JP6153292B2 - Compound-linked glycoprotein - Google Patents
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Description
本発明は糖タンパク質及び化合物連結糖タンパク質に関する。 The present invention relates to glycoproteins and compound-linked glycoproteins.
糖タンパク質は、細胞の相互認識、増殖、分化、又はがん化等において重要な役割を果たすことが知られている。例えば、血球細胞の細胞膜上に存在する膜タンパク質の一種であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１は、炎症した血管内皮細胞特異的に発現するＰ−セレクチンと結合することにより、炎症部位への血球細胞の遊走を仲介している。 Glycoproteins are known to play an important role in mutual recognition, proliferation, differentiation, or canceration of cells. For example, P-selectin glycoprotein ligand-1, which is a kind of membrane protein present on the cell membrane of blood cells, binds to P-selectin expressed specifically in inflamed vascular endothelial cells, thereby causing blood cells to enter the inflamed site. It mediates cell migration.
糖タンパク質に化合物を連結すれば、このような糖タンパク質の機能を利用することができると考えられる。例えば糖タンパク質として生体内の特定部位に局在（又は集積）する糖タンパク質を採用すれば、連結した化合物を特定細胞上に効率的に伝達することが可能になると考えられる。 It is considered that such a function of glycoprotein can be utilized by linking a compound to the glycoprotein. For example, if a glycoprotein that is localized (or accumulated) at a specific site in a living body is employed as a glycoprotein, it is considered that a linked compound can be efficiently transmitted onto a specific cell.
また、糖タンパク質に他の化合物を連結すれば、糖タンパク質の性質を改善することもできると考えられる。例えば、ポリエチレングリコールは肝臓での代謝を阻害するため、糖タンパク質に連結することにより糖タンパク質の血中寿命を延ばすことができると考えられる。 It is also considered that the properties of glycoprotein can be improved by linking other compounds to the glycoprotein. For example, since polyethylene glycol inhibits metabolism in the liver, it is thought that the blood life of glycoprotein can be extended by linking to glycoprotein.
一方、タンパク質に他の化合物を連結する技術が各種知られている。一例として、特許文献１には、タンパク質を構成するアミノ酸上の官能基（アミノ基又はカルボキシル基）を介して、ポリエチレングリコールを連結する技術について記載されている。
On the other hand, various techniques for linking other compounds to proteins are known. As an example,
しかしながら、上記技術を採用して糖タンパク質に他の化合物を連結する場合、連結される他の化合物を、アミノ酸上の官能基と反応するように修飾する必要があるため、化合物連結糖タンパク質の製造が煩雑なものとなる。 However, when other compounds are linked to the glycoprotein using the above technique, it is necessary to modify the linked other compound so that it reacts with a functional group on the amino acid. Becomes complicated.
本発明は、他の化合物を容易に連結できるように修飾された糖タンパク質、さらには他の化合物が連結された糖タンパク質を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a glycoprotein modified so that another compound can be easily linked, and further a glycoprotein to which another compound is linked.
本発明者等は、鋭意研究の結果、糖タンパク質中の糖鎖を構成する少なくとも１つの糖残基が、メタクリロイル基のような反応性基で置換された糖残基で置き換えられている糖タンパク質を用いることにより、該糖タンパク質に他の化合物を容易に連結できることを見出した。糖鎖は糖タンパク質の機能の発揮に重要であるため、糖鎖部分に改変が加えられた糖タンパク質は、糖タンパク質本来の機能を発揮できない可能性が示唆されていた。ところが、驚くべきことに本発明の糖タンパク質は、糖タンパク質本来の機能を損なうことなく発揮できることが示された。これらの知見に基づき、さらに研究を進めることにより本発明が完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that at least one sugar residue constituting a sugar chain in a glycoprotein is replaced with a sugar residue substituted with a reactive group such as a methacryloyl group. It was found that other compounds can be easily linked to the glycoprotein by using. Since sugar chains are important for exerting the functions of glycoproteins, it has been suggested that glycoproteins modified in the sugar chain portion may not exhibit their original functions. However, it was surprisingly shown that the glycoprotein of the present invention can be exhibited without impairing the original function of the glycoprotein. Based on these findings, the present invention was completed by further research.
即ち、本発明は、下記の構成を有するものを包含する。 That is, this invention includes what has the following structure.
項１．糖鎖を構成する少なくとも１つの糖残基が、一般式（１）：
［式中、Ｒは水素又は炭素数１〜３のアルキル基を示す］
で表される基で置換された糖残基で置き換えられている、糖タンパク質。
[Wherein R represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]
A glycoprotein substituted with a sugar residue substituted with a group represented by
項２．糖鎖末端に存在する少なくとも１つの糖残基が、一般式（１）で表される基で置換された糖残基で置き換えられている、請求項１に記載の糖タンパク質。
項３．一般式（１）で表される基で置換された糖残基で置き換えられている少なくとも１つの糖残基がシアル酸残基である、請求項１又は２に記載の糖タンパク質。
項４．一般式（１）で表される基で置換された糖残基がＮ−メタクリロイルノイラミン酸残基である、請求項１〜３のいずれかに記載の糖タンパク質。
項５．糖タンパク質が膜タンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載の糖タンパク質。
項６．糖タンパク質がＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１である、請求項１〜５のいずれかに記載の糖タンパク質。
項７．請求項１〜６のいずれかに記載の糖タンパク質と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物とが、糖タンパク質上の一般式（１）で表される基を介して連結している、化合物連結糖タンパク質。
Item 7. The glycoprotein according to any one of
項８．求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物が、一般式（２）：
［式中、ｎは数平均で１〜５００を示す］
で表される化合物である、請求項７に記載の化合物連結糖タンパク質。
[Wherein n represents a number average of 1 to 500]
The compound-linked glycoprotein according to claim 7, which is a compound represented by the formula:
本発明によれば、他の化合物を容易に連結できるように修飾された糖タンパク質、さらには他の化合物が連結している化合物連結糖タンパク質を提供できる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the glycoprotein modified so that another compound can be connected easily, and also the compound connection glycoprotein which the other compound has connected can be provided.
本発明の糖タンパク質中の一般式（１）で表される基は、求核性基などの官能基と容易に反応できるため、該糖タンパク質に多様な化合物を簡便かつ効率的に連結することができる。また、本発明の糖タンパク質は糖タンパク質本来の機能を損なうことなく発揮できる。 Since the group represented by the general formula (1) in the glycoprotein of the present invention can easily react with a functional group such as a nucleophilic group, various compounds can be easily and efficiently linked to the glycoprotein. Can do. Further, the glycoprotein of the present invention can be exhibited without impairing the original function of the glycoprotein.
本発明の化合物連結糖タンパク質によれば、糖タンパク質の機能を利用して、連結された化合物の性質を効率的に発揮することができる。例えば、糖タンパク質として生体内の特定部位に局在（又は集積）する糖タンパク質を採用する場合は、連結した化合物（例えば医薬化合物）を特定細胞上に効率的に伝達することが可能になる
また、本発明の化合物連結糖タンパク質によれば、特定の機能を有する化合物を連結することにより、糖タンパク質の機能を改善することもできる。例えば、化合物としてエチレングリコールが重合した構造を有する化合物を採用する場合は、該化合物が肝臓での代謝を阻害するという機能を利用して、糖タンパク質の血中寿命を延ばすことができる。別の例としては、化合物として水溶性の化合物を採用することにより、不溶性の糖タンパク質を水溶性に改質し、該糖タンパク質の精製を容易にすることができる。
According to the compound-linked glycoprotein of the present invention, the properties of the linked compound can be efficiently exhibited using the function of the glycoprotein. For example, when a glycoprotein that is localized (or accumulated) at a specific site in a living body is employed as a glycoprotein, it becomes possible to efficiently transmit a linked compound (for example, a pharmaceutical compound) onto a specific cell. According to the compound-linked glycoprotein of the present invention, the function of the glycoprotein can also be improved by linking a compound having a specific function. For example, when a compound having a structure in which ethylene glycol is polymerized is employed as the compound, the blood life of the glycoprotein can be extended by utilizing the function that the compound inhibits metabolism in the liver. As another example, by employing a water-soluble compound as a compound, an insoluble glycoprotein can be modified to be water-soluble and the purification of the glycoprotein can be facilitated.
