JP6117474B2 - Food / beverage product containing lactic acid bacteria having high survival rate and method for producing the food / beverage product - Google Patents
Food / beverage product containing lactic acid bacteria having high survival rate and method for producing the food / beverage product Download PDFInfo
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Description
本発明は、乳酸菌、乳酸菌の製造方法、該乳酸菌を含む飲食品等に関する。さらに詳しくは、生存率が高い乳酸菌を含む飲食品、または該飲食品の製造方法等に関する。 The present invention relates to a lactic acid bacterium, a method for producing the lactic acid bacterium, a food and drink containing the lactic acid bacterium, and the like. More specifically, the present invention relates to a food / beverage product containing lactic acid bacteria having a high survival rate, a method for producing the food / beverage product, and the like.
健康への意識の高まりから、プロバイオティクス乳酸菌入りの飲食品が各種製造・販売されている。プロバイオティクスとは、宿主の腸内菌叢のバランスを改善することにより宿主にとって有益な作用をもたらす生きた微生物のことであり、整腸作用、免疫賦活作用、メタボリックシンドロームの改善作用等の幅広い効果が期待されるようなってきた。 Various foods and beverages containing probiotic lactic acid bacteria have been manufactured and sold due to the heightened health awareness. Probiotics are living microorganisms that have beneficial effects on the host by improving the balance of the intestinal flora of the host, and have a wide range of effects such as intestinal regulation, immunostimulation, and metabolic syndrome. The effect has come to be expected.
プロバイオティクスとされる乳酸菌（以下、単に乳酸菌と示す場合がある）には、様々な菌が知られており、乳酸桿菌に限定して列挙した場合でも、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、等の複数の菌が挙げられる。これらの菌の機能については、多くの知見が得られている。 Various bacteria are known for lactic acid bacteria (hereinafter sometimes simply referred to as lactic acid bacteria) as probiotics, and even when enumerated only by lactobacilli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei (Lactobacillus casei), Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus lactobacillus, Lactobacillus lacteplan (Lactobacillus brevis), easy Bacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus), Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri), include several bacteria like. Many knowledge has been acquired about the function of these bacteria.
このようなプロバイオティクス乳酸菌の一つである、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）やラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、ヒト腸内の常在細菌として知られており、小腸からの検出例が報告されている。 Lactobacillus gasseri and Lactobacillus johnsonii, which are one of such probiotic lactic acid bacteria, are known as resident bacteria in the human intestine and are detected from the small intestine. Examples have been reported.
中でもラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５株は、生きて腸内に届き、腸管内で長く留まることから、多面的・長期的な効果が期待できると考えられる。 Among them, Lactobacillus gasseri SBT2055 strain is alive and reaches the intestine and stays in the intestine for a long time, so it is considered that multifaceted and long-term effects can be expected.
このようなプロバイオティクス乳酸菌を含む飲食品において、製品中の菌数を維持することが重要であり、流通段階や家庭での保存期間において飲食品中の菌数が減少することは、その飲食品が示し得る健康効果の低下に繋がり問題となる。 In such foods and drinks containing probiotic lactic acid bacteria, it is important to maintain the number of bacteria in the product, and the decrease in the number of bacteria in foods and drinks during the distribution stage and the storage period at home This leads to a decrease in the health effects that the product can exhibit, which is a problem.
飲食品にプロバイオティクス乳酸菌を添加する場合は、製品中の菌数を高めるため、凍結濃縮菌体や濃縮乾燥菌体を製品に直接添加する方法や、前培養工程を設けて菌体を増やした後にその培養物を添加する方法、また製品中で菌体を増殖させる方法等が考えられる。
前培養工程を設ける場合には、乳酸菌を増殖させるために、窒素源やビタミン・ミネラル、糖類等の炭素源を含んだ培地で培養することが必要とされる。例えば、脱脂乳に酵母エキスを添加したものや、食品添加物で構成されたものを培地とし、必要に応じて好適なｐＨを維持しながら、嫌気条件で培養する。この培養によって増殖した乳酸菌が、必要に応じて洗浄や濃縮工程を経た後、飲食品に添加される。
添加された乳酸菌は、飲食品中に炭素源や窒素源が好適に含まれ、温度条件が合致した場合に、さらに増殖する。しかし、この増殖に伴い、乳酸菌自身が乳酸や酢酸を生成し、飲食品のｐＨを下げたり、溶存酸素や酸素由来のスーパーオキシドイオン、過酸化水素またはヒドロキシラジカルを生成したりする。これによって、乳酸菌がストレスを受け、耐性の弱い菌株については保存中に減少してしまうことが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
When adding probiotic lactic acid bacteria to foods and drinks, in order to increase the number of bacteria in the product, increase the number of bacteria by providing a method of adding freeze-concentrated cells or concentrated dry cells directly to the product, or a pre-culture step After that, a method of adding the culture, a method of growing microbial cells in the product, and the like are conceivable.
In the case of providing a pre-culture step, it is necessary to culture in a medium containing a nitrogen source, a vitamin / mineral, a carbon source such as saccharides, etc. in order to grow lactic acid bacteria. For example, a non-fat milk added with a yeast extract or a food additive is used as a medium, and cultured under anaerobic conditions while maintaining a suitable pH as necessary. Lactic acid bacteria grown by this culture are added to food and drink after passing through washing and concentration steps as necessary.
The added lactic acid bacteria further proliferate when the food or drink contains a carbon source or a nitrogen source and the temperature conditions are met. However, along with this growth, the lactic acid bacteria themselves produce lactic acid and acetic acid, lowering the pH of the food and drink, and producing dissolved oxygen, oxygen-derived superoxide ions, hydrogen peroxide, or hydroxy radicals. As a result, it is known that lactic acid bacteria are stressed and strains that are weakly resistant are reduced during storage (Non-patent Documents 1 and 2).
以上のように、プロバイオティクス乳酸菌は、製品の製造・保存中の環境ストレスにより減少することが知られているが、糖を含んだ飲食品中でも代謝による酸生成や浸透圧等の強いストレスを受けることが知られている。そのため、このようなストレス条件下において、プロバオイティクス乳酸菌の生存率を向上させる方法が望まれている。
そこで、プロバイオティクス乳酸菌を含む食品において、生存率を高めるための様々な技術が、これまでに数多く報告されている。例えば、発酵乳製品中のプロバイオティクス乳酸菌の生存率を高める方法として、パーオキシダーゼを添加して保存中の酸度上昇を抑制する方法（特許文献１）、カテキン類及び／またはトコフェロール類を添加する方法（特許文献２）、ビフィズス菌と共生関係を持つ乳酸菌を添加する方法（特許文献３）、着色フィルムにより遮光性を高める方法（特許文献４）等がある。また、摂取後の生体内での生存率を高める方法については、乳酸菌を腸溶性カプセルに封入することで胃酸の影響を抑えて腸内に到達させる方法（特許文献５）が報告されている。また、乳酸菌が資化できる炭素源が存在しない環境下におかれた乳酸菌は、凍結や凍結乾燥工程において生存率が高まることが知られている（非特許文献３）。
As mentioned above, probiotic lactic acid bacteria are known to decrease due to environmental stress during production and storage of products, but even in sugar-containing foods and drinks, strong stresses such as acid production and osmotic pressure due to metabolism It is known to receive. Therefore, a method for improving the survival rate of probaotic lactic acid bacteria under such stress conditions is desired.
Thus, various techniques for increasing the survival rate of foods containing probiotic lactic acid bacteria have been reported so far. For example, as a method of increasing the survival rate of probiotic lactic acid bacteria in fermented dairy products, a method of adding peroxidase to suppress an increase in acidity during storage (Patent Document 1), adding catechins and / or tocopherols There are a method (patent document 2), a method of adding lactic acid bacteria having a symbiotic relationship with bifidobacteria (patent document 3), and a method of enhancing light-shielding properties with a colored film (patent document 4). Moreover, about the method of raising the survival rate in the living body after ingestion, the method (patent document 5) which suppresses the influence of a gastric acid and encloses lactic acid bacteria in an enteric capsule is reported. In addition, it is known that lactic acid bacteria placed in an environment where there is no carbon source that can assimilate lactic acid bacteria has an increased survival rate in the freezing and lyophilization processes (Non-patent Document 3).
