JP6203022B2

JP6203022B2 - 走査型顕微鏡

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Description

本発明は、走査型顕微鏡に関し、特に、標本に対して対物レンズやコンデンサレンズの焦点位置を調整する焦点位置調整ユニットを備える走査型顕微鏡に関する。

顕微鏡の分野では、標本に対して焦点位置を調整する方法として様々な方法が提案されているが、その一つとして対物レンズを光軸方向に移動させる方法が知られている。この方法により焦点位置を調整する顕微鏡は、対物レンズが装着されるレボルバ及びレボルバアームが光軸方向に移動するように構成されているのが通常である。このような構成は、例えば、正立型の多光子励起レーザ顕微鏡で、ステージの上方で比較的広いスペースを使用するパッチクランプ法を実行する場合などに好適である。

ところで、落射照明が採用された顕微鏡において対物レンズを光軸方向に移動させると、対物レンズと検出器との間の光路長が変化することに起因して、対物レンズと検出器の間の光学系でケラレが発生することがある。この点について、図１を参照しながら具体的に説明する。

図１は、従来技術に係る多光子励起レーザ顕微鏡１００の構成を例示した図である。多光子励起レーザ顕微鏡１００は、照明光路上にある対物レンズ１０７の瞳Ｐの位置と光学的に共役な位置（以降、瞳共役位置と記す）にＸＹスキャナ１０２を備え、且つ、検出光路上にある対物レンズ１０７の瞳共役位置にノンデスキャン検出器（ＮＤＤとも記す。）として光電子増倍管（以降、ＰＭＴと記す）１０９を備える走査型顕微鏡である。なお、リレー光学系１０３は、対物レンズ１０７の瞳ＰをＸＹスキャナ１０２にリレーする光学系であり、リレー光学系１０８は、対物レンズ１０７の瞳ＰをＰＭＴ１０９にリレーする光学系である。

多光子励起レーザ顕微鏡１００では、レーザ光源１０１から出射されたレーザ光Ｌ１（図１の一点鎖線）の照射により標本Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ１０７で平行光束に変換される。その後、蛍光は、ダイクロイックミラー１０４で反射し、リレー光学系１０８を介してＰＭＴ１０９に入射する。

多光子励起レーザ顕微鏡１００で、焦点位置を調整するために対物レンズ１０７を光軸方向に移動させると、レボルバ１０６及びレボルバアーム１０５は対物レンズ１０７とともに光軸方向に移動するのに対して、ダイクロイックミラー１０４は移動しない。このため、対物レンズ１０７からダイクロイックミラー１０４までの距離が変化することになる。

対物レンズ１０７から光軸と平行に出射される蛍光の軸上光束Ｌ２（図１の破線）は、対物レンズ１０７とダイクロイックミラー１０４の間の距離が変化しても、ダイクロイックミラー１０４の同じ位置に入射する。これに対して、対物レンズ１０７から光軸に対して角度を持って出射される蛍光の軸外光束Ｌ３（図１の点線）は、対物レンズ１０７とダイクロイックミラー１０４の間の距離が長くなりすぎると、ダイクロイックミラー１０４から逸れてしまい、ケラレが生じる可能性がある。

このような焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制する技術は、例えば、特許文献１、特許文献２に開示されている。

特許文献１には、対物レンズと、対物レンズ交換器の合焦のために必要な案内部との間に、デカップリング部および検出器が設けられた構成が開示されている（特許文献１の段落［０００９］）。このような構成では、焦点位置を調整するときに対物レンズとともに検出系全体が移動することになるため、対物レンズから検出器までの光路長が変化せず、ケラレが生じにくい。

特許文献２には、光路分割手段と検出器とを備える顕微鏡対物レンズが開示されている（特許文献２の段落［００１０］）。このような構成では、対物レンズ内に検出系が設けられているため、標本（つまり、焦点位置）から検出器までの距離は常に一定であり、ケラレが生じにくい。

特開２００９−１８１１２３号公報特開２００８−１９７１２７号公報

ところで、近年、上述した多光子励起レーザ顕微鏡のような非線形光学顕微鏡の分野では、多チャンネル化の要請が高まっていて、複数の検出器を備える顕微鏡が少なくない。

しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示される技術を採用する場合、複数の検出器を設けるスペースを確保することは難しい。仮に複数の検出器を設けるスペースが確保できたとしても、対物レンズまたはその周辺構造が大型化することになる。このため、利用者が標本を操作するためのステージ上方のスペースが狭くなってしまい、パッチクランプ法の実行が困難となる。

