 8 shows optical microscope images of the obtained alginic acid gel and gel fiber complex under the conditions where the HPC concentration in the pregel is 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, and 7.0 wt%. Show. According to this, it was found that when the HPC concentration was 4.0 wt% or more, the HPC was gelled while being held in a fibrous shape inside the skeleton of the alginate gel. The diameters of the composites were all about 400 μm.
得られた複合体にクエン酸ナトリウム水溶液を添加し、鋳型のアルギン酸ゲルを分解除去した結果、４．０ｗｔ％以上のＨＰＣ濃度においてＨＰＣを主骨格とする束状のゲルファイバー集合体が得られることが確認された。ＨＰＣ濃度が、２．０ｗｔ％と７．０ｗｔ％の光学顕微鏡像を図９に示す。７．０ｗｔ％ではきれいな束状の形成が確認できるのに対し、２．０ｗｔ％ではそのような構造は認識されなかった。 As a result of adding a sodium citrate aqueous solution to the resulting composite and decomposing and removing the template alginate gel, a bundle-like gel fiber assembly having HPC as the main skeleton at an HPC concentration of 4.0 wt% or more is obtained. Was confirmed. FIG. 9 shows optical microscope images with HPC concentrations of 2.0 wt% and 7.0 wt%. At 7.0 wt%, a clean bundle-like formation can be confirmed, whereas at 2.0 wt%, such a structure was not recognized.
３．ゲルファイバー集合体の力学的特性の評価
本発明の束状ゲルファイバー集合体の力学的特性を評価するため、水中における引張試験を行った。具体的には，最終濃度で１％のＡｌｇと７％のＨＰＣよりなる混合水溶液から調製した本発明の束状ゲルファイバー集合体（ＢＦ）、及びシリコーンチューブ内（７％ＨＰＣ水溶液）で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲルを水中にて垂直方向に引き上げることで各ゲルが持つヤング率、破断強度を算出した。ファイバーの断面積は、ＮＦでは調製の際に用いたシリコンチューブの内径（５００μｍ）を、ＢＦでは使用したマイクロ流路デバイスから作成される典型的なファイバーの直径（４００μｍ）を用いた。
結果を図１０に示す。
3. Evaluation of Mechanical Properties of Gel Fiber Assembly In order to evaluate the mechanical properties of the bundled gel fiber assembly of the present invention, a tensile test in water was performed. Specifically, it was formed in a bundled gel fiber assembly (BF) of the present invention prepared from a mixed aqueous solution consisting of 1% Alg and 7% HPC at a final concentration, and in a silicone tube (7% HPC aqueous solution). The Young's modulus and the breaking strength of each gel were calculated by pulling up the non-bundle gel of the comparative example composed only of HPC in the vertical direction in water. For the cross-sectional area of the fiber, the inner diameter (500 μm) of the silicon tube used for the preparation was used for NF, and the diameter (400 μm) of a typical fiber made from the microchannel device used for BF.
The results are shown in FIG.
図１０に示すように、本発明のＢＦは、比較例ＮＦの約２倍のヤング率を有し、ＮＦよりも著しく大きい単位断面積あたりの破断荷重を有することが明らかとなった。また、ＢＦは、破断までに初期値の３〜５倍程度の伸びを示し（ＮＦは１．５倍程度）、かつ段階的に破断することが観測された。これらの結果は、本発明の束状ゲルファイバー集合体は、非束状のＨＰＣゲルに比して、伸びやすく、かつ切れ難いという優れた力学的特性を有することを示すものである。 As shown in FIG. 10, the BF of the present invention has a Young's modulus about twice that of Comparative Example NF, and has a breaking load per unit cross-sectional area significantly larger than NF. In addition, BF exhibited an elongation of about 3 to 5 times the initial value until rupture (NF was about 1.5 times), and it was observed that BF was broken in stages. These results indicate that the bundled gel fiber aggregate of the present invention has excellent mechanical properties that it is easy to stretch and hard to break as compared with the non-bundled HPC gel.