（１）糖タンパク質
本発明の糖タンパク質は、糖鎖を構成する少なくとも１つの糖残基が、一般式（１）：
(1) Glycoprotein In the glycoprotein of the present invention, at least one sugar residue constituting the sugar chain has the general formula (1):
［式中、Ｒは水素又は炭素数１〜３のアルキル基を示す］
で表される基で置換された糖残基で置き換えられている、糖タンパク質である。
[Wherein R represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]
A glycoprotein that is substituted with a sugar residue substituted with a group represented by:
糖タンパク質は、糖鎖（Ｎ結合型及び／又はＯ結合型）が連結しているタンパク質であれば特に限定されない。糖タンパク質は、ヒト、サル、マウス、ラット、又はウサギ等の生物由来の天然タンパク質であってもよいし、人工的に設計したタンパク質発現プラスミドを生体内に導入することにより発現させた人工タンパク質であってもよい。 The glycoprotein is not particularly limited as long as it is a protein in which sugar chains (N-linked type and / or O-linked type) are linked. The glycoprotein may be a natural protein derived from an organism such as human, monkey, mouse, rat, or rabbit, or an artificial protein expressed by introducing an artificially designed protein expression plasmid into the living body. There may be.
天然の糖タンパク質としては、例えば、膜タンパク質や分泌タンパク質などが挙げられ、好ましくは膜タンパク質が挙げられる。 Examples of natural glycoproteins include membrane proteins and secreted proteins, preferably membrane proteins.
天然の糖タンパク質として、具体的には、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１、ＣＤ４３、ＣＤ４５、又はＣＤ１１ｂが挙げられ、好ましくはＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１、又はＣＤ４３が挙げられる。ヒト由来Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１のアミノ酸配列は配列番号１に示され、マウス由来のＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１のアミノ酸配列は配列番号２に示される。 Specific examples of the natural glycoprotein include P-selectin glycoprotein ligand-1, CD43, CD45, or CD11b, and preferably P-selectin glycoprotein ligand-1 or CD43. The amino acid sequence of human-derived P-selectin glycoprotein ligand-1 is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of mouse-derived P-selectin glycoprotein ligand-1 is shown in SEQ ID NO: 2.
これらの天然の糖タンパク質は、本来の機能を発揮できる限り、例えば糖タンパク質がＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１である場合はＰ−セレクチンと結合するという機能を発揮できる限り、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、又は負荷されていてもよい。アミノ酸が置換される場合は性質が類似のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えば、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸が置換される場合は、同じく酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換されることが好ましい。 As long as these natural glycoproteins can exhibit their original functions, for example, when the glycoprotein is P-selectin glycoprotein ligand-1, 1 to 50 as long as it can function to bind to P-selectin. An amino acid, preferably 1-20 amino acids, more preferably 1-10 amino acids, and even more preferably 1-5 amino acids may be substituted, deleted, or loaded. When an amino acid is substituted, it is preferably substituted with an amino acid having similar properties. For example, when aspartic acid, which is an acidic amino acid, is substituted, glutamic acid, which is also an acidic amino acid, is preferably substituted.
一般式（１）で表される基で置換された糖残基で置き換えられる「糖鎖を構成する糖残基」としては、糖タンパク質の糖鎖（Ｎ結合型及び／又はＯ結合型）を構成する糖残基であれば特に限定されない。このような糖残基としては、例えば、シアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基若しくはＮ−グリコイルノイラミン酸残基）、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はキシロース残基等が挙げられ、好ましくはシアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基又はＮ−グリコイルノイラミン酸残基）が挙げられ、より好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸残基が挙げられる。 As the “sugar residue constituting the sugar chain” replaced with the sugar residue substituted with the group represented by the general formula (1), a sugar chain (N-linked type and / or O-linked type) of glycoprotein is used. It is not particularly limited as long as it is a constituting sugar residue. Examples of such sugar residues include sialic acid residues (N-acetylneuraminic acid residues or N-glycolneuraminic acid residues), glucose residues, galactose residues, mannose residues, fucose residues. Group, N-acetylglucosamine residue, N-acetylgalactosamine residue, xylose residue and the like, preferably sialic acid residue (N-acetylneuraminic acid residue or N-glycolneuraminic acid residue) More preferably, an N-acetylneuraminic acid residue is mentioned.
「一般式（１）で表される基で置換された糖残基」とは、水素及び／又は官能基が一般式（１）で表される基で置き換わっている糖残基を意味する。 The “sugar residue substituted with the group represented by the general formula (1)” means a sugar residue in which hydrogen and / or a functional group is replaced with a group represented by the general formula (1).
一般式（１）で表される基で水素及び又は官能基が置き換えられている糖残基としては、例えば、シアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基若しくはＮ−グリコイルノイラミン酸残基）、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、又はキシロース残基等が挙げられ、好ましくはシアル酸残基（Ｎ−アセチルノイラミン酸残基又はＮ−グリコイルノイラミン酸残基）が挙げられ、より好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸残基が挙げられる。 Examples of sugar residues in which hydrogen and / or functional groups are replaced with groups represented by the general formula (1) include sialic acid residues (N-acetylneuraminic acid residues or N-glycolneuraminic acid). Residue), glucose residue, galactose residue, mannose residue, fucose residue, N-acetylglucosamine residue, N-acetylgalactosamine residue, xylose residue, etc., preferably sialic acid residue ( N-acetylneuraminic acid residue or N-glycolneuraminic acid residue), more preferably N-acetylneuraminic acid residue.
一般式（１）で表される基で置き換えられている糖残基上の水素又は官能基としては、例えばＮ−アセチルノイラミン酸残基中のアセチル基、又はＮ−グリコリルノイラミン酸残基中のグリコリル基が挙げられる。 Examples of the hydrogen or functional group on the sugar residue replaced with the group represented by the general formula (1) include an acetyl group in an N-acetylneuraminic acid residue, or an N-glycolylneuraminic acid residue. The glycolyl group in group is mentioned.
「一般式（１）で表される基で置換された糖残基」として、具体的にはＮ−アセチルノイラミン酸残基中のアセチル基、又はＮ−グリコリルノイラミン酸残基中のグリコリル基が、一般式（１）で表される基で置き換わっている糖残基が挙げられ、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸残基中のアセチル基、又はＮ−グリコリルノイラミン酸残基中のグリコリル基が、メタクリル基で表される基で置き換わっている糖残基（Ｎ−メタクリロイルノイラミン酸残基）が挙げられる。 As the “sugar residue substituted with the group represented by the general formula (1)”, specifically, an acetyl group in an N-acetylneuraminic acid residue, or an N-glycolylneuraminic acid residue Examples include sugar residues in which a glycolyl group is replaced by a group represented by the general formula (1), and preferably an acetyl group in an N-acetylneuraminic acid residue or an N-glycolylneuraminic acid residue An example is a sugar residue (N-methacryloylneuraminic acid residue) in which the glycolyl group in the group is replaced with a group represented by a methacryl group.
一般式（１）中、Ｒは水素又は炭素数１〜３のアルキル基を示す。Ｒとして、具体的には、水素、メチル基、エチル基、１−プロピル基、又は２−プロピル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、１−プロピル基、又は２−プロピル基が挙げられ、より好ましくはメチル基、又はエチル基が挙げられ、さらに好ましくはメチル基が挙げられる。 In general formula (1), R shows hydrogen or a C1-C3 alkyl group. Specific examples of R include hydrogen, a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, and a 2-propyl group, preferably a methyl group, an ethyl group, a 1-propyl group, and a 2-propyl group. More preferably, a methyl group or an ethyl group is mentioned, More preferably, a methyl group is mentioned.
