JP6144873B2 - Ｉｒｅ１、ｓｒｃ、及びａｂｌ活性を調節するための方法及び組成物 - Google Patents

Description

関連する出願のクロスリファレンス
本出願は、2008年9月15日出願の米国仮特許出願第61/097,173号（本明細書中、その全体が参照として含まれる）に基づく優先権を主張する。

連邦政府の委託研究開発の規定による本発明の権利に関する声明
本発明は、国立衛生研究所のグラント(GM60641)及び国防総省グラント第W81XWH-06-1-0383号の援助を受けた。政府は本発明に一定の権利を有する。

真核生物中の全タンパク質の約1/3は、翻訳後プロセシング及び折り畳みのためにERに入る。タンパク質折り畳みの品質は、誤って折り畳まれた(misfolded)タンパク質によって活性化される、ER膜に内在するキナーゼ-リボヌクレアーゼIre1によってモニターされる。Ire1はmRNAをコードする転写因子の非スプライスソーム細胞質スプライシング反応を開始し、小胞体ストレス応答(unfolded protein response：UPR)と呼ばれるゲノムスケールの転写プログラムを開始する。スプライスされたmRNAの翻訳により、タンパク質合成に関与する遺伝子を活性化し、ER中で折り畳まれているタンパク質を修復する、酵母中ではHac1(Cox，J.S.ら、Cell 87巻：391-404頁(1996年))(非特許文献１)及び後生動物ではXbp1(Yoshida，H.ら、Cell 107巻：881-91(2001年))(非特許文献２)と呼ばれるUPR-特異的転写因子を産生する。このUPRは癌(Koong，A.C.ら、Cancer Biol Ther 5巻(2006年)(非特許文献３)；Ma，Y.ら、Nat Rev Cancer 4巻：966-77頁(2004年)(非特許文献４))、アルツハイマー病(Kudo，T.ら、Ann N Y Acad Sci 977巻：349-55頁(2002年)(非特許文献５))、種々の他の細胞異常(Zheng，Yら、J Microbiol 43巻：529-36頁(2005年)(非特許文献６)；Naidoo，N.ら、J Nuerochem 92巻：1150-7(2005年)(非特許文献７)；Doody，G.M.ら、Eur J Immunol 36巻：1572-82頁(2006年)(非特許文献８))で活性化し、このことは異常Ire1活性化と細胞機能障害との間の多くの可能性を示唆している。

UPRの間、ER-ルーメンドメイン(Lumenal domain：LD)は異常(unfolded)タンパク質のセンサーとして機能し、ER膜の面でIre1の側面自己会合(lateral self-association)を促進する(図１A)。特に精製されたLDは、二つのはっきりした結晶境界面をもつオリゴマーとして結晶化する。両方の境界面上のIre1表面残基はインビボでIre1活性化に寄与する(Credle，J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻：18773-84頁(2005年))(非特許文献９)。この知見は、UPRの間にIre1のオリゴマー化が早期に観察されることを説明しており(Shamu，C.E.ら、Embo J 15：3028-39頁(1996年))(非特許文献10)、ライフセルイメージング(life-cell imaging)によって知見され得るUPR-誘導フォーカスにおけるIre1組織化(Ire1 organization)の最初の構造的考察を提供する(Kimata，Y.ら、J Cell Biol 179巻：75-86(1997年))(非特許文献１１)。LDのオリゴマー化はER膜の細胞質側のIre1のキナーゼ-RNaseドメインの局所濃度を増加して、二量体化により酵素ドメインを活性化することが提案されてきた(Credle，J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻：18773-84頁(2005年))(非特許文献１２)。活性化のこのメカニズムは、多くのよく解明された細胞表面シグナル伝達受容体のものと似ている。たとえば、上皮成長因子受容体(EGFR)のリガンド誘導二量体化(Zhang，X．ら、Cell 125巻：1137-49頁(2006年))(非特許文献１３)は、キナーゼのN-及びC-ローブの開口と、よく保存されたαCへリックスと活性化ループの再配列とを含む構造変化を誘発することによってキナーゼドメインを活性化する(Zhang，Xら、Cell 125巻：1137-49頁(2006年))(非特許文献１３)。自己会合に加えて、Ire1の活性化は、自己リン酸化及び補助因子としてADPの結合を包含する。これらの事象はいずれも、RNaseを活性化させる構造変化を促進するものと考えられている(Papa，F.R．ら、Science 302巻：1533-7頁(2003年))(非特許文献１４)；Gonzalez，T.N.ら、Methods Mol Biol 160巻：25-36頁(2001年))(非特許文献１５)。

Ire1キナーゼ-RNaseドメインの結晶構造は報告されている(Lee，L.P.ら、Cell 132巻：89-100頁(2008年))(非特許文献１６)。この構造から、二つの独立した活性化部位をもつRNase二量体にコンパクトに結合したキナーゼドメインの背合わせ配置(back-to-back arrangement)の２回対称二量体(two-fold symmetric dimer)が明らかになった。この構造は、活性化ループ、ループと続くキナーゼドメインのαDへリックス、及びRNaseドメインの機能的に重要で外見上動的ループを除いてよく整列している。二量体でのキナーゼの背合わせ配置は予想外のことであった。というのも、この背合わせ配置は、二量体中のつながっている分子の活性部位から活性化ループ中のリン酸化部位を43〜48Å離して位置づけているからである。この配置は、インビボ(Shamu，C.E.ら、Embo J 16巻：3028-39頁(1996年))(非特許文献１７)及びインビトロ(Lee，L.P.ら、Cell 132巻：89-100頁(2008年))(非特許文献１６)で知見されるIre1のトランス-自己リン酸化に有効であるようにはみえない。RNaseドメインの二量体化は、HAC1/XBP1 mRNAにスプライス部位を含む保存タンデムステムループの認識を可能にすると提案された(Lee，L.P.ら、Cell 132巻：89-100頁(2008年))(非特許文献１６)(図１B)。

ERストレスと、糖尿病、タンパク質異常症及びウイルス感染などの多様なヒトの疾患との関連は、UPRを操作することによって発病機序を変える論理的思考を提供する。たとえば嚢胞性線維症では、細胞表面に示されるより多くのクロライド・チャネルを産生するためにタンパク質折り畳み能力を増加させることが有効であろう。他方、糖尿病では、膵臓細胞はUPR誘導アポトーシスがもとで死に、UPRのIre1分岐は細胞保護的であることが判明した。神経変性病及び他のタンパク質折り畳み疾患、たとえば失明に至る網膜色素変性症では、細胞はUPR誘導アポトーシスで死ぬ。同じ概念は、UPRが関与する他の多くの疾患に当てはまる。

本発明は、タンパク質を折り畳み、UPR誘導細胞死を防ぐための細胞の能力を薬理学的に調節する(たとえば様々な程度に増加または減少させる)ための予想外の手段を提供する。野生型Ire1を調節し得る最初の小分子及びその作用機序を提示する。さらにIre1モジュレータの作用機序と標的を検査するための着実且つ高効率アッセイと共に、新しいモジュレータを検査するための手段を提供する。

Cox，J.S.ら、Cell 87巻：391-404頁(1996年) Yoshida，H.ら、Cell 107巻：881-91(2001年) Koong，A.C.ら、Cancer Biol Ther 5巻(2006年) Ma，Y.ら、Nat Rev Cancer 4巻：966-77頁(2004年) Kudo，T.ら、Ann N Y Acad Sci 977巻：349-55頁(2002年) Zheng，Yら、J Microbiol 43巻：529-36頁(2005年) Naidoo，N.ら、J Nuerochem 92巻：1150-7(2005年) Doody，G.M.ら、Eur J Immunol 36巻：1572-82頁(2006年) Credle，J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻：18773-84頁(2005年) Shamu，C.E.ら、Embo J 15：3028-39頁(1996年) Kimata，Y.ら、J Cell Biol 179巻：75-86(1997年) Credle，J.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA、102巻：18773-84頁(2005年) Zhang，X．ら、Cell 125巻：1137-49頁(2006年) Papa，F.R．ら、Science 302巻：1533-7頁(2003年) Gonzalez，T.N.ら、Methods Mol Biol 160巻：25-36頁(2001年) Lee，L.P.ら、Cell 132巻：89-100頁(2008年) Shamu，C.E.ら、Embo J 16巻：3028-39頁(1996年)

本明細書では、式：
をもつIre1活性剤を開示する。式I中、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、独立して水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR¹⁵R¹⁶、-OR¹⁷、-COOR¹⁸、-SR¹⁹、-COR²⁰、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換へテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールであり；ここでR⁶及びR⁷は任意に結合して、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹及びR²⁰は、独立して、R³⁰-置換若しくは非置換アルキル、R³⁰-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換アリール、またはR³⁰-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³⁰は独立して、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R³¹-置換若しくは非置換アルキル、R³¹-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換へテロシクロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換アリール、またはR³¹-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³¹は、独立してハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換へテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。

別の側面では、細胞においてIre1活性を調節する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の有効量のIre1モジュレータまたは有効量のスニチニブと細胞とを接触させることを含む。

別の側面では、異常Ire1活性により生じる疾患の治療の必要な被験者で異常Ire1活性により生じる疾患を治療する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の治療的有効量のIre1モジュレータまたは治療的有効量のスニチニブを被験者に投与することを含む。

別の側面では、試験化合物におけるIre1活性化能を検出する方法を提供する。本方法は、溶液中で試験化合物と複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質とを接触させることを含む。複数のIre1タンパク質のオリゴマー化を検出し、これにより試験化合物におけるIre1調節活性を同定する。

別の側面では、試験化合物中のIre1不活化能を検出する方法を提供する。本方法は溶液中で試験化合物と複数のオリゴマー化Ire1タンパク質とを接触させることを含む。複数のオリゴマー化Ire1タンパク質を除去し、それにより形成している複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質を検出し、それにより試験化合物中のIre1不活化能を同定する。

別の側面では、Srcチロシンキナーゼ活性を調節する方法を提供する。本方法は、Srcチロシンキナーゼ(たとえば細胞中)と本明細書に記載の有効量のモジュレータとを接触させることを含む。

さらに別の側面では、Ablチロシンキナーゼ活性を調節する方法を提供する。本方法は、Ablチロシンキナーゼ(たとえば細胞中)と本明細書に記載の有効量のモジュレータとを接触させることを含む。

別の側面では、実質的に本明細書に記載の方法及び化合物を提供する。

自己会合によるIre1の活性化。A．小胞体(endoplasmic reticulum：ER)中の異常(折り畳まれていない)タンパク質はルーメンドメイン(LD)に結合し、Ire1のキナーゼ(K)とリボヌクレアーゼ（R）を活性化する。B．Ire1基質の略図を使用する。C．切断アッセイ及び構造決定で使用したIre1構築物。D．補因子を使用(＋ADP)または、補因子を使用しない(−ADP)で、5’-³²p-HP21を使用して得られたIre1KR、Ire1KR24及びIre1KR32の共同活性化プロフィール。 リンカーはIre1のオリゴマー化及び活性化を制御する。A．Ire1KRは試験した全ての濃度で溶解性であるが、Ire1KR32は10μM濃度より上では濁った溶液を形成する。B．凝集条件(a)のもとでのIre1KR32の分析超遠心により、モノマー、二量体、及び高次アセンブリが明らかになっている。C．塩は、共同的にIre1KR32のRNase活性を阻害する。D．Ire1KR32は、Ire1KR及びIre1KR24と比較して、HP21及びXBP1の切断時に高いRNase活性を示す。 キナーゼ阻害剤は野生型Ire1のRNaseを活性化する。A．セリン及びチロシンキナーゼの阻害剤はIre1KR32のRNaseを活性化する。B．Ire1KR32キナーゼのATPポケットに結合したAPY29の十分に分解された電子密度。C．Ire1KR32キナーゼのAPY29とATPポケットとの間の相互作用のネットワーク。D．点線で表されたIre1への提案された水素結合をもつAPY24、スニチニブ及びAIN54。E．Ire1二量体構造中のIre1キナーゼのADP-MgとATPポケットとの間の相互作用のネットワーク。F．ADPの存在下では反応緩衝液由来のマグネシウムのキレート化によりIre1KR32のRNase活性化は阻害されるが、APY29は阻害されない。 Ire1の細胞質ドメインにより形成されたオリゴマーの構造。A．伸張管状オリゴマー内のIre1KR32アセンブリ。B．逆平行二重鎖配置のオリゴマー中のモノマーパック。C．Ire1KR32・APY29のIF1は、Ire1-ADP共結晶構造中のものに似ている。D．IF2は、２回非結晶学的対称性をもち、新しいRNase-RNase境界面(IF2)並びにより小さなキナーゼ-RNase境界面(IF2)を形成する対角線上に位置するIre1モノマーを含む。E．IF3はオリゴマーの同一「ストランド」のモノマー間に形成し、キナーゼ-キナーゼ相互作用のみを含み、トランス自己リン酸化のためにうまく活性化ループを位置づける。 Ire1の三つの境界面はRNase活性に寄与する。A．オリゴマー内におけるIre1の三つの境界面と新しい構造エレメントの位置。B．三つの境界面のそれぞれにおける側鎖間の接触。C．Ire1のRNase活性は、IF1、IF2及びIF3における接触を弱めるため、または分離させるために設計された変形の際に大きく減少する。 Ire1活性化モデル。A．Ire1KR32は、二つのステムループをもつXBP1と同じ速度で一つのステムループをもつ切断XBP1(XBP1/PstI)を切断する。B．(a)におけるゲルの定量化及びデータの単一指数関数最小二乗法フィッティング。C．一つ及び二つのステムループをもつ基質の切断速度の比較。D．HLEの3’-a4ループの二つのコンフォメーション。E．UPRの間のIre1の一般的なモデル。 使用したタンパク質及びRNA構築物の配列。Ire1構築物の概観。 イントロン配列に下線を付したRNA構築物。 Ire1KR32の電子密度例。A．高い非結晶学的対称性(non-crystallographic symmetry：NCS)により3.9Å解像度で解像したIre1KR32の側鎖。B．鎖Aを示すαD-へリックスの電子密度図。C．鎖Aの活性化ループの電子密度。D．オープンコンフォメーション中のa3’へリックスとa3’-a4ループの電子密度(鎖B)。E．クローズドコンフォメーション中のa3’へリックスとa3’-a4ループの電子密度(鎖A)。 Ire1オリゴマーの二重らせん構造。 Ire1KR32のリン酸化状態を決定するためのIre1KR32の質量分析。 Ire1のRNaseドメインのオリゴマー構造。 Ire1の活性化におけるリン酸化の役割。A．Ire1KR32の非リン酸化変異体(D828A)は共同オリゴマー化により活性化する。B．非リン酸化Ire1KR32は補因子に対して活性が低い。C．オリゴマー中の活性化ループの位置は、CDK2-型キナーゼの従来のオープン(リン酸化)状態に対応する。 インビボでのIre1フォーカスのモデル構造。A．Ire1の細胞質ドメイン(現在の構造)とルーメンドメイン(PDB ID 2bel)の結晶構造におけるフィラメント軸に沿ったモノマー充填密度の比較。B．オリゴマールーメンドメインのフィラメント(上)、モデル化膜及びオリゴマー細胞質ドメインの幾つかのコピー(図４Aと同じ方向)。 データ収集及び精密化値。 Ire1KR32のMALDIスペクトルにないトリプシンペプチド。 HEK293細胞におけるAPY29及びAPY24によるIre1活性化。 例示化合物によるUPR阻害。 例示化合物によるUPR活性化。 例示化合物によるRNA-切断ベースのyIre1活性化アッセイ。 予備活性化された条件のもとで精製Ire1によるRNA切断ベースのyIre1阻害アッセイ。ここでは、幾つかの化合物、特にAPY81がIre1を阻害する。従って、数種のAPY化合物は、実験設定に依存して、Ire1 RNase阻害剤またはIre1 RNase活性剤の両方として機能できた。 予備活性化された条件のもとで精製Ire1によるRNA切断ベースのyIre1阻害アッセイ。ここでは、幾つかの化合物、特にAPY81がIre1を阻害する。従って、数種のAPY化合物は、実験設定に依存して、Ire1 RNase阻害剤またはIre1 RNase活性剤の両方として機能できた。 APY29及びAD75のhIre1を使用する滴定。