４．ゲルファイバー集合体における細胞接着評価
本発明の束状構造を有するゲルファイバー集合体の細胞培養の足場材料への適性を評価した。具体的には，ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を本発明の束状ゲルファイバー集合体（ＢＦ）及びシリコーンチューブ内で形成したＨＰＣのみから構成される比較例の非束状ゲル（ＮＦ）へそれぞれ播種し、培養２時間後及び４８時間後の細胞の接着状況を観察した。
4). Evaluation of Cell Adhesion in Gel Fiber Assembly The suitability of the gel fiber assembly having a bundle structure of the present invention to a scaffold material for cell culture was evaluated. Specifically, human umbilical vein-derived endothelial cells (HUVECs) of a bundled gel fiber assembly (BF) of the present invention and a non-bundle gel (NF) of a comparative example composed only of HPC formed in a silicone tube Each cell was seeded, and the state of cell adhesion after 2 hours and 48 hours of culture was observed.
材料は、
・ヒト臍帯静脈由来内皮細胞，ＥＧＭ２培地
・リピジュア（細胞非接着性ポリマー）
・３５ｍｍ ペトリディッシュ
・Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ，Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核染色）
を用いた。実験手順は、以下のとおりである。
1） リピジュア（10 w/v% in ethanol）を３５ｍｍペトリディッシュに上に５０μＬ滴下し、クリーンベンチ内で風乾させた。
２） １にＥＧＭ−２を加えＢＦ及びＮＦファイバーを入れた。
３） ２に細胞を最終濃度１０００００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２となるように加えた。
４） シェーカー上でゆっくりと振とうさせながら培養を行った。
５） 倒立顕微鏡を用いて、２時間後、４８時間後の細胞を観察した。４８時間後については，核をＨｏｅｃｓｈｔ３３３４２及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ試薬で染色し、細胞の生死と接着形態を評価した。
the material is,
・ Human umbilical vein-derived endothelial cells, EGM2 medium ・ Lipidure (cell non-adhesive polymer)
・ 35mm Petri dish ・ Live / Dead reagent (Calcinin-AM, Ethidium homodimer-1), Hoechst 33342 (nuclear staining)
Was used. The experimental procedure is as follows.
1) 50 μL of lipid (10 w / v% in ethanol) was dropped onto a 35 mm Petri dish and air-dried in a clean bench.
2) EGM-2 was added to 1 and BF and NF fibers were added.
3) Cells were added to 2 to a final concentration of 100,000 cells / cm 2 .
4) Cultivation was performed while gently shaking on a shaker.
5) The cells after 2 hours and 48 hours were observed using an inverted microscope. Forty-eight hours later, the nuclei were stained with Hoecsh 33342 and Live / Dead reagents to evaluate cell viability and adhesion morphology.
結果を図１１に示す。培養２時間後、ＨＵＶＥＣｓはＢＦ上へ接着性（丸い形態）を示した。４８時間後、接着細胞は減少し、形態は丸い状態で伸展細胞はみられなかった。一方で，ＮＦにおいては，培養４８時間後も細胞接着は観察されなかった。以上より，ＢＦは細胞接着性を示したことから細胞足場へ応用可能であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. After 2 hours of culture, HUVECs showed adhesion (round form) on BF. After 48 hours, adherent cells decreased, the morphology was round, and no stretched cells were seen. On the other hand, in NF, cell adhesion was not observed even after 48 hours of culture. From the above, it was clarified that BF can be applied to cell scaffolds because it showed cell adhesion.
