JP6143853B2 - 宿主細胞における組換えタンパク質の発現のためのバキュロウイルスｄｎａエレメント - Google Patents

Description

本発明は、バイオテクノロジー分野に含まれるということができるものであり、組換えタンパク質産生の質および効率を増大させうる、プロモーター、エンハンサーとしての相同領域（ｈｒ）および転写調節因子をコードする配列、例えば、バキュロウイルスＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せなどを含む核酸配列を包含する。さらに、本発明はまた、上記の本発明の核酸配列を含むベクター自体、それらの配列またはベクターで感染させ、形質転換し、またはトランスフェクトした細胞、ならびに前記の配列、ベクターまたは細胞を使用することによってタンパク質を産生する方法も対象とする。

バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、ワクチン、治療分子または診断試薬として使用される組換えタンパク質を産生するための、十分に確立された方法である。過剰発現および迅速な発達速度の潜在性があるので、ＢＥＶＳは、任意の目的のために組換えタンパク質を産生するための最も魅力的な選択肢の１つである。組換えタンパク質発現のために産業上使用されるものとして、最も採用されているバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）をベースとし、適した発現宿主としてスポドプテラ・フルギペルダ ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ９）（Ｓｆ９）またはスポドプテラ・フルギペルダ ２１（Ｓｆ２１）昆虫細胞を用い（非特許文献１）、かつ、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｔ．ｎｉ）昆虫幼虫を生きた生物工場として用いる（非特許文献２）。ＢＥＶＳは、８０年代に開発され（非特許文献３）、細胞質酵素から膜結合タンパク質に至る数百種の組換えタンパク質が、バキュロウイルス感染昆虫細胞において成功裏に産生されてきた。

ＢＥＶＳ産生性を増大させるための努力がなされてきた（非特許文献４）。マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＳＵＭＯおよびＫＤＥＬ保留シグナルを含めた、タンパク質発現を改善すると報告されている常在性融合タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスの構築のために、種々のトランスファーベクターが利用可能である。発現されたタンパク質の安定性を改善するための関連するその他の試みは、細胞培養においてウイルスの成長に必須ではないバキュロウイルスゲノム中の２種の遺伝子、すなわち、ｃｈｉＡ（キチナーゼ）およびｃａｔｈ（カテプシン）に焦点を合わせて調べられてきた。ＣｈｉＡ欠失は、小胞体中にタンパク質を蓄積することおよび細胞の分泌経路を介してタンパク質をプロセッシングすることによって、分泌型タンパク質の産生を改善すると思われる。さらに、カテプシンプロテアーゼの形成の阻止もまた、ｃｈｉＡ⁻ウイルスからの生成物安定性の改善に寄与し得る。Ｔ．ｎｉ由来のＨｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）（Ｈｉ−５）またはＢＴＩ−ＴｎＡｏ３８細胞系統などの新規昆虫細胞系統が、バキュロウイルス生産性を増大させるために最近開発され、異種タンパク質回収の最終量が大幅に改善した（非特許文献５、６）。

昆虫細胞の機構がバキュロウイルス感染によって深刻に損なわれる前にタンパク質発現が起こるよう、組換えタンパク質発現を加速することは、ＢＥＶＳの重要な改善となろう。ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）またはｐ１０遺伝子の従来の強力なウイルスプロモーターによって駆動される遅い発現は、外来タンパク質翻訳後修飾において深刻な不利益をもたらす。従来使用されていたｐｏｌｈまたはｐ１０プロモーターよりも早期の発現を可能にするバキュロウイルスプロモーターが性状解析されており、異種タンパク質産生のために使用されてきたが、産生性の低下を示した（非特許文献７）。

ＢＥＶＳを改善するための別の可能性は、ウイルス誘導性細胞死を低減することによって、感染後の遅い時間に細胞完全性の保存を増強させることであろう。ＢＥＶＳによって引き起こされる感染後の遅い時間の昆虫細胞機構の深刻な機能障害の低減は、組換えタンパク質（分泌型または比分泌型）を産生し、蓄積するための時間枠を増大するだけでなく、複雑なタンパク質のフォールディングのための、または産生されたタンパク質の任意の翻訳後修飾のためのより多くの時間を可能にするはずである。

いくつかのバキュロウイルスＤＮＡエレメントは、ウイルス増殖に必要である後期発現因子遺伝子の活性化に関与していることが判明している。それらのうち１種として、ＡｃＭＮＰＶ（オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス）由来の最初期（ｉｅ）タンパク質ＩＥ−１およびそのスプライシング変異体ＩＥ−０がある。Ａｃ−ｉｅ−０１遺伝子によってコードされるＡｃＭＮＰＶ ｍＲＮＡの翻訳は、内部翻訳開始によってＩＥ−０およびＩＥ−１の両方をもたらす。両者は、転写調節因子としてのその効力のためにバキュロウイルス遺伝子発現の重大なメディエーターであると考えられる（非特許文献８）。ＡｃＭＮＰＶ ＩＥ−１は、感染の際に極めて早期に合成され、そのＮ末端酸性ドメインの活性によってプラスミドトランスフェクションアッセイにおいて転写を刺激する、６７ｋＤａの二量体のＤＮＡ結合タンパク質である（非特許文献９、１０）。ＩＥ−１は、核内に蓄積し、そこで、後期の間、維持される（非特許文献１１）。ＩＥ−１によるトランス活性化は、転写エンハンサーとして機能し、ウイルスＤＮＡ複製の起点である、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）配列にホモ二量体として結合することによって増強される。ＡｃＭＮＰＶ ＩＥ−０は、７２．６−ｋＤａの、ｏｒｆ１４１（エキソン０）によってコードされる３８個のアミノ酸、ｉｅ１の上流非翻訳リーダーによってコードされる１６個のアミノ酸および全５８２個のアミノ酸ＩＥ−１タンパク質からなる６３６個のアミノ酸のタンパク質である。したがって、最終生成物は、Ｎ末端と融合しているさらなる５４個のアミノ酸を除いてＩＥ−１と同一である。おそらく、その共通配列のために、ＩＥ−０およびＩＥ−１は、ｈｒエンハンサー結合および転写調節を含めた生化学的活性を共有する。

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ａ）ｐｏｌｈまたはｐ１０プロモ−ターを使用する市販のＢＥＶＳよりも強力な発現およびｂ）ウイルス誘導性細胞損傷を低減することによるバキュロウイルス系における長期の発現を可能にする新規代替ＢＥＶＳが求められている。

本発明は、ＢＥＶＳを使用する組換えタンパク質の発現の改善のための生成物および方法を提供する。

以下の項は、この発現の改善を可能にするための好ましい実施形態である：
１．転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む組換えバキュロウイルスであって、核酸は、
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される、組換えバキュロウイルス。

２．組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、項１に記載の組換えバキュロウイルス。

３．組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、項２に記載の組換えバキュロウイルス。

４．相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項２または３に記載の組換えバキュロウイルス。

５．配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、項１〜４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。

６．組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、項１〜５の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、項１〜５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。

７．転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含み、バキュロウイルスにおける組込みまたは転位に適した核酸配列をさらに含む、項１〜６のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスの生産に適したトランスファーベクター。

８．組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、項７に記載のトランスファーベクター。

９．組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、項８に記載のトランスファーベクター。

１０．相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項８または９に記載のトランスファーベクター。

１１．配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、項７〜１０のいずれかに記載のトランスファーベクター。

１２．組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、項７〜１１の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、項７〜１１のいずれかに記載のトランスファーベクター。

１３．組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、項７〜１１のいずれかに記載のトランスファーベクター。

１４．バクミドであることを特徴とする、項７〜１３のいずれかに記載のトランスファーベクター。

１５．バキュロウイルス発現系「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＰＡＫ（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））、「ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「ＢａｃｕＶａｎｃｅ（商標）」（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）」１０００、２０００、３０００（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））、「ＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（商標）」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））または「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）」（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））のいずれかに由来することを特徴とする、項７〜１４のいずれかに記載のトランスファーベクター。

１６．転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含み、細菌複製にさらに適している、項１〜１５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するのに適したクローニングベクター。