特許文献１〜３は、乳酸菌の生存率を向上させるために添加物を必要とするため、添加方法の煩雑さの点で課題があり、また、添加物による風味への影響も問題となる場合がある。
非特許文献１，２には、乳酸菌の生存率に影響する要因が開示されているが、乳酸菌自身がストレス源を生成してしまうため、飲食品に含まれる乳酸菌の死滅を完全に防ぐことは難しく、死滅を抑制する方法は開示されていない。
また、非特許文献３には、乳酸菌が資化できる炭素源が存在しない環境下におかれた乳酸菌は、凍結や凍結乾燥工程において生存率が高まることが開示されているが、糖を含む飲食品中において乳酸菌の生存率が向上することについての示唆や記載はない。
よって、本発明者らは、糖等によるストレス条件下で生存率が高い乳酸菌を含み、生きた乳酸菌を多く摂取できる飲食品を提供することを目的とする。
Since Patent Documents 1 to 3 require an additive to improve the survival rate of lactic acid bacteria, there is a problem in terms of the complexity of the addition method, and the effect of the additive on the flavor also becomes a problem There is.
Non-Patent Documents 1 and 2 disclose factors that affect the survival rate of lactic acid bacteria, but since lactic acid bacteria themselves generate stress sources, it is possible to completely prevent the death of lactic acid bacteria contained in food and drink. It is difficult and no method for suppressing death is disclosed.
Non-Patent Document 3 discloses that lactic acid bacteria placed in an environment where there is no carbon source that can be utilized by lactic acid bacteria have an increased survival rate in freezing and freeze-drying processes. There is no suggestion or description about improving the survival rate of lactic acid bacteria in the product.
Therefore, the present inventors have an object to provide a food and drink that contains lactic acid bacteria having a high survival rate under stress conditions such as sugar and that can consume a large amount of living lactic acid bacteria.
すなわち、本発明は、次の（１）〜（１３）に示される乳酸菌、乳酸菌の製造方法、該乳酸菌を含む飲食品、飲食品の製造方法および乳酸菌の生存率を向上する方法等に関する。
（１）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
（２）次の１）〜１５）から選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の発現が抑制されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
（３）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
（４）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
（５）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が、次の１）〜１５）から選ばれるいずれか１種以上の遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする上記（４）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
（６）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする上記（４）または（５）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を含有させることを特徴とする飲食品。
（８）前記飲食品が乳製品であることを特徴とする上記（７）に記載の飲食品。
（９）前記乳製品が発酵乳または乳酸菌飲料であることを特徴とする上記（８）に記載の飲食品。
（１０）次の１）および２）の工程を含むことを特徴とする飲食品の製造方法。
１）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存し、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を製造する工程。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
２）上記１）の工程によって保存した乳酸菌を、飲食品または飲食品の原料に添加する工程。
（１１）前記飲食品が乳製品である上記（１０）に記載の飲食品の製造方法。
（１２）前記乳製品が発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、または乳酸菌飲料である上記（１１）に記載の飲食品の製造方法。
（１３）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したことを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を向上させる方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
That is, the present invention relates to a lactic acid bacterium, a method for producing lactic acid bacterium, a food and drink containing the lactic acid bacterium, a method for producing food and drink, a method for improving the survival rate of lactic acid bacteria, and the like shown in the following (1) to (13).
(1) When Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored under the following conditions, the number of bacteria after storage (CFU / ml) is the number of bacteria before storage (CFU). Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, characterized in that it is within 10 times the / ml).
Conditions: Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours.
(2) Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii in which the expression of any one or more genes selected from the following 1) to 15) is suppressed.
1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
(3) Lactobacillus gasseri (Sactobacillus gasseri) is SBT2055 (FERM BP-10953), SBT2056 (FERM BP-11038), SBT10241 (FERM P-17786), SBT10239 (FERM P-16939), JCM113163T Lactobacillus johnsonii according to (1) or (2) above, wherein Lactobacillus johnsonii is one of SBT1839 (FERM P-15534), SBT2050 (FERM P-14824), JCM2010T Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnson nsonii).
(4) When Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored under the following conditions, the number of bacteria after storage (CFU / ml) is the number of bacteria before storage (CFU). Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, characterized in that it is within 10 times of / ml).
Conditions: Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours.
(5) Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii is suppressed in the expression of any one or more genes selected from the following 1) to 15): (5) Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii The method for producing Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii as described in (4) above,
1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
(6) Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri) is SBT2055 (FERM BP-10953), SBT2056 (FERM BP-11038), SBT10241 (FERM P-17786), SBT10239 (FERM P-16939), JCM113613 Lactobacillus johnsonii according to (4) or (5) above, wherein Lactobacillus johnsonii is one of SBT1839 (FERM P-15534), SBT2050 (FERM P-14824), and JCM2010T. Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnson nsonii).
(7) A food or drink comprising the Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii according to any one of (1) to (3) above.
(8) The food / beverage product according to (7) above, wherein the food / beverage product is a dairy product.
(9) The food or drink according to (8) above, wherein the dairy product is fermented milk or a lactic acid bacteria beverage.
(10) A method for producing a food or drink comprising the following steps 1) and 2).
1) Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored under the following conditions, and the number of bacteria after storage (CFU / ml) is the number of bacteria before storage (CFU / ml) A process for producing Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, which is characterized in that it is within 10 times.
Conditions: Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours.
2) The process of adding the lactic acid bacteria preserve | saved by the process of said 1) to the food / beverage products or the raw material of food / beverage products.
(11) The method for producing a food or drink according to (10), wherein the food or drink is a dairy product.
(12) The method for producing a food or drink according to (11), wherein the dairy product is fermented milk, a dairy lactic acid bacteria beverage, or a lactic acid bacteria beverage.
(13) Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri) and / or Lactobacillus johnsonii (Lactobacillus gasseri) and / or Lactobacillus gasseri characterized by having been stored under the following conditions (Lactobacillus johnsonii) The method of improving the survival rate.
Conditions: Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours.
本発明により、乳酸菌がストレスを受けうる飲食品においても、生菌数を維持できる乳酸菌を得ることが可能となった。 According to the present invention, it is possible to obtain a lactic acid bacterium capable of maintaining the number of viable bacteria even in foods and drinks in which the lactic acid bacterium can be stressed.
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（以下、「ラクトバチルス・ガセリ」という場合がある。）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（以下、「ラクトバチルス・ジョンソニー」という場合がある。）の保存条件とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存することをいう（以下、本保存条件を「増殖しない条件」という場合がある）。
この保存条件における保存培地とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が資化できる炭素源を含まない培地や生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、水等をあげることができる。また、例えば、市販のＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ製）の組成において、グルコース等のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が資化できる炭素源を除いたものや、ＰＢＳ（−）等のバッファーにパン酵母エキスもしくはビール酵母エキス等の酵母エキス、当該乳酸菌が資化しない糖類等の炭素源、ペプトン、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等を一種または二種以上、それぞれ０．１％〜２０％等、適宜添加したものも、本発明の保存培地として用いることができる。
ここで、添加する酵母エキスは、メーカーや規格を特に指定するものではなく、食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。ペプトンに関しても、原料や処理方法を限定するものではなく、食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。当該乳酸菌が増殖しない糖類等の炭素源、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等についても同様に食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。
In the present invention, Lactobacillus gasseri (hereinafter sometimes referred to as "Lactobacillus gasseri") and / or Lactobacillus johnsonii (hereinafter referred to as "Lactobacillus johnsonii") The storage conditions of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii are stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours (hereinafter referred to as “Lactobacillus gasseri” and / or Lactobacillus johnsonii). This storage condition may be referred to as “a condition that does not proliferate”).
The storage medium under these storage conditions includes a medium that does not contain a carbon source that can be assimilated by Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, physiological saline, acetate buffer, citric acid. Examples thereof include a buffer solution, a borate buffer solution, a tartrate buffer solution, a tris buffer solution, and water. Further, for example, in the composition of a commercially available MRS medium (manufactured by Difco) excluding carbon sources that can be assimilated by Lactobacillus gasseri such as glucose and / or Lactobacillus johnsonii , A yeast extract such as baker's yeast extract or brewer's yeast extract in a buffer such as PBS (−), a carbon source such as saccharides that are not assimilated by the lactic acid bacteria, peptone, mineral, vitamin, amino acid, etc. Those appropriately added such as 1% to 20% can also be used as the preservation medium of the present invention.