一般式（１）で表される基で置換された糖残基で置き換えられる「糖鎖を構成する糖残基」の糖鎖上の位置は特に限定されない。置き換えられる糖残基としては、具体的には、糖鎖末端に存在する糖残基が好ましく挙げられる。 The position on the sugar chain of the “sugar residue constituting the sugar chain” replaced with the sugar residue substituted with the group represented by the general formula (1) is not particularly limited. Specific examples of the sugar residue to be replaced preferably include a sugar residue present at the end of the sugar chain.
本発明の糖タンパク質は、糖タンパク質を発現している細胞と、一般式（１）で表される基で置換された糖、及び／又は細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖とを接触させることを含む方法により製造することができる。この製造方法によれば、細胞内でタンパク質に糖鎖が付加されて糖タンパク質が合成される際に、本来付加される糖の代わりに、一般式（１）で表される基で置換された糖が付加されることにより、本発明の糖タンパク質が合成される。 The glycoprotein of the present invention includes a cell expressing a glycoprotein, a sugar substituted with a group represented by the general formula (1), and / or a group represented by the general formula (1) in the cell. It can be produced by a method comprising contacting a sugar that is metabolized to a substituted sugar. According to this production method, when a glycoprotein is synthesized by adding a sugar chain to a protein in a cell, the glycoprotein is substituted with a group represented by the general formula (1) instead of the originally added sugar. By adding a sugar, the glycoprotein of the present invention is synthesized.
糖タンパク質を発現している細胞としては、特に限定されず、例えば動物細胞を広く使用することができる。細胞としては、所望の糖タンパク質の発現量が高い細胞が好ましい。例えば、所望の糖タンパク質がＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１である場合は、該糖タンパク質の発現量が高い細胞、例えば血球細胞を使用することが好ましい。 The cell expressing the glycoprotein is not particularly limited, and for example, animal cells can be widely used. As the cell, a cell having a high expression level of a desired glycoprotein is preferable. For example, when the desired glycoprotein is P-selectin glycoprotein ligand-1, it is preferable to use cells with high expression level of the glycoprotein, such as blood cells.
一般式（１）で表される基で置換された糖としては、前述の「一般式（１）で表される糖残基」に対応する糖を用いることができる。 As the saccharide substituted with the group represented by the general formula (1), a saccharide corresponding to the aforementioned “sugar residue represented by the general formula (1)” can be used.
細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖とは、細胞内における代謝により各種修飾が行われることにより一般式（１）で表される基で置換された糖に変換される糖を意味する。具体的には、マンノサミンは細胞内における代謝によりシアル酸に変換されるため、一般式（１）で表される基で置換されたシアル酸に代謝される糖として、一般式（１）で表される基で置換されたマンノサミンが例示される。 A sugar that is metabolized to a sugar substituted with a group represented by the general formula (1) in the cell is substituted with a group represented by the general formula (1) by performing various modifications by metabolism in the cell. It means a sugar that is converted into a modified sugar. Specifically, since mannosamine is converted into sialic acid by intracellular metabolism, it is represented by the general formula (1) as a sugar metabolized to the sialic acid substituted with the group represented by the general formula (1). Mannosamine substituted with a group represented by
一般式（１）で表される基で置換された糖、及び／又は細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖としては、一種又は二種以上を組み合わせてもよい。 As the sugar substituted with the group represented by the general formula (1) and / or the sugar metabolized into the sugar substituted with the group represented by the general formula (1) in the cell, one kind or two or more kinds are used. May be combined.
一般式（１）で表される基で置換された糖、又は細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖は、公知の方法又はそれに準じた方法に従って合成することができる。 The sugar substituted with the group represented by the general formula (1) or the sugar metabolized into the sugar substituted with the group represented by the general formula (1) in the cell is a known method or a method analogous thereto. Can be synthesized according to
接触の態様は、特に限定されず、例えば糖タンパク質を発現している細胞の培養培地と、一般式（１）で表される基で置換された糖、及び／又は細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖とを混合するという態様が挙げられる。この態様において、一般式（１）で表される基で置換された糖、及び／又は細胞内において一般式（１）で表される基で置換された糖に代謝される糖の培地中の濃度としては、例えば０．１〜５０ｍＭが挙げられ、好ましくは０．５〜２０ｍＭが挙げられ、より好ましくは１．５〜１５ｍＭが挙げられ、さらに好ましくは３〜８ｍＭが挙げられる。この濃度範囲は、製造される糖タンパク質が、一般式（１）で表される基で置換された糖で置き換えられていながらも、糖タンパク質本来の機能を損なわずに発揮できるという観点から好ましい。 The mode of contact is not particularly limited. For example, the culture medium of cells expressing glycoprotein, the sugar substituted with the group represented by the general formula (1), and / or the general formula (1 And a saccharide that is metabolized to a saccharide substituted with a group represented by In this embodiment, in the medium of the sugar substituted with the group represented by the general formula (1) and / or the sugar metabolized into the sugar substituted with the group represented by the general formula (1) in the cell. As a density | concentration, 0.1-50 mM is mentioned, for example, Preferably 0.5-20 mM is mentioned, More preferably, 1.5-15 mM is mentioned, More preferably, 3-8 mM is mentioned. This concentration range is preferable from the viewpoint that the glycoprotein to be produced can be exhibited without impairing the original function of the glycoprotein while being replaced with the sugar substituted with the group represented by the general formula (1).
接触後、細胞を一定時間、例えば１〜５日間培養することにより、本発明の糖タンパク質が合成される。 After the contact, the glycoprotein of the present invention is synthesized by culturing the cells for a certain time, for example, 1 to 5 days.
培養後、本発明の糖タンパク質を、所望により公知の方法に従って精製してもよい。このような方法としては、例えば、細胞破砕物から、公知のタンパク質画分分離方法によりタンパク質画分を精製する方法、又は所望の糖タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する方法が挙げられる。 After culturing, the glycoprotein of the present invention may be purified according to a known method if desired. Examples of such a method include a method of purifying a protein fraction from a cell disrupted product by a known protein fraction separation method, or a method of purifying by affinity chromatography using an antibody against a desired glycoprotein. .
本発明の糖タンパク質は、一般式（１）で表される基を介して求核性基などの官能基を有する化合物と連結できるため、後述の化合物連結タンパク質を簡便且つ効率的に製造するのに利用できる。また、本発明の糖タンパク質は、糖タンパク質の機能を損なわずに発揮することができる。例えば、糖タンパク質がＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１である場合は、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１の機能、すなわちＰ−セレクチンに結合する機能を損なわない。 Since the glycoprotein of the present invention can be linked to a compound having a functional group such as a nucleophilic group via the group represented by the general formula (1), the compound-linked protein described below can be easily and efficiently produced. Available to: Moreover, the glycoprotein of the present invention can be exhibited without impairing the function of the glycoprotein. For example, when the glycoprotein is P-selectin glycoprotein ligand-1, the function of P-selectin glycoprotein ligand-1, that is, the function of binding to P-selectin is not impaired.
（２）化合物連結糖タンパク質
本発明の化合物連結糖タンパク質は、本発明の糖タンパク質と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物とが、糖タンパク質上の一般式（１）で表される基を介して連結している、化合物連結糖タンパク質である。
(2) Compound-linked glycoprotein The compound-linked glycoprotein of the present invention comprises a glycoprotein of the present invention and a compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1) on the glycoprotein. It is a compound-linked glycoprotein linked via a group represented by the general formula (1).
本発明の糖タンパク質としては、前述の「（１）糖タンパク質」と同じものを採用できる。 As the glycoprotein of the present invention, the same “(1) glycoprotein” described above can be employed.