１７．組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、項１６に記載のクローニングベクター。

１８．組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、項１７に記載のクローニングベクター。

１９．相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項１７または１８に記載のクローニングベクター。

２０．配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、項１６〜１９のいずれかに記載のクローニングベクター。

２１．組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、項１６〜２０の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、項１６〜２０のいずれかに記載のクローニングベクター。

２２．組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、項１６〜２０のいずれかに記載のクローニングベクター。

２３．転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含む、項１〜２２のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するのに適した核酸配列。

２４．組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、項２３に記載の核酸配列。

２５．組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、項２４に記載の核酸配列。

２６．相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項２４または２５に記載の核酸配列。

２７．配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、項２３〜２６のいずれかに記載の核酸配列。

２８．組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、項２３〜２７の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、項２３〜２７のいずれかに記載の核酸配列。

２９．組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、項２３〜２７のいずれかに記載の核酸配列。

３０．項１〜２９のいずれかの組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列で感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。

３１．昆虫細胞系統であることを特徴とする、項３０に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。

３２．鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）または双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の属に属する昆虫に由来することを特徴とする、項３０または３１に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。

３３．イラクサギンウワバ、ヨトウガ、アスカラファ・オドラタ（Ａｓｃａｌａｐｈａ ｏｄｏｒａｔａ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）またはネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）に由来することを特徴とする、項３０〜３２のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。

３４．Ｈｉ−５（商標）、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−Ｔｎ５Ｂ−１、Ｔｎ３６８、ＥｘｐｒｅｓＳｆ＋（登録商標）、ＢＴＩ−ＴｎＡｏ３８、ＡＴＣ−１０およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒのショウジョウバエ系統２からなる群から選択される細胞系統であることを特徴とする、項３０〜３３のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。

３５．項１〜２９のいずれかの組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列を含む培養培地。

３６．項３０〜３４に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞、ならびに従来手段による組換えタンパク質を抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。

３７．組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンおよび診断用タンパク質試薬を含む群から選択される、項３６に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。

３８．項１〜６のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを生産するための、項７〜１５のいずれかに記載のトランスファーベクターの使用。

３９．項１〜１５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するための、項１６〜２２のいずれかに記載のクローニングベクターの使用。

４０．項１〜２２のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するための、項２３〜２９のいずれかに記載の核酸配列の使用。

４１．（ａ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される核酸である導入遺伝子を含むトランスジェニック細胞系統。

４２．昆虫、鳥類または哺乳類起源のものである、項４１に記載のトランスジェニック細胞系統。

４３．項４１または４２に記載のトランスジェニック細胞系統の成長ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。

４４．組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能する核酸配列を含む核酸配列であって、
（ａ）配列番号１２、１４または１５に示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、および
（ｂ）配列番号１２、１４または１５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される、核酸配列。

４種の主要なエレメント：発現が、プロモーター（Ｂ；例えば、ｐｏｌｈまたはｐＢ２_９）によって駆動される、転写調節因子（Ａ；例えば、ＩＥ０およびＩＥ１）をコードする配列；組換えタンパク質をコードする外来遺伝子の発現を駆動するプロモーター（Ｄ；例えば、ｐ１０、ｐｏｌｈ、ｐＢ２_９ｐ１０またはｐ６．９ｐ１０）の上流の、エンハンサー相同領域（ｈｒ）配列（Ｃ；例えば、ｈｒ１）を含む、本発明のバキュロウイルス組換えＤＮＡエレメントの模式図である。スキームは、組換えタンパク質の前例のない過剰発現をもたらす本発明の組換えＤＮＡエレメント間の相互作用の理論的機序を示す図である。 「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」クローニング系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））による組換えバキュロウイルスの生成をもたらす異なる方法論を示す図である。 組換えバキュロウイルスを作製するために使用されるその他の市販の技術と適合するクローニング、ドナーおよびトランスファーベクターを作製するための一般スキームを示す図である。 Ａ）ｐＢ２_９またはｐｏｌｈプロモーターの制御下で発現されるｈｒ１ｐ１０、ｈｒ１ｐＢ２_９ｐ１０またはｈｒ１ｐ６．９ｐ１０およびＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡを含有する、本発明のバキュロウイルス発現カセットにおいて発現される場合の、感染後種々の時間での感染Ｓｆ２１細胞に蓄積されたＧＦＰタンパク質の増大を測定するための蛍光定量的アッセイを示す図である。すべてのＧＦＰ発現レベルを、従来のバキュロウイルスベクターにおいてｐｏｌｈプロモーターを用いて得られたものと比較した。グラフは、各バキュロウイルスの３つの独立した発現実験の平均値を表し、各場合において、標準偏差は５％未満である。この図はまた、野生型バキュロウイルスを用いる（対照）、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する従来のバキュロウイルスを用いる、または本発明の発現カセットによってＧＦＰを発現するバキュロウイルスｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐＢ２_９ｐ１０ＧＦＰを用いる感染後種々の時間でのＳｆ２１細胞を示す代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。細胞を、Ａ）およびＢ）において、５の多重感染度（ＭＯＩ）で、またはＣ）において、０．１のＭＯＩで感染させた。 Ａ）ｐｏｌｈプロモーターの制御下、従来のバキュロウイルスベクターによって（明灰色）またはエレメントｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐＢ２_９ｐ１０ＧＦＰからなる本発明の発現カセットを用いて工学的に作製したバキュロウイルスベクターによって（暗灰色）発現され、マイクロ流体タンパク質分析（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）；ＢｉｏＲａｄ（商標）、ＵＳＡ）によって測定された、感染後種々の時間での単層で増殖させたＳｆ２１昆虫細胞における組換えＧＦＰタンパク質の量の比較を示す図である。細胞を、両ウイルスを用いて５のＭＯＩで感染させた；Ｂ）ｐｏｌｈプロモーターの制御下、従来のバキュロウイルスベクターによって（明灰色）またはエレメントｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．ｐ１０ＧＦＰからなる本発明の発現カセットを用いて工学的に作製したバキュロウイルスベクターによって（暗灰色）発現され、マイクロ流体タンパク質分析（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）；ＢｉｏＲａｄ（商標）、ＵＳＡ）によって測定された、感染後種々の時間での懸濁液中で増殖させたＳｆ９昆虫細胞中に蓄積された組換えＧＦＰタンパク質の比較を示す図である。細胞を、両ウイルスを用いて、０．１のＭＯＩで感染させた；非継続線は、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する従来のバキュロウイルスを用いて得られたものと比較した、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスによって生産された組換えＧＦＰの増大パーセンテージを示す；Ｃ）パネルＡに記載された実験の感染細胞抽出物を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色；Ｄ）パネルＢに記載された実験の感染細胞抽出物を分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色。 Ｓｆ９昆虫細胞を、懸濁液で培養し、ｐｏｌｈの制御下でＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡを過剰発現するバキュロウイルスによって、または本発明のバキュロウイルス発現カセットｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰの状況でリポータータンパク質ＧＦＰを発現するバキュロウイルスによって感染させて、これらの細胞の細胞密度（Ａ）および生存率（Ｂ）を評価した図である。対照として、ｐｏｌｈの制御下でＧＦＰタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスを使用した。細胞を、懸濁液で０．１のＭＯＩで感染させた。（Ａ）細胞を、感染後種々の時間（０、２４および４８時間）でカウントして、細胞密度を算出した。細胞増殖が、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡの過剰発現によってもたらされる正確な瞬間のより詳細な分析が、ｐｏｌｈＧＦＰまたはｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰに感染した細胞の挿入図中に示されている。（Ｂ）細胞生存率は、トリパンブルー染色（懸濁細胞およびＰＢＳバッファー中０．４％の着色剤の１：１希釈）によって評価した。この染色によって、生存細胞および死細胞間の区別が可能となる。細胞生存率は、感染後種々の時間（０〜１２０時間）での総細胞数に対する生存細胞のパーセンテージによって算出した。ｐｏｌｈプロモーターの下でリポータータンパク質ＧＦＰを過剰発現する対照の従来のバキュロウイルスを用いて（Ｃ）、またはｐｏｌｈプロモーターの制御下でＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡを過剰発現するバキュロウイルスを用いて（Ｄ）、５のＭＯＩで感染したＨｉ−５（商標）昆虫細胞単層の顕微鏡写真。顕微鏡写真は、倒立顕微鏡Ｌｅｉｃａ（商標）ＤＭＩＬ（商標）において２０Ｘ倍率で感染の９６時間後に得た。 Ａ）Ｓｆ９昆虫細胞を、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスによって（１）、またはＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子を過剰発現する、エレメントｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを含有する本発明の発現カセットを用いて工学的に作製したバキュロウイルスベクターによって（２）感染させた図である。細胞を、感染後種々の時間（０〜１２０時間）でサンプリングし、細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＧＦＰに対するか、または細胞アクチンタンパク質に対する抗血清を用いるウエスタンブロットによって分析した。Ｂ）パネルＡにおいて分析されたようなＳｆ９昆虫細胞において発現されたＧＦＰタンパク質の機能性を、蛍光定量によって測定した。従来の組換えバキュロウイルス（灰色バー）によって産生されたＧＦＰタンパク質を用いて感染後種々の時間で得られた蛍光値を、本発明のバキュロウイルスカセットを有する組換えバキュロウイルスによって産生されたもの（黒色バー）と比較した。 組換えタンパク質をコードする外来遺伝子のプロモーター（単数または複数）からの転写を増強する、転写調節因子、相同領域（ｈｒ）のコード配列を含む、本発明のバキュロウイルス発現カセットに含有される好ましいエレメントの模式図である。 Ｔ．ｎｉから単離されたｐＢ２プロモーターの配列分析および転写調節エレメントｐＢ２_９配列の決定を示す図である。Ａ）Ｔ．ｎｉ．から単離されたＢＪＨＳＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４１６４０）のｐＢ２プロモーター領域のヌクレオチド配列。これまでに記載された転写開始部位が、三角によって示されているが、ＴＡＴＡボックスには下線が引かれ、潜在的なシス作用エレメントは、ｐＢ２配列中で四角に囲まれている。影を付けたヌクレオチド残基は、ｐＢ２_９プロモーター中に組み込まれた配列を示す。予測されるＢｒ−ＣおよびＥｃＲ推定結合部位はまた、透明な四角によって図中で示されている。Ｂ）ｐＢ２ ＤＮＡ断片およびその誘導体プロモーターｐＢ２_９の略図。そのプロモーター活性を、リポーター遺伝子としてＧＦＰタンパク質を使用して蛍光定量的分析によって分析した。すべての実験において、ＧＦＰ発現は感染の７２時間後定量し、３つの独立した実験の標準偏差を有する算術中央値（ｍｅｄｉａ）として示されている。 種々のプロモーターまたはプロモーターの組合せの使用によって媒介されたＧＦＰ発現レベルを示す図である。Ａ）種々の個々のまたはキメラプロモーターの制御下でＧＦＰを発現する種々の組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ２１細胞の感染後２４時間での蛍光定量的分析。Ｂ）蛍光定量的アッセイによって測定された、パネルＡと同一の組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ２１細胞におけるＧＦＰ発現の時間経過研究。すべての実験は、５のＭＯＩで行い、図は、３つの独立した実験の算術中央値（ｍｅｄｉａ）および対応する標準偏差を示す。