I．略号及び定義
本明細書中で使用した略号は、化学及び生物学の分野の通常の意味をもつ。

置換基が左から右へかかれた通常の化学式により特定される場合、これらは等しく、右から左へ構造を書かれたものと化学的に同一置換基を包含する、たとえば-CH₂O-は-OCH₂-と等価である。

「アルキル」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、他に記載しないかぎり、直鎖（即ち、分岐でない）若しくは分岐炭素鎖、またはその組み合わせを意味し、指定の炭素原子数（即ちＣ₁−Ｃ₁₀は、１から１０個の炭素原子を意味する）を持つ。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、同族体及びその異性体、たとえばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、一つ以上の二重結合または三重結合をもつものがある。

「アルキレン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、これらに限定されないが、-CH₂CH₂CH₂CH₂-により例示されるようにアルキルから誘導される二価基を意味する。通常、アルキル(またはアルキレン)基は、1〜24個の炭素原子をもつが、本発明では10個以下の炭素原子をもつものが好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、一般に8個以下の炭素原子をもつ短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。

「ヘテロアルキル」なる用語はそれ自体または別の用語と組み合わせて、他に記載しない限り、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子と少なくとも１個の炭素原子とからなる、安定な直鎖若しくは分岐、またはその組み合わせを意味し、ここで窒素及び硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、窒素へテロ原子は任意に四級化されていてもよい。（単数または複数種類の）ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＳｉは、アルキル基が分子の残余に結合している位置またはヘテロアルキル基の任意の内側部分に配置し得る。例としては、−ＣＨ₂ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ₂、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ（Ｏ）₂−ＣＨ₃ 、−Ｓｉ（ＣＨ₃）₃ 、Ｏ−ＣＨ₃、−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₃、及び−ＣＮが挙げられるが、これらに限定されない。最大２個のヘテロ原子が連続することができ、たとえば、−ＣＨ₂−ＮＨ−ＯＣＨ₃及び−ＣＨ₂−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ₃）₃がある。同様に「ヘテロアルキレン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、これらに限定されないが、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、及び−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₂−に例示されるヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基に関しては、ヘテロ原子は、鎖末端のどちらかまたは両方も占めることができる（たとえば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン結合基に関しては、結合基の式がかかれている方向によって結合基の方向は暗示されない。たとえば、式：−Ｃ（Ｏ₂）Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）₂Ｒ’−及び−Ｒ’Ｃ（Ｏ）₂−の両方を表す。上記のように、本明細書中で使用するヘテロアルキル基としては、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＯＲ’、−ＳＲ’及び／または−ＳＯ₂Ｒ’などのヘテロ原子を介して分子の残余に結合している基も含む。「ヘテロアルキル」に続いて特定のヘテロアルキル基、たとえば−ＮＲ’Ｒ”などを列挙する場合、ヘテロアルキル及び−ＮＲ’Ｒ”の用語は、重複でも互いに排他的でもない。むしろ具体的なヘテロアルキル基は明確性を加えるために列挙される。従って、「ヘテロアルキル」なる用語は、本明細書中、−ＮＲ’Ｒ”などの具体的なヘテロアルキル基を除外するものとして解釈されるべきではない。

「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」なる用語はそれ自体または別の用語と組み合わせて、他に記載しない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環式バージョンを表す。さらに、ヘテロシクロアルキルに関しては、ヘテロ原子は、その複素環が分子の残余に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」は、それぞれシクロアルキル及びヘテロシクロアルキルから誘導される二価基をさす。

「ハロ」または「ハロゲン」なる用語はそれ自体または別の置換基の一部として、他に記載しない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを包含するものである。たとえば、「ハロ(C₁-C₄)アルキル」なる用語としては、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

「アリール」なる用語は、他に記載しない限り、互いに融合または共有結合的に結合している1個の環または複数の環(好ましくは1〜3個の環)であり得る、多価不飽和、芳香族炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」なる用語は、N、O及びSから選択される1〜4個のヘテロ原子を含むアリール基(または環)をさし、ここで窒素及び硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、(単数または複数の)窒素原子は任意に四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残余に結合することができる。アリール及びヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル及び6-キノリルが挙げられる。上記アリール及びヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。「アリーレン」及び「ヘテロアリーレン」は、それぞれアリール及びヘテロアリールから誘導される二価基をさす。「融合環」は、少なくとも1つの結合と二つの原子を共通してもつ二つ以上の環の環系をさす。従って「融合環アリール」及び「融合環ヘテロアリール」は、別の環と共通して少なくとも1個の結合と2個の原子を共有する、それぞれ少なくとも1個のアリール及びヘテロアリールをもつ環系をさす。

簡潔にするために、他の用語と組み合わせて使用する際(たとえば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル)に「アリール」なる用語は、上記定義のアリール及びヘテロアリール環の両方を包含する。従って、「アリールアルキル」なる用語は、アリール基が、炭素原子(たとえばメチレン基)が酸素原子によって置換されたアルキル基(たとえばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど)などのアルキル基(たとえばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)に結合している基を包含するものとする。

本明細書中で使用する「オキソ」なる用語は、炭素原子に二重結合している酸素を意味する。

本明細書中で使用する「アルキルスルホニル」なる用語は、式：-S(O₂)-R’｛式中、R’は上記定義のアルキル基である｝をもつ部分を意味する。R’は、指定数の炭素をもつことができる(たとえば、「C₁-C₄アルキルスルホニル」)。

それぞれの基について好ましい置換基を以下に提供する。

アルキル及びヘテロアルキル基の置換基は、ゼロ〜（２ｍ’＋１）（ここでｍ’はそのような基の中の総炭素数である）を変動する数の−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ₂Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）₂Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）₂Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）₂ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ₂Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ₂から選択される種々の基の一つ以上であり得るが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””は好ましくはそれぞれ独立して、水素、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール（たとえば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基をさす。本発明の化合物が二つ以上のＲ基を含むとき、たとえばＲ基はそれぞれが独立してＲ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””基の二つ以上が存在するときにそれぞれＲ’、Ｒ”、Ｒ”’及びＲ””基であるように選択される。Ｒ’及びＲ”が同一窒素原子に結合しているとき、これらは窒素原子と結合して４−、５−、６−または７−員環を形成することができる。たとえば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを包含するものとするが、これらに限定されない。

アルキル基について記載された置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基の置換基は変動し、ゼロ〜芳香環系上のあいている価(open valence)の総数を変動する数のハロゲン、-OR’、-NR’R”、-SR’、-ハロゲン、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)=NR”’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN及び-NO₂、-R’、-N₃、-CH(Ph)₂、フルオロ(C₁-C₄)アルコキシ、及びフルオロ(C₁-C₄)アルキルから選択され、ここでR’、R”、R”’及びR””は好ましくはそれぞれ独立して、水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール並びに置換若しくは非置換ヘテロアリール基から選択される。本発明の化合物が二つ以上のR基を含むとき、たとえばR基はそれぞれが独立してR’、R”、R”’及びR””基の二つ以上が存在するときにそれぞれR’、R”、R”’及びR””基であるように選択される。

アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうち二つは、任意に、式：-T-C(O)-(CRR’)_q-U-｛式中、T及びUは独立して-NR-、-O-、-CRR’-または一重結合であり、qは0〜3の整数である｝の環を形成していてもよい。あるいはアリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうち二つは、任意に、式：-A-(CH₂)_r-B-｛式中、A及びBは独立して-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-または一重結合であり、rは1〜4の整数である｝の置換基で置換されていてもよい。このようにして形成した新しい環の一重結合の一つは、任意に二重結合により置換されていてもよい。あるいはアリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基のうち二つは、任意に、式：-(CRR’)_s-X’-(C”R”’)_d-｛式中、s及びdは独立して0〜3の整数であり、X’は-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-または-S(O)₂NR’-である｝の置換基で置換されていてもよい。置換基R、R’、R”及びR”’は、好ましくは独立して水素、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、及び置換若しくは非置換ヘテロアリールから選択される。

本明細書中で使用するように、「ヘテロ原子」または「環へテロ原子」なる用語は、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)、リン(P)、及びケイ素(Si)を包含するものとする。

本明細書中で使用する「置換基」とは、以下の部分から選択される基を意味する。
(A)-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-NO₂、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、並びに
(B)以下のものから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール：
(i)オキソ、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-NO₂、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、及び
(ii)以下のものから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール：
(a)オキソ、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-NO₂、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、並びに
(b)オキソ、-OH、-NH₂、-SH、-CN、-CF₃、-NO₂、ハロゲン、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、及び非置換ヘテロアリールから選択される少なくとも一つの置換基で置換された、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール。

本明細書中で使用する「サイズが限定された置換基(size-limited substituent)」または「サイズが限定された置換基(size-limited substituent group)とは、「置換基」に関して先に記載された全ての置換基から選択される基を意味し、ここで各置換若しくは非置換アルキルは置換または非置換C₁-C₂₀-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテロアルキルは置換若しくは非置換2〜20員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは置換若しくは非置換C₄-C₈シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは置換若しくは非置換の4〜8員のヘテロシクロアルキルである。

本明細書中で使用する「低級置換基」または「低級の置換基(lower substituent group)」なる用語は、「置換基」に関して先に記載した全ての置換基から選択される基を意味し、ここで各置換若しくは非置換アルキルは置換または非置換C₁-C₈-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテロアルキルは置換若しくは非置換2〜8員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは置換若しくは非置換C₃-C₇シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは置換若しくは非置換の3〜7員のヘテロシクロアルキルである。

「医薬的に許容可能な塩」なる用語は、本明細書に記載の化合物で知見される特定の置換基に依存して、比較的非毒性の酸または塩基で製造された活性化合物の塩を含むものとする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、塩基付加塩は、ニートまたは好適な不活性溶媒中、かかる化合物の中性形と、十分量の所望の塩基とを接触させることにより得ることができる。医薬的に許容可能な塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ若しくはマグネシウム塩または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、酸付加塩は、ニートまたは好適な不活性溶媒中、かかる化合物の中性形と、十分量の所望の酸とを接触させることにより得ることができる。医薬的に許容可能な酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素(monohydrogencarbonic)、リン酸、リン酸一水素(monohydrogenphosphoric)、リン酸二水素(dihydrogenphosphoric)、硫酸、硫酸一水素(monohydrogensulfuric)、ヨウ化水素酸または亜リン酸などの無機酸から誘導されたもの、並びに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、琥珀酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トシルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的非毒性の有機酸から誘導された塩が挙げられる。アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、及びグルクロン酸またはガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる(たとえばBergeら、“Pharmaceutical Salts”、Journal of Pharmaceutical Science、1977年、66巻、1〜19頁参照)。本発明の特定の具体的な化合物は、化合物が塩基または酸付加塩のいずれかに転換され得る塩基性及び酸性官能基のいずれをも含む。