Here, the yeast extract to be added is not particularly limited by the manufacturer or standard, and any yeast extract may be used as long as it can be used for food. Regarding peptone, the raw material and the treatment method are not limited, and any material can be used as long as it can be used for food. Similarly, any carbon source such as saccharide that does not grow the lactic acid bacteria, minerals, vitamins, amino acids and the like can be used as long as they can be used for food.
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、上記のような保存培地で２０〜４５℃で１〜１６時間保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以である菌株を選択することにより得ることができる。本発明の保存条件（増殖しない条件）における保存温度および保存時間は、２０〜４５℃で１〜１６時間であればよい。２０℃〜４５℃で１時間以上保存することが好ましく、同温度で１時間〜１６時間保存することがより好ましく、同温度で４時間〜１６時間保存することがさらに好ましい。また、３０℃〜４２℃で１時間以上保存することが好ましく、同温度で１時間〜１６時間保存することがより好ましく、同温度で４時間〜１６時間保存することがさらに好ましい。３７℃で１６時間保存することが、さらにより好ましい。
この保存は、例えば、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等の乳酸菌を０．１％〜１０％、保存培地に接種することで行うことができる。なお、本発明の保存条件（増殖しない条件）において、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍を超えてしまうと、保存後の菌体の生存率が向上しないため、該範囲が１０倍以内であることが本発明において重要である。
When the Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii of the present invention is stored in a storage medium as described above at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours, It can be obtained by selecting a strain whose number (CFU / ml) is 10 times or more of the number of bacteria before storage (CFU / ml). The storage temperature and storage time in the storage conditions (non-growth conditions) of the present invention may be 1 to 16 hours at 20 to 45 ° C. It is preferable to store at 20 ° C. to 45 ° C. for 1 hour or longer, more preferably to store at the same temperature for 1 hour to 16 hours, and further preferably to store at the same temperature for 4 hours to 16 hours. Further, it is preferably stored at 30 ° C. to 42 ° C. for 1 hour or longer, more preferably stored at the same temperature for 1 hour to 16 hours, and further preferably stored at the same temperature for 4 hours to 16 hours. It is even more preferred to store at 37 ° C. for 16 hours.
This preservation can be performed, for example, by inoculating a preservation medium with 0.1 to 10% of lactic acid bacteria such as Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii. In addition, when the number of bacteria after storage (CFU / ml) exceeds 10 times the number of bacteria before storage (CFU / ml) under the storage conditions (non-growth conditions) of the present invention, Since the survival rate does not improve, it is important in the present invention that the range is within 10 times.
上述した保存条件で保存することにより、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を高めることができる。ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）菌体自体の生存率が向上するし、通常の組成物や飲食品中における生存率も向上する。
例えば、保存条件（増殖しない条件）で保存した後の乳酸菌を、糖を含む組成物、その一例として糖濃度が０．０１〜６０％の飲食品中に保存した場合でも、乳酸菌の生存率を大きく低下させる要因として知られる糖を含む条件下であるにもかかわらず、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を高めることができる。
糖を含む組成物や飲食品としては、例えば、グルコースを０．０１％〜６０％のいずれかに該当する濃度で含有する組成物、上白糖等の糖質を含む乳原料に乳酸菌スターターを加えて発酵させた発酵乳、および、これにフルーツプレザーブ等を混合したフルーツ入り発酵乳の組成物等を例示することができる。
本発明で述べる「生存率」とは、乳酸菌にとって高ストレスの環境下で保存した場合において、保存開始時の菌数に対し、死滅せずに生き残っている菌数の割合のことをいう。
本発明において、上述した保存条件（増殖しない条件）で保存されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、例えば、糖濃度が０．０１〜６０％の飲食品に添加され、添加後１０℃で１０日間保存された場合に、増殖しない条件で保存されない菌と比較して、保存前の菌数に対して１０倍以上、好ましくは３０倍以上生存率の向上が認められるものであることが好ましい。
By storing under the above-mentioned storage conditions, the survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii can be increased. The survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii itself is improved, and the survival rate in normal compositions and foods and drinks is also improved.
For example, even when lactic acid bacteria after storage under storage conditions (non-growth conditions) are stored in a composition containing sugar, for example, in a food or drink with a sugar concentration of 0.01 to 60%, the survival rate of lactic acid bacteria is increased. The survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii can be increased, even under conditions that include sugars, which are known to cause significant reduction.
As a composition or food or drink containing sugar, for example, a composition containing glucose at a concentration corresponding to any of 0.01% to 60%, a lactic acid bacteria starter is added to a milk raw material containing a sugar such as sucrose Examples thereof include fermented milk fermented by fermentation and a composition of fermented milk containing fruits obtained by mixing a fruit preserve and the like.
The “survival rate” described in the present invention refers to the ratio of the number of bacteria that survive without being killed to the number of bacteria at the start of the storage when the lactic acid bacteria are stored in a highly stressed environment.
In the present invention, Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii stored under the above-described storage conditions (non-growth conditions) have, for example, a sugar concentration of 0.01 to 60%. When added to foods and beverages and stored at 10 ° C. for 10 days after addition, it survives 10 times or more, preferably 30 times or more of the number of bacteria before storage, compared to bacteria that are not stored under non-proliferating conditions It is preferable that the improvement of rate is recognized.
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、上述した保存条件（増殖しない条件）で保存することにより、次の１）〜１５）から選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の発現が抑制されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）となる。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
ここで、遺伝子の発現が抑制されたとは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を通常用いる培地で保存した場合の遺伝子の発現量に比べて、その遺伝子の転写レベルが１０分の１から１０，０００分の１程度に低下していることをいう。
例えば、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を本発明の保存条件（増殖しない条件）で保存した場合の上記遺伝子の発現が、ＭＲＳ培地で３７℃、１６時間保存した場合と比べて、その転写レベルにおいて１０分の１から１０，０００分の１程度に低下している時に、本発明において遺伝子の発現が抑制されたという。
The Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii of the present invention is selected from the following 1) to 15) by being stored under the above-described storage conditions (non-growth conditions). Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri) and / or Lactobacillus johnsonii are suppressed in the expression of any one or more genes.
1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
Here, the expression of the gene was suppressed as compared with the expression level of the gene when stored in a medium in which Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii is usually used. It means that the transcription level of a gene is reduced from about 1/10 to about 1 / 10,000.
For example, when the Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii is stored under the storage conditions of the present invention (non-growth conditions), the expression of the gene is 37 ° C. in an MRS medium. It is said that the expression of the gene was suppressed in the present invention when the transcription level was reduced from 1/10 to 1 / 10,000 in comparison with the case of storage for 16 hours.
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）は、いずれの菌株を用いてもよく、例えば、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８６）ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３９）もしくはＪＣＭ１１３１Ｔから選ばれるいずれか一種以上の菌株等をあげることができるが、特に限定されるものではない。
また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）もいずれの菌株を用いても良く、例えば、ＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４）もしくはＪＣＭ２０１０Ｔから選ばれるいずれか一種以上の菌株等をあげることができるが特に限定されるものではない。
Any strain may be used for Lactobacillus gasseri in the present invention, for example, SBT2055 (FERM BP-10953), SBT2056 (FERM BP-11038), SBT10241 (FERM P-17786) SBT10239 (FERM) Any one or more strains selected from P-16639) or JCM1131T can be mentioned, but it is not particularly limited.
Also, any strain may be used for Lactobacillus johnsonii, for example, one or more strains selected from SBT1839 (FERM P-15534), SBT2050 (FERM P-14824), or JCM2010T, and the like. However, it is not particularly limited.
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を上述した保存条件（増殖しない条件）で保存することにより、生存率の向上したラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を製造することができる。
この製造方法は、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が増殖しない条件で保存する工程以外に、本発明の乳酸菌の製造にあたり必要とされるその他の工程を含んでいても良い。
また、このようなラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法には、一般的な乳酸菌の培養や製造に利用できる機器であれば、従来知られるいずれの機器を用いても良い。
Lactobacillus gasseri (Lactobacillus gasseri) and / or Lactobacillus johnsonii (Lactobacillus johnsonii) are stored under the above-described storage conditions (non-growth conditions), thereby improving the survival rate of Lactobacillus gasseri and Lactobacillus gasseri. Lactobacillus johnsonii can be produced.