本発明は、ＢＥＶＳにおける組換えタンパク質の発現を、バキュロウイルスへの組換えＤＮＡエレメントの導入によって改善する。

本発明の組換えＤＮＡエレメントは、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引き起こす配列ならびに任意選択でエンハンサー相同領域（ｈｒ）およびこれらの上記のエレメントと作動可能に連結したプロモーターである。

さらに、組換えＤＮＡエレメントは、発現カセットの一部を形成し得る。

「発現カセット」とは、遺伝子発現を制御する（例えば、プロモーター）および／または遺伝子発現のために必要である（例えば、遺伝子自体）組換えＤＮＡエレメントを含有する核酸配列を指す。発現カセットは、組換えベクターまたはバキュロウイルス中に導入され得る。

組換えＤＮＡエレメントは、単一の核酸配列、単一のクローニングベクター、単一のトランスファーベクター、単一の組換えバキュロウイルスまたは単一の細胞に組み込まれ得る。しかし、それらはまた、種々の核酸配列、種々のクローニングベクター、種々のトランスファーベクターまたは種々の組換えバキュロウイルス中に存在し、かつ同一細胞中に導入されてもよい。

本発明は、驚くべきことに、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引き起こす配列の導入、および任意選択でエンハンサー相同領域（ｈｒ）配列、プロモーターまたはプロモーターの組合せの導入が、組換えタンパク質の産生を、感染後早期（感染後６〜８時間）から後期（感染後４８〜９６〜１２０時間）に前例のないレベルに増大させることができることを示す。

さらに、これらの組換えＤＮＡエレメントの導入はまた、バキュロウイルス感染細胞の増殖（特に、感染後早期の）、感染後の遅い時間の生存率ならびに前記バキュロウイルス感染細胞の分子細胞機構および形態の完全性も増大させる。バキュロウイルス感染の間の細胞機能の完全性の改善はまた、組換えタンパク質の正しい翻訳後プロセシングに寄与する。

これらの組換えＤＮＡエレメントの導入はまた、従来のｐｏｌｈまたはｐ１０プロモーターと比較して、宿主細胞における組換えタンパク質産生を増大させる。

したがって、本発明の一態様は、転写調節因子の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含有する組換えバキュロウイルスに関する。好ましい実施形態では、転写調節因子は、ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片である。

「バキュロウイルス」とは、主に昆虫および節足動物に感染する無脊椎動物の感染ウイルスのファミリーを指す。「組換えバキュロウイルス」は、さらに導入された組換えＤＮＡを有するものであり、導入が、例えば、相同組換えまたは転位などによって行われるものである。組換えバキュロウイルスは、ＡｃＭＮＰＶを起源とすることが好ましい。

「組換えＤＮＡ」とは、一または複数のＤＮＡ鎖の組合せまたは挿入によって作製されており、それによって通常は一緒には生じないＤＮＡを組み合わせる人工ＤＮＡの形態を指す。

「組換えＤＮＡエレメント」とは、プロモーター、エンハンサーまたは遺伝子などの組換えＤＮＡ内の機能的エレメントを指す。上記のように、本発明の組換えＤＮＡエレメントとは、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引きおこす配列、これらの上記のエレメントと作動可能に連結したエンハンサー相同領域（ｈｒ）およびプロモーターである。

「転写調節因子」とは、特定の遺伝子の転写を調節する能力を有する調節タンパク質を指し、調節が、例えば、エンハンサーまたはレプレッサー領域との結合および／または転写に関与しているさらなるタンパク質を補充することなどによって行われるものを指す。

ＩＥ−１およびそのスプライシング変異体ＩＥ−０は、バキュロウイルス感染の間に内因性に発現される転写調節因子である。本発明によれば、ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片は、これらのタンパク質の総レベルが内因性レベルを上回って増大させるよう組換えによって発現される。これは、例えば、内因性遺伝子の更なるコピーを導入することまたはプロモーターによる内因性遺伝子の発現を操作することによって達成され得る。さらに、内因性遺伝子のコピーは、ｐｏｌｈまたはｐＢ２_９などの適したプロモーターの制御下で導入遺伝子として導入され得る。

タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の発現レベルは、定量的ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析などの当業者に従来公知である方法を用いて、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で決定され得る。

本発明によれば、ＩＥ−１、ＩＥ−０およびそれらの断片は、配列番号１（Ａｃ−ｉｅ−０１とも呼ばれる）〜配列番号５の核酸によってコードされる。配列番号１は、ＩＥ−１およびＩＥ−０の両方をコードするＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡであり、配列番号２は、ＩＥ−１のコード配列（ＣＤＳ）であり、配列番号３は、ＩＥ−０のＣＤＳである。配列番号４および５は、それぞれ、触媒的転写調節因子活性を保持するＩＥ−１およびＩＥ−０のＮ末端ドメインのＣＤＳである。配列番号２〜５によってコードされるタンパク質は、それぞれ、配列番号６〜９によって表されている。

本発明はさらに、転写調節因子として機能できるアミノ酸であるか、またはそれをコードする配列番号１〜９の変異体を開示する。これらの変異体は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、１つまたは複数の位置で、これらの元となる核酸鎖またはアミノ酸鎖と異なっており、それによる相違が、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換であり得る核酸鎖またはアミノ酸鎖である。