求核性基としては、求核性を有する基であれば特に限定されない。求核性基としては、例えば、チオール基、カルボキシル基、カルボン酸塩基、カルボン酸無水物基、スルホン酸（塩）基、１，２級アミノ基、フェノキシド基、水酸基、スルフィド基、ホスフィン基、ホスファイト基、リン酸基、アルシン基、有機セレン基、ヒドロキシド基、ハロゲンイオン（例えば塩素イオン）等が挙げられ、好ましくはチオール基、又は１級アミノ基が挙げられる。 The nucleophilic group is not particularly limited as long as it is a group having nucleophilicity. Examples of the nucleophilic group include a thiol group, a carboxyl group, a carboxylic acid group, a carboxylic anhydride group, a sulfonic acid (salt) group, a primary, secondary amino group, a phenoxide group, a hydroxyl group, a sulfide group, a phosphine group, A phosphite group, a phosphate group, an arsine group, an organic selenium group, a hydroxide group, a halogen ion (for example, a chlorine ion) and the like are preferable, and a thiol group or a primary amino group is preferable.
求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物としては、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する限り特に限定されない。例えば、医薬化合物、又は高分子化合物が挙げられる。 The compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1) is not particularly limited as long as it has a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1). For example, a pharmaceutical compound or a high molecular compound is mentioned.
医薬化合物としては、抗炎症剤、又は抗がん剤が挙げられる。 Examples of the pharmaceutical compound include an anti-inflammatory agent or an anticancer agent.
高分子化合物としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、若しくは天然ゴム等の天然高分子、又は合成樹脂、シリコン樹脂、合成繊維、若しくは合成ゴム等の合成高分子等が挙げられる。具体的には、エチレングリコールが重合した構造を有する化合物、又はアクリル樹脂が挙げられる。 Examples of the polymer compound include natural polymers such as proteins, nucleic acids, lipids, polysaccharides, or natural rubber, or synthetic polymers such as synthetic resin, silicon resin, synthetic fiber, or synthetic rubber. Specifically, a compound having a structure in which ethylene glycol is polymerized or an acrylic resin can be used.
求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物として医薬化合物を採用する場合は、連結される糖タンパク質の局在を利用して、糖タンパク質に連結した医薬化合物を特定部位に効率的に伝達することができる。 When a pharmaceutical compound is employed as the compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1), the pharmaceutical compound linked to the glycoprotein is obtained by utilizing the localization of the linked glycoprotein. It can be efficiently transmitted to a specific site.
求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物としてエチレングリコールが重合した構造を有する化合物を採用する場合は、肝臓での代謝を阻害するという該化合物の機能を利用して、連結される糖タンパク質の血中寿命を延ばすことができる。エチレングリコールが重合した構造を有する化合物としては、例えば、一般式（２）： When a compound having a structure in which ethylene glycol is polymerized is employed as a compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1), the function of the compound that inhibits metabolism in the liver is utilized. Thus, the blood life of the glycoprotein to be linked can be extended. Examples of the compound having a structure in which ethylene glycol is polymerized include, for example, the general formula (2):
［式中、ｎは数平均で１〜５００を示す］
で表される化合物が挙げられる。ｎとしては、好ましくは数平均で５〜１００が挙げられ、より好ましくは数平均で２０〜７０が挙げられる。
[Wherein n represents a number average of 1 to 500]
The compound represented by these is mentioned. As n, Preferably 5-100 is mentioned by a number average, More preferably, 20-70 is mentioned by a number average.
本発明の化合物連結糖タンパク質においては、本発明の糖タンパク質と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物とが、糖タンパク質上の一般式（１）で表される基を介して連結している。 In the compound-linked glycoprotein of the present invention, the glycoprotein of the present invention and the compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1) are represented by the general formula (1) on the glycoprotein. It is linked through the group represented.
糖タンパク質上の一般式（１）で表される基を介して連結しているとは、本発明の糖タンパク質上の一般式（１）で表される基と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物上の求核性基及び／又は一般式（１）で表される基とが、付加反応や重合反応などにより連結していることを意味する。例えば求核性基として少なくとも1つのチオール基を有する化合物を採用する場合は、少なくとも1つの下記式 Linking via a group represented by the general formula (1) on the glycoprotein means that the group represented by the general formula (1) on the glycoprotein of the present invention, a nucleophilic group and / or It means that the nucleophilic group on the compound having the group represented by the general formula (1) and / or the group represented by the general formula (1) are linked by an addition reaction or a polymerization reaction. . For example, when employing a compound having at least one thiol group as a nucleophilic group, at least one of the following formulas
［式中、＊１は、本発明の糖タンパク質から少なくとも１つの一般式（１）で表される基を除いて得られる基と結合する部位を示し、＊２は、チオール基を有する化合物から少なくとも1つのチオール基を除いて得られる基を示し、Ｒは水素又は炭素数１〜３のアルキル基を示す］
で表される二価の基を介して、本発明の糖タンパク質とチオール基を有する化合物とが連結していることを示す。
[In the formula, * 1 represents a site bonded to a group obtained by removing at least one group represented by the general formula (1) from the glycoprotein of the present invention, and * 2 represents a compound having a thiol group. A group obtained by removing at least one thiol group, R represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms]
The glycoprotein of this invention and the compound which has a thiol group are connected through the bivalent group represented by these.
本発明の化合物連結糖タンパク質は、本発明の糖タンパク質と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物とを反応させることにより製造することができる。 The compound-linked glycoprotein of the present invention can be produced by reacting the glycoprotein of the present invention with a compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1).
反応条件（溶媒、反応温度、又は反応時間等）は、本発明の糖タンパク質上の一般式（１）で表される基と、求核性基及び／又は一般式（１）で表される基を有する化合物上の求核性基及び／又は一般式（１）で表される基とが付加反応や重合反応などにより連結できる限り特に限定されない。 The reaction conditions (solvent, reaction temperature, reaction time, etc.) are represented by the group represented by the general formula (1), the nucleophilic group and / or the general formula (1) on the glycoprotein of the present invention. The nucleophilic group on the compound having a group and / or the group represented by the general formula (1) is not particularly limited as long as it can be linked by an addition reaction or a polymerization reaction.
溶媒としては、例えば緩衝液、具体的にはＰＢＳ、又はハンクス緩衝溶液等の水系溶媒が挙げられる。 Examples of the solvent include an aqueous solvent such as a buffer solution, specifically, PBS or Hanks buffer solution.
反応温度としては、例えば４〜５０℃が挙げられる。 As reaction temperature, 4-50 degreeC is mentioned, for example.
反応時間としては、例えば５〜６０分間が挙げられる。 An example of the reaction time is 5 to 60 minutes.
反応中、紫外線を照射することにより、付加反応や重合反応を効率的に進めることができる。 Irradiation with ultraviolet rays during the reaction allows the addition reaction and polymerization reaction to proceed efficiently.
また、反応中、重合開始剤を共存させることにより、反応を効率的に進めることができる。重合開始としては、例えばアルキルフェノン系光重合開始剤、アシルフォスフィンオキサイド系光重合開始剤、又はチタノセン系光重合開始剤等のラジカル型光重合開始剤が挙げられる。 Moreover, reaction can be advanced efficiently by making a polymerization initiator coexist during reaction. Examples of the polymerization start include radical photopolymerization initiators such as alkylphenone photopolymerization initiators, acylphosphine oxide photopolymerization initiators, and titanocene photopolymerization initiators.
反応後、精製した本発明の化合物連結糖タンパク質を、公知の方法に従って精製してもよい。このような方法としては、例えば、反応物から、各種クロマトグラフィーによって本発明の化合物連結糖タンパク質を精製する方法、又は所望の糖タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製する方法等が挙げられる。 After the reaction, the purified compound-linked glycoprotein of the present invention may be purified according to a known method. Examples of such a method include a method of purifying the compound-linked glycoprotein of the present invention from the reaction product by various chromatography, a method of purification by affinity chromatography using an antibody against the desired glycoprotein, and the like. .
本発明の化合物連結糖タンパク質は、連結する糖タンパク質又は化合物の種類に応じて種々の機能を発揮する。 The compound-linked glycoprotein of the present invention exhibits various functions depending on the type of glycoprotein or compound to be linked.