さらに、対物レンズまたはその周辺構造の大型化に伴う重量の増加により、それらを保持する保持機構には従来に比べて高い耐荷重及び剛性が要求されること、対物レンズを光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットが対物レンズを精度良く移動させることが困難となること、といった課題も生じる。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる軽量でコンパクトな焦点位置調整ユニットを備える走査型顕微鏡を提供することを課題とする。

本発明の第１の態様は、標本からの検出光を取り込む集光レンズと、前記集光レンズとともに前記集光レンズの光軸方向に移動して、前記集光レンズを前記光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットと、前記集光レンズの瞳と光学的に共役な位置に配置された検出器と、前記集光レンズの瞳を前記検出器にリレーするリレー光学系と、を備え、前記リレー光学系は、前記焦点位置調整ユニット内に配置され、前記集光レンズで平行光束に変換された前記検出光を収斂光束に変換して前記焦点位置調整ユニット外に出射させる、正のパワーを有する第１の光学素子と、前記焦点位置調整ユニット外であって前記第１の光学素子よりも前記検出器側に配置される第２の光学素子と、を備える走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の走査型顕微鏡において、さらに、前記焦点位置調整ユニット内であって且つ前記第１の光学素子よりも前記集光レンズ側に配置された、前記検出光の光路と前記標本に照射される照明光の光路を波長によって分岐させる波長分岐素子を備える走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の走査型顕微鏡において、さらに、前記焦点位置調整ユニット内であって且つ前記波長分岐素子よりも前記検出器側に配置された、前記検出光を前記集光レンズの光軸と平行な方向に偏向させる偏向素子を備え、前記波長分岐素子は、前記検出光を反射させ、前記照明光を透過させる光学素子である走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第４の態様は、第２の態様に記載の走査型顕微鏡において、さらに、前記波長分岐素子は、前記検出光を反射させ、前記照明光を透過させる光学素子であり、前記第１の光学素子は、前記検出光を前記集光レンズの光軸と平行な方向に偏向させる偏向素子である走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の走査型顕微鏡において、前記第１の光学素子は、凹面ミラーである走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第６の態様は、第４の態様に記載の走査型顕微鏡において、前記第１の光学素子は、デフォーマブルミラーである走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の走査型顕微鏡において、前記第１の光学素子は、焦点距離が可変な光学系である走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第８の態様は、第１の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の走査型顕微鏡において、前記焦点位置調整ユニットは、落射検出光路に設けられる走査型顕微鏡を提供する。

本発明の第９の態様は、第１の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の走査型顕微鏡において、前記焦点位置調整ユニットは、透過検出光路に設けられる走査型顕微鏡を提供する。

本発明によれば、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる軽量でコンパクトな焦点位置調整ユニットを備える走査型顕微鏡を提供することができる。

従来技術に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。本発明の実施例１に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。図２に示す多光子励起レーザ顕微鏡のハウンジング内の構成の変形例を示した図である。図２に示す多光子励起レーザ顕微鏡のハウンジング内の構成の別の変形例を示した図である。本発明の実施例２に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。本発明の実施例３に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。本発明の実施例４に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。本発明の実施例５に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。本発明の実施例６に係る多光子励起レーザ顕微鏡の構成を例示した図である。

図２は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡２００の構成を例示した図である。多光子励起レーザ顕微鏡２００は、ステージ２０８に配置された標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡である。多光子励起レーザ顕微鏡２００では、落射照明が採用されていて、標本Ｓからの検出光である蛍光（軸上光束Ｌ２、軸外光束Ｌ３）を取り込む対物レンズ２０７を介して、照明光（励起光）であるレーザ光Ｌ１が標本Ｓに照射される。なお、図１では、レーザ光Ｌ１は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡２００は、照明光路上にある対物レンズ２０７の瞳Ｐの位置と光学的に共役な位置（瞳共役位置）にＸＹスキャナ２０２を備え、且つ、検出光路上にある対物レンズ２０７の瞳共役位置にノンデスキャン検出器としてＰＭＴ２１１を備える走査型顕微鏡である。