本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、デフォルトパラメータを用いるＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して決定される配列同一性または配列類似性の程度によって、その他の核酸およびアミノ酸配列と区別されなければならない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）。このような変異体を作製する方法として、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、ＰＣＲベースのフラグメントアセンブリー、ＤＮＡシャッフリング、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えおよび遺伝子合成の方法が挙げられる。

配列番号１〜５の変異体の配列は、配列番号１〜５の配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。

配列番号６〜９の変異体の配列は、配列番号６〜９の配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％類似である。

好ましい実施形態では、本発明の組換えバキュロウイルスは、タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列に加えて、それぞれのプロモーターと作動可能に連結していることによって組換えタンパク質の発現を増強し得る組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含有する。

相同領域、ｈｒは、その中心付近に不完全な３０ｂｐのパリンドロームを有する約７０ｂｐの反復されたユニットからなる。相同領域は、ＡｃＭＮＰＶゲノム中の８つの位置で反復され、各側に２〜８の反復配列を有する。相同領域は、転写エンハンサーおよびバキュロウイルスＤＮＡ複製の起点の両方として意味づけられている。

「エンハンサー領域」とは、転写調節因子が結合することにより、関連する遺伝子の転写のレベルを増大させる制御配列を指す。

「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡに起因するタンパク質を指す。このようなタンパク質は、ヒトおよび動物の利益のために使用され得、工業的、商業的または治療的用途を有し得る。

「作動可能に連結している」とは、一方が、他方に影響を及ぼすような方法で連結している２種の核酸配列であって、他方への影響が、例えば、転写調節に関するものであるものを指す。

「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写を開始できるＤＮＡ配列を指す。配列は、転写因子などの転写を調節する種々のタンパク質の結合部位をさらに含有し得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ配列中で近接して位置し、リンカーまたはスペーサーによって分離され得る種々のプロモーター断片（異なるまたは同一断片のいずれか）からなり得る。このようなプロモーターは、キメラプロモーターと呼ばれる。

プロモーター（単数または複数）の上流のエンハンサー相同領域配列ｈｒは、ｈｒ１（配列番号２７）であることが好ましい。組換えタンパク質の発現を駆動するプロモーターは、配列番号１０〜１６またはプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかにおいて示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む群から選択されることが好ましい。

好ましい実施形態では、核酸配列は、配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む。

上記で示されるように、本発明の組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域は、単一分子の一部を形成する必要はなく、代わりに、これらの配列は、それらが作動可能に連結されている限り、すなわち、同一細胞内に含有される限り、別個の分子の一部を形成し得る。

本発明の組換えバキュロウイルスは、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むことが好ましい。この核酸配列は、タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列、および任意選択で相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結している。

一実施形態では、本発明は、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列で感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞を開示する。好ましくは、宿主細胞は、細胞培養で維持される。宿主細胞は、好ましくは、昆虫細胞系統、より好ましくは、鱗翅目または双翅目の属に属する昆虫に由来する細胞系統であり、より好ましくは、宿主細胞は、イラクサギンウワバ、ヨトウガ、アスカラファ・オドラタ、カイコ、キイロショウジョウバエおよびネッタイシマカからなる群に由来し、最も好ましくは、Ｈｉ−５（商標）、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−Ｔｎ５Ｂ−１、Ｔｎ３６８、ＥｘｐｒｅｓＳｆ＋（登録商標）、ＢＴＩ−ＴｎＡｏ３８、ＡＴＣ−１０およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒのショウジョウバエ系統２からなる昆虫細胞系統の群から選択される。宿主細胞は、単層培養または懸濁培養され得る。

さらなる態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を使用する組換えタンパク質を産生するための方法を開示する。組換えタンパク質の発現後、組換えタンパク質の抽出および精製は、従来手段によって行われる。

タンパク質産生のための好ましい実施形態では、宿主細胞は、使用される細胞系統および発酵手順に応じて、１ｍｌあたり２×１０^６〜８×１０^６個細胞の間の密度で浮遊培養（バイオリアクター）される。さらに、細胞は、０．１〜１のＭＯＩで感染させる。

好ましくは、本発明の方法によって産生される組換えタンパク質は、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンおよび診断用タンパク質試薬を含む群から選択されるタンパク質である。

本発明の一態様は、培養培地における本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列の使用に関する。好ましい実施形態では、培養培地は、本発明のバキュロウイルスを含む。

本発明は、本発明の組換えバキュロウイルスを生産するために使用され得、バキュロウイルスにおける組込みまたは転位に適した配列に加えて、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のために前記配列を含むトランスファーベクターを開示する。

トランスファーベクターは、一般に、バキュロウイルスへの遺伝情報の挿入を可能にする。

トランスファーベクターは、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、組換えバキュロウイルスについて上記で記載されたとおりである。

好ましい一態様では、トランスファーベクターは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが、別の好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、このような配列を欠く。

好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、バクミドである。

「バクミド」とは、細胞にトランスフェクトした場合にバキュロウイルスを作製するのに十分なＤＮＡ配列を含有するプラスミド構築物を指す。

さらに好ましい一実施形態では、トランスファーベクターは、市販のバキュロウイルス発現系「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＰＡＫ（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））、「ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「ＢａｃｕＶａｎｃｅ（商標）」（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）」１０００、２０００、３０００（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））、「ＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（商標）」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））または「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）」（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））のいずれかに由来する。

本発明は、本発明の組換えバキュロウイルスおよび／またはトランスファーベクターを生産するために使用され得、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のために前記配列を含み、細菌複製にさらに適しているクローニングベクターを開示する。

「クローニングベクター」とは、一般に、制限酵素認識部位、細菌増殖の複製起点および選択マーカーの存在を含む、クローニングに適している任意のベクターを指す。

クローニングベクターは、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、組換えバキュロウイルスについて上記で記載されたとおりである。

好ましい一態様では、クローニングベクターは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが（「ドナーベクター」とも呼ばれる）、別の好ましい実施形態では、クローニングベクターは、このような配列を欠く。

本発明は、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターおよび／またはクローニングベクターを生産するために使用され得、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含む核酸配列を開示する。

核酸配列は、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、組換えバキュロウイルスについて上記で記載されたとおりである。

好ましい一態様では、核酸配列は、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが、別の好ましい実施形態では、核酸配列は、このような配列を欠く。

バキュロウイルス系によるＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡの一過性発現は、驚くべきことに、細胞に、ウイルス抵抗性および細胞増殖の独特の特性を付与する。これは、この遺伝子によってコードされる転写調節因子の過剰発現により、生産性の増大および種々の細胞ストレスに対する抵抗性に絡む興味深いバイオテクノロジー応用に結びつく可能性のあるその他のウイルス性または細胞性遺伝子が活性化されることを示唆する。この研究に由来する潜在的な適用は、弱毒化または不活化ウイルスに基づいた従来のワクチンの生産における使用の潜在性がある、組換えタンパク質産生またはウイルス増殖に使用される、高度に生産性のある細胞系統に相当し得る、昆虫、鳥類または哺乳類トランスジェニック細胞の作製であり得る。

したがって、本発明の一態様は、導入遺伝子として、配列番号１〜５の配列またはその変異体または配列番号６〜９のタンパク質もしくは上記で定義されるその変異体をコードする配列を保持するトランスジェニック細胞系統に関する。トランスジェニック細胞系統は、哺乳類、鳥類または昆虫起源のものであることが好ましい。さらなる一実施形態では、本発明のトランスジェニック細胞系統は、組換えタンパク質の産生のために使用され得、これが、従来の手段によって抽出され、精製される。

「トランスジェニック細胞系統」とは、細胞に導入された遺伝子を含有する細胞系統を指す。

組換えバキュロウイルスプロモーターｐＢ２_９（配列番号１４）およびキメラ組換えバキュロウイルスプロモーターｐＢ２_９ｐ１０（配列番号１２）およびｐＢ２ｐ１０（配列番号１５）は、ｐＢ２などの従来のプロモーターと比較して、発現の改善を可能にするという驚くべき知見に基づいて、本発明のさらなる態様は、このような配列または配列番号１２、１４もしくは１５の配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である配列番号１２、１４もしくは１５の配列変異体を含む核酸配列に関する。
配列の概要