This production method includes other steps required for producing the lactic acid bacteria of the present invention, in addition to the step of storing under conditions where Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii do not grow. May be included.
In addition, such a method for producing Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii is conventionally known as long as it can be used for culturing and producing general lactic acid bacteria. Any device may be used.
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、飲食品等に含有させることもできる。飲食品としては、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、チーズ、バター、クリーム等の乳製品、乳清飲料、乳入り飲料、清涼飲料等の飲料等をあげることができるが特に限定されるものではない。例えば、市販の乳酸菌スターターを添加して発酵させることによって得られた発酵乳、乳酸菌飲料等の乳製品に本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を添加することができる。
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を発酵乳や乳酸菌飲料に含有させた場合、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の飲食品中での生存率が高く、これによって、生きた乳酸菌を多く摂取することが可能な発酵乳等の飲食品を製造することが可能となる。
The Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii of the present invention can also be contained in food and drink. Examples of foods and drinks include fermented milk, dairy lactic acid bacteria beverages, lactic acid bacteria beverages, dairy products such as cheese, butter, and cream, whey beverages, beverages containing milk, soft drinks, and the like, but are particularly limited. It is not a thing. For example, lactobacillus gasseri and / or lactobacillus johnsonii of the present invention may be applied to dairy products such as fermented milk and lactic acid bacteria beverages obtained by adding and fermenting commercially available lactic acid bacteria starters. Can be added.
When the Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii of the present invention is contained in fermented milk or lactic acid bacteria beverages, Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus gasseri The survival rate in the food and drink of Sony (Lactobacillus johnsonii) is high, and this makes it possible to produce food and drink such as fermented milk that can ingest many living lactic acid bacteria.
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を向上させる方法とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存することを特徴とする。
本方法により、飲食品中のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生菌数を高く維持することができるため、長期保存後も高い健康効果が期待できる。
The method for improving the survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii in the present invention refers to Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii. Lactobacillus johnsonii) is stored in a storage medium at 20 to 45 ° C. for 1 to 16 hours.
By this method, since the number of living bacteria of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii in food and drink can be maintained high, a high health effect is expected even after long-term storage. it can.
以下に、本発明の実施例等をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の飲食品中での生存率向上効果を確認するために、モデルとして異性化糖溶液を用いたが、これに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples of the present invention, but the present invention is not limited thereto. In order to confirm the effect of improving the survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii in food and drink, an isomerized sugar solution was used as a model. It is not limited to.
１．試料の調製
１）保存培地の調製
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の保存培地として、グルコースを含まないＭＲＳ培地（以下、「ＭＲＳ（糖無し）培地」とする場合がある）を調製した。表１に示した各成分を１Ｌの水に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷して用いた。
また、対照として、乳酸菌が増殖する保存培地として、グルコースを含む通常のＭＲＳ培地（以下、「ＭＲＳ（グルコース）培地」とする場合がある）を調製した。表１に示した各成分を１Ｌの水に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷して用いた。
1. Sample Preparation 1) Preparation of Storage Medium As a storage medium for Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, an MRS medium (hereinafter referred to as “MRS (no sugar) medium) without glucose is used as a storage medium for Lactobacillus johnsonii. In some cases). Each component shown in Table 1 was dissolved in 1 L of water, sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and then allowed to cool before use.
In addition, as a control, a normal MRS medium containing glucose (hereinafter sometimes referred to as “MRS (glucose) medium”) was prepared as a preservation medium for growing lactic acid bacteria. Each component shown in Table 1 was dissolved in 1 L of water, sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and then allowed to cool before use.
２）使用した乳酸菌株
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）に属する以下の菌株を使用した。
（１）ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）
（２）ＪＣＭ １１３１Ｔ
（３）ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３８）
（４）ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８６）
また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に属する以下の菌株も使用した。
（１）ＪＣＭ２０１０Ｔ
2) The following strains belonging to the lactic acid strain Lactobacillus gasseri used were used.
(1) SBT2055 (FERM BP-10953)
(2) JCM 1131T
(3) SBT2056 (FERM BP-11038)
(4) SBT10241 (FERM P-17786)
The following strains belonging to Lactobacillus johnsonii were also used.
(1) JCM2010T
上記の乳酸菌株をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ製）に接種し、３７℃で１６時間、２回継代培養を行なった後、試験に用いた。培養液を遠心分離して菌体を回収した後、ＰＢＳ（−）溶液（ニッスイ製）で２回洗浄し、初発の培養液と等量のＰＢＳ（−）溶液に再懸濁した。これを菌体懸濁液１として試験に用いた。この菌体懸濁液１をＰＢＳ（−）で段階希釈し、１．５％寒天入りＭＲＳプレートに適量塗抹して、３７℃でアネロパック嫌気（三菱化学製）を用いて３日間、嫌気培養した。生育したコロニーを計測し、懸濁液中の菌数を算出した（以下、菌数の測定は同様に行った）。 The above lactic acid strain was inoculated into MRS medium (manufactured by Difco), subcultured twice at 37 ° C. for 16 hours, and used for the test. After centrifuging the culture solution to collect the cells, the cells were washed twice with a PBS (−) solution (manufactured by Nissui) and resuspended in an equal amount of PBS (−) solution to the initial culture solution. This was used as a bacterial cell suspension 1 for the test. This bacterial cell suspension 1 was serially diluted with PBS (−), smeared onto an MRS plate containing 1.5% agar, and anaerobically cultured at 37 ° C. using Aneropack anaerobic (manufactured by Mitsubishi Chemical) for 3 days. . The grown colonies were counted, and the number of bacteria in the suspension was calculated (hereinafter, the number of bacteria was measured in the same manner).
３）糖組成物の調製
異性化糖溶液（王子コンスターチ製）３５０ｇに、イオン交換水６５０ｍｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌した。その後、溶液中の糖濃度をＢｒｉｘ計（デジタル糖度計、アタゴ製）で測定したところ、糖濃度は２６．５％であった。
3) Preparation of sugar composition To 350 g of an isomerized sugar solution (manufactured by Oji Constarch), 650 ml of ion-exchanged water was added and sterilized at 121 ° C for 15 minutes. Then, when the sugar concentration in the solution was measured with a Brix meter (digital sugar meter, manufactured by Atago), the sugar concentration was 26.5%.
２．増殖しない条件での保存（以下、「保存（１）」という場合がある。）
乳酸菌を以下の工程により、保存した。
１）上記１．２）で調製した菌体懸濁液１を、上記１．１）で調製したＭＲＳ（糖無し）培地に１％（ｖ／ｖ）接種した。この時の保存前の培地中の乳酸菌数（菌体懸濁液１の１／１００）を初発菌数１（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
２）上記１）の乳酸菌を接種した培地を３７℃のインキュベーター内で１６時間保存した。その後、菌数を測定し、到達菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
上記と同様に、上記１．１）で調製したＭＲＳ（グルコース）培地を用いて（増殖する条件）乳酸菌を保存した。
2. Storage under non-proliferating conditions (hereinafter sometimes referred to as “storage (1)”)
Lactic acid bacteria were preserved by the following steps.
1) 1% (v / v) of the cell suspension 1 prepared in 1.2) above was inoculated into the MRS (sugar-free) medium prepared in 1.1) above. The number of lactic acid bacteria in the medium before storage at this time (1/100 of cell suspension 1) was defined as the initial bacterial count 1 (CFU / ml).
2) The medium inoculated with the lactic acid bacteria of 1) above was stored in an incubator at 37 ° C. for 16 hours. Thereafter, the number of bacteria was measured, and the number was reached (CFU / ml).
Similarly to the above, lactic acid bacteria were preserved using the MRS (glucose) medium prepared in 1.1) above (conditions for growth).