以上の実施例の結果は、同軸フロー型のマイクロ流路デバイスにおいて、流路中の動的流れによるシェアストレスを利用することにより、まず鋳型となるゲルファイバーを形成させたうえ、その骨格中に更なるゲルファイバーを形成させるという２−Ｓｔｅｐのゲル化法を用いて、異なる２種のゲルファイバーによって構成される複合体が得られること、そして、当該複合体から鋳型ゲルファイバーを除去することにより、複数のゲルファイバーが束状に集まった新規ゲルファイバー集合体が得られることを実証するものである。また、かかるゲルファイバー集合体が、鋳型ゲルを用いずに作成した非束状のゲルに対して、優れた力学的強度を有し、細胞培養のための足場材料として有用であることを示すものである。従って、本発明のゲルファイバー集合体は、ドラッグデリバリーシステム等の生体材料、或いは刺激応答性のマイクロアクチュエーターへの応用も期待できる。 As a result of the above examples, in the coaxial flow type microchannel device, by using the shear stress due to the dynamic flow in the channel, the gel fiber as the template is first formed and then in the skeleton. By using the 2-Step gelation method of forming additional gel fibers, a composite composed of two different types of gel fibers can be obtained, and by removing the template gel fibers from the composite This demonstrates that a novel gel fiber assembly in which a plurality of gel fibers are gathered in a bundle is obtained. In addition, this gel fiber aggregate has excellent mechanical strength against non-bundled gel prepared without using a template gel, and shows that it is useful as a scaffold material for cell culture. It is. Accordingly, the gel fiber assembly of the present invention can be expected to be applied to biomaterials such as drug delivery systems, or stimulus-responsive microactuators.
以上、本発明の具体的態様を詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。また、特許請求の範囲に記載の発明には、以上の例示した具体的態様を種々変更したものが含まれ得る。 Although specific embodiments of the present invention have been described in detail above, these are merely examples and do not limit the scope of the claims. In addition, the invention described in the claims may include various modifications of the specific embodiments described above.
Claims (19)
ａ）第１のプレゲル剤及び第２のプレゲル剤を含む溶液を調製する工程、ここで、前記第１のプレゲル剤は前記溶液中に溶解した状態であり、前記第２のプレゲル剤は前記溶液中に凝集した状態で存在する、当該工程、
ｂ）前記溶液をマイクロ流路に注入する工程、
ｃ）前記マイクロ流路中に第１の架橋剤を注入することによって、流れ場において前記第１のプレゲル剤をゲル化させて、糸状に伸長した形状を有する鋳型ゲルファイバーを形成する工程、ここで、前記第２のプレゲル剤は前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持される、当該工程、
ｄ）前記鋳型ゲルファイバーを含む溶液に第２の架橋剤を添加することによって、前記鋳型ゲルファイバーの骨格内部に束状の形状で保持された状態で前記第２のプレゲル剤を架橋させ、それにより、前記第２のプレゲル剤が架橋してなるゲルが前記鋳型ゲルファイバーに被覆された構造のゲルファイバー複合体を形成する、当該工程、及び
ｅ）前記ゲルファイバー複合体を含む溶液にゲル除去剤を添加することによって前記鋳型ゲルファイバーを除去して、束状構造を有するゲルファイバー集合体を得る工程、
を含む、該方法。 A method for producing a gel fiber assembly having a structure in which a plurality of gel fibers that are one-dimensionally stretched are bundled,
a) Step of preparing a solution containing a first pregel agent and a second pregel agent, wherein the first pregel agent is in a state dissolved in the solution, and the second pregel agent is the solution The process, present in an aggregated state,
b) injecting the solution into the microchannel;
c) Injecting the first cross-linking agent into the microchannel to gel the first pregel agent in the flow field to form a template gel fiber having a shape elongated in a thread shape, Then, the second pregel agent is held in a bundle shape inside the skeleton of the template gel fiber, the process,
d) adding a second cross-linking agent to the solution containing the template gel fiber to cross-link the second pre-gel agent in a state of being held in a bundle shape inside the skeleton of the template gel fiber; To form a gel fiber composite having a structure in which the gel obtained by crosslinking the second pregel agent is covered with the template gel fiber, and e) removing the gel into the solution containing the gel fiber composite. Removing the template gel fiber by adding an agent to obtain a gel fiber assembly having a bundle structure;
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