従って本発明の化合物は、医薬的に許容可能な酸との塩として存在することができる。本発明はそのような塩を含む。かかる塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩((+)-酒石酸塩、(−)-酒石酸塩若しくはラセミ混合物を含むその混合物、琥珀酸塩、安息香酸塩並びにグルタミン酸などのアミノ酸との塩が挙げられる。

本化合物の中性形は好ましくは、この塩と塩基または酸とを接触させ、慣用法で親化合物を単離することによって再生する。本化合物の親形は、極性溶媒中の溶解性など特定の物理的特性における種々の塩形とは異なる。

塩形に加えて、本発明の化合物はプロドラッグ形である化合物を提供する。本明細書中で記載する化合物のプロドラッグは、本発明の化合物を提供するために生理学的条件下で化学的変化を直ちに受ける化合物である。さらに、プロドラッグは、生体外環境で化学的または生化学的方法により本発明の化合物に転換することができる。たとえば、好適な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバ中に収めると、プロドラッグは本発明の化合物にゆっくりと転換することができる。

本発明の特定の化合物は、非溶媒和形並びに水和形などの溶媒和形で存在することができる。通常、溶媒和形は非溶媒和形と等価であり、本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形またはアモルファス形で存在することができる。通常、全ての物理形が本発明により考えられている使用に関して等価であり、本発明の範囲内である。

本発明の特定の化合物は、非対称炭素原子(光学中心)または二重結合をもつ；ラセミ化合物、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体及び個々の異性体は本発明の範囲内に含まれる。本発明の化合物は、合成及び/または単離するのに不安定すぎることが当業界で公知であるものを含まない。

本発明の化合物は、かかる化合物を構築する原子の一つ以上で不自然な割合の原子同位体(atomic isotope)を含むこともある。たとえば本化合物は、トリチウム(³H)、ヨウ素-125(¹²⁵I)または炭素-14(¹⁴C)などの放射性同位体でラベル付けできる。放射性であろうとなかろうと、本発明の化合物の全同位体変種は、本発明の範囲内に含まれる。

本明細書中で使用される「ひとつの(a、an)」なる用語は、一つ以上を意味する。さらに本明細書中で使用される「ひとつの〜で置換された」なる用語は、指名された置換基の任意の一つ以上または全てで置換され得る特定の基を意味する。たとえば、アルキルまたはヘテロアリール基などの基が「非置換C₁-C₂₀アルキル、または非置換2〜20員のヘテロアルキル」で置換される場合、この基は一つ以上の非置換C₁-C₂₀アルキル、及び/または一つ以上の非置換2〜20員のヘテロアルキルを含むことができる。

本明細書中で使用する「疾患を治療する方法」とは、病態、病態により生じる状態または病徴を治療する方法をさす。「治療する」なる用語及びその活用は疾患の予防を包含する。

「スニチニブ(Sunitinib)」は、N-[2-(ジエチルアミノ)エチル]-5-[(Z)-(5-フルオロ-1,2-ジヒドロ-2-オキソ-3H-インドール-3-イリジン)メチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボキサミド及びその医薬的に許容可能な塩(たとえばCAS番号341031-54-7)である。

「ペプチド」とはモノマーがアミノ酸であり、且つアミド結合を介して一緒に結合しているポリマーであり、「ポリペプチド」または「ペプチド」とも称される。「タンパク質」なる用語は、ポリペプチド、タンパク質を包含する。非天然アミノ酸、たとえばβ-アラニン、フェニルグリシン及びホモアルギニンも本定義に含まれる。遺伝子によりコードされていないアミノ酸も本発明で使用することができる。さらに、反応基を含むよう修飾したアミノ酸も本発明で使用できる。本発明で使用される全てのアミノ酸は、D-またはL-異性体のいずれかである。L-異性体が一般的に好ましい。さらに本発明では他のペプチド模倣薬も有用である。一般的な評論に関しては、Spatola，A.F．のCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS、B．Weinstein編、Marcel Dekker、ニューヨーク、267頁(1983年)を参照されたい。従って、Ire1タンパク質(本明細書中、簡単に「Ire1」とも称される)は、組み換えIre1タンパク質並びに同一Ire1タンパク質のコピーまたは種々の供給源(たとえば、ヒトIre1、マウスIre1、酵母Ire1)由来のバージョンを包含する。Ire1タンパク質がオリゴマー化される場合には、オリゴマーを形成するIre1タンパク質は同一または異なる供給源由来であってもよい。

II．モジュレータ
本明細書では、式：
をもつIre1モジュレータを開示する。

式Iにおいて、R⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、独立して水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR¹⁵R¹⁶、-OR¹⁷、-COOR¹⁸、-SR¹⁹、-COR²⁰、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、ここでR⁶及びR⁷は任意に結合して、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成してもよい。

ある態様ではR⁵、R⁶、R⁷及びR⁸は、独立して水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR¹⁵R¹⁶、-OR¹⁷、-COOR¹⁸、-SR¹⁹、-COR²⁰、R²⁶-置換若しくは非置換アルキル、R²⁶-置換若しくは非置換へテロアルキル、R²⁶-置換若しくは非置換シクロアルキル、R²⁶-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R²⁶-置換若しくは非置換アリール、またはR²⁶-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R²⁶は独立して、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R²⁷-置換若しくは非置換アルキル、R²⁷-置換若しくは非置換へテロアルキル、R²⁷-置換若しくは非置換シクロアルキル、R²⁷-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R²⁷-置換若しくは非置換アリール、またはR²⁷-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、R⁶及びR⁷は結合して、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルまたは置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成する。たとえばR⁶及びR⁷は結合して、置換若しくは非置換ピラゾール、または置換若しくは非置換トリアゾールを形成する。ある態様では、R⁶及びR⁷は結合して置換若しくは非置換ピラゾールを形成する。ある態様では、R⁶及びR⁷は結合してR²⁸-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルまたはR²⁸-置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成する。R²⁸は独立してハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R²⁹-置換若しくは非置換アルキル、R²⁹-置換若しくは非置換へテロアルキル、R²⁹-置換若しくは非置換シクロアルキル、R²⁹-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R²⁹-置換若しくは非置換アリール、またはR²⁹-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、R⁵は、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R⁵は置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、R⁵は、置換若しくは非置換ピラゾリル、置換若しくは非置換フラニル、置換若しくは非置換イミダゾリル、置換若しくは非置換イソキサゾリル、置換若しくは非置換オキサジアゾリル、置換若しくは非置換オキサゾリル、置換若しくは非置換ピロリル、置換若しくは非置換ピリジル、置換若しくは非置換ピリミジル、置換若しくは非置換ピリダジニル、置換若しくは非置換チアゾリル、置換若しくは非置換トリアゾリル、置換若しくは非置換チエニル、置換若しくは非置換ジヒドロチエノ-ピラゾリル、置換若しくは非置換チアナフテニル、置換若しくは非置換カルバゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチエニル、置換若しくは非置換ベンゾフラニル、置換若しくは非置換インドリル、置換若しくは非置換キノリニル、置換若しくは非置換キナゾリニル、置換若しくは非置換ベンゾトリアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾオキサゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換イソキノリニル、置換若しくは非置換イソインドリル、置換若しくは非置換アクリジニル、置換若しくは非置換ベンゾイサゾリル、または置換若しくは非置換ジメチルヒダントインである。ある態様では、R⁵は5-員または6-員のR²⁶-置換若しくは非置換の窒素含有ヘテロアリールである。ある態様では、R⁵はR²⁶-置換若しくは非置換ピリミジル、またはR²⁶-置換若しくは非置換キナゾリニルである。

R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹及びR²⁰は、独立して、R³⁰-置換若しくは非置換アルキル、R³⁰-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³⁰-置換若しくは非置換アリール、またはR³⁰-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³⁰は独立してハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R³¹-置換若しくは非置換アルキル、R³¹-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³¹-置換若しくは非置換アリール、またはR³¹-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

R²⁷、R²⁹及びR³¹は独立して、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、Ire1モジュレータは、式：
を有する。

理論に拘束されるものではないが、上記の3-窒素モチーフは、Ire1調節機能に関与するものと考えられる。

式IIにおいて、R⁵は式Iの記載で定義されたとおりである。

式IIにおいて、R¹は水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR⁹R¹⁰、-OR¹¹、-COOR¹²、-SR¹³、-COR¹⁴、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R¹は、R³²-置換若しくは非置換アルキル、R³²-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³²-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換アリール、またはR³²-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³²は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R³³-置換若しくは非置換アルキル、R³³-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³³-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³³-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³³-置換若しくは非置換アリール、またはR³³-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、R¹はR³²-置換若しくは非置換C₁-C₁₀アルキル、R³²-置換若しくは非置換2〜10員のヘテロアルキル、R³²-置換若しくは非置換C₃-C₈シクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換3〜8員のヘテロシクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換アリール、R³²-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。別の態様では、R¹はR³²-置換若しくは非置換C₁-C₅アルキル、R³²-置換若しくは非置換2〜5員のヘテロアルキル、R³²-置換若しくは非置換C₃-C₆シクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換5若しくは6員のヘテロシクロアルキル、R³²-置換若しくは非置換アリール、R³²-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R¹は非置換C₁-C₅アルキルまたは非置換C₃-C₆シクロアルキルである。ある態様では、R¹は非置換C₃-C₆シクロアルキル、たとえばシクロプロピルである。他の態様では、R³²-置換若しくは非置換5若しくは6員のヘテロシクロアルキル、たとえば非置換チエニルまたはC₁-C₄-置換チエニルである。

R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³及びR¹⁴は、独立して、水素、R³⁴-置換若しくは非置換アルキル、R³⁴-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³⁴-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³⁴-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³⁴-置換若しくは非置換アリール、またはR³⁴-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³⁴は独立してハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R³⁵-置換若しくは非置換アルキル、R³⁵-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³⁵-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³⁵-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³⁵-置換若しくは非置換アリール、またはR³⁵-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

R³³及びR³⁵は独立してハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。

別の態様では、Ire1モジュレータは式：
を有する。

式IIIにおいて、R¹は式IIの記載でR¹に関して定義されたとおりである。

同様に、R²は、独立して水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR⁹R¹⁰、-OR¹¹、-COOR¹²、-SR¹³、-COR¹⁴、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³及びR¹⁴は、独立して式IIの記載において定義されたとおりである。

R²は置換若しくは非置換C₁-C₁₀アルキル、置換若しくは非置換2〜10員のヘテロアルキル、置換若しくは非置換C₃-C₈シクロアルキル、置換若しくは非置換3〜8員のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリールでありえる。

ある態様では、R²はR³-置換若しくは非置換アリールまたはR³-置換若しくは非置換へテロアリールである。たとえばR²はR³-置換若しくは非置換フェニルでありえる。R³は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、-SH、-NO₂、オキソ、-NHR⁴、R⁴-置換若しくは非置換アルキル、R⁴-置換若しくは非置換へテロアルキル、R⁴-置換若しくは非置換シクロアルキル、R⁴-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R⁴-置換若しくは非置換アリール、またはR⁴-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R⁴は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、-SH、-NO₂、オキソ、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。

他の態様では、R²は、置換若しくは非置換フェニル、置換若しくは非置換ピラゾリル、置換若しくは非置換フラニル、置換若しくは非置換イミダゾリル、置換若しくは非置換イソキサゾリル、置換若しくは非置換オキサジアゾリル、置換若しくは非置換オキサゾリル、置換若しくは非置換ピロリル、置換若しくは非置換ピリジル、置換若しくは非置換ピリミジル、置換若しくは非置換ピリダジニル、置換若しくは非置換チアゾリル、置換若しくは非置換トリアゾリル、置換若しくは非置換チエニル、置換若しくは非置換ジヒドロチエノ-ピラゾリル、置換若しくは非置換チアナフテニル、置換若しくは非置換カルバゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチエニル、置換若しくは非置換ベンゾフラニル、置換若しくは非置換インドリル、置換若しくは非置換キノリニル、置換若しくは非置換ベンゾトリアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾチアゾリル、置換若しくは非置換ベンゾオキサゾリル、置換若しくは非置換ベンズイミダゾリル、置換若しくは非置換イソキノリニル、置換若しくは非置換イソインドリル、置換若しくは非置換アクリジニル、置換若しくは非置換ベンゾイサゾリル、または置換若しくは非置換ジメチルヒダントインである。R²は置換若しくは非置換フェニル、または置換若しくは非置換ベンズイミダゾリルであってもよい。別の態様では、R²は非置換フェニル、または非置換ベンズイミダゾリルであってもよい。ある態様では、R²は置換若しくは非置換の融合環アリール、または置換若しくは非置換の融合環ヘテロアリール、たとえば置換若しくは非置換ベンズイミダゾリルまたは置換若しくは非置換ベンゾチアゾリルであってもよい。

別の態様では、Ire1モジュレータは、式：
を有する。

式IV及びVにおいて、R¹は式IIの記載において定義したとおりである。

同様に、R²¹及びR²²は、独立して水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR⁹R¹⁰、-OR¹¹、-COOR¹²、-SR¹³、-COR¹⁴、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R²¹及びR²²は、独立して、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR⁹R¹⁰、-OR¹¹、-COOR¹²、-SR¹³、-COR¹⁴、R²⁵-置換若しくは非置換アルキル(たとえばC₁-C₁₀-アルキル)、R²⁵-置換若しくは非置換へテロアルキル(たとえば2〜10員)、R²⁵-置換若しくは非置換シクロアルキル、R²⁵-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R²⁵-置換若しくは非置換アリール、またはR²⁵-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。