３．増殖しない条件での保存（保存（１））後の乳酸菌の菌数の確認
上記２．にて測定した、初発菌数１に対する到達菌数の割合を、到達菌数／初発菌数１として算出し、増殖しない条件、または増殖する条件での保存後の乳酸菌の割合を培養倍率としてそれぞれ調べた。
その結果、図１に示したように、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）のいずれの菌株も、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合、菌数が３０倍以上に増加した。一方、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合は、いずれの菌株においても菌数の増加は１０倍以内であった。また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＪＣＭ２０１０Ｔ株についても同様の結果が得られた。
3. Confirmation of the number of lactic acid bacteria after storage (preservation (1)) under non-proliferating conditions 2. The ratio of the number of reached bacteria to the number of first bacteria measured in 1 was calculated as the number of reached bacteria / number of first bacteria 1, and the ratio of lactic acid bacteria after storage under non-growth conditions or growth conditions was used as the culture magnification. Examined.
As a result, as shown in FIG. 1, when all strains of Lactobacillus gasseri were stored in MRS (glucose) medium (growth conditions), the number of bacteria increased 30 times or more. On the other hand, when stored in MRS (no sugar) medium (conditions for non-growth), the increase in the number of bacteria was 10 times or less in any strain. Similar results were obtained for Lactobacillus johnsonii JCM2010T strain.
４．糖溶液での保存（以下、「保存（２）」という場合がある。）
上記２．にて保存した各乳酸菌を、以下の工程により、糖濃度２６．５％溶液に保存した。
１）上記２．２）において、到達菌数を測定した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を廃棄した。その後、等量のＰＢＳ（−）溶液を添加し、十分に攪拌した後、再度遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行ない、上清を廃棄した。この操作を再度繰り返した後、等量のＰＢＳ（−）溶液に菌体を懸濁し、菌体懸濁液２として菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
２）上記１．３）において調製した糖水溶液９０ｍｌに、上記１）の菌体懸濁液２を１０ｍｌ添加し、十分に攪拌して保存液とした。この時の保存液中の乳酸菌数（菌体懸濁液２の１／１０）を初発菌数２（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
３）上記２）の保存液を１０℃のインキュベーター内に入れ、１０日間保存した。保存開始から１０日後の保存液の菌数を測定し、保存後の生残菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
4). Storage in a sugar solution (hereinafter sometimes referred to as “storage (2)”)
2. Each lactic acid bacterium stored in (1) was stored in a solution having a sugar concentration of 26.5% by the following steps.
1) In 2.2) above, the number of bacteria reached was measured, then centrifuged (3000 rpm, 10 minutes) and the supernatant was discarded. Thereafter, an equal volume of PBS (−) solution was added, and after sufficient stirring, centrifugation (3000 rpm, 10 minutes) was performed again, and the supernatant was discarded. After repeating this operation again, the cells were suspended in an equal volume of PBS (−) solution, and the number of bacteria (CFU / ml) was measured as the cell suspension 2.
2) 10 ml of the cell suspension 2 of 1) above was added to 90 ml of the aqueous sugar solution prepared in 1.3) above, and stirred well to obtain a stock solution. The number of lactic acid bacteria in the preservation solution at this time (1/10 of the cell suspension 2) was defined as the initial bacterial count 2 (CFU / ml).
3) The stock solution of 2) above was placed in an incubator at 10 ° C. and stored for 10 days. The number of bacteria in the stock solution after 10 days from the start of storage was measured and used as the number of surviving bacteria (CFU / ml) after storage.
５．糖溶液での保存（保存（２））後の乳酸菌の菌数の確認
上記４．にて測定した、初発菌数２に対する生残菌数の割合（生残率）を、保存後の生残菌数／初発菌数２として算出し、糖溶液での保存後の乳酸菌の生存率を求めた。
その結果、図２に示したように、ラクトバチルス・ガセリのいずれの菌株も、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合の方が、保存（２）における乳酸菌の生存率は１００倍以上高かった。ラクトバチルス・ジョンソニーのＪＣＭ２０１０Ｔ菌株についても同様の結果が得られた。
増殖しない条件で保存したことにより、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率が向上し、よって、乳酸菌にとってストレス環境である糖溶液における乳酸菌の生存率が向上することが明らかとなった。
5. Confirmation of the number of lactic acid bacteria after storage in a sugar solution (storage (2)) The ratio of the number of surviving bacteria to the number of initial bacteria 2 (survival rate) measured in step 2 was calculated as the number of surviving bacteria after storage / number of initial bacteria 2 and the survival rate of lactic acid bacteria after storage in a sugar solution Asked.
As a result, as shown in FIG. 2, all strains of Lactobacillus gasseri were MRS (no sugar) as compared with the case of storage in MRS (glucose) medium (growth conditions) in storage (1). The survival rate of lactic acid bacteria in storage (2) was 100 times or more higher when stored in a medium (non-growth condition). Similar results were obtained for the JCM2010T strain of Lactobacillus johnsonii.
Storage under non-proliferating conditions improves the survival rate of Lactobacillus gasseri and / or Lactobacillus johnsonii, and thus the survival of lactic acid bacteria in a sugar solution that is a stress environment for lactic acid bacteria. It became clear that the rate improved.
菌種の検討
以下の１）〜４）の乳酸菌を用いて、実施例１と同様の試験を行った。
１）ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＪＣＭ １１３２Ｔ
２）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＪＣＭ １１７３Ｔ
３）ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ） ＪＣＭ １１２０Ｔ
４）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ） ＪＣＭ １１３１Ｔ
Examination of bacterial species The same tests as in Example 1 were performed using the following lactic acid bacteria 1) to 4).
1) Lactobacillus acidophilus JCM 1132T
2) Lactobacillus fermentum JCM 1173T
3) Lactobacillus helveticus JCM 1120T
4) Lactobacillus gasseri JCM 1131T
保存（１）後の乳酸菌の菌数の割合を培養倍率として図３に示した。図３に示されるように、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびラクトバチルス・ガセリのいずれの菌株も、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合、菌数が３０倍以上に増殖した。
一方で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合には、ラクトバチルス・ファーメンタムの菌数が２０倍まで増加したが、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびラクトバチルス・ガセリの菌数の増加は１０倍以内であった。
The ratio of the number of lactic acid bacteria after storage (1) is shown in FIG. As shown in FIG. 3, when all strains of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus and Lactobacillus gasseri are stored in MRS (glucose) medium (growth conditions), Numbers grew more than 30 times.
On the other hand, when stored in MRS (no sugar) medium (non-growth condition), the number of Lactobacillus fermentum increased to 20 times, but Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus and Lactobacillus The increase in the number of bacteria in the gasseri was within 10 times.
また、糖溶液での保存（保存（２））後の乳酸菌の生存率を図４に示した。図４に示したように、ラクトバチルス・ガセリでは、増殖しない条件での保存（保存（１））においてＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合に、保存（２）における乳酸菌の生存率が１０，０００倍以上と大きく向上した。
一方、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ヘルベティカスでは、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地で保存した場合も、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存した場合も、保存（２）における乳酸菌の生存率に大きな変化は見られなかった。
In addition, the survival rate of lactic acid bacteria after storage in a sugar solution (storage (2)) is shown in FIG. As shown in FIG. 4, in Lactobacillus gasseri, MRS (no sugar) compared to the case of storage in MRS (glucose) medium (growth conditions) in storage under non-growth conditions (storage (1)) ) When preserved in medium (non-growth conditions), the survival rate of lactic acid bacteria in preservation (2) was greatly improved to 10,000 times or more.
On the other hand, in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus helveticus, it is preserved whether it is preserved in MRS (glucose) medium or preserved in MRS (sugar-free) medium in preservation (1) ( There was no significant change in the survival rate of lactic acid bacteria in 2).
したがって、この結果より、ラクトバチルス・アシドフィラス， ラクトバチルス・ファーメンタムおよびラクトバチルス・ヘルベティカスにおいては、乳酸菌が増殖しない条件で保存することにより、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存した場合の乳酸菌の生存率に影響を与えない（保存（１）により保存（２）の生存率が向上しない）ことが明らかとなった。
一方で、ラクトバチルス・ガセリおよびラクトバチルス・ジョンソニーにおいては、実施例１に示されたように、該乳酸菌が増殖しない条件で保存することにより、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存した場合の乳酸菌の生存率に影響を与える（保存（１）により保存（２）の生存率が顕著に向上する）ことから、このような特性は菌種に依存することが示唆された。
Therefore, from this result, in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus helveticus, it was further preserved in a composition having a sugar concentration of 26.5% by storage under conditions where lactic acid bacteria do not grow. It was revealed that the survival rate of lactic acid bacteria was not affected in some cases (storage (1) does not improve the survival rate of storage (2)).