多光子励起レーザ顕微鏡２００は、照明光路上に、レーザ光Ｌ１を出射するレーザ光源２０１と、レーザ光Ｌ１で標本Ｓを走査するための走査手段であるＸＹスキャナ２０２と、対物レンズ２０７の瞳ＰをＸＹスキャナ２０２にリレーするリレー光学系２０３と、レーザ光Ｌ１を対物レンズ２０７の光軸方向に偏向させるミラー２０４と、レーザ光Ｌ１の光路と蛍光（軸上光束Ｌ２、軸外光束Ｌ３）の光路とを波長によって分岐させる波長分岐素子であるダイクロイックミラー２２１と、対物レンズ２０７を備えている。なお、ダイクロイックミラー２２１は、レーザ光Ｌ１を透過させ蛍光を反射させるダイクロイックミラーである。また、ＸＹスキャナ２０２は、例えば、ガルバノミラーである。

対物レンズ２０７は、レボルバアーム２０５に支持されたレボルバ２０６に取り付けられている。さらに、レボルバアーム２０５上には、ダイクロイックミラー２２１が内部に配置されたハウジング２２０が設けられている。

レボルバ２０６、レボルバアーム２０５、及びハウジング２２０は、対物レンズ２０７を光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットであり、対物レンズ２０７とともに光軸方向に移動する。多光子励起レーザ顕微鏡２００では、落射照明光路に設けられた焦点位置調整ユニットが対物レンズ２０７を光軸方向に移動させることにより、標本Ｓに対して対物レンズ２０７の焦点位置が調整される。

多光子励起レーザ顕微鏡２００は、検出光路上に、対物レンズ２０７と、ダイクロイックミラー２２１と、対物レンズ２０７で平行光束に変換された蛍光を収斂光束に変換する正のパワーを有するレンズ２２２と、蛍光を対物レンズ２０７の光軸と平行な方向に偏向させる偏向素子であるミラー２２３と、ミラー２０９と、正のパワーを有するレンズ２１０と、ＰＭＴ２１１を備えている。なお、ダイクロイックミラー２２１、レンズ２２２、及びミラー２２３は、ハウジング２２０内（つまり、焦点位置調整ユニット内）に配置されているため、対物レンズ２０７とともに光軸方向に移動する。

焦点位置調整ユニット内に配置されたレンズ２２２と、顕微鏡本体内（つまり、焦点位置調整ユニット外）であってレンズ２２２よりもＰＭＴ２１１側に配置されたレンズ２１０は、対物レンズ２０７の瞳ＰをＰＭＴ２１１にリレーするリレー光学系を構成している。即ち、レンズ２２２、レンズ２１０は、それぞれリレー光学系の第１の光学素子、第２の光学素子である。

以上のように構成された多光子励起レーザ顕微鏡２００では、ダイクロイックミラー２２１がレボルバアーム２０５上に固定されたハウジング２２０内に配置されている。このため、対物レンズ２０７が光軸方向へ移動しても、対物レンズ２０７からダイクロイックミラー２２１までの距離は変化しない。従って、焦点位置の調整のために対物レンズ２０７を光軸方向に移動させても、軸外光束Ｌ３はダイクロイックミラー２２１の一定の位置に入射するため、焦点位置の調整に伴うダイクロイックミラー２２１でのケラレの発生を防止することができる。

また、多光子励起レーザ顕微鏡２００では、正のパワーを有するレンズ２２２がハウジング２２０であってダイクロイックミラー２２１とミラー２２３の間に配置されている。このため、対物レンズ２０７で平行光束に変換されてハウジング２２０に入射した蛍光は、レンズ２２２で収斂光束に変換されて、ハウジング２２０（焦点位置調整ユニット）外に出射される。これにより、焦点位置の調整に伴う、レンズ２２２よりもＰＭＴ２１１側でのケラレの発生を抑制することができる。

この点についてさらに詳細に説明する。対物レンズ２０７の瞳Ｐから光軸に対して傾いて出射する軸外光束Ｌ３の主光線が、レンズ２２２の正のパワーにより内向きに屈折し、軸外光束Ｌ３の主光線の方向がレンズ２２２の光軸方向に近くなる。つまり、軸外光束Ｌ３の主光線の角度が抑えられる。このため、焦点位置の調整のために対物レンズ２０７を対物レンズ２０７の光軸方向に移動させてミラー２２３とミラー２０９の間の距離が変化しても、距離が変化するミラー２２３とミラー２０９の間を通る前に軸外光束Ｌ３の主光線の角度が抑えられているため、軸外光束Ｌ３の主光線が光軸から大きく離れた位置を通ることを防止することができる。従って、レンズ２２２よりもＰＭＴ２１１側の光学素子、特に、顕微鏡本体内の光学素子、でのケラレが発生を抑制することができる。