例えば、糖タンパク質として生体内の特定部位に局在（又は集積）する糖タンパク質を採用すれば、その性質を利用して、連結する化合物を特定部位に効率的に伝達することができる。具体的には、糖タンパク質としてＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１を採用すれば、該糖タンパク質が炎症細胞特異的に発現するＰ−セレクチンに結合するという機能を利用して、連結された化合物（例えば医薬化合物）を効率的に炎症部位に伝達することができる。 For example, when a glycoprotein that is localized (or accumulated) at a specific site in a living body is employed as the glycoprotein, the compound to be linked can be efficiently transmitted to the specific site by utilizing its properties. Specifically, when P-selectin glycoprotein ligand-1 is employed as a glycoprotein, a compound linked by utilizing the function that the glycoprotein binds to P-selectin expressed specifically in inflammatory cells ( For example, a pharmaceutical compound) can be efficiently transmitted to an inflammatory site.
また別の例として、連結する化合物として特定の性質を有する化合物を採用すれば、糖タンパク質の性質を改善（改質）することができる。具体的には、連結する化合物として、エチレングリコールが重合した構造を有する化合物を採用すれば、肝臓での代謝を阻害するという該化合物の機能を利用して、連結される糖タンパク質の血中寿命を延ばすことができる。 As another example, if a compound having a specific property is employed as the compound to be linked, the properties of the glycoprotein can be improved (modified). Specifically, if a compound having a structure in which ethylene glycol is polymerized is employed as a compound to be linked, the blood lifetime of the glycoprotein to be linked is utilized by utilizing the function of the compound to inhibit metabolism in the liver. Can be extended.
本発明の化合物連結糖タンパク質は上記のような機能を発揮するため、医薬組成物の有効成分として有用である。 Since the compound-linked glycoprotein of the present invention exhibits the functions as described above, it is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition.
医薬組成物は、本発明の化合物連結糖タンパク質そのものであってもよいし、これと他の薬理活性成分、薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等）等が必要に応じて配合され、注射剤、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等の医薬製剤に調製されたものでもよい。 The pharmaceutical composition may be the compound-linked glycoprotein of the present invention itself, and other pharmacologically active ingredients, pharmaceutically acceptable bases, carriers, additives (for example, solvents, dispersants, emulsifiers, Buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.) etc. are blended as necessary, and injections, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules It may also be prepared in a pharmaceutical preparation such as a capsule.
本発明の化合物連結糖タンパク質の医薬組成物中の含有量は、例えば、０．１〜１００重量％であり得る。医薬組成物の有効成分の一日摂取量は、患者の年齢や性別、病状の重篤度等に応じて、適宜設定することができる。 The content of the compound-linked glycoprotein of the present invention in the pharmaceutical composition can be, for example, 0.1 to 100% by weight. The daily intake of the active ingredient of the pharmaceutical composition can be appropriately set according to the age and sex of the patient, the severity of the medical condition, and the like.
医薬組成物は、本発明の化合物連結糖タンパク質を配合し、さらに必要に応じて上記他の薬理活性成分、上記薬学的に許容される基剤、担体、添加剤を配合し、またさらに必要に応じて注射剤、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等の医薬製剤に調製されることによって製造することができる。 The pharmaceutical composition contains the compound-linked glycoprotein of the present invention, and if necessary, the other pharmacologically active ingredient, the pharmaceutically acceptable base, carrier, additive, and the like. Accordingly, it can be produced by preparing pharmaceutical preparations such as injections, tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules and the like.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
１．メタクリル基で置換された糖の合成
下記反応式に従って、アミノ基がメタクリル基で置換されたマンノサミン（以下、「Ｎ−Ｎ−メタクリロイルマンノサミン」と示すこともある）を合成した。詳細を以下に説明する。
1. Synthesis of sugar substituted with methacryl group Mannosamine in which an amino group was substituted with a methacryl group (hereinafter sometimes referred to as "N-N-methacryloyl mannosamine") was synthesized according to the following reaction formula. Details will be described below.
三口フラスコに、脱水テトラヒドロフラン（THF）（Wako：試薬特級）を77 ml、トリエチルアミン（TEA）（Wako：和光特級）を常圧蒸留して得られたb.p89.4℃/760 mmHgの留分を4.2 ml、及びメタクリル酸（Wako：試薬特級）を減圧蒸留して得られたb.p 72℃/14 mmHgの留分を2.4 ml取り、30分間撹拌した。そこへ、3.3 mlのクロロギ酸イソブチル（Wako：ペプチド合成用）を一滴ずつ加え、3時間撹拌した。別の三角フラスコに、脱水テトラヒドロフラン（THF）（Wako：試薬特級）を68.4 ml、及び純水を85.6 ml加え、撹拌しながらさらにD-マンノースアミン塩酸塩（Aldrich）5.00 gとトリエチルアミン（TEA）（Wako：和光特級）を常圧蒸留して得られたb.p89.4℃/760 mmHgの留分3.6mlを加え、5分間撹拌した。三口フラスコ中の溶液を三角フラスコに一滴ずつ加え、24時間撹拌した。そこへ、重合禁止剤としてp-メトキシフェノール（Wako）を0.3 ml加えた。エバポレーターにより有機溶媒を除去し、その後凍結乾燥することにより水を除去して濃縮した。濃縮液をクロロホルムとメタノールとの混合溶液（クロロホルム：メタノール＝15：1（容量比））に溶解し、該溶解液をシリカゲル（Merck silicagel60 0.063-0.200mm）カラムに通した。クロロホルムに対するメタノールの容量を増加させながら、クロロホルムとメタノールとの混合溶液で溶出し、クロロホルム：メタノール＝5：1の混合溶液で溶出したフラクションを回収した。該フラクション中の溶液をエバポレーターで濃縮した。該濃縮液を陽イオン交換樹脂（Biorad AG50W-X8 pyridium form）カラムで精製し、精製物を凍結乾燥により濃縮した。該濃縮液をさらに陰イオン交換樹脂（Biorad AG-1X2 acetate form）カラムで精製し、精製物を凍結乾燥することにより水を除去した。得られた化合物をNMRで解析した結果を図１に示す。 B.p89.4 ℃ / 760 mmHg fraction obtained by atmospheric distillation of 77 ml of dehydrated tetrahydrofuran (THF) (Wako: reagent grade) and triethylamine (TEA) (Wako: Wako grade) in a three-necked flask 4.2 ml of a fraction of bp 72 ° C./14 mmHg obtained by distillation under reduced pressure of methacrylic acid (Wako: reagent grade) was taken and stirred for 30 minutes. Thereto, 3.3 ml of isobutyl chloroformate (Wako: for peptide synthesis) was added dropwise and stirred for 3 hours. In another Erlenmeyer flask, 68.4 ml of dehydrated tetrahydrofuran (THF) (Wako: reagent grade) and 85.6 ml of pure water were added. While stirring, 5.00 g of D-mannoseamine hydrochloride (Aldrich) and triethylamine (TEA) ( A 3.6 ml fraction of b.p89.4 ° C./760 mmHg obtained by atmospheric distillation of Wako: Wako Special Grade) was added and stirred for 5 minutes. The solution in the three-necked flask was added dropwise to the Erlenmeyer flask and stirred for 24 hours. Thereto, 0.3 ml of p-methoxyphenol (Wako) was added as a polymerization inhibitor. The organic solvent was removed by an evaporator, and then water was removed by lyophilization to concentrate. The concentrated solution was dissolved in a mixed solution of chloroform and methanol (chloroform: methanol = 15: 1 (volume ratio)), and the solution was passed through a silica gel (Merck silicagel 60 0.063-0.200 mm) column. While increasing the volume of methanol with respect to chloroform, elution was performed with a mixed solution of chloroform and methanol, and the fraction eluted with a mixed solution of chloroform: methanol = 5: 1 was collected. The solution in the fraction was concentrated by an evaporator. The concentrate was purified by a cation exchange resin (Biorad AG50W-X8 pyridium form) column, and the purified product was concentrated by lyophilization. The concentrated solution was further purified with an anion exchange resin (Biorad AG-1X2 acetate form) column, and water was removed by freeze-drying the purified product. The result of having analyzed the obtained compound by NMR is shown in FIG.