On the other hand, in Lactobacillus gasseri and Lactobacillus johnsonii, as shown in Example 1, in a composition having a sugar concentration of 26.5% by storage under conditions where the lactic acid bacteria do not grow. Furthermore, it affects the survival rate of lactic acid bacteria when stored (the survival rate of storage (2) is significantly improved by storage (1)), suggesting that such characteristics depend on the bacterial species. .
保存培地の検討
１．保存培地の調製
ラクトバチルス・ガセリ ＪＣＭ１１３１Ｔを用いて、表２に示した保存培地を調製し、実施例１と同様の試験を行った。
ＰＢＳ（−）に、表２に示した各成分（グルコース、プロテオース ペプトンＮｏ．３および酵母エキス）を添加し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷したものを保存培地１〜３および保存培地５として調製した。また、乳酸菌が資化できる炭素源を含まない培地として、ＭＲＳ（糖無し）培地を実施例１のとおり調製し、保存培地４とした。
Examination of preservation medium Preparation of preservation medium The preservation medium shown in Table 2 was prepared using Lactobacillus gasseri JCM1131T, and the same test as in Example 1 was performed.
Each component shown in Table 2 (glucose, proteose peptone No. 3 and yeast extract) was added to PBS (−), sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and then allowed to cool. Prepared as medium 5. In addition, as a medium that does not contain a carbon source capable of assimilating lactic acid bacteria, an MRS (no sugar) medium was prepared as in Example 1, and designated as preservation medium 4.
糖濃度が２６．５％の組成物中で保存した後（保存（２）後）の乳酸菌の生存率を図５に示した。図５に示されるように、保存培地１（ＰＢＳ（−）に何も添加していない培地）においては、保存培地４のＭＲＳ（糖無し）培地と同等の生存率を示した。また、プロテオース ペプトンＮｏ．３のみを添加した保存培地２、酵母エキスのみを添加した保存培地３も同等の生存率であった。一方、グルコースのみを添加した保存培地５では、著しく低い生存率を示した。これは、実施例１において示したＭＲＳ（グルコース）培地の結果と同様の傾向を示した。
したがって、これらの結果から、保存培地として、ＰＢＳ（−）のみの培地、ＰＢＳ（−）にプロテオース ペプトンＮｏ．３、または、酵母エキスを添加した溶液を保存培地として用いることができることが分かった。
また、この結果において、プロテオース ペプトンＮｏ．３、酵母エキスを添加した場合でも、ラクトバチルス・ガセリの生存率が高まることから、飲食品の製造工程において必要な成分を、食品添加物等として添加することが可能であることも確認できた。
The survival rate of lactic acid bacteria after storage in a composition having a sugar concentration of 26.5% (after storage (2)) is shown in FIG. As shown in FIG. 5, the preservation medium 1 (medium in which nothing was added to PBS (−)) showed a survival rate equivalent to that of the MRS (no sugar) medium of the preservation medium 4. In addition, Proteose Peptone No. The preservation medium 2 to which only 3 was added and the preservation medium 3 to which only the yeast extract was added also had the same survival rate. On the other hand, the preservation medium 5 to which only glucose was added showed a remarkably low survival rate. This showed the same tendency as the result of the MRS (glucose) medium shown in Example 1.
Therefore, from these results, as a preservation medium, PBS (−)-only medium, PBS (−) to Proteose Peptone No. 3 or a solution supplemented with yeast extract can be used as a storage medium.
In this result, Proteose peptone No. 3. Even when yeast extract was added, the survival rate of Lactobacillus gasseri was increased, so that it was also possible to confirm that it was possible to add necessary ingredients as food additives etc. in the production process of food and drink .
保存（１）の保存条件の検討
１．試料の調製
ラクトバチルス・ガセリ ＪＣＭ １１３１Ｔおよびラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）を用いて、実施例１の保存（１）の保存時間を０，４，８，１２，１６時間とする以外は実施例１と同様に試験を行った。
Examination of preservation conditions for preservation (1) Sample Preparation Using Lactobacillus gasseri JCM 1131T and Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953), the storage time of Example 1 storage (1) is other than 0, 4, 8, 12, 16 hours Were tested in the same manner as in Example 1.
結果を図６に示した。保存０時間の生存率は、１×１０-7（ＣＦＵ／ｍｌ）と低い値であったが、増殖しない条件で４時間以上保存を行った場合、その後の該乳酸菌の生存率は著しく向上することが明らかとなった。 The results are shown in FIG. The survival rate at 0 hours after storage was a low value of 1 × 10 −7 (CFU / ml), but when stored for 4 hours or longer under non-proliferating conditions, the survival rate of the lactic acid bacteria after that significantly improved. It became clear.
保存（２）における糖濃度条件の検討
１．各糖濃度組成物の調製
ラクトバチルス・ガセリ ＪＣＭ１１３１Ｔを用いて、実施例１の１．３）の糖組成物の糖濃度を変えた以外は、実施例１と同様の試験を行った。なお、糖濃度を変えた糖組成物は以下のように調製した。
異性化糖溶液（王子コンスターチ製）に、イオン交換水を表３に示した所定の濃度となるように添加し、十分混合した後、１２１℃で１５分間滅菌した。その後に溶液中の糖濃度をＢｒｉｘ計（デジタル糖度計、アタゴ製）で測定したところ、表３に示したように、Ｂｒｉｘ濃度は設定濃度とほぼ一致した。これらの糖水溶液を、糖濃度が０．０％〜３５％の組成物として用いた。
Examination of sugar concentration conditions in preservation (2) Preparation of Each Sugar Concentration Composition The same test as in Example 1 was conducted, except that Lactobacillus gasseri JCM1131T was used and the sugar concentration of 1.3) in the sugar composition of Example 1 was changed. In addition, the saccharide | sugar composition which changed saccharide | sugar concentration was prepared as follows.
To the isomerized sugar solution (manufactured by Oji Constarch), ion-exchanged water was added so as to have a predetermined concentration shown in Table 3, and after sufficient mixing, sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the sugar concentration in the solution was measured with a Brix meter (digital sugar meter, manufactured by Atago). As shown in Table 3, the Brix concentration almost coincided with the set concentration. These sugar aqueous solutions were used as compositions having a sugar concentration of 0.0% to 35%.
結果を図７に示した。
図には示していないが、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地で保存したラクトバチルス・ガセリ ＪＣＭ１１３１Ｔを糖濃度が２６．５％の組成物中で保存した場合は、生存率が１．０×１０-6以下であった。
これに対し、保存（１）においてＭＲＳ（糖無し）培地で保存したラクトバチルス・ガセリ ＪＣＭ１１３１Ｔを用いた場合、糖濃度が０．０％〜３５％のいずれの組成物中で保存した場合でも生存率が１．０×１０-3以上であった。
したがって、この結果より、保存（１）においてＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した乳酸菌は、保存（２）において、いずれの糖濃度の組成物中で保存された場合でも、生存率が１，０００倍以上に向上することが確認できた。
The results are shown in FIG.
Although not shown in the figure, when Lactobacillus gasseri JCM1131T stored in MRS (glucose) medium in storage (1) is stored in a composition having a sugar concentration of 26.5%, the survival rate is 1.0. × 10 −6 or less.
In contrast, when Lactobacillus gasseri JCM1131T stored in MRS (no sugar) medium was used in storage (1), it survived when stored in any composition with a sugar concentration of 0.0% to 35%. The rate was 1.0 × 10 −3 or more.
Therefore, from this result, the lactic acid bacteria stored in the MRS (no sugar) medium (the condition that does not grow) in the storage (1) can survive even if stored in the composition of any sugar concentration in the storage (2). It was confirmed that the rate was improved to 1,000 times or more.