また、レンズ２２２の正のパワーにより蛍光を収斂光束に変換することで、レンズ２２２から顕微鏡本体内にある対物レンズ２０７の焦点位置（標本Ｓ）と光学的に共役な位置（像共役位置）までの間、軸外光束Ｌ３の光束径は徐々に細くなっていく。このため、レンズ２２２から像共役位置までの間にある光学素子では、レンズ２２２がない場合に比べて光束径が細い軸外光束Ｌ３が入射することになる。従って、軸外光束Ｌ３が光軸から離れた位置を通過している場合であっても、軸外光束Ｌ３の一部又は全部が光学素子からはみ出しにくくなるため、レンズ２２２よりもＰＭＴ２１１側の光学素子でのケラレが発生を抑制することができる。

このように、多光子励起レーザ顕微鏡２００によれば、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができるため、標本Ｓ内で散乱した蛍光を含む標本Ｓで発生した蛍光を効率よく検出することができる。従って、明るい画像を得ることができる。

さらに、多光子励起レーザ顕微鏡２００では、ＰＭＴ２１１は焦点位置調整ユニット内に配置されておらず、焦点位置調整ユニット内に配置される光学素子は比較的小型で軽量なものである。このため、焦点位置調整ユニットを軽量でコンパクトに構成することができる。従って、ステージ２０８上方のスペースを十分に確保しつつ、高精度な焦点位置の調整が可能である。

なお、蛍光がレンズ２２２に平行光束として入射し、且つ、レンズ２２２で収斂光束に変換された蛍光がミラー２０９に向かってハウジングから出射する限り、ハウジング内の光学素子の配置は、様々に変形することができる。例えば、図３Ａに示すハウジング２３０のように、ダイクロイックミラー２２１の特性に応じてダイクロイックミラー２２１を対物レンズ２０７の光軸に対して４５度以外の角度に配置してもよい。この場合、他の光学素子（レンズ２２２、ミラー２２３）の向きはダイクロイックミラー２２１の向きに合せて調整される。また、図３Ｂに示すハウジング２４０のように、レンズ２２２をミラー２２３よりもＰＭＴ２１１側に配置しても良い。即ち、レンズ２２２及びミラー２２３は、ダイクロイックミラー２２１よりもＰＭＴ２１１側に配置されていれば良く、ダイクロイックミラー２２１は、レンズ２２２よりも対物レンズ２０７側に配置されていれば良い。

また、レンズ２２２が単焦点レンズに限られず、焦点距離が可変な光学系である可変焦点レンズであってもよい。レンズ２２２を可変焦点レンズにして対物レンズのＺ位置に応じて焦点距離を変化させることで、対物レンズのＺ位置によらずＰＭＴ２１１に入射する蛍光の光束径を最適化することができる。また、焦点距離が長いレンズをレンズ２２２として用いることで、軸外光束Ｌ３が収斂または発散する角度が緩やかになる。従って、焦点距離の長いレンズ２２２はレンズ２２２よりもＰＭＴ２１１側の光学素子でのケラレの発生を抑制する上で望ましい。

さらに、レーザ光源２０１とＸＹスキャナ２０２の間には、種々の光学素子を配置しても良い。例えば、音響光学素子（ＡＯＭ：Acousto-Optic Modulator）、ビームエクスパンダ、複数のレーザ光を合成するためのダイクロイックミラーなどのレーザ合成素子、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal On Silicon）やＤＭＤ（Digital Mirror Device）などの波面補正素子が配置されても良い。

図４は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡３００の構成を例示した図である。なお、図４でも、レーザ光Ｌ１は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡３００は、ステージ２０８に配置された標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡である点、落射照明が採用されている点は、実施例１に係る多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様である。多光子励起レーザ顕微鏡３００は、複数のＰＭＴを備えて多チャンネル化されている点が、多光子励起レーザ顕微鏡２００と異なっている。