図１より、Ｎ−Ｎ−メタクリロイルマンノサミンの合成が確認できた。 From FIG. 1, the synthesis of NN-methacryloyl mannosamine was confirmed.
２．糖鎖への反応性基の導入
細胞内ではマンノサミンからシアル酸が生合成され、該シアル酸が細胞表面の糖鎖に取り込まれることが知られている。このことを利用して、合成したＮ−Ｎ−メタクリロイルマンノサミンを細胞培養環境下に添加することにより、細胞表面の糖鎖を構成するシアル酸残基を、メタクリロイルシアル酸残基に置き換えた。メタクリロイルシアル酸に置き換えられていることの確認は、メタクリロイル基を介して蛍光物質を連結し、蛍光を確認することにより行った。詳細を以下に説明する。
2. Introduction of a reactive group into a sugar chain It is known that sialic acid is biosynthesized from mannosamine in a cell and the sialic acid is taken into a sugar chain on the cell surface. Utilizing this fact, the synthesized NN-methacryloylmannosamine was added to the cell culture environment to replace the sialic acid residues constituting the sugar chains on the cell surface with methacryloyl sialic acid residues. . Confirmation that it was replaced by methacryloyl sialic acid was performed by connecting a fluorescent substance via a methacryloyl group and confirming fluorescence. Details will be described below.
細胞としてはHL-60細胞（ヒト骨髄性白血病細胞：ヒューマンサイエンス資源バンク）を用いた。培地としては、RPMI Medium 1640（GIBCO）に、FBS（終濃度10％）及び抗生物質（終濃度1％）を添加したものを用いた。Ｎ−メタクリロイルマンノサミンはPBS(-)で50mMに調製した。なお、これらは、下記「３．糖タンパク質と化合物の連結」及び「４．反応性基が導入された糖タンパク質の機能の評価」においても使用した。
HL-60 cells (human myeloid leukemia cells: Human Science Resource Bank) were used as the cells. As the medium, RPMI Medium 1640 (GIBCO) to which FBS (
HL-60細胞を培地中に2.0×105cells/mlになるように懸濁した。12 wellプレートの1 well当たり、該細胞懸濁液1 mlと、50 mMＮ−メタクリロイルマンノサミン溶液（またはPBS(-)）110μlを入れた。 37℃、CO2濃度5％の湿潤環境下で3日間培養した。培養後の培養液を回収し、1000 rpmで3分間遠心分離し、分離された細胞を無血清培地で3回洗浄した。2.5％Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene （日油株式会社：PTE-100SH）と0.05wt% Irgacure 2959（Ciba）の混合溶液300μlを加え、365nmのUVランプを15分間照射した。1000 rpmで3分間遠心分離し、分離された細胞を無血清培地で3回洗浄した。10μg/ml Alexa Fluor 488 C5-maleimide（invitrogen）を、細胞が懸濁されている無血清培地中に、終濃度0.6 μg/mlになうように添加し、暗所において室温で15分間静置した。1000 rpmで3分間遠心分離し、無血清培地で3回洗浄した。洗浄後の細胞を、共焦点顕微鏡（ZEISS：LSM5PASCAL-V3.2）により観察した。観察された微分干渉画像および蛍光画像を図２に示す。 HL-60 cells were suspended in the medium so as to be 2.0 × 10 5 cells / ml. 1 ml of the cell suspension and 110 μl of 50 mM N-methacryloylmannosamine solution (or PBS (−)) were added per well of a 12-well plate. The cells were cultured for 3 days in a humid environment at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. The culture solution after the culture was collected, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the separated cells were washed three times with a serum-free medium. 300 μl of a mixed solution of 2.5% Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene (NOF Corporation: PTE-100SH) and 0.05 wt% Irgacure 2959 (Ciba) was added and irradiated with a 365 nm UV lamp for 15 minutes. Centrifugation was performed at 1000 rpm for 3 minutes, and the separated cells were washed three times with serum-free medium. Add 10 μg / ml Alexa Fluor 488 C 5 -maleimide (invitrogen) to the serum-free medium in which the cells are suspended to a final concentration of 0.6 μg / ml, and let stand at room temperature in the dark for 15 minutes. I put it. The mixture was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes and washed 3 times with serum-free medium. The washed cells were observed with a confocal microscope (ZEISS: LSM5PASCAL-V3.2). The observed differential interference image and fluorescence image are shown in FIG.
図２中、ManMA(＋)はＮ−メタクリロイルマンノサミン溶液を添加したサンプルの画像を示し、ManMA(−)はＮ−メタクリロイルマンノサミン溶液の代わりにPBS(-)を添加したサンプルの画像を示す。 In FIG. 2, ManMA (+) represents an image of a sample to which an N-methacryloyl mannosamine solution was added, and ManMA (−) represents an image of a sample to which PBS (−) was added instead of the N-methacryloyl mannosamine solution. Indicates.
図２より、Ｎ−メタクリロイルマンノサミンを添加したサンプルは、細胞表面が蛍光標識されていることが示された。すなわち、Ｎ−メタクリロイルマンノサミンを添加することにより、細胞表面の糖鎖を構成する糖残基が、メタクリロイルシアル酸に置き換えられたことが確認できた。 FIG. 2 shows that the cell surface of the sample to which N-methacryloyl mannosamine was added was fluorescently labeled. That is, it was confirmed that by adding N-methacryloyl mannosamine, sugar residues constituting sugar chains on the cell surface were replaced with methacryloyl sialic acid.
３．糖タンパク質と化合物の連結
３−１． Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneの連結
膜タンパク質の糖鎖を構成するシアル酸残基を、Ｎ−メタクリロイルシアル酸残基に置き換え、さらにメタクリル基を介してPentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneを連結した。メタクリロイルシアル酸に置き換えられていることの確認、及びPentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneが連結されていることの確認は、膜タンパク質であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１に対する抗体を用いたウェスタンブロットで解析することにより確認した。抗Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１抗体で検出されるバンドが、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１の分子量から推定される位置よりも高い位置に検出されれば、膜タンパク質であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１上のシアル酸残基がメタクリロイルシアル酸に置き換えられ、且つメタクリロイル基を介してPentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneが連結されていることを示す。詳細を以下に説明する。
3. Linking glycoproteins and compounds
3-1. The sialic acid residue constituting the sugar chain of the linked membrane protein of Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene was replaced with an N-methacryloyl sialic acid residue, and Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene was further linked via a methacryl group. Confirmation of replacement with methacryloyl sialic acid and confirmation of connection of Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene were analyzed by Western blot using an antibody against P-selectin glycoprotein ligand-1 which is a membrane protein. It was confirmed by doing. If the band detected by the anti-P-selectin glycoprotein ligand-1 antibody is detected at a position higher than the position estimated from the molecular weight of P-selectin glycoprotein ligand-1, the P-selectin glycoprotein, which is a membrane protein, is detected. It shows that the sialic acid residue on protein ligand-1 is replaced with methacryloyl sialic acid and Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene is linked via a methacryloyl group. Details will be described below.
HL-60細胞を培地中に8.0×105cells/mlになるように懸濁した。12 wellプレートの1 well当たり、該細胞懸濁液1 mlと、50 mMＮ−メタクリロイルマンノサミン溶液（またはPBS(-)）110μlを入れた。 37℃、CO2濃度5％の湿潤環境下で3日間培養した。培養後の培養液を回収し、1000 rpmで3分間遠心分離し、分離された細胞をPBS(-)で3回洗浄した。洗浄後、細胞をPBS(-)195μl中に懸濁した。該懸濁液に0.01 wt% PTE-100SHと0.05 w% Irgacure 2959との混合溶液を105μl加え、365nmのUVランプを10分間照射した。1000 rpmで3分間遠心分離し、分離された細胞をPBS(-)で3回洗浄した。 HL-60 cells were suspended in the medium so as to be 8.0 × 10 5 cells / ml. 1 ml of the cell suspension and 110 μl of 50 mM N-methacryloylmannosamine solution (or PBS (−)) were added per well of a 12-well plate. The cells were cultured for 3 days in a humid environment at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. The culture solution after the culture was collected, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and the separated cells were washed three times with PBS (−). After washing, the cells were suspended in 195 μl of PBS (−). 105 μl of a mixed solution of 0.01 wt% PTE-100SH and 0.05 w% Irgacure 2959 was added to the suspension, and irradiated with a 365 nm UV lamp for 10 minutes. Centrifugation was performed at 1000 rpm for 3 minutes, and the separated cells were washed three times with PBS (−).