乳酸菌の遺伝子発現特性の検討
実施例１の２．と同様の方法で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）について、次の１、２の工程により、菌体からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によって遺伝子の転写量を調べた。対照として、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）についても同様に、遺伝子の転写量を調べた。
Examination of gene expression characteristics of lactic acid bacteria 2. In the same manner as above, for Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) stored in MRS (sugar-free) medium (conditions that do not grow), mRNA is extracted from the cells by the following steps 1 and 2, cDNA was synthesized and the amount of gene transcription was examined by RT-qPCR method. As a control, the amount of gene transcription was also examined for Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) stored in MRS (glucose) medium (growth conditions).
１．保存（１）後のＭＲＳ（糖無し）培地、またはＭＲＳ（グルコース）培地の各２ｍｌを回収し、それぞれ８ｍｌの氷冷したＰＢＳ（−）を添加して混合した後、遠心分離（４℃、５０００Ｇ、１分間）した。その後、ＴＲＩ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ製）および菌体破砕機（Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ ｓｈｏｃｋｅｒ， 安井器械製）を用い菌体破砕、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いて菌体からｍＲＮＡを取得し、ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ， ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）によりｃＤＮＡを合成した。
２．調製したｃＤＮＡと表４に示したラクトバチルス・ガセリ用のプライマーセット、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ＴＭ７ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン製）にて定量的ＰＣＲを行った。１６ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準とした。
1. 2 ml each of MRS (sugar-free) medium or MRS (glucose) medium after storage (1) was collected, mixed with 8 ml of ice-cold PBS (−), and then centrifuged (4 ° C., 5000G, 1 minute). Thereafter, using TRI reagent (Ambion) and a cell disrupter (Multi-Beads shocker, manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.), disrupting the cells, using TURBO DNA-free kit (Ambion) to obtain mRNA from the cells, cDNA CDNA was synthesized with a synthesis kit (SuperScript ™ III First-Strand, manufactured by Invitrogen).
2. Using the prepared cDNA and Lactobacillus gasseri primer set shown in Table 4, Power SYBR (registered trademark) Green PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems), Applied biosystems ViiA TM7 Real-Time PCR Technology ) For quantitative PCR. The expression level of 16S rRNA was used as an internal standard.
表５に、各遺伝子がコードするタンパク質および機能を示した。また、図８に、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存されたラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルを１として、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存されたラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルの相対比較値を示した。
その結果、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存された場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存されたことにより、遺伝子の転写レベルが、いずれの遺伝子も１０分の１から１０，０００分の１まで、著しく低下することが確認できた。
Table 5 shows the proteins and functions encoded by each gene. FIG. 8 shows that the transcription level of the gene of Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) preserved in MRS (glucose) medium is 1, Lactobacillus gasseri SBT2055 preserved in MRS (no sugar) medium. The relative comparison value of the transcription level of the gene of (FERM BP-10953) was shown.
As a result, compared with the case where it was preserve | saved with MRS (glucose) culture medium, by having preserve | saved with MRS (sugar-free) culture medium, the transcription | transfer level of a gene is 1/10 to 10,000 minutes for all genes. It was confirmed that the value significantly decreased to 1.
糖溶液中で保存した前後のガセリ菌体の遺伝子発現状態の比較
実施例１の２．と同様の方法で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存（保存（１））した後、さらに、実施例１の４．と同様の方法で、糖濃度が２６．５％の組成物で、１０℃で５日間保存したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）について、実施例６の２と同様の工程において、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いることにより、遺伝子の転写量を調べた。
対照として、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した後、さらに、実施例１の４．と同様の方法で、糖濃度が２６．５％の組成物で、１０℃で５日間保存したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）についても遺伝子の転写量を調べた。
Comparison of gene expression state of gasseri cells before and after storage in sugar solution In the same manner as above, after storing (preserving (1)) in an MRS (sugar-free) medium (conditions for non-growth), 4 in Example 1 was further performed. In the same manner as in Example 6, 2 for Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953), which was stored at 10 ° C. for 5 days in the same manner as in the composition with a sugar concentration of 26.5%, Was extracted, cDNA was synthesized, and the amount of gene transcription was examined by using RT-qPCR method.
As a control, after storing in an MRS (glucose) medium (growth conditions), 4 in Example 1 was further performed. In the same manner as above, the amount of gene transcription was also examined for Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) stored at 10 ° C. for 5 days with a composition having a sugar concentration of 26.5%.
その結果、図９に示したように、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存（保存（１））された後、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存（保存（２））したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルは、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存（保存（１））されたものと同等か、やや高かった。
一方で、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存（保存（１））され、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存（保存（２））したラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルは、ＭＲＳ（グルコース）培地で培養された（保存（１））ものと比較して著しく低く、これは保存（２）の前の各種遺伝子の発現レベルの状態を維持していると考えられた。
これらの結果より、乳酸菌が増殖しない条件で保存されたラクトバチルス・ガセリは、糖濃度が高い組成物中で保存した後も、各種遺伝子の発現レベルが保存前の低い状態で維持されていた。従って、この結果より、これらの遺伝子の発現を調べることにより、乳酸菌の生存率が向上した状態で保存されたことを確認できることが示唆された。
As a result, as shown in FIG. 9, after being stored (preserved (1)) in an MRS (glucose) medium, the lactate further stored (preserved (2)) in a composition having a sugar concentration of 26.5%. The transcription level of the gene of Bacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) was similar to or slightly higher than that stored (preserved (1)) in MRS (glucose) medium.
On the other hand, Lactobacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) preserved in MRS (no sugar) medium (preserved (1)) and further preserved (preserved (2)) in a composition having a sugar concentration of 26.5%. The transcription level of the gene in (1) is significantly lower than that of the one cultured in MRS (glucose) medium (preservation (1)), which maintains the state of the expression level of various genes prior to preservation (2). It was thought that
From these results, Lactobacillus gasseri stored under conditions where lactic acid bacteria do not grow was maintained in a state in which the expression levels of various genes were low before storage even after storage in a composition having a high sugar concentration. Therefore, from this result, it was suggested that by examining the expression of these genes, it could be confirmed that the lactic acid bacteria were preserved in an improved survival rate.
乳酸菌を含有する飲食品の製造（１）
１）９５℃で９０分殺菌した発酵ミックス（１６％脱脂粉乳＋３％グルコース）１０ｇにラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）基準株ＪＣＭ ８１３０のスターターを３％添加し、３０℃で７６時間発酵した。
２）上記１）にて得られた発酵物１０ｇ、異性化糖１０ｇおよびイオン交換水を３５ｇ、実施例１と同様の方法で０．８９％生理食塩水で保存した（保存（１））ラクトバチルス・ガセリ ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３）を５ｇ添加して、ＢＲＩＸ １５％の乳製品乳酸菌飲料を製造した。
３）この乳製品乳酸菌飲料を１０℃で１０日間保存したところ、１０日間保存後のラクトバチルス・ガセリの菌数は、７．５×１０6（ＣＦＵ／ｍｌ）と高い値を示し、生存率は２．５×１０-1であった。
Manufacture of food and drink containing lactic acid bacteria (1)
1) 3% of a starter of Lactobacillus paracasei reference strain JCM 8130 was added to 10 g of a fermented mix (16% nonfat dry milk + 3% glucose) sterilized at 95 ° C. for 90 minutes, followed by fermentation at 30 ° C. for 76 hours.
2) 10 g of the fermented product obtained in 1) above, 10 g of isomerized sugar and 35 g of ion-exchanged water, stored in 0.89% physiological saline in the same manner as in Example 1 (preservation (1)) lact 5 g of Bacillus gasseri SBT2055 (FERM BP-10953) was added to produce a 15% BRIX dairy lactic acid bacteria beverage.
3) When this dairy lactic acid bacteria beverage was stored at 10 ° C. for 10 days, the number of bacteria of Lactobacillus gasseri after storage for 10 days showed a high value of 7.5 × 10 6 (CFU / ml), and the survival rate Was 2.5 × 10 −1 .