ブタペスト条約に従う微生物の供託
プラスミドは、２０１１年１０月４日に受託番号ＣＥＣＴ８０３１で、Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＥＣＴ）（ｗｗｗ．ｃｅｃｔ．ｏｒｇ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｐａｒｃ Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ ｄｅ Ｖａｌｅｎｃｉａ； Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ Ａｇｕｓｔｉｎ Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ、９； ４６９８０ Ｐａｔｅｒｎａ （Ｖａｌｅｎｃｉａ）、Ｓｐａｉｎに供託された。
［実施例］

バキュロウイルス転写調節因子の過剰発現は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）における組換えタンパク質の発現を増大するプロモーターと機能的に連結している相同領域ｈｒのエンハンサー機能を増強する。

ＡｃＭＮＰＶに由来する、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる最初期ウイルスタンパク質、すなわち、ＩＥ−１およびＩＥ−０は、バキュロウイルスにおける強力な転写調節因子である。これらのタンパク質によって媒介されるトランス活性化は、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）配列との、ホモ二量体としてのその結合によって増強され、これは、転写エンハンサーとして作用する。ＡｃＭＮＰＶ ＩＥ−１／ＩＥ−０は、そのＮ末端酸性ドメインの活性によってプラスミドトランスフェクションアッセイにおいて転写を刺激する、６７〜７２ｋＤａの二量体ＤＮＡ結合タンパク質である（７、８）。ＩＥ−１およびＩＥ−０は、感染の際、極めて早期に合成され、核内に蓄積し、後期の間中、そこで維持される。ｄｕａｌプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ（商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡをｐｏｌｈプロモーターの制御下でクローニングした。同一プラスミド中であるが、別の遺伝子座中に、これまでに合成され、プロモーターｐＢ２_９およびｐ１０と融合している相同領域ｈｒ１を含有するｈｒ１ｐＢ２_９ｐ１０キメラプロモーターの下流に、ＧＦＰをコードする遺伝子をクローニングした。プロモーターｐＢ２_９は、Ｔ．ｎｉ鱗翅類において塩基性幼若ホルモン抑制性タンパク質２（Ｂａｓｉｃ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ＢＪＨＳＰ−２）の発現を駆動するプロモーターｐＢ２に由来するＤＮＡ断片である。バキュロウイルス発現ベクター中に組み込まれた場合に全長昆虫由来プロモーターよりも高い発現レベルを示す、ｐＢ２プロモーターに由来する４３６のヌクレオチドからなる配列を含む、断片ｐＢ２_９。得られた本発明のバキュロウイルス発現カセットおよび組換えＤＮＡエレメントの推定機能の模式図が、図１に示されている。得られたプラスミドを使用し、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））によって組換えバキュロウイルスを作製した。並行して、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスを、同一系によって作製した。

種々のバキュロウイルスによって媒介されるＧＦＰタンパク質の発現を、単層で培養されたＳｆ２１細胞において感染後種々の時間での蛍光定量によって研究した。ｐｏｌｈプロモーターの制御下でタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスと比較して、転写調節因子およびエンハンサー配列を含有するバキュロウイルス発現カセットを用いるＧＦＰの発現レベルは、５のＭＯＩで使用した場合に約２倍高く（図４Ａ）、０．１のＭＯＩで使用した場合には４倍高かった（示されていないデータ）。タンパク質蓄積におけるこれらの相違はまた、Ｈｉ−５（商標）細胞においても観察され（示されていないデータ）、本発明のバキュロウイルス発現カセットは、研究および産業において使用される種々の昆虫細胞系統において組換えタンパク質を産生するために使用され得ることを示唆した。

重要なことに、蛍光顕微鏡によって観察される感染細胞では、本発明のバキュロウイルス発現カセットによって媒介されるＧＦＰ発現は、ＧＦＰ発現を駆動するために従来のプロモーターｐｏｌｈが使用された場合よりも早く検出され、さらに、感染細胞の蛍光強度は、大幅に高かった（図４Ｂ）。蛍光細胞は、本発明の発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスを用いて、５のＭＯＩで感染させた場合、感染後１６時間という早期に検出され、前記ＧＦＰ発現は、感染の時間に沿って増大していた（図４Ｂ）。新規および対照組換えバキュロウイルス間のこれらの著しい相違はまた、低い０．１のＭＯＩでも観察された（図４Ｃ）。

転写調節因子の過剰発現のために使用されるプロモーターの影響を分析するために、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡをまた、ｐｏｌｈプロモーターの置換でｐＢ２_９プロモーターの制御下、上記の発現カセット中にクローニングした。Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡ発現を駆動するために使用したプロモーターとは独立に、ＧＦＰ蓄積は、リポータータンパク質が、ｐｏｌｈプロモーターの制御下で発現され、発現カセット中にＡｃ−ｉｅ−０１およびｈｒ１エレメントがない従来のバキュロウイルスを使用した場合に観察されたものよりも高かった（図４Ａ）。同様に、ｐＢ２_９ｐ１０キメラプロモーターと連結されたｈｒ１エンハンサーを含有する発現カセット中にＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡがないことも、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡを含有するものに対して、ＧＦＰの低い発現レベルをもたらした（示されていないデータ）。

Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子は、その他のｈｒ１シス連結したバキュロウイルスプロモーターを増強する。

Ａｃ−ｉｅ−０１によってコードされる転写調節因子が、エンハンサー配列と組み合わせて、転写エンハンサー相同領域１（ｈｒ１）とシス連結したその他のバキュロウイルスプロモーター、キメラまたはそうではないもの（ｐ６．９ｐ１０またはｐ１０）によって媒介される発現を増大するかどうかを分析するために、本発明者らは、バキュロウイルス発現カセットの新規セットおよびその対応するＡｃＭＮＰＶ組換えバキュロウイルスを作製した。これらの発現カセットは、ｐｏｌｈプロモーターの制御下にクローニングされたＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡおよびｈｒ１ｐ１０またはｈｒ１ｐ６．９ｐ１０プロモーターの下流にＧＦＰをコードする遺伝子を含有していた。発現レベルは、種々のバキュロウイルスに感染した昆虫細胞からの抽出物の蛍光定量的分析によって測定した。対照として、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質を発現する従来の組換えバキュロウイルスを使用した。観察された結果は、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子はまた、相同配列ｈｒ１と組み合わせて、その他のバキュロウイルスプロモーターまたはプロモーターの組合せ（キメラ）の制御下で発現されたリポータータンパク質ＧＦＰの前例のない発現レベルを促進できることを実証した（図４Ａ）。ｐ６．９およびｐ１０からなるキメラプロモーターを使用する発現カセットの場合には、組換えタンパク質産生は、アッセイされた種々の組換えバキュロウイルスの間で最高であった（感染後７２時間で、対照と比較して約２．５倍高い）。

従来のバキュロウイルスによって、またはエレメントｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐＢ２_９ｐ１０ＧＦＰを含有する本発明の発現カセットを組み込んでいるバキュロウイルスによって媒介される、単層でのＳｆ２１昆虫細胞および懸濁液でのＳｆ９昆虫細胞の両方におけるＧＦＰ産生のさらなる定量を、マイクロ流体タンパク質分析（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）；ＢｉｏＲａｄ（商標）、ＵＳＡ）によって実施した。単層での昆虫細胞を、高い５のＭＯＩで感染させ、懸濁液では、低い０．１のＭＯＩで感染させた。図５Ａは、感染後種々の時間（２４〜７２時間）での、総可溶性細胞タンパク質に対する産生された組換えＧＦＰのパーセンテージおよび従来のバキュロウイルスに対する産生性の相対的増大を示す。分析した最も遅い時間で、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスは、総細胞タンパク質の４０％を超える組換えＧＦＰのレベルに達した。アッセイしたバキュロウイルス間のＧＦＰバンド強度の大幅な相違は、感染細胞からの細胞抽出物が分離された、クーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて目に見えた（図５Ｃ）。昆虫細胞を懸濁液で培養し、各バキュロウイルスを用いて感染させた場合には、組換えタンパク質産生性の相違は、単層で培養され、高い５のＭＯＩで感染させた昆虫細胞において検出されたものよりもかなり高かった。図５Ｂは、感染後２４〜１２０時間の間にＧＦＰ産生において見られるこのような相違を示す。興味深いことに、本発明の発現カセットを組み込むバキュロウイルスを使用した場合には、組換えタンパク質産生性は、時間に沿って増大し、感染後１２０時間で最大レベルに達した。対照的に、従来のバキュロウイルスによって産生された組換えタンパク質は、感染後７２時間で最大レベルに達し、感染後のより遅い時間に減少した（図５Ｂ）。本発明のバキュロウイルス発現カセットを用いて、感染後の極めて遅い時間に２０倍を超える産生性の増大が観察された。Ｈｉ−５（商標）細胞において同様の結果が観察され（示されていないデータ）、本発明の発現カセットは、研究および産業において使用される種々の昆虫細胞系統において組換えタンパク質を産生するために使用され得ることを実証した。懸濁液で培養した細胞から得たアッセイしたバキュロウイルス間のＧＦＰバンド強度の大幅な相違はまた、感染細胞からの細胞抽出物が分離された、クーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて目に見えた（図５Ｄ）。