洗浄後の細胞を定法に従って溶解し、ウェスタンブロットを行った。一次抗体溶液としてPSGL-１抗体（TOYOBO）を0.5％スキムミルク/TBSTで333倍に希釈したものを用いた。ウェスタンブロットの結果を図３に示す。 The washed cells were lysed according to a conventional method, and Western blotting was performed. As a primary antibody solution, PSGL-1 antibody (TOYOBO) diluted with 0.5% skim milk / TBST 333 times was used. The result of the Western blot is shown in FIG.
図３中、ManMA(＋)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加したサンプルを示し、ManMA(−)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加していないサンプルを示す。PEG-SH（＋）はPTE-100SHを添加したサンプルを示し、PEG-SH（−）はPTE-100SHを添加していないサンプルを示す。 In FIG. 3, ManMA (+) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was added, and ManMA (−) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was not added. PEG-SH (+) indicates a sample to which PTE-100SH is added, and PEG-SH (−) indicates a sample to which PTE-100SH is not added.
図３より、Ｎ−メタクリロイルマンノサミン及びPTE-100SHを添加したサンプルのレーン（図３中の「5」）において、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１の分子量から推定される位置よりも高い位置にバンドが検出された。すなわち、膜タンパク質であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１上のシアル酸がメタクリロイルシアル酸に置き換えられ、メタクリロイル基を介してPentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneが連結したことが示された。 From FIG. 3, in the lane (“5” in FIG. 3) of the sample to which N-methacryloyl mannosamine and PTE-100SH were added, a position higher than the position estimated from the molecular weight of P-selectin glycoprotein ligand-1 A band was detected. That is, it was shown that sialic acid on P-selectin glycoprotein ligand-1 which is a membrane protein was replaced with methacryloyl sialic acid, and Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene was linked via a methacryloyl group.
３−２．リゾチームの連結
0.01 wt% PTE-100SHの代わりに10 wt%リゾチーム（Wako）を用いる以外は、上記「３−１．Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneの連結」と同様に行った。ウェスタンブロットの結果を図４に示す。
3-2. Concatenation of lysozyme
The procedure was the same as in “3-1. Linking Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene” except that 10 wt% lysozyme (Wako) was used instead of 0.01 wt% PTE-100SH. The result of the Western blot is shown in FIG.
図４中、ManMA(＋)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加したサンプルを示し、ManMA(−)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加していないサンプルを示す。リゾチーム（＋）はリゾチームを添加したサンプルを示し、リゾチーム（−）はリゾチームを添加していないサンプルを示す。 In FIG. 4, ManMA (+) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was added, and ManMA (−) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was not added. Lysozyme (+) indicates a sample to which lysozyme is added, and lysozyme (−) indicates a sample to which lysozyme is not added.
図４より、Ｎ−メタクリロイルマンノサミン及びリゾチームを添加したサンプルのレーン（図４中の「5」）において、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１の分子量から推定される位置よりも高い位置にバンドが検出された。すなわち、膜タンパク質であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１上のシアル酸がメタクリロイルシアル酸に置き換えられ、メタクリロイル基を介してリゾチームが連結したことが示された。 From FIG. 4, in the lane of the sample to which N-methacryloyl mannosamine and lysozyme were added (“5” in FIG. 4), a band at a position higher than the position estimated from the molecular weight of P-selectin glycoprotein ligand-1 Was detected. That is, it was shown that sialic acid on P-selectin glycoprotein ligand-1 which is a membrane protein was replaced with methacryloyl sialic acid, and lysozyme was linked via a methacryloyl group.
３−３． PMPC-SHの連結
＜PMPC-SHの合成＞
PMPC-SHの合成は、下記反応式に従って行った。詳細を以下に説明する。
3-3. Connection of PMPC-SH <Synthesis of PMPC-SH>
PMPC-SH was synthesized according to the following reaction formula. Details will be described below.
純水を沸騰するまで加熱し、1時間バブリングした。丸底フラスコに2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日油株式会社：MPC）、10.30g(34.88mmol)、4-シアノ吉草酸ジチオベンゾエート0.123g(0.44mmol)、4-4’アゾビス(シアノ吉草酸) 0.0170g(0.63mmol)を加えバブリングした純水30mlに溶かした。30分間撹拌しながらアルゴンでバブリングした。バブリング後、75℃で3時間加熱した。加熱後、純水で3日間透析(MWCO=3500)し、凍結乾燥した。凍結乾燥物をNMRにより解析した結果を図５に示す。図５より、Poly(MPC)が合成されていることが確認された。 Pure water was heated to boiling and bubbled for 1 hour. 2-Methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (NOF Corporation: MPC), 10.30 g (34.88 mmol), 4-cyanovaleric acid dithiobenzoate 0.123 g (0.44 mmol), 4-4 ′ azobis (cyanovaleric acid) in a round bottom flask 0.0170 g (0.63 mmol) was added and dissolved in 30 ml of bubbling pure water. Bubbled with argon with stirring for 30 minutes. After bubbling, it was heated at 75 ° C. for 3 hours. After heating, it was dialyzed against pure water for 3 days (MWCO = 3500) and lyophilized. The result of analyzing the freeze-dried product by NMR is shown in FIG. From FIG. 5, it was confirmed that Poly (MPC) was synthesized.
凍結乾燥により得られたPoly(MPC) 2.0g(149μmol)をメタノール44.8mLに溶かし、微量のTCEPを加え、2-アミノエタノールを溶液の色が無色になるまで滴下した。室温で1時間撹拌した。反応後メタノールで２日間、純水で1日透析(MWCO=3500)し、凍結乾燥した。凍結乾燥物をNMRにより解析した結果を図６に示す。図５及び図６より、PMPC-SHを合成できたことが確認された。 Poly (MPC) 2.0 g (149 μmol) obtained by lyophilization was dissolved in 44.8 mL of methanol, a small amount of TCEP was added, and 2-aminoethanol was added dropwise until the color of the solution became colorless. Stir at room temperature for 1 hour. After the reaction, it was dialyzed with methanol for 2 days and with pure water for 1 day (MWCO = 3500) and lyophilized. The result of analyzing the freeze-dried product by NMR is shown in FIG. FIG. 5 and FIG. 6 confirmed that PMPC-SH could be synthesized.
＜PMPC-SHの連結＞
0.01 wt% PTE-100SHの代わりに、合成したPMPC-SHを用いる以外は、上記「３−１．Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethyleneの連結」と同様に行った。ウェスタンブロットの結果を図７に示す。
<Consolidation of PMPC-SH>
The same procedure as in “3-1. Linking Pentaerythritol tetra (mercaptoethyl) polyoxyethylene” was performed except that synthesized PMPC-SH was used instead of 0.01 wt% PTE-100SH. The result of the Western blot is shown in FIG.
図７中、ManMA(＋)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加したサンプルを示し、ManMA(−)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加していないサンプルを示す。PMPC-SH（＋）はPMPC-SHを添加したサンプルを示し、PMPC-SH（−）はPMPC-SHを添加していないサンプルを示す。 In FIG. 7, ManMA (+) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was added, and ManMA (−) represents a sample to which N-methacryloyl mannosamine was not added. PMPC-SH (+) indicates a sample to which PMPC-SH is added, and PMPC-SH (-) indicates a sample to which PMPC-SH is not added.