多光子励起レーザ顕微鏡３００は、顕微鏡本体内部のミラー２０９とレンズ２１０との間にダイクロイックミラー３０１を備え、さらに、ダイクロイックミラー３０１の反射光路上にレンズ３０２とＰＭＴ３０３とを備えている。これにより、多光子励起レーザ顕微鏡３００によれば、複数の蛍光色素を用いたマルチカラーイメージングが可能となる。

なお、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる点、軽量でコンパクトな焦点位置調整ユニットによりステージ２０８上方のスペースを十分に確保しつつ、高精度な焦点位置の調整が可能である点は、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様である。
また、多光子励起レーザ顕微鏡３００も、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に種々の変形が可能である。

図５は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡４００の構成を例示した図である。なお、図５でも、レーザ光Ｌ１は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡４００は、ステージ２０８に配置された標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡である点、落射照明が採用されている点は、実施例１に係る多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様である。多光子励起レーザ顕微鏡４００は、ハウジング２２０の代わりにハウジング４１０を備える点が、多光子励起レーザ顕微鏡２００と異なっている。

ハウジング４１０は、内部にダイクロイックミラー２２１を備える点はハウジング２２０と同様である。ただし、レンズ２２２及びミラー２２３の代わりに正のパワーを有する凹面ミラー４１１をハウジング４１０内（つまり、焦点位置調整ユニット内）に備える点が異なっている。

多光子励起レーザ顕微鏡４００では、凹面ミラー４１１とレンズ２１０が、対物レンズ２０７の瞳ＰをＰＭＴ２１１にリレーするリレー光学系を構成している。ダイクロイックミラー２２１よりもＰＭＴ２１１側に配置された凹面ミラー４１１は、対物レンズ２０７で平行光束に変換された蛍光を収斂光束に変換してミラー２０９に向かって焦点位置調整ユニット外に出射させる。つまり、凹面ミラー４１１は、リレー光学系を構成する第１の光学素子であり、且つ、蛍光を対物レンズ２０７の光軸方向に偏向させる偏向素子である。

多光子励起レーザ顕微鏡４００によっても、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる。また、レンズ２２２及びミラー２２３の代わりに凹面ミラー４１１を用いられるため、焦点位置調整ユニット内の光学素子の数を減らすことができる。従って、焦点位置調整ユニットをより軽量でコンパクトに構成することが可能となり、焦点位置調整ユニットによりステージ２０８上方のスペースを十分に確保しつつ、高精度な焦点位置の調整が可能である。

なお、多光子励起レーザ顕微鏡４００は、凹面ミラー４１１の代わりに、焦点距離が可変な光学系であるデフォーマブルミラーを用いてもよい。デフォーマブルミラーを用いることで、対物レンズのＺ位置によらず、ＰＭＴ２１１に入射する蛍光の光束径を最適化することができる。さらに、多光子励起レーザ顕微鏡４００は、実施例２に係る多光子励起レーザ顕微鏡３００のように、複数のＰＭＴを備えて多チャンネル化されてもよい。また、レーザ光源２０１とＸＹスキャナ２０２の間に種々の光学素子が配置されても良く、ダイクロイックミラー２２１の特性に応じてダイクロイックミラー２２１を対物レンズ２０７の光軸に対して４５度以外の角度に配置してもよい。

図６は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡５００の構成を例示した図である。なお、図６でも、レーザ光Ｌ１は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡５００は、ステージ２０８に配置された標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡である点、落射照明が採用されている点は、実施例１に係る多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様である。多光子励起レーザ顕微鏡５００は、レーザ光Ｌ１の光路と蛍光（軸上光束Ｌ２、軸外光束Ｌ３）の光路とを波長によって分岐させる波長分岐素子であるダイクロイックミラー５１１の反射光路上にレーザ光源２０１などを含む照明手段を備え、ダイクロイックミラー５１１の透過光路上にＰＭＴ２１１などを含む検出手段を備えている点が、多光子励起レーザ顕微鏡２００と異なっている。

多光子励起レーザ顕微鏡５００は、上記のような構成を実現するために、ハウジング２２０の代わりにハウジング５１０を備えている。ハウジング５１０の内部には、ダイクロイックミラー２２１の代わりにレーザ光Ｌ１を反射させ蛍光を透過させるダイクロイックミラー５１１が配置されていて、さらに、レンズ２２２がダイクロイックミラー５１１の透過光路上に配置されている点が、ハウジング２２０と異なっている。