R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³及びR¹⁴は、独立して式IIの記載において定義されたとおりである。

R²⁵は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、-NO、-SH、-NO₂、オキソ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R²⁵は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、-SH、-NO₂、オキソ、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。

ある態様では、R²¹は、-CN、-NO、-NO₂、-OH、-COOR¹²、-SR¹³、置換若しくは非置換アルキル(たとえばC₁-C₁₀アルキル)、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R²¹は、R²⁵-置換若しくは非置換アルキルC₁-C₄アルキル、またはR²⁵-置換若しくは非置換2〜4員へテロアルキルである。ある態様では、R²⁵は、-CN、-CF₃、-OHまたはオキソである。ある態様では、R²¹は-CH₂-CNである。他の態様では、R²¹は-CH₂CH₂OHである。他の態様では、R²¹は-NH-CO-CH₃である。

式Vにおいて、XはNHまたはSである。ある態様では、XはNHである。

記号x及びzは独立して0〜5の整数である。ある態様ではx及びzは独立して0または1である。一態様において、zは1である。別の態様ではxは0である。

さらに別の態様では、Ire1モジュレータは式：
を有する。

式VIにおいて、R¹、R²¹及びzは、式IVの記載において定義したとおりである。

ある態様では、zは１より多く、二つの隣接するR²¹置換基は結合して、置換若しくは非置換アリールまたは置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成する。一態様において、二つの隣接するR²¹置換基は結合して置換若しくは非置換チアゾリルまたは置換若しくは非置換イミダゾリルを形成する。

記号yは0〜4の整数である。ある態様では、yは0、1または2である。

R³⁶は独立して、水素、ハロゲン、-CN、-NO、-NO₂、-NR⁹R¹⁰、-OR¹¹、-COOR¹²、-SR¹³、-COR¹⁴、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³及びR¹⁴は、独立して式IIの記載において定義されたとおりである。ある態様では、R³⁵は置換若しくは非置換C₁-C₁₀アルキルである。一態様において、R³⁶は非置換C₁-C₄アルキル、たとえばメチルである。

ある態様では、yは１より大きく、二つの隣接するR³⁶置換基は結合して、置換若しくは非置換アリールまたは置換若しくは非置換ヘテロアリールを形成する。ある態様では、二つの隣接するR³⁶置換基は結合して、一態様においてIre1モジュレータが式：
を有するように、置換若しくは非置換フェニルを形成する。

式VIIにおいて、R¹、R²¹及びzは、式VIの記載において定義したとおりである。

別の態様では、Ire1モジュレータは式：
を有する。

式VIIIにおいて、R¹は、式VIの記載において定義したとおりである。

式VIIIにおいて、Lは結合、置換若しくは非置換アルキレン、置換若しくは非置換ヘテロアルキレン、-NH-C(O)-、または-NH-C(O)-NH-である。ある態様では、Lは結合、R³⁸-置換若しくは非置換アルキレンまたはR³⁸-置換若しくは非置換ヘテロアルキレンである。R³⁸は、ハロゲン、オキソ、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R³⁹-置換若しくは非置換アルキル、R³⁹-置換若しくは非置換へテロアルキル、R³⁹-置換若しくは非置換シクロアルキル、R³⁹-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R³⁹-置換若しくは非置換アリール、またはR³⁹-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R³⁹は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。ある態様では、LはR³⁸-置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、ここでR³⁸はオキソである。ある態様では、Lは-NH-C(O)-または-NH-C(O)-NH-である。

式VIIIでは、環Aはアリールまたはヘテロアリールである。ある態様では、環Aはアリール、例えばフェニルである。

式VIIIにおいて、R³⁷は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換へテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、または置換若しくは非置換ヘテロアリールである。ある態様では、R³⁷は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、R⁴⁰-置換若しくは非置換アルキル、R⁴⁰-置換若しくは非置換へテロアルキル、R⁴⁰-置換若しくは非置換シクロアルキル、R⁴⁰-置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、R⁴⁰-置換若しくは非置換アリール、またはR⁴⁰-置換若しくは非置換ヘテロアリールである。R⁴⁰は、ハロゲン、-CN、-CF₃、-OH、-NH₂、-SO₂、-COOH、非置換アルキル、非置換へテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、または非置換ヘテロアリールである。一態様において、R³⁷は、置換若しくは非置換C₁-C₄アルキルである。一態様において、R³⁷は-CF₃である。

記号wは0〜5の整数である。一態様において、wは0または1である。別の態様では、wは1である。

本明細書に記載の式の幾つかの態様では、置換されたそれぞれの基は、少なくとも一つの置換基で置換されている。より具体的には、ある態様では上記式の化合物において記載されたそれぞれの置換されたアルキル、置換されたヘテロアルキル、置換されたアルキレン、置換されたヘテロアルキレン、置換されたシクロアルキル、置換されたヘテロシクロアルキル、置換されたアリール及び置換されたヘテロアリールは、少なくとも一つの置換基で置換されている。別の態様では、これらの基の少なくとも一つまたは全てが少なくとも一つのサイズが限定された置換基(size-limited substituent)で置換されている。あるいは、これらの基の少なくとも一つまたは全てが少なくとも一つの低級の置換基(lower substituent group)により置換されている。

上記式の化合物の別の態様では、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換C₁-C₂₀-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテロアルキルは置換若しくは非置換2〜20員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換アルキレンは、置換若しくは非置換C₁-C₂₀アルキレンであり、各置換若しくは非置換へテロアルキレンは、置換若しくは非置換2〜20員のヘテロアルキレンであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換C₃-C₈シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換3〜8員のヘテロシクロアルキルである。

ある態様では、各置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換C₁-C₈-アルキルであり、各置換若しくは非置換へテロアルキルは置換若しくは非置換2〜8員のヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換アルキレンは、置換若しくは非置換C₁-C₈アルキレンであり、各置換若しくは非置換へテロアルキレンは、置換若しくは非置換2〜8員のヘテロアルキレンであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換C₃-C₇(たとえばC₅-C₇)シクロアルキルであり、及び各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換3〜7(たとえば5〜7)員のヘテロシクロアルキルである。

本明細書に記載の式のある態様では、化合物は塩基の隣接員に結合している少なくとも二つの置換基を含むことができる。これらの態様において、二つの隣接する置換基は任意に結合してアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を形成していてもよい。

別の態様では、Ire1モジュレータ化合物は、以下の式の一つを有する。

別の態様では、Ire1モジュレータ化合物は、以下の式の一つを有する。

一態様において、化合物はAD75である。

別の態様では、Ire1モジュレータ化合物は以下の式の化合物である。

一態様において、本化合物は、たとえば化合物AD75、AD74、AD76、AD77、APY29、APY69、APY24、APY76、APY83、APY77、APY67、APY65、APY84及びAPY85はIre１の顕著な活性化を示す。別の態様では、本化合物は、たとえば化合物APY69、APY24、APY76、APY83、APY65、APY84及びAPY82はIre1の顕著なインビボ活性化を示す。さらに別の態様では、本化合物は、たとえば化合物APY84、APY33、APY81、APY80、APY79及びAPY86はIre1の顕著な阻害を示す。

III．方法
別の側面では、細胞でのIre1活性を調節する方法を提供する。本方法は、細胞と有効量の上記Ire1モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)または有効量のスニチニブとを接触させることを含む。ある態様では、細胞はヒト細胞などの哺乳細胞である。細胞はインビトロに単離されるか、インビトロ組織の一部を形成するか、または有機体の一部を形成してもよい。

Ire1活性の調節は、Ire1の一つ以上の機能及び/またはIre1の一つ以上の下流効果に直接または間接的に影響を与えることを含む。言い換えれば、Ire1の機能または効果は、モジュレータが存在しない場合のIre1の機能または効果と比較して変更される。

一態様において、Ire1モジュレータは、間違って折り畳まれたタンパク質によるIre1の活性化、UPRの開始、Ire1のトランス-自己リン酸化、Ire1による補因子結合、Hac1の翻訳、Xbp1の翻訳及び正しいタンパク質折り畳みの一つ以上を減少させるIre1阻害剤である。たとえばXbp1過剰発現は多発性骨髄腫と関連しているので、ある態様では有効量のIre1とは、Ire1阻害剤の非存在下におけるXbp1の発現に対してXbp1発現を減少させる量である。別の態様では、有効量のIre1阻害剤は、Ire1阻害剤の非存在下におけるUPR量に対してUPR量を低下させるために細胞中でIre1活性を低下させるのに十分な量である。

別の態様では、Ire1モジュレータは、間違って折り畳まれたタンパク質によるIre1の活性化、UPRの開始、トランス-自己リン酸化、補因子結合、Hac1の翻訳、Xbp1の翻訳、及び正しいタンパク質折り畳みの一つ以上を増加させるIre1活性化剤である。したがって、有効量のIre1活性化剤またはスニチニブとは、Ire1活性化剤またはスニチニブの非存在下における間違って折り畳まれたタンパク質の集積に対して、間違って折り畳まれたタンパク質の集積を減少させるために細胞中でのIre1活性を増加させるのに十分な量である。

一態様において、Ire1活性を調節することは、Ire1に対してIre1モジュレータを直接結合させることを含む。別の態様では、Ire1活性の調節は、間接的に達成される。

本明細書では、異常レベルのIre1活性により生じる疾患の治療の必要な被験者における、異常レベルのIre1活性により生じる疾患の治療法も提供する。この疾患は、Ire1活性量が低すぎるか、または高すぎることによって生じる場合がある。たとえば、疾患はIre1活性の欠如または異常に高いIre1活性(たとえばIre1の活動過剰)により生じることがある。本方法は、治療的有効量の上記Ire1モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)または治療的有効量のスニチニブを被験者に投与することを含む。

Ire1欠如とは、特定の被験者または健康な被験者集団におけるIre1活性の正常レベルに対してIre1活性量が減少していることである。Ire1活性量が減少すると、間違って折り畳まれたタンパク質の集積が過剰量となり、これにより病態を生じる。

Ire1活動過剰とは、特定の被験者または健康な被験者集団におけるIre1活性の正常レベルに対してIre1活性量が増加していることである。Ire1活性量が増加すると、たとえば細胞増殖が過剰量となり、これにより病態を生じる。

ある態様では、疾患はIre1欠如と関連している。かかる疾患としては、嚢胞性線維症、網膜色素変性病、糖尿病または神経変性病が挙げられるが、これらに限定されない。前記神経変性病としては、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性小脳失調症、バッテン病(シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても公知)、ウシ海綿状脳症(BSE)、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、HIVに伴う認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調タイプ３)、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性脊髄連合変性症、統合失調症、脊髄小脳失調(種々の特徴をもつ複数の型)、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー病、または脊髄癆が挙げられる。

別の態様では、疾患は異常に高いIre1と関連している。かかる疾患としては、癌、炎症性疾患及び自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な癌としては、乳癌及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、疾患は多発性骨髄腫である。代表的な炎症性疾患としては、ぜんそく、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏性炎症性大腸炎、骨盤感染症；再かん流傷害、関節リウマチ、移植片拒絶反応及び脈管炎が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な自己免疫疾患としては、XBP1-連鎖クローン病、セリアック病、1型糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、アレルギー性肉芽腫血管炎(Chung Strauss症候群)、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病及び関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、疾患はXBP1-連鎖クローン病である。

疾患を治療する被験者は通常、哺乳類である。Ire1モジュレータまたはスニチニブで治療される哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、及び/または非ヒト哺乳類(たとえばげっ歯動物、イヌ)であってもよい。

別の側面では、本明細書に記載のモジュレータはSrcチロシンキナーゼ活性も調節することができる。従って、Srcチロシンキナーゼの活性を調節する方法を提供する。本方法は、Srcチロシンキナーゼと、有効量の上記モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)とを接触させることを含む。

さらに別の側面では、本明細書に記載のモジュレータは、Ablチロシンキナーゼ活性も調節することができる。従って、Ablチロシンキナーゼの活性を調節する方法を提供する。本方法は、Ablチロシンキナーゼと、有効量の上記モジュレータ(たとえば式I〜VIIIの化合物)とを接触させることを含む。

IV．アッセイ
Ire1活性の調節は、溶液中で試験化合物とIre1タンパク質とを接触させることにより特定することができる。

複数のIre1タンパク質のオリゴマー化は、試験化合物中のIre1調節活性を特定することにより検出できる。複数のIre1タンパク質のオリゴマー化(またはオリゴマー化Ire1タンパク質)とは、二つ以上のIre1タンパク質が一緒に非共有結合することをさす。ある態様では、オリゴマー化は２を超えるIre1タンパク質が一緒に非共有結合することをさす。ある態様では、オリゴマー化は、約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100個のIre1タンパク質または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90若しくは100個のIre1タンパク質が一緒に非共有結合することである。他の態様では、オリゴマー化は多数のIre1タンパク質が一緒に非共有結合することである。Ire1タンパク質のオリゴマー化は、以下の実施例区分に詳細が記載される。非オリゴマー化Ire1タンパク質は、オリゴマー化していない複数のIre1タンパク質をさす。

一側面において、Ire1モジュレータは、溶液中で試験化合物と複数のオリゴマー化Ire1タンパク質とを接触させることにより特定される。複数のオリゴマー化Ire1タンパク質を分離し、形成している複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質を検出し、それにより試験化合物によってIre1活性調節を特定する。