乳酸菌を含有する飲食品の製造（２）
１）脱脂粉乳９．５ｋｇ、無塩バター３ｋｇ、上白糖１０．５ｋｇ、水７７ｋｇをホモミキサーで混合し、原料ミックスを調製した。
この原料ミックスを５０℃まで加温し、８０ｋｇ／ｃｍ2 で均質処理した後、プレート式殺菌機で９０℃、１０分間加熱殺菌し、プレート式熱交換機で４２℃まで冷却した。そして、発酵乳製造用の市販乳酸菌スターター４重量％を添加した後、 １００ｍｌ容の容器に充填し、４２℃で発酵を行い、乳酸酸度が０．７５％になったところで５℃まで冷却して発酵乳を得た。
２）上記１）にて調製した発酵乳６８ｇ、実施例１と同様の方法で２．５％酵母エキス溶液で保存した（保存（１））ラクトバチルス・ジョンソニー ＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５３４）２ｇとフルーツプレザーブ１２ｇとを混合してフルーツ入り発酵乳を製造した。
３）このフルーツ入り発酵乳を１０℃で１０日間保存したところ、１０日間保存後のラクトバチルス・ジョンソニーの菌数は５．３×１０5（ＣＦＵ／ｍｌ）と高い値を示し、生存率は７．２×１０-1であった。
Manufacture of food and drink containing lactic acid bacteria (2)
1) 9.5 kg of skim milk powder, 3 kg of unsalted butter, 10.5 kg of super white sugar, and 77 kg of water were mixed with a homomixer to prepare a raw material mix.
This raw material mix was heated to 50 ° C., homogenized at 80 kg / cm 2 , sterilized by heating at 90 ° C. for 10 minutes with a plate type sterilizer, and cooled to 42 ° C. with a plate type heat exchanger. Then, after adding 4% by weight of a commercially available lactic acid bacteria starter for fermented milk production, it is filled into a 100 ml container, fermented at 42 ° C, and cooled to 5 ° C when the lactic acid acidity is 0.75%. Fermented milk was obtained.
2) 68 g of fermented milk prepared in 1) above and stored in a 2.5% yeast extract solution in the same manner as in Example 1 (Storage (1)) 2 g of Lactobacillus johnsonii SBT1839 (FERM P-15534) And 12g of fruit puree are mixed to produce fermented milk containing fruit.
3) When this fermented milk containing fruits was stored at 10 ° C. for 10 days, the number of bacteria of Lactobacillus johnsonii after storage for 10 days showed a high value of 5.3 × 10 5 (CFU / ml), and the survival rate Was 7.2 × 10 −1 .
乳酸菌にとってストレスの高い環境下においても生存でき、乳酸菌が死滅しやすい飲食品においても、生菌数を維持できる乳酸菌を製造することにより、この乳酸菌を含む飲食品を、高い健康効果が期待される、プロバイオティクス乳酸菌入り飲食品として提供することが可能となる。 By producing lactic acid bacteria that can survive in a stressful environment for lactic acid bacteria and that can easily kill lactic acid bacteria, it is expected that foods and drinks containing these lactic acid bacteria will have a high health effect. It can be provided as a food and drink containing probiotic lactic acid bacteria.
［寄託生物材料への言及］
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ２０５５
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９５３
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ２０５６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
上記（１）に同じ
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
昭和６１年４月２２日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１０３８
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ１０２４１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１７７８６
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ１０２３９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１０年２月１７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１６６３９
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＳＢＴ１８３９
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１５５３４
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＳＢＴ２０５０
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成７年３月１４日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８２４
[Reference to deposited biological materials]
(1) Lactobacillus gasseri SBT2055
The name and address of the depositary that deposited the biological material AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center 1st-1st, Tsukuba City, Ibaraki, Japan 1st-6th (zip code 305-8666)
Date of deposit of biological materials at the depository in Loi March 27, 1996 Deposit number FERM BP-10953 assigned to the deposit by the depository in the high
(2) Lactobacillus gasseri SBT2056
(A) Name and address of the depositary that deposited the biological material The date of deposit of the biological material at the same depository in the same (1) above April 22, 1986 The deposit number assigned by the depositary institution for the deposit FERM BP-11038
(3) Lactobacillus gasseri SBT10241
The name and address of the depository institution that deposited the biological material 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (Postal code 305-8666)
Date of deposit of biological material at the depository of Loi March 15, 2000 Deposit number FERM P-17786 attached to the depository by the depository of high
(4) Lactobacillus gasseri SBT10239
The name and address of the depository institution that deposited the biological material 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (Postal code 305-8666)
Date of deposit of biological materials at the depository in Loi February 17, 1998 Deposit number FERM P-16639 attached to the depository by the depository in Hai
(5) Lactobacillus johnsonii SBT1839
The name and address of the depository institution that deposited the biological material 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (Postal code 305-8666)
Date of deposit of biological material at the depository in Loi March 27, 1996 Deposit number FERM P-15534 attached to the depository by the depository in Hai
(6) Lactobacillus johnsonii SBT2050
The name and address of the depository institution that deposited the biological material 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (Postal code 305-8666)
Date of deposit of biological material at the depository of Loi March 14, 1995 Deposit number FERM P-14824 attached by the depositary of hi
Claims (11)
（ｉ）条件；ラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーをグルコースを含まない保存培地で２０〜４５℃、４〜１６時間保存する
前記保存後のラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーの下記（ii）に示す全ての遺伝子の発現が、ＭＲＳ培地で３７℃、１６時間保存した場合と比べてその転写レベルにおいて１０分の１以下に低下している前記ラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニー。
（ii）遺伝子
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ When Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii is stored under the following conditions (i), the number of bacteria after storage (CFU / ml) is within 10 times the number of bacteria before storage (CFU / ml) Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii after the storage, characterized in that
(I) Conditions: Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii is stored in a storage medium not containing glucose at 20 to 45 ° C for 4 to 16 hours.
The expression of all the genes shown in the following (ii) of Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii after the storage is one-tenth at the transcription level as compared with the case of storage at 37 ° C. for 16 hours in MRS medium. The Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii is reduced below .
(Ii) Gene 1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
（ｉ）条件；ラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーをグルコースを含まない保存培地で２０〜４５℃、４〜１６時間保存する
当該保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であり、前記保存後のラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーの下記（ii）に示す全ての遺伝子の発現が、ＭＲＳ培地で３７℃、１６時間保存した場合と比べてその転写レベルにおいて１０分の１以下に低下している前記製造方法。
（ii）遺伝子
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ A Lactobacillus gasseri or Lactobacillus gasseri or Lactobacillus John Sony manufacturing method Lactobacillus John Sony the step of storing in the following conditions (i) and said containing Mukoto,
(I) Conditions: Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii is stored in a storage medium not containing glucose at 20 to 45 ° C for 4 to 16 hours.
Number of bacteria after the storage (CFU / ml) are bacterial count before storage (CFU / ml) Ri 10 times within der of the after storage Lactobacillus gasseri or Lactobacillus John Sony below (ii) The said manufacturing method in which the expression of all the genes shown has fallen to 1/10 or less in the transcription | transfer level compared with the case where it preserve | saved at 37 degreeC for 16 hours in a MRS culture medium .
(Ii) Gene
1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
（ｉ）条件；ラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーをグルコースを含まない保存培地で２０〜４５℃、４〜１６時間保存する
当該保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であり、前記保存後のラクトバチルス・ガセリまたはラクトバチルス・ジョンソニーの下記（ii）に示す全ての遺伝子の発現が、ＭＲＳ培地で３７℃、１６時間保存した場合と比べてその転写レベルにおいて１０分の１以下に低下している前記生存率を向上させる方法。
（ii）遺伝子
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ A method for improving the survival rate of Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii comprising the step of storing Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii under the conditions of (i) below ,
(I) Conditions: Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii is stored in a storage medium not containing glucose at 20 to 45 ° C for 4 to 16 hours.
The number of bacteria after storage (CFU / ml) is within 10 times the number of bacteria before storage (CFU / ml), and is shown in the following (ii) of Lactobacillus gasseri or Lactobacillus johnsonii after the storage The method for improving the survival rate, wherein the expression of all genes is reduced to 1/10 or less at the transcription level as compared with the case where the gene expression is stored at 37 ° C. for 16 hours in MRS medium .
(Ii) Gene
1) atpD, 2) cfa, 3) clpC, 4) dnaK, 5) ftsH, 6) groEL, 7) hsp20, 8) ldh, 9) mscL, 10) npr, 11) opuA, 12) ptsH, 13) rpoS, 14) trx, 15) uvrA
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