多光子励起レーザ顕微鏡５００によっても、レンズ２２２が対物レンズ２０７で平行光束に変換された蛍光を収斂光束に変換して焦点位置調整ユニット外に出射させることで、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる。また、軽量でコンパクトな焦点位置調整ユニットによりステージ２０８上方のスペースを十分に確保しつつ、高精度な焦点位置の調整が可能である。

なお、多光子励起レーザ顕微鏡５００も、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に種々の変形が可能である。また、多光子励起レーザ顕微鏡５００は、実施例２に係る多光子励起レーザ顕微鏡３００のように、複数のＰＭＴを備えて多チャンネル化されてもよい。

図７は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡６００の構成を例示した図である。なお、図７では、レーザ光Ｌ１及び光ファイバー光源６０２からの照明光Ｌ４は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡６００は、ステージ６０１に配置された標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡である点は、実施例１に係る多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様である。多光子励起レーザ顕微鏡６００は、対物レンズ２０７側から透過照明を行い、コンデンサレンズ６０８側で透過検出を行うことが可能となっている点が、多光子励起レーザ顕微鏡２００と異なっている。また、コンデンサレンズ６０８側から透過照明を行い、図示しない接眼レンズで標本Ｓ１の明視野観察を行うことが可能となっている点も多光子励起レーザ顕微鏡２００とは異なっている。

多光子励起レーザ顕微鏡６００は、透過照明を可能とするために、ステージ２０８の代わりに光を透過するステージ６０１が設けられている。ステージ６０１上には、ガラスボトムディッシュなど光を透過する部材で作られたディッシュが配置され、ディッシュ内に標本Ｓ１が配置されている。さらに、ステージ６０１の下方には、コンデンサレンズ６０８が配置されている。

コンデンサレンズ６０８は、コンデンサレンズ６０８の焦点位置を調整するための焦点位置調整ユニット６２０によりコンデンサレンズ６０８の光軸方向に移動するように構成されている。多光子励起レーザ顕微鏡６００は、焦点位置調整ユニット６２０の内部に、コンデンサレンズ６０８の光軸に対して挿脱可能に配置されたミラー６２１と、正のパワーを有するレンズ６２２と、ミラー６２３を備えていて、これらは、コンデンサレンズ６０８とともに、コンデンサレンズ６０８の光軸方向に移動する。なお、ミラー６２１は、レーザ光源２０１からのレーザ光で透過照明を行う間はコンデンサレンズ６０８の光軸上に配置され、後述する光ファイバー光源６０２からの照明光で透過照明を行う間はコンデンサレンズ６０８の光軸上から取り除かれて、光路外に配置される。また、光ファイバー光源６０２からの照明光で透過照明を行う間は、ミラー２０４も対物レンズ２０７の光軸上から取り除かれて、光路外に配置される。

多光子励起レーザ顕微鏡６００は、コンデンサレンズ６０８側からの透過照明を可能とするために、ハロゲンランプ６０３と光ファイバー６０４からなる光ファイバー光源６０２を備えている。光ファイバー光源６０２からの照明光Ｌ４は、顕微鏡本体内に設けられた、レンズ６０５、ミラー６０６、レンズ６０７を介してコンデンサレンズ６０８の瞳位置に集光した後、コンデンサレンズ６０８に入射し、標本Ｓ１に下方から照射される。即ち、光ファイバー光源６０２からの照明光Ｌ４によりケーラー照明が行われる。
なお、コンデンサレンズ６０８側からの透過照明で標本Ｓ１を透過した光は、対物レンズ２０７、ダイクロイックミラー２２１を介して目視観察光路に入射し、目視観察用鏡筒を通って接眼レンズに入射する。これにより、ステージ６０１上における標本Ｓ１の位置決め等に用いられる目視観察が可能となる。

多光子励起レーザ顕微鏡６００は、対物レンズ２０７側からの透過照明による検出を可能とするために、顕微鏡本体に取り付けられた外部検出ユニット６１２を備えている。外部検出ユニット６１２は、その内部に、ミラー６０９と、正のパワーを有するレンズ６１０と、コンデンサレンズ６０８の瞳共役位置に配置されたＰＭＴ６１１を備えていて、ミラー６０９がミラー６２３の反射光路上に位置するように取り付けられる。なお、レンズ６１０は、レンズ６２２とともに、コンデンサレンズ６０８の瞳をＰＭＴ６１１にリレーするリレー光学系を構成している。