複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質のオリゴマー化の検出は、任意の公知方法により実施することができる。たとえば、検出は、溶液中で透明度の減少(たとえば濁度及び光散乱の増加)を検出することにより実施される。あるいは、複数のIre1タンパク質の第一の部分をドナー蛍光色素団(fluorophore)でラベルし、前記複数のIre1タンパク質の第二の部分をアクセプタ蛍光色素団(たとえば消光剤)でラベルする。オリゴマー化検出は、蛍光シグナルにおける変化を検出することにより実施する。同一方法を使用して、複数の非オリゴマー化Ire1タンパク質を形成する複数のオリゴマー化Ire1タンパク質の分離を検出することができる。オリゴマー化は、放射能でラベル化された、または蛍光ラベルされたRNAを使用するIre1 RNaseの酵素活性を測定することによっても検出することができる。Ire1のRNA切断活性は、試験化合物によって生じたオリゴマー化時に上昇するか、または脱重合(de-oligomerization)時に減少する。

ある態様では、オリゴマー化は、オリゴマーIre1が全体の酵素速度(enzymatic rate)に寄与する条件下で、Ire1の酵素活性(たとえばRNaseまたはキナーゼ)を、RNA基質を使用してモニターすることにより検出する。全酵素速度は、共同活性化プロフィール(cooperation activation profile)の存在により検証することができる。たとえば、Hill係数ｎは、1、2、3、4、5、6、7、8、10以上を超えることができる(図１を参照されたい)。

たとえば阻害は、モノマー、二量体または高次オリゴマーの状態でIre1を化合物に結合することによって実施することができる。阻害は、Ire1オリゴマー若しくは二量体の分裂、Ire1の変換コンフォメーション(altering conformation)、またはIre1に結合するための阻害剤とRNA基質との競合により達成することができる。阻害剤は、競合的に、非競合的に(non-competitively)、非競争的に(uncompetitively)または混合モードで作用することができる。

Ire1の阻害または活性化は、RNA切断アッセイにおけるIre1の酵素活性を測定することにより検出できる。RNA切断アッセイでは、たとえば放射能でラベルされたRNA、蛍光ラベルされたRNA、ラベル化されていないRNA、または他の手段によりラベル化されたRNAを使用する。あるいは阻害または活性化は、Ire1キナーゼ活性アッセイを使用して測定できる。あるいはIre1の阻害または活性化は、タンパク質-タンパク質またはタンパク質-リガンド相互作用を検出する動的光散乱、分析超遠心、等温熱量計などの生物物理学的方法を使用して測定できる。Ire1の阻害または活性化は、化合物と細胞若しくは動物とを接触させることに基づく任意の好適な細胞ベースアッセイを使用し、そしてIre1のキナーゼ活性をモニター、Ire1のRNase活性をモニター、またはIre1活性化の下流効果をモニターすることによって測定することもできる。Ire1活性化の下流効果としては、スプライスされたHac1若しくはXBP1タンパク質の産生、またはこれらの二種のタンパク質の転写標的などの変化、またはIre1のキナーゼ活性により誘導された下流変化が挙げられる。良好なモジュレータは、Ire1のRNase活性、Ire1のキナーゼ活性、またはIre1のオリゴマー状態に作用する。

V．医薬組成物
別の側面では、本発明は医薬的に許容可能なキャリヤと組み合わせた本発明の化合物(即ちIre1モジュレータ)を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本明細書中に開示された阻害剤の光学異性体、ジアステレオマー、または医薬的に許容可能な塩を含む。医薬組成物に含まれる化合物は、上記のようにキャリヤ部分に共有結合していてもよい。あるいは、医薬組成物に含まれる化合物は、キャリヤ部分に共有結合していない。

本明細書中で使用する「医薬的に許容可能なキャリヤ」とは、化合物と有害に反応しない腸内または非経口投与に適した医薬的にまたは生理学的に許容可能な有機または無機キャリヤ物質などの医薬的賦形剤をさす。好適な医薬的に許容可能なキャリヤとしては、水、塩溶液(たとえばリンガー液)、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物たとえば、ラクトース、アミロース若しくはスターチ、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリジンが挙げられる。かかる製剤は殺菌することができ、所望により助剤、たとえば滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料及び/または、本発明の化合物と有害に反応しない芳香族物質などと混合することができる。

本発明の化合物は、患者に単独で投与または併用することができる。併用とは、化合物を個々にまたは(一を超える化合物と)組み合わせて同時または逐次投与することを包含するものとする。従って、製剤は所望により(たとえば代謝低下を減少させるために)他の活性物質と混合することもできる。

本発明の化合物は、広範な種類の経口、非経口及び局所剤形で製造及び投与することができる。従って、本発明の化合物は注射(たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内または腹腔内に)投与することができる。また本明細書に記載の化合物は、鼻腔内など吸入により投与することができる。さらに本発明の化合物は、経皮投与することができる。本発明の化合物を投与するために、複数の投与経路(たとえば筋肉内、経口、経皮)を使用することも想定される。従って、本発明は医薬的に許容可能な賦形剤と一種以上の本発明の化合物とを含む医薬組成物も提供する。

本発明の化合物から医薬組成物を製造するためには、医薬的に許容可能なキャリヤは固体または液体でありえる。固体状製剤としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、カシェ、座剤及び分散性顆粒が挙げられる。固体キャリヤは、希釈剤、フレーバー剤、バインダー、防腐剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても作用し得る一種以上の物質を含むことができる。

粉末中では、キャリヤは微粉化活性成分との混合物中の微粉化固体である。錠剤中では、活性成分は、好適な割合で必要な結合特性をもつキャリヤと混合し、所望の形状及びサイズに圧縮する。

粉末及び錠剤は好ましくは、活性化合物5％〜70％を含む。好適なキャリヤは、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、スターチ、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバターなどである。

座剤を製造するためには、低融点ワックス、たとえば脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などを最初に溶融し、攪拌するなどして活性成分をその中に均質に分散させる。溶融した均質混合物を小分け型に流し入れ、放冷して、固化させる。

「製剤(preparation)」なる用語は、任意に他のキャリヤを使用して、活性成分をキャリヤにより取り囲み、これによってキャリヤと結合するカプセルを提供するキャリヤとして封入材料との活性成分との配合物(formulation)を包含するものとする。同様にカシェ及びトローチ剤も含まれる。錠剤、粉末、カプセル、ピル、カシェ及びトローチ剤は、経口投与に適した固体剤形として使用することができる。

液体形製剤としては、溶液、懸濁液及びエマルション、たとえば水または水/プロピレングリコール溶液が挙げられる。注射剤(parenteral injection)に関しては、液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液の溶液中で製造することができる。

非経口適用が必要または望ましい場合、本発明の化合物に関して特に好適な混合物は、注射可能な無菌溶液、好ましくは油性若しくは水性溶液、並びに懸濁液、エマルション、または座剤などのインプラントである。特に非経口投与用のキャリヤとしては、デキストロース、生理食塩水、純水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ピーナッツ油、ごま油、ポリオキシエチレン-ブロックコポリマーなどの水溶液が挙げられる。アンプルは慣用の剤形である。本発明の化合物はリポソームに配合または、経皮ポンプ若しくはパッチを介して投与することもできる。本発明で使用するのに好適な医薬混合物は当業者に公知であり、本明細書中そのいずれの教示も参照として含まれる、Pharmaceutical Sciences(第17版、Mack Pub．Co．、Easton、PA)及びPCT国際特許出願国際公開第WO96/05309号に記載されている。

経口用途に好適な水溶液は、水に活性成分を溶解し、所望により好適な着色剤、フレーバー剤、安定剤及び増粘剤を添加することにより製造できる。経口用途に好適な水性懸濁液は、粘性材料、たとえば天然若しくは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び他の公知の懸濁剤と一緒に微粉化活性成分を水中に分散させることにより製造できる。

使用直前に経口用途用の液状製剤に転換することを目的とする固体形製剤も含まれる。かかる液状としては、溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。これらの製剤は、活性成分に加えて、着色料、フレーバー剤、安定剤、緩衝液、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含みえる。

医薬製剤は好ましくは単位剤形である。かかる形状では、製剤は好適量の活性成分を含む単位用量に細分される。単位剤形は、パッケージ化された製剤でありえ、パッケージは、包装済錠剤、カプセル及びバイアル若しくはアンプル中に個別量の製剤を含む。また単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェまたはロゼンジ自体でありえるか、またはこれらのいずれかの好適数でありえる。

単位用量製剤中の活性成分量は、特定の用途及び活性成分の効能に従って変動しえ、0.1mg〜10000mg、より典型的には1.0mg〜1000mg、最も典型的には10mg〜500mgで調整される。所望により組成物は、他の混合可能な治療薬も含みえる。

化合物によっては水に対して僅かな溶解性をもつので、組成物中に境界面活性剤または他の好適な共溶媒が必要になるかもしれない。かかる共溶媒としては、Polysorbate 20、60及び80；Pluronic F-68、F-84及びP-103；シクロデキストリン；ポリオキシル35ひまし油；または当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる共溶媒は通常、約0.01重量％〜約2重量％のレベルで使用される。

配合物を分配する際に変動性を減少させるために、配合物の懸濁液またはエマルションの成分の物理的分離を減少させるために及び/または配合物を改善するためには、単純な水溶液よりも粘度が高いほうが望ましいかもしれない。かかる増粘剤(viscosity building agent)としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸及びその塩、ヒアルロン酸及びその塩、上記のものの組み合わせ並びに当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる物質は通常、約0.01重量％〜約2重量％のレベルで使用される。上記アジュバントのいずれかの許容量の決定は、当業者によって容易に確定される。

本発明の組成物はさらに、徐放性及び/または快適性を提供するための成分も含みえる。かかる成分としては、高分子量のアニオン性粘液擬態ポリマー、ゲル化多糖類及び微粉化薬物キャリヤ基質が挙げられる。これらの成分は、米国特許第4,911,920号；同第5,403,841号；同第5,212,162号；及び同第4,861,760号にその詳細が検討されている。これらの特許の全ての内容は、その全ての目的に関して本明細書中、参照として含まれる。

本発明により提供される医薬組成物は、活性成分が治療的有効量、即ちその目的を達成するのに有効量で含まれる組成物が挙げられる。特定の用途に効果的な実際量は、中でも治療される症状に依存する。疾患を治療する方法で投与する場合には、かかる組成物は、Ire1活性を低下または増加させる、及び/または病徴の進行を減弱、除去または遅延させるなどの所望の結果を達成するのに有効量の活性成分を含む。本発明の化合物の治療的有効量の決定は、当業界、特に本明細書中の詳細な開示を考慮すると当業者の能力の範囲内である。

哺乳類に投与される用量及び頻度(一回または複数回の用量)は、種々の因子、たとえば哺乳類が別の疾患に罹患しているかどうか、並びにその投与経路；受益者のサイズ、年齢、性別、健康、体重、肥満度指数及び食習慣；治療される疾患の性質及び症状の程度(たとえばアルツハイマー病)、併用療法の種類、治療される疾患による合併症または他の健康に関連する問題に依存して変動し得る。他の治療計画または治療薬は本出願人の発明の方法及び化合物と併せて使用することができる。確立された用量の調節及び操作(たとえば頻度及び期間)は当業者の技量の範囲内である。

本明細書に記載の任意の化合物に関して、治療的有効量は、細胞培養アッセイから当初は決定することができる。標的濃度は、本明細書に記載または当業界で公知の方法を使用して測定して、本明細書に記載の方法を達成し得る(単数または複数種類の)活性化合物の濃度である。

当業者には公知であるように、ヒトにおいて使用するのに治療的有効量は動物モデルからも決定することができる。たとえば、ヒト用の用量は、動物で有効であることが知見された濃度を達成するために配合することができる。ヒトでの用量は、上述のように化合物の有効性をモニターし、用量を上方または下方に調節することによって調整することができる。上記方法及び他の方法をベースとするヒトでの最大効能を達成するために用量を調節することは、当業者の能力の範囲内である。

用量は、使用する化合物及び患者の要求条件に応じて変動し得る。本発明の状況における患者への投与用量は、経時で患者における有効な治療反応を得るのに十分でなければならない。用量サイズも、全ての悪い副作用の存在、性質及び程度により決定することができる。特定の状況に対して正しい用量の決定は、開業医の技能の範囲内である。通常、最適用量の化合物よりも少ない量の用量で治療を始める。その後、その状況下で最大の効果が達成されるまで、用量を僅かに増加させることによって増やしていく。一態様において、用量範囲は0.001％〜10％w/vである。別の態様では、用量範囲は0.1％〜5％w/vである。

投与量及び間隔は、治療される特定の臨床適応症に有効な投与化合物のレベルを提供するために個々に調整することができる。これは、各個人の症状の重篤度に応じた治療計画を提供する。

本明細書に記載の教示を使用して、実質的な毒性を生じることなく且つその上特定の患者で示される臨床症状を治療するのに有効である有効な予防的または治療的処置計画を立てることができる。この計画は、化合物の効能、相対的生物学的利用能、患者の体重、副作用の存在及び重篤度、選択した薬剤の好ましい投与モード及び毒性プロフィールなどの因子を考慮することにより活性化合物を注意深く選択することを含むべきである。

特定の化合物の毒性と治療効果との比は、その治療指数であり、LD₅₀(母集団の50％で致命的な化合物量)及びED₅₀(母集団の50％で有効な化合物量)との比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び/または動物研究から得られた治療指数データをヒトで使用するための用量範囲の考案に使用することができる。かかる化合物の用量は好ましくは、殆どまたは全く毒性を持たないED₅₀を含む血漿濃度範囲内にある。用量は、使用する剤形及び使用する投与経路に依存してこの範囲内を変動し得る。たとえばFinglらのIn：THE PHARMACOLOGIAL BASIS OF THERAPEUTICS，第1章、1ページ、1975年を参照されたい。正確な配合、投与経路及び用量は、化合物を使用する特定の方法及び患者の症状を考慮して個々の医師により選択することができる。