本発明のバキュロウイルス発現カセットは、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子によって、細胞増殖を誘導し、細胞生存率を増大させる
本発明者らは、顕微鏡によって、本発明のバキュロウイルス発現カセットを組み込む組換えバキュロウイルスは、ウイルス誘導性細胞変性効果の低減および培養における細胞密度の増大と関連する興味深い特性を有することを観察した。これらの現象を定量化し、このような興味深い特性に関与するＤＮＡエレメント（単数または複数）を決定するために、本発明者らは、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子を発現する組換えバキュロウイルスを作製した。このバキュロウイルスを、実施例２において使用した本発明の発現カセットのエレメントを組み込むバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰ）およびＧＦＰタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスと共同で使用して、低い０．１のＭＯＩで懸濁液のＳｆ９細胞に感染させた。感染後２４〜１２０時間の間で、細胞数および細胞生存率の増大を研究した。感染後２４時間で、上記の転写調節因子を過剰発現するバキュロウイルスのいずれかによって感染した昆虫細胞は、対照組換えバキュロウイルスによって感染した培養物に対して１０％より高い細胞数の増大を示した（図６Ａ）。これらの因子が、細胞増殖における観察された相違を誘導するのに必要な時間のフローサイトメトリーによるより詳細な分析によって、感染後３時間でＳ相の昆虫細胞の増大が示され、次いで、感染後６時間で、Ｇ１の昆虫細胞数の増大が観察された。これらのデータは、タンパク質をコードするＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡを過剰発現するバキュロウイルスに感染した培養物における有糸分裂の極めて早期の増大を意味する（示されていないデータ）。

ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））フローサイトメーターで蛍光測定を実施した。細胞を、７０％ ＥｔＯＨ中で固定し、再懸濁し、染色溶液（ＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、５ｕｇ／ｍｌのＲＮアーゼ）中でインキュベートした。データはゲート開閉して、細胞とは異なる大きさを有する粒子を排除し、ヨウ化プロピジウムからの赤色蛍光に対して細胞数をプロットすることによって分析した。アッセイあたり５０，０００個細胞をカウントした。Ｍｏｄｆｉｔソフトウェアを使用して、細胞周期相（Ｇ１、ＳおよびＧ２）あたりの細胞総数のデータ分析を行った。

感染細胞培養物はまた、トリパンブルー染色によって分析して、感染後種々の時間の細胞生存率を決定した。興味深いことに、感染後極めて遅い時間（９６〜１２０時間）に、転写調節因子を過剰発現するウイルスに感染した昆虫細胞は、細胞生存率の増大（５０〜６０％の増大）および完全性の増大を示した（図６Ｂ）。これは、本発明の転写調節因子の過剰発現が、細胞をバキュロウイルス誘導性細胞変性効果から保護し、長期の発現を可能にすることを示唆する。感染後の細胞増殖および細胞生存率の増大は両方とも、ＢＥＶＳの組換えタンパク質産生性において重大な結果を有する。同様の結果が、転写調節因子の過剰発現が、ｐＢ２_９またはｐｏｌｈプロモーターの両方によって駆動された場合に得られた（示されていないデータ）。懸濁液で感染したＳｆ９昆虫細胞において観察された結果は、単層で培養されたＳｆ２１細胞において（示されていないデータ）および単層で培養されたＨｉ−５（商標）細胞においても（図６ＣおよびＤ）確認された。これらの図は、転写調節因子の過剰発現が、感染後の遅い時間（９６時間）に細胞完全性を改善する方法を実証する。

Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子のバキュロウイルス発現系における過剰発現が、組換えタンパク質の翻訳後プロセシングを促進する。

バキュロウイルス感染の際の細胞完全性は、この系よって発現された外来タンパク質の正しいフォールディングまたは任意のその他の翻訳後修飾を確認するために非常に重要である。ｐｏｌｈおよびｐ１０などの、研究および生産のためによく使用されるバキュロウイルスの強力なプロモーターは、感染細胞がすでに、深刻な細胞変性効果を示し、細胞生存率が低下している場合には、感染後の遅い時間にしか外来遺伝子を発現しない。上記のように、本発明のバキュロウイルス発現カセットにおいて使用される転写調節因子の過剰発現は、細胞を、未だ未知の機序によるバキュロウイルス感染の発病効果から保護し、十分に生存したままである細胞における組換えタンパク質産生のための広い時間ウィンドウを可能にする。本発明者らは、組換えタンパク質の翻訳後修飾との関連での本発明の発現カセット中に組み込まれたエレメントの関連性を研究した。この目的のために、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でリポータータンパク質ＧＦＰを発現する従来のバキュロウイルスおよび本発明のバキュロウイルスカセットを組み込んでおり、ＧＦＰタンパク質も発現するバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰ）を、使用して、０．１のＭＯＩで懸濁液のＳｆ９昆虫細胞に感染させた。図７に示されるように、感染細胞を、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ｍａｂ２５１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を使用するウエスタンブロットによって感染後種々の時間で分析した。興味深いことに、従来のバキュロウイルスによって発現されたＧＦＰタンパク質は、感染後４８および７２時間でいくつかの反応性バンドを示し（タンパク質の適切でない発現および／またはフォールディングを示唆する）、より遅い時間に、分子量の低減したバンド（予測されるものよりも小さい）が観察された（分解を示唆する）（図７Ａ）。対照的に、ＧＦＰタンパク質発現が、本発明のバキュロウイルス発現カセットによって媒介された場合には、分析されたすべての感染後の時間で、このタンパク質の予測された分子量を示す１種のＧＦＰバンドのみが観察された（図７Ａ）。このベクターによるＧＦＰの発現は、感染後の極めて遅い時間（１２０時間）に大幅に低減せず、本発明のバキュロウイルス発現カセットが、バキュロウイルスベクターに長期に持続する発現のための興味深い利点を付与することが確認された。

並行して、特異的抗血清を使用する細胞性アクチンタンパク質のウエスタンブロット解析によって、感染後の種々の時間で細胞機構の完全性を測定した（図７Ａ）。従来のバキュロウイルスを用いる感染は、感染後７２時間で細胞完全性を深刻に損なったが、これは、検出されるアクチンバンドが、この時点以後著しく低減したからである（細胞完全性の完全な喪失の結果としての分解）。本発明のバキュロウイルス発現カセット中に含有される組換えＤＮＡエレメントによって誘導される細胞保護と一致して、細胞性アクチンは、発現カセットを用いて工学的に作製した組換えバキュロウイルスに感染した細胞では、同等には影響を受けなかった。

種々のバキュロウイルスによって発現される組換えＧＦＰの蛍光活性は、その正しいコンホメーションを反映する。図７Ｂに示されるように、本発明のバキュロウイルス発現カセットとの関連で発現されたＧＦＰは、感染時間に沿って機能性の増大したパターンを維持する。対照的に、従来のバキュロウイルスによって発現されたＧＦＰの蛍光は、感染後７２時間でピークに達し、アクチン分解（図７Ａ）、および観察された細胞生存率低減（図６Ｂ）と並行して、より遅い時間で低減した（図７Ｂ）。