レーザ光源２０１からのレーザ光Ｌ１が照射された標本Ｓ１からの蛍光のうち、コンデンサレンズ６０８に取り込まれた蛍光は、コンデンサレンズ６０８で平行光束に変換されて、焦点位置調整ユニット６２０に入射する。その後、蛍光は、ミラー６２１で反射し、レンズ６２２で収斂光束に変換される。さらに、ミラー６２３でコンデンサレンズ６０８の光軸と平行な方向に偏向されて、焦点位置調整ユニット６２０から出射し外部検出ユニット６１２に入射する。外部検出ユニット６１２に入射した蛍光は、ミラー６０９及びレンズ６１０を介して、ＰＭＴ６１１に入射して、検出される。

このように、多光子励起レーザ顕微鏡６００は、対物レンズ２０７を光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットとコンデンサレンズ６０８を光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニット６２０を含んでいる。対物レンズ２０７を光軸方向に移動させる、レボルバ２０６、レボルバアーム２０５及びハウジング２２０からなる焦点位置調整ユニットは、レーザ光源２０１からのレーザ光Ｌ１で照明する場合の落射検出光路上に設けられている。一方、コンデンサレンズ６０８を光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニット６２０は、レーザ光源２０１からのレーザ光Ｌ１で照明する場合の透過検出光路上に設けられている。

以上のように構成された多光子励起レーザ顕微鏡６００では、対物レンズ２０７及びコンデンサレンズ６０８の各々の焦点位置調整ユニットにより、各々の焦点位置の調整が行われる。特に、透過照明を行う場合には、対物レンズ２０７とコンデンサレンズ６０８の焦点位置が一致するように調整される。

多光子励起レーザ顕微鏡６００によっても、焦点位置調整ユニット内に配置されたレンズ（レンズ２２２、レンズ６２２）が、集光レンズ（対物レンズ２０７、コンデンサレンズ６０８）で平行光束に変換された蛍光を収斂光束に変換して焦点位置調整ユニット外に出射させることで、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に、焦点位置の調整に伴うケラレの発生を抑制することができる。また、軽量でコンパクトな焦点位置調整ユニットによりステージ６０１上方のスペースを十分に確保しつつ、高精度な焦点位置の調整が可能である。さらに、多光子励起レーザ顕微鏡６００によれば、蛍光の落射検出と透過検出の両方が可能である。

なお、多光子励起レーザ顕微鏡６００も、多光子励起レーザ顕微鏡２００と同様に種々の変形が可能である。また、多光子励起レーザ顕微鏡６００は、実施例２に係る多光子励起レーザ顕微鏡３００のように、複数のＰＭＴを備えて多チャンネル化されてもよい。また、多光子励起レーザ顕微鏡６００は、実施例３に係る多光子励起レーザ顕微鏡４００のように、焦点位置調整ユニット内に、正のパワーのレンズの役割と偏向素子であるミラーの役割を兼ねた凹面ミラーを備えても良い。また、多光子励起レーザ顕微鏡６００は、実施例４に係る多光子励起レーザ顕微鏡５００のように、焦点位置調整ユニット内であって波長分岐手段の透過光路上に正のパワーを備える第１の光学素子を備え、波長分岐手段の透過光路上に検出手段を備えても良い。また、レーザ光源２０１を光ファイバー光源として構成してもよい。光ファイバー光源は、顕微鏡本体への熱の伝達を抑制することができるという点で望ましい。

図８は、本実施例に係る多光子励起レーザ顕微鏡７００の構成を例示した図である。なお、図８でも、レーザ光Ｌ１は一点鎖線で、蛍光のうち軸上光束Ｌ２は破線で、蛍光のうち軸外光束Ｌ３は点線で示されている。

多光子励起レーザ顕微鏡７００は、ステージ６０１に配置された標本Ｓを下方から観察する倒立顕微鏡である点が、実施例５に係る多光子励起レーザ顕微鏡６００と異なっている。このため、多光子励起レーザ顕微鏡７００では、ステージ６０１の下方に、焦点位置調整ユニットにより光軸方向に移動する対物レンズ２０７が配置され、ステージ６０１の上方に、焦点位置調整ユニット６２０により光軸方向に移動するコンデンサレンズ６０８が配置されている。即ち、多光子励起レーザ顕微鏡７００では、多光子励起レーザ顕微鏡６００においてステージ６０１の上方に有った構成がステージ６０１の下方に配置され、多光子励起レーザ顕微鏡６００においてステージ６０１の下方に有った構成がステージ６０１の上方に配置されている。その他の点は、実施例５に係る多光子励起レーザ顕微鏡６００と同様である。