I．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明するためのものであり、本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものではない。

一般的な方法
タンパク質は大腸菌で発現させ、GST-アフィニティ精製及びサイズ除外クロマトグラフィーを使用して精製した。DNAオリゴヌクレオチドはPCRで製造し、IDTから購入した。RNAオリゴヌクレオチドは、Dharmacon Inc．より購入するか、T7 RNAポリメラーゼでインビトロ転写により製造した。全ての動態アッセイ及び分析超遠心は、30℃及び中性pHで実施した。回折データはビームライン8.3.1(Advanced Lignt Source，Berkeley National Laboratories)で冷凍保存された結晶から集めた。相は、PHASERでのサーチモデルとしてPDB座標2rioを使用して分子置換より決定した。最終モデルはIre1のアミノ酸665-864、892-1115を含み；N-末端の一部(641-664)及び高リン酸化ループ865-891(aF-aEF)が不規則になっている。最終解像度は3.9Åであり、R/Rfreeは良い形状で0.264/0.298であった。実験手順の詳細な記載を以下に示す。

実施例１：一般的な化学合成
本発明の特定の化合物は、以下に記載のスキームを使用して合成し、必要により好適な試薬選択を実施することができる。

一般スキーム１
上記スキーム中の変数R₁及びR₂は、上記Ire1モジュレータの記載においてそれぞれ変数R¹及びR²に関して定義したとおりである。上記スキームは本明細書中に記載の化学的属(genus)の種々の態様を得るために公知の化学合成技術に従って変形することができる。

実施例２：一般スキーム１を使用するAPY24の合成

段階１：4-ピリミジノ-アミノピラゾール中間体の合成
2,4-ジクロロピリミジン(3.2g，21.6mmol)及び5-シクロプロピル-2H-ピラゾール-3-イルアミン(2.65g，21.5mmol)をTHFとH₂Oの１：１混合物(140mL)中に溶解し、KOAc(30当量，64g)で処理し、55℃で48時間保持した。層を分離し、有機層を蒸発させ、CH₂Cl₂(30mL)に溶解し、−20℃で３時間保持した。沈殿したピリミジノ-アミノピラゾール塩化物塩を濾過により集めた。濾液を蒸発させ、CH₂Cl₂(25mL)に溶解し、−20℃でさらに３時間保持し、濾過した。合わせた固体をCHCl₃：CH₃OHが10：1(25mL)に溶解し、精製(CHCl₃：CH₃OH＝100：0〜90：10)すると、ピリミジノ-アミノピラゾール中間体が得られた(収率46%，2.32g)。

段階２：APY24の合成
ピリミジノ-アミノピラゾール一塩化物(0.2g，0.85mmol)及びp-アミノベンゾニトリル(0.112g，0.85mmol)をBuOH(8mL)に溶解し、続いて濃HCl(0.1mL)を添加した。得られた混合物を一晩100℃に保持した。固体沈殿物を濾過により集め、BuOH(8mL)で洗浄し、真空下で乾燥すると化合物APY24が得られた(0.23g，収率86％)。

実施例３：AD74の合成
AD74：N-(4-(4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル)-3-(トリフルオロメチル)ベンズアミドの合成
N2-(4-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.011g，0.035mmol；Shokat Lab：A．Statsyuk)のCH₂Cl₂(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これに、CH₂Cl₂(10mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド(0.005mL，0.036mmol)を滴下添加した。反応物を放置して温め１時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50：50のH₂O-CH₃CN中に再び懸濁させ、CH₃CN/H₂O/0.1%TFA(1〜100％勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD74が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値480.5，計算値480.2。

実施例４：AD75の合成
AD75：1-(4-(4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル)-3-(3-(トリフルオロメチル)フェニル)ウレアの合成。
N2-(4-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.022g，0.07mmol)のCH₂Cl₂(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これにCH₂Cl₂(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネート(0.030mL，0.2mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、１時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50：50のH₂O-CH₃CN中に再び懸濁させ、CH₃CN/H₂O/0.1%TFA(1〜100％勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD75が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値495.5，計算値495.2。

実施例５：AD76の合成
AD76：N-(3-(4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル)-3-(トリフルオロメチル)ベンズアミドの合成。
N2-(3-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.014g，0.046mmol；Shokat Lat：A．Stasyuk)のCH₂Cl₂(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これにCH₂Cl₂(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド(0.007mL，0.046mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、１時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50：50のH₂O-CH₃CN中に再び懸濁させ、CH₃CN/H₂O/0.1%TFA(1〜100％勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD76が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値480.4，計算値480.2。

実施例６：AD77の合成
AD77：1-(3-(4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル)-3-(3-(トリフルオロメチル)フェニル)ウレアの合成。
N2-(3-アミノフェニル)-N4-(3-シクロプロピル-1H-ピラゾール-5-イル)ピリミジン-2,4-ジアミン(0.014g，0.046mmol)のCH₂Cl₂(10mL)中の溶液を氷水浴中で冷却した。これにCH₂Cl₂(5mL)中に希釈した3-(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネート(0.006mL，0.046mmol)を滴下添加した。反応物を放置して室温に温め、12時間攪拌したままにした。TLC及びLC-MSで反応が完了したことを判断するまで、反応を進行させた。反応混合物を真空下で濃縮し、50：50のH₂O-CH₃CN中に再び懸濁させ、CH₃CN/H₂O/0.1%TFA(1〜100％勾配液)中のC18カラムで精製すると、AD77が得られた。ESI-MS m/z [M+H]+、実測値495.4，計算値495.2。

実施例７：アッセイ方法
Ire1構築物の発現及び精製
Ire1発現用プラスミドは、Pfuポリメラーゼ及びIre1の細胞質ドメインをコードするpGEX-6P-2ベクターでPCRを使用して調製した(Sidrauski，C．ら、Cell 90巻：1031-9頁(1997年))。突然変異変性用のDNAプライマーは、Biochem Lab Solutions 3.5を使用して設計し、IDTより購入した。タンパク質はBL21 CodonPlus(RIPL)大腸菌細胞(Stratagene)上で発現させた。発現及び精製は先に記載のように実施した(Nock，S．ら、Methods Enzymol 342巻：3〜10頁(2001年))。バクテリアは22℃で成長させ、溶解及びEPLC緩衝液はIre1凝集を防ぐために少なくとも300mMのNaClを含んでいた。タンパク質濃度は、280nmでの吸収ピークを使用してUVスペクトルから測定し、吸光係数(Biochem Lab Solutions 3.5)を計算した。精製Ire1変異体は濃度10〜70mg/mlであり、クーマシーブルー染色及びFPLCトレースの定量により判断して純度99％を超えていた。

RNA基質の調製
HP21 21-mer及びHAC1 28-merはDhrmacon Inc.より購入した。他のRNA基質はHAC1及びXBP1 mRNAをコードする制限(酵素)消化プラスミドから、またはPCR-増幅産生物から調製した。長鎖RNAの予備量(preparative amount)はMegashortScript kit(Ambion)を使用して調製した。使用前に、オリゴヌクレオチドは、変性(8M変性)5〜20％ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で精製し、29：１架橋させ(National diagnostics)、TE緩衝液中で溶離し、エタノール沈殿させた。5’-末端基質で³²p-ラベルしたものは、NENによりT4 PNK(NEB)及びg-³²pATPを使用して調製した。³²p-ボデー-ラベル化基質は、a-³²pUTP(NEN)の存在下、T7 RNAポリメラーゼ(Promega)で転写により調製した。³²p-ラベル化基質は、変性5〜20％PAGEにより精製し、TE中で溶離し、エタノール沈殿させた。

RNase切断アッセイ
RNA切断反応は、20mM HEPES(pH7.5)、70mM NaCl、2mM ADP(pH7.0)、2mM Mg(OAc)₂、5mM DTT、5％グリセロール、1nM未満³²p-ラベルRNA基質、及び3nM〜20μM Ire1を含む緩衝液中、30℃で実施した。反応溶液及び緩衝液は、Biochem Lab Solutions 3.5を使用して設計した。反応は、RNA以外の全ての成分を含む予め温めておいた反応混合物9μlにRNA 1μlを添加するように調製した。通常、最初の時間点に関して5秒から開始して、3〜10分の時間的経過を集めた。時間間隔で溶液1μlをそれぞれの反応物から取り出し、10M尿素、0.1%SDS、0.1mM EDTA、0.05％キシレンシアノール、及び0.05%ブロモフェノールブルーを含む6μl停止溶液と混合した。サンプルは、変性10％PAGEで分離し、ホスファーストレージスクリーン(phosphor strage screen)上に暴露した。スクリーンをStormまたはTyphoon装置上でスキャンし、ImageQuant 5.0またはGelQuant．NET 1.4プログラムを使用して定量した。データをプロットし、SigmaPlot 6.0で作成した。

RNA切断を使用して図20及び以下の表(3μM yIre1、ステムループRNA、15μMエフェクタ)により示されるように、yIre1活性化を評価することができる。

RNA切断阻害アッセイは、図21A(1.5μM yIre1、ステムループRNA、100μM ADP-2mM Mg、30μMエフェクタ)により表されるように例示化合物でも実施した。

分析的超遠心分離法
Ire1サンプル(10μM)を、RNase切断活性用で使用する緩衝液中、400μl細胞に充填した。55,000rpm及び30℃でBeckmann XL-A分析超遠心分離機で遠心分離を実施した。１スキャン/2分の頻度で全部で60スキャンを集めた。沈殿した痕跡量を、平均軸比(average axial ratio)3：2のC(s)分布を使用してUltraScan 6.0で分析した。

質量分析法
金メッキプレートを100％メタノール及び水で洗浄した。溶液A(アセトニトリル0.7mL中10mg 4-HCCA、0.1%トリフルオロ酢酸)を迅速に層に塗布し、放置して乾燥した。残渣をティッシュでそっと除去した。次に1μl Ire1サンプル(0.1〜1mg/ml)及び5μl溶液B(300μl蟻酸、100μl H₂O、200μlイソプロパノール及び10mg4-HCCA)を含む混合物0.5μlを乾燥表面上にスポットし、放置して乾燥した。サンプルを0.1%トリフルオロ酢酸2μlで２回洗浄し、Voyager質量分析計上でMALDI分析に使用した。スペクトルはMoverZで分析した。

結晶化
最初に、Ire1KR32(10mg/ml)を1.0Mクエン酸ナトリウムからADP(2mM)との複合体(complex)として蒸気拡散により結晶化した。これらの共結晶は一方向で乱れており、回折実験での使用は中止した。別の結晶形は、ADPをキナーゼ阻害剤APY29で置換することによって得た。Ire1KR32・APY29結晶は、液滴をつるす際に蒸気拡散により得た。液滴は、貯蔵緩衝液(20mM HEPES pH7.0(20℃)、300mM NaCl、2mM DTT、及び5％グリセロール)中のIre1KR32(12mg/ml)とAPY29(1.2mM)1μlを、0.27M Na₂SO₄、8％PEG-3350、10mM EDTA及び2mM TCEPを含む溶液1μlとを混合することにより調製した。ウエル溶液は200μlの0.085M Na₂SO₄、2.33％3350、及び5％tert-アミルアルコールを含んでいた。単結晶は、室温で3〜4日間の間に最大サイズ0.1×0.4×0.2mmに成長した。本出願人は、TCEPが10mM L-システインで置換できたことを知見した。低温保護(cryo-protection)のために、結晶は、0.085M Na₂SO₄、3％tAm、5％PEG-3350及び30％エチレングリコールを含む溶液中でフラッシュ凍結した。

データ収集及び解析
X-線回折データは、Berkeley National LaboratoryのAdvanced Light Source、ビームラインBL8.3.1で記録した。X-線波長1.11587Å及び１度の振動角で得られたデータセットは、XDSパッケージを使用してインデックスをつけ、積分し、目盛りを付けた(Kabsch，W.J.、J．Appl．Cryst．26巻：795-800頁(1993年))(図14)。精密化(refinment)の進行度をモニターするために５％の反射をテスト-セット(R^free-set)反射としてマークした。分子置換溶液はPHASER(McCoy，A．J．、J Appl Cryst 40巻：658-674頁(2007年))を使用して見つけた。Ire1二量体の最近のX線構造由来のモノマーA14コピー(Lee，K．P．ら、Cell 132巻：89-100頁(2008年))を精密化用の出発モデルとして使用した。CNS(Brunger，A．T．ら、Acta Cystallogr D Biol Crystallogr 54巻：905-21頁(1998年))におけるシミュレーテッド-アニーリング及びグループ化B因子精密化ならびに最終段階では、PHENIX(Adams，P.D.ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58巻：1948-54頁(2002年))を14-回(14-fold)NCSを使用して実施した。フーリエS_A-秤量(Read，R.J.、Acta Cryst A42巻：140-149頁(1986年))F_obs-F_calc差マップは、出発構造から見当たらないモデルの部分を説明するために使用した。リガンドモデルは、ChemSketch10.0(ACD labs)を使用して作成した。モデル構築及び実空間精密化はCoot(Emsley，P．ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60巻：2126-32頁(2004年))、Pymol(W．DeLano)及びRSRef(Korostelev．A．ら、Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58巻：761-7頁(2002年))で実施した。得られたモデルは優れた立体化学パラメータ(図14)をもち、0.264/0.298という低い結晶学的R/R^freeは、回折データとよく一致していることを示している。