図７より、Ｎ−メタクリロイルマンノサミン及びPMPC-SHを添加したサンプルのレーン（図７
中の「5」）において、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１の分子量から推定される位置よりも高い位置にバンドが検出された。すなわち、膜タンパク質であるＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１上のシアル酸がメタクリロイルシアル酸に置き換えられ、メタクリロイル基を介してPMPC-SHが連結したことが示された。
FIG. 7 shows a lane of a sample to which N-methacryloyl mannosamine and PMPC-SH are added (FIG. 7).
In “5”), a band was detected at a position higher than the position estimated from the molecular weight of P-selectin glycoprotein ligand-1. That is, it was shown that sialic acid on P-selectin glycoprotein ligand-1 which is a membrane protein was replaced with methacryloyl sialic acid, and PMPC-SH was linked via a methacryloyl group.
４．反応性基が導入された糖タンパク質の機能の評価
Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１は、炎症した血管内皮細胞特異的に発現するＰ−セレクチンと結合することにより、炎症部位への血球細胞の遊走を仲介することが知られている。この機能の発揮には、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１上の糖鎖を構成するシアル酸残基が重要な役割を果たしているため、シアル酸残基がメタクリロイルシアル酸残基に置き換えられた場合、この機能が発揮されない、もしくは著しく機能が低下する可能性が高い。そこで、シアル酸残基がメタクリロイルシアル酸残基に置き換えられても、Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１が本来の機能を発揮できるか否か、すなわちＰ−セレクチンと結合できるか否かを調べた。詳細を以下に説明する。
4). Evaluation of function of glycoprotein introduced with reactive group P-selectin glycoprotein ligand-1 binds to P-selectin expressed specifically in inflamed vascular endothelial cells, thereby causing migration of blood cells to the inflamed site. It is known to mediate. When the sialic acid residue constituting the sugar chain on P-selectin glycoprotein ligand-1 plays an important role in exerting this function, the sialic acid residue is replaced with a methacryloyl sialic acid residue. It is highly possible that this function is not performed or the function is remarkably deteriorated. Thus, it was investigated whether P-selectin glycoprotein ligand-1 can exhibit its original function even when the sialic acid residue is replaced with a methacryloyl sialic acid residue, that is, whether it can bind to P-selectin. . Details will be described below.
HL-60細胞を培地中に2.0×105cells/mlになるように懸濁した。12 wellプレートの1 well当たり、該細胞懸濁液1 mlと、50 mMＮ−メタクリロイルマンノサミン溶液（またはPBS(-)）110μlを入れた。 37℃、CO2濃度5％の湿潤環境下で3日間培養した。培養後、1000 rpmで3分間遠心分離し、培地で3回洗浄した。洗浄後の細胞を1 mlの培地に懸濁し、そこへCalcein AMを5μl加え、暗所で15分間静置した。静置後、細胞をPBS(-)で3回洗浄した。洗浄後の細胞を500μlの培地に懸濁した。 HL-60 cells were suspended in the medium so as to be 2.0 × 10 5 cells / ml. 1 ml of the cell suspension and 110 μl of 50 mM N-methacryloylmannosamine solution (or PBS (−)) were added per well of a 12-well plate. The cells were cultured for 3 days in a humid environment at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%. After culturing, the mixture was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes and washed 3 times with a medium. The washed cells were suspended in 1 ml of medium, 5 μl of Calcein AM was added thereto, and allowed to stand in the dark for 15 minutes. After standing, the cells were washed 3 times with PBS (−). The washed cells were suspended in 500 μl of medium.
一方で、ガラスベースディシュにHUVEC（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞：ヒューマンサイエンス資源バンク）を播種し、コンフルエントになるまで培養した。HUVECを培養したガラスベースディシュにIL-1α（またはPBS(-)）を5μl加え、4時間培養した。培養後の細胞を培地で洗浄後、500μlの培地を加えた。 On the other hand, HUVEC (normal human umbilical vein endothelial cells: Human Science Resource Bank) was seeded on a glass-based dish and cultured until it became confluent. 5 μl of IL-1α (or PBS (−)) was added to a glass base dish in which HUVECs were cultured, and cultured for 4 hours. The cultured cells were washed with a medium, and 500 μl of a medium was added.
HL-60細胞の懸濁液をHUVECが培養されているガラスベースディシュに加え、37℃、CO2濃度5％の湿潤環境下で30分間培養した。培養後、PBS(-)で2回洗浄した。洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。観察画像を図８に示す。 The suspension of HL-60 cells was added to a glass base dish in which HUVECs were cultured, and cultured for 30 minutes in a humid environment at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration. After culturing, the plate was washed twice with PBS (−). After washing, it was observed with a fluorescence microscope. An observation image is shown in FIG.
洗浄により、ガラスベースディシュに接着して培養されているHUVECはディッシュ上に残り、浮遊細胞であるHL-60細胞は、HUVECと接着していない場合はディッシュ上に残らないが、HUVECと接着している場合はディッシュ上に残る。HL-60細胞はCalcein AMで蛍光標識されているため、洗浄後の蛍光観察により蛍光が確認されれば、HL-60細胞とHUVECとが接着していることを示す。 By washing, HUVECs that adhere to the glass-based dish and remain on the dish remain on the dish, and HL-60 cells that are floating cells do not remain on the dish if they do not adhere to HUVEC, but adhere to HUVEC. If it remains on the dish. Since HL-60 cells are fluorescently labeled with Calcein AM, if fluorescence is confirmed by fluorescence observation after washing, it indicates that HL-60 cells and HUVEC are adhered.
図８中、ManMA(＋)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加したサンプルを示し、ManMA(−)はＮ−メタクリロイルマンノサミンを添加していないサンプルを示す。IL-1α（＋）はIL-1αを添加したサンプル、すなわちHUVEC上にＰ−セレクチンの発現が誘導されたサンプルを示し、IL-1α（−）はIL-1αを添加していないサンプルを示す。 In FIG. 8, ManMA (+) indicates a sample to which N-methacryloyl mannosamine is added, and ManMA (−) indicates a sample to which N-methacryloyl mannosamine is not added. IL-1α (+) indicates a sample to which IL-1α is added, that is, a sample in which the expression of P-selectin is induced on HUVEC, and IL-1α (−) indicates a sample to which IL-1α is not added. .
図８より、Ｎ−メタクリロイルマンノサミンを添加していない場合と、Ｎ−メタクリロイルマンノサミンを添加した場合との間に、蛍光量の差はなかった。すなわち、シアル酸残基がメタクリロイルシアル酸残基に置き換えられたHL-60細胞でも、置き換えられていない場合と同様に、Ｐ−セレクチンを発現しているHUVECに接着したことが示された。より具体的には、シアル酸残基がメタクリロイルシアル酸残基に置き換えられたＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１でも、Ｐ−セレクチンと結合するという本来の機能を発揮できることが示された。 From FIG. 8, there was no difference in the amount of fluorescence between the case where N-methacryloyl mannosamine was not added and the case where N-methacryloyl mannosamine was added. That is, it was shown that HL-60 cells in which sialic acid residues were replaced with methacryloyl sialic acid residues adhered to HUVEC expressing P-selectin as in the case where sialic acid residues were not replaced. More specifically, it was shown that P-selectin glycoprotein ligand-1 in which a sialic acid residue is replaced with a methacryloyl sialic acid residue can also exhibit the original function of binding to P-selectin.
Claims (7)
で表される基で置換されたシアル酸残基で置き換えられている、細胞から精製されたＰ−セレクチングリコプロテインリガンド−１。 At least one sialic acid residue constituting the sugar chain is represented by the general formula (1):
P-selectin glycoprotein ligand-1 purified from cells , which is replaced with a sialic acid residue substituted with a group represented by:
で表される化合物である、請求項４に記載の化合物連結Ｐ−セレクチングリコプロテインリガンド−１。 A compound having a nucleophilic group and / or a group represented by the general formula (1) is represented by the general formula (2):
The compound connection P-selectin glycoprotein ligand-1 of Claim 4 which is a compound represented by these.
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