多光子励起レーザ顕微鏡７００によっても、実施例５に係る多光子励起レーザ顕微鏡６００と同様の効果を得ることができる。また、多光子励起レーザ顕微鏡７００も、多光子励起レーザ顕微鏡６００と同様に種々の変形が可能である。

上述した実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。各実施例に記載された走査型顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。例えば、上述した実施例では、多光子励起レーザ顕微鏡が例示されているが、本願発明の顕微鏡は、多光子励起レーザ顕微鏡に限られず、走査型の顕微鏡であってノンデスキャン検出器を備えた顕微鏡であればよい。また、焦点位置調整ユニットは、対物レンズを光軸方向に移動させるものに限られず、コンデンサレンズを光軸方向に移動させるものであっても良い。焦点位置調整ユニットは、標本からの検出光を取り込む集光レンズ（対物レンズ、コンデンサレンズ）を光軸方向に移動させるものであれば良い。

１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００多光子励起レーザ顕微鏡
１０１、２０１レーザ光源
１０２、２０２ＸＹスキャナ
１０３、１０８、２０３リレー光学系
１０４，２２１、３０１、５１１ダイクロイックミラー
１０５、２０５レボルバアーム
１０６、２０６レボルバ
１０７、２０７対物レンズ
１０９、２１１、３０３、６１１ＰＭＴ
２０４、２０９、２２３、５１３、６０６、６０９、６２１、６２３ミラー
２０８、６０１ステージ
２１０、２２２、３０２、５１２、６０５、６０７、６１０、６２２レンズ
２２０、２３０、２４０、４１０、５１０ハウジング
４１１凹面ミラー
６０２光ファイバー光源
６０３ハロゲンランプ
６０４光ファイバー
６０８コンデンサレンズ
６１２外部検出ユニット
６２０焦点位置調整ユニット
Ｐ瞳
Ｓ、Ｓ１標本
Ｌ１レーザ光
Ｌ２軸上光束
Ｌ３軸外光束
Ｌ４照明光

Claims

標本からの検出光を取り込む集光レンズと、
前記集光レンズとともに前記集光レンズの光軸方向に移動して、前記集光レンズを前記光軸方向に移動させる焦点位置調整ユニットと、
前記集光レンズの瞳と光学的に共役な位置に配置された検出器と、
前記集光レンズの瞳を前記検出器にリレーするリレー光学系と、を備え、
前記リレー光学系は、
前記焦点位置調整ユニット内に配置され、前記集光レンズで平行光束に変換された前記検出光を収斂光束に変換して前記焦点位置調整ユニット外に出射させる、正のパワーを有する第１の光学素子と、
前記焦点位置調整ユニット外であって前記第１の光学素子よりも前記検出器側に配置される第２の光学素子と、を備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、さらに、
前記焦点位置調整ユニット内であって且つ前記第１の光学素子よりも前記集光レンズ側に配置された、前記検出光の光路と前記標本に照射される照明光の光路を波長によって分岐させる波長分岐素子を備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項２に記載の走査型顕微鏡において、さらに、
前記焦点位置調整ユニット内であって且つ前記波長分岐素子よりも前記検出器側に配置された、前記検出光を前記集光レンズの光軸と平行な方向に偏向させる偏向素子を備え、
前記波長分岐素子は、前記検出光を反射させ、前記照明光を透過させる光学素子である
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項２に記載の走査型顕微鏡において、さらに、
前記波長分岐素子は、前記検出光を反射させ、前記照明光を透過させる光学素子であり、
前記第１の光学素子は、前記検出光を前記集光レンズの光軸と平行な方向に偏向させる偏向素子である
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項４に記載の走査型顕微鏡において、
前記第１の光学素子は、凹面ミラーである
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項４に記載の走査型顕微鏡において、
前記第１の光学素子は、デフォーマブルミラーである
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記第１の光学素子は、焦点距離が可変な光学系である
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記焦点位置調整ユニットは、落射検出光路に設けられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記焦点位置調整ユニットは、透過検出光路に設けられる
ことを特徴とする走査型顕微鏡。