細胞アッセイ
Ire1活性におけるツニカマイシン、SU11248、DJM2005、APY24及びAPY29の効果は、モデルシステムとしてHEK293細胞を使用する哺乳類細胞で試験した。細胞は、Lin JHらのScience 318巻：944頁(2007年)に記載の方法に従って処理した。表示時間の間、対応する薬剤で処理した後、Xbp-1 mRNAスプライシングはRT-PCRにより測定した。スプライスされていない(unspliced：u)及びスプライスされた(spiliced：s)Xbp1-mRNA産生物は、Ire1を介するUPR活性化の尺度として表示され機能する。結果を図17に示す。

代表的な化合物をUPRにおけるその効果に関してアッセイした。結果は図18〜19及び以下に記載の表に示す。

Ire1モジュレータのADシリーズを使用して、ヒトIre1による³²p-ステムループRNAのインビトロ切断から以下の結果が得られた。

Src及びAblとの交差反応性のアッセイも実施した。精製c-SrcまたはAblは、キナーゼ反応緩衝液(10ｍM HEPES(pH7.2)、10mM MgCl₂、0.2mM DTT)中で約10mMの濃度まで希釈し、1mg/mL BSA、2.5％(v/v)DMSO、133μMペプチド(ablに関しては配列EAIYAAPFKKK、c-Srcに関してはEIYGEFKKK)及び種々の濃度の阻害剤でプレインキュベートした。キナーゼ反応は5mCiγ³²P ATPを補った100mM 冷ATPを添加して開始し、室温(RT)で進行させた。10分で反応物1mLをホスホセルロースシート(P81、Whatman)上にスポットし、続いて洗浄緩衝液(1.0％(v/v)リン酸)中に浸漬した。シートは緩衝液中で５回洗浄し、乾燥し、転移した放射線はTyhoon(商標)スキャナ(Molecular Dynamics)を使用してホスホイメージングにより測定した。放射能カウント(radioactive count)はImageQuantソフトウエアを使用して定量し、滴定データはPrism(登録商標)ソフトウエアパッケージを使用してIC₅₀値を導き出すためにS字状(sigmoidal)用量反応に適合した。用量反応は100mMから出発して1/3希釈を用いて12点阻害剤滴定をベースとした。

インビトロスクリーニング法
Ire1の活性化剤及び阻害剤を同定するために、具体的なインビトロアッセイを実施する。

1)溶液トランスパレンシーアッセイ
活性化剤の同定のために、本アッセイでは溶液中でタンパク質凝集を検出するのに適した方法のいずれかを使用する。最も原始的な形態では、約300mM NaCl及び5〜100mg/ml Ire1を含む中性緩衝液中のIre1溶液を簡単に目視チェックする。活性化剤を添加すると、曇ってくる(図2A)。このスクリーニング(screen)は迅速で、処理能力が高く、且つ簡単な自動化に適している。あるいは溶液による光散乱は、動的光散乱(dynamic light scattering：DLS)または静的光散乱(static light scattering：SLS)アプローチを使用して測定することができる。スクリーニング条件は、ADPまたは公知活性化剤(APY29)を溶液に添加すると、DLSまたはSLSアプローチにより検出されるように重質種が発生するように選択する。うまくできた活性化剤ならばオリゴマーが形成する。当業者に公知のタンパク質凝集を検出する他の方法も同様に効果的である。

阻害剤は、逆の同一スクリーニングを実施することにより知見される。即ち試験化合物を、ADPまたは合成活性化剤の存在下で予備形成したIre1凝集体に添加する。逆の変化(凝集体の溶解)が検出される。うまくできた阻害剤ならば、凝集体を溶解することができる。

2)蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer：FRET)アッセイ
このアッセイの好都合な点は、非常に希薄なIre1濃度の分子の活性化及び測定を実施する能力に対して高感度であるということであり、ここでしっかりと結合している活性化剤及び阻害剤は、大量の弱く相互作用している活性化剤及び阻害剤からずっと容易に選択される。本アッセイで使用されるIre1は、ドナー蛍光色素団分子でラベルしたIre1(Ire1-FRET-D)と、アクセプター蛍光色素団(または消光性染料)でラベルしたIre1(Ire1-FRET-A/Q)との混合物である。

蛍光色素団は、システイン化学またはタンパク質を標識化する当業界の手段の任意の他の状態を使用してIre1に共有結合する。蛍光色素団の位置は、これらが溶媒に暴露され且つタンパク質-タンパク質境界面のいずれにも位置せず；キナーゼ及びRNaseの活性部位をブロックしない；且つ起こりえるタンパク質再構成を引き起こしも妨害もしない、即ち標識がタンパク質に対してニュートラルであるべきように注意深く選択される。重要なことには、標識は、標識間のFRETがIre1-FRET-DとIre1-FRET-A/Qとの混合物から複合体オリゴマーのアセンブリ上で可能であるような距離で存在すべきである。化合物を活性化と阻害化するためのスクリーニングは、ADPまたはAPY29などの試験化合物を添加する際でも有用なシグナル変化を出すずっと低いIre1濃度であった以外には、上記のように実施する。シグナル検出は、ドナーまたは/及びアクセプター染料の蛍光を使用して実施する。

代表的な化合物をアッセイし、結果を以下の表に示す。

3)動的アッセイ
動的アッセイは、Lin JHら、Science 318巻：944頁(2007年)に記載の通りである。Ire1により切断される放射性標識または蛍光標識RNAオリゴヌクレオチドを基質として使用する。RNA切断反応のスクリーニングは、試験化合物(ADP及びAPY29)に対して最大活性応答を産生するIre1濃度で実施する。活性化剤及び阻害剤スクリーニングは、上記説明のように関連している。

結果
キナーゼ及びRNaseドメイン(Ire1KR)及びN-末端に向かって24個または32個のアミノ酸で伸張したIre1KR(Ire1KR24またはIreKR32)を含むIre1の細胞質部分の変異体を調製した(図1A、図1C、図7)。これらの追加のアミノ酸伸張部分は、膜貫通領域にキナーゼ/RNaseドメインをつなぐ約100個のアミノ酸の長いリンカードメインの一部である。これら三つの構築物は、XBP1 mRNAから誘導された部位特異的5’-32p-標識化ステムループオリゴリボヌクレオチド14を切断した(図1B、図8)。21-merステムループHP21の切断に関して観察された速度定数は、酵素濃度において非ミカエリス依存性を示し、IreKR及びIre1KR24に関してHill係数n＝2、そして意外にもIre1KR32に関してHill係数n＝3.5-8と共同的に増加した(図1D)。この知見は、Ire1のRNase活性がIre1KR及びIre1KR24に関しては主に二量体、並びにIre1KR32に関してはオリゴマーの形成と共に自己会合から生じることを示唆する。ADP・Mg補因子はRNaseの共同的活性化に全く必要ではなかった。しかしながら、補因子は、特異的RNase活性を平均で二桁増加させ、このことは補因子が活性化遷移を刺激することを示している(機構的関係を参照されたい)。

10μMを超えるタンパク質濃度では、Ire1KR32との反応は、曇った不均一懸濁液として見え、このことはIre1KR32の高次オリゴマー化を示している(図1D、図2A)。Ire1KR32の幾つかのオリゴマー種が存在することは、サンプルの分析的超遠心時で明らかである(図2B)。オリゴマー化は直ちに逆転されえ、RNase活性は、溶液に塩を添加することにより抑制できた(図2A、図2C)。対照的に、Ire1KR及びIreKR24の溶液は全てのタンパク質濃度で透明のままであり、図1Dのその活性化プロフィールの低い共同性(cooperativity)から予想されるように、タンパク質オリゴマー化の理学的兆候を示さなかった。

Ire1KR32は、Ire1KR及びIre1KR24のHP21に対するよりも約10²倍高い特異的RNase活性を示した(図2D、左のパネル)。観察された速度定数は酵素1μM濃度で比較し、ここで反応は、観察された速度定数の対数線形濃度応答によって特徴付けられる同一動的レジメ(kinetic regime)で起きる。Ire1KR32の触媒的に好都合な点は、より長い基質、XBP1 443-merではより明白であり、これはIre1の天然mRNA基質に非常に似ている(図2D、右のパネル)。示された条件下では、Ire1KR32はこの基質をIre1KR24及びIre1KRが行うよりも約10⁴〜10⁵倍早く切断する。これらの観察結果は、Ire1KR32とIre1KR24との間の差を構築するN-末端リンカードメイン内の8個の塩基性アミノ酸(図7)が、Ire1の自己会合特性及び細胞質ドメインの特異的RNase活性を定めることを示している。伸張N-末端を含むIre1ドメインを使用することは、Ire1のオリゴマー状態の結晶構造を得るのに重要である(以下)。

野生型Ire1活性化
Ire1KR32は、CDK2及びEGFRキナーゼを標的にするように設計された阻害剤と共に共結晶化した。特定のキナーゼ阻害剤は、Ire1のRNase機能を十分に活性化した(図3A)。これは、合成化合物による野生型Ire1活性化の最初の例である。

阻害剤APY29で得られた結晶により、3.9Å解像度でIre1KR32-APY29の構造決定が可能になった。統計データを図15にまとめる。阻害剤分子に関して十分な分解密度は、Ire1キナーゼドメインのATP結合ポケットで知見された(図3B)。APY29はE746、L747及びC748により形成されたタンパク質骨格と大きな水素結合ネットワークを形成する(図3C)。水素結合は活性部位、N751及びD828で二つの側鎖も形成しそうである。阻害剤構造を比較すると、試験した全ての化合物がタンパク質骨格と水素結合を形成し得ることがわかる(図3D)。APY29及びAPY24などの強力な活性化剤は、さらに側鎖N751と水素結合を形成し、ADPの糖-リン酸部分の代わりに嵩高い芳香環を挿入し得る。キナーゼ・阻害剤複合体(たとえばPDB IDs 2G9X及び2F4J)の公知構造により導かれるスニチニブのマニュアル・フィッティングから、化合物は核酸塩基部位を満たすが、糖及びリン酸塩サブサイト(sub-site)は満たさないことが予測される。そのような部分的な占有は、酵素の部分的な活性化だけを伴うスニチニブのIre1へのまあまあ良い結合と一致する(図3A)。AIN54は、Ire1キナーゼのヌクレオチド-結合ポケットを覆うベータ鎖β1の異常な位置により、構造的な衝突が一部生じるため、ATPポケットには容易には適合できなかった。

APY29とヌクレオチド-結合ポケットとの相互作用は、阻害剤がドッキングに二価の金属イオンを使用しない以外には、天然補因子、ADPの相互作用と非常に似ている(図3E)。この構造的な差異から、Ire1のRNase活性におけるマグネシウムの役割を試験するために優れたツールが提供される。従って、Ire1KR32のRNase活性におけるEDTAの作用を試験した。ADPにより刺激された反応に関しては、RNase活性は大きさが一桁を超えて減少したが、APY29により刺激された反応に関しては、RNase活性は変化しなかった(図3F)。従って、Ire1のRNase活性は二価の金属イオンを必要としないので、マグネシウムはADPの負に帯電したホスフェート部分とD828のカルボキシル基とを結合することにより明らかにADP結合だけに役立つことが示される。

同時に、これらの観察結果は、ADP及び阻害剤がATPポケットを満たすことによってIre1 RNaseを活性化することを示す。最大活性のためには、核酸塩基及び糖部分は、Ire1の自己会合を助けるキナーゼの活性なオープンコンフォメーションを安定化させるために占められるべきである。金属イオンとADPのホスフェート基との配位のため静電相互作用は特別な役割を果たさないので、中性の空間充填基と置き換えることができる。

オリゴマー化-誘導N-末端セグメントがなく、且つ二量体として結晶化するIre1の結晶構造(図１、図２、図７)と対照的に、Ire1KR32は対照的な高次アセンブリとして結晶化する(図４A)。IreKR32の14個の分子は結晶格子中で非対称ユニットを構築する。オリゴマーの形成は、成長するフィラメントの側面への対称Ire1二量体の増加加算として記載することができ、二量体に対して同時に51.4°時計回り、14分子ごとに完全360°回転である。Ire1KR32の分析超遠心が単量体、二量体、四量体及び六量体を示すが、三量体及び五量体がないことを示しているように、そのような段階的なオリゴマーメカニズムは明らかに溶液中で起きている(図2B)。

Ire1-ADP二量体の結晶充填(図4A、差込図)と比較してオリゴマーにおけるIre1KR32の密な充填は、現在のモデルに組み込むことができただけだったIre1の幾つかの重要なエレメントを配列する。これらの新しい構造エレメントは、図4C〜Eに分類される。新しいエレメントのいずれもが、既に決定された構造(図4C)で定義された２回対称性背合わせIre1二量体(モノマーA及びB、C及びDなどから作られる；図4B)によって形成される境界面IF1に属さない。二つの新しい境界面は、これらのIre1二量体がらせん形ロッド(helical rod)に積みあがるように形成する。境界面IF2もまた２回対称性であり、モノマーA及びD、C及びFなどのRNaseドメイン間の接触により形成する。これは、α3’及びα4へリックスを結合するα3’へリックス及びα3’-α4ループを包含する。境界面IF3は、モノマーを側-側配置(side-to-side arrangement)してフィラメント(．．．−＞A−＞C−＞E−＞．．．及び異極性では、…−＞F−＞D−＞B−＞．．．)にすることにより形成される。IF3は、キナーゼドメイン間の接触により形成され、二つの新しいエレメント、αD’へリックス及び活性化ループを包含する(図4E)。Ire1の二つの領域、N-末端伸張(残基641-664)及びαEF-αFループ(残基865-892)は、オリゴマーでは秩序が乱れており、その構造はまだわかっていない。構造上は、オリゴマーはDNAの二重らせんに似ている(図4B、図9)が、境界面IF1は向かい合ったストランドの核酸塩基間の相互作用に平行であり、境界面IF3は同一ストランドの核酸塩基間のリン酸ジエステル結合に平行である。