細胞培養およびウイルス
ヨトウガＳｆ２１またはＳｆ９細胞系統を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、２７℃で、６ウェルの組織培養プレートで培養した（１×１０^６個細胞／ウェル）。ＡｃＭＮＰＶ組換えバキュロウイルスは、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」バキュロウイルス発現系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）によって得た。本発明の組換えＤＮＡエレメントを含有する種々のトランスファーベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）−ＤＵＡＬプラスミド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して作製した。ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）−ＤＵＡＬ中に組み込まれたプロモーターおよび調節エレメントは、クローニングを容易にするための適切な隣接する制限酵素認識配列を用いて合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＵＳＡ）。これらのトランスファーベクターを使用し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）を用いてＳｆ２１細胞をトランスフェクトした。次いで、Ｓｆ２１細胞の感染から得られた組換えバキュロウイルスを、細胞において２回継代し、プラークアッセイ法によって力価測定した。得られた本発明のバキュロウイルス発現カセットの遺伝子構築物が、図８に模式的に示されており、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡまたは外来遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の発現を駆動するプロモーターの種々の潜在的な組合せを示す。種々の発現カセットを使用して、図４〜７に示される実施例において使用した組換えバキュロウイルスを作製した。

クローニングベクターの作製
クローニングベクターは、外来ＤＮＡ断片が、媒介物および外来ＤＮＡを同一のオーバーハングを生成する制限酵素で処理すること、次いで断片を一緒にライゲーションすることによって挿入され得る本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するＤＮＡの小片である。クローニングベクターの本質的な特徴は、選択された配向に向けられた外来遺伝子、正に形質転換された細胞の選択を可能にするための抗生物質耐性などの選択マーカー、および細菌における増殖のための機能的複製起点（ＯＲＩ）の挿入を容易にするために合成多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含まなくてはならない。

本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するドナーベクターの作製
ドナーベクターは、外来遺伝子が、適当な制限酵素を使用してクローニングされている、バキュロウイルス発現カセットを含有するクローニングベクター、例えば、ｐＵＣ５７プラスミドからなる。本発明のバキュロウイルス発現カセットは、以下のＤＮＡ配列：（ｉ）ｐｏｌｈまたはｐＢ２_９プロモーターなどのプロモーター配列の下流およびＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナルの上流に、バキュロウイルス転写調節因子をコードする配列Ａｃ−ｉｅ−０１および（ｉｉｉ）プロモーター配列、例えば、ｐＢ２_９ｐ１０、ｐ１０、ｐ６．９ｐ１０またはｐｏｌｈの上流に、（ｉｉ）別の遺伝子座中に、エンハンサー配列、例えば、相同領域ｈｒ１とそれに続く、対象の遺伝子のクローニングのための多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびＭＣＳの下流にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（図１）をライゲートすることによって合成した。バキュロウイルス発現カセットは、市販のバキュロウイルス作製系（転位をベースとする、例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））または相同組換えをベースとする、例えば、「ｆｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ（商標）」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））、「ＢａｃＰＡＫ６（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））（図２および３）のトランスファーベクターへのサブクローニングを容易にするよう、特定の制限酵素認識部位（例えば、５’末端のＢｇｌＩＩおよびＢｓｔＺ１７ｌならびに３’末端のＢｇｌ ＩＩおよびＳｇｆ Ｉ）によってフランキングされる。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、Ｎｃｏ ＩおよびＳｐｅ Ｉ制限酵素認識部位を使用してクローニングベクターのＭＣＳ中にクローニングし、ドナープラスミドベクターを作製した（図２）。

本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するトランスファーベクターの作製
トランスファーベクターを、５’フランキング部位のＢｓｔＺ１７ ｌおよびＸｂａ Ｉを用いてドナーベクターを消化し、それを同様に同一酵素で消化したトランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１中にクローニングすることによって作製した。この場合には、サブクローニングの結果として、バキュロウイルス発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、トランスファーベクター由来のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルによって交換される。これとは別に、発現カセットのすべてのエレメントは、元の市販のトランスファーベクターのｐｏｌｈプロモーターおよびＭＣＳと代わって、ｐＦａｓｔＢａｃトランスファーベクター中に含まれる（図２）。

「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系を使用する、本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するバキュロウイルス発現ベクターの作製
改変されたトランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１および個々のバキュロウイルス発現カセットを使用し、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」バキュロウイルス発現系を使用して組換えバキュロウイルスを作製した。より詳しくは、改変されたトランスファーベクターを使用して、バキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）およびヘルパープラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）を形質転換し、発現カセットの転位後に組換えバクミドの作製を可能にした。次いで、本発明のバキュロウイルス発現カセットおよびＧＦＰをコードする遺伝子を含有する組換えバクミドのＤＮＡを使用し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を使用して昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を回収し、第１組換えバキュロウイルス世代を得た（図２）。次いで、この組換えバキュロウイルスは、従来のプロトコールに従ってさらに増幅され、および／または力価測定され得る。市販のＢＥＶＳによって提供されるその他のトランスファーベクターを有する組換えバキュロウイルスを作製するために、同様の手順が使用され得る（図３）。

タンパク質サンプル調製
各時点から感染細胞（１×１０^６）を回収し、遠心分離した。上清を除去し、ＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁し、凍結（−１９６℃）および解凍（３７℃）の３サイクルに付した。細胞片は、遠心分離によって除去した。

タンパク質発現の時間経過研究
Ｓｆ９、Ｓｆ２１またはＨｉ−５（商標）細胞を、５または０．１のＭＯＩを使用して、調節、エンハンサーおよびプロモーターエレメントの種々の組合せの制御下でＧＦＰを発現する種々の組換えバキュロウイルスに感染させた。細胞培養物を、種々の時点（感染後２４、４８、７２、９６および１２０時間）で回収し、蛍光顕微鏡、蛍光定量的アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクーマシーブルー染色またはウエスタンブロットによって、またマイクロ流体分離および定量化（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）自動化電気泳動系；Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）、ＵＳＡ）によってＧＦＰ発現を分析した。

組換えＧＦＰの定量化のために、サンプルをＰｒｏ２６０チップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））にロードし、製造業者の使用説明書に従って、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）系（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））を使用してキャピラリー電気泳動によって分析した。サンプルの電気泳動は、印加電圧および電力を制御することによってマイクロチャネルを通して行った。マイクロ流体チップによって、分離、染色、脱染、検出およびユーザーの介入を全く必要としない基礎データ解析を含めたいくつかの連続手順が可能となった。Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）系によって、１０〜２６０ｋＤａの大きさのタンパク質サンプルを、コロイドクーマシーブルーＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル染色に匹敵する高感度で分離し、定量化した。定量化のために、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ（商標）系は、Ｐｒｏ２６０ラダー、この系において使用するために最適化されているＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）標準物質の改変版を使用する。

蛍光顕微鏡分析
感染細胞を、Ｌｅｉｃａ（商標）ＤＭＩＬ（商標）倒立蛍光顕微鏡でＧＦＰフィルターを使用して６ウェル細胞培養プレート中で直接的に可視化した。

蛍光定量的分析
種々の量の組換えＧＦＰタンパク質を含有する感染細胞に由来する約２０μｇの総可溶性タンパク質を分析し、Ｔｅｃａｎ（商標）ＧＥＮｉｏｓ（商標）（ＣＡ、ＵＳＡ）蛍光プレートリーダー（励起［Ｅｘ］、４８５／発光［Ｅｍ］、５３５）によって定量化した。

ウエスタンブロット解析
組換えバキュロウイルスに感染した細胞からの総可溶性タンパク質画分（１０μｇ）を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルをクーマシーブルー染色法によって染色するか、またはニトロセルロースメンブランにトランスファーした。ウエスタンブロットを、１：１０００の抗ＧＦＰモノクローナル抗体ｍａｂ２５１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）、ＵＳＡ）またはアクチン抗血清（２０−３３；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））を用いて探索し、免疫複合体は、二次抗体として、それぞれ、１：２，０００希釈した抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識コンジュゲート（ＫＰＬ（商標）、ＵＫ）を用いて、または１：２，０００希釈した抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識コンジュゲート（ＫＰＬＴＭ、ＵＫ）によって示された。タンパク質バンドは、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出系を使用して検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）、ＵＳＡ）によって分析した。