境界面IF3におけるIre1モノマーの配置(図4E、図5A)は、イン-トランス(in-trans)リン酸化を実施するために近隣分子の活性部位と一つのキナーゼのリン酸化ループを並置する。慣用のキナーゼに関しては、トランス自己リン酸化複合体は二量体であり、ここではキナーゼは関係したパートナーとその活性化ループを交換する。Ire1オリゴマーではそうではなく、活性化ループ交換配置は、各キナーゼがその活性化ループを新しいパートナーに提供し、それによって線状フィラメント状のオリゴマーアセンブリを伸長するように達成される。

動的解析及び結晶化で使用されるIre1KR32は、17個のリン酸化残基を含んでいた(図10)。四つのホスフェート以外の全てがホスファターゼの混合物との処理により除去することができた。キナーゼ活性部位に変異(D828A)をもつIre1を発現させる時にはリン酸化は知見されず、このことはタンパク質が大腸菌内で発現されるようにIre1の全てのホスフェートが自らのキナーゼ活性から誘導されることを示している。トリプシン消化、続く質量分光分析から、リン酸化部位が、いずれも境界面IF3に面する活性化ループとαEF-αFループ(図11)に限局されることを突き止めた。同時に、オリゴマー構造及びMALDI分析は、IF3がホスフェートの転移がイン-トランスで役立つモデルを支持する。境界面IF3の存在は、IF1-様二量体におけるキナーゼの構造的に好ましくない背合わせ配置に基づくIre1のトランス-自己リン酸化を説明する際の問題を解決する。

密に充填されたオリゴマーにより、Ire1以外のキナーゼがホスホ-受容体部位に殆ど出入りできにくくしており、このことはホスホリル転移反応が非常に特異的であることを示唆している。この特徴は、任意の認識可能なコンセンサス・モチーフの一部でないIre1の部位の特異的なリン酸化と、Ire1をリン酸化することが公知の他のキナーゼが見かけ上存在しないことのいずれをも説明する。

オリゴマー構造中のIre1KR32の分子間に三つの明確な境界面が存在すること(図4、図５A)は、Ire1 RNaseの活性化への相対的な寄与に関する疑問を提起した。本研究において開発した大規模動的範囲で定量的切断アッセイ(図1、図2)を使用して、変異体により選択的に減じられた境界面のそれぞれをもつIre1変異体を特性決定した。IF1に関しては、Ire1は、RNase活性において試験したRNase IF1変異体の中で最大の悪影響を持つE988Q変異体で調製した。IF2及びIF3に関しては、個々の境界面が不安定化されるように変異された、従来特性決定されていない接触を同定した(図5B)。

標準切断アッセイ(3μM Ire1、HP21基質)では、試験した全ての変異体が顕著な悪影響を示した(図5C)。IF2及びIF3をマッピングする変異体は、IF1のE988Q変異のようにRNase活性において同程度に強いか、それよりもより強い効果を示した。Ire1のRNaseドメインにより形成した新しい境界面IF2について詳細な研究を実施した。キナーゼ-RNase境界面における塩橋の崩壊(R947A)により、RNase活性が10倍を超えて減少した。新しいRNase-RNase境界面に位置するアルギニンの変異体(R1087Q)はさらに強い影響を及ぼした。塩橋に関して予想されたように、電荷反転(R1087D)は電荷-中性変異体(R1087Q)よりも強くRNase活性を弱めた。R1087のパートナーの変異体(D1030R)も、RNase活性を阻害したが、わずかであった。D1030R変異体の影響が小さかった理由は不明である。D1030Rは、静電接触の妨害を部分的に相殺する局所的接触の再分配を引き起こすのかもしれない。RNase活性に関する三つ全てのIre1境界面の重要性は、Ire1KR32の活性化オリゴマーの組み立ての際にIF1、IF2及びIF3の共同効果を示す。

二量体化は、HAC1/XBP1 mRNAのスプライス部位のタンデムを相殺する活性部位のタンデム配置を提供することによりIre1のRNaseを活性化することが示唆れてきた。原理上はこのメカニズムは、HAC1/XBP1 mRNAと比較してステム-ループがゆっくりと切断することを説明できた(図2D)。しかしながら、幾つかの証拠は、提案されたモデルを支持しない。Ire1KR32はステム-ループよりもHAC1/XBP1 mRNAの切断の有利な点を示すが、Ire1KR及びIre1KR24はまったく差別を示さない(図2DにおいてHP21とXBP1データを比較せよ)。従って、XBP1 mRNAの認識はIre1のオリゴマーを形成する能力と関連している。さらにたった一つのステムループ切断部位を含む基質は、HAC1及びXBP1 mRNAの速度でIre1KR32と反応することができ(図6A、図6B、XBP-1とXBP1-Pst1比較せよ)、二つのステム-ループを含む基質は、HP21オリゴヌクレオチドの速度で反応することができる(図6C、XBP-1、58ntとHP21とを比較せよ)。これらの知見は、Ire1の自己会合が、基質mRNAの二重スプライス部位への構造的相補性とは異なるメカニズムでRNaseドメインを活性化することを示唆している。

Ire1活性化のメカニズムをよりよく理解するために、RNaseドメインの配置をオリゴマー内で研究した。オリゴマー構造物中では、RNaseドメインは二つの境界面、IF1及びIF2により連続リボンに結合される。どちらの境界面の形成も全表面積約500Ųを覆う(図14)。IF2は、隣接するRNaseモノマーからα3’へリックスの間に相互側-側接触(reciprocal side-to-side contact)を包含する(図6D)。α3’アルファ-へリックス並びにα3’へリックスに結合したα3’-α4ループ(図6D及び図14に示されている)は、二量体構造中では乱れており、このことはIF2が形成すると、α3’、α3’-α4へリックス-ループエレメント(helix-loop element：HLEと示される)を安定化することを示唆している。HLE内の点変異はIre115のRNase活性を強く阻害する。HLEの機能的重要性及び二量体化境界面近くでのその位置により、Ire1のRNase活性を制御する動的スイッチングを提供することができる。実際、α3’へリックスは提案された活性部位の一部を形成し、酵素の基質結合ポケットに特徴的な空隙(cavity)を作り出す。HLEが存在しない場合には、先に提案された活性部位残基は平坦な溶媒-暴露表面上にある(PDB ID 2rio)。

非対称ユニット中の14個のIre1モノマーの全ての部分が、Ire1KR32オリゴマーを画定する非-結晶学的対称性と関連しているが、HLEのα3’-α4ループは、これがオリゴマー内で二つのコンフォメーションをとるという点で特徴的である(図6D)。非対称ユニットにおけるIre1KR32の大部分に関しては、HLEのループの「オープン」コンフォメーションが観察される(図6D、上部パネル)。幾つかのモノマーに関しては、結晶格子中で互いにらせん形ロッド(helical rod)が固まり(packing)になると、オープンコンフォメーションに適合できない。これらのモノマーに関しては、別の「クローズド」コンフォメーションが作られた(図6D、下部パネル)。HLEループのオープン状態でのみ、RNA基質はIre1 RNaseの推測上の活性部位残基と接触することができる。「クローズド」コンフォメーションでは、活性部位、特にY1043への基質アクセスが塞がれる(図６D)。これらの観察結果は、境界面IF2がHLEを配置し、且つ活性部位を構築することによってRNaseの活性化に大きな役割を果たしていることを示唆する。

オリゴマー化のRNase活性化への別の貢献は、オリゴマー内の各RNase活性部位の周囲に作り出された大きな分子表面から生じる(図4A)。そのような配置は、モノマーまたは二量体では可能でない基質mRNAのために大きな相互作用表面を形成する。このことは、オリゴマーを形成するIre1KR32のみが、ステム-ループHP21よりも早くXBP1 mRNAを切断できることの知見を説明する(図2D、図6C)。二量体形成構築物、Ire1KR及びIre1KR24は、XBP1 mRNAとHP21とを区別しない(図2D)。従って、オリゴマー化はXBP1/HAC1 mRNAの認識に関連し、Ire1オリゴマーとmRNAの間の連続接触(extended contact)は、Ire1機能に顕著に表れる。

Ire1活性化の重要な特性は、その発見直後から出現し、受容体の自己会合、そのトランス-自己リン酸化、及びRNase活性化に重要な補因子としてのADPの結合が挙げられる(図1A)。本明細書に示したオリゴマー構造は、これらの事象の機構的な役割を示唆している。Ire1 RNaseを活性化する主な事象は、間違って折り畳まれたタンパク質をLDに結合することによって誘発されたらせんナノロッド構造体内への細胞質ドメインの自己組織化(self-assembly)である(図6E)。Ire1の遊離(isolated)細胞質フラグメントは独立して自己会合し、このことは、ルーメンドメインの役割はキナーゼ-RNaseモジュール内につくられた自己会合平衡(self-association equilibrium)の調節であることを示している。トランス-自己リン酸化及び補因子結合はいずれも自己組織化へ平衡をシフトさせることによってIre1活性化を助けるが、どの事象もRNaseの活性化及び自己組織化に不可欠ではない。本研究は、Ire1KR32がオリゴマー化可能であり、且つ補因子(図1D)もリン酸化(図10、図13A、図13B)もなく活性化できることを示す。

トランス-自己リン酸化及びADP結合の役割及び一時的な分離は現在では明らかである。リン酸化されていないIre1のオリゴマー化はトランス-自己リン酸化のためにキナーゼを位置づけし、境界面IF3を介してオープンコンフォメーション中に活性化ループを安定化する(図9C)。ATPはオープン状態のキナーゼに結合し、活性化ループはリン酸化され、境界面IF3でオープン状態で安定化される。これにより、オリゴマーアセンブリの正のフィードバックが提供される(図6E)。補因子の結合は、Ire1キナーゼのオープン状態でのみ、即ちオリゴマー中で起こりえるが、モノマーでは起こりえない。補因子のオープン状態への優先的な結合は、平衡をさらにオリゴマー化にシフトさせ、遷移を活性化するための付加的且つ独立レベルの正のモジュレーションを提供する(図6E)。

UPR-誘導Ire1フォーカス11の構造用の魅力的なモデルが明らかになる。任意の角度での細胞質ドメイン及びLDにより形成されたオリゴマーの配置(図14A)は、ER膜の両側にモノマーの似たような周期性を与える。得られたクロスリンク・メッシュは、二次元で超分子Ire1フォーカスの無制限成長及び形成用のプラットフォームを与える。膜貫通領域にキナーゼ-RNaseドメインとLDを結合するリンカーの長さは、そのような配置を提供するのに十分である。入力シグナル及び不活発(inertia)に対する非線形応答(UPRをマウント(mount)する及びアンマウントする(unmount)ための長い時間)は、かかるアセンブリに関して予測でき、且つ探究される必要のある生物学的役割を有しているかもしれない。

Claims (19)

1. 式：
   Ｒ¹は、非置換のＣ₃−Ｃ₆シクロアルキル；
   Ｌは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
   Ａはアリールまたはヘテロアリールであり；
   Ｒ³⁷は、ハロゲン、ハロゲン−置換若しくは非置換Ｃ₁−Ｃ₈アルキル、または非置換へテロアルキルであり、ここでヘテロアルキルは、少なくとも１つの炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とを含み、炭素原子とヘテロ原子との総数は２〜８であり；及び
   ｗは０〜５の整数である｝
   をもつ化合物。
2. Ｒ¹はシクロプロピルである、請求項１に記載の化合物。
3. Ａはアリールである、請求項１または２に記載の化合物。
4. Ａはフェニルである、請求項１または２に記載の化合物。
5. Ｒ³⁷は−ＣＦ₃である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
6. ｗは０または１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
7. ｗは１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
8. 以下の式：
   の一つをもつ、請求項１に記載の化合物。
9. 式：
   をもつ、請求項１に記載の化合物。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物と医薬的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
11. 細胞中のＩｒｅ１活性を活性化するための医薬組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の有効量を含む医薬組成物。
12. 通常レベルと比較して低下したＩｒｅ１活性により生じる疾患を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の有効量を含む医薬組成物。
13. 疾患は、嚢胞性線維症、網膜色素変性病、糖尿病または神経変性病である、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記疾患は、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性小脳失調症、バッテン病、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶに伴う認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性脊髄連合変性症、統合失調症、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー病、または脊髄癆である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. Ｉｒｅ１活性を活性化させるための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
16. 細胞中のＩｒｅ１活性を活性化するための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
17. 低下したＩｒｅ１活性により生じる疾患の治療の必要な患者において、前記低下したＩｒｅ１活性により生じる疾患を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物または請求項１０に記載の組成物の使用。
18. 疾患は、嚢胞性線維症、網膜色素変性病、糖尿病または神経変性病である、請求項１７に記載の使用。
19. 前記疾患は、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性小脳失調症、バッテン病、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶに伴う認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、多系統萎縮症、ナルコプシー、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッヘル病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性脊髄連合変性症、統合失調症、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー病、または脊髄癆である、請求項１７に記載の使用。