ｐＢ２ ＤＮＡ断片におけるプロモーター配列の限界の設定
ＢＪＨＳＰ−２遺伝子（ｐＢ２）の上流のＤＮＡ領域を、これまでに報告されたＢＪＨＳＰ２配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４１６４０）に基づいてＴ．ｎｉ昆虫ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。２つの挿入、８つの欠失ならびに１７の突然変異を含む増幅されたＤＮＡ領域は、注釈がつけられた配列（配列番号３４）とはいくつかの面で異なっていた。種々のバイオインフォマティクス分析を使用して、ホルモン応答エレメントと関連する６つの推定結合部位が、ｐＢ２配列に沿って見られ、そのうち４つが、推定エクジソン応答エレメント（ＥｃＲ）に対応し、それらの３つが推定Ｂｒｏａｄ−Ｃｏｍｐｌｅｘ部位（Ｂｒ−Ｃ）に対応していた（図９ＡおよびＢ）。

転写活性に必須の調節領域および潜在的なホルモン調節エレメントの関連性を決定するために、ｐＢ２末端切断型配列を分析した（断片ｐＢ２_９）（図９Ｂ）。ｐＢ２およびｐＢ２_９断片の両方とも、バキュロウイルスベクターにクローニングし、ＧＦＰリポータータンパク質を使用してそのプロモーター活性について試験した。図９Ｂは、あらゆる断片を用いて得られ、蛍光定量的分析によって定量化されたＧＦＰ発現レベルを示す。驚くべきことに、ｐＢ２_９断片は、２つの推定Ｂｒ−Ｃ結合部位を欠いていても、親の全長ｐＢ２よりも強いプロモーター活性を示した（図９Ｂ）。

ｐＢ２またはｐＢ２_９および従来のバキュロウイルスプロモーター間の相乗性協同作用
ｐＢ２またはｐＢ２_９配列および従来のバキュロウイルスプロモーターｐｏｌｈまたはｐ１０を含む種々のキメラプロモーターを構築し、その結果、組合せｐＢ２ｐｏｌｈ、ｐｏｌｈｐＢ２、ｐＢ２ｐ１０、ｐ１０ｐＢ２およびｐＢ２_９ｐ１０が得られた。それらのすべてを使用して、組換えバキュロウイルスを作製し、そのプロモーター特徴について試験した。感染の２４時間後に、ｐｏｌｈｐＢ２およびｐＢ２_９ｐ１０ハイブリッドプロモーターによって駆動されるＧＦＰタンパク質発現は、従来のプロモーターｐｏｌｈまたはｐ１０を使用するよりも高かった（図１０Ａ）。興味深いことに、キメラプロモーターｐｏｌｈｐＢ２の制御下でのＧＦＰ発現は、感染後４８時間で低下し、キメラプロモーターｐＢ２_９ｐ１０の制御下で発現されたＧＦＰは、時間に沿って、ｐｏｌｈプロモーターを使用することによって得られたものよりもかなり高いレベルに増大した（図１０Ｂ）。キメラプロモーターｐＢ２ｐ１０は、感染後４８時間で最大ＧＦＰ発現レベルを示したが、発現増大は、その後の時間では直線的ではなかった（図１０Ｂ）。結論として、ハイブリッドプロモーターｐＢ２_９ｐ１０は、ｐｏｌｈまたはｐ１０プロモーター単独よりも早期に強力であった。
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Claims (36)

1. 転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸を含む組換えバキュロウイルスであって、前記核酸の核酸配列は、
   （ａ）配列番号１〜５のいずれかに示される核酸配列、
   （ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
   （ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
   （ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
   からなる群から選択される少なくとも一種の核酸配列を含む、組換えバキュロウイルス。
2. 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
3. 組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、請求項２に記載の組換えバキュロウイルス。
4. 相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
   （ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸及び
   （ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する核酸
   からなる核酸の群から選択される、請求項２または３に記載の組換えバキュロウイルス。
5. 配列番号１７〜２６からなる群から選択される組換えプロモーター配列、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸を含む、請求項１から４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。
6. 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項１から５に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項１から５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス。
7. 転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための請求項１に記載の前記核酸を含み、バキュロウイルスにおける組込みまたは転位に適した核酸配列をさらに含む、請求項１から６のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスの生産に適したトランスファーベクター。
8. 組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、請求項７に記載のトランスファーベクター。
9. 組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、請求項８に記載のトランスファーベクター。
10. 相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
    （ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸及び
    （ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する核酸
    からなる核酸の群から選択される、請求項８または９に記載のトランスファーベクター。
11. 配列番号１７〜２６からなる群から選択される組換えプロモーター配列、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項７から１０のいずれかに記載のトランスファーベクター。
12. 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、該核酸配列が、請求項１及び７から１１に記載の前記核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項７から１１のいずれかに記載のトランスファーベクター。
13. 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項７から１１のいずれかに記載のトランスファーベクター。
14. バクミドであることを特徴とする、請求項７から１３のいずれかに記載のトランスファーベクター。
15. バキュロウイルス発現系「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、「ＢａｃＰＡＫ（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））、「ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「ＢａｃｕＶａｎｃｅ（商標）」（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、「ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、「ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）」１０００、２０００、３０００（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））、「ＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（商標）」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））または「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）」（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））のいずれかに由来することを特徴とする、請求項７から１４のいずれかに記載のトランスファーベクター。
16. 転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための請求項１に記載の前記核酸を含み、細菌複製にさらに適している、請求項１から１５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するのに適したクローニングベクターであって、
    組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含み、かつ
    組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、クローニングベクター。
17. 相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
    （ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸及び （ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する核酸
    からなる核酸の群から選択される、請求項１６に記載のクローニングベクター。
18. 配列番号１７〜２６からなる群から選択される組換えプロモーター配列、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項１６又は１７に記載のクローニングベクター。
19. 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項１及び１６から２０に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項１６から１８のいずれかに記載のクローニングベクター。
20. 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項１６から１９のいずれかに記載のクローニングベクター。
21. 転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための請求項１に記載の前記核酸を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するのに適した核酸配列を有する核酸分子であって、
    組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含み、かつ
    組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、核酸分子。
22. 相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
    （ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸及び （ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含有する核酸
    からなる核酸の群から選択される、請求項２１に記載の核酸分子。
23. 配列番号１７〜２６からなる群から選択される組換えプロモーター配列、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項２１又は２２に記載の核酸分子。
24. 組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項１及び請求項２１から２３に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項２１から２３のいずれかに記載の核酸分子。
25. 組換えタンパク質をコードする核酸配列を欠く、請求項２１から２４のいずれかに記載の核酸分子。
26. 請求項１から６のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスで感染させ、請求項７から１５のいずれかに記載のトランスファーベクターでトランスフェクトし、請求項１６から２０のいずれかに記載のクローニングベクターで形質導入し、または請求項２１から２５のいずれかに記載の核酸分子で形質転換した宿主細胞。
27. 昆虫細胞系統であることを特徴とする、請求項２６に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
28. 鱗翅目または双翅目の属に属する昆虫に由来することを特徴とする、請求項２６または２７に記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
29. イラクサギンウワバ、ヨトウガ、アスカラファ・オドラタ、カイコ、キイロショウジョウバエまたはネッタイシマカに由来することを特徴とする、請求項２６から２８のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
30. Ｈｉ−５（商標）、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−Ｔｎ５Ｂ−１、Ｔｎ３６８、ＥｘｐｒｅｓＳｆ＋（商標）、ＢＴＩ−ＴｎＡｏ３８、ＡＴＣ−１０およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒのショウジョウバエ系統２からなる群から選択される細胞系統であることを特徴とする、請求項２６から２９のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞。
31. 請求項１から２５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸分子を含む培養培地。
32. 請求項２６から３０のいずれかに記載の、感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換した宿主細胞から、従来手段により組換えタンパク質を抽出することと、
    抽出された前記組換えタンパク質を従来手段により精製することと
    を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
33. 組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンおよび診断用タンパク質からなる群から選択される、請求項３２に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。
34. 請求項１から６のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを生産するための、請求項７から１５のいずれかに記載のトランスファーベクターの使用。
35. 請求項１から１５のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスまたはトランスファーベクターを生産するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のクローニングベクターの使用。
36. 請求項１から２０のいずれかに記載の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターまたはクローニングベクターを生産するための、請求項２１から２５のいずれかに記載の核酸分子の使用。

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